CZ302498B6 - Farmaceutický prípravek obsahující aplidin pro lécení rakovinových onemocnení - Google Patents

Abstract

Použití aplidinu pro prípravu farmaceutického prípravku pro lécení rakoviny u pacienta, kterému se ve farmaceutickém prípravku podává aplidin až do doporucené dávky, která je v souladu s údaji o toxicite limitující dávku. Farmaceutický prípravek obsahující aplidin vykazuje velmi slibné výsledky ve fázi I klinických pokusu pri lécbe nádoru.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravu pro léčení rakovinových onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Rakovinové onemocnění zahrnuje skupinu maligních novotvarů, které lze rozdělit do dvou kategorií, karcinomy, které zahrnují většinu případů pozorovaných na klinikách a další, méně častá rakovinová onemocnění, která zahrnují leukémii, lytnfom, nádory centrálního nervového systému a sarkom.

Karcinomy mají svůj původ v epitelových tkáních, zatímco sarkomy se vyvíjejí v pojivové tkáni a těch strukturách, jež mají původ v mezodermálních tkáních. Sarkomy mohou zachvátit například sval nebo kost a objevují se v kostech, močovém měchýři, ledvinách, játrech, plicích, priušní žláze nebo slezině.

Rakovina je invazivní a má tendenci metastázovat do nových míst. Rozšiřuje se přímo do okolních tkání a také se může šířit prostřednictvím lymfatíckých a oběhových systémů. Na rakovinu jsou k dispozici mnohé léčebné postupy, v to zahrnujíc operační zákrok a radiační působení u lokalizovaného onemocnění a léčiva. Avšak účinnost léčebných postupů, které jsou na různé typy rakoviny k dispozici, je omezená, a tak jsou žádoucí zlepšené formy léčení, které přinášejí klinický prospěch. To je obzvláště pravdivé u těch pacientů, kteří jsou v pokročilém a/nebo mestastázujícím stavu nemoci. Totéž platí pro pacienty, u kterých došlo k postupující nemoci k opětovnému zhoršení zdravotního stavu poté, co již dříve byli léčeni zavedenými terapiemi a pro které je další léčení stejnou terapií většinou neúčinné v důsledku získání rezistence nebo v důsledku omezení podávání léčivých látek vzhledem kjejich doprovodným toxicitám.

Chemoterapie hraje důležitou roli v léčbě rakoviny, neboť je vyžadována pro léčbu pokročilých karcinomů věštících metastázi a často napomáhá zmenšení nádoru před operací, přičemž bylo vyvinuto mnoho protirakovinových léčiv založených na různých způsobem účinku. Dehydodidemnin B, nyní známý jako aplidin, je předmětem WO 91/04985.

Další informace o aplidinu jsou například v pracech

Ji měno J., Využití mořských mikroorganismů a bezobratlých: Protinádorová léčiva mořského původu (Exploitation of marine microorganisms and invertebrates: Anticancer drugs from marine origin), IBC Conf Discov Drugs from nat Novel Approaches New Sources, 8. až 9. prosince 1994, Londýn 1994,

Faircloth G. et al., Dehydrodidemnin B (DDM), nové protirakovinovč činidlo mořského původu (MDA) účinné na experimentální nádorové modely (Dehydrodidemnin B (DDM) a new marine derived anticancer agent (MDA) with activity agaínst experimental tumoru models), 9. NCIEORTC Symp New Drugs Cancer The, 12. až 15. března 1996, abstrakt 111, Amsterodam 1996,

Sakai R. et al., Vztah mezi strukturou a aktivitou didemninů (Structure-activity reíationships of the didemnins), Journal of Medicinal Chemistry 39 (14), 2819 (1996),

- 1 CZ 302498 B6

Urdiales J.L. et al., AntiproliferaČní účinek dehydrodidemninu B (DDB), depsipeptidu izolovaného z pláštěnců Středozemního moře (Antiproliferative effect od dehydrodidemnin B (DDB), a depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates), Cances Letters 102 (1-2), 31 (1996),

Faircloth G. et al., Preklinická charakterizace aplidinu (APD), nového prot(rakovinového depsipeptidu mořského původu (MADEP) (Preclinical characterization of aplidine (APD), a new marine anticancer depsipeptide (MADEP)), Proč. Amer. Assoc. Cancer Res 38, 1997, abstrakt 692,

Depenbrock H. et al., In Vitro aktivita aplidinu, nové protirakovinové sloučeniny mořského původu, na explantované klonogenní lidské nádorové buňky a krvetvorné prekurzorové buňky (In vitro activity of aplidine, a new marine-derived anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells), British Journal of Cancer 78 (6), 739(1998),

Faircloth G. et al., Aplidin (aplidin) je nový depsipeptid mořského původu s protinádorovou aktivitou in vivo (Aplidine (aplidine) is a novel marine-derived depsipeptide with in vivo antitumour activity), Proč Amer Assoc Cancer Res 39, 1998, abstrakt 1551,

Faircloth G. et al., Preklinické využití aplidinu, nového Činidla mořského původu, které má silný protinádorový účinek (Preclinical development od aplidine, a novel marine-derived agent with potent antitumour activity), 10. NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (16. až 19. června 1998, Amsterodam), abstrakt 129,

Mastbergen S.C., et al. Cytotoxicita a neurocytotoxicita aplidinu, nového protirakovinové ho činidla mořského původu, vyhodnocená pomocí testů in vitro (Cytotoxicity and neurocytotoxicity of aplidine, a new marine anticancer agent evaluated using in vitro assays), 10. NCI-EORTC Symp New Drugs Cancer Ther (16.až 19. června 1998, Amsterodam), abstrakt 131.

Pri preklinických studiích měl aplidin na dávce závislý cytotoxický účinek na dvě epitelovité buněčné linie, CT-1 a CT-2 a buněčnou linii HT-29 rakoviny trakčníku u lidí. Nejproliferativnější linie CT-2 byla na aplidin nej citlivější. Navíc tato sloučenina snižovala omitindekarboxylázovou aktivitu u všech tří buněčných linií (Lobo C., Garcia-Pozo S. G. et al., Voli v dehydrodidemninu B na buněčné linie rakoviny trakčníku u lidí (Effect of dehydrodidemnin B on human colon carcinoma cell lineš), Anticander Research 17, 333 až 336, leden až únor 1997). V podobné studii 50 nM aplidin inhiboval růst buněčných linií u rakoviny prsu, MDA-MB231 a MCF-7, a to v uvedeném pořadí ze 17 a 47 %. V buňkách, na něž se působilo, byl pozorován významný nárůst spermidinu a sperminu (Gomer-Fabre Ρ. M., De Pedro E. et al., Obsahy polyaminu v lidských rakovinových buňkách při rakovině prsu, na které se působilo cytotoxickými činidly chlorfeniraminem a dehydrodidemninem B (Polyamine contents of human breast cancer cells treated with the cytotoxic agents chlorpheniramine and dehydrodidemnin B), Cande Letters 113, 141 až 144, 26. února 1997)). Průtoková cytometrická analýza prokázala, že aplidin neindukoval žádné zřejmé perturbace buněčného cyklu (Erba E., Balconi G. et al. Perturbace fází buněčného cyklu indukované novými přírodními sloučeninami mořského původu (Cell cycle phases perturbation induced by new naturel marine compounds), Annals of Oncology 7 (dodatek I), 82 (1996)). U myší byl aplidin účinný vůči implantovanému leukemickému P388 a melanomu B16, s optimální dávkou 160 pg/kg. Na rozdíl od didemninu B byl aplidin účinný vůči subklavikulámě implantovaným lewisovským plicním karcinomům (Faircloth G., Rinahert K. et al., Dehydrodidemnin B, nové protirakovinové činidlo mořského původu, které působí na experimentální modely nádorů (Dehydrodidemnin B a new marine derived anticancer agent with activity against experimental tumour models), Annals of Oncology 7 (dodatek 1), 34 (1996)).

Nepřetržitá expozice nízkým koncentracím aplidinu inhibovala růst mnoha nádorových buněčných linií, v to zahrnující nehodgkinský lymfon, melanom a rakovinu prsu, karcinomy vaječníků a nemalobuněčné plicní karcinomy. Velikost účinku byla závislá na době expozice a účinek byl dosažitelný při koncentracích, které nebyly myelotoxické. Buněčné linie nemalobuněčné plicního .

CZ 302498 BÓ karcinomu, rakoviny prsu a melanomu byly citlivé na nepřetržitou expozici aplidinu v koncentracích větších nebo rovných 0,001 pmol/I, Aplidin má podobnou toxicitu jako doxorubicin vůči klonogenním krvetvorným stemálním buňkám (Depenbrock H., Peter R. et al., In vitro aktivita aplidinu, nové protirakovinové sloučeniny mořského původu, na čerstvě explantované klonogen5 ní lidské nádorové buňky a krvetvorné prekurzorové buňky (In vitro activity of aplidine, a new marine-dertved anti-cancer compound, on freshly explanted clonogenic human tumour cells and haematopoietic precursor cells), British Journal of Cancer 78(6), 739 až 744 (září 1998).

