CN101389347A - 提高的抗肿瘤治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及aplidine或aplidine类似物与其它抗肿瘤药剂的联合及这些联合在治疗癌症中的应用，特别是在治疗肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤中的应用。

Description

提高的抗肿瘤治疗
发明领域
本发明涉及Aplidine或aplidine类似物与其它抗肿瘤药剂的联合及这些联合在治疗癌症中的应用，特别是在治疗肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤中的应用。
发明背景
Aplidine(Dehydrodidemnin B)是环状酯肽，其分离自地中海海洋被囊动物，Aplidium albicans，并且是WO 9104985的主题。其涉及已知为didemnins的化合物，并具有下列结构：
关于Aplidine，aplidine类似物，其应用，制剂和合成的更多的信息可以见于专利申请WO 9942125，WO 0135974，WO 0176616，WO0230441，WO 0202596，WO 0333013和WO 2004080477。我们通过具体参考这些PCT文本的每个的内容来结合。
在动物临床前研究和人临床I期研究中，Aplidine已经显示具有针对广谱的肿瘤类型包括白血病和淋巴瘤的细胞毒潜在作用。见例如：
Faircloth，G.等：＂Dehydrodidemnin B(DDB)a new marine derivedanticancer agent with activity against experimental tumour models(Dehydrodidemnin B (DDB)，一种具有针对实验肿瘤模型的活性的新的海洋来源的抗癌剂)＂，9th NCI-EORTC Symp.New Drugs Cancer Ther(新的药物癌症治疗).(3月12-15日，Amsterdam)1996，Abst 111；
Faircloth，G.等：＂Preclinical characterization of aplidine，a new marineanticancer depsipeptide(aplidine的临床前特征，一种新的海洋抗癌酯肽)＂，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.1997，38：Abst 692；
Depenbrock H，Peter R，Faircloth GT，Manzanares I，Jimeno J，HanauskeAR.：＂In vitro activity of Aplidine，a new marine-derived anticancer compound，on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoieticprecursor cells(Aplidine，一种新的海洋来源的抗癌化合物对新鲜移植的克隆原人肿瘤细胞和造血前体细胞的体外活性)＂Br.J.Cancer(英国癌症杂志)，1998；78：739-744；
Faircloth G，GrantW，Nam S，Jimeno J，Manzanares I，Rinehart K.：＂Schedule-dependency of Aplidine，a marine depsipeptide with antitumoractivity＂(具有抗肿瘤活性的Aplidine，一种海洋酯肽的时间依赖性)，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.1999；40：394；
Broggini M，Marchini S，D′Incalci M，Taraboletti G，Giavazzi R，Faircloth G，Jimeno J.：＂Aplidine blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-R1autocrine loop in a human leukemic cell line(Aplidine在人白血病细胞系中阻断VEGF分泌和VEGF/VEGF-R1自分泌环)＂，Clin.Cancer Res(临床癌症研究).2000；6(增刊)：4509；
Erba E，Bassano L，Di Liberti G，Muradore I，Chiorino G，Ubezio P，Vignati S，Codegoni A，Desiderio MA，Faircloth G，Jimeno J和D′Incalci M.：＂Cell cycle phase perturbations and apoptosis in tumour cells induced byaplidine(aplidine诱导的在肿瘤细胞中的细胞周期阶段扰动和凋亡)＂，Br.J.Cancer(英国癌症杂志)2002；86：1510-1517；
Paz-Ares L，Anthony A，Pronk L，Twelves C，Alonso S，Cortes-Funes H，Celli N，Gomez C，Lopez-Lazaro L，Guzman C，Jimeno J，Kaye S.：＂Phase Iclinical and pharmacokinetic study of aplidine，a new marine didemnin，administered as 24-hour infusion weekly(aplidine，一种新的海洋didemnin每周一次的24小时输注施用的I期临床和药物代谢动力学研究)＂Clin.Cancer Res(临床癌症研究).2000；6(增刊)：4509；
Raymond E，Ady-Vago N，Baudin E，RibragV，Faivre S，Lecot F，WrightT，Lopez Lazaro L，Guzman C，Jimeno J，Ducreux M，Le Chevalier T，ArmandJP.：＂A phase I and pharmacokinetic study of aplidine given as a 24-hourcontinuous infusion every other week in patients with solid tumor andlymphoma(在患有实体瘤和淋巴瘤的患者中，每隔一周以24小时持续输注给药aplidine的I期和药物代谢动力学研究)＂，Clin.Cancer Res(临床癌症研究).2000；6(增刊)：4510；
Maroun J，Belanger K，Seymour L，Soulieres D，Charpentier D，Goel R，Stewart D，Tomiak E，Jimeno J，Matthews S.：＂Phase I study of aplidine in a 5day bolus q 3 weeks in patients with solid tumors and lymphomas(在患有实体瘤和淋巴瘤的患者中，以每3周5天的推注进行aplidine的I期研究)＂，Clin.Cancer Res(临床癌症研究).2000；6(增刊)：4509；
Izquierdo MA，Bowman A，Martinez M，Cicchella B，Jimeno J，GuzmanC，Germa J，Smyth J.：＂Phase I trial of Aplidine given as a 1 hour intravenousweekly infusion in patients with advanced solid tumors and lymphoma(在患有晚期实体瘤和淋巴瘤的患者中以每周一次1小时静脉内的输注给药Aplidine的I期试验)＂，Clin.Cancer Res(临床癌症研究).2000；6(增刊)：4509。
机制研究显示Aplidine可以在ALL-MOLT4细胞中阻断VEGF分泌并且在来自患有再一次或复发的ALL和AML的小儿科患者中的AML和ALL样品中观察到低浓度(5nM)的体外细胞毒活性。Aplidine表现出在药物处理的白血病细胞中体外诱导G1和G2抑制。除了VEGF受体的下调之外，很少了解其它的Aplidine作用的方式。
在关于Aplidine的I期临床研究中，以24小时预处理或共施用给药L-肉碱来防止骨髓毒性，见例如WO 02 30441。共施用L-肉碱证实能够提高药物诱导的肌肉毒性的恢复并且容许Aplidine的剂量增加。
以前，用Aplidine联合其它的抗癌剂进行的体外和体内测定显示测定的药物联合在治疗白血病和淋巴瘤的联合治疗中是有用的。在WO2004080421中，对Aplidine和甲氨蝶呤，阿糖胞苷，米托蒽醌，长春碱，甲泼尼龙和多柔比星的联合治疗白血病和淋巴瘤进行了具体地评估。
因为癌症是动物和人死亡的主要原因，已经进行并且正在进行一些努力以获得对于施用于遭受癌症的患者是具有活性和安全的抗肿瘤疗法。本发明待解决的问题是提供有效治疗癌症的抗肿瘤疗法。
发明概述
我们已经发现Aplidine和aplidine类似物加强其它抗癌药剂的效力并且因此可以成功地用于治疗癌症的联合疗法。本发明涉及药物组合物，药物剂型，试剂盒，使用这些联合疗法治疗癌症的方法和Aplidine和aplidine类似物用于制备用于联合治疗的药物的应用。
根据本发明的一个方面，我们提供基于Aplidine和aplidine类似物，使用其它的有效治疗癌症的药物的有效联合疗法。优选地，其它的一种或多种药物有效治疗选自下列各项的癌症：肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤。最优选地其它的一种或多种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP 16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米(bortezomib)，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00092
白介素-2(IL-2)，干扰素-α2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00093
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
在另一个实施方案中，本发明包括治疗癌症的方法，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的Aplidine或aplidine类似物，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物，和治疗有效量的有效治疗癌症的另一种药物或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物，所述另一种药物在施用Aplidine或aplidine类似物前，过程中或其后进行施用。在本发明的另一个实施方案中，施用治疗有效量的第三种药物，并且在施用Aplidine或aplidine类似物和第二种药物之前，过程中或其后进行施用。
优选地，所述其它的一种或多种药物有效治疗选自下列各项的癌症：肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤。最优选地，所述其它的一种或多种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00101
白介素-2(IL-2)，干扰素-α2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00102
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。其它的一种或多种药物可以形成同一组合物(same composition)的部分，或作为单独的组分(separate compositions)提供以用于在同时或在不同时间进行施用。
在另一个方面中，本发明包括增加有效治疗癌症的药物的治疗功效的方法，所述有效治疗癌症的药物优选地是有效治疗选自肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤的癌症的药物，最优选地是选自由紫杉醇
Figure A200780006866D00103
多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00104
白介素-2(IL-2)，干扰素-α 2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00105
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗组成的组的药物，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物，所述方法包括向需要所述治疗的患者施用一定量的Aplidine或aplidine类似物，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物。Aplidine或aplidine类似物在施用其它药物之前，过程中或之后施用。在本发明的另一个实施方案中，施用治疗有效量的第三种药物，并且在施用Aplidine或aplidine类似物和第二种药物之前，过程中，或之后进行施用。优选地，所述第三种药物是有效治疗选自肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤的癌症的药物。最优选地，所述第三种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇
Figure A200780006866D00106
多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00107
白介素-2(IL-2)，干扰素-α 2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00108
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物。
在另一个方面，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含Aplidine或aplidine类似物，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物和有效治疗癌症的另一种药物。在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物还包含也有效治疗癌症的第三种药物。优选地，其它一种或多种药物有效治疗选自肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤的癌症。最优选地，其它的一种或多种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00112
白介素-2(IL-2)，干扰素-α 2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00113
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
本发明还包括用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包括Aplidine或aplidine类似物，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物的剂型，有效治疗癌症的另一种药物，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物的剂型，和用于联合使用每种作用物来治疗或预防癌症的说明书。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含也有效治疗癌症的第三种药物，或其药用前药，盐，溶剂合物或水合物的剂型。优选地，其它的一种或多种药物有效治疗选自下列各项的癌症：肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤。最优选地，其它的一种或多种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇
Figure A200780006866D00114
多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP 16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00115
白介素-2(IL-2)，干扰素-α2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00116
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
本发明还包括基于使用三种药物，Aplidine和aplidine类似物，加上两种其它的药物(第二种药物和第三种药物)的有效的联合疗法。
在一个优选的方面，本发明涉及协同联合。
附图简述
图1.作为揭示协同作用存在的方法的线性回归分析的实例。
图2.Aplidine
Figure A200780006866D00117
与紫杉醇
Figure A200780006866D00118
联合针对SKBR3细胞的体外活性数据。
图3.Aplidine
Figure A200780006866D00121
与紫杉醇
Figure A200780006866D00122
联合针对MOLT3细胞的体外活性数据。
图4.Aplidine
Figure A200780006866D00123
与紫杉醇
Figure A200780006866D00124
联合针对PC3细胞的体外活性数据。
图5.Aplidine与紫杉醇
Figure A200780006866D00126
联合针对HL60细胞的体外活性数据。
图6.Aplidine
Figure A200780006866D00127
与紫杉醇
Figure A200780006866D00128
联合针对MX1细胞的体外活性数据。
图7.Aplidine与紫杉醇
Figure A200780006866D001210
联合针对A549细胞的体外活性数据。
图8.Aplidine
Figure A200780006866D001211
与多柔比星(DOX)的联合针对A549细胞的体外活性数据。
图9.Aplidine与多柔比星(DOX)的联合针对HT29细胞的体外活性数据。
图10.Aplidine与多柔比星(DOX)的联合针对PC3细胞的体外活性数据。
图11.Aplidine
Figure A200780006866D001214
与多柔比星(DOX)的联合针对MOLT3细胞的体外活性数据。
图12.Aplidine
Figure A200780006866D001215
与多柔比星(DOX)的联合针对MX1细胞的体外活性数据.
