ES2272462T3 - Analogos de tamadarina y didemnina y procedimiento de fabricacion y uso. - Google Patents

Analogos de tamadarina y didemnina y procedimiento de fabricacion y uso. Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende un análogo de tamandarina que tiene la estructura en la que: i) R1 se selecciona del grupo constituido por -H, -(terc-butiloxicarbonilo), - leucina, -(N-metil)leucina, -(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo), -(N-metil)leucina-prolina, -(N-metil)leucina-prolina-lactato, -(N-metil)leucina-prolina-piruvato, -(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo), -(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato, -(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato, -(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato, -(N-metil)leucina-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato, -(N-metil)leucina-desoxo-prolina. -(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato, -(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato, -(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo). -(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato, -(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato, -(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato, -(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato, -(N-metil)leucina-deshidro-prolina, -(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato, -(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato, -(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo), -(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato, -(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato, -(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y -(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina- piroglutamato. ii) o (a) R3 se selecciona del grupo constituido por -CH3 y -H; y R2 se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura o (b) R2 y R3 juntos son un sustituyente, que tiene la estructura iii) cada uno de R5, R6, R7, R8 y R9, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH3, - CO(C6H5), -Br, -I, -F, -Cl, -CH3 y -C2H5; iv) R4 es una cadena lateral de isoleucina; v) X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-; vi) Y se selecciona del grupo constituido por -H y un grupo protector de hidroxilo; vii) R10 se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina y una cadena lateral de lisina; y viii) la molécula no es tamandarina A.

Description

Análogos de tamadarina y didemnina y procedimientos de fabricación y uso.
Antecedentes de la invención
Didemnina B es un depsipéptido macrocíclico aislado a partir de una especie de tunicado marino. Didemnina B muestra actividades antivirales, inmunosupresoras y antitumorales potentes in vitro e in vivo y fue el primer producto natural marino que se sometió a pruebas clínicas contra los cánceres humanos (Li y cols., 1992, Studies in Natural Products Chemistry, 10:241-302; Sakai y cols., 1996, J. Med. Chem. 39:2819-2834; Wipf, 1995, Chem. Rev. 95:2115-2134). Didemnina B es una didemnina, una familia de compuestos que de forma potente inhiben la síntesis de proteínas y el desarrollo del ciclo celular e induce una apoptosis más rápida que ningún otro producto natural que haya sido aislado hasta la fecha (Grubb y cols. 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:1130-1136; Johnson y cols., 1996, FEBS Lett. 383:1-5; Johnson y cols., 1999. Inmunol. Cell Biol. 77:242-248; Johnson y cols., 1999, J. Cell. Biochem. 72:269-278). Otros miembros de esta familia de compuestos, que incluyen didemnina M y deshidrodidemnina B, presentan efectos citotóxicos y citoestáticos también.
Tamandarina A (también denominada {(2S)Hiv^{2}}didemnina B) es un congénere de la didemnina natural que se ha aislado recientemente a partir de un tunicado marino. Tamandarina A presenta actividad biológica que es análoga a las actividades que muestra didemnina B. Por ejemplo, tamandarina A es un inhibidor potente de la síntesis de proteínas, del crecimiento celular y de la oncogénesis. Tamandarina A presenta una mayor actividad in vitro contra el carcinoma pancreático que didemnina B (Liang y cols., 1999, Org. Lett. 1:1319-1322). Una limitación significativa del uso de tamandarina A, bien para investigaciones o para aplicaciones prácticas, es el limitado suministro de tamandarina A disponible a partir de fuentes naturales y la dificultad y el coste de aislar este producto. Existe una necesidad de un procedimiento de sintetizar tamandarina A y otros análogos de didemnina (que incluyen análogos de deshidrodidemnina).
A pesar de la potencia de didemnina B en los estudios aislados, su eficacia clínica se ve obstaculizada por los efectos secundarios asociados a las dosis terapéuticas del compuesto. Al igual que con muchos agentes antiproliferativos, didemnina B muestra un intervalo terapéutico relativamente estrecho. Aunque didemnina M y deshidrodidemnina B muestran un potencial terapéutico mejorado, comparado con didemnina B, todavía existe una necesidad de agentes antiproliferativos que presenten una toxicidad menor a dosis terapéuticas (es decir, análogos de didemnina que tengan un índice terapéutico superior).
La presente invención satisface las necesidades descritas anteriormente.
Breve sumario de la invención
La invención se refiere a análogos de tamandarina y didemnina que tienen un resto desoxoprolina o un resto deshidroprolina en su estructura. En una realización, la invención se refiere a una composición que comprende un análogo de tamandarina que tiene la estructura de la fórmula I
1
En la fórmula I, R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-H,
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato.
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato.
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato, y
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato.
R^{2} y R^{3} en la fórmula I, pueden ser restos separados o, juntos, pueden ser un resto único. Cuando R^{2} y R^{3} son restos separados, R^{3} es o un grupo metilo o un radical hidruro y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura de la fórmula III
2
Cuando R^{2} y R^{3}, juntos, son un sustituyente, este sustituyente tiene la estructura de la fórmula IV.