Aplidin má významný účinek na lidské rakovinové xe no implantáty implantované myším, io Při maximální tolerované dávce 2,1 mg/kg vyvolal aplidin téměř úplné vymizení projevů nemoci u některých zvířat s poměrem léčených ku kontrolním (T/C) zvířatům rovným 9 %. Při koncentraci 1,25 mg/kg byl pozorovatelný významný účinek na žaludeční nádory (T/C je 14 %) a byla také pozorována inhibice růstu nádoru prostaty (T/C je 25 %), (Faireloth G., Grant W. et al., preklinícké využití aplidinu, nového činidla mořského původu, která má silný protinádorový účinek (Preclinicat development od aplidine, a novel marinederived agent with potent antitumour activity), Annals of Oncology 9 (dodatek 2), 34 (1998)).

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení jakéhokoliv savce, zejména člověka, který je postižen rakovinovým onemocněním přičemž farmaceutický přípravek je podán tak, aby bylo podáno terapeuticky účinné množství aplidinu postiženému jednotlivci.

Vynález se tedy týká použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, kde aplidin je ve formě pro intravenózní infuzní podání

a) 24 hodinové infuze jednou za týden po tri týdny, následované přestávkou 1 týdne, při jednot30 kové dávce do 3750 gg/m²/týden

b) 24 hodinové infuze jednou za čtrnáct dnů, pri jednotkové dávce do 7000 gg/m²/2 týdny, nebo

c) 1 hodinové infuze jednou týdně po tri týdny každé čtyři týdny, pri jednotkové dávce do 3600 pg/m²/týden.

Předložený vynález se také týká farmaceutických přípravků, které obsahují jako aktivní složku aplidin, stejně jako postupů pro jejich přípravu.

Příklady farmaceutických přípravků zahrnují kapalinu (roztoky, suspenze nebo emulze) o vhodné složení pro nitrožilní podání a tyto přípravky mohou obsahovat čistou látku nebo její kombinaci s jakýmkoliv nosičem nebo jinými farmakologicky aktivními látkami.

Sloučeninu aplidin a přípravky tohoto vynálezu lze použít s dalšími léčivy, aby byla získána kombinovaná terapie. Další léčiva mohou tvořit část stejného přípravku nebo jsou jako oddělený přípravek pro podávání ve stejném nebo různém čase.

Identita tohoto dalšího léčiva není konkrétně omezena a vhodní kandidáti zahrnují

a) léčiva s antimitotickými účinky, konkrétně ta, jejichž cílovým místem jsou cytoskeletální prvky, v to zahrnujíc mikrotubulámí modulátory jako taxanová léčiva (jako taxol, paclitaxel, taxotere, docetaxel), podofylotoxiny nebo Vinca alkaloidy (vincristin, vinblastin)

- j CZ 302498 B6

b) antimetabolitová léčiva (jako 5-fluorouráčil, cytarabin, gamcitabin, purinové analogy jako pcntostatin, methotrexát),

c) alkylační činidla nebo dusíkaté yperity (jako nitrosomočoviny, cyklofbsfamid nebo ifosfamid),

d) léčiva, jejichž cílem působení je DNA, jako anticyklinová léčiva adriamycin, doxorobucin, farmorubicin nebo epirubicin,

e) léčiva, jej ichž cílem působení jsou topoizomerázy, jako etoposid,

f) hormony a agonisté nebo antagonisté hormonů jako estrogeny, antiestrogeny (tamoxfen a příbuzné sloučeniny) a androgeny, flutamid, leuprorelin, goserelin, cyproteron nebo octreotid,

g) léčiva, jejichž cílem působení je přenos signálu v nádorových buňkách, v to zahrnujíc deriváty protilátekjako je herceptin,

h) alkylační činidla jako léčiva s platinou (cis-platina, karboplatina, oxaliplatina, paraplidineatin) nebo nitrosomočoviny,

i) léčiva potenciálně ovlivňující metastázu nádorů jako inhibitory matrixových metaloproteirtáz,

j) Činidla pro genovou terapii a znecitlivující činidla,

k) protilátková terapeutika,

l) další bioaktivní látky mořského původu, zvláště kahalalid F nebo exteinascidiny jako et-743,

m) protektory kosterního svalstvajako kamitinové doplňky,

o) další léčiva, která působí proti vedlejším účinkům aplidínu, jako jsou antiematika,

p) obecněji léčiva, která umožňují, aby se aplidin dávkoval v doporučené dávce a která kontrolují toxicitu.

Předkladatelé dále zjistili, že aplidin inhibuje expresi genu (FLTI) kódujícího receptoru vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF). Aplidin navíc silně inhibuje produkci samotného proteinu VEGF nádorovými buňkami.

Vylučování VEGF buněčnou hmotou, konkrétně nádorovou buněčnou hmotou, způsobuje vaskularizací de novo (angíogenezi), která vede k novým krevním cévám vytvářeným k buněčné hmotě a která utváří síť kapilár, kteráje schopna ji opatřit prokrvením pro její další proliferaci. O těchto účincích, konkrétně demonstrovaném zabránění produkce VEGF nádorovými buňkami, se předpokládá, že značně mezi schopnost nádorových buněk pokračovat v angíogenezi. Navíc VEGF je jako růstový faktor vyžadován přímo některými krvetvornými nádorovými buňkami (jako jsou lidské leukemické buňky MOLT--4).

O aplidinu se tak předpokládá, že má inhibiční účinek na de novo vaskularizaci rostoucích primárních nádorů nebo metastáz, a proto inhibuje růst nádorů, o nichž je známo, že pro růst vyžadují vaskularizaci. Aplidin by měl být také účinný na nádory krvetvorné tkáně.

O aplidinu je navíc známo, že modeluje funkci vápníkových kanálků v buňkách.

-4 cz 302498 Bó

Nádory močového měchýře jsou jedním typem nádoru, který nadměme vylučuje receptor pro epiteliální růstový faktor (EGF), což vede ke zvyšování VEGF a receptorů VEGF. Navázání VEGF jako receptor vede mezi jinými mechanismy signalizace i ke stimulaci růstu buňky prostřednictvím přechodných místních změn iontu vápníku. O látce, která ínhibuje účinek VEGF se předpokládá, že ínhibuje i tyto nádory.

O aplidinu bylo experimentálně zjištěno, že má v souladu s předpovědí neobyčejně vysoký vliv na rakovinu močového měchýře u člověka (za úplného vymizení u některých modelových pokusech se zvířaty).

O aplidinu se předpokládá, že má vzhledem ke svým účinkům na velké množství nádorů široké spektrum proti nádorových účinků.

Účinek VEGF je důležitější, neboť zahrnuje inhibici nových krevních cév. Některé nádory navíc k účinkům na krevní cévy vyžadují VEGF přímo pro růst buňky (to je u leukémie, lymfomů, nádorům močového měchýře a nádorů vaječníků).

Proto je tak popsán způsob léčení nádoru, který je závislý na angiogenním procesu, který zahrnuje podávání aplidinu. Vynález se dále týká procesu přípravy inhibitoru invaze rakovinou nebo rakovinových metastáz a zahrnuje smíchání účinné dávky aplidinu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Konkrétně se předpokládají způsoby léčení poruch angiogeneze jako je neoplazie zahrnující metastázy.

Při klinických pokusech s aplitinem byly u pacientů s rakovinou pozorovány odezvy, které prokázaly užitečnost tohoto způsobu léčení.

Klinické studie fáze I a farmakokinetická analýza ukazují, že aplidin představuje pozitivní terapeutický prostředek s přijatelnou toxicitou v rozmezí dávkování požadovaného pro klinickou účinnost při léčení pacientů s rakovinou.

Aplidin se podává a skladuje jako sterilní, lyofylizovaný výrobek, který obsahuje aplidin a excipient v přípravku vhodném proterapeutické použití.

Solubilizovaný aplidin podléhá za podmínek testování tepelnou a světelnou zátěží značnému rozkladu, a tak byla vyvinuta lyofilizovaná forma, viz WO 99/42125. V obecně zvýhodněném provedení vynálezu byla lyofilizace provedena z 500 mg/l roztoku aplidinu ve 40% (v/v) tercbutanolu ve vodě pro injekci (Wfl) obsahující 25 mg/ml D-mannitolu jako plnicího činidla. V klinických studiích byl jako optimální přípravek nalezen prototyp obsahující 500 mg aplidinu a 25 mg D- mannitolu jako plnicího činidla na vialku, a to stran rozpustnosti, délky lyofilizacního cyklu a požadavků na dávkování. Optimálním zjištěním rekonstitučním roztokem je 15%/l 5%/70% (v/v/v) Cremaphor EL/ethanol/Wfí (CEW). Jak rekonstituění produkt, tak jeho normálním fyziologickým roztokem zředěné formy rekonstituěního produktu (do 1:100, v/v), byly stálé alespoň 24 hodin po přípravě. Údaje o skladování, jež jsou dosud k dispozici, ukazují, že přípravek je stálý alespoň 1 rok, když je skladován při 4 °C v temnu.

