NO342012B1 - Forbedrede antitumorale behandlinger - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til kombinasjoner av aplidin eller aplidin analoger med andre antitumor midler, og anvendelsen av disse kombinasjonene i behandlingen av cancer, spesielt i behandlingen av lunge cancer, bryst cancer, kolon cancer, prostata cancer, nyre cancer, melanom, multippel myelom, leukemi og lymfom.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til en synergistisk kombinasjon av aplidin med deksametason for behandling av multippel myelom.

Aplidin (dehydrodidemnin B) er et cyklisk depsipeptid som ble isolert fra den marine tunikaten fra middelhavet, Aplidium albicans, og det er emne av WO 9104985. Det er relatert til forbindelser kjent som didemniner, og har den følgende strukturen:

.OMe

N

N y

Me Ox \,i\Me

l O

NH

Mer informasjon om aplidin, aplidin analoger, dets anvendelser, formuleringer og syntese kan bli funnet i patentsøknader WO 99 42125, WO 01 35974, WO 01 76616, WO 02 30441, WO 02 02596, WO 03 33013 og WO 2004 080477.

I både prekliniske studier i dyr og kliniske fase I studier i mennesker har aplidin blitt vist å ha cytotoksisk potensiale mot et bredt spektrum av tumortyper, inkluderende leukemi og lymfom.Se for eksempel:

Faircloth, G. et al.: "Dehydrodidemnin B (DDB) a new marine derived anticancer agent with activity mot experimental tumour models", 9. NCI-EORTC Symp. New DrugsCancer Ther. (12-15 mars, Amsterdam) 1996, Abst 111;

Faircloth, G. et al.: "Preclinical characterization of aplidine, a new marine anticancer depsipeptide", Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1997, 38: Abst 692;

Depenbrock H, Peter R, Faircloth GT, Manzanares I, Jimeno J, Hanauske AR.: "In vitro activity of Aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explantedclonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells" Br. J. Cancer, 1998; 78: 739-744;

Faircloth G, Grant W, Nam S, Jimeno J, Manzanares I, Rinehart K.: "Scheduledependency of Aplidine, a marine depsipeptide with antitumor activity", Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1999; 40: 394;

Broggini M, Marchini S, D’Incalci M, Taraboletti G, Giavazzi R, Faircloth G, Jimeno J.: "Aplidine blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-R1 autocrine loop in a humanleukemic cell line", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;

Erba E, Bassano L, Di Liberti G, Muradore I, Chiorino G, Ubezio P, Vignati S, Codegoni A, Desiderio MA, Faircloth G, Jimeno J og D’Incalci M.: "Cell cycle phase perturbations and apoptosis in tumour cells induced by aplidine", Br. J. Cancer 2002; 86: 1510-1517;

Paz-Ares L, Anthony A, Pronk L, Twelves C, Alonso S, Cortes-Funes H, Celli N,Gomez C, Lopez-Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Kaye S.: "Phase I clinical andpharmacokinetic study of aplidine, a new marine didemnin, administered as 24-hourinfusion weekly" Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;

Raymond E, Ady-Vago N, Baudin E, Ribrag V, Faivre S, Lecot F, Wright T, LopezLazaro L, Guzman C, Jimeno J, Ducreux M, Le Chevalier T, Armand JP.: "A phase I and pharmacokinetic study of aplidine given as a 24-hour continuous infusion everyother week in patients with solid tumor and lymphoma", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4510;

Maroun J, Belanger K, Seymour L, Soulieres D, Charpentier D, Goel R, Stewart D, Tomiak E, Jimeno J, Matthews S. :"Phase I study of aplidine in a 5 day bolus q 3 weeks in patients with solid tumors and lymphomas", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509; Izquierdo MA, Bowman A, Martinez M, Cicchella B, Jimeno J, Guzman C, Germa J, Smyth J.: "Phase I trial of Aplidine given as a 1 hour intravenous weekly infusion in patients with advanced solid tumors and lymphoma", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509.

Mekanistiske studier indikerer at aplidin kan blokkere VEGF sekresjon i ALL-MOLT4celler og in vitro cytotoksisk aktivitet ved lave konsentrasjoner (5 nM) har blitt observert i AME og ALL prøver fra pediatriske pasienter med de novo eller tilbakefalt ALL og AME. Aplidin viser seg å indusere både en Gl og en G2 arrestering i medikament-behandlede leukemi celler in vitro. Bortsett fra nedregulering av VEGFreseptoren, er lite annet kjent omkring måten(e) for virkning av aplidin.

I fase I kliniske studier med aplidin ble L-kamitin gitt som en 24 timers prebehandlingeller ko-administrert for å hindre myelotoksisitet, se for eksempel WO 02 30441. Koadministrasjon av L-kamitin ble vist til å være i stand til å forbedre bedringen av denmedikament-induserte muskulære toksisiteten og har tillatt for dose eskalering avaplidin.

Tidligere har in vitro og in vivo tester utført med aplidin i kombinasjon med andre anticancer midler vist at de testede medikament kombinasjonene var nyttige i kombinasjonsterapi for behandlingen av leukemi og lymfom. I WO 2004/080421 ble aplidin spesifikt evaluert i kombinasjon med metotreksat, cytosin arabinosid, mitoksantron, vinblastin, metylprednisolon og doksorubicin for behandlingen av leukemi og lymfom.

US 2004/0010043 beskriver beskriver en fase I studie av aplidin gitt i forbindelse med en skjelettmuskelbeskytter, slik som L-kamitin for behandling av cancer.

WO 01/35974 beskriver også fase I kliniske studier av aplidin, hvor flere doser og protokoller for behandling av cancer er tilveiebrakt.

WO 03/033013 beskriver at flere in vzvo-analyser utført med aplidin var nyttige forbehandling av bukspyttkjertelcancer.

WO 2004/080477 beskriver at flere in v/Zrø-analyscr utført med aplidin indikerer atdette middelet kan være nyttig for behandling av multippel myelom.

Siden cancer er en ledende årsak for død hos dyr og mennesker har flere forsøk blitt foretatt, og foretas fortsatt for å oppnå en antitumor terapi aktiv og trygg å bli administrert til pasienter som lider fra en cancer. Problemet som skal bli løst ved den foreliggende oppfinnelsen er å forbedre antitumor terapier som er nyttig i behandlingen av cancer.

Vi har etablert at aplidin og aplidin analoger potensierer andre anticancer midler og kan derfor vellykket bli benyttet i kombinasjonsterapi for behandlingen av cancer. Denne oppfinnelsen er rettet til farmasøytiske sammensetninger, farmasøytiske doseringsformer, sett, fremgangsmåter for behandlingen av cancer ved å benytte disse kombinasjonsterapiene og anvendelser av aplidin og aplidin analoger i fremstillingen av et medikament for kombinasjonsterapi.

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse aplidin for behandling av multippel myelom ved kombinasjonsterapi ved å benytte aplidin i synergistisk kombinasjon med deksametason.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig 1 Et eksempel på lineær regresjonsanalyse med en metode for å vise nærværet av synergi.

Fig 2. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med paclitaxel (Taxol®) mot SKBR3 celler.

Fig 3. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med paclitaxel (Taxol®) mot MOLT3 celler.

Fig 4. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med paclitaxel (Taxol®) mot PC3 celler.

Fig 5. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med paclitaxel (Taxol®) mot HL60 celler.

Fig 6. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med paclitaxel (Taxol®) mot MX1 celler.

Fig 7. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med paclitaxel (Taxol®) mot A549 celler.

Fig 8. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med doxorubicin (DOX) mot A549 celler.

Fig 9. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med doxorubicin (DOX) mot HT29 celler.

Fig 10. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med doxorubicin (DOX) mot PC3 celler.

Fig 11. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med doxorubicin (DOX) mot MOLT3 celler.

Fig 12. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med doxorubicin (DOX) mot MX1 celler.

Fig 13. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med doxorubicin (DOX) mot SKBR3 celler.

Fig 14. In vitro aktivitetsdata av aplidin (AP, Aplidin®) i kombinasjon med cisplatin (DDP) mot MX1 celler.

Fig 15. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cisplatin (cisDDP) mot HT29 celler.

Fig 16. In vitro aktivitetsdata av aplidin (APE, Aplidin®) i kombinasjon med cisplatin (cisDDP, DDP) mot SKBR3 celler.

Fig 17. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cisplatin (cisDDP, DDP) mot MOLT3 celler.

Fig 18. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cisplatin (cisDDP, DDP) mot A549 celler.

Fig 19. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med arsenikk trioksid (TRI) mot A549 celler.

Fig 20. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med arsenikk trioksid (TRI) mot HT29 celler.

Fig 21. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med arsenikk trioksid (TRI) mot PC3 celler.

Fig 22. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med arsenikk trioksid (TRI) mot MOLT3 celler.

Fig 23. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med 5-fLuoruracil(5FU) mot HL60 celler.

Fig 24. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med 5-fIuoruracil(5FU) mot SKBR3 celler.

Fig 25. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med 5-fIuoruracil(5FU) mot A549 celler.

Fig 26. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med 5-fIuoruracil(5FU) mot PC3 celler.

Fig 27. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med 5-fIuoruracil(5FU) mot HT29 celler.

Fig 28. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cytosin arabinosid (AraC) mot SKBR3 celler.

Fig 29. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cytosin arabinosid (AraC) mot A549 celler.

Fig 30. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cytosin arabinosid (AraC) mot PC3 celler.

Fig 31. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cytosin arabinosid (AraC) mot HL60 celler.

Fig 32. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med cytosin arabinosid (AraC) mot HT29 celler.

Fig 33. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med karboplatin mot PC3 celler.

Fig 34. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med karboplatin mot HT29 celler.

Fig 35. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med karboplatin mot A549 celler.

Fig 36. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med karboplatin mot MOLT3 celler.

Fig 37. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med karboplatin mot MX1 celler.

Fig 38. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med SN-38 motA549 celler.

Fig 39. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med SN-38 motSKBR3 celler.

Fig 40. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med SN-38 motHL60 celler.

Fig 41. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med SN-38 mot PC3celler.

Fig. 42A og 42B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot HL-60 celler.

Fig. 43A og 43B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot K562 celler.

Fig. 44A og 44B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot MOLT-3 celler.

Fig. 45A og 45B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot MCI 16 celler.

Fig. 46A og 46B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot RAMOS celler.

Fig. 47A og 47B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot U937 celler.

Fig. 48A og 48B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot NCI-H929 celler.

Fig. 49A og 49B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot HUNS-1 celler.

Fig. 50A og 50B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot U266 Bl celler.

Fig. 51A og 51B. In vitro aktivitetsdata av aplidin (A, Aplidin®) i kombinasjon med

VP 16 (B) mot RPMI 8226 celler.

Fig. 52. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med karboplatin mot LOX-I-MVI celler.

Fig. 53. In vitro aktivitetsdata av aplidin (Aplidin®) i kombinasjon med karboplatin mot UACC-257 celler.

Fig. 54. Doserespons til aplidin etter (48 timers behandling) i MM1S, MM1R, U266 og U266-LR7 cellelinjer.

Fig. 55. Sammenligning av dose-virkeevne til aplidin (Aplidin®) og andremedikamenter på MM IS cellelinje (48 timers behandling).

Fig. 56. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og deksametason ved 3 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 57. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og deksametason ved 6 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 58. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og melfalan ved 3 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 59. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og melfalan ved 6 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 60. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og doxorubicin ved 3 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 61. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og doxorubicin ved 6 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 62. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og lenalidomid (Revlimid®) ved 3 dager.

A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 63. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og lenalidomid (Revlimid®) ved 6 dager.

A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 64. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og bortezomib ved 3 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 65. Kombinasjon av aplidin (Aplidin®) og bortezomib ved 6 dager. A) Dose effekt kurve. B) Fa-CI plott.

Fig. 66. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med dakarbazin i MRI-H-187melanom tumor xenografter.

Fig. 67. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med karboplatin i MRI-H-187melanom tumor xenografter.

Fig. 68. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med interleukin-2 (IL-2) i MRI-H187 melanom tumor xenografter.

Fig. 69. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med interferon-a 2a (INF-a) i MRIH-187 melanom tumor xenografter.

Fig. 70. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med dakarbazin (DTIC) i LOX-IMVImelanom tumor xenografter.

Fig. 71. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med karboplatin i LOX-IMVI melanomtumor xenografter.

Fig. 72. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL, Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med interleukin-2 (IL-2) iLOX-IMVI melanom tumor xenografter.

Fig. 73. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL, Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med interferon-a 2a (INF-a) iLOX-IMVI melanom tumor xenografter.

Fig. 74. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med bevacizumab (Avastin®) i CaKi-1nyre tumor xenografter.

Fig. 75. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med interleukin-2 (IL-2) i CaKi-1 nyretumor xenografter.

Fig. 76. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med interferon-a 2a (INF-a 2a) i CaKi-1nyre tumor xenografter.

Fig. 77. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med bevacizumab (Avastin®) i MRIH121 nyre tumor xenografter.