3
En las formulas III y IV, cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9} se selecciona independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -C_{2}H_{5};
R^{4} en la fórmula l es una cadena lateral de isoleucina. También, en la fórmula I, X es o bien -O- o bien -(NH)-, Y es o un radical hidruro o un grupo protector de hidroxilo y R^{10} es o una cadena lateral de leucina o una cadena lateral de lisina. El análogo de didemnina es un análogo distinto de tamandarina A (es decir, {(2S)Hiv^{2}}didemnina B). En una realización, cada resto prolina o lactato que está presente en R^{1} muestra estereoquímica (S). En otra, cada resto capaz de presentar estereoquímica en R^{1} está presente en sus forma natural (es decir, la forma (S) para los restos aminoacídicos y lactato. Se cree que ciclopentanoato se presenta de forma natural con una estereoquímica (S).
En otra realización, la invención se refiere a una composición que comprende un análogo de didemnina que tiene la estructura de la fórmula XXI.
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4 
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En la fórmula XXI, cada uno de R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8}, R^{9} y R^{10} tiene el mismo significado que en la fórmula I.
En clases preferidas de análogos tamandarina y didemnina con desoxo-prolina que tienen la fórmula de I y XXI, respectivamente, R^{2} tiene la estructura de la fórmula III, R^{3} es metilo, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} es un radical hidruro, R^{7} es metoxi, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es un radical hidruro. Ejemplos de análogos de tamandarina y didemnina que se incluyen en la invención son los compuestos 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 133, 134, 136, 137, 139, 141, 142, 143, 201, 202, 203 y 204, que se muestran en las Figuras.
En una realización, el análogo de tamandarina o didemnina tiene un sustituyente fotorreactivo, tal como un resto R^{2} que tiene la estructura
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El sustituyente fotorreactivo puede estar unido directamente al análogo, o puede unirse mediante un enlazador que tiene una cadena que comprende de 1 a aproximadamente 13 o más átomos de carbono y, opcionalmente que tiene restos amina o amida secundaria en la cadena.
En otra realización, el análogo de tamandarina o didemnina tiene un fluoróforo unido, tal como un análogo en el que un fluoróforo está unido al resto amino omega de una cadena lateral de lisina en R^{2} o en R^{10}. Un ejemplo de la estructura de uno de tales análogos de didemnina fluorescentes se muestra en la Figura 29. De forma alternativa, el análogo de didemnina puede estar unido (por ejemplo, de forma covalente) a un soporte. En la mayoría de las realizaciones, Y en las formulas I y XXI es preferiblemente un radical hidruro.
La invención incluye una realización de un análogo de tamandarina o didemnina que puede activarse (o cuya actividad puede potenciarse) mediante escisión enzimática de un resto unido al análogo. Por ejemplo, la invención incluye composiciones que comprenden un análogo que tiene una estructura que se selecciona del grupo constituido por las fórmulas (a)-(d), siguientes
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7 
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8
y
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En las fórmulas (a)-(d), R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{10}, X, e Y tienen las mismas identidades que se describen anteriormente para la fórmula I. R^{13} es un resto enzimáticamente escindible que puede escindirse mediante una enzima, tal como una que se selecciona del grupo constituido por una carboxipeptidasa, una \beta-lactamasa, una \beta-galactosidasa, una penicilina V-amidasa, una citosina desaminasa, una nitrorreductasa, una fosfatasa alcalina, una \beta-glucuronidasa y un anticuerpo catalítico. A modo de ejemplo, R^{13} puede tener la estructura de cualquiera de las fórmulas V y VI
10 
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11
Ejemplos de tales análogos incluyen el compuesto 131 y el compuesto 132.
La invención también se refiere a composiciones que comprenden un fragmento de didemnina que tiene la estructura de la fórmula VII
12
En la fórmula VII, Y es o un radical hidruro o un grupo protector de hidroxilo, X es o bien -O- o bien -(NH)-, R^{4} es o una cadena lateral de isoleucina o una cadena lateral de valina y APG es un grupo protector de amina. R^{11} puede ser cualquiera de -OH, NH_{2},-O(alilo), -O(pentafluorofenilo) y un sustituyente que tiene la estructura de la fórmula VIII
13
En la fórmula VIII, R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{10} tienen las mismas identidades que se describen anteriormente para la fórmula I y R^{12} puede ser o un radical hidruro o un resto -2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo.
Los análogos de tamandarina y didemnina que se describen en la presente memoria pueden formularse, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, formando preparaciones farmacéuticas. Estas preparaciones pueden administrarse a una célula de mamífero (por ejemplo un ser humano) (es decir, o in vitro o in vivo) para inhibir la síntesis de proteínas, inhibir el crecimiento, inhibir la proliferación, inhibir la oncogénesis, o potenciar la apoptosis en la célula o en uno o más tejidos del mamífero.