Přípravek infuzního roztoku se také vyrobí za aseptíckých podmínek vytažením objemu rekonstitučního roztoku odpovídajícího dávce vypočtené pro každého pacienta a pomalým injikováním požadovaného objemu rekonstituěního roztoku do infuzního vaku nebo lahve obsahující 100 až 1000 ml 0,9% chloridu sodného, po kterém se však pomalým ručním třepáním zhomogenizuje. Infuzní roztok s aplidinem by se měl podávat nitrožilně co nejdříve je to možné, do 48 hodin od přípravy. Zvýhodněné zásobníkové a přívodní materiály jsou infuzní systémy z PVC a polyethylenu, stejně jako z čirého skla.

- 5 CZ 302498 Β6

Podávání se provádí v cyklech. Podle potřeby se provádějí zpoždění dávky a/nebo snížení dávky a úpravy časového plánu, a to v závislosti na toleranci jednotlivých pacientů k léčení, konkrétně jsou doporučeny redukce dávky u pacientů s vyššími než normálními sérovými hladinami jaterních transamináz nebo alkalické fosfatázy nebo bilirubinu.

Doporučená dávka (RD) je nejvyšší dávka, kterou lze bezpečně podat pacientovi a která má tolerovatelnou, zvládnutelnou a reverzibilní toxicitu podle obecného kriteria toxicity zavedeného Národním ústavem pro výzkum rakoviny (National Cancer Institute), USA, s ne více než 2 ze 6 pacientů, u kterých se objeví jakékoliv limitní toxicity dávky (DLT).

Postupy v terapii rakoviny často vyžadují podávání chemoterapeutických činidel v nejvyšší bezpečné dávce, při které je toxicita ještě zvládnutelná, aby se dosáhlo maximální účinnosti (DeVita, V.T. jr., Hellmans S. a Rosenberg S., A., Rakovina: Princity a praktické postupy v onkologii (Cancer: Principles and Practice of Oncology), 3. vydání 1989. Lipincott, Filadelfie).

DLT pro aplidin byly v klinických studiích určeny použitím tohoto způsobu léčení. Tyto studie určily doporučenou hladinu dávky pro různé druhy dávkovačích protokolů.

Aplidin lze bezpečně podávat na dávkové úrovni doporučené dávky (RD) nebo nižší než RD. Postupem je v současné době infuze, s typickými režimy, které zahrnují následující typy, hodin infuze týdně po mnoha týdnů, obvykle 3 týdny, následované jedním týdnem přestávky, hodin infuze za čtrnáct dnů, hodina infuze týdně po 3 týdny každé 4 týdny.

Konkrétně lze nitrožilní infuzi provádět jako 24hodinovou infuzi jednou týdně po 3 týdny ze 4 týdnů. Více údajů je uvedeno v příkladech 3, 4, 10 a 11. Vhodná je doporučená dávka 3750 gg/m‘/týden po 3 týdny. Tento protokol byl doplněn a pacienti budou nyní léčeni použitím různého rozpisu, kterýje vhodný: 3 týdny infuze každé 2 týdny bez přestávky. Viz například 1 1. Ve studii s 24 hodinami ze čtrnáct dnů se na studované pacientů působí dávkou 7000 gg/m72 týdny. Viz příklady 6, 13 a 16. Na pacienty zahrnuté ve studii 1 hodina/týden po 3 týdny každé 4 týdny se působí dávkami do 3600 gg/m²/týden po 3 týdny. Viz příklady 12 a 15. Když se aplidin použije v kombinaci s dalšími terapeutickými činidly, může být potřeba upravit dávkování obou činidel.

Hlavní biologické odezvy dříve pozorované při podávání aplidinu byly pozorovány na modelech se zvířaty nebo in vitro, o nichž je známo, že jsou notoricky nepřesné, a to ve vztahu k jejich použitelnosti k předpovězení odezev u lidských pacientů nebo u lidských pacientů pri experimentálním uspořádání, kde nebyl k dispozici účinný a bezpečný způsob léčení (buď použité dávkování bylo v toxické dávce významně vyšší než v doporučené dávce, nebo rozpis podávání nebyl vhodný).

V klinických pokusech s použitím způsobu tohoto vynálezu bylo u pacientů dosaženo vhodných úrovní v plazmě při doporučené dávce a co je nejdůležitější, objektivně měřitelné odezvy poskytly důkaz klinického přínosu pro pacienty.

Definice pro toxicitu vůči pacientům byly přijaty z kritérií WHO a odezvy určené podle kritérií pro odezvy podle WHO.

U pacientů s pokročilými a/nebo metastázujícími karcinomy, které vzdorovaly předchozím léčením, byly získány objektivní odezvy, jež zahrnovaly ty odezvy, které jsou popsány v příkladech.

- 6 CZ 302498 B6

Při konkrétním léčení tímto způsobem byly u pacientů s rakovinou v pokročilém a/nebo metastázujícím stavu nemoci prokázány odezvy, které vykazovalo progresivní onemocnění po předchozím léčení zavedenými terapiemi.

Zvýhodněný způsob tohoto vynálezu proto zahrnuje identifikaci pacientů s rakovinou, kteří byli na rakovinu léčeni, konkrétně pacientů, na které se působilo chemoterapeuticky a jejich léčení aplidinem.

io Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje pokles exprese fit—1 pozorovaný pomocí techniky microarrays potvrzeného RT-PCR analýzou.

i? Obrázek 2 ukazuje pokles fit—1 mRNA. indikovaný aplidinem v buňkách MOLT^L

Obrázky 3a a 3b ukazují VEGF-Flt-1 autokrinní smyčku v buňkách MOLT-4 a účinek aplidinu. Obrázek 4 ukazuje, že aplidin blokuje vylučování VEGF z buněk MOLT-4.

Obrázek 5 ukazuje aplidinem indukovanou zábranu vylučování VEGF.

Obrázek 6 ukazuje silný pokles hladin mRNA VEGF v buňkách MOLTM,

Obrázek 7 ukazuje, že aplidin nesnižuje aktivitu promotoru VEGF přeneseného do buněk MOLT-4.

Obrázek 8 ukazuje, že aplidin neblokuje navázání transkripčních faktorů HIF-1 a AP-1 na jejich společné sekvence DNA, které jsou přítomné v promotoru VEGF.

Obrázek 9 ukazuje, že aplidin neblokuje navázání transkripěního faktoru HIF-1 a jejich společné sekvence DNA, které jsou přítomné v promotoru VEGF.

Obrázky 10a a 10b ukazují, že VEGF přidaný do kultivačního média buněk MOLT-4 trochu sníží účinek nízkých koncentrací aplidinu, zatímco při vyšších koncentracích je bez účinků.

Obrázek 11 ukazuje, že aplidin je schopný snížit vylučování VEGF u linie IGROV-1 rakoviny vaječníků u lidí.

Obrázek 12 ukazuje, že aplidin snižuje hladiny mRNA VEGF také u linie IGROV-1 rakoviny vaječníků u lidí.

Obrázek 13 ukazuje, že aplidin neovlivňuje promotorovou aktivitu VEGF, měřenou pomocí reportérového genového systému luciferáza/renilla.

Obrázek 14 ukazuje vztah mezi dávkou a AUC.

Obrázek 15a a 15b ukazují účinek ne medulámí karcinom štítné žlázy: hladiny ACE.

- 7 CZ 302498 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 (srovnávací příklad)

Profil genové exprese v lidských leukemických buňkách MOLT-4, na které se působilo sloučeninou mořského původu aplidinem

Prvotní změny v genové expresi indukované aplidinem v buňkách MOLI'-4 byly vyhodnoceny technikou microarrays pomocí exprese cDNA (Atlas Human Cancer, Clontech). Na buňky MOLT-N se I hodinu působilo koncentracemi aplidinu, které inhibovaly růst z 50 % a veškerá RNA byla izolována v časech 0, 1, 6 a 24 hodin po vymytí léčiva. Filtry byly hybridizovány stejným množstvím cDNA značené ³² P. Analýza výsledků byla provedena použitím programu ATLAS 1MAGE 1.0. Jako významné změny v expresi RNA byly brány změny genové exprese větší než dvojnásobné a tyto byly následně potvrzeny pomocí PCR. Výrazné, na čase závislé snížení exprese VEGF-R1 (fit-1) bylo pozorováno a potvrzeno u hladiny RNA pomocí PCR a proteinové hladiny pomocí Western blotting.

Příklad 2 (srovnávací příklad)

Korelace selektivních protinádorových účinků sloučeniny mořského původu aplidinu pomocí různých modelových systémů

K získání základu pro další klinickou práci byly vyhodnoceny různé modelové systémy. Selektivní protinádorové účinky byly zřejmé vůči dvěma h i sto logicky odlišným tvrdým nádorům, žaludečnímu a prostatovému nádoru u lidí. Silný in vitro účinek na primární žaludeční nádorové preparáty nebo žaludeční nádorové buňky Hs746T je v uvedeném pořadí evidentní na IC₅₀ hodnotách 146 a 450 pM. Proti nádorovým buňkám prostaty PC-3 byl zjištěn slabší, ale ne méně selektivní účinek IC_S0 při 3,4 nM. Účinky in vitro byly vyhodnoceny na holých hlodavcích použitím subkutánně implantovaných nádorových fragmentů nebo dutých vláken (HF) obsahujících nádorové buňky.

