ES2315404T3 - Uso de aplidina para el tratamiento de cancer de pancreas. - Google Patents

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Abstract

El uso de aplidina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero afectado por cáncer de páncreas para prevenir el riesgo de desarrollar tumores, para fomentar la regresión tumoral, para detener el crecimiento del tumor, y/o para prevenir metástasis.

Description

Uso de aplidina para el tratamiento de cáncer de páncreas.
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Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere en general a la terapia contra el cáncer. La invención se refiere de forma más específica al uso de aplidina en la producción de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas. Para prevenir el riesgo de desarrollar tumores, para fomentar la regresión de tumores, para detener el crecimiento de tumores, y/o para prevenir la metástasis.
Antecedentes de la invención
El cáncer es un problema de salud significativo en todo el mundo. Aunque se han hecho avances en la detección y terapia contra el cáncer, actualmente no hay disponible ninguna vacuna u otro método de éxito universal para la prevención y/o tratamiento.
Las terapias actuales, que en general están basadas en una combinación de quimioterapia o cirugía y radiación, continúan demostrándose inadecuadas en muchos pacientes.
Situado en el abdomen superior en el retroperitoneo, el páncreas está íntimamente asociado con muchas estructuras principales incluyendo la vena porta, estómago, duodeno, conducto colédoco, y la arteria mesentérica superior.
El cáncer de páncreas es la quinta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. Es más común entre hombres, y los hombres entre las edades de 60 y 70 tienen más riesgo. Al crecer el tumor, los síntomas del paciente que resultan de la infiltración tumoral de la estructura adyacente producen dolor, nausea, vómitos, pérdida de peso e ictericia. La última afección presenta síntomas en no más de la mitad de los pacientes. Una vez que se ha producido la infiltración tumoral otras estructuras tal como la vena porta se van afectadas y esto excluye la resección curativa del páncreas.
El tratamiento eficaz del cáncer de páncreas debe alcanzar dos fines difíciles: control de la masa tumoral primaria, tanto inicial como posteriormente, y tratamiento de las células tumorales metastásicas. Como resultado de su inicio insidioso, el diagnóstico de cáncer de páncreas se retrasa con frecuencia durante varios meses. Este retraso tiene implicaciones profundas, ya que se ha observado la extensión metastásica al hígado o ganglios linfáticos al tiempo del diagnóstico en el 60% de los pacientes, y este factor disminuye la expectativa de supervivencia a largo plazo. Además, el carcinoma del páncreas es asintomático en su fase inicial. Los síntomas más comunes en fase más tardía son pérdida de peso, dolor abdominal, e ictericia. La pérdida de peso, las causas de la cual no se entienden por completo, normalmente es significativa. La ictericia se produce si el cáncer bloquea el conducto colédoco. Al tiempo en que el tumor maligno se identifica, con frecuencia se ha extendido (metastasizado) a otras partes del cuerpo. La supervivencia mediana es poco más de seis meses desde el tiempo del diagnóstico.
Las terapias actuales para esta enfermedad común y difícil de tratar incluyen cirugía y/o quimioterapia. Con frecuencia el tumor no se puede eliminar mediante cirugía, bien porque ha invadido estructuras vitales que no se pueden eliminar o porque se ha extendido a sitios distantes.
Aunque han mejorado las tasas de supervivencia de 5 años tras la eliminación quirúrgica del páncreas y una gran parte del duodeno, el procedimiento sólo se usa en el 9% de los pacientes. De estos, la tasa más alta de supervivencia de 5 años descrita está en el intervalo del 20%.
Los pacientes con cáncer de páncreas avanzado son tratados principalmente con quimioterapia. El objetivo de tal terapia es prolongar la supervivencia del paciente. También se usan cirugía e irradiación para mitigar el dolor y reducir el bloqueo del órgano.
A pesar de la considerable investigación en terapias para estos y otros cánceres, el cáncer de páncreas permanece difícil de tratar de forma eficaz.
De acuerdo con esto, existe una necesidad en la técnica para métodos mejorados para el tratamiento de cánceres de páncreas primarios y metastásicos. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.
La deshidrodidemnina B, ahora conocida como aplidina, es el objeto de WO91/04985.
