PT2029155E - Tratamento melhorado de mieloma múltiplo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO MELHORADO DE MIELOMA MÚLTIPLO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma combinação sinérgica de Aplidina com dexametasona para utilização no tratamento de mieloma múltiplo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Aplidina (Desidrodidemnina B) é um depsipéptido cíclico que foi isolado a partir de um tunicado marinho mediterrânico, Aplidium albicans, e é o objeto do documento WO 9104985. Está relacionada com compostos conhecidos como didemninas, e tem a seguinte estrutura:

Mais informações sobre a Aplidina, análogos de aplidina, suas utilizações, formulações e síntese podem ser encontradas nos pedidos de patente WO 99 42125, WO 01 35974, WO 01 76616, WO 02 30441, WO 02 02596, WO 03 33013 e WO 2004 080477.

Em ambos estudos pré-clínicos em animais e estudos clínicos de Fase I em seres humanos, foi demonstrado que a Aplidina tem um potencial citotóxico contra um amplo espectro de tipos tumorais incluindo leucemia e linfoma. Veja-se por exemplo:

Faircloth, G. et al.: "Dehydrodidemnin B (DDB) a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models", 9th NCI-EORTC Symp. New Drugs Cancer Ther. (12-15 março, Amsterdão) 1996, Abst 111; Faircloth, G. et al. : "Preclinical characterization of aplidine, a new marine anticancer depsipeptide", Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1997, 38: Abst 692;

Depenbrock H, Peter R, Faircloth GT, Manzanares I, Jimeno J, Hanauske AR.: "In vitro activity of Aplidine, a new marine-derived anticancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells" Br. J. Cancer, 1998; 78: 739-744;

Faircloth G, Grant W, Nam S, Jimeno J, Manzanares I, Rinehart K. : "Schedule-dependency of Aplidine, a marine depsipeptide with antitumor activity", Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1999; 40: 394;

Broggini M, Marchini S, D'Incalci M, Taraboletti G, Giavazzi R, Faircloth G, Jimeno J.: "Aplidine blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-R1 autocrine loop in a human leukemic cell line", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509; Erba E, Bassano L, Di Liberti G, Muradore I, Chiorino G, Ubezio P, Vignati S, Codegoni A, Desiderio MA, Faircloth G, Jimeno J e D' Incalci M. : "Cell cycle phase perturbations and apoptosis in tumour cells induced by aplidine", Br. J. Cancer 2002; 86: 1510-1517;

Paz-Ares L, Anthony A, Pronk L, Twelves C, Alonso S, Cortes-Funes H, Celli N, Gomez C, Lopez-Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Kaye S.: "Phase I clinical and pharmacokinetic study of aplidine, a new marine didemnin, administered as 24-hour infusion weekly" Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;

Raymond E, Ady-Vago N, Baudin E, Ribrag V, Faivre S, Lecot F, Wright T, Lopez Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Ducreux M, Le Chevalier T, Armand JP.: "A phase I and pharmacokinetic study of aplidine given as a 24-hour continuous infusion every other week in patients with solid tumor and lymphoma", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4510; Maroun J, Belanger K, Seymour L, Soulieres D, Charpentier D, Goel R, Stewart D,

Tomiak E, Jimeno J, Matthews S. : "Phase I study of aplidine in a 5 day bolus q 3 weeks in patients with solid tumors and lymphomas", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509; Izquierdo MA, Bowman A, Martinez M, Cicchella B, Jimeno J, Guzman C, Germa J, Smyth J. : "Phase I trial of Aplidine given as a 1 hour intravenous weekly infusion in patients with advanced solid tumors and lymphoma", Clin. Cancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509.

Estudos mecanisticos indicam que a Aplidina pode bloquear a secreção de VEGF em células ALL-MOLT4 e foi observada uma atividade in vitro a baixas concentrações (5 nM) em amostras de AML e ALL a partir de pacientes pediátricos com ALL e AML de novo ou recidivo. A Aplidina parece induzir ambas paragens em Gl e G2 em células de leucemia tratadas farmacologicamente in vitro. Além da regulação negativa do recetor de VEGF, pouco mais se conhece sobre o(s) modo(s) de ação da Aplidina.

Em estudos clínicos de fase I com a Aplidina, a L-carnitina foi dada como um pré-tratamento de 24 horas ou coadministrada para prevenir a mielotoxicidade, veja-se, por exemplo, o documento WO 02 30441. Foi provado que a coadministração de L-carnitina é capaz de melhorar a recuperação da toxicidade muscular induzida por fármacos e permitiu um aumento da dose de Aplidina.

Anteriormente, ensaios in vitro e in vivo conduzidos com Aplidina em combinação com outros agentes anticancro mostraram que as combinações de fármacos testadas eram úteis em terapêutica de combinação para o tratamento de leucemia e linfoma. No documento WO 2004 080421, a Aplidina foi especificamente avaliada em combinação com metotrexato, citosina arabinósido, mitoxantrona, vinblastina, metilprednisolona e doxorrubicina para o tratamento de leucemia e linfoma. O documento WO 02/30441 descreve um estudo de Fase I de aplidina dada em combinação com um protetor do músculo-esquelético, tal como L-carnitina para o tratamento de cancro. 0 documento WO 01/35974 também descreve estudos clínicos de Fase I de aplidina, em que são proporcionadas várias dosagens e protocolos para o tratamento de cancro. O documento WO 03/033013 descreve que vários ensaios in vivo levados a cabo com aplidina eram úteis para o tratamento de cancro pancreático. O documento WO 2004/080477 descreve que vários ensaios in vitro levados a cabo com apldina indicam que este agente pode ser útil para o tratamento de mieloma múltiplo.

Uma vez que o cancro é a principal causa de morte em animais e seres humanos, vários esforços foram feitos, e estão ainda a ser realizados, de modo a obter uma terapêutica antitumoral ativa e segura para ser administrada a pacientes que sofrem de um cancro. O problema a ser solucionado pela presente invenção consiste em proporcionar terapêuticas antitumorais que são úteis no tratamento de cancro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é divulgada nas reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig 1. Um exemplo de análise de regressão linear que é um método para a revelação da presença de sinergia.

Fig 2. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com paclitaxel (Taxol®) contra células SKBR3. Fig 3. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com paclitaxel (Taxol®) contra células MOLT3. Fig 4. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com paclitaxel (Taxol®) contra células PC3.

Fig 5. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com paclitaxel (Taxol®) contra células HL60. Fig 6. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com paclitaxel (Taxol®) contra células MX1.

Fig 7. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com paclitaxel (Taxol®) contra células A549. Fig 8. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com doxorrubicina (DOX) contra células A549. Fig 9. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidine®) em combinação com doxorrubicina (DOX) contra células HT29. Fig 10. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com doxorrubicina (DOX) contra células PC3. Fig 11. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com doxorrubicina (DOX) contra células M0LT3. Fig 12. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com doxorrubicina (DOX) contra células MX1. Fig 13. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com doxorrubicina (DOX) contra células SKBR3. Fig 14. Dados de atividade in vitro de Aplidina (AP, Aplidin®) em combinação com cisplatina (DDP) contra células MX1.

Fig 15. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com cisplatina (cis-DDP) contra células HT29. Fig 16. Dados de atividade in vitro de Aplidina (APL, Aplidin®) em combinação com cisplatina (cisDDP, DDP) contra células SKBR3.

Fig 17. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com cisplatina (cis-DDP, DDP) contra células M0LT3. Fig 18. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com cisplatina (cis-DDP, DDP) contra células A549. Fig 19. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com trióxido de arsénico (TRI) contra células A549.

Fig 20. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com trióxido de arsénico (TRI) contra células HT29. Fig 21. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com trióxido de arsénico (TRI) contra células PC3.

Fig 22. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com trióxido de arsénico (TRI) contra células M0LT3.

Fig 23. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com 5-fluorouracilo (5FU) contra células HL60.

Fig 24. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com 5-fluorouracilo (5FU) contra células SKBR3.

Fig 25. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com 5-fluorouracilo (5FU) contra células A549. Fig 26. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com 5-fluorouracilo (5FU) contra células PC3. Fig 27. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com 5-fluorouracilo (5FU) contra células HT29. Fig 28. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com citosina arabinósido (AraC) contra células SKBR3.

Fig 29. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com citosina arabinósido (AraC) contra células A54 9 .

Fig 30. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com citosina arabinósido (AraC) contra células PC3. Fig 31. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com citosina arabinósido (AraC) contra células HL60.

Fig 32. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com citosina arabinósido (AraC) contra células HT2 9 .

Fig 33. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com carboplatina contra células PC3.

Fig 34. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com carboplatina contra células HT29.

Fig 35. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com carboplatina contra células A549.

Fig 36. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com carboplatina contra células M0LT3.

Fig 37. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com carboplatina contra células MX1.

Fig 38. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com SN-38 contra células A549.

Fig 39. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com SN-38 contra células SKBR3.

Fig 40. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com SN-38 contra células HL60.

Fig 41. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com SN-38 contra células PC3.

Fig. 42A e 42B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células HL-60. Fig. 43A e 43B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células K562. Fig. 44A e 44B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células MOLT-3. Fig. 45A e 45B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células MC 116. Fig. 46A e 46B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células RAMOS. Fig. 47A e 47B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células U937. Fig. 48A e 48B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células NCI-H929. Fig. 49A e 49B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células HUNS-1. Fig. 50A e 50B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células U266 B1. Fig. 51A e 51B. Dados de atividade in vitro de Aplidina (A, Aplidin®) em combinação com VP16 (B) contra células RPMI 8226.

Fig. 52. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com carboplatina contra células LOX-I-MVI. Fig. 53. Dados de atividade in vitro de Aplidina (Aplidin®) em combinação com carboplatina contra células UACC-257. Fig. 54. Resposta à dose frente a Aplidina depois (48 h de tratamento) nas linhas celulares MM1S, MM1R, U266 e U266-LR7. Fig 55. Comparação da eficácia da dose de Aplidina (Aplidin®) e outros fármacos sobre a linha celular MM1S (48 h de tratamento).

Fig 56. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Dexametasona aos 3 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 57. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Dexametasona aos 6 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 58. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Melfalano aos 3 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 59. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Melfalano aos 6 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 60. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Doxorrubicina aos 3 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 61. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Doxorrubicina aos 6 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 62. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Lenalidomida (Revlimid®) aos 3 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 63. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Lenalidomida (Revlimid®) aos 6 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 64. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Bortezomib aos 3 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 65. Combinação de Aplidina (Aplidin®) e Bortezomib aos 6 dias. A) Curva de dose efeito. B) Traçado Fa-Cl.

Fig 66. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (Aplidin®) como um agente único ou em combinação com Dacarbazina em xenoenxertos tumorais de melanoma MRI-H-187.