-8CZ 302498 B6

Tabulka 1. Optimální dávka a in vivo účinky aplidinu

Nádor	Linie	Režim	Subkutánní model	Zvíře	Dávka (mg/kg)	Účinek <% T/C)
Žaludeční	MRI-	qd9.ip	xeno implantát	myš	2,1	19%
	-H254				1,05	17%
		q4dx3.ip	xenoimplautát	myš	1,25	18%
		24	HF	krysa	0,7	20 %
		h iv
		inf.
Prostaty	PC-3	qd9.ip	xeno implantát	myš	1,25	25%
					0,62	30%
		q4dx3,ip	xeno implantát	myš	2,10	34%
					1,05	38 %
		24	HF	krysa	0,70	31 %
		h ív	HF	krysa	0,70	33%
		inf.
		5 dílů, i v
		inf.

Zkratky v tabulce I.ip - intraperitoneálně, iv = nitrožilně, h = hodina, inf = infuze, d = den, q = každý

Optimální účinky byly pozorovány u xenoimplantováných žaludečních (17 až 20 %) a prostatových (25 až 38 %) nádorů po intraperitoneálním podávání. Následné studie si vyžádaly použití krys pro nitrožilní infuze. Rozpis s 24hodinovou nitrožilní infuzí s touto obměnou poskytl podobné účinky na žaludeční (20 %) a prostatové (31 %) nádorové buňky v dutých vláknech. Cytotoxiio čita byla také zjištěna při použití rozpisu s Sdenní nitrožilní infuzí vůči prostatovým nádorovým buňkám (33 %) v dutých vláknech. Rozšířená in vivo hodnocení nejenom že ukazují silnou relativní korelaci s in vivo cytotoxickým profilem, ale také silnou korelaci s in vivo modely použitými k charakterizaci nádorové selektivity, která označila aplidin za kandidáta pro klinickou etapu zkoušek.

Příklad 3

Studium fáze I a farmakokinetické studie aplidinu podávaného pacientům s pokročilými tvrdými 20 nádory jako 24hodinová infuze týdně

In vivo studie odhalily, že účinek in vivo se zvýšil prodloužením doby trvání infuze. V této studii se působilo na 16 pacientů. Charakteristiky pacientů: medián věku byl 55 let, medián PS 1, muži/ženy = 11/5, typy nádorů byly následující: hlava a krk 5, ledvina 2, trakčním tlustého stře25 va 3, konečník 2, sarkom 1 a melanom 3, všechny byly předem ošetřeny chemoterapií (medián 2 kúry).

-9 CZ 302498 B6

Aplidin byl podáván jako 24hodinová infuze v následujících dávkových úrovních (Dis): 133 (3 pacienti), 266 (3 pacienti), 532 (3 pacienti), 1000 (3 pacienti), 2000 (3 pacienti) a 3000 (1 pacient) pg/rrf/týden po 3 týdny každých 28 dnů.

Nebyly pozorovány toxicity limitující dávku (DLTs). Zaznamenány byly pouze mírné, nehematologické toxicity sestávající z nevolnosti stupně 1, vylučování hlenu stupně 1, tělesné slabosti stupně 1. Běžná byla flebitida paže s infuzí a závisela na koncentraci. Earmakokinetická analýza byla provedena u všech pacientů a tato ukázala plazmové hladiny pri úrovních dávek 1000 a 2000 pg/m7týden jako ekvivalentní koncentraci aktivní látky in vitro 1 ng/ml. Pri úrovni dávky 532 pg/m²/týden bylo pozorováno klinické zlepšení u jednoho předléčeného pacienta s pokročilým melanomem.

Příklad 4

Studium fáze I a farmakokinetické (PK) studium aplidinu (APL) použitím 24hodinového týdenního rozpisu

K dnešku bylo v této studii fáze I léčeno 25 pacientů (s mediánem věku 58 let, s mediánem ECOG1), u nichž byly v minulosti léčeny pokročilé, tvrdé nádory nebo lymfomy. Pří použití aplidinového rozpisu 24 hodin týdně po 3 týdny následovaného 1 týdnem přestávky byly testovány následující dávkové hladiny: 133 (3 pacienti), 266 (3 pacienti), 532 (3 pacienti), 1000 (3 pacienti), 2000 (3 pacienti), 4500 (3 pacienti) a 3750 pg/m²/týden (3 pacienti). Po 60 cyklech (180 infuzích) podávání byli všichni pacienti vyšetřeni na toxicitu. Nejvyšší snesitelná dávka byla 4500 g/m/týden po 3 týdnech se stupněm (G) svalové toxicity 3 (biopsií prokázaný typ II svalové atrofie). U 2 nebo 4 pacientů byly toxicity CPK G4 a abnormální jatémí tedy G3, které limitovaly dávku. Nevolnost G2 byla pozorována u většiny pacientů a zvracení G2/3 pri dávkách >2000 gg/m², flebitida je běžná, ale závisí na koncentraci. U všech pacientů byly provedeny odběry pro farmakokinetickou analýzu pomocí LC/MS/MS. Předběžné údaje indikují rozsáhlou distribuci do tkáně, dlouhou eliminaci s t]_/2 10 až 24 hodin a plazmové hladiny > 1 ng/ml (která je účinná in vitro). U jednoho pacient s pokročilým melanomem odolným vůči DTIC/interferonu se dosáhlo klinického zlepšení udržovaného po více než 30 týdnů. Tato studie s týdenními infuzemi ukazuje vhodnost a účinnost rozpisu se silnou dávkou aplidinu. Jak bylo očekáváno, dávku limituje neurosvalová toxicita. Jako možná doporučená dávka byla stanovena dávka 3750 pg/m²/týden po 3 týdny.

Příklad 5

Klinické farmakokinetické (PK) studie aplidinu (APL) u pacientu s tvrdými nádory a nehodgkinskými lymfomy

Hodnoceny byly čtyři nitrožilní rozpisy pro fázi 1: 24 hodin infuze týdně, 24 hodin infuze za čtrnáct dnů a 1 hodina infuze po 5 následujících dnů každé 3 týdny. Koncentrace aplidinu v krvi byla analyzována kapalinovou chromatografií ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Počáteční výsledky ukazují akumulaci v krevních buňkách a farmakokinetika v plazmě je charakterizována širokou distribucí (rozmezí distribuce je obvykle vyšší než 200 1/m²) a poločasy eliminace řádu 10 až 24 hodin. Otevřený dvoukompartmentový model vhodně vyhovuje většině profilů po 24 hodinách infuze. Pro infuze s 1 hodinou ve většině případů lépe vyhovuje trojkompartmentový model. O získaných hladinách v plazmě je známo, že jsou účinné in vitro. V současnosti probíhá vyhodnocení dalších pacientů a porovnání farmakokinetiky v krevních buňkách a plazmě.

- 10CZ 302498 B6

Příklad 6

Předběžné výsledky studie fáze I a farmakokínetické studie aplidinu podávaného jako 24hodinová infuze každé 2 týdny pacientům s tvrdými nádory a nehodgkinskými lymfomy

Aplidin se podával jako 24hodinová infuze každé 2 týdny. Počáteční dávka byla 200 gg/m²/den a zvyšování dávky pokračovalo až do 400, 800, 1600 a 3200 pg/m²/den. Studie se účastnilo celkem 18 pacientů (muži/ženy = 7/11, medián věku byl 52 let, OMS 0/1 = 10/8). Dosud nebyla zaznamenána žádná dávka s mezní toxicitou, U hodnocených pacientů byla zaznamenána toxicita sestávající z nevolnosti/zvracení mírného stupně I až II, tělesná slabost stupně I až II a křeče, které se objevily během nebo vzápětí po infuzi. U hodnocených dávek nebyla zjištěna žádná neurosvalová toxicita. U jednoho pacienta s pokročilou rakovinou plic a dokumentovanou progresí nádoru se při dávce 1600 gg/m² vyvinula hemolytická anemie a trombocytopacie, které byly považovány za nepravděpodobně spojené se studovaným léčivem. Úvodní farmakokinetická analýza ukázala, že léčivo se široce distribuuje a prokázala jeho koncentrace v krvi. Otevřený dvoukompartmentový model hlavně vyhovuje většině profilů koncentrace v plazmě. Terminální poločas je obvykle řádu 10 až 24 hodin. Klinická zlepšení se projevila u pacientů s nehodgkinským lymfomem. Pokračuje nárůst ve sběru dat pro určení dávky s limitní toxicitou a dávky doporučené pro studie fáze II.

