MXPA05009742A - Aplidina para tratamiento de mieloma multiple. - Google Patents

Abstract

Aplidina y analogos de aplidina se utilizan en la fabricacion de un medicamento para tratar mieloma multiple.

Description

APLIDINA PARA TRATAMIENTO DE MIELOMA MÚLTIPLE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de apiidina y análogos en el tratamiento de cáncer, en particular en el tratamiento de mieloma múltiple.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El mieloma múltiple representa una proliferación maligna de células de plasma de un solo clon. Los términos mieloma múltiple y mieloma se pueden utilizar de manera intercambiable. Las células de plasma producen anticuerpos, proteínas q ue se mueven a través del torrente sang uíneo para ayudar al cuerpo a deshacerse de sustancias nocivas. Cada tipo de célula de plasma responde solamente a una sustancia específica haciendo una gran cantidad de una clase de anticuerpo. Estos anticuerpos encuentran y actúan contra aquella una sustancia. Debido a que el cuerpo tiene muchos tipos de células de plasma, este puede responder a muchas sustancias. Cuando el cáncer afecta células de plasma, el cuerpo se mantiene produciendo más y más de estas células. Las células de plasma no necesitadas -todas anormales y todas exactamente de la misma forma- se llaman células de mieloma. Las células de mieloma tienden a reunirse en la médula ósea y en la parte externa dura de los huesos . Alg unas veces se reúnen solamente en un hueso y forman una sola masa, ó tumor, llamado un plasmacitoma. En la mayoría de los casos, sin embargo, las células de mieloma se reúnen en muchos huesos, a menudo formando muchos tumores y provocando otros problemas. Cuando esto sucede,' la enfermedad se llama mieloma múltiple (MM). Debido a que la gente con MM tiene un número anormalmente grande de células de plasma idénticas, también tiene demasiado de un tipo de anticuerpo. El tumor, sus productos, y la respuesta huésped hacia este resulta en un número de disfunciones de órgano y síntomas de dolor de hueso ó fractura, falla renal, susceptibilidad a infección, anemia, hipercalcemia y ocasionalmente anormalidades coagulantes, síntomas neurológicos, y manifestaciones vasculares de hiperviscosidad. MM es la 2da malignidad hematológica comúnmente diagnosticada en el Mundo Occidental, con una incidencia anual de -15,000 nuevos casos sólo en EE.UU. Desafortunadamente, MM hoy en día es considerado una enfermedad incurable y la supervivencia total de pacientes con MM ha permanecido fundamentalmente igual en un valor mediano de 3-4 años, a pesar de los intensos esfuerzos durante las últimas -3 décadas para mejorar en la actividad de terapias a base de quimioterapia citotóxica para esta enfermedad. Dándose mucho tono, la edad mediana de diagnóstico de MM en <65 años de edad y >1 /3 de pacientes con MM son <55 años de edad en diagnóstico: para esta proporción sustancial de pacientes con MM relativamente jóvenes, el diagnóstico de MM significa, incluso en la ausencia de otras co-morbosidades, una alta probabilidad de que su supervivencia total será significativamente más corta que la esperanza de vida promedio de pacientes sin MM de la misma edad. Recientemente, han habido una serie de avances importantes en el manejo terapéutico de MM, a saber la documentación de actividad anti-MM de 2 nuevas clases de agentes anti-cáncer, talidomida (y sus derivados ¡n munomoduladores) y los inhibidores de proteasoma. Aunq ue estas clases de agentes se han mostrado para activarse en el marco de pacientes con MM quienes recayeron/refractarios a regímenes a base de q uimioterapia citotóxica de dosis alta ó convencional, una proporción significativa de pacientes con MM tiene resistencia de novo hacia aquellos agentes nuevos, aunque hay gente que responde de manera inicial (incluso aquellos que logran remisiones completas durables) eventuaimente pueden recaer. Por consiguiente, se necesita urgentemente el desarrollo de nuevas clases de agentes anti-MM, para además mejorar el resultado de pacientes con MM y, de un modo alentador, para lograr niveles de curación altos para esta neoplasia actualmente incurable.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LA INVENCIÓN Hemos establecido por primera vez q ue la aplidina tiene actividad de mieloma anti-múltiple muy poderosa. La aplidina (Dehid rodidemnina B) es un depsipéptido cíclico aislado del tunicado Mediterráneo Aplidium albicans.