Se puede encontrar información adicional sobre la aplidina en, por ejemplo: Jimeno, J., "Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticancer drugs from marine origin", IBC Conf Discov Drugs from Nat Novel Approaches New Sources (8-9 Dic., Londres) 1994, 1994; Faircloth, G. et al., "Dehydrodidemnin B (DDM) a new marine derived anticancer agent (MDA) with activity against experimental tumour models", 9th NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (12-15 marzo, Ámsterdam) 1996, Abst 111; Sakai, R. et al., "Structure-activity relationships of the didemnins", Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39 (14): 2819; Urdiales, J. L. et al. "Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B (DDB), a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates", Cancer Letters 1996, 102 (1-2): 31; Faircloth, G. et al., "Preclinical characterization of aplidine (APD), a new marine anticancer depsipeptide (MADEP)", Proc Amer Assoc Cancer Res. 1997, 38: Abst 692; Depenbrock, H. et al. "In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells", British Journal of Cancer 1998, 78 (6): 739; Faircloth, G. et al., "Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity", Proc Amer Assoc Cancer Res 1998, 39: Abst 1551; Faircloth, G. et al., "Preclinical development of aplidine, a novel marine derived agent with potent antitumour activity", 10th NCI-EORTC Symp. New Drugs Cancer Ther (16-19 Junio, Amsterdam) 1998, Abst 129; Geldof AA, Mastbergen SC, Henrar RE, Faircloth GT. "Cytotoxicity and neurocytotoxicity of new marine anticancer agents evaluated using in vitro assays", Cancer Chemother Pharmacol 1999; 44(4):312-8; Jimeno J, Smith B, Grant W, Faircloth GT. "A correlation of selective antitumour activities of the marine-derived compound aplidine using different models" 10th NCI-EORTC-AACR Symposium on molecular targets and cancer therapeutics. Washington, 1999. Abstract 311; Broggini M. Marchini S, D'Incalci M, Taraboletti G, Giavazzi R, Faircloth G, Jimeno J. "Aplidine blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-RI autocrine loop in a human leukemic cell line", 11th NCI-EORTC-AACR Symposium on new drugs in cancer therapy. Ámsterdam, 2000. Abstract 21; Luber-Narod, J., Jimeno, J.; Faircloth, GT. et al. "In vitro safety profile of aplidine, a marine natural product with chemotherapeutic potential", Proceedings of the AACR, vol. 42, abstract 374, Marzo 2001.
En estudios preclínicos, la aplidina tenía una actividad citotóxica dependiente de la dosis contra las dos líneas celulares de tipo epitelial, CT-1 y CT-2, y la línea celular de cáncer de colon humano, HT-29. La línea más proliferativa, CT-2, era la más sensible a aplidina. Además el compuesto disminuyó la actividad ornitina descaboxilasa en las tres líneas (Lobo C, Garcia Pozo SG, et al.: "Effect of dehydrodidemnin B on human colon carcinoma cell lines", Anticancer Research. 17: 333-336, En-Feb 1997). En un estudio similar, aplidina 50 nmol/L inhibió el crecimiento de líneas celulares de cáncer de mama, MDA-MB231 y MCF-7 en un 17 y 47%, respectivamente.
La exposición continua a bajas concentraciones de aplidina inhibió el crecimiento de un número de líneas celulares tumorales, incluyendo linfoma no de Hodgkin, melanoma y cánceres de mama, ovario y pulmón no microcítico. La magnitud del efecto dependía del tiempo de exposición y parecía ser alcanzable a concentraciones no mielotóxicas. Las líneas celulares de cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama y melanoma eran sensibles a una exposición continua a aplidina a concentraciones de > = 0,001 micromol/L. La aplidina tenía una toxicidad similar a la doxorubicina contra células troncales hematopoyéticas clonogénicas (Depenbrock H, Peter R, et al.: "In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells", British Journal of Cancer. 78: 739-744, No. 6, Sep 1998).
En general las terapias de fármacos se evalúan con respecto al tratamiento de cáncer humano, por ejemplo, líneas de xenoinjertos de cáncer humano. Los tumores humanos se heterotrasplantan serialmente en ratones inmunodeficientes, denominados "desnudos", y los ratones se ensayan después para su respuesta a un fármaco específico (Giovanella, B. C., et al., Cancer 52(7):1146 (1983)). Los datos obtenidos en estos estudios apoyan fuertemente la validez de los tumores humanos heterotrasplantados en mamíferos inmunodeficientes, tal como ratones desnudos, como un modelo predictivo para ensayar la eficacia de agentes anticancerosos.