Fig. 78. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med interleukin-2 (IL-2) i MRI-H121nyre tumor xenografter.

Fig. 79. Kinetikker av netto tumor volum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med interferon-a 2a (INF-a) i MRI-H121nyre tumor xenografter.

Fig. 80. Kombinasjon av aplidin (A) + lenalidomid (Revlimid®; R) + deksametason (D) i MM IS etter 72 timers behandling. Aplidin doser er uttrykt i nM enheter, lenalidomid doser er uttrykt i pM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Fig. 81. Kombinasjon av aplidin (A) + bortezomib (B) + deksametason (D) i MM IS etter 72 timers behandling. Aplidin doser er uttrykt i nM enheter, bortezomib doser er uttrykt i nM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Fig. 82. Kombinasjon av aplidin (A) + bortezomib (B) + lenalidomid (Revlimid®; R) i MM IS etter 72 timers behandling. Aplidin doser er uttrykt i nM enheter, bortezomib doser er uttrykt i nM enheter og lenalidomid doser er uttrykt i pM enheter.

Fig. 83. Kombinasjon av aplidin (A) + talidomid (T) + deksametason (D) i MM IS etter 72 timers behandling. Aplidin doser er uttrykt i nM enheter, talidomid doser er uttrykt i pM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Fig. 84. Kombinasjon av aplidin (A) + melfalan (M) + deksametason (D) i MM IS etter 72 timers behandling. Aplidin doser er uttrykt i nM enheter, melfalan doser er uttrykt i pM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Fig. 85. Kombinasjon av aplidin (A) + melfalan (M) + bortezomib (B) i MM1S etter 72 timers behandling. Aplidin doser er uttrykt i nM enheter, melfalan doser er uttrykt i pM enheter og bortezomib doser er uttrykt i nM enheter.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Med "cancer" menes det å inkludere tumorer, neoplasier og ethvert annet malignt vev eller celler. Den foreliggende oppfinnelsen er rettet til anvendelsen av aplidin i kombinasjon for behandling av multippel myelom.

Selv om det ikke er omfattet av foreliggende oppfinnelse er det i tillegg beskrevet anvendelse av en aplidin analog i kombinasjon for behandlingene av cancer generelt, men mer foretrukket for behandlingen av lunge cancer, bryst cancer, kolon cancer, prostata cancer, nyre cancer, melanom, multippel myelom, leukemi og lymfom.

For å studere den mulige potensieringen av andre anticancer midler med aplidin initierte vi en systematisk studie av medikamentkombinasjoner for mulig anvendelse i de ovenfor nevnte cancer typene. Medikament kombinasjonsstudier ble utført på forskjellige typer av cellelinjer. In vitro studier ble utført ved å benytte tumor cellelinjer slik somNSCL A549, bryst karsinom MX1, promyelocytisk leukemi HL60, kolon adenokarsinom HT29, prostata adenokarsinom PC3, bryst adenokarsinom SKBR3 og akutt lymfoblastisk leukemi (MOLT3), som har forskjellig sensitivitet for aplidin (fra lav til høy). Ytterligere studier ble også utført med leukemier, lymfomer, multippel myelom og melanom cellelinjer. I tillegg ble in vivo studier ved å benytte melanom, nyre, myelom og lymfom xenografter benyttet for å etablere effekten av aplidin i kombinasjon med andre standard midler. Til slutt ble in vitro studier utført i multippel

myelom cellelinjer ved å benytte tredoble kombinasjoner, som er kombinasjon med aplidin med to ytterligere standard midler (et andre og et tredje medikament).

Selv om det ikke er omfattet av foreliggende oppfinnelse fant vi som en generell konklusjon at cytotoksisiteten av aplidin i tumorceller er sterkt forsterket i kombinasjon med mange av standard midlene benyttet for denne evalueringen. Den synergistiske hovedeffekten ble observert med kombinasjonen av aplidin med paclitaxel (Taxol®), doxorubicin, cisplatin, arsenikk trioksid, 5-fluoruracil (5-FU), cytosin arabinosid(AraC), karboplatin, 7-etyl-10-hydroksykamptotecin (SN38), etoposid (VP16),melfalan, deksametason cyklofosfamid, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomid (Revlimid®), interleukin-2 (IL-2), interferon-a 2 (INF- a), dakarbazin (DTIC),bevacizumab (Avastin®), idarubicin, talidomid og rituximab. I tillegg ble det også funnet at en forsterkning av cytotoksisiteten også ble oppnådd med tredoble kombinasjoner av aplidin med de ovenfor nevnte midlene.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med paclitaxel i behandlingen av cancer, og mer bestemt i behandlingen av en cancer valgt fra bryst cancer, leukemi og prostata cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med doxorubicin i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandling av en cancer valgt fra lunge cancer, kolon cancer, prostata cancer og multippel myelom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med cisplatin i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av en cancer valgt fra bryst cancer og kolon cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med arsenikk trioksid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av en cancer valgt fra lunge cancer, kolon cancer og prostata cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med 5-fluoruracil i behandlingen avcancer, og mer spesielt i behandlingen av en cancer valgt fra leukemi, lunge cancer, bryst cancer og prostata cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med cytosin arabinosid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av en cancer valgt fra lunge cancer, bryst cancer og prostata cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med karboplatin i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av en cancer valgt fra kolon cancer, prostata cancer og melanom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med SN38 i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av lunge cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med etoposid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av en cancer valgt fra lymfom og multippel myelom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med deksametason i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med lenalidomid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med bortezomib i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med dakarbazin i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av melanom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med bevacizumab i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av nyre cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med interleukin-2 i behandlingen avcancer, og mer spesielt i behandlingen av nyre cancer.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med melfalan i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med idarubicin i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av leukemi.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med rituximab i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av lymfom.

Spesielt foretrukket er kombinasjonen av aplidin med talidomid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er den tredoble kombinasjonen av aplidin med lenalidomid og deksametason i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er den tredoble kombinasjonen av aplidin med bortezomib og deksametason i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er den tredoble kombinasjonen av aplidin med bortezomib og lenalidomid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er den tredoble kombinasjonen av aplidin med bortezomib og talidomid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er den tredoble kombinasjonen av aplidin med deksametason og talidomid i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er den tredoble kombinasjonen av aplidin med deksametason og melfalan i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Spesielt foretrukket er den tredoble kombinasjonen av aplidin med melfalan og bortezomib i behandlingen av cancer, og mer spesielt i behandlingen av multippel myelom.

Sammensetningene av den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte alle komponentene (medikamentene) i en enkel farmasøytisk akseptabel formulering. Alternativt kan komponentene ble formulert separat og administrert i kombinasjon med hverandre. Ulike farmasøytisk akseptable formuleringer godt kjent for fagpersoner kan bli benyttet i den foreliggende oppfinnelsen. Valg av en hensiktsmessig formulering for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen kan bli utført rutinemessig ved fagpersoner basert på måten av administrasjon og løselighetsegenskapene av komponentene av sammensetningen.

Eksempler på farmasøytiske sammensetninger inneholdende aplidin eller en aplidin analog inkluderer flytende sammensetninger (løsninger, suspensjoner eller emulsjoner) egnet for intravenøs administrasjon, og de kan inneholde den rene forbindelsen eller i kombinasjon med enhver bærer eller andre farmakologisk aktive forbindelser. Oppløst aplidin viser vesentlig degradering under testforhold av varme og lysstress, og en lyofilisert doseringsform ble utviklet, se WO 99 42125.

Selv om det ikke er omfattet av foreliggende oppfinnelse er administrasjon av aplidin eller sammensetninger av den foreliggende oppfinnelsen basert på en doseringsprotokoll fortrinnsvis ved intravenøs infusjon. Vi foretrekker at infusjonstider av opptil 72 timer er benyttet, mer foretrukket 1 til 24 timer, hvor omkring 1, omkring 3 eller omkring 24 timer er mest foretrukket. Kortere infusjonstider som tillater behandling å bli utført uten opphold over natt på sykehus er spesielt ønskelig. Imidlertid kan infusjon være omkring 24 timer eller ennå lengre om nødvendig. Infusjon kan bli utført ved egnede intervaller med varierende mønstre, illustrativt en gang i uken, to ganger i uken, eller mer hyppig per uke, repetert hver uke eventuelt med mellomrom på vanligvis en eller flere uker.

Den korrekte doseringen av forbindelsene av kombinasjonen vil variere i henhold til den bestemte formuleringen, måten for anvendelse og det bestemte stedet, verten og tumoren som blir behandlet. Andre faktorer slik som alder, kroppsvekt, kjønn, diett, tid for administrasjon, hastighet for utskillelse, tilstand av verten, medikament kombinasjoner, reaksjonssensitiviteter og kraftighet av sykdommen skal bli tatt i betraktning. Administrasjon kan bli utført kontinuerlig eller periodisk med den maksimale tolererte dosen. Ytterligere retningslinjer for administrasjonen av aplidin er gitt i WO 01 35974.

I et aspekt er den foreliggende oppfinnelsen relatert til synergistiske kombinasjoner ved å benytte aplidin eller deksametason. Selv om det ikke er omfattet av foreliggende

oppfinnelse kan andre kombinasjoner også anvendes. En indikasjon på synergi kan lett bli oppnådd ved å teste kombinasjoner og analysere resultatene, for eksempel ved lineær regresjonsanalyse. Referanse er gjort til Figur 1 for å illustrere dette punktet. Alternative metoder slik som isobologram analyse er tilgjengelig for å vise synergisme og kan bli benyttet for de foreliggende formålene.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1. In vitro studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med et annet standard middel på tumor cellelinjer.

Aplidin som et enkelt middel eller i kombinasjon med valgte standard kjemoterapeutiske midler ble evaluert mot flere tumor cellelinjer for å måle forskjeller i cytotoksisitet.

De følgende standard midlene ble valgt som enkle midler og for kombinasjon med aplidin: paclitaxel (Taxol®), doxorubicin, cisplatin, arsenikk trioksid (Trisonex®), 5fluoruracil (5-FU), cytosin arabinosid (AraC), karboplatin og 7-etyl-10hydroksykamptotecin (SN38).

Det enkle middelet aplidin er cytotoksisk for flere cancer typer med varierende potens. Av denne årsaken ble representative tumor cellelinjer valgt som har en lav, middels eller høy sensitivitet for aplidin. Tumor cellelinjene som ble benyttet er listet opp i Tabell 1.

Tabell 1

Cancer type (cellelinje)

Sensitivitet for aplidin

NSCL (A549)

Lav

bryst karsinom (MX1)

Lav

promyelocytisk leukemi (HL60)

Middels

kolon adenokarsinom (HT29)

Middels

prostata adenokarsinom (PC3)

Middels

bryst adenokarsinom (SKBR3)

Høy

akutt lymfoblastisk leukemi (MOLT3)

Høy

Screeningen ble utført i to deler:

a. I det første settet av tester ble IC50 verdier bestemt for hver forbindelse etter 72 timers medikament eksponering i hver av tumor cellelinjene.

Alle cellelinjer ble opprettholdt i respektive dyrkningsmedier ved 37°C, 5% CO2 og 98% fuktighet. Alle mediumsformuleringer inneholdt ikke antibiotika. Dagen før utplating av celler ble alle kulturer gitt friskt fullstendig vekstmedium. På dagen for høsting (plating) ble celler tellt ved fargingsmetoden avtrypan blå eksklusjon (basal celle dyrkning). Celler ble høstet og sådd ut i 96-brønners mikrotiter plater ved 10,000 celler per brønn i 190 pkmedium og inkubert i 24 timer for å tillate cellene å feste seg før tilsetning av medikament. Celler ble behandlet med medikamentene og den cytotoksiske effekten ble målt ved MTS testen (tetrazolium), som er en kolorimetrisk metode for å bestemme antallet av levedyktige celler. Etter 72 timers inkubering med medikament ble 25 pL MTS+PMS løsning tilsatt til hver mikrotiter brønn og inkubert i 4 timer ved 37°C. Plater ble så fjernet fra inkubator og plassert på platerister i 5 minutter (dekket med aluminiumsfolie for beskyttelse fra lys). Optiske tettheter ble lest ved 490 nm på spektrofotometer plateleser. Data ble analysert ved å benytte SoftMax v 3.12 program.

IC50 ble kalkulert, som omtrentlig er ekvivalent til IG50 (konsentrasjon hvorved 50% vekst inhibering er målt). En regresjonskurve ved å benytte SoftMax program ble generert, og så ble 50% inhiberingskonsentrasjonen manuelt interpolert og omdannet den konsentrasjonen til molar (M) ved å dele på den molekylære vekten av forbindelsen. De individuelle IC50 verdiene (72 timers medikament eksponering) er vist i Tabell 2. IC50 verdiene representerer 100% av medikamentkonsentrasjonen.