Aplidina Como se utiliza en la presente, el término aplidina también cubre cualquier hidrato, soivato, éster, sal farmacéuticamente aceptable ó un compuesto de promedicamento el cual, al administrarse al destinatario es capaz de proporcionar (directamente ó indirectamente) el compuesto aplidina. La preparación de sales y otros derivados, y promedicamentos, se puede llevar a cabo por métodos conocidos en la materia. Análogos de aplidina incluyen los compuestos revelados en WO 02/2596. Más información sobre aplidina, análogos de aplid ina, sus usos, formulaciones y síntesis se pueden encontrar en las solicitudes de patente: WO 91 /9485, WO 98/1 352, WO 99/42125, WO 01 7661 6 , WO 01 /35974, WO 02/30441 y WO 02/2596. Incorporamos para referencia específica el contenido de cada uno de estos textos de PCT. La aplidina ha mostrado, tanto en pruebas in vitro como pruebas clínicas en fase I y li , tener potencial de ser útil como un agente anticáncer. La aplidina tiene varios modos de acción, incluyendo el bloq ueo de secreción de VEGF, inhibición de síntesis de proteína y transducción de señales, e induciendo detención de ciclo celular G1 . La toxicidad limitadora de dosis en pruebas de fase l/l l fue toxicidad muscular, con una falta notable de mielosupresión aguda. La aplidina muestra actividad in vitro poderosa contra estirpes de célula sólidas de tumor humano, particularmente células de tumor de colon y pulmón de célula no peq ueña con valores de IC50 en 0.1 8 nM y 0.45 nM respectivamente (Faircloth et al, 1995, Proceedings 8th ECCO Congress, París, Abstract no. 122, 529; Lobo et al. , 1997, Anticancer Res, 17, 333-336). El grupo in vitro humano del Instituto Nacional de Cáncer (NCI) ha confirmado selectividad para cáncer de pulmón de célula no peq ueña (NSCLC), melanoma estirpes de célula de cáncer colorectal y ovárico (Faircloth et al., 1 996, Ann Oncol, 7,34). Estud ios iniciales con este depsipéptido marino sugiere actividad in vivo contra tumores de murino tales como melanoma B1 6 (Faircloth et al., 1995, Proceedings 8th ECCO Congress, París, Abstract no. 122, 529). Además, estudios in vivo adicionales llevados a cabo en ratones que portan tumores xenoinjertados humanos confirman actividad contra mama MX-1 y colon CX- 1 (Faircloth et al., 1996 , Ann Oncol., 7, 34). Una prueba en fase I en leucemia pediátrica está en práctica (Jimeno J . ef al., 2002, Ann Oncol., 13 (suppl. 5), Abst. 65P). Finalmente, se ha mostrado q ue la aplidina también demostró actividad antitumor in vivo contra xenoinjertos humanos de linfoma Burkitts y próstata , gástricos, injertados, subcutáneos así como carcinoma de vejiga en la fibra hueca (Faircloth et al., 1999, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res., 40, Abstract 2612; Faircloth et al., 1 998, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res., 39, Abstract 227). La presente invención se dirige al uso de aplidina y análogos en el tratamiento de mieloma múltiple. La presente invención también se dirige a una composición farmacéutica que consta de aplidina ó un análogo y un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente ó disolvente, para usarse en el tratamiento de mieloma múltiple. La presente invención además proporciona un método para tratar cualquier mamífero, de manera notoria, un humano, afectado por mieloma múltiple el cual consta de administrar al individuo afectado una cantidad terapéuticamente eficaz de aplidina ó un análogo. En otro aspecto la presente Invención se dirige al uso de aplidina ó un análogo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de mieloma múltiple. La invención de manera adicional proporciona equipos que constan de recipientes separados que contienen una composición farmacéutica q ue consta de aplidina ó un análogo, y un agente reconstructor. También se proporcionan métodos de reconstitución .

