KR20060006779A

KR20060006779A - 다발 골수종 치료를 위한 아플리딘

Info

Publication number: KR20060006779A
Application number: KR1020057016966A
Authority: KR
Inventors: 조셉 알 베르티노; 다니엘 메디나; 글린 토마스 패어클로스; 콘스탄틴 에스. 미시아데스; 케네쓰 앤더슨; 니콜라스 미시아데스
Original assignee: 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.; 파르마 마르, 에스. 에이.
Priority date: 2003-03-12
Filing date: 2004-03-12
Publication date: 2006-01-19
Also published as: AU2004218883A1; EP1603584A1; JP4584245B2; NZ541611A; US20070149445A9; PT1603584E; WO2004080477A1; RU2335294C2; US20060172926A1; RU2005131578A; NO20054668L; EP1603584B1; US7381703B2; CA2519789C; KR101160320B1; WO2004080477A8; CY1108599T1; IL170136A; NO334264B1; JP2006519828A

Abstract

아플리딘 및 아플리딘 유사체는 다발 골수종을 치료하기 위한 약물의 제조에 사용된다.

아플리딘, 다발 골수종

Description

다발 골수종 치료를 위한 아플리딘{Aplidine for multiple myeloma treatment}

본 발명은 암의 치료에 있어서, 특히 다발 골수종의 치료에 있어서 아플리딘 또는 유사체의 용도에 관한 것이다.

다발 골수종은 단일 클론으로부터 유래된 형질 세포 (plasma cell)의 악성 증식을 나타낸다. 다발 골수종 (multiple myeloma) 및 골수종 (myeloma)이라는 용어는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

형질 세포는 혈류를 통하여 이동하는 항체, 단백질을 생산하여 해로운 물질을 신체로부터 제거하는 것을 돕는다. 형질 세포의 각 형태는 많은 양의 한 종류의 항체를 제조함으로써 단지 하나의 특이적 물질에 대하여만 반응한다. 이들 항체는 그 한가지 물질을 발견하고 대항하여 작용한다. 신체는 많은 형태의 형질 세포를 가지고 있기 때문에, 신체는 많은 물질에 반응할 수 있다. 암이 형질 세포와 관련되는 경우, 신체는 더 많은 이들 세포를 계속하여 생산한다. 상기 필요하지 않은 형질 세포-모두 비정상적이고 모두 정확하게 유사한-는 골수종 세포 (myeloma cell)라고 불린다. 골수종 세포는 골수 및 뼈의 단단한 외부 부분에 모이는 경향이 있다. 때로는 골수종 세포는 단지 하나의 뼈에 모여 형질세포종 (plasmacytoma)이 라고 하는, 단일 덩어리 (mass), 또는 종양을 형성한다. 그러나, 대부분의 경우, 상기 골수종 세포는 많은 뼈에 모여, 종종 많은 종양을 형성하여 다른 문제점을 야기시킨다. 이것이 일어나는 경우, 이 질병은 다발 골수종 (multiple myeloma) (MM)이라고 한다.

다발 골수종을 가진 사람들은 비정상적으로 많은 수의 형질 세포를 가지고 있기 때문에, 그들은 또한 너무 많은 한 가지 형태의 항체를 가진다. 상기 종양, 그의 산물, 및 상기 숙주는 그것에 반응하여 많은 기관의 부전과 골통 또는 골절, 신장 부전, 감염에 대한 민감성, 빈혈, 과칼슘혈증, 및 종종 혈액응고 이상, 신경학적 증상, 및 과점도의 혈관학적 소견의 증상을 야기시킨다.

다발 골수종은 미국에서만 매년 약 15,000 신규 환자가 발생하는, 서구 세계에서는 2번째로 흔하게 진단되는 혈액 종양이다. 불행하게도, 다발 골수종은 현재 불치 질환으로 여겨지고 있고 이 질병에 대한 세포독성 화학요법에 근거한 치료의 활성을 개선하기 위한 집중적인 노력이 지난 약 30 년 동안 있었음에도 불구하고, 다발 골수종 환자의 전체 생존은 실질적으로 3 내지 4년의 중간값으로 변화하지 않고 있다. 중요하게도, 다발 골수종 진단의 중간값 나이는 < 65 세이고, 다발 골수종 환자의 >1/3은 진단시 <55 세이다: 상대적으로 젊은 다발 골수종 환자의 이 실질적인 비율에 대하여, 다발 골수종의 진단은, 다른 공동 치사율 (morbidity)의 존재하에도 불구하고, 그들의 전체 생존은 나이-매치되는 비-다발 골수종 환자의 평균 수명에 비하여 유의하게 더 짧을 가능성이 높다는 것을 의미한다.