La aplidina tenía actividad significa contra ratones que llevaban xenoinjertos de tumores humanos. A una dosis tolerada máxima de 2,1 mg/kg, la aplidina produjo una remisión casi completa en algunos animales con una proporción de tumor tratado/control (T/C) del 9%. A 1,25 mg/kg, se vio actividad significativa frente a tumores gástricos (T/C 14%) y también se observó inhibición del crecimiento de tumor de próstata (T/C 25%) (Faircloth G, Grant W, et al. "Preclinical development of aplidine, a novel marine derived agent with potent antitumour activity", Annals of Oncology. 9 (Suppl. 2): 34, 1998). La aplidina también era activa contra leucemia P388 y melanoma B16 implantadas en ratones, con una dosis óptima de 160 micro/kg. De forma diferente a la didemnina B, la aplidina era activa en carcinomas de pulmón de lewis implantados SC (F'aircloth O, Rinehart K, et al.: "Dehydrodidemnin B a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumor models", Annals of Oncology. 7 (Suppl. 1): 34, 1996).
El uso de aplidina para el tratamiento de diferentes cánceres se describe en WO 0135974 del presente solicitante. Los ejemplos 17 y 18 de esta solicitud establecen que la aplidina se probó en ensayos clínicos en fase I para determinar datos de toxicidad (dosis máxima tolerada) y farmacocinéticos. Algunos de los pacientes tenían tumor de páncreas, aunque no se describió ninguna indicación de actividad para estos tumores. Es el caso que estos 4 pacientes no respondieron a la aplidina que se les administró.
Compendio de la invención
Se ha establecido por primera vez que la aplidina induce un efecto antitumoral en tumores primarios y metástasis en modelos de carcinoma de páncreas humano, de una manera específica de tumor.
De esta manera, la presente invención proporciona el uso de aplidina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquier mamífero, en particular un ser humano, afectado de cáncer de páncreas para prevenir el riesgo de desarrollar tumores, para fomentar la regresión tumoral, para detener el crecimiento del tumor, y/o para prevenir la metástasis.
La presente invención proporciona el uso de aplidina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquier mamífero, en particular un ser humano, afectado de cáncer de páncreas metastásico para prevenir el riesgo de desarrollar tumores, para fomentar la regresión tumoral, para detener el crecimiento del tumor, y/o para prevenir la metástasis.
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Descripción de las figuras
Figura 1. La aplidina induce la muerte celular necrótica y apoptótica en los tumores NP18 (paneles A-H) y NP9 (paneles I-P) sólo en el sitio ORT: la tinción H&E de tumores NP18 ORT tratados con aplidina mostró sustitución de fibra cicatricial de tejido necrótico (panel B), que no se observó en el grupo control ORT (panel A), ni en tumores SC tratados (panel D) o control (panel C). La tinción de Hoescht de tumores NP18 ORT tratados viables mostró condensación nuclear (panel F). No se observó inducción de condensación nuclear en tumores ORT control (panel E), los SC tratados (panel G) o los SC control (panel H). En el tumor NP9 ORT tratado, se observaron múltiples focos de necrosis que ocupaban la mayoría del tumor (panel J). Estos focos eran significativamente menores o no se observaron en los grupos ORT control (panel I), ni en los SC tratados (panel L) o control (panel K). La condensación nuclear sólo se observó en los tumores NP9 ORT tratados viables (panel N), pero no lo fue en los tumores ORT control (panel M), los SC tratados (panel O) o los SC control (panel P).
Figura 2. La aplidina activa vías apoptóticas en el tumor NP18: Se detectaron descenso en la activación de AKT, activación de las caspasas 3, 7 y 8 y corte de PARP en tumores ORT tratados con aplidina (T), comparado con los control (C). En el sitio SC, la aplidina no alteró la regulación de ninguna de estas proteínas. Se detectó un descenso similar de la proteína Bcl-X_{L} en tumores ORT o SC tratados con aplidina, comparados con sus respectivos vehículos controles. No se observaron diferencias en la activación de ERK entre tumores tratados y controles en ningún sitio.