BREVE DESCRI PCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig . 1 . Resultados de pruebas de supervivencia colorimétricas de MTT de un grupo de estirpes de célula de MM tratadas con aplidina. La Fig . 2. Actividad in vitro de aplid ina (20 n M por 48 hrs) contra muestras de célula de tumor de MM primario derivadas de pacientes con MM resistentes a varios medicamentos. La Fig. 3. Co-cultivo de células de tumor de MM primario (aisladas de pacientes con MM resistentes a varios medicamentos) con células estromales de médula ósea (BMSCS) no atenúa de manera significativa la sensibilidad de células de MM hacia Aplidina. La Fig. 4. A) Tratamiento de aplidina (20 nM, 0-12 hrs) de células de tumor de MM primario de un paciente con MM resistente a varios medicamentos suprime la secreción de VEGF. La Fig. 4.B) Aplidina (20 nM, 1 2 hrs) suprime la secreción de VEGF a través de células de tumor de MM primario, BMSCs, así como a través de células de MM co-cultivadas y BMSCs. La Fig. 5. Aplidina sensibiliza células de tumor de MM primario a doxorubicina. La Fig . 6. Aplidina inhibe crecimiento de células de mieloma múltiple (MM1 .R) resistentes a dexametasona en cultivo de manera tan eficaz como la línea parenteral (MM 1 .S). La Fig. 7 Aplidina inhibe crecimiento de células de MM sobreexpresadoras de Bcl-2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCIÓN A pesar de recientes avances en el manejo terapéutico de mieloma múltiple (MM), actualmente no existe terapia curativa para esta enfermedad , la cual es la 2da malignidad hematológica más comúnmente diagnosticada en el Mundo Occidental. La identificación de agentes terapéuticos nuevos con actividad anti-MM, particularmente en pacientes quienes recaen ó no responden de manera óptima a las terapias nuevas y/o convencionales, sigue siendo una prioridad urgente. Encontramos que la Aplidina (APL) , un nuevo depsipéptido derivado marino, es muy poderoso contra células de MM in vitro. Particularmente, observamos que concentraciones clínicamente pertinentes de APL fueron activas contra un amplio grupo de estirpes de célula de MM humanas, el cual incluyó estirpes de célula de MM resistentes a agentes anti-MM convencionales (por ejemplo, dexametasona, agentes alq uiladores, antraciclinas) ó agentes anti-MM nuevos (por ejemplo, talidomida, derivados de talidomida inmunomoduladores, inhibidor de proteasoma PS-341 [bortezomib] , Apo2L/TRAIL), ó células que sobreexpresan reguladores anti-apoptóticos principales para células de MM. Pruebas de supervivencia colorimétricas de MTT mostraron q ue la aplidina fue universalmente activa contra las estirpes de célula de nuestro grupo, con dosis de IC50 (para la mayoría abrumadora de estas estirpes de célula de MM) en la escala de 10 nM ó menor. Cada vez más importante, esta poderosa actividad anti-MM in vitro se acciona a través de concentraciones de APL las cuales fueron clínicamente factibles en la prueba clínica de fase I de este agente en tumores sólidos. Además estos valores de I C50 fueron comparables con la actividad in vitro de este agente en la mayoría de los modelos de tumor sólido sensibles a APL. Para confirmar además que la actividad anti-MM in vitro de APL no está limitada solamente a modelos de estirpe de célula, también sometimos a prueba el efecto de APL contra células de tumor de M primario recién aislado de pacientes resistentes a talidomida ó sus análogos y/ó inhibición de proteasoma. En una prueba preliminar de 1 0 especímenes de tumor primario de pacientes con MM (pureza del >90% para células de tumor de MM CD138+ CD38+), observamos actividad anti-MM in vitro de aplidina de acuerdo con los resultados obtenidos de la prueba de nuestro grupo de estirpe de célula. Tomados en conjunto, los resultados de estudios in vitro de aplidina contra especímenes de tumor de MM primario y estirpes de célula de MM indican que este agente puede ser activo contra un amplio espectro de células de MM, incluyendo aquellas con resistencia adquirida ó de novo a terapias convencionales u otros agentes nuevos con actividad anti-MM poderosa. Aunque interacciones mediadas de adhesión de célula ó de citoquina del microentorno de la médula ósea local (BM) (por ejemplo células estromales de BM) protegen a las células de MM de las terapias convencionales (por ejemplo, dexametasona ó quimioterapia citotoxica) (refs), APL es capaz de vencer este efecto protector en modelos de co-cultivo de células de MM con células estromales de BM. Además, APL sensibilizó células de MM a muerte de célula