Fig 67. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (Aplidin®) como um agente único ou em combinação com Carboplatina em xenoenxertos tumorais de melanoma MRI-H-187.

Fig 68. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (Aplidin®) como um agente único ou em combinação com Interleucina-2 (IL-2) em xenoenxertos tumorais de melanoma MRI-H-187.

Fig 69. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (Aplidin®) como um agente único ou em combinação com Interferão-α 2a (INF-a) em xenoenxertos tumorais de melanoma MRI-H-187.

Fig 70. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Dacarbazina (DTIC) em xenoenxertos tumorais de melanoma LOX-IMVI.

Fig 71. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Carboplatina em xenoenxertos tumorais de melanoma LOX-IMVI.

Fig 72. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL, Aplidin®) como um agente único ou em combinação com Interleucina-2 (IL-2) em xenoenxertos tumorais de melanoma LOX-IMVI.

Fig 73. C inética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL, Aplidin®) como um agente único ou em combinação com Interf erão-α 2a (INF-oí) em xenoenxertos tumorais de melanoma LOX-IMVI.

Fig 74. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Bevacizumab (Avastin®) em xenoenxertos de tumor renal CaKi-1.

Fig 75. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Interleucina-2 (IL-2) em xenoenxertos de tumor renal CaKi-1.

Fig 76. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Interferão-α 2a (INF-a 2a) em xenoenxertos de tumor renal CaKi-1.

Fig 77. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Bevacizumab (Avastin®) em xenoenxertos de tumor renal MRI-H121.

Fig 78. Cinética do volume tumoral líquido depois do início do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Interleucina-2 (IL-2) em xenoenxertos de tumor renal MRI-H121.

Fig 79. Cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Interferão-α 2a (INF-a) em xenoenxertos de tumor renal MRI-H121.

Fig 80. Combinação de Aplidina (A) + Lenalidomida (Revlimid®; R) + Dexametasona (D) em MM1S depois de 72 h de tratamento. As doses de Aplidina são expressas em unidades μΜ, as doses de Lenalidomida são expressas em unidades mM e as doses de Dexametasona são expressas em unidades nM.

Fig 81. Combinação de Aplidina (A) + Bortezomib (B) + Dexametasona (D) em MM1S depois de 72 h de tratamento. As doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Bortezomib são expressas em unidades nM e as doses de Dexametasona são expressas em unidades nM.

Fig 82. Combinação de Aplidina (A) + Bortezomib (B) + Lenalidomida (Revlimid®; R) em MM1S depois de 72 h de tratamento. As doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Bortezomib são expressas em unidades nM e as doses de Lenalidomida são expressas em unidades μΜ.

Fig 83. Combinação de Aplidina (A) + Talidomida (T) + Dexametasona (D) em MM1S depois de 72 h de tratamento. As doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Talidomida são expressas em unidades μΜ e as doses de Dexametasona são expressas em unidades nM.

Fig 84. Combinação de Aplidina (A) + Melfalano (M) + Dexametasona (D) em MM1S depois de 72 h de tratamento. As doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Melfalano são expressas em unidades μΜ e as doses de Dexametasona são expressas em unidades nM.

Fig 85. Combinação de Aplidina (A) + Melfalano (M) +

Bortezomib (B) em MM1S depois de 72 h de tratamento. As doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Melfalano são expressas em unidades μΜ e as doses de Bortezomib são expressas em unidades nM.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Por "cancro" pretende-se incluir tumores, neoplasias, e outros tecidos ou células malignas. A presente invenção está direcionada à utilização de Aplidina em combinação para os tratamentos de mieloma múltiplo.

Embora não de acordo com a presente invenção, adicionalmente, descreve-se a utilização de um análogo de Aplidina em combinação para os tratamentos de cancro em geral, mas mais preferentemente para o tratamento de cancro pulmonar, cancro da mama, cancro do cólon, cancro da próstata, cancro renal, melanoma, leucemia e linfoma.

De modo a estudar a possível potenciação de outros agentes anticancro com Aplidina iniciou-se um estudo sistemático de combinações de fármacos para possível utilização nos tipos de cancro supramencionados. Os estudos de combinações de fármacos foram levados a cabo em diferentes tipos de linhas celulares. Foram realizados estudos in vitro utilizando linhas de células tumorais tais como A549 de NSCL, MX1 de carcinoma da mama, HL60 de leucemia promielocítica, HT29 de adenocarcinoma do cólon, PC3 de adenocarcinoma da próstata, SKBR3 de adenocarcinoma da mama e leucemia linfoblástica aguda (M0LT3), que têm uma sensibilidade diferente frente a Aplidina (desde baixa até alta). Também foram realizados estudos adicionais com linhas celulares de leucemias, linfomas, mieloma múltiplo e melanoma. Adicionalmente, estudos in vivo utilizando xenoenxertos de melanoma, renais, de mieloma, e linfoma foram utilizados para estabelecer o efeito da Aplidina em combinação com outros agentes padrão. Finalmente, foram realizados estudos in vitro em linhas celulares de mieloma múltiplo utilizando combinações triplas, isto é, combinando a Aplidina com dois agentes padrão adicionais (um segundo e terceiro fármaco).

Embora não de acordo com a presente invenção, como uma conclusão geral, verificou-se que a toxicidade da Aplidina em células tumorais é grandemente potenciada em combinação com muitos dos agentes padrão utilizados para esta avaliação. Um efeito sinérgico principal foi observado com a combinação de Aplidina com paclitaxel (Taxol®), doxorrubicina, cisplatina, trióxido de arsénico, 5-fluorouracilo (5-FU), citosina arabinósido (Ara-C), carboplatina, 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalano, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), Interferão-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarrubicina, talidomida e rituximab. Adicionalmente, também se verificou que uma potenciação da citotoxicidade também foi obtida com combinações triplas de Aplidina com os agentes supramencionados. A combinação de Aplidina com paclitaxel é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de cancro selecionado a partir de cancro da mama, leucemia e cancro da próstata. A combinação de Aplidina com doxorrubicina é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de um cancro selecionado a partir de cancro pulmonar, cancro do cólon, cancro da próstata e mieloma múltiplo. A combinação de Aplidina com cisplatina é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de um cancro selecionado a partir de cancro da mama e cancro do cólon. A combinação de Aplidina com trióxido de arsénico é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de um cancro selecionado a partir de cancro pulmonar, cancro do cólon e cancro da próstata. A combinação de Aplidina com 5-fluorouracilo é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de um cancro selecionado a partir de leucemia, cancro pulmonar, cancro da mama e cancro da próstata. A combinação de Aplidina com citosina arabinósido é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de um cancro selecionado a partir de cancro pulmonar, cancro da mama e cancro da próstata. A combinação de Aplidina com carboplatina é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de um cancro selecionado a partir de cancro do cólon, cancro da próstata e melanoma. A combinação de Aplidina com SN38 é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de cancro pulmonar. A combinação de Aplidina com etopósido é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de um cancro selecionado a partir de linfoma e mieloma múltiplo. A combinação de Aplidina com dexametasona é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação de Aplidina com lenalidomida é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação de Aplidina com bortezomib é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação de Aplidina com dacarbazina é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de melanoma. A combinação de Aplidina com bevacizumab é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de cancro renal. A combinação de Aplidina com interleucina-2 é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de cancro renal. A combinação de Aplidina com melfalano é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação de Aplidina com idarrubicina é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de leucemia. A combinação de Aplidina com rituximab é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de linfoma. A combinação de Aplidina com talidomida é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação tripla de Aplidina com lenalidomida e dexametasona é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação tripla de Aplidina com bortezomib e dexametasona é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação tripla de Aplidina com bortezomib e lenalidomida é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação tripla de Aplidina com bortezomib e talidomida é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação tripla de Aplidina com dexametasona e talidomida é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação tripla de Aplidina com dexametasona e melfalano é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A combinação tripla de Aplidina com melfalano e bortezomib é particularmente preferida no tratamento de cancro, e mais particularmente no tratamento de mieloma múltiplo. A composição da presente invenção pode compreender todos os componentes (fármacos) numa única formulação farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, os componentes podem ser formulados separadamente e administrados em combinação uns com os outros. Várias formulações farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidas para os peritos na especialidade podem ser utilizadas na presente invenção. A seleção de uma formulação apropriada para utilização na presente invenção pode ser realizada rotineiramente pelos peritos na especialidade com base no modo de administração e nas caracteristicas de solubilidade dos componentes da composição.

Exemplos de composições farmacêuticas contendo Aplidina ou um análogo de aplidina incluem composições liquidas (soluções, suspensões ou emulsões) adequadas para administração intravenosa, e podem conter o composto puro ou em combinação com qualquer portador ou outros compostos farmacologicamente ativos. A Aplidina solubilizada mostra uma degradação substancial sob condições de ensaio de stress térmico e de iluminação, e foi desenvolvida uma forma farmacêutica liofilizada, veja-se o documento WO 99 42125.

Embora não de acordo com a presente invenção, a administração de Aplidina ou composições da presente invenção baseia-se num Protocolo de Dosagem, preferentemente por infusão intravenosa. Prefere-se que sejam utilizados os tempos de infusão de até 72 horas, mais preferentemente 1 a 24 horas, com cerca de 1, cerca de 3 ou cerca de 24 horas sendo mais preferidos. Tempos de infusão curtos que permitem que o tratamento seja levado a cabo sem uma estadia durante a noite no hospital são especialmente desejáveis. Contudo, a infusão pode demorar cerca de 24 horas ou mesmo mais se necessário. A infusão pode ser levada a cabo em intervalos adequados com padrões variáveis, de forma ilustrativa uma vez por semana, duas vezes por semana, ou mais frequentemente por semana, repetida cada semana, opcionalmente, com intervalos de tipicamente uma ou várias semanas. A dosaqem correta dos compostos da combinação variará de acordo com a formulação particular, o modo de aplicação, e o local, hospedeiro e tumor particulares a serem tratados. Outros fatores como a idade, peso corporal, sexo, dieta, momento de administração, taxa de excreção, condição do hospedeiro, combinações de fármacos, sensibilidades e qravidade de reação da doença, devem ser tidos em consideração. A administração pode ser levada a cabo continua ou periodicamente dentro da dose máxima tolerada. Orientação adicional para a administração de Aplidina é fornecida no documento WO 01 35974.

Num aspeto, a presente invenção refere-se a combinações sinérgicas que empregam Aplidina e dexametasona e, embora não esteja de acordo com a presente invenção, também podem ser empregues outras combinações. Uma indicação de sinergia pode ser facilmente obtida testando combinações e analisando os resultados, por exemplos através de análise de regressão linear. É feita referência à Figura 1 para ilustrar este ponto. Métodos alternativos tais como análise de isobolograma estão disponíveis para revelar a sinergia e podem ser empregues para as presentes finalidades.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. Estudos in vitro para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outro agente padrão em linhas celulares tumorais.