Příklad 7 (srovnávací příklad)

Profil genové exprese u lidských leukemických buněk MOLT-4, na které se působilo látkou mořského původu aplidinem

V předložené studii byly zhodnoceny prvotní změny genové exprese, které byly indukovány aplidinem v buňkách MOLT-4 použitím exprese cDNA sledované technikou microarrays (Atlas Human Cancer, Clontech). Na buňky MOLT-4 se 1 hodinu působilo koncentracemi aplidinu, které inhibovaly růst z 50 % a veškerá RNA byla izolována v časech 0, 1, 6 a 24 hodin po vymytí léčiva. Filtry byly hybridizovány stejnými množstvími cDNA značené ³²P. Analýza výsledků byla provedena použitím programu ATLAS IMAGE 1.0. Jako významné změny v expresi RNA byly brány změny genové exprese větší než dvojnásobné a tyto byly následně potvrzeny pomocí PCR. Výrazné, na čase závislé snížení exprese VEGF—Rl (fit—1) bylo pozorováno a potvrzeno u hladiny RNA pomocí PCR a u hladiny proteinu pomocí Western blotting. V současnosti je předmětem zkoumání, zda omezení aktivity fit—1 se týká cytotoxického a proti nádorového účinku aplidinu. V současnosti je také studována charakterizace exprese dalších genů, která se zdá být explozí aplidinu omezována.

Kvantitativní změny genové exprese indukované aplidinem v buňkách MOLT-4

Gen	1 hodina	6 hodin	24 hodin
B-RAF	-	+2,0	+2,6
FLT-1	-1,5	-5,0	-34
FMS	-	+2,7	+2,1
ETR	+2,7	-	-
DNA-PK	-	+3,0	+3,8
PLK-1	-	+3,0	+4,4

-IICZ 302498 Bó

Pokles genové exprese FLT-1, pozorované pomocí techniky mikroarrays, byl potvrzen RT-PCR analýzou, viz obrázek 1.

Použitím RNázového chránění byl vyčíslen pokles mRNA u Fit—1 v buňkách MOL.T 4. indukovaný 20 mM aplidinu, viz obrázek 2.

Obrázky 3a a 3b znázorňují autokrinní smyčku VEGF-Fltl v buňkách MOLT-4 a účinek aplidinu v autokrinní smyčce VEGF-Flt-1.

Aplidín blokuje vylučování VEGF z buněk MOLT-4, viz obrázek 4. Na buňkách se působilo 1 hodinu 20 mM aplidinu. V prostředí vyloučený VEGF byl změněn pomocí metody ELISA na konci působení a po 6 a 24 hodinách inkubace v prostředí bez léčiva.

Aplidinem indukovaná blokace vylučování VEGF je závislá na koncentraci aje pozorovatelná již při koncentraci 5 nM, viz obrázek 5.

Při použití RNázového chránění byl v buňkách MOLT—4 po použití 20 mM aplidinu pozorovatelný silný pokles hladin mRNA VEGF, viz obrázek 6.

Dávka aplidinu nesnižuje aktivitu promotoru VEGF přineseného do buněk MOLT-4, viz obrázek 7. Buňky byly infikovány promotorem VEGF (v rozsahu prvních 1000 bází od výchozí polohy, navázané k lucífe rázové mu re portérové mu genu a s kontrolním pl asm i dem nesoucím reportérovy gen polypu renilla). Na buňky se poté působilo různými koncentracemi aplidinu a luciferázová aktivita byla měřena po 24 hodinách a porovnána s aktivitou polypu renilla.

Aplidin neblokuje navázání transkripěních faktorů HIF-I a AP-1 na jejich společné sekvence DNA přítomné v promotoru VEGF, viz obrázek 8. Jaderné extrakty byly 60 minut inkubovány s různými koncentracemi aplidinu a značenými oligonukleotidy. Navázání H1F-1 nebo AP-1 bylo sledováno pomocí genové retardační analýzy.

Aplidín neblokuje navázání transkripčního faktoru HIF-1 na jejich společné sekvence DNA přítomné v promotoru VEGF, viz obrázek 9. Jaderné extrakty získané z buněk, na které se působilo různými koncentracemi aplidinu, byly 60 minut inkubovány se značenými oligonukleotidy. Navázaní HIF-1 bylo sledováno pomocí gelové retardační analýzy.

VEGF (10 ng/ml) přidaný do kultivačního média buněk MOLT—4 kultivovaných v 10% FCS trochu snížil aktivitu nízkých koncentrací aplidinu, zatímco u vysokých koncentrací nemá účinek žádný, viz obrázek 10a, 10b.

Aplidin je také schopen snížit vylučování VEGF v linii IGROV-1 rakoviny vaječníku u lidí, viz obrázek 11.

Aplidin snižuje hladiny mRNA VEGF také linie IGROV-1 rakoviny vaječníku u lidí, viz obrázek 12.

Aplidin nemá vliv na promotorovou aktivitu VEGF měřenou pomocí reportérového genového systému luciferáza/renilla, viz obrázek 13.

Příklad 8 (srovnávací příklad)

Aplidinové zábrany vylučování VEGF a autokrinní smyčky VEGF/VEGF-R1 u linie lidské leukemické buňky

- 12 CZ 302498 B6

Bylo zjištěno, že aplidin indukuje silnou apoptózu lidské leukemické buněčné linie MOLT-4. V téže buněčné linii odhalila analýza technikou microarrays změny v expresi různých genů v brzkých časech po působení. Kromě toho bylo zjištěno, že působením léčiva byla snížena aktivita VEGF-R1 (fitO a toto snížení bylo potvrzeno pomocí analýzy Northern a Western blottin.

Další studie ukázaly, že působení látky na stejný buněčný systém vyústilo do velkého snížení vylučování VEGF v tomto prostředí. Pokles vylučování VEGF byl spojen s poklesem mRNA kódující VEGF v buňkách MOLT-4, na které se působilo apíidinem. Pri pokusu o osvětlení mechanismu, kterým aplidin blokuje vylučování VEGF, bylo zjištěno, že tato látka nemění poločas mRNA VEGF. Podobně pri použití analýzy posunu elektromobility aplidin nezměnil schopio nost dvou transkripčních faktorů HIF-1 a AP-1 vázat se na jejich odpovídající společnou sekvenci v promotoru VEGF a nesnížil transkripci VEGF, když se v krátkodobých pokusech s transkripcí použila struktura promotor VEGF-luciferáza. Snížené vylučování aplidinu bylo spojeno se zvýšenou intracelulámí akumulací VEGF, čímž bylo naznačeno, že tato látka může působit prostřednictvím blokace vylučování VEGF. Souběžně působení na buňky MOLT—1 nízkými kon15 centracemi aplidinu a VEGF částečně rušilo účinek aplidinu, naznačujtch tak, že toto léčivo by částečně mohlo uplatňovat svůj účinek v tomto buněčném systému blokováním autokrinní smyčky VEGF/VEGF-R1.

Příklad 9 (srovnávací příklad) ín vitro bezpečnostní profil aplidinu, přírodního produktu mořského původu s chemoterapeutickým potenciálem

Při použití CellTiter96 (MTS, Promega) in vitro zkoušky na cytotoxicitu vykazuje aplidin nízkou toxicitu pro játra (AMI.12) nebo toxicitu pro srdce (H9 c2 (2-1), LD₅₀ je 1 μΜ). Naopak aplidin je velmi toxický pro kosterní svalstvo (L8) a ledvinové (NRK-52E) buňky (LD50 je 0,1 nM), má střední toxicitu pro myelogenní kmenové buňky (FDC-P1, LD₅₀ je 0,1 μΜ) v těsné shodě s klinickými údaji o toxicitě. Ve skutečnosti je limitní toxicita dávky u lidí dána atrofíi kosterního svalstva.

Aplidin vykazuje neurotoxicitu pri vyšších koncentracích in vitro. Při spojení fluorescenčního barviva pro živé organizmy (ethidiumhomopolymer a kalcein AM, Molecular Probes) s imunocytochemií bylo pozorováno, že přibližně 1 μΜ aplidin je toxický pro mozkové buňky (jak neuro35 ny, tak astrocyty) a motorické (pozitivní cholinacetyltransferáza) neurony v míše, ale ne pro pozitivní senzorické neurony látky P. Motorická neuronová citlivost může napomoci vysvětlení svalové atrofie typu II pozorované (jak bylo předpovězeno) u malých skupin pacientů, kde je koncentrace léčiva vyjádřená jako AUC zvýšena v důsledku sníženého vylučování.