图13.Aplidine
Figure A200780006866D001216
与多柔比星(DOX)的联合针对SKBR3细胞的体外活性数据。
图14.Aplidine
Figure A200780006866D001217
与顺铂(DDP)的联合针对MX1细胞的体外活性数据。
图15.Aplidine
Figure A200780006866D001218
与顺铂(顺式-DDP)的联合针对HT29细胞的体外活性数据。
图16.Aplidine(APL，
Figure A200780006866D001219
)与顺铂(顺式DDP，DDP)的联合针对SKBR3细胞的体外活性数据。
图17.Aplidine与顺铂(顺式DDP，DDP)的联合针对MOLT3细胞的体外活性数据。
图18.Aplidine与顺铂(顺式DDP，DDP)的联合针对A549细胞的体外活性数据。
图19.Aplidine
Figure A200780006866D00132
与三氧化二砷(TRI)联合针对A549细胞的体外活性数据。
图20.Aplidine与三氧化二砷(TRI)的联合针对HT29细胞的体外活性数据。
图21.Aplidine与三氧化二砷(TRI)的联合针对PC3细胞的体外活性数据。
图22.Aplidine
Figure A200780006866D00135
联合三氧化二砷(TRI)针对MOLT3细胞的体外活性数据。
图23.Aplidine
Figure A200780006866D00136
与5-氟尿嘧啶(5FU)联合针对HL60细胞的体外活性数据。
图24.Aplidine
Figure A200780006866D00137
与5-氟尿嘧啶(5FU)联合针对SKBR3细胞的体外活性数据。
图25.Aplidine
Figure A200780006866D00138
与5-氟尿嘧啶(5FU)联合针对A549细胞的体外活性数据。
图26.Aplidine
Figure A200780006866D00139
与5-氟尿嘧啶(5FU)联合针对PC3细胞的体外活性数据。
图27.Aplidine与5-氟尿嘧啶(5FU)联合针对HT29细胞的体外活性数据。
图28.Aplidine
Figure A200780006866D001311
与阿糖胞苷(AraC)联合针对SKBR3细胞的体外活性数据。
图29.Aplidine
Figure A200780006866D001312
与阿糖胞苷(AraC)联合针对A549细胞的体外活性数据。
图30.Aplidine
Figure A200780006866D001313
与阿糖胞苷(AraC)联合针对PC3细胞的体外活性数据。
图31.Aplidine
Figure A200780006866D001314
与阿糖胞苷(AraC)联合针对HL60细胞的体外活性数据。
图32.Aplidine
Figure A200780006866D001315
与阿糖胞苷(AraC)联合针对HT29细胞的体外活性数据。
图33.Aplidine与卡铂的联合针对PC3细胞的体外活性数据。
图34.Aplidine与卡铂的联合针对HT29细胞的体外活性数据。
图35.Aplidine与卡铂的联合针对A549细胞的体外活性数据。
图36.Aplidine
Figure A200780006866D00144
与卡铂的联合针对MOLT3细胞的体外活性数据。
图37.Aplidine
Figure A200780006866D00145
与卡铂的联合针对MX1细胞的体外活性数据。
图38.Aplidine
Figure A200780006866D00146
与SN-38的联合针对A549细胞的体外活性数据。
图39.Aplidine
Figure A200780006866D00147
与SN-38的联合针对SKBR3细胞的体外活性数据。
图40.Aplidine
Figure A200780006866D00148
与SN-38的联合针对HL60细胞的体外活性数据。
图41.Aplidine
Figure A200780006866D00149
与SN-38的联合针对PC3细胞的体外活性数据。
图42A和42B.Aplidine
Figure A200780006866D001410
与VP16(B)的联合针对HL-60细胞的体外活性数据。
图43A和43B.Aplidine
Figure A200780006866D001411
与VP16(B)的联合针对K562细胞的体外活性数据。
图44A和44B.Aplidine
Figure A200780006866D001412
与VP16(B)的联合针对MOLT-3细胞的体外活性数据。
图45A和45B.Aplidine
Figure A200780006866D001413
与VP16(B)的联合针对MC116细胞的体外活性数据。
图46A和46B.Aplidine与VP16(B)的联合针对RAMOS细胞的体外活性数据。
图47A和47B.Aplidine
Figure A200780006866D001415
与VP16(B)的联合针对U937细胞的体外活性数据。
图48A和48B.Aplidine
Figure A200780006866D001416
与VP16(B)的联合针对NCI-H929细胞的体外活性数据。
图49A和49B.Aplidine与VP16(B)的联合针对HUNS-1细胞的体外活性数据。
图50A和50B.Aplidine
Figure A200780006866D001418
与VP16(B)的联合针对U266B1细胞的体外活性数据。
图51A和51B.Aplidine
Figure A200780006866D001419
与VP16(B)的联合针对RPMI8226细胞的体外活性数据。
图52.Aplidine
Figure A200780006866D00151
与卡铂的联合针对LOX-I-MVI细胞的体外活性数据。
图53.Aplidine与卡铂的联合针对UACC-257细胞的体外活性数据。
图54.在MM1S，MM1R，U266和U266-LR7细胞系中，在(48小时处理)后对Aplidine的剂量反应。
图55.Aplidine
Figure A200780006866D00153
和其它药物对MM1S细胞系(48小时处理)的剂量功效的比较。
图56.Aplidine
Figure A200780006866D00154
和地塞米松的联合，三天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图57.Aplidine和地塞米松的联合，6天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图58.Aplidine
Figure A200780006866D00156
和美法仑的联合，三天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图59.Aplidine
Figure A200780006866D00157
和美法仑的联合，6天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图60.Aplidine
Figure A200780006866D00158
和多柔比星的联合，3天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图61.Aplidine
Figure A200780006866D00159
和多柔比星的联合，6天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图62.Aplidine
Figure A200780006866D001510
和Lenalidomide的联合，3天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图63.Aplidine
Figure A200780006866D001512
和Lenalidomide
Figure A200780006866D001513
的联合，6天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图64.Aplidine
Figure A200780006866D001514
和硼替佐米的联合，3天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图65.Aplidine
Figure A200780006866D001515
和硼替佐米的联合，6天。
A)剂量效应曲线.B)Fa-CI图。
图66.在用Aplidine
Figure A200780006866D001516
作为单一药剂或与达卡巴嗪联合开始治疗后，在MRI-H-187黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图67.在用Aplidine
Figure A200780006866D00161
作为单一药剂或与卡铂联合开始治疗后，在MRI-H-187黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图68.在用Aplidine
Figure A200780006866D00162
作为单一药剂或与白介素-2(IL-2)联合开始治疗后，在MRI-H-187黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图69.在用Aplidine作为单一药剂或与干扰素-α 2a(INF-α)联合开始治疗后，在MRI-H-187黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图70.在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与达卡巴嗪(DTIC)联合开始治疗后，在LOX-IMVI黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图71.在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与卡铂联合开始治疗后，在LOX-IMVI黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图72.在用Aplidine作为单一药剂或与白介素-2(IL-2)联合开始治疗后，在LOX-IMVI黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图73.在用Aplidine
Figure A200780006866D00165
作为单一药剂或与干扰素-α 2a(INF-α)联合开始治疗后，在LOX-IMVI黑素瘤肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图74.在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与贝伐单抗
Figure A200780006866D00166
联合开始治疗后，在CaKi-1肾肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图75.在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与白介素-2(IL-2)联合开始治疗后，在CaKi-1肾肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图76.在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与干扰素-α2a(INF-α2a)联合开始治疗后，在CaKi-1肾肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图77.在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与贝伐单抗联合开始治疗后，在MRI-H 121肾肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图78.在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与白介素-2(IL-2)联合开始治疗后，在MRI-H 121肾肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图79在用Aplidine(APL)作为单一药剂或与干扰素-α 2a(INF-α)联合开始治疗后，在MRI-H 121肾肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。