Figura 3. La aplidina regula negativamente las moléculas reguladoras del ciclo celular en el tumor NP9: Se detectó un descenso en la expresión de ciclina B1 y ciclina D1 en tumores ORT tratados con aplidina (T) comparados con tumores ORT control (C). Por el contrario, no se observaron diferencias en los niveles de ciclina B1 o ciclina D1 entre tumores SC tratados y controles. No se detectaron formas activas de la caspasas 3, 7 u 8, a pesar de detectar sus procaspasas respectivas en tumores NP9 controles (C) o tratados (T), sin embargo, se observó regulación negativa de FAK sólo en los tumores ORT tratados. La activación de ERK no se alteró por el tratamiento en ambos sitios tumorales. Se usó la expresión de beta-actina para controlar para cargar igual proteína.
Figura 4. Tinción con H&E de metástasis peritoneal de NP9 tratado con aplidina: los implantes tratados con aplidina (Panel A (aumento 40X) y B (aumento 200X)) no contenían áreas necróticas. No se observaron diferencias en necrosis en implantes tratados con aplidina, comparados con implantes control (panel C (X200) y D (X200)). Se detectaron un alto porcentaje de células tumorales con citoplasma grande y blanco en implantes tratados con aplidina (panel B) comparados con los control (panel D).
Figura 5. Análisis molecular de metástasis peritoneal de NP9 tratado con aplidina: Se detectó un descenso en la activación de las ERKs sólo en metástasis peritoneal de NP9 tratada (T). No se detectaron ni activación de caspasa-3 ni proteólisis de PARP en implantes control (C) o tratados (T). J, ADN apoptótico control de células Jurkat tratadas con camptotecina.
Descripción detallada de la invención
Se probaron modelos de cáncer de páncreas in vivo con aplidina para encontrar evidencia de actividad. De forma sorprendente, se encontró que la aplidina induce necrosis, apoptosis y parada del ciclo celular en dos carcinomas de páncreas humanos primarios (NP9 y NP18) xenotrasplantados en ratones desnudos y muy especialmente inhibe el crecimiento de las metástasis peritoneales en el tumor NP9 probado.
Por lo tanto la aplidina, o una composición farmacéutica de la misma, serán eficaces en el tratamiento del cáncer de páncreas.
La aplidina tiene la siguiente fórmula:
1
Los ejemplos de composiciones farmacéuticas que contienen aplidina incluyen líquidos (soluciones, suspensiones o emulsiones) con composición adecuada para administración intravenosa, y pueden contener el compuesto puro o en combinación con cualquier soporte u otros compuestos farmacológicamente activos.
La aplidina solubilizada muestra una degradación sustancial en condiciones de prueba de estrés calórico y lumínico, y se desarrolló una forma posológica liofilizada, ver WO99/42125 incorporada aquí mediante referencia. En una forma de realización actualmente preferida se llevó a cabo liofilización a partir de una solución de aplidina
500 mg/mL en tert-butanol al 40% (volumen/volumen) en agua para inyección (Wf1) que contenía D-manitol
25 mg/mL como agente de carga. Se determinó que el prototipo, que contenía 500 mg de aplidina y 25 mg de D-manitol como agente de carga por vial, era la formulación óptima en términos de solubilidad, duración del ciclo de liofilización y requerimientos de dosis en los estudios clínicos. Se determinó que la solución de reconstitución óptima era 15/15/70% (volumen/volumen/volumen) Cremaphor EL/etanol/Wfi (CEW). Tanto los productos reconstituidos como las diluciones (hasta 1 : 100 volumen/volumen) del producto reconstituido con solución salina normal parecen ser estables durante al menos 24 horas después de la preparación. Los datos de vida útil, disponibles hasta ahora, muestran que la formulación es estable durante al menos 1 año cuando se almacena a 4ºC en la oscuridad.
La administración de aplidina o composiciones como se describe aquí se basa en un protocolo de dosificación preferiblemente mediante infusión intravenosa. Se prefiere que se usen tiempos de infusión de hasta 72 horas, más preferiblemente de 1 a 24 horas, con alrededor de 1, alrededor de 3 o alrededor de 24 horas lo más preferido. Los tiempos cortos de infusión que permiten que el tratamiento se lleve a cabo sin pernoctar en el hospital son especialmente deseables. Sin embargo, la infusión puede ser de alrededor de 24 horas o incluso más larga si se requiere. La infusión se puede llevar a cabo a intervalos adecuados con patrones variables, de forma ilustrativa una vez a la semana, dos veces a la semana, o con mayor frecuencia por semana, repetido cada semana opcionalmente con intervalos de típicamente una semana.