Aplidina como um agente único ou em combinação com agentes quimioterapêuticos padrão selecionados foi avaliada contra várias linhas celulares tumorais para medir diferenças na citotoxicidade.

Foram selecionados os seguintes agentes padrão como agentes únicos e para combinação com Aplidina: paclitaxel (Taxol®), doxorrubicina, cisplatina, trióxido de arsénico (Trisonex®), 5-fluorouracilo (5-FU), citosina arabinósido (Ara-C), carboplatinae7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN38). 0 agente único Aplidina é citotóxico para vários tipos de cancro com potência variável. Por este motivo, foram selecionadas linhas celulares tumorais representativas que têm uma sensibilidade baixa, média ou alta frente a Aplidina. As linhas celulares tumorais que foram utilizadas estão listadas no Quadro 1. _ Quadro 1_

0 rastreio foi realizado em duas partes: a. No primeiro conjunto de ensaios, os valores de IC5o foram determinados para cada composto depois de 72 horas de exposição ao fármaco em cada uma das linhas celulares tumorais.

Todas as linhas celulares foram mantidas em meios de crescimento respetivos a 37 °C, 5 % de CO2 e 98 % de humidade. Todas as formulações dos meios não continham antibióticos. No dia anterior à colocação das células nas placas, todas as culturas foram alimentadas com meios de cultura novos. No dia da colheita (colocação em placas) as células foram contadas pelo método de coloração por exclusão com Azul de Tripano (cultura celular básica). As células foram colhidas e semeadas em placas de microtitulação de 96 poços a 10.000 células por poço em 190 μΐ de meio e incubadas durante 24 horas para permitir que as células adiram antes da adição de fármaco. As células foram tratadas com os fármacos e o efeito citotóxico foi medido pelo ensaio de MTS (Tetrazólio) , que é um método colorimétrico para a determinação do número de células viáveis. Depois das 72 horas de incubação com o fármaco, foram adicionados 25 μΐ de solução de MTS+PMS a cada poço de microtitulação e incubados durante 4 horas a 37 °C. As placas foram depois removidas da incubadora e colocadas num agitador de placas durante 5 minutos (cobertas com folha de aluminio para proteção da luz). As densidades óticas foram lidas a 490 nm num leitor de placas espectrofotómetro. Os dados foram analisados utilizando o programa SoftMax® v 3.12. A IC5o foi calculada, que é o equivalente aproximado de IG50 (concentração à qual é medida 50 % da inibição do crescimento) . Foi gerada uma curva de regressão utilizando o programa SoftMax®, e depois 50 % da concentração de inibição foi manualmente interpolada e foi convertida aquela concentração para molar (M) dividindo pela massa molecular do composto. Os valores de IC50 individuais (72 horas de exposição ao fármaco) são mostrados no quadro 2. Os valores de IC50 representam 100 % da concentração do fármaco.

Ouadro 2

b. Num segundo conjunto de ensaios, cada linha celular foi incubada com Aplidina em combinação com cada dos agentes padrão mencionados acima nas seguintes combinações de concentrações IC50 únicas: IC50 de Aplidina IC50 de Agente padrão 100 % 0 % 75 % 25 % 60 % 40 % 50 % 50 % 40 % 60 % 30 % 70 % 25 % 75 % 0 % 100 % 0 % 0 %

As placas de microtitulação foram incubadas durante 72 horas, a 5 % de C02 e 37 °C. 0 efeito citotóxico foi medido por Ensaio de MTS. As densidades óticas foram lidas a 490 nm. Os dados normalizados foram traçados e interpretados conforme descrito. Os dados foram analisados como: 1. O programa software Prism (Graphpad®) foi utilizado para normalizar os dados para valores de controlo (100 % = crescimento celular na ausência de agente (fármaco); 0 % = controlo branco). 2. Os dados normalizados foram traçados como diagramas de dispersão. Foi desenhada uma linha conectando os valores de 100 % de IC50 para cada agente (fármaco) . Valores significativamente acima da linha indicam antagonismo, abaixo indicam sinergia e sobre a linha indicam aditividade. O tratamento estatístico dos dados seguiu Laska R. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 e Greco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. As combinações nas razões de dose testadas foram avaliadas como sendo sinérgicas guando a inibição da proliferação celular excedeu valores de inibição máximos para cada fármaco separadamente (a 100 % de IC50) · De modo inverso, concluiu-se o antagonismo quando a inibição era mais baixa do que ambos máximos. Conclui-se a aditividade quando os efeitos de combinações não diferiram significativamente dos máximos de ambos fármacos. A significância estatística foi avaliada através da realização de um teste-t de Student sobre a inibição em cada razão de dose frente à inibição no máximo para cada fármaco. A significância global das combinações de fármacos para cada linha celular foi dependente da demonstração da signif icância estatística para mais do que 50 % das razões de dose.

Como uma ajuda visual, os valores de resposta foram traçados num diagrama de dispersão com as razões de dose dadas no eixo-x e valores de resposta em % no eixo-y. Foi desenhada uma linha horizontal entre os dois valores de resposta de ponto terminal (por exemplo, entre os valores de resposta para 100 % IC50 de Aplidina e 100 % IC50 de agente quimioterapêutico padrão) . Em casos onde os valores de resposta nos dois pontos finais foram aproximadamente equivalentes, os pontos que permanecem acima ou abaixo desta linha de aditividade prevista podem ser interpretados como representando uma interação de fármacos antagonista ou sinérgica, respetivamente.

As combinações in vitro de cada fármaco com Aplidina têm o potencial para serem sinérgicas, aditivas ou antagonistas. A citotoxicidade sinérgica para as células tumorais é um efeito ótimo e implica que a combinação de Aplidina com outro fármaco é mais eficaz do que qualquer fármaco sozinho.

De acordo com este ensaio foi verificado que: a. A combinação Aplidina com paclitaxel mostrou sinergia em células SKBR3 de adenocarcinoma da mama (Figura 2), células MOLT3 de leucemia linfoblástica aguda (Figura 3) e células PC3 de adenocarcinoma da próstata (Figura 4) . Uma tendência para a aditividade foi observada em células HL60 de leucemia promielocítica (Figura 5) , células MX1 de carcinoma da mama (Figura 6) e células A549 de NSCL (Figura 7). b. A combinação de Aplidina com doxorrubicina mostrou sinergia em células A549 de NSCL (Figura 8), células HT29 de adenocarcinoma do cólon (Figura 9) e células PC3 de adenocarcinoma da próstata (Figura 10). A aditividade foi observada em células MOLT3 de leucemia linfoblástica aguda (Figura 11), células MX1 de carcinoma da mama (Figura 12) e células SKBR3 de adenocarcinoma da mama (Figura 13). c. A combinação de Aplidina com cisplatina mostrou sinergia em células MX1 de carcinoma da mama (Figura 14) e células HT29 de adenocarcinoma do cólon (Figura 15). A aditividade foi observada em células SKBR3 de adenocarcinoma da mama (Figura 16) e células MOLT3 de leucemia linfoblástica (Figura 17), e foram verificadas tendências para a sinergia em células A549 de NSCL (Figura 18) . d. A combinação de Aplidina com trióxido de arsénico mostrou sinergia em células A549 de NSCL (Figura 19), células HT29 de adenocarcinoma do cólon (Figura 20) e células PC3 de adenocarcinoma da próstata (Figura 21). A aditividade foi observada em células MOLT3 de leucemia linfoblástica aguda (Figura 22). e. A combinação de Aplidina com 5-fluorouracilo mostrou sinergia em células HL60 de leucemia promielocítica (Figura 23), células SKBR3 de adenocarcinoma da mama (Figura 24), células A549 de NSCL (Figura 25) e células PC3 de adenocarcinoma da próstata (Figura 26). A aditividade foi observada em células HT29 de adenocarcinoma do cólon (Figura 27) . f. A combinação de Aplidina com citosina arabinósido mostrou sinergia em células SKBR3 de adenocarcinoma da mama (Figura 28) , células A549 de NSCL (Figura 29) e células PC3 de adenocarcinoma da próstata (Figura 30). A aditividade foi verificada em células HL60 de leucemia promielocítica (Figura 31) e células HT29 de adenocarcinoma do cólon (Figura 32) . g. A combinação de Aplidina com carboplatina mostrou sinergia em células PC3 de adenocarcinoma da próstata (Figura 33) e células HT29 de adenocarcinoma do cólon (Figura 34). A aditividade foi observada em células A549 de NSCL (Figura 35) , células M0LT3 de leucemia linfoblástica aguda (Figura 36) e células MX1 de carcinoma da mama (Figura 37). h. A combinação de Aplidina com SN38 mostrou sinergia em células A549 de NSCL (Figura 38) . A aditividade foi observada em células SKBR3 de adenocarcinoma da mama (Figura 39) , células HL60 de leucemia promielocitica (Figura 40) e células PC3 de adenocarcinoma da próstata (Figura 41).

Exemplo 2. Estudos in vitro para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outro agente padrão em linhas celulares de leucemia, linfoma, mieloma múltiplo e tumor de melanoma.

Seguindo o mesmo procedimento conforme divulgado no exemplo 1, a Aplidina como um agente único ou em combinação com agentes guimioterapêuticos padrão selecionados, foi avaliada frente a várias linhas celulares tumorais para medir diferenças na toxicidade.

Foram selecionados os seguintes agentes padrão como agentes únicos e para combinação com Aplidina: etopósido (VP16) e carboplatina. As linhas celulares tumorais selecionadas para este ensaio são mostradas no Quadro 3.

Quadro 3

Método de cultura celular

Todas as linhas celulares foram mantidas em meios de crescimento respetivos a 37 °C, 5 % de CO2 e 98 % de humidade. Todas as formulações dos meios não continham antibióticos. No dia anterior à colocação das células nas placas, todas as culturas foram alimentadas com meios de cultura completos. No dia da colheita (colocação em placas) as células foram contadas pelo método de coloração por exclusão com Azul de Tripano. Colocação das células em placas

As células foram colhidas e semeadas em placas de microtitulação de 96 poços a 15.000 células por poço em 190 μΐ de meio e incubadas durante 24 horas para permitir que as células adiram antes da adição de fármaco.

Tratamento farmacológico

Uma solução-mãe de Aplidina foi preparada em 100 % de DMSO a 5 mg/ml. Soluções-mãe dos agentes quimioterapêuticos VP16 e carboplatina foram preparadas em 100 % de DMSO na concentração de 2 mg/ml para ambos os fármacos.