图80.Aplidine(A)+Lenalidomide
Figure A200780006866D00171
+地塞米松(D)的联合在MM1S中在72小时的处理后。Aplidine剂量以nM单位表示，Lenalidomide剂量以μM单位表示，地塞米松剂量以nM单位表示。
图81.Aplidine(A)+硼替佐米(B)+地塞米松(D)的联合在MM1S中在72小时处理后。Aplidine剂量以nM单位表示，硼替佐米剂量以nM单位表示，并且地塞米松剂量以nM单位表示。
图82.Aplidine(A)+硼替佐米(B)+Lenalidomide在MM1S中在72小时处理后。Aplidine剂量以nM单位表示，硼替佐米剂量以nM单位表示，并且Lenalidomide剂量以μM单位表示。
图83.Aplidine(A)+沙利度胺(T)+地塞米松(D)的联合在MM1S中在72小时处理后。Aplidine剂量以nM单位表示，沙利度胺剂量以μM单位表示，和地塞米松剂量以nM单位表示。
图84.Aplidine(A)+美法仑(M)+地塞米松(D)的联合在MM1S中在72小时处理后。Aplidine剂量以nM单位表示，美法仑剂量以μM单位表示，和地塞米松剂量以nM单位表示。
图85.Aplidine(A)+美法仑(M)+硼替佐米(B)的联合在MM1S中在72小时处理后。Aplidine剂量以nM单位表示，美法仑剂量以μM单位表示，硼替佐米剂量以nM单位表示。
发明详述
所谓“癌症”意味着包括肿瘤，瘤和任何其它恶性组织或细胞。本发明涉及Aplidine或aplidine类似物用于联合治疗一般癌症的应用，但是更优选地用于治疗肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤。
为了研究Aplidine对其它的抗癌药剂的可能的增效作用，我们开始了对于可能应用在上述癌症类型中的药物联合的系统研究。在不同的细胞系类型上进行药物联合研究。使用肿瘤细胞系如对Aplidine具有不同敏感性(从低到高)的NSCL A549，乳腺癌MX1，早幼粒细胞性白血病HL60，结肠腺癌HT29，前列腺癌PC3，乳腺癌SKBR3和急性淋巴母细胞白血病(MOLT3)进行体外研究。还用白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤和黑素瘤细胞系进行了另外的研究。此外，使用以黑素瘤，肾，骨髓瘤，和淋巴瘤异种移植物进行的体内研究来确定Aplidine与其它标准药剂的联合的效果。最终，使用三种药物的联合，即Aplidine与两种其它的标准药剂(第二和第三种药物)的联合在多发性骨髓瘤细胞系中进行体外研究。
作为一般结论，我们发现Aplidine在肿瘤细胞中的细胞毒性在与用于该评估的许多标准药剂的联合中被大大增加。用Aplidine与紫杉醇
Figure A200780006866D00181
多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00182
白介素-2(IL-2)，干扰素-α 2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00183
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗的联合观察到了主要的协同作用效果。此外，还发现用Aplidine与上述提及的药剂的三重联合还获得细胞毒性的增加。
特别优选的是，Aplidine与紫杉醇的联合，其用于治疗癌症，更具体地治疗选自乳腺癌，白血病，和前列腺癌的癌症。
特别优选的是，Aplidine与多柔比星的联合，其用在治疗癌症中，更具体地在治疗选自肺癌，结肠癌，前列腺癌，和多发性骨髓瘤的癌症中。
特别优选的是，Aplidine与顺铂的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗选自乳腺癌，和结肠癌的癌症中。
特别优选的是Aplidine与三氧化二砷的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗选自肺癌，结肠癌和前列腺癌的癌症中。
特别优选的是，Aplidine与5-氟尿嘧啶的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗选自下列各项的癌症中：白血病，肺癌，乳腺癌，和前列腺癌。
特别优选的是Aplidine与阿糖胞苷的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗选自下列各项的癌症中：肺癌，乳腺癌，和前列腺癌。
特别优选的是Aplidine与卡铂的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗选自下列各项的癌症中：结肠癌，前列腺癌，和黑素瘤。
特别优选的是Aplidine与SN38的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗肺癌中。
特别优选的是Aplidine与依托泊苷的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗选自下列各项的癌症中：淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
特别优选的是Aplidine与地塞米松的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与lenalidomide的联合用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与硼替佐米的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与达卡巴嗪的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗黑素瘤中。
特别优选的是Aplidine与贝伐单抗的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗肾癌中。
特别优选的是Aplidine与白介素-2的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗肾癌中。
特别优选的是Aplidine与美法仑的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与伊达比星的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗白血病中。
特别优选的是Aplidine与利妥昔单抗的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗淋巴瘤中。
特别优选的是Aplidine与沙利度胺的联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与lenalidomide和地塞米松的三重联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与硼替佐米和地塞米松的三重联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与硼替佐米和lenalidomide的三重联合用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与硼替佐米和沙利度胺的三重联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与地塞米松和沙利度胺的三重联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与地塞米松和美法仑的三重联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
特别优选的是Aplidine与美法仑和硼替佐米的三重联合，其用在治疗癌症中，更具体地用在治疗多发性骨髓瘤中。
本发明的组合物可以在单一的药用制剂中包含全部的成分(药物)。或者，所述成分可以单独配制并且彼此联合施用。可以将本领域技术人员熟知的各种药用制剂用在本发明中。选择用在本发明的适合的制剂可以由本领域技术人员基于施用的方式和组合物的成分的溶解性特征常规进行。
包含Aplidine或aplidine类似物的药物组合物的实例包括适合静脉内给药的液体组合物(溶液，混悬液或乳剂)，并且它们可以包含纯的化合物，或组合以任何载体或其它药用活性化合物。溶解的Aplidine在热和光胁迫测试条件下显示充分的降解，并且开发了冻干的剂型，见结合在本文作为参考的WO 99 42125。
本发明的Aplidine或组合物的施用基于给药手册优选地通过静脉内输注给药。我们优选使用多到72小时的输注时间，更优选地1-24小时，其中约1，约3或约24小时是最优选的。较短的输注时间尤其理想，其容许进行治疗，而不用在医院过夜。然而，输注根据需要可以是约24小时或甚至更长。输注可以以变化的模式，以适当的间隔进行，举例说明每周一次，每周两次，或每周更频繁，任选地以典型地一或数周的间隙每周重复。
联合的化合物的正确的剂量将根据具体的制剂，应用的方式和具体的位点，待治疗的宿主和肿瘤而变化。要考虑其它的因素如年龄，体重，性别，饮食，给药时间，排泄率，宿主的状况，药物联合，反应敏感度和疾病的严重性。施用可以在最大耐受剂量内持续地或周期地进行。施用Aplidine的另外的指导在WO 01 35974中给出，将其完全结合在本文作为参考。
在一个方面，本发明涉及应用Aplidine或aplidine类似物的协同联合。协同作用的指示可以容易地通过测试联合和分析结果而获得，例如通过线性回归分析而获得。参考图1来举例说明该点。可以将备选的方法如等效线图解分析(isobologram analysis)用于揭示协同作用并且可以用于本发明的目的。
适合的aplidine类似物包括由WO0202596的权利要求1所定义的化合物，尤其是权利要求1的任何从属权利要求所定义的化合物。我们通过具体参考在WO 02 02596中关于作为aplidine的类似物的化合物的公开内容，包括权利要求而结合其。
实施例
实施例1.确定Aplidine联合另一种标准药剂对肿瘤细胞系的作用的体外研究
针对一些肿瘤细胞系评估Aplidine作为单一药剂或与选定的标准化疗剂联合以测量在细胞毒性中的不同。
选择下列标准药剂作为单一药剂并且与Aplidine联合：紫杉醇
Figure A200780006866D00211
多柔比星，顺铂，三氧化二砷
Figure A200780006866D00212
5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂和7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)。
单一的药剂Aplidine以不同的效价对一些癌症类型具有细胞毒性。为此原因，选择对Aplidine具有低度，中度或高度敏感性的代表性肿瘤细胞系。将所用的肿瘤细胞系列在表1中。
表1
 
癌症类型(细胞系) 对Aplidine的敏感性