최근, 다발 골수종의 치료학적 처리에 있어서 일련의 중요한 진전 즉, 2가지 신규 부류의 항암제인 탈리도마이드 (및 그의 면역자극적 유도체) 및 프로테아좀 저해제의 항-다발 골수종 활성의 개시 (documentation)가 있었다. 이들 부류의 약제는 재발/종래 또는 고용량 세포독성 화학요법에 근거한 체계에 저항성인 다발 골수종 환자의 세팅(setting)에서 활성이 있는 것으로 밝혀졌으나, 다발 골수종 환자의 유의한 비율이 상기한 신규 약제들에 신생 (de novo) 저항성을 가지는 반면, 초기 반응자들(치료가능한 완전한 완화를 달성한 사람들 조차도)은 결국에는 재발할 수 있다. 그러므로, 다발 골수종 환자의 결과를 추가로 개선하고, 희망하기로는, 현재로서는 치료불가능한 이 암에 대한 높은 치료율을 달성하기 위하여, 신규한 부류의 항-다발 골수종 약제의 개발은 긴급하게 요구되고 있다.

본 발명자들은 처음으로 아플리딘이 아주 강한 항-다발 골수종 활성을 갖는다는 것을 확립하였다.

아플리딘 (aplidine) (데히드로디뎀닌 B: Dehydrodidemnin B)은 지중해 피낭류 (tunicate)인 아플리디움 알비칸스 (Aplidium albicans)로부터 분리된 시클릭 뎁시펩티드 (depsipeptide)이다.

아플리딘

본 명세서에 사용된 바와 같이, 아플리딘이라는 용어는 또한 임의의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 용매화물, 수화물 또는 수용자에게 투여되는 경우 상기 화합물 아플리딘들을 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는, 전구 화합물을 포함한다. 염 및 다른 유도체, 및 전구 약물의 제조는 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

아플리딘 유사체에는 WO 02/2596에 개시된 화합물이 포함된다.

아플리딘, 아플리딘 유사체, 그들의 용도, 제제화 및 합성에 대한 더 많은 정보는 특허 출원에서 발견할 수 있다: WO 91/9485, WO 98/1352, WO 99/42125, WO 01 76616, WO 01/35974, WO02/30441 및 WO 02/2596. 본 발명자들은 이들 PCT 문서 각각의 내용을 특이적인 참조에 의하여 본 명세서에 포함시킨다.

아플리딘은 항암제로서 유용한 잠재력을 가지는 것으로 인 비트로 및 임상 I 및 II 상에서 밝혀졌다.

아플리딘은 VEGF 분비의 봉쇄, 단백질 합성 및 신호 전달의 저해 및 G1 세포 주기 정지 유도를 포함한, 여러 작용 기전을 가지고 있다. 임상 I/II상 시험에서 용량-한정되는 독성은 중증 골수억제 (myelosuppression)의 현저한 결여를 갖는, 근육 독성이었다.

아플리딘은 인간 종양 고형 세포주, 특히 비소세포 폐 및 결장 종양 세포에 대하여 각각 0.18 nM 및 0.45 nM의 IC₅₀ 값으로 강력한 인 비트로 활성을 나타낸다 (Faircloth et al., 1995, Proceedings 8 ^th ECCO Congress, Paris, Abstract no. 122,529; Lobo et al. , 1997, Anticancer Res, 17,333-336). 국립암연구소 (NCI)의 인간 인 비트로 패널은 비소세포 폐암 (NSCLC), 멜라노마 (melanoma), 난소암 및 직장암 (colorectal cancer) 세포주에 대한 선택성을 확인하였다 (Faircloth et al., 1996, Ann Oncol., 7,34).

이 해양 뎁시펩티드로 이루어진 초기 연구는 B16 멜라노마와 같은 생쥐 종양에 대항하는 인 비보 활성을 암시하였다 (Faircloth et al., 1995, Proceedings 8^th ECCO Congress, Paris, Abstract no. 122,529). 더욱이, 인간 이종이식된 종양을 갖는 생쥐에서 수행된 추가적인 인 비보 연구에 의하여, 유방 MX-1 및 결장 CX-1에 대항하는 활성이 확인되었다 (Faircloth et al. , 1996, AnnOncol., 7,34). 소아 백혈병에서 임상 I상 시험이 이행 중에 있다 (Jimeno J. et al., 2002, Ann Oncol., 13 (suppl. 5), Abst. 65P). 마지막으로, 아플리딘이 또한 중공 섬유 중에서 방광 카시노마 뿐만 아니라 피하 이식된 위, 전립선 및 버킷 림프종 인간 이종이식물에 대항하는 인 비보 항암 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다 (Faircloth et al., 1999, Proc. Am. Assoc . Cancer Fees.,40, Abstract 2612; Faircloth et al., 1998, Proc . Am. Assoc . Cancer Res., 39, Abstract 227).

본 발명은 다발 골수종의 치료에 있어서 아플리딘 및 유사체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 다발 골수종의 치료에 사용하기 위한, 아플리딘 또는 유사체 및 약학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 치료학적으로 효과적인 양의 아플리딘 또는 유사체를 다발 골수종을 앓고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 다발 골수종을 앓고 있는 임의의 포유동물, 특히 인간을 치료하는 방법을 더욱 제공한다.