As células foram tratadas com Aplidina e com o outro agente padrão num intervalo conforme listado abaixo, e concentrações de fármaco individuais foram feitas em triplicados por placa. A concentração dos agentes testados utilizados é expressa como uma percentagem da IC50 dos agentes individuais, que foram determinadas como no Exemplo 1. IC50 de Aplidina IC50 de Agente padrão 100 % 0 % 75 % 25 % 60 % 40 % 50 % 50 % 40 % 60 % IC5o de Aplidina IC50 de Agente padrão 30 % 70 % 25 % 75 % 0 % 100 %

Os valores de IC5o individuais de cada agente para cada linha celular são mostrados no quadro 4.

Quadro 4

0 efeito citotóxico foi medido pelo Ensaio de MTS (Tetrazólio) , que é um método colorimétrico para a determinação do número de células viáveis.

Depois de 72 horas de incubação com os agentes testados, foram adicionados 25 μΐ de solução de MTS+PMS a cada poço de microtitulação e incubados durante 4 horas a 37 °C. As placas foram depois removidas da incubadora e colocadas num agitador de placas durante 5 minutos (cobertas com folha de alumínio para proteção da luz) . As densidades óticas foram lidas a 490 nm num leitor de placas espectrofotómetro. Os dados foram analisados como: 1. 0 programa de software Prism (Graphpad®) foi utilizado para normalizar os dados para valores de controlo (100 % = crescimento celular na ausência de agente (fármaco); 0 % = controlo branco). 2. Os dados normalizados foram traçados como diagramas de dispersão. Foi desenhada uma linha conectando os valores de 100 % de IC50 para cada agente (fármaco). Valores significativamente acima da linha indicam antagonismo, abaixo indicam sinergia e sobre a linha indicam aditividade. O tratamento estatístico dos dados seguiu Laska E. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 e Greco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. As combinações nas razões de dose testadas foram avaliadas como sendo sinérgicas quando a inibição da proliferação celular excedeu valores de inibição máximos para cada fármaco separadamente (a 100 % de IC50) . De modo inverso, conclui-se o antagonismo quando a inibição era mais baixa do que ambos máximos. Conclui-se a aditividade quando os efeitos de combinações não diferiram significativamente dos máximos de ambos fármacos. A significância estatística foi avaliada através da realização de um teste-t de Student sobre a inibição em cada razão de dose frente à inibição no máximo para cada fármaco. A significância global das combinações de fármacos para cada linha celular foi dependente da demonstração da signif icância estatística para mais do que 50 % das razões de dose.

Como um auxiliar visual, os valores de resposta foram traçados num diagrama de dispersão com as razões de dose dadas no eixo-x e valores de resposta em % no eixo-y. Foi desenhada uma linha horizontal entre os dois valores de resposta de ponto terminal (por exemplo, entre os valores de resposta para 100 % IC50 de Aplidina e 100 % IC50 de agente quimioterapêutico padrão) . Em casos onde os valores de resposta nos dois pontos finais foram aproximadamente equivalentes, os pontos que permanecem acima ou abaixo desta linha de aditividade prevista podem ser interpretados como representando uma interação de fármacos antagonista ou sinérgica, respetivamente.

Na Figura 42A e 42B mostram-se os dados de atividade in vitro de Aplidina em combinação com VP16 contra células HL-60. De acordo com estes dados, é obtido um efeito aditivo.

Na Figura 43A e 43B mostram-se os dados de atividade in vitro de Aplidina em combinação com VP16 contra células K562. De acordo com estes dados, é obtida aditividade.

Na Figura 44A e 44B mostram-se os dados de atividade in vi tro de Aplidina em combinação com VP16 contra células MOLT-3 . De acordo com estes dados, é obtida aditividade.

Na Figura 45A e 45B mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com VP16 contra células MC116. De acordo com estes dados, é obtida aditividade nesta linha celular tumoral.

Na Figura 46A e 46B mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com VP16 contra células RAMOS. De acordo com estes dados, é obtido sinergismo nesta linha celular tumoral.

Na Figura 47A e 47B mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com VP16 contra células U937. De acordo com estes dados, é obtida aditividade.

Na Figura 48A e 48B mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com VP16 contra células NCI-H929. De acordo com estes dados, é obtido sinergismo.

Na Figura 49A e 49B mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com VP16 contra células HUNS-1. De acordo comestes dados, é obtida aditividade nesta linha celular tumoral.

Na Figura 50A e 50B mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com VP16 contra células U266B-1. De acordo com estes dados, é obtida aditividade nesta linha celular tumoral.

Na Figura 51A e 51B mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com VP16 contra células RPMI 8226. De acordo com estes dados, é obtida aditividade nesta linha celular tumoral.

Na Figura 52 mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com carboplatina contra células LOX-I-MVI. De acordo com estes dados, é obtida aditividade nesta linha celular tumoral.

Na Figura 53 mostram-se os dados de atividade in vitro observados com Aplidina em combinação com carboplatina contra células UACC-257. De acordo com estes dados, é obtido sinergismo nesta linha celular tumoral.

Exemplo 3: Estudos in vitro para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outros agentes padrão em linhas celulares de mieloma múltiplo. 0 mieloma múltiplo (MM) é uma doença maligna das células plasmáticas, geralmente originária a partir de um clone de células plasmáticas gue proliferam e se acumulam na medula óssea. As caracteristicas clinicopatológicas de pacientes com mieloma incluem acumulação de proteína monoclonal no sangue ou na urina, lesões ósseas líticas, anemia e disfunção renal (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87). 0 tratamento atual para o mieloma baseia-se numa terapêutica de dose elevada suportada por transplante de células estaminais. Apesar dos avanços na última década, hoje em dia o MM permanece uma doença incurável com uma sobrevivência global média para os pacientes de 2 a 5 anos (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87) . Novas abordagens de tratamento são necessárias para melhorar o resultado dos pacientes seguindo três linhas principais de investigação: a) potenciar a eficácia da quimioterapia através da utilização de uma dose elevada; b) potenciar a resposta imunitária do hospedeiro frente a células de mieloma; e c) desenvolver novos fármacos com alvos mais específicos que podem interferir não apenas com células de mieloma mas também com o microambiente da medula óssea (San Miguel JF et al. Curr. Treat. Options Oncol. (2003) 4: 247-58) . Esperançosamente, a combinação de dois ou mais destes agentes terapêuticos conduzirá a uma eficácia anti-MM melhorada e taxas de sobrevivência mais longas.

Com isto, os inventores relatam vários estudos sobre o efeito de Aplidina como um novo fármaco no tratamento de mieloma múltiplo. Estes estudos incluem: 1) eficácia citotóxica da Aplidina (sozinha ou em combinação) em várias linhas celulares de MM utilizando ensaios de viabilidade celular (ensaio de MTT) e apoptose (coloração de anexina V). 2) eficácia citotóxica de combinações de Aplidina e outros fármacos clássicos e recentemente desenvolvidos no tratamento desta doença.

Materiais e métodos

Linhas celulares e reagentes de cultura celular

Quatro linhas celulares derivadas de MM foram utilizadas neste estudo: as variantes sensível a dexametasona (MM.1S) e resistente a dexametasona (MM.1R) da linha celular MM.l de mieloma múltiplo (Greenstein S. et al. Exp. Hematol (2003) 31: .271-82) que foram gentilmente cedidas pelo Dr. S Rudikoff, Bethesda MD; e as linhas celulares U266 e a sua homóloga resistente a melfalano U266 LR7 foram obtidas do Dr. W. Dalton, Tampa, FL. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado por calor a 10 %, penicilina a 100 U/ml, estreptomicina a 100 yg/ml e L-glutamina a 2 mM. Todos os meios de cultura celular e reagentes foram adquiridos da Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Ensaios de viabilidade celular A análise da proliferação de células de MM foi avaliada utilizando o ensaio colorimétrico de metiltiotetrazol (MTT; Sigma, St. Louis MO). Linhas celulares de MM foram semeadas a uma densidade de 50000 células/200 μΐ de meio por poço em placas de 48 poços, e tratadas com uma dose de fármaco determinada num momento determinado. Duas horas antes do final do tratamento, uma solução de MTT (5 mg/ml em PBS; normalmente a 10 % do volume em cada poço) foi adicionada e o sal de tetrazólio foi reduzido por células metabolicamente ativas a cristais de formazano coloridos. Depois da solubilização destes cristais por incubação durante a noite com solução de SDS-HCl a 10 %, a absorvância foi medida a 570 nm com correção a 630 nm. Foram analisados quatro poços para cada condição, e os resultados são apresentados como a média ± DP de quadruplicados de uma experiência representativa que foi repetida pelo menos três vezes.

Western blot

As células foram recolhidas e lavadas com PBS, e lisados celulares totais foram obtidos depois da incubação em tampão de lise gelado (NaCl a 140 mM, EDTA a 10 mM, glicerol a 10 %, Nonidet P-40 a 1 %, Tris a 20 mM (pH 7,0), pepstatina a 1 μΜ, aprotinina a 1 pg/ml, leupeptina a 1 pg/ml, ortovanadato de sódio a 1 mM) . As amostras foram centrifugadas a 10.000 g a 4 °C durante 10 min e foram reveladas por SDS-PAGE 6 %-12,5 %, quantidades iguais de proteína nos sobrenadantes. As proteínas foram depois transferidas para membranas de nitrocelulose ou PVDF, bloqueadas por incubação em leite em pó magro a 5 % em tampão PBST (0,05 %-Tween 20 em PBS) e subsequentemente incubadas com o anticorpo primário especifico de Santa Cruz Technologies, [os anticorpos anti-p-c-jun, anti-p-Erkl/2 e anti-Erk5 foram adquiridos de Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA) , enquanto o anti-p-p38 foi obtido de Cell Signaling (Danvers, MA) e o anticorpo anti-PARP de Becton Dickinson Biosciences (Bedford, MA)]. Depois de uma segunda incubação com o anticorpo secundário correspondente, foram revelados immunoblots por quimiluminescência potenciada (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL) . A identificação de JNK e Erk5 ativados necessitou de uma imunoprecipitação prévia dos lisados proteicos com os anticorpos específicos correspondentes e proteína A sepharose.

Análise de isobolograma A interação entre Aplidina e outros agentes anti-MM foi analisada utilizando o programa de software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO) . Os dados do ensaio de viabilidade celular (MTT) foram expressos como a fração de células afetadas pela dose (Fa) em células tratadas com fármaco em comparação com células não tratadas (controlo). Este programa baseia-se no método de Chou-Talalay (Chou TC et al. Adv. Enzyme Regul. (1984) 22: 27-55) de acordo com a seguinte equação Cl = (D) 1 / (Dx) 1 + (D) 1 (D) 2 / (Dx) 1 (Dx)2 onde (D) 1 e (D) 2 são as doses de fármaco 1 e 2 que têm o mesmo efeito x quando utilizados isoladamente. Os valores de Cl menores que 1,0 indicam sinergia, valores de Cl = 1,0 indicam um efeito aditivo, enquanto valores de mais do que 1 correspondem a um efeito antagonista.