inducida con quimioterapia citotóxica y secreción abrogada de citoquinas pro-angiogénicas (por ejemplo, VEGF) a través de células MM ó células estromales de BM en modelos de co-cultivo ex vo. Esto sugiere que la aplidina se puede combinar con protocolos a base de quimioterapia citotóxica para lograr actividad anti-MM aumentada. Análisis comparativos de los patrones de sensibilidad de célula de MM hacia APL contra otros medicamentos anti-cáncer mostraron que la relación dosis-respuesta de MM tratada con APL es distinta de aquellas asociadas con administración de medicamentos. Esto además sostiene la teoría de que las propiedades anti-MM de APL están mediadas a través de mecanismos moleculares distintos de aquellos de medicamentos anti-MM actualmente disponibles, y también sugiere que la APL puede ser activa aún contra subgrupos de MM los cuales podrían ser resistentes a otras terapias nuevas las cuales están actualmente en desarrollo clínico. Estos hallazgos se acoplaron con el perfil de seguridad favorable de APL en pruebas clínicas para tumores sólidos. Para la presente Invención, se pueden utilizar análogos de aplidina en lugar de APL, la aplidina misma. Típicamente tales compuestos son como se definen en WO 0202596. Ejemplos de compuestos para la presente invención incluyen los compuestos preferidos dados en WO 0202596, y en particular importamos en esta especificación de patente la discusión de compuestos preferidos y aspectos relacionados dados en WO 0202596. Más preferentemente, los análogos son estructuralmente cercanos a la aplidina, y normalmente son distintos de la aplidina respecto a un aminoácido ó la cadena lateral terminal. El aminoácido diferente puede estar en la parte cíclica de la molécula ó en la cadena lateral. Muchos ejemplos de tales compuestos se dan en WO 0202596, y son candidatos para uso en la presente invención. Las formulaciones farmacéuticas de aplidina ó análogos se pueden adaptar para administración a través de cualquier vía apropiada, por ejemplo a través de la vía oral (incluyendo bucal ó sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual ó transdermal), vaginal ó parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa ó intradermal). Tales formulaciones se pueden preparar a través de cualquier método conocido en la materia de la farmacia, por ejemplo conduciendo en asociación, el ingrediente activo con el vehículo(s) ó excipiente(s). Ejemplos de composiciones farmacéuticas que contienen aplidina ó análogos incluyen líquido (soluciones, suspensiones ó emulsiones) con composición conveniente para administración intravenosa, y pueden contener el compuesto puro ó en combinación con cualquier vehículo u otros compuestos farmacéuticamente activos. La aplidina soiubilizada muestra degradación sustancial bajo calor y condiciones de prueba de presión ligera, y se desarrolló una forma de dosificación liofilizada, ver WO 99/42125 incorporada en la presente para referencia.

La administración de aplidina y análogos ó composiciones de la presente invención puede ser a través de infusión intravenosa. Se pueden utilizar periodos de infusión de hasta 72 horas, más preferentemente 1 hasta 24 horas, con ya sea aproximadamente 1 , aproximadamente 3, aproximadamente 24 horas más preferido. Son particularmente deseables periodos cortos de infusión los cuales permiten que el tratamiento se lleve a cabo sin una estancia de noche en el hospital. Sin embargo, la infusión puede ser de aproximadamente 24 horas ó incluso más tiempo si se requiere. La infusión se puede llevar a cabo en intervalos convenientes con patrones variables, de manera ilustrativa una vez por semana, dos veces por semana, ó más frecuentemente por semana, repetida cada semana de manera opcional con espacios de típicamente una semana. En el método de aplicación preferida, la administración se realiza en ciclos. Una infusión intravenosa de un compuesto de la invención se da a los pacientes la primera semana de cada ciclo, a los pacientes se les permite recuperarse para el resto del ciclo. La duración preferida de cada ciclo es de uno u otro 1 , 3, ó 4 semanas; se pueden dar varios ciclos como sea necesario. En un protocolo de dosis alternativa, el compuesto de la invención se administra por decir aproximadamente 1 hora por 5 días consecutivos cada 3 semanas. Se pueden concebir otros protocolos como variaciones. Retrasos de dosis y/ó reducciones de dosis y ajuste de horario se realizan como sean necesarios, dependiendo de la tolerancia del paciente individual de tratamientos.