Tabell 2

Cellelinje

Type

Medikament

IC50 (Molar)

A549

NS CL tumor

aplidin

3.6E-04

paclitaxel

1.3E-08

doxorubicin

1.3E-06

cisplatin

6.0E-06

arsenikk trioksid

4.2E-04

5-FU

1.4E-03

AraC

>1.0E-04

karboplatin

3.1E-04

SN38

1.3E-03

MX1

bryst adenokarsinom

aplidin

>1.0E-04

paclitaxel

9.4E-06

doxorubicin

>1.0E-04

cisp latin

1.7E-04

arsenikk trioksid

9.7E-05

5-FU

>1.0E-04

AraC

>1.0E-04

karboplatin

>1.0E-04

SN38

1.5E-07

HL60

promyelocytisk leukemi

aplidin

3.0E-09

paclitaxel

1.6E-08

doxorubicin

>1.0E-04

cisplatin

1.2E-05

arsenikk trioksid

2.0E-05

5-FU

1.2E-03

AraC

1.0E-05

karboplatin

5.6E-05

SN38

<1.0E-06

HT29

kolon adenokarsinom

aplidin

>1.0E-04

paclitaxel

5.0E-09

doxorubicin

>1.0E-04

cisplatin

7.2E-04

arsenikk trioksid

8.0E-05

5-FU

8.8E-04

AraC

>1.0E-04

karboplatin

2.6E-04

SN38

1.2E-07

PC3

prostata tumor

aplidin

7.8E-08

paclitaxel

Not determined

doxorubicin

1.1E-05

cisplatin

8.7E-05

arsenikk trioksid

1.2E-03

5-FU

2.2E-04

AraC

>1.0E-04

karboplatin

>1.0E-04

SN38

4.6E-05

SKBR3

bryst adenokarsinom

aplidin

2.0E-09

paclitaxel

>1.0E-04

doxorubicin

2.9E-07

cisplatin

7.0E-06

arsenikk trioksid

1.0E-04

5-FU

1.8E-05E

AraC

>1.0E-04

karboplatin

5.2E-05

SN38

<1.0E-ll

MOLT3

akutt lymfoblastisk leukemi

aplidin

4.9E-14

paclitaxel

7.7E-05

doxorubicin

6.9E-09

cisplatin

5.7E-07

arsenikk trioksid

3.7E-06

5-FU

1.1E-05

AraC

2.2E-07

karboplatin

4.0E-06

SN38

1.0E-06

b. I et andre sett av tester ble hver cellelinje inkubert med aplidin i kombinasjon med hvert av standard midlene nevnt ovenfor i de følgende kombinasjonene av unike IC50 konsentrasjoner:

IC50 av aplidin

IC50 av standard middel

100%

0%

75%

25%

60%

40%

50%

50%

40%

60%

30%

70%

25%

75%

0%

100%

0%

0%

Mikrotiter platene ble inkubert i 72 timer ved 5% CO2 og 37°C. Den cytotoksiske effekten ble målt ved MTS test. Optiske tettheter ble lest ved 490 nm. Normaliserte data ble plottet og fortolket som beskrevet. Data ble analysert som:

1. Prism (Graphpad) programvare ble benyttet for å normalisere dataene til kontrollverdier (100% = cellevekst i fråværet av middel (medikament); 0% = blank kontroll).

2. Data normalisert ble plottet som punkt tegninger. En linje ble trukket som forbinder verdiene av 100% IC50 for hvert middel (medikament). Verdier signifikant over linjen indikerte antagonisme, under indikerte synergisme, og på linjen indikerte additivitet.

Statistisk behandling av data fulgte Laska E. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 ogGreco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. Kombinasjoner ved testededoseforhold ble bedømt til å være synergistiske under inhibering av celle proliferasjon som overskred maksimale inhiberingsverdier for hvert medikament separat (ved 100% IC50). Motsatt ble antagonisme konkludert når inhibering var lavere enn begge maksimumsverdier. Additivitet ble konkludert når effektene av kombinasjoner ikke var signifikant forskjellig fra maksimums verdiene for begge medikamenter. Statistisk signifikans ble bestemt ved å utføre en students t-test på inhiberingen ved hvertdoseforhold versus inhiberingen ved maksimum for hvert medikament. Total signifikans av medikament kombinasjoner for hver cellelinje var avhengig av å vise statistisk signifikans for mer enn 50% av doseforhold.

Som en visuell hjelp ble responsverdier plottet på et punkt diagram med doseforhold gitt på x-aksen og % responsverdier på y-aksen. En horisontal linje ble trukket mellom de toende responsverdiene (for eksempel mellom responsverdiene for 100% IC50 aplidin og 100% IC50 standard kjemoterapeutisk middel). I tilfeller hvor responsverdier ved de to endepunktene var omtrentlig like, kan punkter som ligger over eller under denne beregnede linjen av additivitet bli fortolket som å representere henholdsvis antagonistisk eller synergistisk medikament interaksjon.

In vitro kombinasjonene av hvert medikament med aplidin har potensiale til å være synergistiske, additive eller antagonistiske. Synergistisk cytotoksisitet til tumorceller er en optimal effekt og innebærer at kombinasjonen av aplidin med et annet medikament er mer effektiv enn hvert medikament alene.

I henhold til denne testen ble det funnet at:

a. Kombinasjonen aplidin med paclitaxel viste synergisme i bryst adenokarsinom SKBR3 celler (Figur 2), akutte lymfoblastiske leukemi MOLT3 celler (Figur 3) og prostata adenokarsinom PC3 celler (Figur 4). Trend mot additivitet ble observert i promyelocytisk leukemi HL60 celler (Figur 5), bryst karsinom MX1 celler (Figur 6) og NSCL A549 celler (Figur 7).

b. Kombinasjonen av aplidin med doxorubicin viste synergisme i NSCL A549 celler (Figur 8), kolon adenokarsinom HT29 celler (Figur 9) og prostata adenokarsinom PC3 celler (Figur 10). Additivitet ble observert i akutt lymfoblastisk leukemi MOLT3 celler (Figur 11), bryst karsinom MX1 celler (Figur 12) og bryst adenokarsinom SKBR3 celler (Figur 13).

c. Kombinasjonen av aplidin med cisplatin viste synergisme i bryst karsinom MX1 celler (Figur 14) og kolon adenokarsinom HT29 celler (Figur 15). Additivitet ble observert i bryst adenokarsinom SKBR3 celler (Figur 16) og akutt lymfoblastisk leukemi MOLT3 celler (Figur 17) og i NSCL A549 celler (Figur 18) ble trender mot synergisme funnet.

d. Kombinasjonen av aplidin med arsenikk trioksid viste synergisme i NSCL A549 celler (Figur 19), kolon adenokarsinom HT29 celler (Figur 20) og prostata adenokarsinom PC3 celler (Figur 21). Additivitet ble observert i akutt lymfoblastisk leukemi MOLT3 celler (Figur 22).

e. Kombinasjonen av aplidin med 5-fluoruracil viste synergisme i promyelocytiskleukemi HL60 celler (Figur 23), bryst adenokarsinom SKBR3 celler (Figur 24), NSCL A549 celler (Figur 25) og prostata adenokarsinom PC3 celler (Figur 26). Additivitet ble observert i kolon adenokarsinom HT29 celler (Figur 27).

f. Kombinasjonen av aplidin med cytosin arabinosid viste synergisme i bryst adenokarsinom SKBR3 celler (Figur 28), NSCL bryst A549 celler (Figur 29) og prostata adenokarsinom PC3 celler (Figur 30). Additivitet ble funnet i promyelocytisk leukemi HL60 celler (Figur 31) og kolon adenokarsinom HT29 celler (Figur 32).

g. Kombinasjonen av aplidin med karboplatin viste synergisme i prostata adenokarsinom PC3 celler (Figur 33) og kolon adenokarsinom HT29 celler (Figur 34).

Additivitet ble observert i NSCL A549 celler (Figur 35), akutt lymfoblastisk leukemi MOLT3 celler (Figur 36) og bryst karsinom MX1 celler (Figur 37).

h. Kombinasjonen av aplidin med SN38 viste synergisme i NSCL A549 celler (Figur 38). Additivitet ble observert i bryst adenokarsinom SKBR3 celler (Figur 39), promyelocytisk leukemi HL60 celler (Figur 40) og prostata adenokarsinom PC3 celler (Figur 41).

Eksempel 2. In vitro studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med et annet standard middel på leukemi, lymfom, multippel myelom og melanom tumor cellelinjer.

Etter den samme prosedyren som angitt i Eksempel 1 ble aplidin som et enkelt middel eller i kombinasjon med valgte standard kjemoterapeutiske midler evaluert mot flere tumor cellelinjer for å måle forskjeller i cytotoksisitet.

De følgende standard midlene ble valgt som enkle midler og for kombinasjon med aplidin: etoposid (VP 16) og karboplatin. Tumor cellelinjene valgt for denne testen er vist i Tabell 3.

Tabell 3

Cellelinje

Tumor type

HL-60

Leukemi

K562

Leukemi

MOLT-3

Leukemi

H9

Lymfom

HUT78

Lymfom

MC116

Lymfom

RAMOS

Lymfom

U937

Lymfom

NCI-H929

Multippel myelom

HUNS-1

Multippel myelom

U266B-1

Multippel myelom

RPMI 8226

Multippel myelom

LOXIMVI

Melanom

UACC-257

Melanom

Celle dyrkning metode

Alle cellelinjer ble opprettholdt i respektive dyrkningsmedier ved 37°C, 5% CO2 og 98% fuktighet. Alle mediumsformuleringer inneholdt ikke antibiotika. Dagen før utplating av celler ble alle kulturer gitt friskt fullstendig dyrkningsmedium. På dagen for høsting (plating) ble celler telt ved fargingsmetoden av trypan blå eksklusjon.

Celle plating

Celler ble høstet og sådd ut i 96-brønners mikrotiter plater ved 15,000 celler per brønn i190 pl medium og inkubert i 24 timer for å tillate cellene å feste seg før medikament tilsetning.

Medikament behandling

Stam løsning av aplidin ble preparert i 100% DMSO ved 5 mg/ml. Stam løsninger av kjemoterapeutiske midler VP 16 og karboplatin ble preparert i 100% DMSO ved konsentrasjonen 2 mg/ml for begge medikamenter.

Celler ble behandlet med aplidin og det andre standard middelet ved området som listet nedenfor, og individuell medikamentkonsentrasjon ble laget i triplikater per plate. Konsentrasjonen av de testede midlene benyttet er uttrykt som en prosent av de individuelle midlenes IC50, som ble bestemt som i Eksempel 1.

IC50 av aplidin

IC50 av standard middel

100%

0%

75%

25%

60%

40%

50%

50%

40%

60%

30%

70%

25%

75%

0%

100%

De individuelle IC50 verdiene for hvert middel for hver cellelinje er vist i Tabell 4.

Tabell 4

Medikament

Cellelinje

IC50 (molar)

Aplidin

HL-60

8.0E-12

K562

2.0E-10

MOLT-3

3.2E-14

H9

4.8E-14

HUT78

10E-15

MCI 16

5.5E-10

RAMOS

5.0E-09

U937

4.4E-13

U266B-1

5.9E-12

RPMI 8226

1.4E-14

HUNS-1

3.4E-14

NCI-H929

5.2E-13

LOXIMVI

3.5E-09

UACC-257

4.8E-10

VP16

HL-60

2.0E-06

K562

7.6E-06

MOLT-3

2.4E-08

H9

7.3E-07

HUT78

1.4E-06

MCI 16

2.3E-07

RAMOS

1.1E-07

U937

4.4E-07

U266B-1

5.9E-06

RPMI 8226

3.7E-07

HUNS-1

3.1E-06

NCI-H929

2.4E-06

Karbop latin

LOXIMVI

1.2E-04

UACC-257

1.7E-04

5 Den cytotoksiske effekten ble målt ved MTS testen (tetrazolium), som er en kolorimetrisk metode for å bestemme antallet av levedyktige celler.

Etter 72 timers inkubering med testede midler ble 25 gl av MTS+PMS løsning tilsatt til hver mikrotiter brønn og inkubert i 4 timer ved 37°C. Plater ble så fjernet fra inkubator og plassert på platerister i 5 minutter (dekket med aluminiumsfolie for beskyttelse fra lys). Optiske tettheter ble lest ved 490 nm på spektrofotometer plateleser. Data ble analysert som:

1. Prism (Graphpad) programvare ble benyttet for å normalisere dataene til kontrollverdier (100% = cellevekst i fravær av middel (medikament); 0% = blank kontroll).

2. Data normalisert ble plottet som punkt diagrammer. En linje ble trukket som forbinder verdiene av 100% IC50 for hvert middel (medikament). Verdier signifikant over linjen indikerte antagonisme, under indikerte synergi og på linjen indikerte additivitet.

Statistisk behandling av data fulgte Laska E. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 ogGreco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. Kombinasjoner ved testededoseforhold ble bedømt til å være synergistiske når inhibering av celle proliferasjon overskred maksimale inhiberingsverdier for hvert medikament separat (ved 100% IC50). I motsetning ble antagonisme konkludert når inhibering var lavere enn begge maksimumsverdier. Additivitet ble konkludert når effektene av kombinasjoner ikke var signifikant forskjellig fra maksimumsverdiene for begge medikamenter. Statistisk signifikant ble bestemt ved å utføre en students t-test på inhiberingen ved hvertdoseforhold versus inhiberingen ved maksimumsverdien for hvert medikament. Total signifikans av medikament kombinasjoner for hver cellelinje var avhengig av å vise statistisk signifikans for mer enn 50% av doseforhold.