Resultados

Resposta à dose frente a Aplidina em linhas celulares derivadas de MM

Foi determinado em primeiro lugar se a Aplidina afeta a viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT em células derivadas de MM tanto sensíveis como resistentes a fármacos de terapêutica convencional. Como observado na Figura 54, o tratamento com Aplidina durante 48 h induz uma diminuição semelhante na viabilidade celular de uma forma dependente da dose em todas as linhas celulares testadas. Uma diminuição de cinquenta porcento nas células viáveis (IC50) depois de tratamento de 48 h encontrava-se dentro do intervalo de 1-10 nM para as quatro linhas celulares testadas. A eficácia da Aplidina também foi comparada com outros fármacos clássicos (Melfalano, Dexametasona) e novos (Bortezomib) no tratamento de MM. A Figura 55 mostra uma potência superior da Aldipina em comparação com outros fármacos quando testados a doses de 0,1-1 nM durante 48 h sobre a linha celular MM.1S; o seu efeito foi semelhante ao de Bortexomib a doses máximas (10-100 nM).

Avaliação da sinergia em combinações duplas de Aplidina

Uma vez que a exposição continua à quimioterapia de MM está, em muitos casos, associada com toxicidade aumentada e desenvolvimento de resistência a fármacos de novo, foi testado se a combinação de concentrações minimamente tóxicas de Aplidina e outros fármacos afetaria a viabilidade de células de MM. Especificamente, a Aplidina foi combinada com fármacos clássicos no tratamento de MM (tal como Dexametasona ou Melfalano), igualmente com agentes anti-mieloma recentemente desenvolvidos (Bortezomib), e com fármacos que teriam especificamente como alvo o microambiente da medula óssea (lenalidomida (Revlimid®)).

Experiências de curso de tempo nos dias 1, 2, 3 e 6 também foram realizadas para os agentes terapêuticos mencionados para determinar as doses subótimas apropriadas (10 % a 30 % de inibição do crescimento) para experiências combinatórias bem como para explorar a duração dos tratamentos. As experiências de combinação de Aplidina e o resto dos fármacos foram realizadas depois de incubação durante 3 dias ou 6 dias. O crescimento celular da linha celular MM.1S foi medido por ensaio de MTT conforme descrito acima, e as percentagens de inibição foram analisadas pelo programa CalcuSyn. 0 indice de combinação (Cl) calculado por computador foi utilizado para avaliar os resultados de uma combinação: CI>1, CI = 1, e CI< 1 indicando efeitos antagónicos, aditivos e sinérgicos, respetivamente. A conformidade dos dados com o principio de efeito médio pode ser prontamente manifestada pelo coeficiente de correlação linear (r) do traçado de efeito médio: log (fa/fu) = m log (D) - m log (Dm) , em gue D é a dose, Dm é a dose necessária para um efeito de 50 %, fa é a fração afetada pela dose, fu é a fração não afetada, e m é o coeficiente da sigmoidicidade da curva de dose-efeito. Para cada combinação dupla foi utilizada uma combinação de razão não constante. Cada experiência foi repetida três vezes, e foi levado a cabo um minimo de três pontos de dados para cada fármaco isolado e três combinações. Combinação de Aplidina com Dexametasona

No dia 3, foi observado uma sinergia para combinações de Aplidina a 0,5 nM/Dexametasona a 1 nM e 10 nM (Figura 56).

Conforme ilustrado na figura 57, a combinação foi mais sinérgica aos 6 dias.

Combinação de Aplidina com Melfalano

As seguintes combinações mostraram efeitos guase aditivos aos dias 3 e 6 (Figuras 58 e 59 respetivamente).

Combinação de Aplidina com Doxorrubicina

Aos 3 dias, apenas uma combinação foi moderadamente sinérgica (Figura 60, combinação 1) e duas combinações foram aditivas (Figura 60, combinações 3 e 4).

Aos 6 dias apenas duas combinações foram aditivas (Figura 61, combinação 7 e 8) .

Combinação de Aplidina com lenalidomida (Revlimid®)

No presente estudo, a combinação de Aplidina e lenalidomida (Revlimid®) mostrou maiores graus de sinergia do que outras combinações examinadas (Figura 62).

Notavelmente, a sinergia foi mais importante aos 6 dias (Figura 63).

Combinação de Aplidina com Bortezomib

Esta combinação mostrou antagonismo aos 3 dias (Figura 64) ; aos 6 dias, a sinergia foi verificada para duas combinações (Figura 65, combinação 4 e 6).

Exemplo 4: Estudos in vivo para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outros agentes padrão em xenoenxertos de melanoma e renais. A finalidade deste estudo consistiu em avaliar a atividade antitumoral de Aplidina guando administrada com um agente padrão antitumoral, ambos administrados utilizando um regime de doses múltiplas em vários tipos de xenoenxertos tumorais em ratinhos atimicos do sexo feminino.

Ratinhos nus atimicos, do sexo feminino foram recibidos de Harlan Sprague Dawley, Madison, Wisconsin com 4-5 semanas de idade. Os ratinhos foram aclimatados ao laboratório durante pelo menos uma semana antes da implantação do tumor. Os animais foram alojados em jaulas estáticas com comida e água disponíveis ad libitum. Os animais experimentais foram implantados com fragmentos tumorais derivados a partir de tumores humanos estabelecidos de transplante ou com células obtidas diretamente a partir de cultura in vitro. Os tumores foram implantados por via subcutânea no flanco direito no Dia 0 .

As medições do tamanho tumoral foram registadas duas vezes por semana iniciando no dia 4 ou 5 utilizando um paquímetro. A fórmula para calcular o volume para uma elipsoide alongada foi utilizada para estimar o volume tumoral a partir de medições tumorais bidimensionais: volume tumoral (mm3) = (comprimento x largura2) : 2. Assumindo uma densidade unitária, o volume foi convertido em peso (ou seja, 1 mm3 = 1 mg). Quando os tumores atingiram um intervalo de volume aproximado de 100 ± 15 mg, os ratinhos foram randomizados em grupos de tratamento e controlo. Os tratamentos foram iniciados e administrados numa base de peso corporal do indivíduo. Um estudo de descoberta de intervalo de doses foi realizado em cada modelo tumoral para determinar o nível de dose apropriado de cada composto utilizado nos estudos de combinação.

Os seguintes agentes de padrão de cuidados para os vários tipos de cancro (indicações) foram combinados com Aplidina (APL) para determinar se a terapêutica de combinação proporcionará uma maior atividade antitumoral quando comparada com a atividade combinada dos dois agentes administrados como monoterapêuticas.

Os quadros 5-10 mostram a cinética do volume tumoral liquido (média ± S.E.M., mg) depois do inicio do tratamento com Aplidina seja isoladamente ou em combinação com um agente de padrão de cuidados em xenoenxertos de melanoma e cancro renal. O Quadro 5 e figura 66 e 67 mostram a cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (Aplidin®) como um agente único ou em combinação com DTIC e carboplatina em xenoenxertos de tumor de melanoma MRI-H187. A Aplidina foi administrada cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção intraperitoneal (i.p.), solução salina (solução salina estéril) cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., DTIC cada dia durante 5 dias consecutivos através de injeção i.p. e Carboplatina uma dose cada 4 dias durante um total de 4 tratamentos através de injeção i.p..

Quadro 5

S.E.M.=Erro padrão da média

Quadro 5 (cont.)

Quadro 5 (cont. )_

A partir deste estudo de xenoenxertos concluiu-se que nas células de melanoma MRI-H187 a combinação de Aplidina com DTIC e Aplidina com carboplatina mostrou uma clara potenciação estatisticamente significativa da atividade antitumoral, sendo mais destacável no caso da combinação com carboplatina. 0 Quadro 6 e figura 68 e 69 mostram a cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (Aplidin®) como um agente único ou em combinação com Interleucina-2 (IL-2) e Interferão-α 2a (INF-a) em xenoenxertos de tumor de melanoma MRI-H187. A Aplidina foi administrada cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., solução salina (solução salina estéril) cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., IL-2 cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 dias através de injeção i.p. e INF-α cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 semanas através de injeção subcutânea (s.c.).

Quadro 6_

S.E.M.=Erro padrão da média Quadro 6 (cont.)

A partir deste estudo de xenoenxertos concluiu-se que nas células de melanoma MRI-H187 a combinação de Aplidina com IL-2 e Aplidina com INF-a mostrou aditividade. 0 Quadro 7 e figura 70 e 71 mostram a cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com DTIC e carboplatina em xenoenxertos de tumor de melanoma LOX-IMVI. A Aplidina foi administrada cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., solução salina (solução salina estéril) cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., DTIC cada dia durante 5 dias consecutivos através de injeção i.p. e Carboplatina uma dose cada 4 dias durante um total de 4 tratamentos através de injeção i.p.. _Quadro 7_

A partir deste estudo de xenoenxertos pode concluir-se que nas células de melanoma LOX-IMVI a combinação de Aplidina com DTIC mostra um padrão aditivo e a combinação de Aplidina com carboplatina mostra uma tendência para o sinergismo. 0 Quadro 8 e figura 72 e 73 mostram a cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Interleucina-2 (IL-2) e Interferão-α 2a (INF-a) em xenoenxertos de tumor de melanoma LOX-IMVI. A Aplidina foi administrada cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., solução salina (solução salina estéril) cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., IL-2 cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 dias através de injeção i.p. e INF-a cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 semanas através de injeção s.c..

Quadro 8

A partir deste estudo de xenoenxertos concluiu-se que nas células de melanoma LOX-IMVI a combinação de Aplidina com IL-2 e Aplidina com INF-a mostrou aditividade. O Quadro 9 e figura 74, 75 e 76 mostram a cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Bevacizumab (Avastin®) , Interleucina-2 (IL-2) e Interferão-α 2a (INF-oí) em xenoenxertos de tumor renal CaKi-1. A Aplidina foi administrada cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., solução salina (solução salina estéril) cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., Bevacizumab (Avastin®) cada 3 dias durante um total de 4 tratamentos através de injeção i.p., IL-2 cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 dias através de injeção i.p. e INF-a cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 semanas através de inj eção s.c..