Aunq ue la guía para la dosificación se da arriba, la dosificación correcta del compuesto puede cambiar según la formulación particular, el modo de aplicación, y el sitio particular, huésped y tumor q ue se está tratando. Otros factores como edad, peso corporal, sexo, alimentación, periodo de administración, nivel de excreción, condición del huésped, combinaciones de medicamento, sensibilidades de reacción y gravedad de la enfermedad se pueden tomar en cuenta . La administración se puede llevar a cabo de manera continua ó de manera periódica dentro de la dosis máxima tolerada. Se da guía adicional para la administración de aplidina en WO 01 /35974 la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. La aplidina y análogos se pueden utilizar con otros medicamentos para proporcionar una terapia de combinación en el tratamiento de mieloma múltiple. Los otros medicamentos pueden formar parte de la misma composición, ó se pueden proporcionar como una composición separada para administración al mismo tiempo ó diferente tiempo. EJEMPLOS Análisis Estadístico Se examinó importancia estadística a través de un análisis de 2 modos de variación, seguido por la prueba post hoc de Duncan. En todos los análisis, P <.05 se consideró estadísticamente importante. EJ EMPLO 1 Prueba de supervivencia colorimétrica de TT Se examinó supervivencia de célula utilizando la prueba colorimétrica de (MTT; Sigma Chemical, St. Louis, MO) de bromuro 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, como se describe anteriormente (Mitsiades C. S. et al. Blood. 2001 , 98, 795-804; Mitsiades N. et al. Proc Nati Acad. Sci USA. 2002, 99, 14374-14379; Mitsiades N. eí al. Blood. 2003, 101 , 2377-2380). Brevemente, células se colocaron en placas de 48 cavidades en confluencia de 70% a 80% en la presencia de suero bovino fetal al 2.5% (FBS) y en la presencia de Aplidina en la concentración final de 0-1 00 nM ó control de excipiente DMSO. Al final de cada tratamiento, células se incubaron con 1 mg/mL MTT por 4 horas a 37°C; una mezcla de isopropanol y 1 N HCI (23:2, vol/vol) después se agregó bajo pipeta vigorosa hasta disolver los cristales de formazan. Absorción de color (A) en células viables se midió en 570 nm, con 630 nm como una longitud de onda de referencia. La viabilidad celular se estimó como un porcentaje del valor de controles no tratados. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces, y cada condición experimental se repitió al menos en cavidades triplicadas en cada experimento. Los datos presentados son valores promedio ± SD de experimentos representativos. Grupo de estirpes de célula de MM resistentes a medicamento y células de tumor de MM primario Evaluamos la actividad de aplidina en un grupo de estirpes de célula de MM humanas resistentes a medicamento y sensibles a medicamento, el cual incluyó las siguientes estirpes de célula: estirpes de célula de MM-1 R resistentes a Dex y MM-1 S sensibles a dexametasona (Dex) (amablemente proporcionadas como una donación académica por Dr. Steven Rosen, Northwestern University, Chicago, IL); la estirpe de célula RPMI-8226/S quimio-sensible y sus subestirpes resistentes a doxorubícina (Dox6, Dox40), melfalan (LR5) y mitoxantrona (MR20) (amablemente proporcionadas como una donación académica por Dr. William Dalton, Lee offitt Cáncer Center, Tampa, FL); células OCI-My-5 por Dr. H. A, Messner (Ontario Cáncer Institute, ON, Canadá); células S6B45 por Dr. T. Kishimoto (Osaka University, Osaka, Japón); células ARD, ARK y ARP-1 (amablemente proporcionadas por Dr. Nikhil Munshi, Dana-Farber Cáncer Institute, Boston, MA); las células OPM-1 , OPM-6, K620 y LP-1 (amablemente proporcionadas como una donación académica por Dr. Leif Bergsagel, Cornell University, New York, NY); así como células U266 y NCI-H929 obtenidas de American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se aislaron células de tumor de MM primario de aspiraciones de médula ósea (BM) de 10 pacientes, quienes eran resistentes a agentes anti-MM convencionales (a base de quimioterapia citotóxica y de esteroide) y agentes anti-MM más recientemente desarrollados (por ejemplo, taiidomida ó inhibidores de proteasoma). Las aspiraciones de BM inicialmente se trataron a través de centrifugación de densidad Ficoll, se purificaron a través de selección CD138+ (una u otra, a través de clasificación de célula activada por citometría de flujo (FACS), ó a través de selección positiva CD138+ con separación inmunomagnética), utilizando los protocolos anteriormente descritos (Mitsiades C.S. et al. Blood. 