Som en visuell hjelp ble responsverdier plottet på et punktdiagram med doseforhold gitt på x-aksen og % responsverdier på y-aksen. En horisontal linje ble trukket mellom de toendepunkt responsverdiene (for eksempel mellom responsverdiene for 100% IC50 aplidin og 100% IC50 standard kjemoterapeutisk middel). I tilfeller hvor responsverdier av de to endepunktene var omtrentlig like, kan punkter som ligger over eller under denne beregnede linjen av additivitet bli fortolket som å representere henholdsvis antagonistisk eller synergistisk medikament interaksjon.

I Figur 42A og 42B er det vist in vitro aktivitetsdataene for aplidin i kombinasjon med VP 16 mot HL-60 celler. I henhold til disse dataene er additiv effekt oppnådd.

I Figur 43A og 43B er det vist in vitro aktivitetsdataene for aplidin i kombinasjon med VP 16 mot K562 celler. I henhold til disse dataene er additivitet oppnådd.

I Figur 44A og 44B er det vist in vitro aktivitetsdataene for aplidin i kombinasjon med VP 16 mot MOLT-3 celler. I henhold til disse dataene er additivitet oppnådd.

I Figur 45A og 45B er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med VP 16 mot MCI 16 celler. I henhold til disse dataene er additivitet oppnådd i denne tumor cellelinjen.

I Figur 46A og 46B er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med VP 16 mot RAMOS celler. I henhold til disse dataene er synergisme oppnådd i denne tumor cellelinjen.

I Figur 47A og 47B er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med VP 16 mot U937 celler. I henhold til disse dataene er additivitet oppnådd.

I Figur 48A og 48B er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med VP 16 mot NCI-H929 celler. I henhold til disse dataene er synergismeoppnådd.

I Figur 49A og 49B er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med VP 16 mot HUNS-1 celler. I henhold til disse dataene er additivitetoppnådd i denne tumor cellelinjen.

I Figur 50A og 50B er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med VP 16 mot U266B-1 celler. I henhold til disse dataene er additivitetoppnådd i denne tumor cellelinjen.

I Figur 51A og 5 IB er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med VP 16 mot RPMI 8226 celler. I henhold til disse dataene er additivitet oppnådd i denne tumor cellelinjen.

I Figur 52 er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med karboplatin mot LOX-I-MVI celler. I henhold til disse dataene er additivitet oppnådd idenne tumor cellelinjen.

I Figur 53 er det vist in vitro aktivitetsdataene observert med aplidin i kombinasjon med karboplatin mot UACC-257 celler. I henhold til disse dataene er synergisme oppnådd idenne tumor cellelinjen.

Eksempel 3: In vitro studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med andre standard midler på multippel myelom tumor cellelinjer.

Multippel myelom (MM) er en malign sykdom av plasmaceller, generelt oppstående fra en klon av plasmaceller som prolifererer og akkumulerer i benmargen. Kliniskpatologiske trekk av pasienter med myelom inkluderer akkumulering av monoklonalt protein i blod eller urin, lytiske ben lesjoner, anemi og nyre dysfunksjon (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87).

Aktuell behandling for myelom beror på høy dose terapi støttet ved stamcelle transplantasjon. Til tross for fremskrittene i det siste tiåret er fortsatt MM en ikkekurerbar sykdom med en median total overlevelse for pasienter på 2 til 5 år (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87). Nye behandlingsmetoder er nødvendig for å forbedrepasientresultat ved å følge tre hovedlinjer av undersøkelse: a) forsterkning av virkeevnen av kjemoterapi igjennom anvendelsen av høy dose; b) forsterkning av verts immunresponsen mot myelom celler; og c) utvikling av nye medikamenter med mer spesifikke mål som kan interferere ikke bare med myelom celler, men også benmargs mikroomgivelsene (San Miguel JF et al. Curr. Treat. Options Oncol. (2003) 4: 247-58).Forhåpentligvis vil kombinasjonen av to eller flere av disse terapeutiske midlene føre til en forbedret anti-MM virkeevne og lengre overlevelsesrater.

Hermed rapporterer vi flere studier på effekten av aplidin som et nytt medikament i behandlingen av multippel myelom. Disse studiene inkluderer:

1) cytotoksisk virkeevne av aplidin (alene eller i kombinasjon) på flere MM cellelinjer ved å benytte celle viabilitet (MTT test) og apoptose (annexin V farging) tester.

2) cytotoksisk virkeevne av kombinasjoner av aplidin og andre klassiske og nylig utviklede medikamenter i behandling av denne sykdommen.

Materialer og fremganssmåter

Cellelinjer og celledyrknings reagenser

Fire MM-deriverte cellelinjer ble benyttet i denne studien: de deksametason-sensitive(MM.IS) og deksametason-resistente (MM.IR) variantene av den humane multippelmyelom cellelinjen MM.l (Greenstein S. et al. Exp. Hematol (2003) 31:.271-82) somvennlig ble tilveiebrakt ved Dr. S Rudikoff, Bethesda MD; og U266 og dens melfalanresistente motstykke U266 LR7 cellelinjene ble oppnådd fra Dr. W. Dalton, Tampa, FL. Alle MM cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum, 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin og 2 mM Lglutamin. Alle celledyrkningsmedier og reagenser ble innkjøpt fra Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Celle viabilitetstester

Analysen av MM celle proliferasjon ble bestemt ved å benytte metyltiotetrazol (MTT; Sigma, St. Louis MO) kolorimetrisk test. MM cellelinjer ble sådd ut ved en tetthet på 50000 celler/200 pl medium per brønn i 48-brønners plater, og behandlet med enbestemt medikamentdose og tid. To timer før slutten av behandlingen ble en MTT løsning (5 mg/ml i PBS; vanligvis 10% av volumet i hver brønn) tilsatt og tetrazolium saltet ble redusert ved metabolsk aktive celler til fargede formazan krystaller. Etter oppløsning av disse krystallene ved over natt inkubering med 10% SDS-HC1 løsning,ble absorbans målt ved 570 nm med korreksjon ved 630 nm. Fire brønner ble analysert for hver tilstand, og resultatene er presentert som middelverdien ± SD for kvadruplikater av et representativt eksperiment som ble repetert minst tre ganger.

Western blot

Cellene ble samlet og vasket med PBS, og totale celle lysater ble oppnådd etter inkubering i iskald lysis buffer (140 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% glyserol, 1% Nonidet P-40, 20 mM Tris (pH 7.0), 1 pM pepstatin, 1 pg/ml aprotinin, 1 pg/mlleupeptin, 1 mM natrium ortovanadat). Prøver ble så sentrifugert ved 10,000 g ved 4°C i 10 min og like mengder av protein i supematanter ble løst opp ved 6% - 12.5% SDSPAGE. Proteiner ble så overført på nitrocellulose eller PVDF membraner, blokkert ved inkubering i 5% fettfri tørrmelk i PBST buffer (0.05% -Tween 20 i PBS) og deretterinkubert med det spesifikke primære antistoffet [anti-p-c-jun, anti-p-Erkl/2 og anti

Erk5 antistoffene ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA), imens anti-p-p38 ble oppnådd fra Cell Signaling (Danvers, MA) og anti-PARP antistoffet fraBecton Dickinson Biosciences (Bedford, MA)]. Etter en andre inkubering med det korresponderende sekundære antistoffet ble immunoblot fremkalt ved forsterket kjemilunescens (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL). Identifisering av aktivert JNK og Erk5 krevde tidligere immunpresipitering av protein lysater med de korresponderende spesifikke antistoffene og protein A sefarose.

Isobologram analyse

Interaksjonen mellom aplidin og andre anti-MM midler ble analysert ved å benytteCalcusyn programvaren (Biosoft, Ferguson, MO). Data fra celle viabilitetstest (MTT) ble uttrykt som fraksjonen av celler påvirket ved dosen (Fa) i medikament-behandledeceller sammenlignet med ubehandlede celler (kontroll). Dette programmet er basert på Chou-Talalay metoden(Chou TC et al. Adv. Enzyme Regul. (1984) 22: 27-55) ihenhold til den følgende ligningen Cl = (D)l/(Dx)l + (D)l(D)2/(Dx)l(Dx)2 hvor (D)l og (D)2 er dosene av medikament 1 og 2 som har den samme x effekten når benyttet alene. Cl verdier mindre enn 1.0 indikerer synergisme, Cl verdier =1.0 indikerer en additiv effekt, imens verdier mer enn 1 korresponderer til antagonistisk effekt.

Resultater

Doserespons til aplidin i MM-deriverte cellelinjer

Vi bestemte først hvorvidt aplidin påvirker celle viabilitet ved å benytte MTT testen på MM-deriverte cellelinjer både sensitive og resistente for konvensjonelleterapimedikamenter. Som sett i figur 54 induserer aplidin behandling i 48 timer en lignende reduksjon i celle viabilitet på en dose-avhengig måte i alle cellelinjer testet.Femti prosent reduksjon i levedyktige celler (IC50) etter 48 timers behandling var innenfor 1-10 nM området for de fire cellelinjene testet.

Virkeevnen av aplidin ble også sammenlignet med andre klassiske (melfalan, deksametason) og nye medikamenter (bortezomib) i behandlingen av MM. Figur 55 viser overlegen potens av aplidin sammenlignet med de andre medikamentene når testet ved 0.1-1 nM doser i 48 timer på MM. IS cellelinje; dets effekt var lignende den avbortexomib ved maksimale doser (10-100 nM).

Evaluering av synergisme i doble kombinasjoner av aplidin

Siden kontinuerlig eksponering for MM kjemoterapi i mange tilfeller er assosiert med økt toksisitet og utvikling av the novo medikament resistens, testet vi hvorvidt kombinasjonen av minimale toksiske konsentrasjoner av aplidin og andre medikamenter vil påvirke MM celle viabilitet. Spesifikt ble aplidin kombinert med klassiske medikamenter i behandlingen av MM (slik som deksametason eller melfalan), også med nylig utviklede anti-myelom midler (bortezomib), og med medikamenter som spesifiktvil målsøke benmargs mikroomgivelsene (lenalidomid (Revlimid®)).

Tidsforløp eksperimentene ved dager 1, 2, 3 og 6 ble også utført for de nevnte terapeutiske midlene for å bestemme de hensiktsmessige suboptimale dosene (10% til 30% vekst inhibering) for kombinasjonsmessige eksperimenter så vel som for å undersøke varigheten av behandlingene. Kombinasjonseksperimenter for aplidin og resten av medikamentene ble utført etter inkubering i 3 dager eller 6 dager. Cellevekst av MM.IS cellelinje ble målt ved MTT test som beskrevet ovenfor, og prosentandelene av inhibering ble analysert ved CalcuSyn programmet. Computer-kalkulertekombinasjonsindeksen (Cl) ble benyttet for å bedømme resultatene av en kombinasjon: CI>1, CI=1, og CKl indikerer henholdsvis antagonisme, additive og synergistiske effekter. Overensstemmelsen av data til det mediane-effekt prinsippet kan enkelt blimanifestert ved den lineære korrelasjonskoeffisienten (r) eller det mediane-effektplottet: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), hvor D er dosen, Dm er dosen nødvendigfor en 50% effekt, fa er fraksjonen påvirket ved dose, fu er den upåvirkede fraksjonen, og m er en koeffisient for sigmoiditeten av dose-effekt kurven. For hver doblekombinasjon ble en ikke-konstant forholdskombinasjon benyttet. Hvert eksperiment blerepetert tre ganger, og et minimum av tre datapunkter for hvert enkle medikament og tre kombinasjoner ble utført.

Kombinasjon av aplidin med deksametason

Ved dag 3 ble en synergisme observert for 0.5 nM aplidin/1 nM og 10 nM deksametason kombinasjoner (Figur 56).

Som illustrert i figur 57 var kombinasjonen mer synergistisk ved 6 dager.

Kombinasjon av aplidin med melfalan

De følgende kombinasjonene viste nesten additive effekter ved 3 og 6 dager (henholdsvis Figur 58 og 59).

Kombinasjon av aplidin med doxorubicin

Ved 3 dager var bare en kombinasjon moderat synergistisk (Figur 60, kombinasjon 1) og to kombinasjoner var additive (Figur 60, kombinasjoner 3 og 4).

Ved 6 dager var bare to kombinasjoner additive (Figur 61, kombinasjon 7 og 8).

Kombinasjon av aplidin med lenalidomid (Revlimid®)

I den foreliggende studien viste kombinasjonen av aplidin og lenalidomid (Revlimid®) større grader av synergisme enn alle andre kombinasjoner undersøkt (Figur 62).

Bemerkelsesverdig var synergismen mer viktig ved 6 dager (Figur 63).

Kombinasjon av aplidin med bortezomib

Denne kombinasjonen viste antagonisme ved 3 dager (Figur 64); og ved 6 dager ble synergisme funnet for to kombinasjoner (Figur 65, kombinasjon 4 og 6).