Quadro 9___

S.E.M.=Erro padrão da média

Quadro 9 (cont. )_

A partir deste estudo de xenoenxertos concluiu-se que nas células renais CaKi-1 a combinação de Aplidina com Avastin® e Aplidina com IL-2 mostrou sinergia, sendo mais destacável no caso da combinação com IL-2. Por outro lado, a combinação de Aplidina com INF-a mostra um padrão aditivo. 0 Quadro 10 e figura 77, 78 e 79 mostram a cinética do volume tumoral liquido depois do inicio do tratamento com Aplidina (APL) como um agente único ou em combinação com Bevacizumab (Avastin®), Interleucina-2 (IL-2) e Interferão-a 2a (INF-a) em xenoenxertos de tumor renal MRI-H121. A Aplidina foi administrada cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., solução salina (solução salina estéril) cada dia durante 9 dias consecutivos através de injeção i.p., Bevacizumab (Avastin®) cada 3 dias durante um total de 4 tratamentos através de injeção i.p., IL-2 cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 dias através de injeção i.p. e INF-a cada dia durante 5 dias semanais (Segunda-Sexta) durante 3 semanas através de injeção s.c..

Quadro 10___

S.E.M.=Erro padrão da média

Quadro 10 (cont. )_

A partir deste estudo de xenoenxertos concluiu-se que nas células renais MRI-H121 as três combinações mostram um padrão aditivo.

Exemplo 5. Ensaios in vitro adicionais em linhas celulares de mieloma múltiplo (RPMI-8226 e U266B1) foram realizados para determinar o efeito de Aplidina em combinação com dois agentes quimioterapêuticos de padrão de cuidados (Bortezomib e Melfalano). A Aplidina como um agente único ou em combinação com Bortezomib ou Melfalano foram avaliados frente a linhas celulares de mieloma múltiplo, especificamente as linhas celulares RPMI-8226 e U266B1.

Estas linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI1640 com FBS a 10 % e L-Glutamina a 1 %. Cada linha celular foi colocada em placas de 96 poços a 20.000 células por poço.

Em primeiro lugar foram testados a Aplidina, Bortezomib e Melfalano isoladamente para determinar o valor de IC5o para cada um deles individualmente. Para determinar o valor de IC50 cada fármaco foi verificado num intervalo diferente de concentração de fármaco, seguindo o procedimento conforme descrito no Exemplo 1. O Quadro 11 mostra a IC50 individual obtida com cada um dos três fármacos frente às duas linhas celulares de mieloma múltiplo. _Quadro 11_

Na seguinte etapa Bortezomib ou Melfalano foram combinados com Aplidina. Nestas experiências, as concentrações de Aplidina foram utilizadas com uma diluição seriada de 1:10. Cada diluição seriada foi emparelhada com 4 concentrações diferentes de Bortezomib e Melfalano.

As placas foram incubadas durante 3 dias a 37 °C e 5 % de CO2. As placas foram lidas utilizando o sistema de ensaio Promega MTS com o MTS sendo metabolizado por células vivas transformando-se em formazano que é fluorescente a um comprimento de onde de 490 nm. Isto foi uma medida indireta da viabilidade celular. Estas foram analisadas utilizando o programa Softmax Pro® que determina a viabilidade celular com base na percentagem dos poços de controlo. Estes dados de IC50 foram depois transferidos para o programa CalcuSyn para análise do índice de combinação. O CalcuSyn compara a IC50, os valores dos fármacos isoladamente com aqueles dos fármacos em combinação utilizando um algoritmo para determinar um índice de combinação. É importante notar que o índice de combinação (Cl) é um reflexo do efeito da combinação dos dois fármacos: Cl = 1 indica um efeito aditivo; Cl < 1 indica um efeito sinérgico; e Cl > 1 indica um efeito antagónico. 0 Quadro 12 resume aquelas doses em que foi observado um efeito sinérgico na combinação de Aplidina com Bortezomib frente à linha celular RMPI 8226: ^_Quadro 12_^^

O Quadro 13 resume aquelas doses em que foi observado um efeito sinérgico na combinação de Aplidina comMelfalano frente à linha celular RMPI 8226: _Quadro 13_

0 Quadro 14 resume aquelas doses em que foi observado um efeito sinérgico na combinação de Aplidina com Bortezomib frente à linha celular U266B 1: _Quadro 14_

0 Quadro 15 resume aquelas doses em que foi observado um efeito sinérgico na combinação de Aplidina com Melfalano frente à linha celular U266B1:

Quadro 15

Exemplo 6. Ensaios in vitro adicionais em linhas celulares de leucemia (M0LT4 e K-562) foram realizados para determinar o efeito de Aplidina em combinação com um agente quimioterapêutico de padrão de cuidados como Idarrubicina. A Aplidina como um agente único ou em combinação com

Idarrubicina foram avaliados frente a linhas celulares de leucemia, especificamente as linhas celulares M0LT4 e K562.

Estas linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI1640 com FBS a 10 % e L-Glutamina a 2 mM. Cada linha celular foi colocada em placas de 96 poços a 20.000 células por poço.

Em primeiro lugar foram testados Aplidina e Idarrubicina isoladamente para determinar o valor de IC5o para cada um deles individualmente. Para determinar o valor de IC5o cada fármaco foi verificado num intervalo diferente de concentração de fármaco, seguindo o procedimento conforme descrito no Exemplo 1. O Quadro 16 mostra a IC50 individual obtida com cada um dos dois fármacos frente às duas linhas celulares de leucemia.

Quadro 16

I

Na seguinte etapa Idarrubicina foi combinada com Aplidina. Na experiência relacionada com a linha celular M0LT4, as concentrações de Aplidina foram utilizadas com uma diluição seriada de 1:10. Cada diluição seriada foi emparelhada com 4 concentrações diferentes de Idarrubicina. Na experiência relacionada com a linha celular K562, as concentrações de Aplidina foram utilizadas com uma diluição seriada de 1:5, e uma concentração de Idarrubicina foi adicionada a conjunto de combinação com base numa razão. Conseguentemente, a combinação A foi de 1:1, a combinação B foi de 0,008 : 1, a combinação C foi de 6,4E-05:1 e a combinação D foi de 5,12E-07:1.

As placas foram incubadas durante 3 dias a 37 °C e 5 % de CO2 · As placas foram lidas utilizando o sistema de ensaio Promega MTS com o MTS sendo metabolizado por células vivas transformando-se em formazano gue é fluorescente a um comprimento de onde de 490 nm. Isto foi uma medida indireta da viabilidade celular. Estas foram analisadas utilizando o programa Softmax Pro® que determina a viabilidade celular com base na percentagem dos poços de controlo. Estes dados de IC50 foram depois transferidos para o programa CalcuSyn para análise do índice de combinação. 0 CalcuSyn compara a IC50, os valores dos fármacos isoladamente com aqueles dos fármacos em combinação utilizando um algoritmo para determinar um índice de combinação. É importante notar que o índice de combinação (Cl) é um reflexo do efeito da combinação dos dois fármacos: Cl = 1 indica um efeito aditivo; Cl < 1 indica um efeito sinérgico; e Cl > 1 indica um efeito antagónico. 0 Quadro 17 resume aquelas doses em que foi observado um efeito sinérgico na combinação de Aplidina com Idarrubicina frente à linha celular M0LT4: _Quadro 17_

0 Quadro 18 resume aquelas doses em que foi observado um efeito sinérgico na combinação de Aplidina com Idarrubicina frente à linha celular K562:

Quadro 18

Exemplo 7: Estudos in vivo para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outro agente padrão em xenoenxertos de melanoma. A finalidade deste estudo consistiu em avaliar a eficácia antitumoral de Aplidina quando administrada em combinação com Carboplatina frente a células de melanoma humano UACC-257 implantadas por via subcutânea em ratinhos NCr-nu/nu atimicos do sexo feminino.

Os animais foram alojados em jaulas microisoladoras, até cinco por j aula num ciclo de luz/escuridão de 12 horas. Ratinhos NCr-nu/nu atimicos com seis semanas de idade e do sexo feminino foram aclimatados nos laboratórios durante uma semana antes da experiência.

Cada ratinho foi inoculado por via subcutânea perto do flanco direito com células de melanoma humano UACC-257 a partir de uma cultura celular in vitro utilizando uma agulha de 23 gauge. Cada ratinho recebeu 2 x 107 células ressuspendidas em 0. 2 ml de Matrigel®. Um frasco com células congeladas de melanoma humano UACC-257 foi descongelado e cultivado em meio RPMI 1640 contendo baixa glucose (2.000 mg/1), bicarbonato de sódio (1.500 mg/ml), L-glutamina a 2 mM, e soro fetal bovino a 10 % (meio completo) , e deixado crescer numa incubadora a +37 °C numa atmosfera humidificada com 5 % de C02 até que foi obtido o número necessário de células para inoculação. As células foram colhidas depois de quatro passagens em cultura. As células foram removidas dos frascos, colocadas em tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugadas a 1.000 rpm durante 10 minutos numa centrífuga refrigerada. Os sedimentos celulares foram ressuspendidos em meio novo completo. A contagem e viabilidade celular foram determinadas com um contador de células e analisador de viabilidade Beckman Coulter VI CELL XR. A suspensão celular foi centrifugada, e o sedimento celular foi ressuspendido em Matrigel® a uma densidade celular de 1, 0 x 108 células/ml e colocado em gelo húmido. A concentração final de Matrigel® na suspensão celular foi de 56, 9 %. No dia da colheita das células a viabilidade celular foi de 98,9 %. O dia da inoculação das células tumorais foi designado como Dia 0. Tumores individuais cresceram para 150-245 mg em peso (150-245 mm3 em tamanho) no dia do início do tratamento, o Dia 13 depois da inoculação das células tumorais. Quarenta animais com tumores no intervalo de tamanho adequado foram atribuídos a quatro grupos de tratamento de modo que os pesos tumorais médios no primeiro dia de tratamento estavam tão perto uns dos outros como possível. A experiência consistiu de um grupo de controlo tratado com veículo de 10 ratinhos e três grupos tratados com fármaco de 10 ratinhos por grupo para um total de 40 ratinhos no primeiro dia de tratamento, o Dia 13 depois da inoculação das células tumorais. Os animais no grupo 1 foram tratados i.p. cada dia durante 9 dias consecutivos (Dias 13-21) com um veículo de Aplidina diluído com solução salina. Aplidina foi administrada 1. p. cada dia durante 9 dias (Dias 13-21) a uma dosagem de 60 yg/kg/dose isoladamente (Grupo 2) ou em combinação com Carboplatina (Grupo 4). A carboplatina foi administrada i.v. cada 4 dias durante um total de três tratamentos (Dias 13, 17, e 21) a uma dosagem de 50 mg/kg/dose (Grupo 3) ou em combinação com Aplidina (Grupo 4) . Nos dias em gue ambos os compostos foram administrados no Grupo 4, a Aplidina foi injetada em primeiro lugar a todos os dez animais no grupo, seguida imediatamente pela administração de Carboplatina (Grupo 4). O Grupo 1 foi tratado i .p. com cremofor EL a 0,18 %/etanol a 0,18 %/WFI a 0,84 %/solução salina a 98,8 % (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal). A Aplidina foi reconstituída com um veículo contendo cremofor EL a 15 %/etanol a 15 %/WFI a 70 % e diluída com solução salina (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal). A Carboplatina foi preparada em WFI (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal) .