Dependiendo del tipo de tumor y del estado de desarrollo de la enfermedad, los usos de la invención son útiles en prevenir el riesgo de desarrollar tumores, en fomentar la regresión tumoral, en detener el crecimiento del tumor y/o en prevenir la metástasis.
La dosis correcta del compuesto variará según la formulación particular, el modo de aplicación, y el sitio particular, huésped y tumor que se tratan. Se deben tomar en consideración otros factores como la edad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, estado del huésped, combinación de fármacos, sensibilidades de reacción y gravedad de la enfermedad. La administración se puede llevar a cabo de forma continua o periódica con la dosis máxima tolerada. Se dan más consejos en WO 0135974.
El compuesto aplidina y las composiciones como se describen aquí se pueden usar con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o ser suministrados como una composición separada para la administración al mismo tiempo o a tiempos diferentes. Un fármaco preferido para ser combinado con aplidina es carnitina. También preferiblemente, la aplidina se administra junto con uno o más agentes terapéuticos eficaces contra el cáncer de páncreas tal como gemcitabina o 5-FU.
Según la presente invención, se demostró que la aplidina induce necrosis, apoptosis y parada del ciclo celular en dos carcinomas de páncreas primarios humanos (NP9 y NP 18) xenotrasplantados en ratones desnudos e inhibe el crecimiento de metástasis peritoneales en el tumor NP9 probado.
La aplidina tiene actividad antitumoral contra el tumor NP18, cuando se implanta en el sitio ORT, a través de inducción apoptótica y necrótica, seguido por la formación de fibra cicatricial. La apoptosis parece estar mediada por la vía de AKT, ya que se observó inhibición de la activación de AKT y activación de las caspasas 3, 7 y 8 que producen corte de PARP en estos tumores. Otras vías de regulación del crecimiento, como las ERKs permanecen sin cambiar. La activación disminuida de AKT es un descubrimiento común en apoptosis inducida por fármacos.
De forma muy significativa, la aplidina tiene actividad antitumoral contra el tumor NP9, cuando se implanta en sitio ORT, y su mecanismo de acción parece ser una combinación de parada de crecimiento y muerte celular. Esto está basado en las necrosis microscópicas observadas, y en la regulación negativa de las ciclinas D1 y B1 y Ki67 y el alto porcentaje de condensación nuclear, mediante tinción con Hoescht, en el tejido viable en estos tumores. De esta manera, a pesar de no observar una reducción en el tamaño del tumor, esto probablemente ocurra posteriormente, como consecuencia de la resorción de estos focos necróticos. Por lo tanto, la aplidina induce una alteración específica de tumor de las vías apoptótica y/o proliferativa que podría explicar su efecto antitumoral cuando se implanta en el sitio ORT.
Además del efecto antitumoral de la aplidina contra los carcinomas primarios de páncreas, aquí se muestra que este compuesto también es antimetastásico en el tumor NP9. Este efecto antimetastásico se demostró tanto cuando el tratamiento empezó antes de la implantación metastásica como mediante la inhibición de crecimiento de implantes metástasicos previamente establecidos.
Los focos metastásicos que tenían 1-2 mm antes del tratamiento, desaparecieron completamente o sufrieron una reducción significativa de tamaño y se volvieron detectables sólo con el microscopio, sin mostrar áreas necróticas. Por lo tanto, el mecanismo más probable para su reducción de tamaño era, no la necrosis, sino la inducción apoptótica.
De forma interesante la respuesta molecular de las metástasis y tumores primarios al fármaco diferían (la activación de ERK disminuyó en metástasis y no cambió en el tumor primario); implicando que la respuesta de las metástasis no se podría anticipar de la observada en el tumor primario. La observación es muy relevante porque, hasta la fecha, no se ha descrito terapia eficaz para el tratamiento del carcinoma metastásico de páncreas. Basado en estos descubrimientos se diseñó un ensayo clínico de fase II sobre el cáncer de páncreas exocrino.