Eksempel 4: In vivo studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med andre standard midler i melanom og nyre xenografter.

Formål av denne studien var å evaluere antitumor aktiviteten av aplidin når administrert med et antitumoralt standard middel, begge administrert ved å benytte multippel doseringsplan i flere typer av tumor xenografter i atymiske hunnmus.

Atymiske naken hunnmus ble mottatt fra Harlan Sprague Dawley, Madison, Wisconsin ved 4-5 ukers alder. Mus ble akklimatisert til laboratoriet i minst en uke førimplantering av tumor. Dyr ble holdt i statiske bur med mat og vann tillatt ad libitum. Eksperimentelle dyr ble implantert enten med tumor fragmenter derivert fra transplantasjonsetablerte humane tumorer eller med celler oppnådd direkte fra in vitro kultur. Tumorer ble implantert subkutant i den høyre siden på dag 0.

Målinger av tumorstørrelse ble registrert to ganger ukentlig startende på dag 4 eller 5 ved å benytte vemier kalibreringsmål. Formelen for å evaluere volum for en prolat ellipsoide ble benyttet for å estimere tumorvolum fra 2-dimensjonale tumor målinger:tumorvolum (mm3) = (lengde x bredde2) 2. Ved å anta enhetstetthet ble volum omdannet til vekt (det vil si 1 mm3 = 1 mg). Når tumorer nådde et omtrentlig volumsområde på 100 ± 15 mg, ble mus randomisert til behandling og kontrollgrupper. Behandlinger ble initiert og administrert på en basis av individuell kroppsvekt. En søkende studie for doseområde ble utført på hver tumor modell for å bestemme det hensiktsmessige dosenivåen for hver forbindelse benyttet i kombinasjonsstudiene.

Den følgende standarden av behandlende midler for de ulike cancer typene (indikasjonene) ble kombinert med aplidin (APE) for å bestemme om kombinasjonsterapien vil tilveiebringe en større antitumor aktivitet når sammenlignet med den kombinerte aktiviteten av de to midlene administrert som monoterapier.

Indikasjon

Tumor modell

Forbindelser

Melanom

LOX-IMVI

APE + Karboplatin

APE + Interleukin-2 (IL-2)

APE + Interferon-a 2a (INF-a)

APE + Dakarbazin (DTIC)

MRI-H187

APE + Karboplatin

APE + Interleukin-2 (IL-2)

APE + Interferon-a 2a (INF-a)

APE + Dakarbazin (DTIC)

Nyre

CaKi-1

APE + Interleukin-2 (IL-2)

APE + Interferon-a 2a (INF-a)

APE + Bevacizumab (Avastin®)

MRI-H121

APE + Interleukin-2 (IL-2)

APE + Interferon-a 2a (INF-a)

APE + Bevacizumab (Avastin®)

Tabeller 5-10 viser kinetikken av netto tumorvolum (middelverdi ± S.E.M., mg) etterinitiering av behandling med aplidin enten alene eller i kombinasjon med en standard av behandlende middel i melanom og nyre cancer xenografter.

Tabell 5 og figur 66 og 67 viser kinetikk av netto tumorvolum etter initiering av behandling med aplidin (Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med DTIC og karboplatin i MRI-H187 melanom tumor xenografter. Aplidin ble administrert hver dagi 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, saltkontroll (sterilt salt) hver dag i

5 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjo, DTIC hver dag i 5 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon og karboplatin ved dose hver 4 dag for en total på 4 behandlinger ved intraperitoneal injeksjon.

Tabell 5

Medikament

Dose/ dag

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 20

DAG 24

DAG 27

DAG 31

DAG 34

Salt kontroll

—

139+13

221+41

292 ± 47

420 + 71

571±111

Aplidin

50 pg/kg

141 ± 12

265 ± 72

317 + 64

442 + 81

601±116

DTIC

40 mg/kg

148+14

264 ± 60

377 ± 98

558 +

681±187

Karboplatin

25 mg/kg

143 + 13

213 + 32

301+50

398 ± 76

540 ± 99

Aplidin + DTIC

50 pg/kg + 40 mg/kg

145 + 11

257 + 51

311+52

476 +

632+ 150

Aplidin + karboplatin

50 pg/kg + 25 mg/kg

145 + 14

201+46

262 ± 55

339 + 76

443 ±104

io S.E.M.=Standard feil av middelverdien

Tabell 5 (fortsettelse)

Medikament

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 38

DAG 41

DAG 46

DAG 49

DAG 52

DAG 55

Salt kontroll

702+ 110

820+ 141

1270 +

1499 +

1629 +

1848 +

Aplidin

813 + 121

934+ 156

1295 +

1445 +

1649 +

1767 +

DTIC

927 ± 274

1182 +

1508 +

1804 +

2036 +

2123 +

Karboplatin

793 + 132

917+138

1303 +

1447 +

1603 +

1989 +

Aplidin + DTIC

723 ±126

855 + 133

1028 +

1101 ±

1358 +

1397 +

Aplidin + karboplatin

608±129

617±146

622±105

720 ±

796 ±145

867±164

Tabell 5 (fortsettelse)

Medikament

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 59

DAG 62

DAG 66

Salt kontroll

2049 ±

2100 ±

2263 ±

Aplidin

2113±

2423 ±

2561 ±

DTIC

2166 ±

2333 ±

2508 ±

Karboplatin

2292 ±

2659 ±

2723 ±

Aplidin + DTIC

1585 ±

1571 ±

1879 ±

Aplidin + karboplatin

1070 ±

1153±

1430 ±

Fra denne xenograft studien ble det konkludert at i melanom MRI-H187 celler viserkombinasjonen av aplidin med DTIC og aplidin med karboplatin en tydelig statistisk signifikant potensiering av antitumor aktivitet, som er mer bemerkelsesverdig i tilfellet av kombinasjonen med karboplatin.

Tabell 6 og figur 68 og 69 viser kinetikk av netto tumorvolum etter initiering av behandling med aplidin (Aplidin®) som enkelt middel eller i kombinasjon med interleukin-2 (IL-2) og interferon-a 2a (INF-a) i MRI-H-187 melanom tumorxenografter. Aplidin ble administrert hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, salt kontroll (sterilt salt) hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, IL-2 hver dag under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3 uker vedintraperitoneal injeksjon og INF-a hver dag under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3 ukerved subkutan injeksjon.

Tabell 6

Medikament

Dose/ dag

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 21

DAG 23

DAG 27

DAG 30

DAG 34

Salt kontroll

—

116±4

172 ± 16

289 ±28

367 ±33

562 ± 39

Aplidin

50 pg/kg

114±7

156± 15

262 ± 32

353 ±34

573 ± 70

IL-2

2 pg/ mus

113±4

171 ±24

314 ±46

420 ± 68

647 ± 88

INF-a

200,000 U/mus

115±5

169 ± 19

272 ± 40

398 ±54

653 ± 99

Aplidin +

IL-2

50 pg/kg + 2pg/ mus

113±4

206 ± 19

307 ± 42

399 ±51

673 ± 80

Aplidin + INF-a

50 pg/kg +

200,000 U/mus

113±7

152 ± 12

272 ± 32

328 ±48

506 ±56

S.E.M.=Standard feil av middelverdien.

Tabe

16 (fortsettelse)

Medikament

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 37

DAG 40

DAG 42

DAG 48

DAG 51

Salt kontroll

669 ± 52

863 ± 84

953 ± 94

1495 ±

1840±

Aplidin

743 ±81

837±108

1000 ±

1500 ±

1836 ±

IL-2

843 ± 90

1072 ±

1215 ±

1672 ±

2005 ±

INF-a

776±115

912±149

1104 ±

1521 ±

1978 ±

Aplidin ±

IL-2

872 ± 93

1083 ±98

1299 ±

1592 ±

1739 ±

Aplidin ± INF-a

664 ±61

783 ± 86

938 ±89

1276 ±

1541 ±

Fra denne xenograft studien ble det konkludert at i melanom MRI-H187 celler vistekombinasjonen av aplidin med IL-2 og aplidin med INF-a additivitet.

Tabell 7 og figur 70 og 71 viser kinetikk av netto tumorvolum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med DTIC og karboplatin i LOX-IMVI melanom tumor xenografter. Aplidin ble administrert hver dagi 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, salt kontroll (sterilt salt) hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, DTIC hver dag i 5 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon og karboplatin ved doser hver 4 dag for en total på 4 behandlinger ved intraperitoneal injeksjon.

Tabell 7

Medikament

Dose/ dag

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 6

DAG 8

DAG 12

DAG 14

DAG 19

Salt kontroll

—

107 + 4

292 ± 45

1356 +

3085 +

9364 +

1702

Aplidin

50 pg/kg

107 + 5

288 + 21

863 ± 87

2261 ±

8980 +

1085

DTIC

30 mg/kg

105 + 5

208 ± 25

699 ± 57

950 + 57

2695 +

Karboplatin

25 mg/kg

107 + 3

347 ± 43

1167 +

2936 +

4598 +

1182

Aplidin + DTIC

50 pg/kg + 30 mg/kg

107 + 4

302+ 16

819 + 57

1174 +

3397 +

Aplidin + Karboplatin

50 pg/kg + 25 mg/kg

107 + 5

253 + 30

909+ 152

1911 ±

4000 +

1610

S.E.M.=Standard feil av middelverdi.

Fra denne xenograft studien kan det bli konkludert at i melanom LOX-IMVI celler viserkombinasjonen av aplidin med DTIC et additivt mønster og kombinasjonen av aplidin med karboplatin viser en trend til synergisme.

Tabell 8 og figur 72 og 73 viser kinetikk av netto tumorvolum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med interleukin-2(IL-2) og interferon-a 2a (INF-a) i LOX-IMVI melanom tumor xenografter. Aplidin bleadministrert hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, salt kontroll (sterilt salt) hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, IL-2 hver dag

under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3 uker ved intraperitoneal injeksjon og INF-a hverdag under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3 uker ved subkutan injeksjon.

Tabell 8

Medikament

Dose/ dag

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 6

DAG 9

DAG 13

DAG 16

Salt kontroll

—

111 ±4

532 ± 63

1666 ±

2684±

Aplidin

50 pg/kg

113±4

300 ± 15

1258 ±

2436 ±

IL-2

2pg/ mus

111 ±5

357 ±51

1541 ±

3315 ±

INF-a

200,000 U/mus

110±4

329 ± 39

1452 ±

2188 ±

Aplidin + IL-2

50 pg/kg + 2pg/ mus

111 ±3

358 ±50

1485 ±

3097 ±

Aplidin + INF-a

50 pg/kg +

200,000 U/mus

112±4

260 ± 18

1152 ±

2607 ±

S.E.M.=Standard feil av middelverdi.

Fra denne xenograft studien ble det konkludert at i melanom LOX-IMVI celler viserkombinasjonen av aplidin med IL-2 og aplidin med INF-a additivitet.

Tabell 9 og figur 74, 75 og 76 viser kinetikk av netto tumorvolum etter initiering av behandling med aplidin (APT) som enkelt middel eller i kombinasjon med bevacizumab (Avastin®), interleukin-2 (IL-2) og interferon-a 2a (INF-a) i CaKi-1 nyre tumorxenografter. Aplidin ble administrert hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, salt kontroll (sterilt salt) hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, bevacizumab (Avastin®) hver 3 dag for totalt 4 behandlinger ved intraperitoneal injeksjon, IL-2 hver dag under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3 ukerved intraperitoneal injeksjon og INF-a hver dag under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3uker ved subkutan injeksjon.

Tabell 9

Medikament

Dose/ dag

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 13

DAG 15

DAG 19

DAG 22

DAG 26

Salt kontroll

—

105 + 3

157+11

226+ 18

305 ± 29

500 ± 69

Aplidin

50 pg/kg

103 + 3

164+12

208 ± 12

282 ± 26

406 ± 46

Avastin®

5.0 mg/kg

105 + 3

162+14

286 ± 49

398 + 53

632 ± 79

IL-2

2 pg/ mus

103 + 3

143 + 15

224 + 21

324 ± 25

484 ± 49

INF-a

200,000 U/mus

105 + 3

162+14

239 + 28

312 + 43

496 ± 60

Aplidin+

Avastin®

50 pg/kg + 5.0 mg/kg

106 + 3

169+15

238 + 21

283 ± 25

383 + 48

Aplidin +

IL-2

50 pg/kg + 2pg/ mus

105 + 3

147 + 21

175 + 16

208 ± 34

320 ± 57

Aplidin + INF-a

50 pg/kg + 200,000 U/mus

105 + 4

141 ± 12

213 + 27

267 ± 29

391+39

S.E.M.=Standard feil av middelverdi.