NSCL(A549) 低度
乳腺癌(MX1) 低度
早幼细胞性白血病(HL60) 中度
结肠腺癌(HT29) 中度
前列腺癌(PC3) 中度
乳腺癌(SKBR3) 高度
急性淋巴母细胞白血病(MOLT3) 高度
以两部分进行筛选：
a.在第一组测定中，在每种肿瘤细胞系暴露于药物72小时后，测定每种化合物的IC50值。
所有的细胞系在各自生长培养基中，以37℃，5％ CO2和98％湿度维持。所有的培养基配方不包含抗生素。在接种细胞之前的一天，将所有的培养物用新鲜的完全的生长培养基培养。在收获(接种)日，将细胞用锥虫蓝排除染色法(碱性细胞培养物)进行计数。收集细胞并且以10,000细胞/孔接种在96孔微量滴定板中的190μL培养基中并且温育24小时以容许细胞在药物添加前贴壁。细胞用药物进行处理，并且通过MTS测定(四氮唑)测量细胞毒性效应，所述MTS测定是测量活细胞的数量的比色方法。在用药物温育72小时后，将25μL的MTS+PMS溶液加入每个微量滴定孔中并且在37℃温育4小时。接着从培养箱移出板，并且置于板摇动器上5分钟(用铝箔覆盖以避光)。在分光光度计板阅读器上在490nm读出光密度。使用SoftMax v 3.12程序分析数据。
计算IC50，其是IG50(测量到50％的生长抑制的浓度)的近似等价物。使用SoftMax程序产生回归曲线，接着将50％的抑制浓度手工加入并且将该浓度通过除以化合物的分子量来转化该浓度为摩尔(M)。将每个IC50值(72小时药物暴露)显示在表2中。IC50值表示100％的药物浓度。
表2
Figure A200780006866D00221
Figure A200780006866D00231
表2(续)
Figure A200780006866D00232
Figure A200780006866D00241
b.在第二组测定中，用Aplidine与上述提及的标准药剂的每一种的联合对每种细胞系进行温育，所述联合以下列的特别的IC50浓度的组合进行：
Aplidine的IC50                      标准药剂的IC50
100％                                           0％
75％                                            25％
60％                                            40％
50％                                            50％
40％                                            60％
30％                                            70％
25％                                            75％
0％                                             100％
0％                                             0％
将微量滴定板在5％ CO2和37℃温育72小时。通过MTS测定测量细胞毒性效应。在490nm读光密度。对标准化数据进行绘图并且如所述进行解释。将数据分析为：
1.将Prism(Graphpad)软件程序用于将数据相对于对照值而标准化(100％＝在无药剂(药物)存在下的细胞生长；0％＝空白对照)。
2.将标准化的数据绘制为散点图。对于每种药剂(药物)联系(connecting)100％ IC50的值绘制线。明显在线之上的值指示拮抗作用，在下面的值指示协同作用，并且在线上的值指示可加性。
数据的统计处理按照Laska E.等Biometrics(1994)50：834-841和Greco等Pharmacol Rev(药物综述).(1995)47：331-385。当对细胞增殖的抑制超过每种药物单独的最大抑制值(在100％ IC50)时，判断在测试的剂量比率上的联合是有协同作用的。相反，当抑制低于两个最大值时，可以推断出拮抗作用。当联合的作用对于两种药物没有明显不同于最大值时，推断出可加性。通过对在每种剂量比率上的抑制对比对于每种药物的最大值的抑制进行斯氏t检验来评估统计显著性。对于每种细胞系的药物联合的总的显著性取决于对于超过50％的剂量比率显示统计学显著性。
作为视觉辅助，在散点图上对反应值进行绘图，其中在X轴上给出剂量比率，在y轴上给出％反应值。在两个终点反应值(例如，在对于100％ IC50Aplidine和100％ IC50标准化疗剂的反应值之间)之间绘制水平线。如果在两个终点的剂量值大约相等，在该可加性的预期线之上或之下的点可以解释为分别代表拮抗或协同药物相互作用。
每种药物与Aplidine的体外联合具有协同，添加或拮抗作用的潜能。对于肿瘤细胞的协同细胞毒性是最佳的效果并且显示Aplidine与另一种药物的联合比单独的任一种药物更为有效。
根据该测定，发现：
a.Aplidine与紫杉醇的联合显示在乳腺癌SKBR3细胞(图2)，急性淋巴母细胞白血病MOLT3细胞(图3)和前列腺癌PC3细胞(图4)中显示协同作用。在早幼粒细胞白血病HL60细胞(图5)，乳腺癌MX1细胞(图6)和NSCLA549细胞(图7)中观察到可加性的趋势。
b.Aplidine与多柔比星的联合在NSCL A549细胞(图8)，结肠腺癌HT29细胞(图9)和前列腺癌PC3细胞(图10)中显示协同作用。在急性淋巴母细胞白血病MOLT3细胞(图11)，乳腺癌MX1细胞(图12)和乳腺癌SKBR3细胞(图13)中观察到可加性。
c.Aplidine与顺铂的联合在乳腺癌MX1细胞(图14)和结肠腺癌HT29细胞(图15)中显示协同作用。在乳腺癌SKBR3细胞(图16)和急性淋巴母细胞白血病MOLT3细胞(图17)中观察到可加性，和在NSCLA549细胞(图18)中发现协同作用的趋势。
d.Aplidine与三氧化二砷的联合在NSCL A549细胞(图19)，结肠腺癌HT29细胞(图20)和前列腺癌PC3细胞(图21)中显示协同作用。在急性淋巴母细胞白血病MOLT3细胞(图22)中观察到可加性。
e.Aplidine与5-氟尿嘧啶的联合在早幼粒细胞白血病HL60细胞(图23)，乳腺癌SKBR3细胞(图24)，NSCL A549细胞(图25)和前列腺癌PC3细胞(图26)中显示协同作用。在结肠腺癌HT29细胞(图27)中观察到可加性。
f.Aplidine与阿糖胞苷的联合在乳腺癌SKBR3细胞(图28)，NSCL乳A549细胞(图29)和前列腺癌PC3细胞(图30)中显示协同作用。在早幼粒细胞白血病HL60细胞(图31)和结肠腺癌HT29细胞(图32)中观察到可加性。g.Aplidine与卡铂的联合在前列腺癌PC3细胞(图33)和结肠腺癌HT29细胞(图34)中显示协同作用。在NSCL A549细胞(图35)，急性淋巴母细胞白血病MOLT3细胞(图36)和乳腺癌MX1细胞(图37)中观察到可加性。
h.Aplidine与SN38的联合在NSCL A549细胞(图38)中显示协同作用。在乳腺癌SKBR3细胞(图39)，早幼粒细胞白血病HL60细胞(图40)和前列腺癌PC3细胞(图41)中观察到可加性。
实施例2.确定Aplidine与另一种标准药剂的联合对白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤和黑素瘤肿瘤细胞系效果的体外研究
按照在实施例1中公开的相同的方法，针对一些肿瘤细胞系来评估Aplidine作为单一药剂或与选定的标准化疗剂联合以测量细胞毒性的不同。
选择下列标准药剂作为单一药剂并且与Aplidine联合：依托泊苷(VP16)和卡铂。将选择用于该测定的肿瘤细胞系显示在表3中。
表3
 
细胞系 肿瘤类型
HL-60 白血病
K562 白血病
MOLT-3 白血病
H9 淋巴瘤
HUT78 淋巴瘤
MC116 淋巴瘤
RAMOS 淋巴瘤
U937 淋巴瘤
NCI-H929 多发性骨髓瘤
HUNS-1 多发性骨髓瘤
U266B-1 多发性骨髓瘤
RPMI 8226 多发性骨髓瘤
LOXIMVI 黑素瘤
UACC-257 黑素瘤
细胞培养方法
所有的细胞系在各自生长培养基中，以37℃，5％ CO2和98％湿度维持。所有的培养基配方不包含抗生素。在接种细胞之前的一天，将所有的培养物用新鲜的完全的生长培养基培养。在收获(接种)日，将细胞用锥虫蓝排除染色法进行计数。
细胞接种
收集细胞并且以15,000细胞/孔接种在96孔微量滴定板中的190μL培养基中并且温育24小时以容许细胞在药物添加前贴壁。
药物处理
在100％DMSO中以5mg/ml制备Aplidine的贮存溶液。在100％DMSO中以2mg/ml的浓度对于两种药物制备化疗剂VP 16和卡铂的贮存溶液。
将细胞用Aplidine和其它的标准药剂以下面列出的范围进行处理，并且以每板一式三份地重复制备每个药物浓度。将所用的测试药剂的浓度表示为每种药剂的IC50的百分比，在实施例1中进行确定。
Aplidine的IC50                      标准药剂的IC50
100％                                           0％
75％                                            25％
60％                                            40％
50％                                            50％
40％                                            60％
30％                                            70％
25％                                            75％
0％                                             100％
将对于每种细胞系的每种药剂的每个IC50值显示在表4中。
表4
Figure A200780006866D00281
Figure A200780006866D00291
通过MTS测定(四氮唑)测量细胞毒性效应，所述测定是确定活细胞数量的比色方法。
在用测试药剂温育72小时后，将25μl的MTS+PMS溶液加入每个微量滴定孔中并且在37℃温育4小时。接着从培养箱移出板，并且置于板摇动器上5分钟(用铝箔覆盖以避光)。在分光光度计板阅读器上在490nm读出光密度。将数据分析为：
1将Prism(Graphpad)软件程序用于将数据相对对照值而标准化(100％＝在无药剂(药物)存在下的细胞生长；0％＝空白对照)。
2.将标准化的数据绘制为散点图。对于每种药剂(药物)联系100％ IC50的值绘制线。明显在线之上的值指示拮抗作用，在下面的值指示协同作用，并且正好在线上的值指示可加性。
数据的统计处理按照Laska E.等Biometrics(1994)50：834-841和Greco等Pharmacol Rev(药物综述).(1995)47：331-385。当对细胞增殖的抑制超过每种药物单独的最大抑制值(在100％ IC50)时，判断在测试的剂量比率上的联合是有协同作用的。相反，当抑制低于两个最大值时，可以认为拮抗作用。当联合的作用对于两种药物没有明显不同于最大值时，推断出可加性。通过对在每种剂量比率上的抑制对比对于每种药物的最大值的抑制进行斯氏t检验来评估统计学显著性。对于每种细胞系的药物联合的总的显著性取决于对于超过50％的剂量比率显示统计学显著性。
作为视觉辅助，在散点图上对反应值进行绘图，其中在x轴上给出剂量比率，在y轴上给出％反应值。在两个终点反应值(例如，在对于100％ IC50Aplidine和100％ IC50标准化疗剂的反应值之间)之间绘制水平线。如果在两个终点的反应值大约相等，在该可加性的预期线之上或之下的点可以解释为分别代表拮抗或协同药物相互作用。
在图42A和42B中，显示Aplidine与VP 16联合针对HL-60细胞的体外活性数据。根据该数据获得累加效应。