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Ejemplos Informe preliminar Actividad inhibidora del crecimiento y antimetastásica de la aplidina en xenoinjertos de carcinoma de páncreas humano en ratones desnudos
La aplidina es un depsipéptido cíclico nuevo con actividad anticancerosa in vitro e in vivo en diferentes tipos de tumores, pero no se ha probado en carcinoma de páncreas. Sin embargo, esta patología tiene un pronóstico malo debido a la dificultad del diagnóstico temprano, agresividad y falta de terapias sistémicas eficaces. La mayoría de los pacientes muere de metástasis presentes en el diagnóstico. Se comparó el efecto antitumoral de la aplidina contra dos carcinomas de páncreas humanos, NP9 y NP18, usando modelos de implantación del tumor ortotópica (ORT) y subcutánea (SC). El tumor NP9 muestra una diseminación peritoneal extensa 3-4 semanas tras la implantación. MÉTODOS: Se trataron grupos de diez ratones machos Swiss Nu/Nu (4 semanas de edad) con vehículo o aplidina. Para evaluar la respuesta del tumor primario, se dio aplidina ip, empezando 2 semanas después de la implantación, a 0,8 mg/kg q4d durante 4 semanas (NP9) o a 0,8 mg/kg q4d durante 6 semanas, cesando el tratamiento la 4ª y 5ª semana (NP18). Para evaluar la respuesta de metástasis de NP9 la pauta de aplidina fue de 0,8 mg/kg q4d por 3 dosis, empezando 4 semanas tras la implantación. Se midió el peso final del tumor, viabilidad macroscópica (corteza viable/peso total del tumor), necrosis microscópica, inducción apoptótica y transducción de señales. RESULTADOS: la aplidina mostró efecto antitumoral en los tumores primarios NP9 y NP18, que se observó exclusivamente a nivel microscópico y molecular en el sitio ORT, no en el sitio SC, en ambos tumores. Este efecto era debido a la inducción apoptótica produciendo un número reducido de células viables en ambos tumores. La inducción apoptótica en NP18 estaba asociada con el corte de PARP y activación reducida de AKT, sólo en los tumores ORT tratados. La aplidina indujo un descenso en la expresión de las ciclinas B1 y D1 y FAK sólo en los tumores NP9 ORT tratados. Además, la aplidina mostró inhibición completa de los implantes peritoneales de NP9, empezara el tratamiento antes o después de que se produjeran los depósitos metastásicos. Se observaron ausencia de necrosis y una disminución en la actividad MAPK en las metástasis tratadas. CONCLUSIONES: El uso de un modelo de implantación ORT permitió la observación del efecto antitumoral de la aplidina en tumores primarios y metástasis de carcinomas de páncreas humanos. La aplidina alteró las vías apoptótica y proliferativa, lo que podría explicar su efecto antitumoral. Además, los tumores implantados ORT y SC mostraron una respuesta diferente a este fármaco.
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Informe detallado
Se usaron dos carcinomas de páncreas humanos (NP9 y NP18) perpetuados como xenoinjertos ortotópicos en ratones desnudos. NP9 produce una diseminación peritoneal extensa 4-5 semanas tras la implantación (metastásica). Se implantaron estos tumores en ratones machos Swiss Nu/Nu de cuatro semanas (Charles River), mantenidos en jaulas autoclavadas, y suministrando lecho y alimento esterilizados por rayos \gamma. Se anestesiaron con 2,2,2-tribromoetanol (Sigma-Aldrich) y se implantaron fragmentos de 10 mg de cada tumor de pases previos de forma ortotópica (ORT, en el páncreas). Los animales xenoinjertados se distribuyeron al azar en grupos control (n=10) y experimental (n=10) justo antes del tratamiento. Se excluyeron los animales que tenían tumores no palpables tras la implantación ORT, o con volúmenes tumorales menores de 0,13 cm^{3} (0,5 cm de diámetro). El programa de tratamiento dependía en la velocidad de crecimiento del tumor. En el tumor de crecimiento rápido NP9, se usaron dos programas de tratamiento. En uno, el tratamiento empezó dos semanas después de la implantación del tumor, antes de que sucediera la diseminación peritoneal. Cada animal en el grupo experimental recibió administraciones ip de aplidina a una dosis de 0,8 mg/kg q4d durante cuatro semanas. En el otro programa, el tratamiento empezó cuatro semanas después de la implantación del tumor, una vez que se había producido la diseminación peritoneal, con una pauta de aplidina de 0,8 mg/kg q4d por tres dosis. La existencia de implantes macroscópicamente visibles se confirmó un día antes de que empezara el tratamiento, mediante el sacrificio de un animal extra. En el tumor NP18, el tratamiento empezó 4 semanas después de la implantación del tumor y el programa de aplidina era de 0,8 mg/kg q4d durante 4 semanas, cesando el tratamiento durante dos semanas, y continuando con 0,8 mg/kg q4d ip durante dos semanas adicionales. Los animales en los grupos control correspondientes recibieron administraciones i.p. de vehículo siguiendo el mismo programa. Después de la implantación, y durante el tratamiento, los ratones se inspeccionaron dos veces por semana y se pesaron semanalmente para seguir la toxicidad del compuesto.