또다른 양상에서 본 발명은 다발 골수종의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 아플리딘 또는 유사체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 아플리딘 또는 유사체, 및 재구성제를 포함하는 약학 조성물을 별개의 용기에 포함하는, 키트를 추가적으로 제공한다. 재구성 방법도 또한 제공한다.

다발 골수종 (MM)의 치료적 처리에 있어서의 최근의 진전에도 불구하고, 서구 세계에서 2번째 가장 흔하게 진단되는 혈액 암인 이 질병에 대한 치료적 치료법은 현재 존재하지 않는다. 항-다발 골수종 활성을 갖는 신규한 치료제를 확인하는 것이, 특히 재발하고 종래 및/또는 신규한 치료에 최적으로 반응하지 않는 환자에 있어서, 긴급한 우선 과제로 남아 있다.

본 발명자들은 신규한 해양 유래의 뎁시펩티드인 아플리딘 (APL)이 인 비트로에서 다발 골수종 세포에 대항하는 아주 강한 활성을 가지고 있다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 APL의 임상적으로 관련된 농도가, 종래의 항-다발 골수종제 (예, 덱사메타손, 알킬화제, 안트라사이클린) 또는 신규한 항-다발 골수종제 (예, 탈리도마이드, 면역자극적 탈리도마이드 유도체, 프로테아좀 저해제 PS-341 [bortezomib], Apo2L/TRAIL)에 대하여 저항성인 다발 골수종 세포주, 또는 다발 골수종 세포에 대하여 주요한 항-아포토시스 조절자를 과발현하는 세포를 포함한, 인간 다발 골수종 세포주의 넓은 범위의 패널에 대항하는 활성이 있다는 것을 관찰하였다. MTT 발색 생존 분석에 의하여, 아플리딘이 10 nM 이하의 범위에서 (이들 다발 골수종 세포주의 압도적으로 다수에 대하여) IC₅₀ 용량으로, 본 발명자들의 패널의 상기 세포주에 대항하는 일반적인 활성이 있다는 것을 밝혔다. 중요하게도, 이들 강한 인 비트로 항-다발 골수종 활성은, 고형 암에서 이 약제의 임상 I상 시험에서 임상적으로 달성될 수 있는, APL의 농도에서 유도되었다. 더욱이, 이들 IC₅₀ 값은 대부분의 APL-민감성 고형 암 모델에서 이 약제의 인 비트로 활성에 비교될만하다.

APL의 인 비트로 항-다발 골수종 활성이 세포주 모델에만 한정되지 않는다는 것을 더욱 확인하기 위하여, 본 발명자들은 또한 탈리도마이드 또는 그의 유사체 및/또는 프로테아좀 저해에 저항성인 환자로부터 신선하게 분리된 일차 다발 골수종 종양 세포에 대항하는 APL의 효과를 시험하였다. 다발 골수종 환자로부터의 10개의 일차 종양 표본 (CD138+ CD38+ MM 종양 세포에 대하여 > 90% 순도)의 예비 시험에서, 본 발명자들은 우리 세포주 패널의 시험으로부터 얻어진 결과와 일관된 아플리딘의 인 비트로 항-다발 골수종 활성을 관찰하였다. 요약하면, 일차 다발 골수종 종양 표본 및 다발 골수종 세포주에 대항하는 아플리딘의 인 비트로 연구의 결과는 이 약제가 종래 치료법에 대하여 또는 강력한 항-다발 골수종 활성을 갖는 다른 신규한 약제에 대하여 신생 (de novo) 또는 획득된 저항성을 갖는 세포를 포함한, 넓은 범위의 다발 골수종 세포에 대항하는 활성이 있다는 것을 나타낸다.

국부적 골수 (BM) 미세환경 (예, BM 간질세포)의 사이토카인- 또는 세포 점착-매개된 상호작용이 종래 치료법 (예, 덱사메타손 또는 세포독성 화학요법) (참고문헌)으로부터 다발 골수종 세포를 보호할지라도, APL은 다발 골수종 세포와 BM 간질 세포의 공동 배양 모델에서 이 보호 효과를 극복할 수 있다.

더욱이, APL은 엑스 비보 공동 배양 모델에서 다발 골수종 세포 또는 BM 간질 세포에 의한 세포독성 화학요법에 의하여 유도된 세포 죽음 및 혈관신생 촉진성 사이토카인 (예, VEGF)의 분비의 폐기에 대하여 다발 골수종 세포를 감수성화시켰다. 이는 증가된 항-다발 골수종 활성을 달성하기 위하여 아플리딘이 종래의 세포독성 화학요법에 근거한 프로토콜과 조합될 수 있다는 것을 암시한다. APL 대 다른 항암 약제에 대한 다발 골수종 세포 민감성의 양상의 비교분석에 의하여, APL로 처리된 다발 골수종의 용량-반응 관계는 약물의 투여와 연관된 것들과는 구별되는 것이 밝혀졌다. 이는 APL의 항-다발 골수종 특성이 현재 이용가능한 항-다발 골수종 약물의 기전과는 구별되는 분자적 기전에 의하여 매개된다는 것을 더욱 지지하고, 또한 APL은 현재 임상 개발 중에 있는 다른 신규한 치료에 저항성일 수 있는 다발 골수종의 서브그룹에 대항하여서도 활성이 있을 것이라는 것을 암시한다. 이들 발견은 고형 종양에 대한 임상 시험에서 APL의 유리한 안전성 프로필과 연결되었다.