La invención incluye además un procedimiento de preparar un fragmento de didemnina. Este procedimiento comprende acoplar un primer reactivo que tiene la estructura
14
y un segundo reactivo que tiene la estructura
15
proporcionando un fragmento de didemnina que tiene la estructura
16
En esta estructura, X es o bien -O- o bien -(NH)-, APG es un grupo protector de amina; Y es un grupo protector de hidroxilo (por ejemplo, un grupo triisopropilsililo) y R^{4} puede ser o una cadena lateral de isoleucina o una cadena lateral de valina. El primer fragmento de didemnina puede hidrolizarse proporcionando un segundo fragmento de didemnina que tiene la estructura
17
Puede añadirse un activador (ACT) al resto carbonilo del segundo fragmento de didemnina proporcionando un tercer fragmento de didemnina que tiene la estructura
18
El tercer fragmento de didemnina puede acoplarse a un tercer reactivo que tiene la estructura
19
proporcionando un fragmento de didemnina que tiene la estructura
20
En esta estructura, R^{2} y R^{3} tienen las identidades que se describen anteriormente para la fórmula I, APG es un grupo protector de amina, SEM es un grupo 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo y R^{10} es o una cadena lateral de leucina o una cadena lateral de lisina.
La invención también se refiere a un procedimiento de preparar un análogo de didemnina a partir del cuarto fragmento de didemnina. Este procedimiento comprende eliminar los restos SEM y CBZ del cuarto fragmento de didemnina y ciclar el fragmento proporcionando un primer análogo de didemnina que tiene la siguiente estructura.
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El grupo APG (que, por ejemplo, puede ser un resto carbobenciloxi o un resto terc-butiloxicarbonilo) puede eliminarse del primer análogo de didemnina proporcionando un segundo análogo de didemnina que tiene la estructura
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Este segundo análogo de didemnina puede acoplarse a un cuarto reactivo que tiene la estructura
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Proporcionando un tercer análogo de didemnina que tiene la estructura
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24 
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En estas estructuras, R^{14} puede ser uno de
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-4-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato, y
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato, o puede ser uno de estos restos acoplado a un resto escindible enzimáticamente que puede escindirse mediante una enzima tal como una de una carboxipeptidasa, una \beta-lactamasa, una \beta-galactosidasa, una penicilina V-amidasa, una citosina desaminasa, una nitrorreductasa, una fosfatasa alcalina, una \beta-glucuronidasa y un anticuerpo catalítico. Si Y es un grupo protector de hidroxilo, entonces puede eliminarse del tercer análogo de didemnina (o antes o después de la adición de R^{14}) proporcionando un cuarto análogo de didemnina que tiene la estructura
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La invención además se refiere a un procedimiento de preparar análogos de tamandarina y didemnina que contienen desoxo-prolina. Estos procedimientos emplean procedimientos conocidos para preparar análogos de tamandarina y didemnina y se modifican para incorporar un resto desoxoprolina en lugar del resto prolina del análogo.
La invención de forma todavía adicional se refiere a un procedimiento de preparar análogos de tamandarina o didemnina que contienen deshidro-prolina. Estos procedimientos emplean procedimientos conocidos para preparar análogos de tamandarina o didemnina y se modifican para incorporar un resto deshidro-prolina en lugar de un resto prolina del análogo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1, que comprende las Figuras 1A y 1B, representa la estructura de tamandarina A (es decir, {(2S)Hiv^{2}}didemnina B). La Figura 1A es la estructura de (-) tamandarina A (compuesto 101). La Figura 1B es la estructura de un diastereoisómero (compuesto 102) de (-) tamandarina A. El centro quiral en el que difieren estas dos moléculas se indica con una flecha.
La Figura 2, que comprende las Figuras 2A y 2B, representa la estructura de tamandarina M (es decir, {(2S)Hiv^{2}}didemnina M). La Figura 2A es la estructura de (-) didemnina M (compuesto 103). La Figura 2B es la estructura de un diastereoisómero (compuesto 104) de (-) tamandarina M. El centro quiral en el que difieren estas dos moléculas se indica con una flecha.
La Figura 3, que comprende las Figuras 3A y 3B, representa la estructura de didemnina B (es decir, {(2S)Hiv^{2}}didemnina B). La Figura 3A es la estructura de (-) tamandarina B (compuesto 105). La Figura 3B es la estructura de un diastereoisómero (compuesto 106) de (-) tamandarina B. El centro quiral en el que difieren estas dos moléculas se indica con una flecha.
La Figura 4, que comprende las Figuras 4A, 4B, 4C y 4D, representa la estructura de diversos análogos de didemnina de tipo tamandarina fluorescentes. La Figura 4A es la estructura del compuesto 107. La Figura 4B es la estructura del compuesto 108. El centro quiral en el que difieren los compuestos 107 y 108 se indica con una flecha. La Figura 4C es la estructura del compuesto 109. La Figura 4D es la estructura del compuesto 110. El centro quiral en el que difieren los compuestos 109 y 110 se indica con una flecha.
La Figura 5, que comprende las Figuras 5A y 5B, representa una clase de análogos de didemnina de tipo tamandarina inmovilizables. La Figura 5A es la estructura de un análogo de didemnina de la fórmula I de la presente memoria, en el que R^{10} es una cadena lateral de lisina. La Figura 5B es la estructura del análogo de didemnina de la Figura 5A unido a un soporte sólido (SS).