Tabell 9 (

brtsetter)

Medikament

Net

to tumorvolum ± S.E.M. ।

mS)_

DAG 29

DAG 33

DAG 36

DAG 41

DAG 47

DAG 50

Salt kontroll

639+ 64

741 + 69

897 ± 75

1149 + 76

1595 + 74

1939+ 110

Aplidin

637 + 68

800 ± 86

1035 + 117

1371±125

1855 + 202

2173 + 213

Avastin®

811 + 90

985 + 111

1251±109

1654+ 189

2170 + 253

2842 ± 379

IL-2

623 ± 59

746 ± 77

956+ 102

1206+ 116

1684+ 120

2403 + 218

INF-a

613 + 92

734 ± 99

867 + 86

1125 + 111

1473 ± 149

1777+ 197

Aplidin+

Avastin®

451 + 42

579 + 51

825 ± 86

1014 + 77

1409 ±122

1834+ 174

Aplidin +

IL-2

398 ± 49

495 ± 64

680 + 75

859 + 88

1138 + 106

1404 ± 122

Aplidin +

INF-a

470 ± 39

591 + 56

821±115

1117+148

1699 + 240

2356 + 354

Fra denne xenograft studien ble det konkludert at i nyre CaKi-1 celler viserkombinasjonen av aplidin med Avastin® og aplidin med IL-2 synergisme, som er merbemerkelsesverdig i tilfellet av kombinasjonen med IL-2. På den andre siden viser

5 kombinasjonen av aplidin med INF-a et additivt mønster.

Tabell 10 og figur 77, 78 og 79 viser kinetikk av netto tumorvolum etter initiering av behandling med aplidin (APL) som enkelt middel eller i kombinasjon med bevacizumab (Avastin®), interleukin-2 (IL-2) og interferon-a 2a (INF-a) i MRI-H121 nyre tumor

io xenografter. Aplidin ble administrert hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, salt kontroll (sterilt salt) hver dag i 9 etterfølgende dager ved intraperitoneal injeksjon, bevacizumab (Avastin®) hver 3 dag for totalt 4 behandlinger ved intraperitoneal injeksjon, IL-2 hver dag under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3 ukerved intraperitoneal injeksjon og INF-a hver dag under 5 ukedager (mandag-fredag) i 3

15 uker ved subkutan inj eksjon.

Tabell 10

Medikament

Dose/dag

Netto tumorvolum ± S.E.M. (mg)

DAG 11

DAG 14

DAG 18

DAG 19

DAG 21

Salt kontroll

—

112 + 6

180+15

253 ± 27

266 ± 33

384 + 52

Aplidin

25 pg/kg

108 + 6

182+15

357 + 44

345 ± 42

467 ± 68

Avastin®

2.5 mg/kg

106 + 7

171 ± 16

306 ± 27

299 ± 39

365 + 39

IL-2

1 pg/ mus

108 + 5

201+29

402 ± 60

366 + 56

475 ± 87

INF-a

200,000 U/mus

110 + 6

166+15

331+32

341+32

371+37

Aplidin+

Avastin®

25 pg/kg + 2.5 mg/kg

106 + 7

140 + 20

247 ± 39

241+30

295 ± 39

Aplidin +

IL-2

25 pg/kg + 1 Pg/ mus

109 + 5

149+16

286 + 33

336 + 51

381+79

Aplidin + INF-a

25 pg/kg + 200,000 U/mus

111 + 7

152 + 23

254 ± 45

301+42

343 ± 52

S.E.M.=Standard feil av middelverdi.

Tabell 10

(fortsetter)

Medikament

Net

to tumorvolum ± S.E.M. 1

mg)

DAG 26

DAG 29

DAG 32

DAG 35

DAG 39

DAG 42

Salt kontroll

628± 106

789±105

880±126

1104±166

1512 ±188

1549 ±204

Aplidin

688±108

898±106

1161±141

1206±157

1622±195

1660±169

Avastin®

503 ± 57

678 ± 77

899 ± 93

898 ± 69

1240 ±124

1383 ±148

IE-2

737±121

922±163

1138 ±205

1175 ±192

1615 ±273

1873 ±310

INF-a

591 ±69

704 ±91

809 ± 96

898±108

1457±165

1747 ±210

Aplidin+

Avastin®

501 ±53

784 ± 93

848±110

1166±145

1430±155

Aplidin +

IE-2

662±136

817 ±136

951±167

1052±161

1447±199

1791 ±272

Aplidin +

INF-a

635 ± 83

868±104

937±125

1081±155

1739±181

1996±167

Fra denne xenograft studien ble det konkludert at i nyre MRI-H121 celler viser de trekombinasjonene et additivt mønster.

Eksempel 5. Ytterligere in vitro tester i multippel myelom (RPMI-8226 og U266B1)cellelinjer ble utført for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med to standarder av behandlende kjemoterapeutiske midler (bortezomib og melfalan).

io Aplidin som enkelt middel eller i kombinasjon med enten bortezomib eller melfalan ble evaluert mot multippel myelom cellelinjer, spesifikt RPMI-8226 og U266B1 cellelinjer.

Disse cellelinjene ble dyrket i RPMI1640 medium med 10% FBS og 1% L-glutamin.Hver cellelinje ble platet i en 96 brønners plate ved 20,000 celler per brønn.

Først ble aplidin, bortezomib og melfalan testet alene for å bestemme IC50 verdien for hver av dem individuelt. For å bestemme IC50 verdi ble hvert medikament sjekket ved forskjellig område av medikament konsentrasjon, ved å følge prosedyren som angitt i Eksempel 1. Tabell 11 viser individuell IC50 oppnådd med hvert av de tre

20 medikamentene mot de to multippel myelom cellelinjene.

Tabell 11

IC50 (Molar)

RPMI8226

U2661

Aplidin

2.93E-08

1.39E-09

Bortezomib

2.29E-09

1.66E-05

Melfalan

1.61E-05

3.16E-09

I det neste trinnet ble enten bortezomib eller melfalan kombinert med aplidin. I disse eksperimentene ble konsentrasjoner av aplidin benyttet med en 1:10 seriefortynning. Hver seriefortynning ble paret med 4 forskjellige konsentrasjoner av bortezomib eller melfalan.

Platene ble inkubert i 3 dager ved 37°C og 5% CO2. Platene ble lest ved å benytte Promega MTS testsystem hvor MTS blir metabolisert med levende celler som forvandles til formazan som er fluorescerende ved 490 nm bølgelengde. Dette er en indirekte måling av celle viabilitet. Disse ble analysert ved å benytte Softmax Pro programmet som bestemmer celle viabilitet basert på prosent av kontrollbrønner. Disse IC50 dataene ble så overført til CalcuSyn programmet for kombinasjonsindeks analyse. CalcuSyn sammenligner IC50 verdiene av medikamentene alene med den av medikamentene i kombinasjon ved å benytte en algoritme for å bestemme en kombinasjonsindeks. Det er viktig å bemerke at kombinasjonsindeksen (Cl) er en refleksjon av kombinasjonseffekten av de to medikamentene: Cl = 1 indikerer en additiv effekt; Cl <1 indikerer en synergistisk effekt; og CI>1 indikerer en antagonistisk effekt.

Tabell 12 oppsummerer de dosene hvor en synergistisk effekt ble observert i kombinasjonen av aplidin med bortezomib mot RMPI 8226 cellelinje:

Tabell 12

Aplidin konsentrasjon

Bortezomib konsentrasjon

Cl

0.2 pg/ml

1.0 ng/ml

0.402

3.5 ng/ml

0.911

6.0 ng/ml

0.013

8.5 ng/ml

0.014

2 pg/ml

1.0 ng/ml

0.103

3.5 ng/ml

0.104

6.0 ng/ml

0.106

8.5 ng/ml

0.107

Tabell 13 oppsummerer de dosene hvor en synergistisk effekt ble observert i kombinasjonen av aplidin med melfalan mot RMPI 8226 cellelinje:

5 Tabell 13

Aplidin konsentrasjon

Melfalan konsentrasjon

Cl

0.2 pg/ml

50 ng/ml

0.01

30 ng/ml

0.01

10 ng/ml

0.01

8 ng/ml

0.01

2 pg/ml

50 ng/ml

0.103

30 ng/ml

0.103

10 ng/ml

0.103

8 ng/ml

0.103

Tabell 14 oppsummerer de dosene hvor en synergistisk effekt ble observert i kombinasjonen av aplidin med bortezomib mot U266B1 cellelinje:

Tabell 14 _

Aplidin konsentrasjon

Bortezomib konsentrasjon

Cl

0.2 pg/ml

3.5 ng/ml

0.602

8.5 ng/ml

0.919

20 pg/ml

6.0 ng/ml

0.758

0.2 ng/ml

6.0 ng/ml

0.852

2 ng/ml

3.5 ng/ml

0.588

6.0 ng/ml

0.776

8.5 ng/ml

0.553

20 ng/ml

3.5 ng/ml

0.892

8.5 ng/ml

0.79

0.2 pg/ml

1.0 ng/ml

0.317

3.5 ng/ml

0.193

6.0 ng/ml

0.251

8.5 ng/ml

0.112

Tabell 15 oppsummerer de dosene hvor en synergistisk effekt ble observert i kombinasjonen av aplidin med melfalan mot U266B1 cellelinje:

5 Tabell 15 _

Aplidin konsentrasjon

Melfalan konsentrasjon

Cl

0.2 pg/ml

30 ng/ml

0.922

10 ng/ml

0.064

8 ng/ml

0.047

2.0 pg/ml

50 ng/ml

0.525

30 ng/ml

0.709

10 ng/ml

0.164

8 ng/ml

0.127

20 pg/ml

50 ng/ml

0.793

10 ng/ml

0.467

8 ng/ml

0.845

0.2ng/ml

10 ng/ml

0.472

8 ng/ml

0.974

2ng/ml

50 ng/ml

0.744

30 ng/ml

0.504

10 ng/ml

0.498

8 ng/ml

0.438

20ng/ml

50 ng/ml

0.888

30 ng/ml

0.688

10 ng/ml

0.573

8 ng/ml

0.573

0.2pg/ml

50 ng/ml

0.249

30 ng/ml

0.109

10 ng/ml

0.145

8 ng/ml

0.108

Eksempel 6. Ytterligere in vitro tester i leukemi (MOLT4 og K-562) cellelinjer bleutført for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med et standard kjemoterapeutisk middel slik som idarubicin.

Aplidin som enkelt middel eller i kombinasjon med idarubicin ble evaluert mot leukemi cellelinjer, spesifikt MOLT4 og K562 cellelinjer.

Disse cellelinjene ble dyrket i RPMI1640 medium med 10% FBS og 2 mM L-glutamin.Hver cellelinje ble platet i en 96 brønners plate ved 20,000 celler per brønn.

Først ble aplidin og idarubicin testet alene for å bestemme IC50 verdien for hver av dem individuelt. For å bestemme IC50 verdi ble hvert medikament sjekket ved forskjellig område av medikamentkonsentrasjonen, ved å følge prosedyren som angitt i Eksempel 1. Tabell 16 viser individuell IC50 oppnådd med hvert av de to medikamentene mot de to leukemi cellelinjene.

Tabell 16

IC50 (Molar)

MOLT4

K562

Aplidin

1.43E-08

2.35E-09

Idarubicin

5.0E-11

6.33E-08

I det neste trinnet ble idarubicin kombinert med aplidin. I eksperimentet relatert til MOET4 cellelinje, ble konsentrasjoner av aplidin benyttet med en 1:10 seriefortynning. Hver seriefortynning ble paret med 4 forskjellige konsentrasjoner av idarubicin. I eksperimentet relatert til K562 cellelinje, ble konsentrasjoner av aplidin benyttet med en 1:5 seriefortynning, og idarubicin konsentrasjonen ble tilsatt til hver kombinasjon sett basert på et forhold. Kombinasjon A var derfor 1:1, kombinasjon B var 0.008:1, kombinasjon C var 6.4E-05:1 og kombinasjon D var 5.12E-07:1.

Platene ble inkubert i 3 dager ved 37°C og 5% CO2. Platene ble lest ved å benytte Promega MTS testsystemet hvor MTS blir metabolisert ved levende celler og forvandles til formazan som er fluorescerende ved 490 nm bølgelengde. Dette er en indirekte måling for celle viabilitet. Disse ble analysert ved å benytte Softmax Pro programmet som bestemmer celle viabilitet basert på prosent av kontrollbrønner. Disse IC50 dataene ble så overført til CalcuSyn programmet for kombinasjonsindeks analyse. CalcuSyn sammenligner IC50 verdiene for medikamentene alene med den av

medikamentene i kombinasjon ved å benytte en algoritme for å bestemme en kombinasjonsindeks. Det er viktig å bemerke at kombinasjonsindeksen (Cl) er en refleksjon av kombinasjonseffekten av de to medikamentene: Cl = 1 indikerer en additiv effekt; Cl <1 indikerer en synergistisk effekt; og CI>1 indikerer en antagonistisk 5 effekt.