본 발명에 대하여, 아플리딘의 유사체가 아플리딘 자체인 APL을 대신하여 사용될 수 있다. 일반적으로 그러한 화합물은 WO 0202596에 정의된 바와 같다. 본 발명을 위한 화합물의 예에는 WO 0202596에 주어진 바람직한 화합물이 포함되고, 특히 본 발명자들은 이 특허 명세서 내로 WO 0202596에 주어진 바람직한 화합물 및 관련된 양상의 논의를 도입한다. 더욱 바람직하게는, 상기 유사체는 아플리딘에 구조적으로 가깝고, 보통 하나의 아미노산 또는 말단 측쇄의 관점에서 아플리딘과 다르다. 상기 다른 아미노산은 상기 분자의 환 부분 또는 측쇄에 있을 수 있다. 그러한 화합물의 많은 예가 WO0 202596에 주어져 있으며, 그러한 화합물들은 본 발명에서 사용하기 위한 후보이다.

아플리딘 또는 유사체의 약학적 제형은 임의의 적절한 경로, 예를 들면 (부칼 또는 설하를 포함한) 경구, 직장, 비강, (부칼, 설하 또는 경피를 포함한) 국부, 질내 또는 (피하, 근육내, 정맥내 또는 피내를 포함한) 비경구 경로에 의한 투여를 위하여 맞추어질 수 있다. 그러한 제형물은 약학 분야에서 알려진 임의의 방법, 예를 들면 활성 성분과 담체 또는 부형제를 연합함으로써 제조될 수 있다.

아플리딘 또는 유사체를 포함하는 약학 조성물들의 예에는 정맥내 투여를 위한 적합한 조성물을 갖는 액체 (용액, 현탁액, 유화액)가 포함되고, 상기 약학 조성물들은 순수한 화합물 또는 임의의 담체 또는 다른 약리학적으로 활성인 화합물과 조합된 화합물을 포함할 수 있다. 용해된 아플리딘은 열 및 빛 스트레스 시험 조건 하에서 실질적인 분해를 보여, 동결건조된 투여량 형태가 개발되었다. 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어지는 WO 99/42125 참조.

본 발명의 아플리딘 및 유사체 또는 조성물의 투여는 정맥 내 주입에 의하여 될 수 있다. 72 시간까지, 더욱 바람직하게는, 1 내지 24 시간, 가장 바람직하게는, 약 1, 약 3 또는 약 24 시간 중 어느 하나의 주입 시간이 사용될 수 있다. 병원에서 밤새 체류하지 않고 치료가 수행될 수 있도록 하는 짧은 주입 시간이 특히 바람직하다. 그러나, 주입은 약 24 시간 또는 필요한 경우 더 길어질 수 있다. 주입은 예시적으로 1주 1회, 1주 2회, 또는 1주 더 자주, 선택적으로 일반적으로 1주의 간격 (gap)을 갖는 각 주 반복되는, 다양한 양상으로 적합한 간격으로 수행될 수 있다.

바람직한 적용 방법에 있어서, 상기 투여는 순환적 (cycle)으로 수행될 수 있다. 본 발명의 화합물의 정맥내 주입은 각 주기의 첫번째 주에 환자에게 주어지고, 상기 환자는 상기 주기의 나머지 동안 회복되도록 한다. 각 주기의 바람직한 기간은 1, 3 또는 4 주 중 어느 하나이다; 필요에 따라 다중 주기가 주어질 수 있다. 다른 투여 프로토콜에서, 본 발명의 화합물은 예를 들면 매 3 주마다 약 1 내지 5 연속일 동안 투여된다. 다른 프로토콜이 변형으로서 고안될 수 있다.

치료에 대한 개별 환자 허용 정도에 따라 투여 지연 및/또는 투여 감소 및 스케줄 조정이 필요에 따라 수행될 수 있다.

투여량에 대한 안내를 위에서 언급하였으나, 상기 화합물의 올바른 투여량은 특정한 제형, 적용 방식, 및 치료될 특정한 부위, 숙주 및 종양에 따라 달라질 수 있다. 나이, 체중, 성별, 음식, 투여 시간, 분비 속도, 숙주의 조건, 약물 조합, 반응 민감도, 및 질병의 경중과 같은 다른 인자가 고려되어야 한다. 투여는 최대 허용 용량 범위내에서 연속적으로 또는 주기적으로 수행될 수 있다. 아플리딘의 투여에 대한 추가의 안내는, 그 전체로서 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어지는 WO 01/35974에 주어져 있다.