La Figura 6, que comprende las Figuras 6A y 6B, representa otra clase de análogos de didemnina de tipo tamandarina inmovilizables. La Figura 6A es la estructura del análogo de didemnina de la fórmula I de la presente memoria, en la que R^{1} es -leucina. La Figura 6B es la estructura del análogo de didemnina de la Figura 6A unido a un soporte sólido (SS).
La Figura 7 es la estructura del compuesto 115.
La Figura 8 es la estructura del compuesto 116.
La Figura 9 es la estructura del compuesto 117.
La Figura 10 es la estructura del compuesto 118.
La Figura 11 es la estructura del compuesto 119.
La Figura 12 es la estructura del compuesto 120.
La Figura 13 es la estructura del compuesto 121.
La Figura 14 es la estructura del compuesto 122.
La Figura 15 es la estructura del compuesto 123.
La Figura 16 es la estructura de compuesto 124.
La Figura 17 es la estructura del compuesto 125.
La Figura 18 es la estructura del compuesto 126.
La Figura 19 es la estructura de compuesto 127.
La Figura 20 es la estructura del compuesto 128.
La Figura 21 es la estructura del compuesto 129.
La Figura 22 es la estructura del compuesto 130.
La Figura 23 representa la escisión enzimática del resto cefalosporina del análogo de didemnina 131 mediante \beta-lactamasa proporcionando compuesto 101.
La Figura 24 representa la escisión enzimática del resto glucósido del análogo de didemnina 132 mediante \beta-glucuranidasa proporcionando el compuesto 101.
La Figura 25, que comprende las Figuras 25A y 25B, es un par de estructuras que ilustra la diferencia estructural entre tamandarina A (101; Figura 25A) y didemnina B (201; Figura 25B). El núcleo macrolítico de 101 difiere del 201 en que 101 contiene un resto \alpha-idroxiisovalerilo (Hiv) y 201 contiene un resto \alpha-(\alpha-hidroxiisovaleril)propionilo (Hip) en la posición análoga, tal como indican los paréntesis y líneas de puntos en cada una de las Figuras.
La Figura 26, que comprende las Figuras 26A-26E, representa un procedimiento de síntesis para generar análogos de didemnina que se describen en la presente memoria.
La Figura 27 es la estructura de (-) Tamandarina A (es decir, {(2S)Hiv^{2}}didemnina B), que ilustra la convención numérica que se usa en la presente memoria y en Sakai y cols. (1996, J. Med. Chem. 39: 2819-2834) para los análogos de didemnina.
La Figura 28, que comprende las Figuras 28A y 28B, representa la estructura de un análogo de didemnina de tipo deshidrotamandarina (es decir, {(2S)Hiv^{2}}deshidrodidemnina B). La Figura 28A es la estructura de (-) deshidrotamandarina (compuesto 133). La Figura 28B es la estructura de un diastereoisómero de (-) deshidrotamandarina (compuesto 134). El centro quiral en el que difieren estas dos moléculas se indica con una flecha. La posición en la que estos análogos de didemnina de tipo deshidrotamandarina difieren de los análogos de didemnina de tipo tamandarina se indica con un asterisco.
La Figura 29 es la estructura de un análogo de didemnina de tipo deshidrotamandarina fluorescente. "FL" es un fluoróforo.
La Figura 30 es la estructura del compuesto 136.
La Figura 31 es la estructura del compuesto 137.
La Figura 32 representa un análogo de didemnina de tipo deshidrotamandarina unido a un soporte sólido (SS).
La Figura 33 es la estructura del compuesto 139.
La Figura 34 es la estructura del compuesto 140.
La Figura 35, que comprende las Figuras 35A y 35B, representa la estructura de deshidrotamandarina B, también denominada {(2S)Hiv^{2}, Norstal^{1}}didemnina B. La Figura 35A es la estructura de (-) deshidrotamandarina B (compuesto 141). La Figura 35B es la estructura de un diastereoisómero de (-) deshidrotamandarina B (compuesto 142). El centro quiral en el que difieren estas dos moléculas se indica con una flecha.
La Figura 36 es la estructura del compuesto 143.
La Figura 37, que comprende las Figuras 37A y 37B, representa un procedimiento de síntesis para generar (-) deshidrotamandarina (es decir, {(2S)Hiv^{2}}deshidrodidemnina B, compuesto 133).
La Figura 38, que comprende las Figuras 38A, 38B y 38C, representa un procedimiento de síntesis para generar análogos de didemnina fluorescentes que se describen en la presente memoria.
La Figura 39 es la estructura de un análogo preferido de tamandarina con desoxo-prolina denominado compuesto 201a.
La Figura 40 es la estructura de un análogo preferido de didemnina con desoxo-prolina denominado compuesto 202.
Cada una de la Figura 41, la Figura 42 y la Figura 43 representa un procedimiento de preparar restos de cadenas laterales que contienen desoxo-prolina para análogos de tamandarina o didemnina.
La Figura 44 representa un procedimiento de preparar restos de cadenas laterales que contienen deshidro-prolina para análogos de tamandarina o didemnina.