Al final del tratamiento, los animales se sacrificaron y se registró la diseminación. Los tumores primarios se cortaron y se pesaron en todos los grupos. Se congelaron alícuotas de tumores en nitrógeno líquido o se fijaron en formalina. Se contaron el número de implantes peritoneales en cada animal y se tomaron muestras para análisis histológico y molecular. Se comparó entre grupos la media del peso de tumor total y sólido (excluida la necrosis central), usando la prueba t de Student, siendo las diferencias significativas a p<0,05.
Análisis histológico y prueba de Hoescht
Para el análisis histopatológico, se tiñeron tejidos fijados en formalina embebidos en parafina con H&E siguiendo el protocolo estándar y se observó la presencia o ausencia de muerte celular microscópica. La tinción nuclear de ADN se realizó en secciones de 5 \mum de tejido tumoral fijado en formalina embebido en parafina. Se eliminó la cera de las secciones en xileno y se deshidrataron, se lavaron dos veces con PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron dos veces con PBS. A continuación, los portaobjetos se incubaron con Hoescht (1:5000 en PBS) durante 1 hora, se lavaron agua estéril y se secaron a temperatura ambiente. Por último, los portaobjetos se montaron y se observaron con un microscopio de fluorescencia, analizando sólo las áreas que no implicaban necrosis microscópica.
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Análisis por inmunotransferencia
Los análisis moleculares se realizaron en extractos de proteína de células enteras de tumores mediante inmunotransferencia, como se ha descrito (11). El anticuerpo anti-MAPK activa (Promega) (1:20.000) detectó las formas activas de Erk-1 y Erk-2. Los anticuerpos policlonales de conejo anti-ciclina B1 (1:1.000), anti-Bcl-XL (1:7.000-o/n), y anti-FAK (diluido 1:7.000) y el de cabra anti-\beta-actina (1:15.000) eran de Santa Cruz. El anti-ciclina D1 de conejo era de Upstate Biotech. Los anticuerpos de conejo anti-caspasa-3, anticaspasa-7 y anti-caspasa-8 eran de Pharmingen, el anti-AKT activa de conejo de New England Biolabs, y el anti-PARP de conejo de Boehringer-Mannheim. Todos los anticuerpos secundarios (Jackson ImmunoResearch) se usaron a una dilución de 1:10.000.
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Análisis por inmunohistoquímica
El análisis de IHC se realizó en tejido tumoral embebido en parafina. Se eliminó la cera de secciones de cinco \mum en xileno y se deshidrataron. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con H_{2}O_{2} al 0,03%. El antígeno se recuperó calentando e incubando con tampón monofosfato ácido cítrico 10 mM (pH 6,0). Las secciones se incubaron con el anticuerpo anti-Ki67 a temperatura ambiente durante 1 hora y, después, con anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa EnVision TM (Dako) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por DAB + cromógeno (Dako) y contratinción con hematoxilina. La cuantificación de la muestra se hizo contando las células teñidas positivamente en tres campos al azar con alta potencia (100X). Las diferencias entre grupos se consideraron significativas a p<0,05 (prueba t de Student).
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Resultados
Primero se analizó el efecto de aplidina sobre los tumores primarios de páncreas humanos NP18 y NP9 tras el tratamiento con aplidina. Se describen los cambios macroscópicos y microscópicos, y la alteración de la expresión y/o activación de proteínas apoptóticas o reguladoras del ciclo celular. También se describe el efecto de aplidina sobre los implantes metastásicos a nivel macroscópico, microscópico y molecular.
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Efecto de aplidina sobre los tumores primarios
La aplidina cambió el aspecto macroscópico del tumor primario NP9 en el sitio ORT. Los márgenes del tumor estaban muy bien definidos en el grupo ORT tratado, ya que no invadieron otros órganos del peritoneo, haciendo su disección fácil. Por el contrario, los tumores en animales ORT control invadieron el bazo y la pared del peritoneo. Después del tratamiento de aplidina el tamaño o aspecto macroscópico del tumor primario NP18 no cambió significativamente, comparado con su control.