在图43A和43B中，显示Aplidine与VP 16联合针对K562细胞的体外活性数据。根据该数据获得可加性。
在图44A和44B中，显示Aplidine与VP 16联合针对MOLT-3细胞的体外活性数据。根据该数据获得可加性。
在图45A和45B中，显示用Aplidine与VP 16联合针对MC116细胞观察到的体外活性数据。根据该数据，在该肿瘤细胞系中获得可加性。
在图46A和46B中，显示用Aplidine与VP 16联合针对RAMOS细胞观察到的体外活性数据。根据该数据在该肿瘤细胞系中获得协同作用。
在图47A和47B中，显示用Aplidine与VP 16联合针对U937细胞观察到的体外活性数据。根据该数据获得可加性。
在图48A和48B中，显示用Aplidine与VP 16联合针对NCI-H929细胞观察到的体外活性数据。根据该数据获得协同作用。
在图49A和49B中，显示用Aplidine与VP 16联合针对HUNS-1细胞观察到的体外活性数据。根据该数据，在该肿瘤细胞系中获得可加性。
在图50A和50B中，显示用Aplidine与VP 16联合针对U266B-1细胞观察到的体外活性数据。根据该数据，在该肿瘤细胞系中获得可加性。
在图51A和51B中，显示用Aplidine与VP 16联合针对RPMI8226细胞观察到的体外活性数据。根据该数据，在该肿瘤细胞系中获得可加性。
在图52中，显示用Aplidine与卡铂的联合针对LOX-I-MVI细胞观察到的体外活性数据。根据该数据，在该肿瘤细胞系中获得可加性。
在图53中，显示用Aplidine与卡铂的联合针对UACC-257细胞观察到的体外活性数据。根据该数据在该肿瘤细胞系中获得协同作用。
实施例3：确定Aplidine与其它的标准药剂联合对多发性骨髓瘤肿瘤细胞系的效果的体外研究
多发性骨髓瘤(MM)是血浆细胞的恶性疾病，通常起源自在骨髓中增殖和积累的血浆细胞的克隆。患有骨髓瘤的患者的临床病理学特征包括在血液或尿液中的单克隆蛋白的聚集，松解的骨病灶，贫血症和肾功能障碍(Sirohi B.等Lancet(2004)363：875-87)。
骨髓瘤的实际治疗依赖于由干细胞移植支持的高剂量治疗。尽管在最近十年里取得的进展，目前，MM仍旧是不可治愈的疾病，对于患者的中值总存活时间是2-5年(Sirohi B.等Lancet(2004)363：875-87)。需要新的治疗方法来改善患者在三项主要的研究项目后的结果：a)通过使用高剂量增加化疗的功效；b)增加针对骨髓瘤细胞的宿主免疫应答；和c)开发具有更特异靶标的新药物，其不仅可以干扰骨髓瘤细胞，还干扰骨髓微环境(San Miguel JF等Curr.Treat.Options Oncol.(2003)4：247-58)。有希望的是，两种或多种这些治疗剂的联合将导致改善的抗-MM功效和更长的存活率。
因此，我们报道对Aplidine作为一种新药物在治疗多发性骨髓瘤的效果上的一些研究。这些研究包括：
1)使用细胞存活(MTT测定)和细胞凋亡(膜联蛋白V染色)测定，研究Aplidine(单独地或联合地)对一些MM细胞系的细胞毒性功效
2)Aplidine和其它的传统和最近开发的药物的联合在治疗该疾病中的细胞毒性功效。
材料和方法
细胞系和细胞培养试剂
将四种MM-来源的细胞系用在该研究中：人多发性骨髓瘤细胞系MM.1(Greenstein S.等Exp.Hematol(2003)31：.271-82)的地塞米松-敏感性(MM.1S)和地塞米松-抗性(MM.1R)变体，其由Dr.S Rudikoff，贝塞斯达MD惠赠；并且U266和其美法仑-抗性负体U266 LR7细胞系获自Dr.W.Dalton，Tampa，FL。将所有的MM细胞系培养在RPMI1640培养基中，所述培养基添加了10％热灭活的胎牛血清，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素和2mM的L-谷氨酰胺。所有的细胞培养基和试剂购自Invitrogen公司(卡尔斯巴德，CA)。
细胞存活测定
使用甲硫基四唑(MTT；西格玛，圣路易斯MO)比色测定评估MM细胞增殖的分析。将MM细胞系在48-孔板中以50000细胞/200μl培养基/孔的密度接种，并且用确定的药物剂量和时间进行处理。在治疗结束前两小时，加入MTT溶液(在PBS中的5mg/ml；通常是每个孔的体积的10％)，并且由代谢活性细胞还原四氮唑盐为有色的甲
Figure A200780006866D0032184744QIETU
晶体。在通过与10％SDS-HCl溶液过夜温育溶解这些晶体后，在570nm，以在630nm的校正测量吸光度。对于每种条件分析四个孔，并且将结果表示为重复至少三次的代表性实验的四次重复的平均值±SD。
蛋白质印迹
收集细胞，并且用PBS洗涤，在冰冷的裂解缓冲液(140 mM NaCl，10mM EDTA，10％甘油，1％ Nonidet P-40，20 mM Tris(pH7.0)1μM胃酶抑制剂，1μg/ml牛胰蛋白酶抑制剂，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1mM原钒酸钠)中温育后获得总的细胞裂解物。接着，在4℃，在10,000g离心样品达10分钟并且通过6％-12.5％ SDS-PAGE分辨上清液中等量的蛋白质。接着，将蛋白质转移到硝化纤维素或PVDF膜上，通过在PBST缓冲液(在PBS中的0.05％-Tween 20)中的5％脱脂干奶粉中温育来封闭，并随后用特定的一级antCruz Technologies，ibody[抗-p-c-jun，抗-p-Erkl/2和抗-Erk5抗体购自Santa Cruz Biotechnologies(圣克鲁斯，加利福尼亚)，而抗-p-p38获自CellSignaling(丹弗斯，MA)，抗-PARP抗体获自Becton Dickinson Biosciences(贝德福德，MA)]温育。在用相应的二抗第二次温育后，通过增加的化学发光(ECL；阿莫仙(Amersham)，阿灵顿山庄，伊利诺斯州)使免疫印迹显影。鉴定激活的JNK和Erk5需要在前用相应的特异性抗体和蛋白质A琼脂糖进行蛋白质裂解物的免疫沉淀。
等效线图解分析
使用Calcusyn软件程序(Biosoft，Ferguson，MO)分析在Aplidine和其它的抗-MM药剂之间的相互作用。将来自细胞存活测定(MTT)的数据表示为在药物处理的细胞中受剂量(Fa)影响的细胞与未处理细胞(对照)比较的分数。该程序基于根据下列等式CI＝(D)1/(Dx)1+(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2的Chou-Talalay方法(Chou TC等Adv.Enzyme Regul.(1984)22：27-55)，其中(D)1和(D)2是单独使用时具有相同x作用的药物1和2的剂量。少于1.0的CI值显示协同作用，等于1.0的CI值显示累加效应，而超过1的值对应于拮抗作用。
结果
在MM-来源的细胞系中对Aplidine的剂量反应
我们首先使用在对常规治疗药物敏感和具有抗性的MM-来源的细胞系上的MTT测定确定Aplidine是否影响细胞存活力。如在图54中所观察到的，Aplidine治疗48小时在所有的测试的细胞系中，以剂量依赖性方式诱导细胞存活力的类似减少。在48小时处理后，在存活细胞中的50％的减少(IC50)对于四种测试的细胞系在1-10nM范围内。
Aplidine在治疗MM上的功效还与其它传统(美法仑，地塞米松)和新药物(硼替佐米)进行比较。图55显示当以0.1-1nM剂量在MM.1S细胞系上测试48小时时，Aplidine相比于其它药物优越的功效；其效果类似于Bortexomib在最大剂量(10-100nM)的效果。
在Aplidine的双重联合中评价协同作用
由于向MM化疗的持续暴露在许多情况中与增加的毒性和新的药物抗性的发展相关，我们测试了最小毒性浓度的Aplidine与其它药物的联合是否影响MM细胞存活力。具体而言，在治疗MM中将Aplidine与传统药物联合(如地塞米松或美法仑)，还与最近开发的抗骨髓瘤药剂(硼替佐米)联合，和与特异性靶向骨髓微环境的药物(lenalidomide
Figure A200780006866D00331
)联合。
还对于上述提及的治疗剂进行1，2，3和6天的时间进程实验以确定对于联合实验的适合的次优剂量(10％-30％生长抑制)并且研究治疗的延续时间。在培养3天或6天后，进行Aplidine和其它药物的联合实验。通过如上所述的MTT测定测量MM.1S细胞系的细胞生长，并且通过CalcuSyn程序分析抑制百分比。使用计算机计算的联合指数(CI)来判断联合的效果：CI>1，CI＝1，和CI<1分别指示拮抗作用，累加效应和协同作用。数据与半数有效原则的一致性可以容易地通过半数有效绘图的线性相关系数(r)证实：log(fa/fu)＝m log(D)-m log(Dm)，其中D是剂量，Dm是50％效果所需要的剂量，fa是受剂量影响的分数，fu是未受影响的分数，并且m是剂量效应曲线的S形的系数。对于每个双重联合，使用非常数比率联合。每个实验重复三次，并且处理每个单一药物和三种联合的三个数据点的最小值。
Aplidine与地塞米松的联合
在第三天，对于0.5nM Aplidine/1nM和10nM地塞米松联合观察到协同作用(图56)。
如在图57中举例说明，联合在6天更加具有协同作用。
ADlidine与美法仑的联合
下列的联合显示在3和6天差不多的累加效应(分别为图58和59)。
Aplidine与多柔比星的联合
在3天，仅有一种联合具有中度的协同作用(图60，联合1)，两种联合具有累加效应(图60，联合3和4)。
在6天，仅有两种联合具有累加效应(图61，联合7和8)。
Aplidine与lenalidomide的联合
在本研究中，Aplidine和lenalidomide的联合显示与所有其它检查的联合相比，更大程度的协同作用(图62)。
明显地，协同作用在6天更加重要(图63)。
Aplidine与硼替佐米的联合
该联合在3天显示拮抗作用(图64)；在6天，对于两种联合发现协同作用(图65，联合4和6)。
实施例4：确定Aplidine与其它标准药剂的联合在黑素瘤和肾异种移植物中的作用的体内研究
本研究的目的是当与抗肿瘤标准药剂一起施用时，评估Aplidine在雌性无胸腺小鼠的数种类型的肿瘤异种移植物中的抗肿瘤活性，所述Aplidine和抗肿瘤标准药剂两者都使用多次给药时间表进行施用。
无胸腺雌性裸鼠来自Harlan Sprague Dawley，麦迪逊，威斯康星州，4-5周龄。在植入肿瘤之前，使小鼠适应实验室环境至少一周。将动物笼养在安静的笼中，随意取用食物和水。用来自移植建立的人肿瘤的肿瘤部分或直接获自体外培养物的细胞对实验动物进行移植。在第0天，将肿瘤皮下植入右胁。从第4或第5天开始，使用游标卡尺每周2次记录肿瘤大小测量。使用计算长椭球的体积的式估计来自2维肿瘤测量的肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长度 x 宽度2)÷2。设定单位密度，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。当肿瘤达到100±15mg的适合的体积范围时，将小鼠随机分为处理组和对照组。基于个体体重基础开始处理和给药。在每个肿瘤模型上进行剂量范围发现研究以确定在联合研究中所用的每种化合物的适合的剂量水平。
将下列治疗各种癌症类型(适应症)的标准药剂与Aplidine(APL)联合以确定联合疗法当与作为单一疗法施用的两种药剂的组合活性比较时，是否提供更大的抗肿瘤活性。
Figure A200780006866D00351
Figure A200780006866D00361
表5-10显示在黑素瘤和肾癌异种移植物中，开始用单独的Aplidine或用Aplidine与标准治疗药剂联合进行治疗后，净肿瘤体积(平均值±S.E.M.，mg)的动力学。
表5和图66和67显示在用Aplidine
Figure A200780006866D00362