Tabell 17 oppsummerer de dosene hvor en synergistisk effekt ble observert i kombinasjonen av aplidin med idarubicin mot MOLT4 cellelinje:

io Tabell 17 _

Aplidin konsentrasjon

Idarubicin konsentrasjon

Cl

0.2 pg/ml

3.0 ng/ml

0.28

0.7 ng/ml

0.052

8.0 pg/ml

0.053

2 pg/ml

3.0 ng/ml

0.669

0.7 ng/ml

0.269

8.0 pg/ml

0.337

Tabell 18 oppsummerer de dosene hvor en synergistisk effekt ble observert i kombinasjonen av aplidin med idarubicin mot K562 cellelinje:

Tabell 18

Aplidin konsentrasjon

Idarubicin konsentrasjon

Cl

Combo 1:1 forhold

6.4 ng/ml

6.4 ng/ml

0.054

32 ng/ml

32 ng/ml

0.051

160 ng/ml

160 ng/ml

0.003

0.8 pg/ml

0.8 pg/ml

0.014

4 pg/ml

4 pg/ml

0.222

Combo 0.008:1 forhok

256 pg/ml

32 ng/ml

0.687

1.28 ng/ml

160 ng/ml

0.025

6.4 ng/ml

0.8 pg/ml

0.026

32 ng/ml

4 pg/ml

0.209

Combo 6.4E-05:l forhold

10.2 pg/ml

160 ng/ml

0.194

51.2 pg/ml

0.8 pg/ml

0.677

256 pg/ml

4 pg/ml

0.459

Combo 5.12E-07:l for

iold

81.9fg/ml

160 ng/ml

0.091

0.41 pg/ml

0.8 pg/ml

0.365

2.05 pg/ml

4 pg/ml

0.459

Eksempel 7: In vivo studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med et annet standard middel i melanom xenografter.

Formålet av denne studien var å evaluere antitumor virkeevnen av aplidin når administrert i kombinasjon med karboplatin mot subkutant-implanterte UACC-257humane melanom celler i atymiske NCr-nuZrø hunn mus.

Dyrene ble holdt i mikroisolator bur, opptil fem per bur i en 12-timers lys/mørke syklus.Seks uker gamle atymiske NCr-nu/nu hunn mus ble akklimatisert i laboratoriene i enuke før eksperimentet.

Hver mus ble inokkulert subkutant nær den høyre flanken med UACC-257 humanemelanom celler fra en in vitro celle kultur ved å benytte en 23-gauge nål. Hver musmottok 2 x 107 celler resuspendert i 0.2 mL Matrigel®. Et rør med frosne UACC-257humane melanom celler ble tint og dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende lav glukose (2,000 mg/L), natrium bikarbonat (1,500 mg/mL), 2 mM L-glutamin og 10%føtalt bovint serum (fullstendig medium), og dyrket i en +37°C inkubator i en fuktet atmosfære med 5% CO2 inntil det nødvendige antall av celler for inokkulering av mus ble oppnådd. Celler ble høstet etter fire passeringer i kultur. Cellene ble fjernet fra flaskene, plassert i 50-mL sentrifugerør og sentrifugert ved 1,000 rpm i 10 minutter i enkjølesentrifuge. Celle pelletene ble resuspendert i friskt fullstendig medium. Celle innholdet og viabilitet ble bestemt ved en Beckman Coulter VI CELL XR celleteller og viabilitetsanalysator. Celle suspensjonen ble sentrifugert, og celle pelleten ble resuspendert i Matrigel® ved en celletetthet på 1.0 x 108 celler/mL og plassert på våt is. Den endelige konsentrasjonen av Matrigel® i celle suspensjonen var 56.9%. På dagen av høsting av celler var celle viabilitet 98.9%.

Dagen for tumorcelle inokkulering ble betegnet som dag 0. Individuelle tumorer vokste til 150-245 mg i vekt (150-245 mm3 i størrelse) på danen av behandlingsinitiering, dag13 etter tumorcelle inokkulering. Førti dyr med tumorer i det korrekte størrelsesområdet ble anvist til fire behandlingsgrupper slik at de mediane tumorvektene av den første dagen av behandling var så nær hverandre som mulig.

Eksperimentet bestod av en leveringsmiddel-behandlet kontrollgruppe på 10 mus og tremedikament-behandlede grupper på 10 mus per gruppe for en total på 40 mus på denførste dagen av behandling, dag 13 etter tumorcelle inokkulering. Dyr i Gruppe 1 ble behandlet intraperitonealt hver dag i 9 etterfølgende dager (dager 13-21) med etleveringsmiddel av aplidin fortynnet med salt. Aplidin ble administrert intraperitonealt hver dag under 9 dager (dager 13-21) ved en dose på 60 pg/kg/dose alene (Gruppe 2)eller i kombinasjon med karboplatin (Gruppe 4). Karboplatin ble administrert intravenøst hver 4 dag for en total på tre behandlinger (dager 13, 17 og 21) ved en dosering på 50 mg/kg/dose alene (Gruppe 3) eller i kombinasjon med aplidin (Gruppe 4). På dager når begge forbindelser ble administrert i Gruppe 4, ble aplidin injisert først til alle ti dyrene i gruppen, etterfulgt øyeblikkelig ved administrasjon av karboplatin (Gruppe 4).

Gruppe 1 ble behandlet intraperitonealt med 0.18% cremophor EL/0.18% etanol/0.84% WFI/98.8% salt (injeksjonsvolum: 0.1 mL/10 g kroppsvekt). Aplidin ble rekonstituert med et leveringsmiddel inneholdende 15% cremophor EL/15% etanol/70% WFI og fortynnet med salt (injeksjonsvolum: 0.1 mE/10 g kroppsvekt). Karboplatin ble preparert i WFI (injeksjonsvolum: 0.1 mE/10 g kroppsvekt).

Dyr ble observert daglig og kliniske tegn ble notert. De subkutane tumorene ble målt og dyrene ble veid to ganger ukentlig startende med den første dagen av behandling, dag 13. Tumorvolum ble bestemt ved kalibreringsmålinger (mm) og ved å benytte formelen for en ellipsoidisk sfære:

L x k'2/2=mm\

hvor L og W refererer til de større og mindre perpendikulære dimensjonene samlet ved hver måling. Denne formelen ble også benyttet for å kalkulere tumorvekt, ved å anta enhetstetthet (1 mm3= 1 mg).

Sammenligning av den mediane tumorvekten i behandlingsgruppene (T) til den mediane tumorvekten i kontrollgruppen (T/C x 100%) på dag 23 (to dager etter slutten av behandlingen) og dag 70 (dagen for avslutning av studiet) ble benyttet for å evaluere antitumor virkeevnen. %T/C for hver behandling er rapportert i tabell 19.

Tabell 19

Gruppe nr.

Middel

Dosering & Enhet

Rute

Plan

% T/C

på dag

Leveringsmiddel

0 pg/kg/dose

IP

qld x 9

Aplidin

60 pg/kg/dose

IP

qld x 9

Karboplatin

50 mg/kg/dose

IV

q4d x 3

Aplidin/ Karboplatin

60 pg/kg/dose/

50 mg/kg/dose

IP

IV

qld x 9

q4d x 3

Plan leveringsmiddel: qld x 9 dag 13

Plan aplidin: qld x 9 dag 13

Plan karboplatin: q4d x 3 dag 13

Plan aplidin/karboplatin: qld x 9 dag 13/ q4d x 3 dag 13

Kombinasjonsbehandlingen av aplidin pluss karboplatin ble tolerert uten dødsfall. Kombinasjonsbehandlingen resulterte i T/C verdier på 95% og 53% på henholdsvis dager 23 og 70.

Eksempel 8: In vivo studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med et annet standard middel i myelom xenografter.

Formålet av denne studien var å evaluere antitumor virkeevnen av aplidin når administrert i kombinasjon med bortezomib mot subkutant-implanterte RPMI 8226humane myelom celler i SCID hann mus.

Dyrene ble holdt i mikroisolator bur, opptil fem per bur i en 12-timers lys/mørke syklus.Seks uker gamle SCID hann mus ble akklimatisert i laboratoriene i en uke før eksperimentet.

Hver mus ble inokkulert subkutant nær den høyre flanken med RPMI 8226 humane myelom celler fra en in vitro cellekultur ved å benytte en 23-gauge nål. Hver musmottok 2 x 107 celler resuspendert i 0.2 mL Matrigel®. RPMI 8226 humane myelom

celler ble opprinnelig innkjøpt fra ATCC (ATCC nummer: CCL-155). Et rør med frosneceller ble tint og dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende høy glukose (4,500 mg/L), natrium bikarbonat (1,500 mg/mL), 2 mM L-glutamin, 10 mM Hepes, 1 mM natriumpyruvat og 10% føtalt bovint serum (fullstendig medium), og dyrket i en +37°C inkubator i en fuktet atmosfære med 5% CO2 inntil det nødvendige antall av celler for inokkulering av mus ble oppnådd. Celler ble høstet etter fire passeringer i kultur. Cellene ble fjernet fra flaskene, plassert i 50-mL sentrifuge rør og sentrifugert ved 1,000rpm i 10 minutter i en kjølesentrifuge. Celle pelletene ble resuspendert i friskt fullstendig medium. Celle tallet og viabilitet ble bestemt med en Beckman Coulter VI CELL XR celleteller og viabilitetsanalysator. Celle suspensjonen ble resentrifugert, og celle pelleten ble resuspendert i Matrigel® ved en celletetthet på 1.0 x 108 celler/mL og plassert på våt is. Den endelige konsentrasjonen av Matrigel® i celle suspensjonen var 78.3%. På dagen for høsting av celler var celle viabilitet 89.3%.

Dagen for tumorcelle inokkulering ble betegnet som dag 0. Individuelle tumorer vokste til 75-188 mg i vekt (75-188 mm3 i størrelse) på dagen av initiering av behandling, dag18 etter tumorcelle inokkulering. De dyrene valgt med tumorer i det korrekte størrelsesområdet ble anvist til fire behandlingsgrupper slik at de mediane tumorvektene på den første dagen av behandling var så nærme hverandre som mulig.

Eksperimentet bestod av en leveringsmiddel-behandlet kontrollgruppe på 10 mus og tremedikament-behandlede grupper på 10 mus per gruppe for en total på 40 mus på denførste dagen av behandling, dag 18 etter tumorcelle inokkulering. Dyr i Gruppe 1 ble behandlet intraperitonealt for to runder hver dag under 9 etterfølgende dager (dager 1826 og dager 38-46) med et leveringsmiddel av aplidin fortynnet i salt. Aplidin bleadministrert intraperitonealt for to runder hver dag under 9 etterfølgende dager (dager 18-26 og dager 38-46) ved en dosering på 60 pg/kg/dose alene (Gruppe 2) eller ikombinasjon med bortezomib (Gruppe 4). Bortezomib ble administrert intravenøst ved en dosering på 0.35 mg/kg/dose i fire uker hver 3 dag for en total på 2 behandlinger startende på dag 18, etterfulgt ved en ytterligere intravenøs injeksjon administrert på dag 46 alene (Gruppe 3) eller i kombinasjon med aplidin (Gruppe 4). På dager når begge forbindelser ble administrert i Gruppe 4, ble aplidin først injisert til alle ti dyrene i gruppen, fulgt øyeblikkelig med administrasjonen av bortezomib (Gruppe 4).

Gruppe 1 ble behandlet intraperitonealt med 0.18% cremophor EL/0.18% etanol/0.84% WFI/98.8% salt (injeksjonsvolum: 0.1 mL/10 g kroppsvekt). Aplidin ble rekonstituert med et leveringsmiddel inneholdende 15% cremophor EL/15% etanol/70% WFI og

fortynnet med salt (injeksjonsvolum: 0.1 mL/10 g kroppsvekt). Velcade® (bortezomib) ble preparert i salt (injeksjonsvolum: 0.1 mL/10 g kroppsvekt).

Dyr ble observert daglig og kliniske tegn ble notert. De subkutane tumorene ble målt og dyrene ble veid to ganger ukentlig startende med den første dagen av behandling, dag 18 etter tumorcelle inokkulering. Tumorvolum ble bestemt ved målinger med kalibreringsmål (mm) og ved å benytte formelen for en ellipsoidisk sfære som beskrevet i Eksempel 7.

Sammenligning av den mediane tumorvekten i behandlingsgruppene (T) med den mediane tumorvekten i kontrollgruppen (T/C x 100%) på dag 27 (en dag etter slutten av den første runden av aplidin behandling) og dag 48 (to dager etter slutten av behandlingen med aplidin og bortezomib) ble benyttet for evaluering av antitumor virkeevnen. %T/C for hver behandling er rapportert i tabell 20.

Tabell 20

Gruppe nr.

Middel

Dosering & Enhet

Rute

% T/C

på dag

Leveringsmiddel

0 pg/kg/dose

IP

Aplidin

60 pg/kg/dose

IP

Bortezomib

0.35 mg/kg/dose

IV

Aplidin/

Bortezomib

60 pg/kg/dose/

0.35 mg/kg/dose

IP

IV

Plan leveringsmiddel: qld x 9 dag 18, 38

Plan aplidin: qld x 9 dag 18, 38

Plan bortezomib: q3d x 2 dag 18, 25, 32, 39; qld x 1 dag 46

Plan aplidin/bortezomib: qld x 9 dag 18, 38/ q3d x 2 dag 18, 25, 32, 39; qld x 1 dag 46.