Příklad 10

Klinická studie fáze I a farmakokinetická studie aplidinu, nového didemninu mořského původu, podávaného jako 24hoidnová infuze týdně

Pokus fáze 1 byl proveden pomocí 24 hodin infuze týdně po 3 týdny s následnou přestávkou 1 týden. Bylo léčeno 32 pacientů (medián věku byl 58 let, medián ECOG 1) s pokročilými, dříve léčenými tvrdými nádory. Celkem u nich proběhlo 64 léčebných kůr (medián/pacient = 2(1 až 6)) s 8 dávkovými hladinami - 133 (3 pacienti), 266 (3 pacienti), 532 (3 pacienti), 1000 (3 pa50 cienti), 2000 (3 pacienti), 3000 (3 pacienti), 4500 (4 pacienti) a 3750 gg/m²/týden (10 pacientů). U dvou ze tri hodnocených pacientů se pri DLT 4500 pg/m²/týden projevila reverzibilní ne uroní usku lámí toxicita stupně (G) 4 (biopsie ukázala svalovou atrofíi typu II) a nárůst CK stupně 4 (1 pacient) a přechodné abnormální jatemí testy stupně 3 (1 pacient). Jiné příznaky toxicity zahrnovaly nevolnost stupně 1 až 2 (u většiny pacientů léčených dávkou > 3000 pg/m²/týden), svalo- 13 CZ 302498 B6 vé křeče, zvracení stupně 1 až 2 (s odpovědí na antiemetika) a reakce injekčního místa (velmi běžná a závislá na koncentraci). U všech pacientů byly odebírány vzorky pro farmakokinetickou analýzu pomocí metody LC/MS/MS. Farmakokinetické průběhy jsou lineární a profily vyhovují otevřenému dvoukompartmentovému modelu. Léčivo mělo širokou distribuci ve tkáni (V_ss 611

l), vysokou clearanee (0,47 1/min) a eliminaci st|_/2 rovným 18,8 hodiny. Dosažené hladiny v plazmě > 1 ng/ml (aktivní in vitro) byly získány při dávkách > 3000 pg/rn². Jeden pacient s pokročilým melanomem rezistentním mk DTIC/interťeronu dosáhl jednoznačného klinického zlepšení, které trvalo >30 týdnů. Čtyři další pacienti měli slabší odezvy nebo stabilní stav nemoci >4 měsíce. Závěrem lze shrnout, že aplidin podávaný v DLT podle rozpisu týdenní infuze io vykazoval reverzibílní svalovou toxicitu a abnormální jaterní testy, které byly pozorovány při MTD rovné 4500 pg/nr/týden. Doporučená dávka pro budoucí pokusy 3750 pg/m²/týden po 3 týdny, podávaná prostřednictvím centrálního žilního katetru je vhodná a je spojena s mírnou toxicitou.

Příklad 11

Klinická studie fáze I a farmakokinetická studie aplidinu, nového didemninu mořského původu, podávaného jako 24 hodin infuze týdně

Charakteristiky pacienta

Počet pacientů	35	Typ nádoru
Pohlaví (muži/ženy)	23/12	Kolorektální	12
Medián věku, roky 56,5 (29 až 74)	Ledvinový	6
(rozmezí)
výsledek ECOG (elektrokortikogram)	Hlava a krk	5
0	12	Mel ano m	4
1	18	Žaludeční	2
2	5	Prsu	1
Předchozí radioterapie		Plic	1
Předchozí chemoterapie		Sarkom měkké tkáně	1
Žádná	4	Lymfom	1
1 dávkovači schéma	9	Štítné žlázy	1
2 dávkovači schémata	12	Karcinom neznámého původu	1
3 a více dávkovačích schémat 10
Místa onemocnění
1	14
2	12
>3	9

- 14CZ 302498 B6

Nárůst dávek pro pacienty

Hladina dávky	Dávka (^g/m2/týden)	Počet pacientů	Počet cyklů (rozmezí)
I	133	3	9 (1 až 6)
II	266	3	9 (2 až 5)
III	532	3	10 (2 až 6)
IV	1000	3	7(1 až 4)
v	2000	3	6(2 až2)
VI	3000	3	4(1 až 2)
VH	4500	4	5 (1 až 2)
Vlil	3750	13	21+(1 až 4)
Celkem		35	71 +

Nejhorší toxicity u pacientů

Hladina dávky	I	Π	III	IV	V	VI	VII (MTD)	VIII (RD)
Počet pacientů	3	3	3	3	3	3	4	13
Nevolnost stupně 2					1			2
Nevolnost stupně 3						1
Tělesná slabost stupně 2			1			1	1	3
Tělesná slabost stupně 3						1
Reakce injekčního místa stupně 2		1		1	1	1	1	3
Myozitida stupně 3							l
Zvýšení CPK stupně 4							1
Abnormální jaterní testy stupně 3							1	2

-15CZ 302498 B6

Abnormální jaterní testy stupně 4								1
Hypersenzitivita stupně 3								l

Protinádorový účinek

Pacient 008 - (Madrid). U vysoce předléčeného neměřitelného metastázujícího melanomu bylo pozorováno klinické zlepšení a smrštění nádoru. Biopsie jednoho metastázujícího poškozeného místa neodhalila reziduální nádorovou tkáň. Pacient 032 - (Madrid) Renální karcinom - 20% smrštění nádoru Pacient 034 - (Madrid) Medulární karcinom štítné žlázy. Klinické zlepšení a sklerodermie u plicní lymťangoitidy. Snížení u ACE markéru.

i o Farmakok i netická měřen í

Koncentrace aplidinu v plazmě byla stanovena kapalinovou chromatografií ve spojení s tandemovou hmotnostní spektroskopií s mezí stanovíteInosti 0,25 ng/ml a širokým lineárním rozsahem do 16,00 ng/ml.

Celkem bylo odebráno 15 vzorků do 24 hodin po ukončení infuze.

Farmakokinetické výsledky byly lineární podle dávky ?o Vysoký medián clearance (kvartily) 0,47 (0,40 až 0,56) l/min) a vysoká variabilita mezi pacienty (variační koeficient pro clearance byl 45 %) Střední až dlouhý poločas (t|.₂) (medián (kvartily) 18,8 (15,3 až 25,4) hodin) Široká distribuce se supraťyziologickou mírou rozšíření (Vss) (medián (kvartily 611 (434 až 733) 1).

Akumulace v krevních buňkách (2 až 8násobná ve srovnání s plazmou)

Profily vyhovují otevřenému dvoukompartmentovému modelu

Obrázek 14 ukazuje vztah dávka versus AUC.

Závěry

DLT aplidinu podávaného podle tohoto rozpisu byly reverzibilní svalová toxicita a abnormální jaterní testy pozorované u MTD 4500 gg/m²/týden po 3 týdny.

Doporučená dávka pro budoucí pokusy 3750 gg/m²/týden po 3 týdny je vhodná a je spojena s mírnou toxicitou (hlavně mírnou tělesnou slabostí).

Běžná byla flebitida na paži s infuzi, závisela na koncentraci a bylo možné sejí vyhnout podává40 ním prostřednictvím centrálního žilního katétru.

Nebyla pozorována žádná hematologická toxicita.

Farmakok i netiká je charakterizována dávkovou linearitou, relativně prodlouženým pobytem látky v těle a širokou distribucí. Potenciálně účinných hladin v plazmě bylo dosaženo od 2000 gg/m².

V současnosti probíhá další studie fáze I zkoumající 3 hodiny nitrožilní infuze podávané každý druhý týden. Počáteční dávka je 3000 gg/m² každé 2 týdny.

- 16CZ 302498 B6

Příklad 12

Studie fáze I aplidinu podávaného jako 1 hodina nitrožilní infuze týdně pacientům s pokročilými tvrdými nádory a lymfomem

Do úvahy byli vzati dospělí pacienti s pokročilým onemocněním, PS<3, a vhodné orgánové funkce, pacienti dostávali aplidin týden po 3 týdny/každé 4 týdny. Studováno bylo 24 pacientů s tvrdými nádory - medián (m) věku byl 55 let, medián ECOG = l, 15/24 pacientů bylo léčeno >2 léčebnými cykly. Bylo zhodnoceno sedm úrovní dávky (DL) od 133 pg/m²/týden do 2700 pg/m²/týden, u 102 infuzí byla vyhodnocena toxicita (tox). Nebyla zaznamenána žádná hematologická toxicita, zvracení vyžadující profylaxi bylo pozorováno od 800 μg/m7týden. U dávky 2700 μg/m²/týden (4 pacienti) měl 1 pacient hyperbilirubinemii stupně 3, která byla považována za limitující dávku, a proto úroveň dávky 2700 μg/m²/týden je hraniční. Všichni pacienti byli vzorkováni pro farmakokinetickou analýzu (LC-ESI-MS/MS), kinetika je lineární, medián Vs = 308 1/m², medián clearance je vysoký a roven 0,60 l/min a medián poločasu eliminace = 14,2 h. Hladiny v plazmě > 1 ng/ml 24 hodin po infuzi jsou dosažitelné od 1800 pg/m²/týden. První známky aktivity byly zaznamenány u rakoviny žaludku (1 pacient pří 1200 μg/m²). Pacient s pokročilou renální rakovinou rezistentní vůči VBL-IFN měl průběžnou objektivní odezvu (PR plicních metastáz a SD u peritoneálního onemocnění) při úrovní dávky 2700 pg/m²/týden. Aplidin je klinicky vhodný při farmakologicky vhodných úrovních dávky.