La Figura 45 es la estructura de un análogo preferido de tamandarina con deshidro-prolina denominado compuesto 203.
La Figura 46 es la estructura de un análogo preferido de didemnina con deshidro-prolina denominado compuesto 204.
Cada una de la Figura 47, la Figura 48, la Figura 49 y la Figura 50 representa un procedimiento de preparar análogos de didemnina que tienen restos de cadenas laterales fotorreactivos.
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Descripción detallada de la invención
La invención se refiere a análogos de tamandarina y didemnina, que incluyen análogos que tienen un resto desoxoprolina o un resto deshidro-prolina en su estructura. La invención incluye composiciones que comprenden tales análogos y procedimientos para preparar y usar estos análogos. Estos análogos son de utilidad, entre otras cosas, para inhibir la síntesis de proteínas, el crecimiento celular, la proliferación celular y la oncogénesis. Los análogos de la invención también pueden presentar actividades antivirales, antitumorales, inductoras de la apoptosis e inmunosupresoras en animales, que incluyen los seres humanos.
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La invención incluye composiciones que comprenden un análogo de tamandarina que tiene la estructura
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{10}, X e Y tienen las identidades que se describen en la presente memoria. En las figuras se muestran ejemplos de análogos de acuerdo con esta fórmula.
La invención también incluye composiciones que comprenden un análogo de didemnina que tiene la estructura
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{10}, X e Y tienen las identidades que se describen en la presente memoria.
Definiciones
Tal como se usa en la presente memoria, cada uno de los siguientes términos tiene el significado que se le asocia en esta sección.
Los artículos "un" y "una" se usan en la presente memoria para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Por ejemplo, "un elemento" quiere decir un elemento o más de un elemento.
Tal como se usa en la presente memoria, los restos aminoacídicos se representan por su nombre completo, por el código de tres letras que les corresponde o por el código de una letra que les corresponde, tal como se indica a continuación:
Nombre completo Código de tres letras Código de una letra
Ácido aspártico Asp D
Ácido glutámico Glu E
Lisina Lys K
Arginina Arg R
(Continuación)
Nombre completo Código de tres letras Código de una letra
Histidina His H
Tirosina Tyr Y
Cisteína Cys C
Asparragina Asn N
Glutamina Gln Q
Serina Ser S
Treonina Thr T
Glicina Gly G
Alanina Ala A
Valina Val V
Leucina Leu L
Isoleucina Ile I
Metionina Met M
Prolina Pro P
Fenilalanina Phe F
Triptófano Trp W
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "cadena lateral aminoacídica" se refiere a un resto que comprende todos los átomos de un aminoácido excluyendo el átomo de carbono \alpha, un átomo de hidrógeno unido al carbono \alpha, los átomos del resto carboxilo \alpha y del resto amina \alpha. A modo de ejemplo, una "cadena lateral de alanina" se refiere a un grupo metilo y una "cadena lateral de valina" se refiere a un grupo 2-propilo.
"Inhibición" de un proceso en una célula (por ejemplo, inhibición de la síntesis de proteínas, inhibición del crecimiento celular, inhibición del desarrollo del ciclo celular, inhibición de la proliferación celular, o inhibición de la oncogénesis) quiere decir reducción (por ejemplo, en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, o incluso 100%) de la velocidad a la que el proceso transcurre, reducción (por ejemplo, en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% o incluso 100%) de la velocidad a la que se inicia el proceso o ambos.
"Potenciación" de un proceso en una célula (por ejemplo, potenciación de la apoptosis) quiere decir aumentar (por ejemplo, en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% o incluso 100%) la velocidad a la que se desarrolla el proceso, aumentando (por ejemplo, en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% o incluso 100%) la velocidad a la que se inicia el proceso o ambas.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" quiere decir una composición química con la que puede combinarse un análogo o fragmento de didemnina, tal como se describe en la presente memoria y que, después de la combinación, puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un ser humano u otro animal).
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión éster o sal "fisiológicamente aceptable" quiere decir una estérica o salina de un análogo o fragmento de didemnina, tal como se describe en la presente memoria, que es compatible con otros ingredientes de una composición farmacéutica y que no es perjudicial para un sujeto al que se va a administrar la composición.
Tal como se usa en la presente memoria, "administración parenteral" de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada porque se rompen físicamente los tejidos de un sujeto y se administra la composición farmacéutica a través de la rotura del tejido. La administración parenteral así incluye, pero sin limitación, la administración de una composición farmacéutica mediante la inyección de la composición, mediante la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante la aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra los tejidos y similares. En particular, administración parenteral puede incluir, pero sin limitación, inyección subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal y técnicas de infusión por diálisis
renal.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "actividad antiviral" quiere decir prevenir la replicación de un virus en la célula, prevenir la infección de la célula por un virus o revertir un efecto fisiológico de la infección de la célula por un virus. Un agente o composición antivirales, cuando se administran a una célula, muestran actividades antivirales. Los agentes antivirales son notorios y son descritos en la bibliografía. A modo de ejemplo, AZT (zidovudina, Retrovir® Glaxo Wellcome Inc., Research Triangle Park, NC) es un agente antiviral que se cree que previene la replicación de HIV en células humanas.