Os animais foram observados diariamente e os sinais clínicos foram anotados. Os tumores s.c. foram medidos e os animais foram pesados duas vezes por semana começando com o primeiro dia de tratamento, o Dia 13. O volume tumoral foi determinado através de medições com calibre (mm) e utilizando a fórmula para uma esfera elipsoide: L x W2/2®mm3, onde L e W se referem às dimensões perpendiculares maior e menor recolhidas em cada medição. Esta fórmula também foi utilizada para calcular o peso tumoral, assumindo uma densidade unitária (1 mm3= 1 mg) . A comparação do peso tumoral médio nos grupos de tratamento (T) com o peso tumoral médio no grupo de controlo (T/C x 100 %) no Dia 23 (dois dias depois do final do tratamento) e Dia 70 (o dia da conclusão do estudo) foi utilizada para avaliação da eficácia antitumoral. %T/C para cada tratamento é relatada no Quadro 19.

Quadro 19_

Regime de veiculo: qld x 9 dia 13 Regime de Aplidina: qld x 9 dia 13 Regime de carboplatina: q4d x 3 dia 13

Regime de Aplidina/Carboplatina: qld x 9 dia 13/ q4d x 3 dia 13 O tratamento de combinação de Aplidina mais Carboplatina foi tolerado sem mortes. 0 tratamento de combinação resultou em valores T/C de 95 % e 53 % nos Dias 23 e 70, respetivamente.

Exemplo 8: Estudos in vivo para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outro agente padrão em xenoenxertos de mieloma. A finalidade deste estudo consistiu em avaliar a eficácia antitumoral de Aplidina quando administrada em combinação com bortezomib frente a células de mieloma humano RPMI 8226 implantadas por via subcutânea em ratinhos SCID do sexo masculino.

Os animais foram alojados em jaulas microisoladoras, até cinco por jaula num ciclo de luz/escuridão de 12 horas. Ratinhos SCID com seis semanas de idade e do sexo masculino foram aclimatados nos laboratórios durante uma semana antes da experiência.

Cada ratinho foi inoculado s.c. perto do flanco direito com células de mieloma humano RPMI 8226 a partir de uma cultura celular in vitro utilizando uma agulha de 23 gauge. Cada ratinho recebeu 2 x 107 células ressuspendidas em 0,2 ml de Matrigel®.

As células de mieloma humano RPMI 8226 foram originalmente adquiridas da ATCC (número ATCC: CCL-155). Um frasco com células congeladas foi descongelado e cultivado em meio RPMI 1640 contendo elevada glucose (4.500 mg/1), bicarbonato de sódio (1.500 mg/ml), L-glutamina a 2 mM, HEPES a 10 mM, piruvato de sódio a 1 mM, e soro fetal bovino a 10 % (meio completo), e deixado crescer numa incubadora a +37 °C numa atmosfera humidificada com 5 % de CO2 até que foi obtido o número necessário de células para inoculação. As células foram colhidas depois de quatro passagens em cultura. As células foram removidas dos frascos, colocadas em tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugadas a 1.000 rpm durante 10 minutos numa centrífuga refrigerada. Os sedimentos celulares foram ressuspendidos em meio novo completo. A contagem e viabilidade celular foram determinadas com um contador de células e analisador de viabilidade Beckman Coulter VI CELL XR. A suspensão celular foi centrifugada novamente, e o sedimento celular foi ressuspendido em Matrigel® a uma densidade celular de 1,0 x 108 células/ml e colocado em gelo húmido. A concentração final de Matrigel® na suspensão celular foi de 78,3 %. No dia da colheita das células a viabilidade celular foi de 89,3 %. O dia da inoculação das células tumorais foi designado como Dia 0 . Tumores individuais cresceram para 75-188 mg em peso (75-188 mm3 em tamanho) no dia do início do tratamento, o Dia 18 depois da inoculação das células tumorais. Aqueles animais selecionados com tumores no intervalo de tamanho adequado foram atribuídos a quatro grupos de tratamento de modo que os pesos tumorais médios no primeiro dia de tratamento estavam tão perto uns dos outros como possível. A experiência consistiu de um grupo de controlo tratado com veículo de 10 ratinhos e três grupos tratados com fármaco de 10 ratinhos por grupo para um total de 40 ratinhos no primeiro dia de tratamento, o Dia 18 depois da inoculação das células tumorais. Os animais no grupo 1 foram tratados i.p. durante dois ciclos cada dia durante 9 dias consecutivos (Dias 18-26 e Dias 38-46) com um veiculo de Aplidina diluído com solução salina. Aplidina foi administrada i.p. durante dois ciclos cada dia durante 9 dias consecutivos (Dias 18-26 e Dias 38-46) a uma dosagem de 60 yg/kg/dose isoladamente (Grupo 2) ou em combinação com bortezomib (Grupo 4) . Bortezomib foi administrado i.v a uma dosagem de 0,35 mg/kg/dose durante quatro semanas cada 3 dias durante um total de 2 tratamento iniciando-se no Dia 18 seguido por mais uma injeção i.v. administrada no Dia 46 isoladamente (Grupo 3) ou em combinação com Aplidina (Grupo 4) . Nos dias em que ambos os compostos foram administrados no Grupo 4, a Aplidina foi injetada em primeiro lugar a todos os dez animais no grupo, seguida imediatamente pela administração de bortezomib (Grupo 4). O Grupo 1 foi tratado i.p. com cremo for EL a 0,18 %/etanol a 0,18 %/WFI a 0,84 %/solução salina a 98,8 % (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal). A Aplidina foi reconstituída com um veículo contendo EL cremofor a 15 %/etanol a 15 %/WFI a 70 % e diluída com solução salina (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal). Velcade® (Bortezomib) foi preparado em solução salina (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal).

Os animais foram observados diariamente e os sinais clínicos foram anotados. Os tumores s.c. foram medidos e os animais foram pesados duas vezes por semana começando com o primeiro dia de tratamento, o Dia 18 depois da inoculação das células tumorais. O volume tumoral foi determinado através de medições com calibre (mm) e utilizando a fórmula para uma esfera elipsoide conforme descrito no Exemplo 7. A comparação do peso tumoral médio nos grupos de tratamento (T) com o peso tumoral médio no grupo de controlo (T/C x 100 %) no Dia 27 (um dia depois do final do primeiro ciclo de tratamento com Aplidina) e Dia 48 (dois dias depois da conclusão do tratamento com Aplidina e Bortezomib) foi utilizada para avaliação da eficácia antitumoral. %T/C para cada tratamento é relatada no Quadro 20.

Quadro 20 _

O tratamento de combinação de Aplidina mars Bortezomib foi tolerado sem mortes. O tratamento de combinação foi eficaz na inibição do crescimento das células de mieloma RPMI 8226, resultando em valores T/C de 49 % e 31 % nos Dias 27 e 48, respetivamente. A atividade antitumoral do tratamento de combinação foi maior ao aditivo comparado com a atividade antitumoral produzida pela administração de cada composto isoladamente.

Exemplo 9; Estudos in vivo para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outro agente padrão em xenoenxertos de linfoma. A finalidade deste estudo consistiu em avaliar a eficácia antitumoral de Aplidina quando administrada em combinação com rituximab frente a células de linfoma humano RL implantadas por via subcutânea em ratinhos SCID do sexo feminino.

Os animais foram alojados em jaulas microisoladoras, até cinco por jaula num ciclo de luz/escuridão de 12 horas. Ratinhos SCID com seis semanas de idade e do sexo masculino foram aclimatados nos laboratórios durante uma semana antes da experiência.

Cada ratinho foi inoculado s.c. perto do flanco direito com células de linfoma humano RL 822 6 a partir de uma cultura celular in vitro utilizando uma agulha de 23 gauge. Cada ratinho recebeu 1,0 x 107 células ressuspendidas em 0,2 ml de Matrigel®. Um frasco com células congeladas foi descongelado e cultivado em meio RPMI 1640 contendo elevada glucose (4.500 mg/1), bicarbonato de sódio (1.500 mg/ml), L-glutamina a 2 mM, HEPES a 10 mM, piruvato de sódio a 1 mM, e soro fetal bovino a 10 % (meio completo) , e deixado crescer numa incubadora a +37 °C numa atmosfera humidificada com 5 % de CO2 até que foi obtido o número necessário de células para inoculação. As células foram colhidas depois de seis passagens em cultura. As células foram removidas dos frascos, colocadas em tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugadas a 1.000 rpm durante 10 minutos numa centrífuga refrigerada. Os sedimentos celulares foram ressuspendidos em meio novo completo. A contagem celular foi determinada com um contador celular Coulter Model Z1 e a viabilidade foi medida após coloração com iodeto de propídio e analisada utilizando um citómetro de fluxo Beckman Coulter EPICS XL. A suspensão celular foi centrifugada novamente, e o sedimento celular foi ressuspendido em Matrigel® a uma densidade celular de 5,0 x 107 células/ml e colocado em gelo húmido. A concentração final de Matrigel® na suspensão celular foi de 73,0 %. No dia da colheita das células a viabilidade celular foi de 98,9 %. O dia da inoculação das células tumorais foi designado como Dia 0. Tumores individuais cresceram para 100-196 mg em peso (100-196 mm3 em tamanho) no dia do inicio do tratamento, o Dia 15 depois da inoculação das células tumorais. Quarenta animais com tumores no intervalo de tamanho adequado foram atribuídos a quatro grupos de tratamento de modo que os pesos tumorais médios em todos os grupos no primeiro dia de tratamento estavam tão perto uns dos outros como possivel. A experiência consistiu de um grupo de controlo tratado com veiculo de 10 ratinhos e três grupos tratados com fármaco de 10 ratinhos por grupo para um total de 40 ratinhos no primeiro dia de tratamento, o Dia 15 depois da inoculação das células tumorais. Os animais no grupo 1 foram tratados i .p. durante dois ciclos cada dia durante 9 dias consecutivos (Dias 15-23 e Dias 28-36) com um veiculo de Aplidina diluido com solução salina. Aplidina foi administrada i.p. durante dois ciclos cada dia durante 9 dias consecutivos (Dias 15-23 e Dias 28-36) a uma dosagem de 60 yg/kg/dose isoladamente (Grupo 2) ou em combinação com Rituximab (Grupo 4) . Rituximab foi administrado i.p. a uma dose de 20 mg/kg/dose durante quatro ciclos semanais de tratamento cada 3 dias durante um total de 2 tratamento (regime q3d x 2) iniciando-se no Dia 15 isoladamente (Grupo 3) ou em combinação com Aplidina (Grupo 4) . Nos dias em que ambos os compostos foram administrados no Grupo 4, a Aplidina foi injetada em primeiro lugar a todos os dez animais no grupo, seguida imediatamente pela administração de Rituximab (Grupo 4) . O Grupo 1 foi tratado i .p. com cremofor EL a 0,18 %/etanol a 0,18 %/WFI a 0,84 %/solução salina a 98,8 % (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal). A Aplidina foi reconstituída com um veiculo contendo EL cremofor a 15 %/etanol a 15 %/WFI a 70 % e diluída com solução salina (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal). Rituxan® (Rituximab) foi preparado em solução salina (volume de injeção: 0,1 ml/10 g de peso corporal).