아플리딘 및 유사체는 다발 골수종의 치료에 있어서 조합 치료를 제공하기 위하여 다른 약물과 함께 사용될 수 있다. 상기 다른 약물은 동일 조성물의 부분을 형성할 수 있거나, 동시 또는 다른 시간에 투여하기 위한 별도의 조성물로서 제공될 수 있다.

도 1. 아플리딘 처리된 다발 골수종 세포주의 패널의 MTT 발색 생존 분석의 결과.

도 2. 다중 약물 저항성 다발 골수종 환자로부터 유래된 일차 다발 골수종 종양 세포 시료에 대항하는 아플리딘 (48 시간 동안 20 nM) 인 비트로 활성.

도 3. 골수 간질 세포 (BMSC)와 (다중 약물 저항성 다발 골수종 환자로부터 분리된) 일차 다발 골수종 종양 세포의 공동 배양은 아플리딘에 대한 다발 골수종 세포의 반응성을 유의하게 감쇄시키지 않는다.

도 4. A) 다중 약물 저항성 다발 골수종 환자로부터의 일차 다발 골수종 종양 세포의 아플리딘 처리 (20 nM, 0-12 시간)는 VEGF의 분비를 억제한다.

도 4. B) 아플리딘 (20 nM, 12 시간)은 공동 배양된 다발 골수종 세포 및 BMSC 뿐만 아니라, 일차 다발 골수종 종양 세포, BMSC에 의하여 VEGF 분비를 억제한다.

도 5. 아플리딘은 일차 다발 골수종 종양 세포를 독소루비신에 대하여 감수성화시킨다.

도 6. 아플리딘은 배양액에서 덱사메타손 저항성 다발성 골수종 (MM1.R) 세포의 성장을 모 세포주 (MM1.S)에 대한 만큼 효과적으로 저해한다.

도 7. 아플리딘은 Bcl-2를 과발현하는 다발 골수종 세포의 성장을 억제한다.

통계적 분석

통계적 유의성은 분산의 2-방향 분석 후, 던칸 (Duncan) 포스트 호크 시험에 의하여 시험하였다. P < .05는 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.

실시예 1: MTT 발색측정 생존 분석

세포 생존을 종래 알려진 바 (Mitsiades C. S. et al. Blood. 2001, 98, 795-804; Mitsiades N. etal. Proc Natl Acad Sci USA 2002,99, 14374-14379; Mitsiades N. et al. Blood. 2003,101, 2377-2380)에 따라, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디메틸테크라졸리움 브로마이드 (MTT; Sigma Chemical, St Louis, MO) 발색측정 분석을 사용하여 조사하였다. 간단하게 설명하면, 세포를 2.5% 우태아혈청 (FBS)의 존재하에서 및 최종 농도 0-100 nM의 아플리딘 또는 DMSO 비히클 대조군의 존재 하에서 70 % 내지 80 % 커플루언시로 48-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 각 처리 끝에, 세포를 1 mg/mL MTT와 함께 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였다: 다음으로, 이소프리판올 및 1N HCl (23:2, vol/vol)의 혼합물을 격렬하게 피펫팅하면서 첨가하여 포마잔 결정을 용해시켰다. 생존 세포 내의 염료 흡광도(A)도를 기준 파장 630 nm로 하고, 570 nm에서 측정하였다. 세포 생존성은 처리되지 않은 대조군의 값의 백분율로서 추정하였다. 모든 실험은 적어도 3회 반복되었고, 각 실험 조건을 각 실험에서 적어도 3개 웰에서 반복하였다. 보고된 데이터는 대표적 실험의 평균값±SD이었다.

약물 저항성 MM 세포주 및 일차 MM 종양 세포의 패널

다음 세포주를 포함하는, 약물 민감성 및 약물 저항성 인간 MM 세포주의 패널에서 아플리딘의 활성을 평가하였다: 덱사메타손(Dex)-민감성 MM-1S 및 Dex-저항성 MM-1R 세포주 (Steven Rosen, Northwestern University, Chicago, IL으로부터 학문적 선물 (gift)로서 친절하게 제공받음); 화학민감성 (chemo-sensitive) RPMI-8226/S 세포주 및 그들의 독소루비신-(Dox6, Dox40), 멜팔란 (LR5)-, 및 미톡산트론 (MR20)-저항성 서브세포주 (Dr William Dalton, Lee Moffitt Cancer Center, Tampa, FL로부터 학문적 선물로서 친절하게 제공 받음); Dr H. A. Messner (Ontario Cancer Institute, ON, Canada)로부터 제공받은 OCI-My-5 세포; Dr T. Kishimoto (Osaka University, Osaka, Japan)로부터 제공받은 S6B45 세포; ARD, ARK 및 ARP-1 세포 (Dr Nikhil Munshi, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA에 의하여 친절하게 제공받음); OPM-1, OPM-6, K620 및 LP-1 세포 (Dr Leif Bergsagel, Cornell University, New York, NY로부터 학문적 선물로서 친절하게 제공 받음); 또한 미국세포주은행 (American Type Culture Collection) (Rockville, MD)으로부터 얻은 U266 및 NCI-H929 세포.