作为单一药剂或与DTIC和卡铂联合在MRI-H187黑素瘤肿瘤异种移植物中开始治疗后的净肿瘤体积动力学。每天通过腹膜内(i.p.)注射给药Aplidine，持续9天，每天通过i.p注射给药盐水对照(无菌盐水)持续9天，每天通过i.p.注射给药DTIC，持续5天，和通过i.p.注射每4天给药卡铂一次，共4次治疗。
表5
Figure A200780006866D00363
S.E.M.＝平均值的标准误差
表5(续)
Figure A200780006866D00364
Figure A200780006866D00371
表5(续)
Figure A200780006866D00372
从该异种移植物研究中，得出结论为在黑素瘤MRI-H187细胞中，Aplidine与DTIC的联合和Aplidine与卡铂的联合显示明显的具有统计学显著性的抗肿瘤活性的潜力，其中在与卡铂的联合的情形中更为显著。
表6和图68和69显示在MRI-H-187黑素瘤肿瘤异种移植物中，用aplidine作为单一药剂或与白介素-2(IL-2)和干扰素-α 2a (INF-α)联合开始治疗后的净肿瘤体积的动力学。每天通过i.p注射给药Aplidine，持续9天，每天通过i.p注射给药盐水对照(无菌盐水)，持续9天，通过i.p注射在5个工作日(周一到周五)过程中每天给药IL-2，进行3周，并且通过皮下(s.c.)注射在5个工作日(周一到周五)过程中每天给药INF-α，进行3周。
表6
Figure A200780006866D00381
S.E.M.＝平均值的标准误差
表6(续)
Figure A200780006866D00382
从该异种移植物研究得出结论，即在黑素瘤MRI-H187细胞中，Aplidine与IL-2的联合和Aplidine与INF-α的联合显示可加性。
表7和图70和71显示用Aplidine(APL)作为单一药剂或与DTIC和卡铂联合在LOX-IMVI黑素瘤肿瘤异种移植物中开始治疗后的净肿瘤体积动力学。每天通过i.p.注射给药Aplidine，持续9天，每天通过i.p注射给药盐水对照(无菌盐水)持续9天，每天通过i.p.注射给药DTIC，持续5天，和通过i.p.注射每4天给药卡铂一次，共4次治疗。
表7
Figure A200780006866D00383
Figure A200780006866D00391
S.E.M.＝平均值的标准误差
从该异种移植物研究可以得出结论，即在黑素瘤LOX-IMVI细胞中，Aplidine与DTIC的联合显示累加效应模式，Aplidine与卡铂的联合显示协同作用的趋势。
表8和图72和73显示用Aplidine(APL)作为单一药剂或与白介素-2(IL-2)和干扰素-α 2a(INF-α)联合在LOX-IMVI黑素瘤肿瘤异种移植物中开始治疗后的净肿瘤体积动力学。每天通过i.p注射给药Aplidine，持续9天，每天通过i.p.注射给药盐水对照(无菌盐水)，持续9天，通过i.p.注射在5个工作日(周一到周五)过程中每天给药IL-2，进行3周，并且通过s.c.注射在5个工作日(周一到周五)过程中每天给药INF-α，进行3周。
表8
Figure A200780006866D00392
S.E.M.＝平均值的标准误差
从该异种移植物研究得出结论，即在黑素瘤LOX-IMVI细胞中，Aplidine与IL-2的联合和Aplidine与INF-α的联合显示可加性。
表9和图74，75和76显示Aplidine(APL)作为单一药剂或与贝伐单抗
Figure A200780006866D00393
白介素-2(IL-2)和干扰素-α 2a(INF-α)联合在CaKi-1肾肿瘤异种移植物中开始治疗后的净肿瘤体积动力学。每天通过i.p.注射给药Aplidine，持续9天，每天通过i.p注射给药盐水对照(无菌盐水)，持续9天，贝伐单抗
Figure A200780006866D00401
通过i.p.注射每3天给药，总共4次治疗，IL-2通过i.p.注射在5个工作日(周一-周五)过程中每天给药，进行3周，和INF-α在5个工作日(周一-周五)过程中通过s.c.注射每天给药，进行3周。
表9
Figure A200780006866D00402
S.E.M.＝平均值的标准误差
表9(续)
Figure A200780006866D00403
从该异种移植物研究得出结论，Aplidine与
Figure A200780006866D00411
的联合和Aplidine与IL-2的联合在肾CaKi-1细胞中显示协同作用，其中在与IL-2联合的情形中更为显著。在另一方面，Aplidine与INF-α的联合显示累加效应模式。
表10和图77，78和79显示在用aplidine(APL)作为单一药剂或与贝伐单抗
Figure A200780006866D00412
白介素-2(IL-2)和干扰素-α 2a(INF-α)联合开始治疗后在MRI-H121肾肿瘤异种移植物中的净肿瘤体积的动力学。每天通过i.p注射给药Aplidine，持续9天，每天通过i.p注射给药盐水对照(无菌盐水)，持续9天，贝伐单抗
Figure A200780006866D00413
通过i.p.注射每3天给药一次，总共4次治疗，IL-2通过i.p.注射在5个工作日(周一到周五)过程中每天给药，进行3周和INF-α通过s.c.注射在5个工作日(周一到周五)过程中每天给药，进行3周。
表10
Figure A200780006866D00414
S.E.M.＝平均值的标准误差
表10(续)
Figure A200780006866D00415
Figure A200780006866D00421
从该异种移植物研究得出结论，在肾MRI-H121细胞中，三种联合显示累加效应模式。
实施例5.在多发性骨髓瘤(RPMI-8226和U266B1)细胞系中进行另外的体外测定以确定Aplidine与两种标准治疗化疗剂(硼替佐米和美法仑)的联合的效果。
针对多发性骨髓瘤细胞系，具体地RPMI-8226和U266B1细胞系评价Aplidine作为单一药剂或与硼替佐米或美法仑的联合。
将这些细胞系培养在具有10％ FBS和1％L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。将每种细胞系以20,000细胞/孔接种在96孔板中。
首先单独测试Aplidine，硼替佐米和美法仑以确定对于它们每个的IC50值。为了确定IC50值，按照在实施例1中公开的方法，在不同范围的药物浓度检查每种药物的IC50值。表11显示针对两种多发性骨髓瘤细胞系的三种药物的每种获得的每个IC50。
表11
Figure A200780006866D00422
在下一个步骤中，将硼替佐米或美法仑与Aplidine联合。在这些实验中，使用1：10系列稀释的Aplidine浓度。将每个系列稀释度与4个不同浓度的硼替佐米或美法仑配对。
将板在37℃和5％ CO2培养3天。使用Promega MTS测定系统阅读所述板，其中MTS被活细胞代谢转化为甲
Figure A200780006866D0043113452QIETU
，其在490nm波长发荧光。这是细胞存活力的间接测量。使用Softmax Pro程序分析这些，所述程序基于对照孔的百分比确定细胞存活力。接着，将该IC50数据转化到CalcuSyn程序中进行联合指数分析。CalcuSyn使用算法比较单独的药物的IC50值和药物联合的IC50值以确定联合指数。重要的是注意联合指数(CI)是两种药物的联合效果的反映：CI＝1指示累加效应；CI<1指示协同作用；和CI>1指示拮抗作用效应。
表12总结那些剂量，其中在Aplidine与硼替佐米联合对抗RMPI8226细胞系中观察到协同作用：
表12
Figure A200780006866D00431
表13总结那些剂量，其中在Aplidine与美法仑的联合对抗RMPI 8226细胞系中观察到协同作用：
表13
Figure A200780006866D00432
Figure A200780006866D00441
表14总结那些剂量，其中在Aplidine与硼替佐米的联合对抗U266B1细胞系中观察到协同作用：
表14
Figure A200780006866D00442
表15总结那些剂量，其中在Aplidine与美法仑的联合对抗U266B1细胞系中观察到协同作用：
表15
Figure A200780006866D00443
Figure A200780006866D00451
实施例6.在白血病(MOLT4和K-562)细胞系中进行另外的体外测定以确定Aplidine与标准的治疗化疗剂如伊达比星联合的效果。
针对白血病细胞系，具体地MOLT4和K562细胞系评价Aplidine作为单一药剂或与伊达比星的联合。
将这些细胞系培养在具有10％ FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。将每种细胞系以20,000细胞/孔接种在96孔板中。
首先，单独测试Aplidine和伊达比星以确定它们每个的IC50值。为了确定IC50值，按照在实施例1中公开的方法，在不同范围的药物浓度检查每种药物。表16显示用两种药物的每种对抗两种白血病细胞系获得的每个IC50。
表16
Figure A200780006866D00452
在接下来的步骤中，伊达比星与Aplidine联合。在与MOLT4细胞系相关的实验中，使用1：10系列稀释度的Aplidine的浓度。每个系列稀释度与4个不同浓度的伊达比星组合。在与K562细胞系相关的实验中，使用1：5系列稀释度的Aplidine的浓度，基于比率，将伊达比星浓度加入每个联合组中。因此，联合A是1：1，联合B是0.008：1，联合C是6.4E-05：1并且联合D是5.12E-07：1。
将板在37℃和5％ CO2培养3天。使用Promega MTS测定系统阅读所述板，其中MTS被活细胞代谢转化为甲
Figure A200780006866D0046113557QIETU
，其在490nm波长发荧光。这是细胞存活力的间接测量。使用Softmax Pro程序分析这些，所述程序基于对照孔的百分比确定细胞存活力。接着，将该IC50数据转化到CalcuSyn程序中进行联合指数分析。CalcuSyn使用算法比较单独的药物的IC50值和药物联合的IC50值以确定联合指数。重要的是注意联合指数(CI)是两种药物的联合效果的反映：CI＝1指示累加效应；CI<1指示协同作用；和CI>1指示拮抗作用效应。
表17总结那些剂量，其中在Aplidine与伊达比星的联合对抗MOLT4细胞系中观察到协同作用：
表17
Figure A200780006866D00461
表18总结那些剂量，其中在Aplidine与伊达比星的联合对抗K562细胞系中观察到协同作用：
表18
Figure A200780006866D00462
Figure A200780006866D00471
实施例7：确定Aplidine与另一种标准药剂的联合在黑素瘤异种移植物中的作用的体内研究。
本研究的目的是当与卡铂联合施用对抗在雌性，无胸腺NCr-nu/nu小鼠中皮下植入的UACC-257人黑素瘤细胞时，评价Aplidine的抗肿瘤功效。
将动物笼养在隔离饲育笼(microisolator cage)中，每个笼多到五只，伴随12小时光照/黑暗循环。在实验前，使6周龄的雌性，无胸腺NCr-nu/nu小鼠适应实验室环境一周。
使用23号针，用来自体外细胞培养物的UACC-257人黑素瘤细胞在接近右胁的地方对每只小鼠进行皮下接种。每只小鼠接受重悬浮在0.2mL的中的2 x 107细胞。将具有UACC-257人黑素瘤冷冻细胞的小瓶融解并且在包含低葡萄糖(2,000mg/L)，碳酸氢钠(1,500mg/mL)，2mML-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(完全培养基)中培养，并且在+37℃培养箱，在湿润的气氛中，以5％ CO2进行培养直到获得接种小鼠所需要的细胞数量。在培养四代后，收集细胞。将细胞从烧瓶中取出，置于50-mL离心管中并且在冷冻离心机中，以1,000rpm离心10分钟。将细胞沉淀物重悬在新鲜的完全培养基中。用Beckman Coulter VI CELL XR细胞计数器和存活力分析仪确定下细胞数量和存活力。离心细胞混悬液，并且将细胞沉淀物以1.0 x 108细胞/mL的细胞密度重新悬浮在