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Tal como se usa en la presente memoria, un resto "desoxo-prolina" es un resto químico que tiene la siguiente estructura.
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Tal como se usa en la presente memoria, un resto "deshidro-prolina" es un resto químico que tiene la siguiente estructura.
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Descripción
La presente invención se refiere a análogos de tamandarina y didemnina, que incluyen los que tienen un resto desoxo-prolina o deshidro-prolina en su estructura (y, por supuesto, los que no tienen un resto desoxo-prolina o deshidro-prolina en su estructura). Estos análogos muestran propiedades farmacológicas potentes cuando se administran a seres humanos y otros mamíferos. A modo de ejemplo, estos compuestos pueden inhibir la síntesis de proteínas y el crecimiento y la proliferación celulares. Estos compuestos también pueden potenciar la apoptosis en las células. Estas propiedades hacen que los compuestos sean de utilidad para tratar una variedad de trastornos que se caracterizan por uno o más de síntesis de proteínas aberrante, crecimiento celular aberrante, proliferación celular aberrante y apoptosis aberrante. Ejemplos de tales trastornos incluyen oncogénesis, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, infección de una célula por un virus y replicación de un virus en una célula.
Entre las composiciones de la invención están aquellas que comprenden un análogo de tamandarina que tiene la estructura de la fórmula I o un análogo de didemnina que tiene la estructura de la fórmula XXI.
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El sustituyente R^{1} de las fórmulas I y XXI puede tener un resto desoxo-prolina en su estructura y, por ejemplo puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo protector de amina adecuado para la protección de aminoácidos. Tales grupos protectores son conocidos en la técnica y se hace referencia a ellos en esta descripción. Ejemplos de grupos protectores adecuados pueden encontrarse en referencias tales como Green y Wutz (1999, Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York) y Bodansky (1993, Principles of Peptide Synthesis, Springer, Berlín). De forma alternativa, el sustituyente R^{1} puede ser un resto aminoacídico (por ejemplo, un resto leucina) o un polipéptido que comprende uno o más restos aminoacídicos. Ejemplos de tales restos y polipéptidos incluyen
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-4-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)leucina-piroglutamato.
Ejemplos adicionales de sustituyentes R^{1} alternativos incluyen péptidos que comprenden un fluoróforo (por ejemplo, rodamina o cumarina), un resto aminoacídico, un polipéptido, un grupo escindible enzimáticamente u otro resto químico unido (por ejemplo, unido de forma covalente) a un soporte (por ejemplo, una placa de cristal o sílice, una perla de agarosa u otro polímero, etc.). El fluoróforo o grupo escindible enzimáticamente puede estar enlazado directamente al análogo, o puede estar unido a él con un enlazador que tiene de 1 a aproximadamente 13 o más átomos de carbono (que opcionalmente incluyen uno o más restos amina o amida secundaria) en él. Cuando R^{1} comprende un resto N-metil-leucina, el átomo de carbono \alpha de ese resto puede tener una estereoquímica (R) o (S). Otros restos aminoacídicos en R^{1} pueden tener estereoquímica (R) o (S), pero preferiblemente tienen estereoquímica (S) en su átomo de carbono \alpha.
Cuando R^{1} comprende un resto lactato, el resto lactato preferiblemente es un resto (S)lactato. En una realización preferida, cada resto aminoacídico de R^{1} distinto del resto leucina (o N-metil-leucina) (si está presente) unido directamente al átomo de nitrógeno del anillo de la fórmula I o XXI tiene estereoquímica (S).
R^{3} puede ser cualquiera de -CH3 y -H. De forma alternativa, R^{3} junto con R^{2}, puede ser un sustituyente único.
El sustituyente R^{2} puede ser una cadena lateral aminoacídica tal como una cadena lateral de isoleucina (es decir, un resto 2-butilo, que preferiblemente tiene estereoquímica (R)), una cadena lateral de valina (es decir, un resto 2-propilo), una cadena lateral de alanina (es decir, un resto metilo), una cadena lateral de norleucina (es decir, un resto 1-butilo), una cadena lateral de norvalina (es decir, un resto 1-propilo), una cadena lateral de leucina (es decir, un resto isobutilo, que preferiblemente tiene estereoquímica (S)), una cadena lateral de fenilalanina (es decir, un resto fenilmetilo), una cadena lateral de histidina (es decir, un resto 4-metilimidazol), una cadena lateral de triptófano (es decir, un resto 3-metilindol), una cadena lateral de tirosina (es decir, un resto 4-hidroxifenilmetilo), una cadena lateral de arginina (es decir, un resto 4-guanidinilbutilo) y una cadena lateral de lisina (es decir, un resto
4-aminobutilo).
Un sustituyente R^{2} puede comprender un fluoróforo (por ejemplo, un fluoróforo unido a una de las cadenas laterales aminoacídicas que se describen anteriormente). Además, el sustituyente R^{2} puede tener la estructura de la fórmula
III
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En una realización alternativa, R^{1} y R^{3} juntos son un sustituyente que tiene la fórmula IV
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En las fórmulas III y IV, cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, de forma independiente, puede ser un sustituyente que se selecciona del grupo constituido por H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -CH_{2}-CH_{3}.