2001 , 98, 795-804). Todas las muestras de célula de tumor clasificadas tuvieron pureza de >90% en células CD38+ CD138+ ó CD38+ CD45 A". Inmediatamente antes del tratamiento de Aplidina, todas las muestras de tumor primario se confirmaron por tener más del 95% de viabilidad, a través de la prueba de exclusión de azul trlpan. Todas las estirpes de célula de MM y células de MM de paciente se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) completadas con suero bovino fetal tratado con dextran de carbono vegetal (FBS; Hyclone, Logan, UT) así como L-glutamina, penicilina, y estreptomicina (Gibo Laboratories). Resultados: Actividad de Aplidina contra estirpes de célula de MM resistentes a medicamento v especímenes de tumor primario Sometimos a prueba la actividad In vitro de aplidina contra un amplio grupo de estirpes de célula de MM humanas, el cual incluyó células de MM sensibles ó resistentes a agentes anti-MM convencionales (por ejemplo, dexametasona, agentes alquiladores, antraciclinas) ó nuevos (por ejemplo, talidomida, derivados de talidomida inmunomoduladores, Apo2L/TRAIL). Pruebas de supervivencia colorimétricas de MTT (Figura 1 ) mostraron que la Aplidina fue universalmente activa contra las estirpes de célula de nuestro grupo, con dosis de IC5o (para la mayoría abrumadora de estas estirpes de célula de MM) en la escala de 10nM ó menor (la cual corresponde a concentraciones clínicamente factibles de aplidina, basándose en la experiencia de prueba de fase I con este agente). Cada vez más importante, esta actividad in vitro de aplidina es comparable con su actividad in vitro en la mayoría de los modelos de tumor sólido sensibles a la aplidina. Utilizando análisis de agrupación jerárquica y algoritmos de red de pertinencia, comparamos los patrones de sensibilidad de célula de M hacia aplidina contra otros medicamentos anti-cáncer y encontramos que el patrón de relaciones de dosis-respuesta para aplidina es evidentemente distinto de aquellos para otros medicamentos. Este hallazgo además no solamente sostiene la teoría de que las propiedades anti- de aplidina están mediadas a través de mecanismos moleculares distintos de aquellos de otros medicamentos, sino también sugiere que APL puede ser activa incluso contra diferentes subgrupos moleculares de esta enfermedad. Resultados: Actividad de Aplidina contra células de tumor de MM primario resistentes a medicamento Para confirmar además que la actividad anti-MM in vitro de APL no está limitada solamente a modelos de estirpe de célula, también sometimos a prueba el efecto de APL contra células de tumor de MM primario recién aislado de pacientes resistentes a talidomida ó sus análogos y/ó inhibición de proteasoma. En una prueba preliminar de 10 especímenes de tumor primario de pacientes con MM (pureza del >90% para células de tumor de MM CD 138+ CD38+), observamos actividad anti-MM in vitro de Aplidina de acuerdo con los resultados obtenidos de la prueba de nuestro grupo de estirpe de célula (Fig ura 2). Tomados en conjunto, los resultados de estudios in vitro de aplidina contra especímenes de tumor de MM primario y estirpes de célula de MM indican que este agente puede ser activo contra un amplio espectro de células de MM, incluyendo aquellas con resistencia de novo ó adquirida a terapias convencionales u otros agentes investigacionales con poderosa actividad anti-MM. EJEMPLO 2 Transfecciones Estables de Bcl-2 y Akt activo de manera constitutiva Se transfectaron de manera estable células MM-1 S con Akt miristoilado (activado de manera constitutiva) de codificación de vector piasmido ó Bcl-2 (Upstate Biotechnologies, Lake Placid , NY) ó con vectores (neo) vacíos, y se realizaron utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies), seguido por cultivos en medios de selección que contienen G418, como se describe anteriormente (Mitsiades C.S. et. al. Oncogene. 