Příklad 13

Studie fáze I a farmakokinetická studie aplidinu podávaného pacientům s tvrdým nádorem a lymfomem jako 24 hodin nepřetržité infuze každý druhý týden (q2w)

Aplidin se podával 35 pacientům s tvrdým nádorem/nehodgkinským lymfomem jako 24 hodin infuze/q2w (medián věku = 51/ECOG = 1), a to s tvrdým nádorem (32 pacientů) nebo nehodgkinským lymfomem (3 pacienti). 23 z 35 pacientů bylo předem vystaveno > 3 předchozím kúrám chemoterapie. Bylo podáno devět dávkových hladin (200 až 7000 μg/m²/týden/q2w) a 65 cyklů (120 infuzí). Nebyla zaznamenána žádná hematologická toxicita. Toxicita sestávala z tělesné slabosti stupně 2 u 9 pacientů a stupně 3 u 2 pacientů a zvracení stupně 2 u 12 pacientů a stupně 3 u 1 pacienta. Nevol nost/zvracení stupně 3 (> 5000 μg/m²) byla účinně léčena a poté jí bylo předcházeno režimy 4HT3. Pro srdce nebyla zaznamenána žádná toxicita. Při dávce 5000 pg/rrf/týden/q2w měli 2 pacienti přechodné svalové křeče s reverzibilními zvýšeními CPK-MM stupně 3. Mezi 9 pacienty léčenými dávkou 6000 μg/m²/týden zaznamenali 3 pacienti po třetí injekci aplidinu nárůst CPK-ΜΜ a aldolázy. Zvýšení CPK byly stupně 1 až 2 a u 2 pacientů byly nesymptomatické, ale u jednoho pacienta bylo zaznamenáno zvýšení CPK stupně 3 se svalovou bolestí stupně 3 a ztrátou síly svalu (DLT). Toto bylo reverzibilní a bez následků. Biopsie svalu neodhalila významnou nekrózu myocytů. Pod strukturní elektronová mikroskopie neindikovala žádné morfologické změny mitochondrií, ale ztrátu v síle myosinových vláken. Dávku 7000 pg/m²/q2w dostali 4 pacienti. Farmakokinetická analýza (LC-ESI/MS/MS) ukázala, že nárůst AUC je lineární s velkou Vss = 539 1/m², vysokou clearance (332 ml/min/m²) a dlouhým terminálním poločasem (15 až 35 hodin). Koncentrace v plazmě po 24 hodinách po ukončení infuze s dávkami > 3000 pg/m²/q2w jsou srovnatelné s účinnými koncentracemi in vitro (< 1 ng/ml). Účinek byl pozorován u nehodgkinského lymfomu (1/3 pacientů), molekulové rakoviny štítné žlázy (2/2 pacientů), renální rakoviny (1/5 pacientů) a neuroendokrinní rakoviny (1 pacient). V současnosti se vyhodnocují mechanistická hypotéza a preventivní strategie proti svalové toxicitě.

- 17CZ 302498 B6

Příklad 14 (srovnávací příklad)

Zkouška technikou inicroarray

K těmto pokusům byla použita lidská leukemická buněčná linie MOLT-4, přičemž na buňky MOL ÍM se působilo 1 hodinu 20 nM aplidinu. Veškerá RNA byla extrahována na konci působení a 6 hodin a 24 hodin po regeneraci v prostředí bez léčiva.

pg absolutní RNA bylo přepsáno na cDNA v přítomnosti ³²P-dATP. Stejná množství radioio aktivních sond byla hybridizována na membráně Atlas Human Cancer Microarrays (Clontech).

Po promytí byl filtr vyvolán a výsledky byly zanalyzovány pomocí programu Atlas Image. Do úvahy byl vzat pouze ten rozdíl v expresi genu, který byl větší než dvojnásobný, a to mezi buňkami, na které se působilo a nepůsobilo. Byly provedeny RT-PCR a Northern blotting analýzy, aby se potvrdily změny v expresi genu nalezené metodou microarrays.

Výsledky

Působení aplidinem způsobilo významné změny v expresi genu již 1 hodinu po působení. Po 6 a 24 hodinách regenerace v prostředí bez léčiva byla pozorována exprese zvýšeného počtu genů.

Na konci působení byly nejvýznamnější změny v expresi pozorovány u brzy reagujícího genu ETR, a to zvýšení exprese a u genu VEGF-Rl/flt-1, kde byla tímto způsobem exprese zmenšena.

Hladiny ETR se vrátily na normální úroveň po 6 hodinách a 24 hodinách, zatímco hladiny fit—1 se po 6 a 24 hodinách dále snížily.

Aplidin indukoval také vzrůst hladin B-RAF a Fms, který byl jasně pozorovatelný 6 hodin po regeneraci v prostředí bez léčiva.

5o Změny pozorované v těchto genech byly potvrzeny bud’ RT-PCR, nebo metodou Northern blotting.

Z analýzy technikou microarrays byly pozorovatelné změny v expresi genu (ještě nepotvrzeno pomocí RT-PCR) i u dalších genů jako PLK-1.

Příklad 15

Studie fáze I aplidinu, podávaného jako 1 hodina nitrožilní infuze týdně pacientům s pokročilými tvrdými nádory a nehodgkinským lymfomem

Podávání léčiva

Aplidin byl podáván jako 1 hodina infuze týdně po 3 týdny každé 4 týdny

- 18CZ 302498 B6

Charakteristiky pacientů

Počet pacientů	30	Typ nádoru
Medián věku, roky (rozmezí)	53,5 (36 až 75)	Kolorektální	8
Stav provedeného ECOG		Plicní
0	2	v Žaludeční	4
1	21	Renální	3
2	5	Hlavy a krku	3
Předcházející radioterapie	10	Melanom	2
Předcházející chemoterapie (počet režimů)	Vaječníků	2
1	10	Žlučových cest
2	10	Jícnu	1
>3	8	Slinivky břišní	1

Soubor pacientů a zvyšování dávky

Hladina dávky	Dávka (pg/m2/týden)	Počet pacientů	Počet cyklů (rozmezí)
I	133	3	5(1 až 2)
II	266	3	5(1 až 2)
III	532	3	5 (1 až 2)
IV	800	3	6 (2 až 2)
v	1200	4	7(1 až 2)
VI	1800	4	7(1 až 2)
VII	2700	8	12(1 až 2+)
VIII	3600	2	3(1 až 2+)
Celkem

* definice 1 cyklu = 3 násiedné infuze ve 3 týdnech s jedním týdnem přestávky

- 19CZ 302498 B6

Nejhorší toxicity pro jednotlivé pacienty

Úroveň dávky (týdně x 3)	133	26 6	53 2	800	1200	1800	2700	3600
Počet pacientů	3	3	3	3	4	4	8	2
Nevolnost/zvracení <32	-	-	-	3	-	, 3	2	-
Reakce místa vpíchu G2	-	1	-	1	1	1	3	-
Tělesná slabost G2 (G3)	-		1	l(D	3	2	1(1)	-
Myalgie G2 (G3)	-	-	-	-	(1)	-	-
Zvýšení CPK G1	-	-	*	f		-	-	X*
Abnormální jaterní testy G2 (G3)	1		(1)	í		1	1(4/11
Bilirubin G3	-	-	-	-	-	-	1(1)^	-
Alkalická fosfatáza G2 (G3)		(i)				1
Vysoký tlak G1 (G3)	(1)	-	-	1	-	-	-	-

G = stupeň,jeden pacient s hepatitidou C, dva případy reverzibilní ke dni 8 a 1 DLT,⁽²⁾ DLT ? Charakterizace udané limitní toxicity dávky

Pacient 28 — (Edinburgh) s adenokarcinomem jícnu (žádné jatemí metastázy) léčený dávkou 2700 pg/m² týdně měl zpožděnou regeneraci nárůstu jatemích enzymů (AST G3, bilirubin G3, ALP G3) znemožňující týdenní podávání dalších dávek.

Známky účinku

Pacient 16 (Edinburg) s žaludečním adenokarcinomem primárně rezistentním vůči FAM. Malé zlepšení hlavních částí mízních uzlin kolem spodní křivky žaludku, osy břišní dutiny a pánve s dávkou aplidinu 1200 pg/m² týdně (3600 pg/m²).

Pacient 23 (Barcelona) s ledvinovým nádorem a plicními uzly jako hlavním místem nemoci, primárně rezistentní vůči VBL + alFN a lipozomálnímu doxorubicinu. Částečná remise plicních uzlů a klinické zlepšení s vymizením dusnosti po 2 infuzích aplidinu s 2700 pg/m² týdně (8100 pg/m²).

Pacient 29 (Barcelona) s rakovinou ledvin. Klinické zlepšení při hodnocení supraklavikulámí adepopatie po 3 infuzích. Probíhající hodnocení je v druhém cyklu.

Farmakokinetické údaje

Farmakokinetika je lineární do současné dávkové hladiny 2700 pg/m². Významná variabilita mezi pacienty - variační koeficient clearance je 33 %. Relativně vysoká plazmová clearance s mediánem (kvartily) 329 (288 až 407 ml/min/m²).

-20CZ 302498 B6

Střední t_!/2 s mediánem (kvartily) 15,8 (13,3 až 19,5) hodin.

Rozsáhlá distribuce s mediánem (kvartily) Vss, 345 (220 až 398) I/m².

Předběžná kompartmentová analýza ukázala, že profily nejlépe vyhovují trojkompartmentovému modelu prvého řádu s velmi rychlou počáteční fází (medián poločasu 0,04 h) následovanou střední fází (medián poločasu 1,4 h) a delší terminální fází (medián poločasu 20,7 h).