R^{4} puede ser una cadena lateral de isoleucina o una cadena lateral de valina.
X puede ser -O- o -(NH)-.
Y puede ser -H o un grupo protector de hidroxilo. Ejemplos de grupos protectores de hidroxilo que pueden estar presentes en Y incluyen un resto sililo sustituido con alquilo, un resto sililo sustituido con arilo o un silano sustituido tanto con restos alquilo como arilo. Un ejemplo de un grupo protector de hidroxilo de utilidad es un resto triisopropilsililo. Otros grupos protectores de hidroxilo que pueden usarse en Y en la fórmula I se describen en referencias tales como Green y Wutz (1999, Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York).
R^{10} puede ser una cadena lateral aminoacídica tal como una cadena lateral de leucina o una cadena lateral de lisina. De forma alternativa, R^{10} puede ser un aminoácido u otro resto químico que está unido (por ejemplo, enlazado covalentemente) a un soporte (por ejemplo, un soporte sólido). Un ejemplo de un soporte con un análogo que tiene la estructura de la fórmula I unido a él se representa en la Figura 5B.
Otro grupo de composiciones incluidas en la invención es el que comprende un análogo de tamandarina que tiene una estructura que se selecciona del grupo constituido por las fórmulas (a)-(d), que se describen anteriormente.
Cada uno de R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{10}, X e Y tienen el mismo significado en las fórmulas (a)-(d) que el que tienen en las fórmulas I y XXI.
En las fórmulas (a)-(d), R^{13} puede ser hidrógeno o un resto químico que puede ser enzimáticamente escindible (es decir un resto que puede escindirse mediante enzimas) o fotorreactivo. Tal como se usa en la presente memoria, un resto que puede escindirse enzimáticamente puede incluir cualquier resto químico que puede escindirse (es decir separarse químicamente) en presencia de una enzima específica. Ejemplos de enzimas capaces de separar químicamente un resto que puede escindirse mediante enzimas incluyen carboxipeptidasas, \beta-lactamasa, \beta-galactosidasa, penicilina V-amidasa, citosina deaminasa, nitrorreductasa, fosfatasa alcalina, \beta-glucuronidasa y anticuerpos catalíticos. Ejemplos restos de que pueden escindirse enzimáticamente que pueden incorporarse a un compuesto que se describe en la presente memoria incluyen cefalosporinas, \beta-glucósidos, fosfato, pirofosfato, \beta-galactósidas, nitrobenzamidina, citosina, carbamatos, péptidos y aminoácidos. De forma alternativa, R^{13} puede ser un resto que puede escindirse enzimáticamente tal como un di-péptido enlazado a glutamina-piroglutamato, o un resto que tiene la estructura de la fórmula V o de la fórmula VI
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A modo de ilustración, en el compuesto 131, que se representa en la Figura 23, R^{13} es un resto que puede escindirse enzimáticamente que tiene la estructura de la fórmula V (es decir, un resto cefalosporina). El resto cefalosporina del compuesto 131 puede escindirse por contacto con la enzima, \beta-lactamasa, generando el compuesto 101. Un sustituyente R^{13} que tiene la estructura de la fórmula VI, por ejemplo puede estar en forma de una sal sódica o potásica.
Tras la escisión de un resto que puede escindirse enzimáticamente mediante una enzima, el análogo de didemnina resultante puede mostrar una o más de las actividades fisiológicas que se describen en la presente memoria. Un análogo de tamandarina o didemnina que tiene la estructura de una de las fórmulas (a)-(d), en el que R^{13} es un resto que puede escindirse enzimáticamente, opcionalmente, puede mostrar estas actividades antes de la escisión del resto que puede escindirse enzimáticamente. Sin embargo, en una realización preferida, el análogo muestra actividad terapéutica sólo tras la escisión del mismo del resto que puede escindirse mediante enzimas.
Tal como se describe anteriormente, un análogo de tamandarina o didemnina que tiene la estructura de una de las fórmulas I, XXII y (a)-(d) puede unirse a un soporte. La identidad del soporte no es crítica. El soporte puede ser sustancialmente de cualquier material con el que pueda unirse tal análogo (por ejemplo, por unión covalente mediante uno de los restos R^{10}, R^{2}, R^{3}, o R^{1}). Ejemplos de materiales de soporte incluyen silicatos enlazados, agarosa reticulada, poliacrilamida, dextrano y alildextrano. Tales materiales de soporte pueden modificarse químicamente usando restos químicos reactivos para facilitar la unión covalente del análogo al soporte. Las modificaciones químicas de este tipo son notorias en la técnica y, por ejemplo, pueden incluir la modificación de un soporte con grupos bromuro de cianógeno, grupos epóxido, grupos mesilo y grupos carboxihexilo. En la técnica hay disponibles protocolos para la preparación de un soporte y la unión subsiguiente de un compuesto al soporte y pueden ser modificados por una persona de experiencia en la técnica para usarlos con un análogo de didemnina que se describe en la presente memoria.