2002, 21 , 5673-5683; Mitsiades N . et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2002, 99, 14374-14379). Resultados: Aplidina vence el efecto anti-apoptótico de Bcl-2 ó Akt activo de manera constitutiva Debido a que los papeles de Bcl-2 y el PI-3K/Akt caen en forma de cascada en la regulación de apóptosis inducida con medicamento en MM y otras neoplasias, también describimos la actividad de aplidina en células de MM humanas MM- S transfectadas de manera estable con Bcl-2 ó Akt miristoilado que se construye contra células MM-1 S de control transfectadas con vector vacío. Observamos que las células transfectadas con mirAkt ó Bcl-2 no tuvieron sensibilidad más baja hacia aplidina que las células transfectadas con vector vacío (Figura 1 ), sugiriendo que la sobreexpresión de Bcl-2 ó activación constitutiva de Akt y sus efectores aguas abajo no son suficientes para vencer el efecto anti-MM de aplidina. EJEMPLO 3 Pruebas de co-cultivo de células de MM con células estromales de médula ósea (BMSCs) Cuando se adhieren a BMSCs, las células de MM han reducido sensibilidad hacia terapias anti-MM convencionales, tales como quimioterapéuticas citotóxicas ó de dexametasona (Chauhan D. et al. Blood. 1996, 87, 1 104-1 1 12). Esta forma de resistencia de medicamento se considera una razón clave de porq ue pacientes con MM con el tiempo recaen cuando reciben tratamiento basándose en la administración de glucocorticoides y/ó quimioterapia citotóxica. Por contraste, a lo largo de terapias recientemente desarrolladas para MM, la actividad anti-tumor contra en casos de MM resistente a esteroide ó resistente a quimio ha sido lograda a través de clases de medicamentos, por ejemplo, inhibidores de proteasoma (Hideshima T. et al. Cáncer Res. 2001 , 61 , 3071 -3076), la cual puede vencer los efectos protectores de BMSCs sobre células de MM. Por consiguiente investigamos si la aplidina también puede vencer las secuelas moleculares de la interacción de BMSCs con células de MM y lograr actividad anti-MM en este contexto. Por eso realizamos pruebas de co-cultivo in vitro de células de MM con BMSCs como se describe anteriormente: BMSCs se cultivaron en 24 placas de depósito para confluencia. Después de lavados con medio libre de suero, células de tumor primario (pureza del >95% en células CD 1 38+) aisladas de 3 pacientes con MM se agregaron a cavidades de control ó bañadas con BMSC como se describe anteriormente (Uchiyama H. ef ai. Blood. 1993, 82, 3712-3720; Mitsiades N. et al. Blood. 2003, 101 , 4055-4062) y se incubaron por 48 horas en la presencia ó ausencia de aplidina. Se realizó análisis citométrico de flujo para detectar la población CD 138+ de células de MM viables y el efecto de aplidina sobre viabilidad celular de MM se expresó como % de números de célula viable en comparación a los cultivos tratados con excipiente respectivos. Resultados: Aplidina vence el efecto protector de células estromales de médula ósea (BMSCs) sobre células de MM Estudios previos de nuestro grupo y otros investigadores han mostrado que interacciones mediadas con adhesión de célula ó con citoquina del microentorno de médula ósea (BM) local (por ejemplo, células estromales de BM) pueden proteger a las células de MM contra terapias convencionales (por ejemplo, quimioterapia citotóxica ó de dexametasona) (Chauhan D. er al. Blood. 1 996, 87, 1 1 04-1 1 12). Por eso evaluamos el efecto anti-MM de Aplidina en el marco de co-cultivo de células de MM con BMSCs y observamos, utilizando determinación citométrica de flujo de muerte de célula en la sección de célula de MM (Figura 3), que la interacción de MM-BMSC no atenúa de manera significativa la actividad anti-MM in vitro de aplidina (en dosis de aplidina las cuales no afectaron de manera significativa la supervivencia de BMSCs). EJEMPLO 4 Cuantificación de secreción de VEGF La adhesión de célula de MM a BMSCs induce secreción aumentada de citoquinas angiogénicas, tales como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un caso considerado de mayor importancia para el restablecimiento de nuevos vasos sanguíneos en los sitios de células de MM en el entorno de BM. Por consiguiente evaluamos si aplidina puede suprimir la secreción de VEGF a través de MM y/ó BMSCs utilizando las pruebas de co-cultivo in vitro anteriormente descritos de células de MM con BMSCs: BMSCs se cultivaron en 24 placas de depósito para confluencia. Después de lavados con medio libre de suero, células de tumor primario (pureza del >95% en células CD138+) aisladas de 3 pacientes con MM se agregaron a cavidades de control ó bañadas con BMSC como se describe anteriormente (Uchiyama H. et al. Blood. 1993, 82, 3712-3720; Mitsiades N. et al. Blood. 2003, 101 , 4055-4062) y se incubaron por 12 horas en la presencia ó ausencia de Aplidina. Los sobrenadantes se colectaron y ensayaron para concentración de VEGF a través de prueba inmunosorbente enlazado a encima (ELISA) utilizando un equipo comercialmente disponible (equipo VEGF ELISA; R&D Systems), según las instrucciones del fabricante.