Figure A200780006866D00481
中并置于湿冰(wet ice)上。
Figure A200780006866D00482
在细胞混悬液中的最终浓度是56.9％。在细胞收获的当天，细胞的存活力是98.9％。
将肿瘤细胞接种当天设定为第0天。在治疗开始当天，肿瘤细胞接种后的第13天，个体肿瘤的重量达到150-245mg(大小150-245mm3)。将具有适当大小范围的肿瘤的四十只动物分配到四个处理组从而使在治疗第一天的肿瘤重量的中位值彼此尽可能的接近。
实验在治疗第一天，肿瘤细胞接种后的第13天，由共40只小鼠组成，其中赋形剂处理的对照组10只小鼠，三种药物处理的组，每组10只小鼠。用盐水稀释的Aplidine的赋形剂对组1中的动物每天i.p.处理，持续9天(第13-21天)。Aplidine在9天里(第13-21天)，以每天60μg/kg/剂的剂量单独i.p.给药(组2)，或与卡铂联合i.p.给药(组4)。卡铂每4天，以50mg/kg/剂的剂量单独i.v.给药(组3)，共3次治疗(第13天，17天和21天)，或与Aplidine联合(组4)i.v.给药。在两种化合物都在组4中给药的当天，首先将Aplidine注射到组中的所有的10只动物，紧接着施用卡铂(组4)。
组1用0.18％聚氧乙烯蓖麻油/0.18％乙醇/0.84％ WFI/98.8％盐水(注射体积：0.1mL/10g体重)i.p.处理。用包含15％聚氧乙烯蓖麻油/15％乙醇/70％ WFI的赋形剂重构Aplidine并且用盐水稀释(注射体积：0.1mL/10g体重)。在WFI中制备卡铂(注射体积：0.1mL/10g体重)。
每日观察动物并且记录临床体征。测量s.c.肿瘤并且从治疗的第一天，第13天开始每周两次称重动物。通过测径器测量(mm)并使用对于椭圆球的式确定肿瘤体积：L x W2/2＝mm3，其中L和W指在每次测量收集的更大和更小的垂线大小。设定单位密度，还使用该式来计算肿瘤重量(1mm3＝1mg)。
将在第23天(在治疗结束后2天)和第70天(研究终止当天)的处理组(T)的中位值肿瘤重量与对照组的中位值肿瘤重量的比较(T/C x 100％)用于评估抗肿瘤功效。将对于每次处理的％ T/C在表19中报道。
表19
Figure A200780006866D00491
赋形剂时间表：q1d x 9 第13天
Aplidine时间表：q1d x 9 第13天
卡铂时间表：q4d x 3 第13天
Aplidine/卡铂时间表：q1d x 9 第13天/q4d x 3 第13天
Aplidine加卡铂的联合治疗被耐受而没有死亡。联合治疗导致在第23天和第70天，分别为95％的T/C值，和53％的T/C值。
实施例8：在骨髓瘤异种移植物中确定Aplidine与另一种标准药剂的联合的效果的体内研究
该研究的目的是评估当与硼替佐米联合施用对抗在雄性，SCID小鼠中的皮下植入的RPMI 8226人骨髓瘤细胞时，Aplidine的抗肿瘤功效。
将动物笼养在隔离饲育笼中，每个笼中多到5只动物，伴随12小时的光照/黑暗周期。在实验前，使6周龄的雄性SCID小鼠适应实验室环境一周。
使用23号针，用来自体外细胞培养物的RPMI 8226人骨髓瘤细胞在接近右胁的地方，s.c.接种每只小鼠。每只小鼠接受重悬浮在0.2mL的中的2 x 107细胞。RPMI 8226人骨髓瘤细胞开始购自ATCC(ATCC号：CCL-155)。将具有冷冻细胞的小瓶融解并且培养在包含高葡萄糖(4,500mg/L)，碳酸氢钠(1,500mg/mL)，2 mM L-谷氨酰胺，10mMHepes，1mM丙酮酸钠和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(完全培养基)中并且在+37℃培养箱，在湿润的气氛中，以5％ CO2进行培养直到获得接种小鼠所需要的细胞数量。在培养四代后，收集细胞。将细胞从烧瓶中取出，置于50-mL离心管中并且在冷冻离心机中，以1,000rpm离心10分钟。将细胞沉淀物重悬在新鲜的完全培养基中。用Beckman Coulter VI CELLXR细胞计数器和存活力分析仪确定细胞数量和存活力。离心细胞混悬液，并且将细胞沉淀物以1.0 x 108细胞/mL的细胞密度重新悬浮在
Figure A200780006866D00501
中并置于湿冰上。
Figure A200780006866D00502
在细胞混悬液中的最终浓度是78.3％。在细胞收获的当天，细胞的存活力是89.3％。
将肿瘤细胞接种当天设定为第0天。在治疗开始当天，肿瘤细胞接种后的第18天，个体肿瘤的重量达到75-188mg(大小75-188mm3)。将选择具有适当大小范围的肿瘤的那些动物分配到四个处理组从而使在治疗第一天的肿瘤重量的中位值彼此尽可能的接近。
实验在治疗第一天，肿瘤细胞接种后的第18天，由共40只小鼠组成，其中赋形剂处理的对照组10只小鼠，三种药物处理的组，每组10只小鼠。用盐水稀释的Aplidine的赋形剂对组1中的动物每天i.p.处理，持续9天进行两轮(第18-26天和第38-46天)。Aplidine在连续9天里(第18-26天和第38-46天)，每天以60μg/kg/剂的剂量单独i.p给药(组2)或与硼替佐米联合给药(组4)，给药两轮。从第18天开始，硼替佐米以0.35mg/kg/剂的剂量每3天，共两次i.v.给药硼替佐米，进行4周，随后在第46天单独(组3)或联合Aplidine(组4)i.v.注射给药一次或多次(one more)。在组4中给药两种化合物的当天，首先将Aplidine注射到组中的所有十只动物中，紧接着给药硼替佐米(组4)。
组1用0.18％聚氧乙烯蓖麻油/0.18％乙醇/0.84％WFI/98.8％盐水(注射体积：0.1mL/10g体重)i.p.处理。用包含15％聚氧乙烯蓖麻油/15％乙醇/70％WFI的赋形剂重构Aplidine并且用盐水稀释(注射体积：0.1mL/10g体重)。在盐水中制备
Figure A200780006866D00503
(硼替佐米)(注射体积：0.1mL/10g体重)。
每日观察动物并且记录临床体征。测量s.c.肿瘤并且从治疗的第一天，肿瘤细胞接种后第18天开始每周两次称重动物。通过测径器测量(mm)并使用如实施例7所述的对于椭圆球的式确定肿瘤体积。
将在第27天(在第一轮Aplidine治疗结束后的一天)和第48天(用Aplidine和硼替佐米治疗结束后两天)的处理组(T)的中位值肿瘤重量与对照组的中位值肿瘤重量的比较(T/C x 100％)用于评估抗肿瘤功效。将对于每次处理的％T/C在表20中报道。
表20
Figure A200780006866D00511
赋形剂时间表：q1d x 9 第18，38天
Aplidine时间表：q1d x 9 第18，38天
硼替佐米时间表：q3d x 2 第18，25，32，39天；q1d x 1 第46天
Aplidine/硼替佐米时间表：q1d x 9 第18，38天/q1d x 2 第18，25，32，39天；q1d x 1 第46天
Aplidine加硼替佐米的联合治疗被耐受而没有死亡。联合治疗有效抑制RPMI 8226骨髓瘤细胞的生长，导致第27天和第48天的T/C值分别为49％和31％。联合治疗的抗肿瘤活性与由每种化合物单独的给药的抗肿瘤活性比较，超过累加效应。
实施例9：确定Aplidine与另一种标准药剂的联合在淋巴瘤异种移植物中的效果的体内研究
本研究的目的是评价当与利妥昔单抗联合施用对抗雌性，SCID小鼠中的皮下植入的RL人淋巴瘤细胞时，Aplidine的抗肿瘤功效。
将动物笼养在隔离饲育笼中，每个笼中多到5只动物，伴随12小时的光照/黑暗周期。在实验前，使6周龄的雄性SCID小鼠适应实验室环境一周。
使用23号针，用来自体外细胞培养物的RL人淋巴瘤细胞在接近右胁的地方，s.c.接种每只小鼠。每只小鼠接受重悬浮在0.2mL的
Figure A200780006866D00512
中的1.0 x 107细胞。将具有冷冻细胞的小瓶融解并且培养在包含高葡萄糖(4,500 mg/L)，碳酸氢钠(1,500 mg/mL)，2mM L-谷氨酰胺，10mMHepes，1mM丙酮酸钠和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(完全培养基)中，并且在+37℃培养箱，在湿润的气氛中，以5％ CO2进行培养直到获得接种小鼠所需要的细胞数量。在培养6代后，收集细胞。将细胞从烧瓶中取出，置于50-mL离心管中并且在冷冻离心机中，以1,000rpm离心10分钟。将细胞沉淀物重悬在新鲜的完全培养基中。用Coulter Z1型细胞计数器确定细胞数量并在用碘化丙锭染色后测量存活力，使用BeckmanCoulter EPICS XL流式细胞仪进行分析。离心细胞混悬液，并且将细胞沉淀物以5.0 x 107细胞/mL的细胞密度重新悬浮在
Figure A200780006866D00521
中并置于湿冰上。
Figure A200780006866D00522
在细胞混悬液中的最终浓度是73.0％。在细胞收获的当天，细胞的存活力是98.9％。
将肿瘤细胞接种当天设定为第0天。在治疗开始当天，肿瘤细胞接种后的第15天，个体肿瘤的重量达到100-196mg(大小100-196mm3)。将具有适当大小范围的肿瘤的四十只动物分配到四个处理组从而使在治疗第一天所有组的肿瘤重量的中位值彼此尽可能的接近。
实验在治疗第一天，肿瘤细胞接种后的第15天，由共40只小鼠组成，其中赋形剂处理的对照组10只小鼠，三种药物处理的组，每组10只小鼠。用盐水稀释的Aplidine的赋形剂对组1中的动物每天i.p.处理，持续9天进行两轮(第15-23天和第28-36天)。Aplidine在连续9天里(第15-23天和第28-36天)，以每天60μg/kg/剂的剂量单独i.p给药(组2)或与利妥昔单抗联合给药(组4)，给药两轮。从第15天开始，利妥昔单抗以20mg/kg/剂的剂量单独i.p给药或联合Aplidine(组4)i.p给药，每轮每3天一次，共两次治疗(q3d×2时间表)，进行4周治疗(组3)。在组4中给药两种化合物的当天，首先将Aplidine注射到组中的所有十只动物中，紧接着给药利妥昔单抗(组4)。
组1用0.18％聚氧乙烯蓖麻油/0.18％乙醇/0.84％WFI/98.8％盐水(注射体积：0.1mL/10g体重)i.p.处理。用包含15％聚氧乙烯蓖麻油/15％乙醇/70％WFI的赋形剂重构Aplidine并且用盐水稀释(注射体积：0.1mL/10g体重)。在盐水中制备
Figure A200780006866D00523
(利妥昔单抗)(注射体积：0.1mL/10g体重)。
每日观察动物并且记录临床体征。测量s.c.肿瘤并且从治疗的第一天，第15天开始每周两次称重动物。通过测径器测量(mm)并使用如实施例7所述的对于椭圆球的式确定肿瘤体积。
将在第24天(在第一轮9天的Aplidine治疗结束后的一天)和第38天(在第二轮9天的Aplidine治疗结束后两天)的处理组(T)的中位值肿瘤重量与对照组的中位值肿瘤重量的比较(T/C x100％)用于评估抗肿瘤功效。将对于每次处理的％T/C在表21中报道。
表21
Figure A200780006866D00531
赋形剂时间表：q1d x 9 第15，28天
Aplidine时间表：q1d x 9 第15，28天
利妥昔单抗时间表：q3d x 2 第15，22，29，36天；
Aplidine/利妥昔单抗时间表：q1d x 9 第15，28天/q3d x 2 第15，22，29，36天
Aplidine加利妥昔单抗的联合治疗被耐受而没有死亡。联合治疗有效抑制RL淋巴瘤细胞的生长，导致第24天和第38天的T/C值分别为69％和74％。因此，当Aplidine与利妥昔单抗联合时，观察到抗肿瘤活性的增效作用。
实施例10：确定Aplidine与其它标准药剂(三重联合)联合在多发性骨髓瘤肿瘤细胞系上作用的体内研究