종래 (스테로이드- 및 세포독성 화학요법에 근거한) 및 더욱 최근에 개발된 항-MM 약제 (예, 탈리도마이드 또는 프로테아좀 저해제)에 저항성인, 10명의 환자의 골수 (BM) 흡입물로부터 일차 MM 종양 세포를 분리하였다. 종래 개시된 프로토콜 (Mitsiades C. S. et al. Blood 2001, 98, 795-804)에 따라, 상기 BM 흡입물을 먼저 필콜 밀도 원심분리에 의하여 처리하고, (유세포분석활성화세포 선발(FACS), 또는 면역자성 분리 CD138+ 양성 선발에 의하여) CD138+ 선발에 의하여 정제하였다. 모든 선별된 종양 세포 시료는 CD38+CD138+ 또는 CD38+ CD45RA-세포에 있어서 순도 >90%였다. 아플리딘 처리 바로 직전에, 모든 일차 종양 시료를 트리판 블루 배제 분석에 의하여 95% 이상의 생존성을 갖는 것을 확인하였다. 모든 MM 세포주 및 환자 MM 세포를 L-글루타민, 페닐실린, 및 스트렙토마이신 (Gibco Laboratories) 뿐만 아니라 10% 목탄 덱스트란-처리된 우태아혈청 (FBS ; Hyclone,Logan, UT)으로 보충된 RPMI1640 배지 (Gibco Laboratories, Grand Island, NY)에서 배양하였다.

결과: 약물 저항성 MM 세포주 및 일차 종양 표본에 대한 아플리딘의 활성

본 발명자들은 종래 (예, 덱사메타손, 알킬화제, 안트라사이클린) 또는 신규한 (예, 탈리도마이드, 면역자극성 탈리도마이드 유도체, Apo2L/TRAIL) 항-MM제에 민감성 또는 저항성인 MM 세포를 포함한, 인간 MM 세포주의 넓은 패널에 대하여 아플리딘의 인 비트로 활성을 조사하였다.

MTT 발색측정 생존 분석 (도 1)은 아플리딘이 (이 약제의 임상 1상 시험 경험에 근거한, 아플리딘의 임상적으로 달성가능한 농도에 해당하는) 10 nM 이하의 범위에서 (이들 MM 세포주의 압도적 다수에 대한) IC₅₀ 용량으로, 본 발명자들의 패널의 세포주에 대하여 일반적으로 활성이 있다는 것을 보였다. 중요하게도, 아플리딘의 이 인 비트로 활성은 가장 아플리딘-민감성인 고형 종양 모델에서 그의 인 비트로 활성에 비교될만하다. 계층적 클러스터링 분석 및 관련 네트워크 알고리듬을 사용하여, 본 발명자들은 아플리딘 대 다른 항암제에 대한 MM 세포 민감성의 양상을 비교하였으며, 아플리딘에 대한 용량-반응 관계의 양상은 다른 약물의 그것과는 명확하게 구별된다는 것을 발견하였다.

이 발견은 아플리딘의 상기 항-MM 특성이 다른 약물의 기전과는 구별되는 분자 기작에 의하여 매개된다는 개념을 추가로 지지할 뿐만 아니라, APL이 이 질병의 다른 분자적 서브그룹에 대하여 조차도 활성적일 수 있다는 것을 암시한다.

결과: 약물 저항성 일차 MM 종양 세포에 대한 아플리딘의 활성

아플리딘의 인 비트로 항-MM 활성이 세포주 모델에만 한정되는 것이 아니라 는 것을 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 또한 탈리도마이드 또는 그의 유사체 및/또는 프로테아좀 저해에 저항성인 환자로부터 신선하게 분리된 일차 MM 종양 세포에 대하여 아플리딘의 효과를 시험하였다.

MM 환자로부터 분리된 10개의 일차 종양 표본(CD138+ CD38+ MM 종양 세포에 대하여 > 90%의 순도)의 예비적 시험에서, 본 발명자들은 본 발명자들의 세포주 패널의 상기 시험으로부터 얻어진 결과와 일관된 아플리딘의 인 비트로 항-MM 활성을 관찰하였다 (도 2).

요약하면, 일차 MM 종양 표본 및 MM 세포주에 대한 아플리딘의 인 비트로 연구의 결과는 이 약제가 종래의 치료 또는 다른 강한 항-MM 활성을 갖는 시험적 약제에 대하여 신생 또는 획득된 저항성을 갖는 세포들을 포함한, 넓은 범위의 MM 세포에 대하여 활성적일 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2: 안정된 Bcl -2 및 구성적으로 활성인 Akt 의 트랜스펙션

MM-1S 세포를 미리스토일화된 (구성적으로 활성인) Akt 또는 Bcl-2 (Upstate Biotechnologies, Lake Placid, NY)를 코딩하는 플라스미드 벡터 또는 빈 (neo) 벡터로 안정되게 트랜스펙션하였다. Lipofectamine 2000 (Life Technologies)을 사용하여 트랜스텍션한 후, 종레 개시된 바 (Mitsiades C. S. et al. Oncogene. 2002,21, 5673-5683; Mitsiades N. et al.Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99, 14374-14379)에 따라, G418-함유 선발 배지에서 배양하였다.