Závěry

Tato probíhající studie naznačuje, že aplidin podávaný jako 1 hodina infuze týdně s jedním týdnem přestávky je klinicky vhodná do dávky 3600 pg/m² každý týden. Toxicita ke kostní dřeni nebyla zaznamenána. Zvracení bylo zvládnutelné proťylaktickými antiemetiky. Svalová toxicita sestávala ze svalové slabosti a zvýšení kreatinkinázy u jednoho pacienta léčeného dávkou 3600 pg/m*?TJ několika pacientů léčených nejvyšší studovanou úrovní dávky byla zaznamenána jatemí toxicita, i když DLT byla u 1 pacienta. Farmakokinetická informace naznačují, že potenciálně terapeutické úrovně jsou v plazmě dosažitelné u pacientů léčených dávkou od 1200 pg/m². V současnosti je studována vhodnost dávky 3600 pg/m² každý týden (úroveň dávky VIII).

Příklad 16

Studium fáze I a farmakokinetické studium aplidinu, podávaného jako 24 hodin nepřetržitá infuze každý druhý týden pacientům s tvrdými nádory a nehodgkinským lymfomem Charakteristiky pacientů

Počet pacientů 43 Typ nádoru

Medián věku, roky (rozmezí)	52 (18 až 71)	Plicní	6
Stav provedeného ECOG		Kolorektální
0	19	Ledvinový	5
1	21	Prsu	4
2	2	Slinivky břišní	4
Předcházející radioterapie	27	Lymfcm	3
Předcházející chemoterapie (počet režimů)	Vaječníků	2
1	7	Štítné žlázy	3
2	5	Kostní	1
>3	29	Melanom	1
		Prostaty	1
		Dělohy	1
		Mezoteliální	i
		Žaludku	1
		Jiný	2

-21 CZ 302498 B6

Soubor pacientů a zvyšování dávky

Hladina dávky	Dávka (Ug.nÚ'2 týdny)	Počet pacientů	Počet cyklů (rozmezí)
1	200	3	5 (I až 3)
II	400	3	6 (2 až 2)
III	800	_)	9 (2 až 4)
IV ;	1600	6	11 (1 až 2)
v	3200	3	5 (1 až 2)
VI	4000	3	8 (2 až 4)
VII	5000	3	6 (2 až 2)
VIII	6000	12	26(1 až 6+)
IX	7000	7	12(1 až 4+)
Celkem

* definice cyklu - 2 iníuze po dvou týdnech

Nejhorší toxicity’pro jednotlivé pacienty

Úroveň dávky	200	400	800	1600	3200	4000	5000	6000	7000
Počet pacientů	3	3	3	6	3	3	3	12	7
Ne volno st/z vracen ÍG2	2	1		4	(1)	2	1	2	1
Krevní návaly G1	-	-	1	-	1	1	-	-	1
Tělesná slabost G2 (G3)	i	2 i		2(1)	1	1	(1)	6	2
Svalové křeče G1+G2			2	1	2	2	2	1
Svalová bolest G1	-	-	-	-	(1)	2	1	1(2)	1

. 9? .

(G2)						1 1
Svalová slabost Gl (G2)							1	KD
Zvýšení CPK G2 (G3) [G4]							(1) [1]	1 (1)	1
Abnormální jatemí testy G2 (G3)	1			(1)			1		1
Hypertenze G2	-	1	-	-	-	-	-	-	-
Neutrofenie G4	-	-	-	-	-	-	-	-	1
Bolest při centrálním katetru G2						2

G = stupeň

Charakterizace svalové toxicity (DLT)

Pacient 27 - mužský pacient s medulámím karcinomem štítné žlázy léčený dávkou 6000 pg/m² týdně měl symptomy CPK stupně 3 se svalovou bolestí stupně 2. Toxické příznaky vymizely do tří týdnu po přerušení léčení.

io Tři pacienti (5000 a 6000 pg/m²) měli menší zvýšení CPK (> stupně 2) sestávající z CPK MM (sval) nárůstu s nevýznamným nárůstem CPK MB (srdce). Bylo pozorováno paralelní zvýšení aldolázové hladiny. Při použití kamitinových doplňků jako protektorů kosterních svalů byla zaznamenána zlepšení. U dvou pacientů byly provedeny svalové biopsie, E/M - částečné vymizení silných vláken myozinu.

Farmakokinetické údaje

Aplidin má dávkově lineární farmakokinetický profil (s omezeními danými malou velikostí vzorku)

Relativně vysoká plazmová clearance s hodnotou mediánu (kvartilů) 252 (192 až 415 ml/min/m²) Vysoká variabilita clearance mezi pacienty (variační koeficient clearance 62 %)

Střední až dlouhý 11/2 s hodnotou mediánu (kvartilů) 23,8 (15,7 až 35,0 hodin)

Široká distribuce Vss s mediánem (kvartily) 413 (274 až 638 l/m²)

Předběžná kompartmentová analýza ukázala, že plazmové profily nejlépe vyhovují dvoukompartmentovému modelu prvního řádu s rychlou počáteční (medián poločasu 0,64 hodiny) a delší terminální fází (medián poločasu 25,8 hodiny).

Vztah myotoxicity aplidinu a farmakokinetiky

Svalová toxicita se objevila pouze u vysokých dávek a expozicích po 24 hodinách infuze.

Maximální hodnoty koncentrace po 1 hodině infuze jsou již vyšší než ty po 24 hodinách infuze. Proto může být vyloučen vztah k maximální koncentraci.

-23 CZ 302498 Bó

Hodnoty AUC u pacientů s myotoxicitou jsou vysoké, ale ne maximální.

Myotoxicita se týkala pacientů s vysokými přetrvávajícími koncentracemi aplidinu. U 3 pacientů sjasnou svalovou toxicitou byl t)/₂ větší než 44 hodin ve srovnání s mediánem t]/₂ = 25,8 hodiny po 24 hodinách infuze.

Obrázky 15a a 15h ukazují účinek u medulárního karcinomu štítné žlázy, a to hladiny CEA. Závěry

Léčivo indukovalo svalové změny (pravděpodobně pri dávce s limitní toxicitou), zaznamenané od dávkové hladiny III dále (1800 až 5000 pg/m³). Dávka s limitní toxicitou je 6000 pg/m³ (1/9 pacientů). Protinádorový účinek byl také zaznamenán u pacientů s nehodgkinským lymfomem a renálním karcinomem.

V současnosti probíhá studie na vhodnost dávek 6000 až 7000 pg/m³ každý druhý týden s použitím karnitinových doplňků jako protektorů kosterního svalstva.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití aplidinu pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny u pacienta, kde aplidin je ve formě pro intravenózní infuzní podání

   a) 24 hodinové infuze jednou za týden po tri týdny, následované přestávkou 1 týdne, pri jednotkové dávce do 3750 pg/m²/týden

   b) 24 hodinové infuze jednou za čtrnáct dnů, při jednotkové dávce do 7000 pg/m²/2 týdny, nebo

   c) 1 hodinové infuze jednou týdně po tři týdny každé čtyři týdny, při jednotkové dávce do 3600 pg/m²/týden.
2. 2. Použití aplidinu podle nároku 1, kde aplidin je ve formě pro intravenózní infuzní podání 24 hodinové infuze jednou za týden po tři týdny, následované přestávkou 1 týdne, při jednotkové dávce do 3750 μg/m²/týden.
3. 3. Použití aplidinu podle nároku 1, kde aplidin je ve formě pro intravenózní infuzní podání 24 hodinové infuze jednou za čtrnáct dnů, při jednotkové dávce do 7000 gg/m²/2 týdny.
4. 4. Použití aplidinu podle nároku 3, kde aplidin je ve formě pro intravenózní infuzní podání 24 hodinové infuze jednou za čtrnáct dnů, pri jednotkové dávce 5000 gg/m²/2 týdny.
5. 5. Použití aplidinu podle nároku 1, kde aplidin je ve formě pro intravenózní infuzní podání 1 hodinové infuze jednou týdně po tři týdny každé Čtyři týdny, při jednotkové dávce do 3600 pg/m²/týden.
6. 6. Použití aplidinu podle nároku 5, kde aplidin je ve formě pro intravenózní infuzní podání 1 hodinové infuze jednou týdně po tři týdny každé čtyři týdny, při jednotkové dávce do 2700 pg/m²/týden.

   -24CZ 302498 B6
7. 7. Použití aplidinu podle některého z předcházejících nároků 1 až 6, kde farmaceutický přípravek obsahující aplidin je určen jako součást kombinované terapie.

   5
8. 8. Použití aplidinu podle některého z předcházejících nároků 7, kde farmaceutický přípravek obsahující aplidin je určen pro podání ve spojení s protektorem kosterního svalstva.
9. 9. Použití aplidinu podle nároku 8, kde protektorem kosterního svalstva je kamitin.

   io 10. Použití aplidinu podle některého z předcházejících nároků, kde pacient/pacientka již podstoupila standardní léčbu svého rakovinového onemocnění a nádor neustupuje.

   13 výkresů