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Efecto sobre el peso del tumor
Una vez que se extirparon los tumores primarios se analizó el efecto de la aplidina sobre el peso del tumor. Al final del periodo de tratamiento, no había diferencias significativas en el peso total o sólido del tumor entre el grupo tratado con aplidina y control en ambos tumores en cualquier sitio. Los pesos finales de los tumores se describen en la tabla 1
2
Análisis histopatológico
En el modelo NP18, se observó un nivel significativamente mayor de necrosis en los tumores ORT tratados que en los ORT controles. Además, las fibras cicatriciales llenaban el espacio dejado por las extensas áreas de células tumorales muertas, exclusivamente en los tumores ORT tratados. En el tumor NP9, los focos de células no viables/necróticas ocupaban el 75-100% de cada tumor. Por el contrario, la necrosis ocupaba sólo el 0-25% de cada tumor en tumores NP9 ORT control. Por lo tanto, la aplidina aumentó significativamente las áreas de necrosis microscópica tanto en los tumores primarios NP9 como en los NP18.
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Tinción nuclear con Hoescht
El análisis del tejido histológicamente viable, tanto en los tumores NP18 como en los NP9, tras la tinción nuclear con el colorante de Hoescht, reveló un aumento en la densidad de núcleos picnóticos con cromatina condensada y fragmentada en los tumores ORT tratados, que no se observaron en los tumores ORT control. Por lo tanto, la aplidina aumentó significativamente la apoptosis tanto en los tumores NP18 como en los NP9.
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Efecto de aplidina sobre los implantes peritoneales de NP9
Se probó el posible efecto antimetastásico de la aplidina sobre el tumor NP9 ORT ya que producía diseminación peritoneal temprana y masiva. En el grupo ORT control, se registraron más de 100 implantes (1-2 mm de diámetro) por animal, cuatro semanas después de la implantación.
Después de terminar el tratamiento de aplidina, que se inició antes de que la diseminación microscópicamente visible hubiera ocurrido, no se observaron implantes peritoneales en ningún animal. Además, la aplidina también inhibió el crecimiento de las metástasis cuando el tratamiento empezó una vez que eran macroscópicamente evidentes, ya que los animales en el grupo tratado tenían solo unos pocos implantes (7-20) y pequeños (menos de 1 mm de diámetro), mientras que los animales control presentaban más de 50 implantes, alcanzando 3-4 mm de diámetro. Por lo tanto, la aplidina anula completamente la diseminación peritoneal del tumor NP9 ORT implantado, y es capaz de inhibir el crecimiento de implantes metastásicos ya establecidos.
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Análisis patológico y molecular de metástasis de NP9 tratado
Se analizaron histopatológicamente los implantes visibles de forma macroscópica en animales tratados con aplidina y tratados con vehículo. A pesar del tamaño significativamente menor de los focos metastásicos en animales experimentales que en controles, las metástasis tratadas con aplidina no mostraron mayor muerte celular que las metástasis controles, al tiempo del análisis, ya que el tejido tumoral en ambos grupos era microscópicamente viable. La tinción nuclear con Hoescht mostró unos pocos (3-6) núcleos apoptóticos por implante tratado, pero no se observaron diferencias significativas entre metástasis tratadas con aplidina y control en número de núcleos apoptóticos. El análisis molecular reveló que el NP9 tratado con aplidina tenía una activación menor de ERK que las metástasis controles. No se observaron activación de caspasa-3 ni corte de PARP en metástasis tratadas. De esta manera, la inhibición del crecimiento en metástasis se asocia con una reducción en la activación de ERK.

Claims (7)

1. El uso de aplidina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero afectado por cáncer de páncreas para prevenir el riesgo de desarrollar tumores, para fomentar la regresión tumoral, para detener el crecimiento del tumor, y/o para prevenir metástasis.
2. El uso según la reivindicación 1, en donde el cáncer de páncreas es cáncer de páncreas metastásico.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en donde el mamífero afectado por el cáncer de páncreas es un ser humano.
4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cáncer de páncreas es resistente a otros tratamientos.
5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la aplidina se administra de forma simultánea o secuencial en combinación con otro fármaco.
6. El uso según la reivindicación 5, en donde el otro fármaco es un agente quimioterapéutico contra el cáncer.
7. Aplidina para su uso en el tratamiento de un mamífero afectado por cáncer de páncreas o para prevenir el riesgo de desarrollar tumores, para fomentar la regresión tumoral, para detener el crecimiento del tumor, y/o para prevenir metástasis.
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