결과: 아플리딘은 Bcl -2 또는 구성적으로 활성인 Akt 의 항- 아포토시스 효과를 극복한다.

MM 및 다른 신생물에서 약물 유도된 아포토시스의 조절에 있어서 Bcl-2 및PI-3K/Akt 카스케이드의 역할 때문에, 본 발명자들은 또한 Bcl-2 또는 미리스토일화된 Akt 구조체로 안정되게 트랜스펙션화된 MM-1S 인간 MM 대 빈 벡터로 트랜스펙션된 대조군 MM-1S 세포에서 아플리딘의 활성을 특성화하였다. 본 발명자들은 Bcl-2- 또는 myrAkt-트랜스펙션된 세포는 빈-벡터로 트랜스펙션된 세포에 비하여 아플리딘에 대한 민감성이 더 낮지 않다는 것을 관찰하였다 (도 1). 이는 Bcl-2 또는 Akt 및 그의 하류 효과기의 구성적 활성화가 아플리딘의 항-MM 효과를 극복하기에 충분하지 않다는 것을 암시한다.

실시예 3: MM 세포와 골수 간질세포 ( BMSC )의 공동배양 분석

BMSC에 부착되는 경우, MM 세포주는 덱사메타손 또는 세포독성 화학요법제와 같은, 종래의 항-MM 치료에 대한 민감성이 감소하였다 (Chauhan D. et al. Blood. 1996,87, 1104-1112). 약물 저항성의 이 형태는 MM 환자가 글루코코티코이드 및/또는 세포독성 화학요법제의 투여에 근거한 치료를 받는 경우 결국에는 재발하는 핵심적 이유로 여겨지고 있다. 대조적으로, MM에 대하여 최근에 개발된 치료 중에, 화학저항성 또는 스테로이드 저항성 MM의 경우에 있어서의 항종양 활성은 MM 세포에 대한 BMSC의 보호적 효과를 극복할 수 있는, 약물의 부류, 예를 들면 프로테아좀 저해제 (Hideshima T. et al. Cancer Res. 2001,61, 3071-3076)에 의하여 달성될 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 아플리딘이 또한 BMSC와 MM 세포와의 상호작용의 분자적 과정(sequelae)를 극복하여 이 문맥에서 항-MM 활성을 달성할 수 있는지를 조사하였다. 따라서, 본 발명자들은 이미 개시된 바와 같이 MM 세포와 BMSC와 의 인 비트로 공동배양 분석을 수행하였다: BMSC를 24-웰 플레이트에서 컨플루언시까지 성장시켰다. 무혈청 배지로 세척한 후, 3 명의 MM 환자로부터 분리된 일차 종양 세포 (CD138+ 세포 >95% 순도)를 종래 기술된 것 (Uchiyama H. et al. Blood. 1993, 82, 3712-3720; Mitsiades N. et al. Blood. 2003,101, 4055-4062) 뿐만 아니라, BMSC 코팅된 또는 대조군 웰에 첨가하여, 아플리딘의 존재 또는 부존재 하에서 48 시간 동안 배양하였다. 생존 MM 세포의 CD138+ 집단을 검출하기 위하여 유세포분석 (flow cytometric analysis)을 수행하였고, MM 세포 생존성에 미치는 아플리딘의 영향은 개별 비히클-처리된 배양물에 비교하여 생존 세포 수의 %로서 표현하였다.

결과: 아플리딘은 골수 간질세포 ( BMSC )의 MM 세포에 대한 보호 효과를 극복한다.

본 발명자 그룹 및 다른 시험자의 종전 연구에 의하여 국부적 골수 (BM) 미세환경 (예, BM 간질세포)의 사이토카인- 또는 세포-매개된 상호작용이 종래 치료제 (예, 덱사메타손 또는 세포독성 화학요법)로부터 MM 세포를 보호할 수 있다는 것이 밝혀졌다 (Chauhan D. et al. Blood. 1996,87, 1104-1112). 따라서, 본 발명자들은 MM 세포와 BMSC의 세팅에서 아플리딘의 항-MM 효과를 평가하고, MM 세포 구획에서의 세포 죽음을 유세포 분석적으로 결정하여 (도 3), 상기 MM-BMSC 상호작용이 (BMSC의 생존에 유의하게 영향을 미치지 않았던 아플리딘 용량에서) 아플리딘의 인 비트로 항-MM 활성을 유의하게 감쇄시키지 않았다는 것을 관찰하였다.