在本研究中，分析抗肿瘤药剂的三重联合。使用细胞存活力测定(MMT)，在MM.1S细胞系，一种非常敏感的MM细胞系中测试所有的联合。使用Calcusyn软件分析结果。
细胞系和细胞培养试剂
地塞米松-敏感的MM细胞系MM.1S由Dr.S Rudikoff，贝塞斯达MD惠赠。将细胞系培养在RPMI 1640培养基中，所述培养基添加了10％热灭活的胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素和2mM的L-谷氨酰胺。所有的细胞培养基和试剂购自Invitrogen公司(卡尔斯巴德，CA)。细胞存活测定
使用甲硫基四唑(MTT；西格玛，圣路易斯MO)比色测定评估MM细胞增殖的分析。将MM细胞系在48-孔板中以50000细胞/200μl培养基/孔的密度接种，并且用确定的药物剂量和时间进行处理。在治疗结束前两小时，加入MTT溶液(在PBS中的5mg/ml；通常是每个孔的体积的10％)，并且由代谢活性细胞还原四氮唑盐为有色的甲
Figure A200780006866D0054114124QIETU
晶体。在通过与10％SDS-HCl溶液过夜温育溶解这些晶体后，在570nm，以在630nm的校正测量吸光度。对于每种条件分析四个孔，并且将结果表示为重复至少三次的代表性实验的四次重复的平均值±SD。
等效线图解分析
使用Calcusyn软件程序(Biosoft，Ferguson，MO)分析在Aplidine和其它的抗-MM药剂之间的相互作用。将来自细胞存活测定(MTT)的数据表示为在药物处理的细胞中受剂量(Fa)影响的细胞与未处理细胞(对照)比较的分数。该程序基于根据下列等式CI＝(D)1/(Dx)1+(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2的Chou-Talalay方法，其中(D)1和(D)2是单独使用时具有相同x作用的药物1和2的剂量。
使用计算机计算的联合指数(CI)来判断联合的效果：CI>1，CI＝1，和CI<1分别指示拮抗作用，累加效应和协同作用。数据与半数有效原则的一致性可以容易地通过半数有效绘图的线性相关系数(r)证实：log(fa/fu)＝mlog(D)-m log(Dm)，其中D是剂量，Dm是50％效果所需要的剂量，fa是受剂量影响的分数，fu是未受影响的分数，并且m是剂量效应曲线的S形的系数。对于每个联合，使用非常数比率联合。
结果
Aplidine+Lenalidomide+地塞米松的联合
将地塞米松加入Aplidine+Lenalidomide的联合在敏感性细胞系(MM1S)中测试的所有联合中都显示重要的协同作用(图80)。在图80中，将Aplidine剂量以nM单位表示，将Lenalidomide剂量以μM单位表示并且将地塞米松剂量以nM单位表示。
Aplidine+硼替佐米+地塞米松的联合
将地塞米松加入Aplidine与硼替佐米的联合导致一些具有明显协同作用的趋势的剂量(图81)。在图81中，将Aplidine剂量以nM单位表示，硼替佐米剂量以nM单位表示和地塞米松剂量以nM单位表示。
Aplidine+硼替佐米+Lenalidomide的联合
将硼替佐米加入Aplidine与免疫调节剂如Lenalidomide的联合在MM1S中明显增加其抗肿瘤作用，其中CI在协同作用范围内(图82)。在图82中，Aplidine剂量以nM单位表示，硼替佐米剂量以nM单位表示和Lenalidomide剂量以μM单位表示。
ADlidine+沙利度胺+地塞米松的联合
如可以在图83中观察到的，该联合在三重联合中显示明显的协同作用。在图83中，Aplidine剂量以nM单位表示，沙利度胺剂量以μM单位表示和地塞米松剂量以nM单位表示。
Aplidin+美法仑+地塞米松的联合
该联合也显示明显的协同作用范围，主要与高剂量的药物相关(图84)。在图84中，Aplidine剂量以nM单位表示，美法仑剂量以μM单位表示和地塞米松剂量以nM单位表示。
Aplidin+美法仑+硼替佐米的联合
当使用高剂量时，该联合导致在协同作用范围内的CI(图85)。在图85中，Aplidine剂量以nM单位表示，美法仑剂量以μM单位表示和硼替佐米剂量以nM单位表示。
可以将关于Aplidine的这些发现延伸到aplidine类似物，衍生物和相关化合物。例如，本发明提供化合物如WO 02 02596的那些与抗癌药物的联合，所述抗癌药物优选地紫杉醇
Figure A200780006866D00553
多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿糖胞苷(AraC)，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)，依托泊苷(VP 16)，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide
Figure A200780006866D00561
白介素-2(IL-2)，干扰素-α2(INF-α)，达卡巴嗪(DTIC)，贝伐单抗
Figure A200780006866D00562
伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
可以用于取代Aplidine本身的aplidine类似物的实例包括在WO0202596中给出的优选化合物，特别地我们将关于优选化合物的讨论和在WO 02 02596中给出的相关方面放入本专利申请说明书中。更优选地，所述类似物在结构上接近Aplidine，通常在一个氨基酸或末端侧链上不同于Aplidine。可以将不同的氨基酸置于分子的环状部分或侧链中。这类化合物的许多实例在WO 02 02596中给出，并且它们是用在本发明中的候选物。

Claims (27)

1.Aplidine或aplidine类似物在制备药物中的应用，所述药物通过应用Aplidine或aplidine类似物与另一种药物的联合治疗来治疗癌症。
2.根据权利要求1的Aplidine或aplidine类似物的应用，其中所述另一种药物有效治疗选自下列各项的癌症：肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病，和淋巴瘤。
3.根据前述权利要求任一项的Aplidine或aplidine类似物的应用，其中所述Aplidine或aplidine类似物和另一种药物形成同一组合物的部分。
4.根据权利要求1或2的Aplidine或aplidine类似物的应用，其中所述Aplidine或aplidine类似物和另一种药物作为单独的组分提供以用于在同时或在不同时间给药。
5.根据前述权利要求任一项的Aplidine或aplidine类似物的应用，其中所述另一种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α 2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
6.根据前述权利要求任一项的Aplidine或aplidine类似物的应用，其中所述Aplidine或aplidine类似物是Aplidine。
7.根据前述权利要求任一项的Aplidine或aplidine类似物的应用，其中施用第三种药物。
8.根据权利要求7的Aplidine或aplidine类似物的应用，其中所述第二和第三种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α 2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
9.一种治疗癌症的方法，其包括向需要所述治疗的患者施用治疗有效量的Aplidine或aplidine类似物和治疗有效量的有效治疗癌症的另一种药物。
10.根据权利要求9治疗癌症的方法，其中待治疗的癌症选自肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病，和淋巴瘤。
11.根据权利要求9或10治疗癌症的方法，其中所述另一种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
12.一种增加有效治疗癌症的药物的治疗功效的方法，所述方法包括向需要其的患者施用一定量的Aplidine或aplidine类似物。
13.根据权利要求12增加有效治疗癌症的药物的治疗功效的方法，其中待治疗的癌症选自肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病，和淋巴瘤。
14.根据权利要求12或13增加有效治疗癌症的药物的治疗功效的方法，其中所述药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α 2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
15.根据权利要求9-14任一项的方法，其中所述Aplidine或aplidine类似物和另一种药物形成同一组合物的部分。
16.根据权利要求9-14任一项的方法，其中所述Aplidine或aplidine类似物和另一种药物作为单独的组分提供以用于在同时或在不同时间给药。
17.根据权利要求9-16任一项的方法，其中所述Aplidine或aplidine类似物是Aplidine。
18.根据权利要求9或17任一项的方法，其中给药治疗有效量的第三种药物。
19.根据权利要求18的方法，其中所述第二种和第三种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α 2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
20.一种用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包括Aplidine或aplidine类似物的剂型，有效治疗癌症的另一种药物的剂型和用于联合使用每种作用物治疗或预防癌症的说明书。
21.根据权利要求20的试剂盒，其中所述试剂盒用于治疗或预防选自下列各项的癌症：肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病，和淋巴瘤。
22.根据权利要求20或21的试剂盒，其中另一种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α 2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
23.根据权利要求20或21的试剂盒，其另外包含有效治疗癌症的第三种药物的剂型。
24.根据权利要求23的试剂盒，其中所述第二和第三种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α 2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
25.一种药物组合物，其包含Aplidine或aplidine类似物以及有效治疗癌症的另一种药物。
26.根据权利要求25的药物组合物，其中所述其它的药物有效治疗选自肺癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，肾癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤，白血病，和淋巴瘤的癌症。
27.根据权利要求25或26的药物组合物，其中所述另一种药物选自由下列各项组成的组：紫杉醇，多柔比星，顺铂，三氧化二砷，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷，卡铂，7-乙基-10-羟基喜树碱，依托泊苷，美法仑，地塞米松，环磷酰胺，硼替佐米，erlotinib，曲妥单抗，lenalidomide，白介素-2，干扰素-α2，达卡巴嗪，贝伐单抗，伊达比星，沙利度胺，和利妥昔单抗。
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