Resultados: Aplidina disminuye la secreción de VEG F a través de MM/BMScs VEGF ha sido propuesto como un mediador putativo de respuestas proliferativas para células de MM en el microentorno de BM. VEG F también es un mediador clave de restablecimiento inducido de tumor de nuevos vasos sangu íneos en las áreas de crecimiento de célula de tumor. Debido a reportes preliminares que sugieren que el tratamiento de aplidina de células leucémicas graves conduce a supresión de secreción de VEGF, estudiamos si Aplidina también puede suprimir la secreción de VEGF a través de células de MM y /ó a través de BMSCs. En efecto, un tratamiento de 12 horas con aplidina (20 nM) fue capaz de suprimir la secreción de VEGF a través de células de MM, así como contrarrestar el aumento de secreción de VEGF lo cual ocurre cuando las células de MM se co-cultivan con BMSCs (Figuras 4A y 4B). EJEMPLO 5 Resultados: Aplidina sensibiliza células de MM a quimioterapéuticas citotóxicas Utilizando pruebas de supervivencia colométricas de MTT encontramos q ue las células de MM han aumentado sensibilidad hacia doxorubicina cuando este tratamiento se combina con Aplidina. La Figura 5 ¡lustra el ejemplo de una muestra de tumor de MM primario sensibilizado hacia con doxorubicina (10 ng/mL) a través de tratamiento con aplidina (2 nM).

EJEMPLO 6 Se sometió a prueba aplidina contra varias células establecidas en cultivo. Las células utilizadas fueron: - células de mieloma múltiple ( M1 .S) - líneas de mieloma múltiple resistentes a dexametasona (MM1 .R) - una línea de mieloma múltiple que sobreexpresa Bcl-2 Para estirpes de célula establecidas, células se colocaron en placas de 96 cavidades y se dejaron crecer por 24 h antes de la añadidura de medicamentos. Se incubaron células con medicamento por periodos indicados y se midió viabilidad celular a través de la prueba MTS ó XTT utilizando un lector de placa automatizado. Los resultados de estos estudios se muestran en las Figuras 6-7.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1. Uso de aplidina ó un análogo de aplidina en la fabricación de un medicamento para tratar mieloma múltiple.
2. 2. El uso de aplidina ó un análogo de aplidina según la reivindicación 1 , caracterizado porque la aplidina ó un análogo de aplidina es aplidina.
3. 3. El uso de aplidina ó un análogo de aplidina según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la aplidina ó el análogo de aplidina se utiliza en combinación con otro medicamento ó medicamentos ó terapia para proporcionar una terapia de combinación.
4. 4. Un método para tratar cualquier mamífero, de manera notoria un humano, afectado por mieloma múltiple el cual consta de administrar al mamífero afectado una cantidad terapéuticamente eficaz de aplidina ó un análogo de aplidina.
5. 5. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque la aplidina ó un análogo de aplidina es aplidina.
6. 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la aplidina ó análogo de aplidina se utiliza en combinación con otro medicamento ó medicamentos ó terapia para proporcionar una terapia de combinación .
7. 7. Una composición farmacéutica que consta de aplidina ó análogo de aplidina y un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente ó disolvente, para utilizarse en el tratamiento de mieloma múltiple.
8. 8. La composición farmacéutica según la reivindicación 7, caracterizada porq ue la aplidina ó un análogo de aplidina es aplidina.
9. 9. Un equipo médico para administrar aplidina ó un análogo de aplidina para el tratamiento de mieloma múltiple, el cual comprende en recipientes separados una composición farmacéutica que consta de aplidina ó un análogo de aplidina, y un agente reconstructor.