실시예 4: VEGF 분비의 정량

BMSC에의 MM 세포 부착은, BM 환경에서 MM 세포의 부위에서 새로운 혈관의 보충을 위한 가장 중요한 것으로 여겨지는 과정인 혈관내피성장인자 (VEGF)와 같은, 혈관신생 사이토카인의 분비 증가를 유도한다. 그러므로, 본 발명자들은 아플리딘이 이미 기술된 MM 세포와 BMSC의 인 비트로 공동 배양 분석을 사용하여 MM 및/또는 BMSC에 의한 VEGF의 분비를 억제할 수 있는지를 평가하였다: BMSC를 24-웰 플레이트에서 컨플루언시까지 성장시켰다. 무혈청 배지로 세척한 후, 3 명의 MM 환자로부터 분리된 일차 종양 세포 (CD138+ 세포 >95% 순도)를 종래 기술된 것 (Uchiyama H. et al. Blood. 1993, 82, 3712-3720; Mitsiades N. et al. Blood. 2003,101, 4055-4062) 뿐만 아니라, BMSC 코팅된 또는 대조군 웰에 첨가하여, 아플리딘의 존재 또는 부존재 하에서 12 시간 동안 배양하였다. 상등액을 수집하고 상업적으로 구입가능한 키트 (VEGF ELISA kit; R&D Systems)를 사용하여 ELISA에 의하여 VEGF 농도를 분석하였다.

결과: 아플리딘은 MM/ BMSC 에 의한 VEGF 의 분비를 감소시킨다.

VEGF는 BM 미세환경에서 MM 세포에 대하여 증식 반응의 잠정적 매개자인 것으로 보고된 바 있다. VEGF는 또한 종양 세포 성장의 영역에 있어서 새로운 혈관의 종양 유도된 보충의 핵심 매개자이다. 급성 백혈병 세포의 아플리딘 처리에 의하여 VEGF 분비의 억제가 유도된다는 것을 암시하는 예비 보고 때문에, 본 발명자들은 아플리딘이 또한, MM 세포 및/또는 BMSC에 의한 VEGF의 분비를 억제할 수 있는지를 연구하였다. 실제로, 아플리딘 (20 nM)으로 12 시간 처리에 의하여, MM 세포에 의한 VEGF의 분비를 억제할 수 있었을 뿐만 아니라, MM 세포가 BMSC와 공동배양된 경 우 일어나는 VEGF 분비의 증가를 상쇄 (counteract)할 수 있었다 (도 4A 및 4B).

실시예 5:

결과: 아플리딘은 MM 세포를 세포독성 화학요법제에 대하여 민감화시킨다 .

MTT 발색측정 생존 분석을 사용하여, 본 발명자들은 이 처리가 아플리딘과 조합되는 경우, MM 세포가 독소루비신에 대한 반응성을 증가시켰다는 것을 발견하였다. 도 5는 독소루비신 (10 ng/mL)과 함께 아플리딘 (2 nM) 처리에 의하여 일차 MM 종양 시료가 감수성화되었다는 것을 나타낸다.

실시예 6:

아플리딘을 배양액에서 다양한 확립된 세포에 대하여 시험하였다.

사용된 세포는 다음과 같다:

-다발 골수종 세포 (MM1.S)

-덱사메타손에 저항성인 다발 골수종 세포주 (MM1.R)

-Bcl-2를 과발현하는 다발 골수종 세포주

확립된 세포주에 대하여, 세포를 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 약물을 첨가하기 전에 24 시간 동안 성장시켰다. 세포를 지시된 시간 동안 약물과 배양하고 세포 생존성을 자동 플레이트 판독기를 사용하여 XTT 또는 MTS 분석에 의하여 측정하였다.

이들 결과는 도 6-7에 나타내었다.

Claims

다발 골수종을 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 아플리딘 또는 아플리딘 유사체의 용도.
제1항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체는 아플리딘인 아플리딘 또는 아플리딘 유사체의 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체는 조합 치료를 제공하기 위하여 다른 약물 또는 약물들 또는 치료와 조합되어 사용되는 것인 아플리딘 또는 아플리딘 유사체의 용도.
다발 골수종을 앓고 있는 포유동물에 치료학적으로 효과적인 양의 아플리딘 또는 아플리딘 유사체를 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 골수종을 앓고 있는 임의의 포유동물, 특히 인간을 치료하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체는 아플리딘 또는 아플리딘 유사체인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유 사체는 조합 치료를 제공하기 위하여 다른 약물 또는 약물들 또는 치료와 조합되어 사용되는 것인 방법.
다발 골수종의 치료에 사용되기 위한, 아플리딘 또는 아플리딘 유사체 및 약학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 아플리딘 또는 아플리딘 유사체는 아플리딘인 약학 조성물.
아플리딘 또는 아플리딘 유사체, 및 재구성제를 포함하는 약학 조성물을 별도의 용기에 포함하는, 다발 골수종의 치료를 위하여 아플리딘 또는 아플리딘 유사체를 투여하기 위한 의학적 키트.