Kombinasjonsbehandlingen av aplidin pluss bortezomib ble tolerert uten dødsfall. Kombinasjonsbehandlingen var effektiv i inhiberingen av veksten av RPMI 8226 myelom cellene, resulterende i T/C verdier på 49% og 31% på henholdsvis dager 27 og 48. Antitumor aktiviteten av kombinasjonsbehandlingen var større enn additiv sammenlignet med antitumor aktiviteten produsert ved administrasjon av hver forbindelse alene.

Eksempel 9: In vivo studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med et annet standard middel i lymfom xenografter.

Formålet av denne studien var å evaluere antitumor virkeevnen av aplidin når administrert i kombinasjon med rituximab mot subkutant-implanterte RL humanelymfom celler i SCID hunn mus.

Dyrene ble holdt i mikroisolator bur, opptil fem per bur i en 12-timers lys/mørke syklus.Seks uker gamle SCID hann mus ble akklimatisert i laboratoriene i en uke før eksperimentet.

Hver mus ble inokkulert subkutant nær den høyre flanken med RL humane lymfom celler fra en in vitro cellekultur ved å benytte en 23-gauge nål. Hver mus mottok 1.0 x107 celler resuspendert i 0.2 mL Matrigel®. Et rør med frosne celler ble tint og dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende høy glukose (4,500 mg/L), natrium bikarbonat (1,500 mg/mL), 2 mM L-glutamin, 10 mM Hepes, 1 mM natrium pyruvat og 10% føtaltbovint serum (fullstendig medium), og dyrket i en +37°C inkubator i en fuktet atmosfære med 5% CO2 inntil det nødvendige antall av celler for inokkulering av mus ble oppnådd. Celler ble høstet etter seks passeringer i kultur. Cellene ble fjernet fra flaskene, plassert i 50-mL sentrifuge rør og sentrifugert ved 1,000 rpm i 10 minutter i enkjølesentrifuge. Celle pelletene ble resuspendert i friskt fullstendig medium. Celletallet ble bestemt med en Coulter Model Z1 celleteller og viabilitet ble målt etter propidium jodid farging og analysert ved å benytte et Beckman Coulter EPICS XL flav cytometer. Celle suspensjonen ble resentrifugert, og celle pelleten ble resuspendert i Matrigel® ved en celletetthet på 5.0 x 107 celler/mL og plassert på våt is. Den endelige konsentrasjonen av Matrigel® i celle suspensjonen var 73.0%. På dagen for høsting av celler var celle viabilitet 98.9%.

Dagen for tumorcelle inokkulering ble betegnet som dag 0. Individuelle tumorer vokste til 100-196 mg i vekt (100-196 mm3 i størrelse) på dagen av initiering av behandling,dag 15 etter tumorcelle inokkulering. Førti dyr med tumorer i det korrekte størrelsesområdet ble anvist til fire behandlingsgrupper slik at de mediane tumorvektene i alle grupper på den første dagen av behandling var så nærme hverandre som mulig.

Eksperimentet bestod av en leveringsmiddel-behandlet kontrollgruppe på 10 mus og tremedikament-behandlede grupper på 10 mus per gruppe for en total på 40 mus på denførste dagen av behandling, dag 15 etter tumorcelle inokkulering. Dyr i Gruppe 1 ble

behandlet intraperitonealt for to runder hver dag under 9 etterfølgende dager (dager 1523 og dager 28-36) med et leveringsmiddel av aplidin fortynnet i salt. Aplidin bleadministrert intraperitonealt for to runder hver dag under 9 etterfølgende dager (dager 15-23 og dager 28-36) ved en dosering på 60 pg/kg/dose alene (Gruppe 2) eller ikombinasjon med rituximab (Gruppe 4). Rituximab ble administrert intraperitonealt ved en dosering på 20 mg/kg/dose i fire ukentlige runder av behandling hver 3 dag for en total på 2 behandlinger (q3d x 2 plan) startende på dag 15 alene (Gruppe 3) eller i kombinasjon med aplidin (Gruppe 4). På dager når begge forbindelser ble administrert i Gruppe 4, ble aplidin injisert først til alle ti dyrene i gruppen, fulgt øyeblikkelig ved administrasjon av rituximab (Gruppe 4).

Gruppe 1 ble behandlet intraperitonealt med 0.18% cremophor EL/0.18% etanol/0.84% WFI/98.8% salt (injeksjonsvolum: 0.1 mL/10 g kroppsvekt). Aplidin ble rekonstituert med et leveringsmiddel inneholdende 15% cremophor EL/15% etanol/70% WFI og fortynnet med salt (injeksjonsvolum: 0.1 mL/10 g kroppsvekt). Rituxan® (rituximab) ble preparert i salt (injeksjonsvolum: 0.1 mL/10 g kroppsvekt).

Dyr ble observert daglig og kliniske tegn ble notert. De subkutane tumorene ble målt og dyrene ble veid to ganger ukentlig startende med den første dagen av behandling, dag 15. Tumorvolum ble bestemt ved målinger med kalibreringsmål (mm) og ved å benytte formelen for en ellipsoidisk sfære som beskrevet i Eksempel 7.

Sammenligning av den mediane tumorvekten i behandlingsgruppene (T) med den mediane tumorvekten i kontrollgruppen (T/C x 100%) på dag 24 (en dag etter slutten av den første 9 dagers runden av aplidin behandling) og dag 38 (to dager etter slutten av den andre 9 dagers runden av aplidin behandling) ble benyttet for evaluering av antitumor virkeevnen. %T/C for hver behandling er rapportert i tabell 21.

Tabell 21_

Gruppe nr.

Middel

Dosering & Enhet

Rute

% T/C

på dag

Leveringsmiddel

0 pg/kg/dose

IP

Aplidin

60 pg/kg/dose

IP

Rituximab

20 mg/kg/dose

IP

Aplidin/

Rituximab

60 pg/kg/dose/

20 mg/kg/dose

IP

IP

Plan leveringsmiddel: qld x 9 dag 15, 28

Plan aplidin: qld x 9 dag 15, 28

Plan rituximab: q3d x 2 dag 15, 22, 29, 36

Plan aplidin/rituximab: qld x 9 dag 15, 28/ q3d x 2 dag 15, 22, 29, 36.

Kombinasjonsbehandlingen av aplidin pluss rituximab ble tolerert uten dødsfall. Kombinasjonsbehandlingen var effektiv i inhiberingen av veksten av RL lymfom cellene, resulterende i T/C verdier på 69% og 74% på henholdsvis dager 24 og 38. Når aplidin er kombinert med rituximab ble derfor en potensiering av antitumor aktiviteten observert.

Eksempel 10: In vivo studier for å bestemme effekten av aplidin i kombinasjon med andre standard midler (tredoble kombinasjoner) på multippel mye lom tumor cellelinjer.

I den foreliggende studien ble tredoble kombinasjoner av antitumor midler analysert. Alle kombinasjonene ble testet ved å benytte celle viabilitetstest (MMT) i MM.IS cellelinje, en veldig sensitiv MM cellelinje. Resultater ble analysert ved å benytte Calcusyn programvaren.

Cellelinjer og celledyrknings reagenser

Den deksametason-sensitive MM cellelinjen MM.IS ble velvillig tilveiebrakt ved Dr. SRudikoff, Bethesda MD). Cellelinjen ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycinog 2 mM L-glutamin. Alle celledyrknings medier og reagenser ble innkjøpt fraInvitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Celle viabilitetstester

Analysen av MM celle proliferasjon ble bestemt ved å benytte den metyltiotetrazol (MTT; Sigma, St. Louis MO) kolorimetriske testen. MM cellelinjer ble sådd ut ved en tetthet på 50000 celler/200 ul medium per brønn i 48-brønners plater, og behandlet meden bestemt medikamentdose og tid. To timer før slutten av behandlingen ble en MTT løsning (5 mg/ml i PBS; vanligvis 10% av volumet i hver brønn) tilsatt og tetrazolium saltet ble redusert ved metabolsk aktive celler til fargede formazan krystaller. Etter oppløsning av disse krystallene ved inkubering over natt med 10% SDS-HC1 løsning,ble absorbans målt ved 570 nm med korreksjon ved 630 nm. Fire brønner ble analysert

for hver tilstand, og resultatene er presentert som middelverdien ± SD for kvadruplikater av et representativt eksperiment som ble repetert minst tre ganger.

Isobologram analyse

Interaksjonen mellom aplidin og andre anti-MM midler ble analysert ved å benytteCalcusyn programvaren (Biosoft, Ferguson, MO). Data fra celle viabilitetstest (MTT) ble uttrykt som fraksjonen av celler påvirket ved dosen (Fa) i medikament-behandledeceller sammenlignet med ubehandlede celler (kontroll). Dette programmet er basert på Chou-Talalay metoden i henhold til den følgende ligningen Cl = (D)l/(Dx)l +(D)l(D)2/(Dx)l(Dx)2 hvor (D)l og (D)2 er dosene av medikament 1 og 2 som har den samme x effekten når benyttet alene.

Den computer-kalkulerte kombinasjonsindeksen (Cl) ble benyttet for å bedømmeresultatene av en kombinasjon: CI>1, CI=1 og CI<1 indikerer henholdsvis antagonisme, additive og synergistiske effekter. Ensartetheten av data til median-effekt prinsippet kanenkelt bli manifestert ved den lineære korrelasjonskoeffisienten (r) av median-effektplottet: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), hvor D er dosen, Dm er dosen nødvendigfor en 50% effekt, fa er fraksjonen påvirket ved dose, fu er den upåvirkede fraksjonen, og m er en koeffisient av sigmoiditeten av dose-effekt kurven. For hver kombinasjonble en ikke-konstant forholdskombinasjon benyttet.

Resultater

Kombinasjon av aplidin + lenalidomid ('Rcvlimid ' ) + deksametason

Tilsetningen av deksametason til kombinasjonen av aplidin + lenalidomid viste en viktig synergi i alle kombinasjonene testet i den sensitive cellelinjen (MMIS) (Figur 80). I figur 80 er aplidin doser uttrykt i nM enheter, lenalidomid doser er uttrykt i pM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Kombinasjon av aplidin + bortezomib + deksametason

Tilsetningen av deksametason til kombinasjonen av aplidin med bortezomib resulterte I flere doser med en tydelig trend til synergi (Figur 81). I Figur 81 er aplidin doser uttrykt i nM enheter, bortezomib doser er uttrykt i nM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Kombinasjon av aplidin + bortezomib + lenalidomid (Revlimid®)

Tilsetningen av bortezomib til kombinasjonen av aplidin med et immunmodulerende middel slik som lenalidomid økte tydelig dets antitumorale effekt med Cl i det synergistiske området i MM IS (Figur 82). I Figur 82 er aplidin doser uttrykt i nM enheter, bortezomib doser er uttrykt i nM enheter og lenalidomid doser er uttrykt i pM enheter.

Kombinasjon av aplidin + talidomid + deksametason

Denne kombinasjonen viste tydelig synergi i de tredoble kombinasjonene som kan bli sett i Figur 83.1 Figur 83 er aplidin doser uttrykt i nM enheter, talidomid doser er uttrykt i pM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Kombinasjon av aplidin + melfalan + deksametason

Denne kombinasjonen viste også et tydelig synergistisk område, hovedsakelig med høye doser av medikamentene (Figur 84). I Figur 84 er aplidin doser uttrykt i nM enheter, melfalan doser er uttrykt i pM enheter og deksametason doser er uttrykt i nM enheter.

Kombinasjon av aplidin + melfalan + bortezomib

Denne kombinasjonen resulterte i Cl i det synergistiske området ved anvendelse av høye doser (Figur 85). I Figur 85 er aplidin doser uttrykt i nM enheter, melfalan doser er uttrykt i pM enheter og bortezomib doser er uttrykt i nM enheter.

Disse funnene med hensyn på aplidin kan bli utvidet til aplidin analoger, derivater og relaterte forbindelser. For eksempel tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en kombinasjon av en forbindelse slik som dem av WO 02 02596 med et anticancer medikament, fortrinnsvis paclitaxel (Taxol®), doxorubicin, cisplatin, arsenikk trioksid, 5-fluoruracil (5-FU), cytosin arabinosid (AraC), karboplatin, 7-etyl-10hydroksykamptotecin (SN38), etoposid (VP 16), melfalan, deksametason, cyklofosfamid, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomid (Revlimid®), interleukin-2 (IL-2), interferon-a 2 (INF- a), dakarbazin (DTIC), bevacizumab(Avastin®), idarubicin, talidomid og rituximab.

Eksempler på analoger av aplidin som kan bli benyttet istedenfor aplidin i seg selv inkluderer de foretrukne forbindelsene i WO 02 02596. Mer foretrukket er analogene strukturelt nært aplidin, og er vanligvis forskjellig fra aplidin med hensyn på en aminosyre eller den terminale sidekjeden. Den forskjellige aminosyren kan være i den

5 sykliske delen av molekylet eller i sidekjeden. Mange eksempler på slike forbindelser er gitt i WO 02 02596.