Os animais foram observados diariamente e os sinais clínicos foram anotados. Os tumores s.c. foram medidos e os animais foram pesados duas vezes por semana começando com o primeiro dia de tratamento, o Dia 15. O volume tumoral foi determinado através de medições com calibre (mm) e utilizando a fórmula para uma esfera elipsoide conforme descrito no Exemplo 7. A comparação do peso tumoral médio nos grupos de tratamento (T) com o peso tumoral médio no grupo de controlo (T/C x 100 %) no Dia 24 (um dia depois do final do primeiro ciclo de 9 dias de tratamento com Aplidina) e Dia 38 (dois dias depois da conclusão do segundo ciclo de 9 dias de tratamento com Aplidina e Bortezomib) foi utilizada para avaliação da eficácia antitumoral. %T/C para cada tratamento é relatada no Quadro 21.

Quadro 21 _

O tratamento de combinação de Aplidina mais Rituximab foi tolerado sem mortes. O tratamento de combinação foi eficaz na inibição do crescimento das células de linfoma RL, resultando em valores T/C de 69 % e 74 % nos Dias 24 e 38, respetivamente. Portanto, quando a Aplidina é combinada com Rituximab é observada uma potenciação da atividade antitumoral.

Exemplo 10: Estudos in vivo para determinar o efeito de Aplidina em combinação com outros agentes padrão (combinações triplas) em linhas celulares de mieloma múltiplo.

No presente estudo, foram analisadas combinações triplas de agentes antitumorais. Todas as combinações foram testadas utilizando um ensaio de viabilidade celular (MMT) na linha celular MM.1S, uma linha celular de MM muito sensivel. Os resultados foram analisados utilizando o software CalcuSyn. Linhas celulares e reagentes de cultura celular A linha celular de MM sensível a dexametasona MM.1S foi gentilmente cedida pelo Dr. S. Rudikoff, Bethesda MD) . A linha celular foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino inativado por calor a 10 %, penicilina a 100 U/ml, estreptomicina a 100 yg/ml e L-glutamina a 2 mM. Todos os meios de cultura celular e reagentes foram adquiridos da Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Ensaios de viabilidade celular A análise da proliferação de células de MM foi avaliada utilizando o ensaio colorimétrico de metiltiotetrazol (MTT; Sigma, St. Louis MO). Linhas celulares de MM foram semeadas a uma densidade de 50000 células/200 μΐ de meio por poço em placas de 48 poços, e tratadas com uma dose de fármaco determinada num momento determinado. Duas horas antes do final do tratamento, uma solução de MTT (5 mg/ml em PBS; normalmente a 10 % do volume em cada poço) foi adicionada e o sal de tetrazólio foi reduzido por células metabolicamente ativas a cristais de formazano coloridos. Depois da solubilização destes cristais por incubação durante a noite com solução de SDS-HC1 a 10 %, a absorvância foi medida a 570 nm com correção a 630 nm. Foram analisados quatro poços para cada condição, e os resultados são apresentados como a média ± DP de quadruplicados de uma experiência representativa que foi repetida pelo menos três vezes.

Análise de isobolograma A interação entre Aplidina e outros agentes anti-MM foi analisada utilizando o programa de software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO) . Os dados do ensaio de viabilidade celular (MTT) foram expressos como a fração de células afetadas pela dose (Fa) em células tratadas com fármaco em comparação com células não tratadas (controlo). Este programa baseia-se no método de Chou-Talalay de acordo com a seguinte equação Cl = (D)1/ (Dx)1 + (D) 1 (D) 2/ (Dx) 1 (Dx) 2 onde (D) 1 e (D) 2 são as doses de fármaco 1 e 2 que têm o mesmo efeito x quando utilizados isoladamente. O indice de combinação (Cl) calculado por computador foi utilizado para avaliar os resultados de uma combinação: CI>1, CI=1, e Cl < 1 indicando efeitos antagónicos, aditivos e sinérgicos, respetivamente. A conformidade dos dados com o princípio de efeito médio pode ser prontamente manifestada pelo coeficiente de correlação linear (r) do traçado de efeito médio: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), onde D é a dose, Dm é a dose necessária para um efeito de 50 %, fa é a fração afetada pela dose, fu é a fração não afetada, e m é o coeficiente da sigmoidicidade da curva de dose-efeito. Para cada combinação foi utilizada uma combinação de razão não constante.

Resultados

Combinação de Aplidina + Lenalidomida (Revlimid®) + Dexametasona A adição de Dexametasona à combinação de Aplidina + Lenalidomida mostrou uma sinergia importante em todas as combinações testadas na linha celular sensível (MM1S) (Figura 80) . Na figura 80 as doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Lenalidomida são expressas em unidades mM e as doses de Dexametasona são expressas em unidades μΜ. Combinação de Aplidina + Bortexomib + Dexametasona A adição de Dexametasona à combinação de Aplidina e Bortezomib resultou em várias doses com uma clara tendência para a sinergia (Figura 81) . Na figura 81 as doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Bortezomib são expressas em unidades nM e as doses de Dexametasona são expressas em unidades nM.

Combinação de Aplidina + Bortezomib + Lenalidomida (Revlimid®) A adição de Bortezomib à combinação de Aplidina com um agente imunomodulador tal como Lenalidomida aumento claramente o seu efeito antitumoral com Cl no intervalo sinérgico em MM1S (Figura 82). Na figura 82 as doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Bortezomib são expressas em unidades nM e as doses de Lenalidomida são expressas em unidades mM. Combinação de Aplidina + Talidomida + Dexametasona

Esta combinação mostrou uma clara sinergia nas combinações triplas como pode ser visto na Figura 83. Na figura 83 as doses de Aplidina são expressas em unidades nM, as doses de Talidomida são expressas em unidades mM e as doses de Dexametasona são expressas em unidades μΜ.

Combinação de Aplidina + Melfalano + Dexametasona

Esta combinação também mostrou um claro intervalo sinérgico, principalmente com doses elevadas dos fármacos (Figura 84). Na figura 84 as doses de Aplidina são expressas em unidades μΜ, as doses de Melfalano são expressas em unidades mM e as doses de Dexametasona são expressas em unidades nM. Combinação de Aplidina + Melfalano + Bortezomib

Esta combinação resultou num Cl no intervalo sinérgico quando utilizando doses elevadas (Figura 85) . Na figura 85 as doses de Aplidina são expressas em unidades μΜ, as doses de Melfalano são expressas em unidades mM e as doses de Bortezomib são expressas em unidades nM.

Estas verificações em relação à Aplidina podem estender-se aos análogos, derivados e compostos relacionados com aplidina. Por exemplo, também se descreveu uma combinação de um composto tal como aqueles documento WO 02 02596 com um fármaco anticancro, preferentemente paclitaxel (Taxol®), doxorrubicina, cisplatina, trióxido de arsénico, 5-fluorouracilo (5-FU), citosina arabinósido (Ara-C), carboplatina, 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN38), etopósido (VP16), melfalano, dexametasona, ciclofosfamida, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomida (Revlimid®), interleucina-2 (IL-2), Interferão-a 2 (INF-a), dacarbazina (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarrubicina, talidomida e rituximab.

Exemplos de análogos de aplidina que podem ser utilizados no lugar da própria Aplidina incluem os compostos preferidos dados no documento WO 02 02596. Mais preferentemente, os análogos são estruturalmente próximos da Aplidina, e normalmente diferem da Aplidina em relação a um aminoácido ou à cadeia lateral terminal. O aminoácido diferente pode estar na parte cíclica da molécula ou na cadeia lateral. Muitos exemplos de tais compostos são dados no documento WO 02 02596.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9104985 A [0002] • WO 9942125 A [0003] [0046] • WO 0135974 A [0003] [0008] [0048] • WO 0176616 A [0003] • WO 0230441 A [0003] [0006] [0008] • WO 0202596 A [0003] [0182] [0183] • WO 0333013 A [0003] • WO 2004080477 A [0003] [0010] • WO 2004080421 A [0007] • WO 03033013 A [0009]

Documentos de não patente citados na descrição • FAIRCLOTH, G. et al. Dehydrodidemnin B (DDB) a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models. New Drugs Cancer Ther., 12 March 1996 [0004] • FAIRCLOTH, G. et al. Preclinical characterization of aplidine, a new marine anticancer depsipeptide. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 1997, vol. 38 [0004] • DEPENBROCK H ; PETER R ; FAIRCLOTH GT ; MANZANARES I ; JIMENO J ; HANAUSKE AR. In vitro activity of Aplidine, a new marine-derived anticancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells. Br. J. Cancer, 1998, vol. 78, 739-744 [0004] • FAIRCLOTH G ; GRANT W ; NAM S ; JIMENO J ; MANZANARES I ; RINEHART K. Schedule-dependency of Aplidine, a marine depsipeptide with antitumor activity. Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 1999, vol. 40, 394 [0004] • BROGGINI M ; MARCHINI S ; D' INCALC I M ; TARABOLETTI G ; GIAVAZZI R ; FAIRCLOTH G ; JIMENO J. Aplidine blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-R1 autocrine loop in a human leukemic cell line. Clin. Cancer Res., 2000, vol. 6, 4509 [0004] • ERBA E ; BASSANO L ; DI LIBERTI G ; MURADORE I ; CHIORINO G ; UBEZIO P ; VI GNAT I S ; CODEGONI A ; DESIDERIO MA ; FAIRCLOTH G. Cell cycle phase perturbations and apoptosis in tumour cells induced by aplidine. Br. J. Cancer, 2002, vol. 86, 1510-1517 [0004]

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Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Aplidina para utilização num método de tratamento de mieloma múltiplo através de terapêutica de combinação pela combinação de Aplidina em combinação sinérgica com dexametasona.
2. 2. Aplidina para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a Aplidina e dexametasona fazem parte da mesma composição.
3. 3. Aplidina para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a Aplidina e dexametasona são proporcionadas como composições separadas em que a dexametasona é administrada antes, durante ou depois da administração de Aplidina.
4. 4. Aplidina para a utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a Aplidina e dexametasona são proporcionadas como composições separadas em que a dexametasona é administrada antes, ou depois da administração de Aplidina.