Ejemplos de análogos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula I o de la fórmula XXI, incluyen, el compuesto 21 y los compuestos 101-143, algunos de los cuales se representan en una o más de las Figuras 1-39.
En el compuesto 21, R^{1} es -(terc-butiloxicarbonilo), R^{2} es una cadena lateral de O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -(triisopropilsililo).
Los análogos de tamandarina preferidos se basan en la estructura de tamandarina A. En la tamandarina A ({(2S)Hiv^{2}}didemnina B; compuesto 101), R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato, R^{2} es una cadena lateral de O-metil-tirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En tamandarina M ({(2S)Hiv^{2}}didemnina M; compuesto 103), R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato, R^{2} es una cadena lateral O-metil-tirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O- e Y es -H.
Los análogos de didemnina preferidos se basan en la estructura de didemnina B. En tamandarina B ({(2S)Hiv^{2}, Norsta^{1}}didemnina B; compuesto 105), R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de valina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 107, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-glicina-(7-dimetilcoumarin-4-acetato), R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 109, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato-rodamina, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 111, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 113, R^{1} es -(N-metil-R-leucina), R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 115, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato, R^{2} es una cadena lateral de lisina, R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 123, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato, R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente tetrahidroisoquinolina que tiene la estructura de la fórmula IV, R^{5}, R^{6} y R^{8} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}, R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de valina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 124, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato, R^{2} es una cadena lateral de O-metil-tirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{1} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -(NH)-, e Y es -H.
En el compuesto 128, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 129, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-(N-metil-S-alanina)leucina-piroglutamato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 131, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-prolina-lactato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, R^{13} es un resto cefalosporina que puede escindirse mediante la enzima \beta-lactamasa, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 132, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-(S)-prolina-(S)-lactato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, R^{13} es un resto \beta-glucósido que puede escindirse mediante la enzima \beta-glucuronidasa, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 134, R^{1} es -(N-metil-S-leucina)-(S)prolina-piruvato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 137, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-(S)prolina-piruvato, R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente tetrahidroisoquinolina que tiene la estructura de la fórmula IV, R^{5}, R^{6} y R^{8} son cada uno -H, R^{4} es una cadena lateral de valina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 138, R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-(S)prolina-prolina-piruvato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de lisina unida de forma covalente a un soporte, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 142, R^{1} es -(N-metil-S-leucina)-(S)prolina-piruvato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de valina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
En el compuesto 143, R^{1} es (N-metil-R-leucina)-(S)prolina-piruvato, R^{2} es una cadena lateral O-metiltirosina (es decir, R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} son cada uno -H y R^{7} es -OCH_{3}), R^{3} es -CH_{3}, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O-, e Y es -H.
La similitud estructural de didemnina B y tamandarina A (es decir, {(2S)Hiv^{2}}didemnina B; compuesto 101) se ilustra en la Figura 25. La diferencia estructural primaria, indicada mediante paréntesis y líneas punteadas, es la porción macrocíclica de estos compuestos. Tamandarina A, que se muestra en la Figura 25A, contiene un resto \alpha-hidroxiisovalerilo (Hiv) y la didemnina B, que se muestra en la Figura 25B, contiene un resto \alpha-(\alpha-hidroxiisovaleril)-propionilo (Hip). La estructura macrocíclica más simple de tamandarina A y de cualquier compuesto que tiene la estructura de la fórmula I o de la fórmula XXI, puede sintetizarse más fácilmente que la estructura macrocíclica de didemnina B. Los compuestos que tienen la estructura o bien de la fórmula I o de la fórmula XXI pueden prepararse más fácilmente (y generalmente de forma menos cara) que los compuestos que son idénticos a excepción de la presencia de un resto Hip en lugar del resto Hiv.
Otro grupo de compuestos que puede presentar las actividades fisiológicas que se describen en la presente memoria y que se incluyen en la invención son compuestos que corresponden a fragmentos de análogos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula I o de la fórmula XXI. Los fragmentos que muestran esta actividad incluyen los que tienen la estructura de la fórmula VII
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En la fórmula VII, X y y R^{4} tienen las identidades que se describen para las fórmulas I y XXI y APG es un grupo protector de amina. Ejemplos de grupos protectores de amina que pueden estar presentes en los fragmentos activos incluyen restos carbobenciloxi (CBZ) y terc-butiloxicarbonilo (BOC). Otros grupos protectores de amina de utilidad se describen en referencias tales como Green y Wutz (1999, Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York) y Bodansky (1993, Principles of Peptide Synthesis, Springer, Berlín).
R^{11} en la fórmula VII puede ser cualquiera de -OH, NH_{2}-, -(O-alilo) y -(O-pentafluorofenilo). De forma alternativa, R^{11} can be un sustituyente que tiene la estructura que se muestra en la fórmula VIII
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En la fórmula VIII, R^{2}, R^{3} y R^{10} tienen las identidades que se describen para las fórmulas I y XXI y APG es un grupo protector de amina tal como se describe para la fórmula VII (aunque no tiene que ser el mismo APG que en la fórmula VII). R^{12} puede ser o -H o un grupo protector de hidroxilo, tal como se describe en la presente memoria. Compuestos que tienen la estructura de la fórmula VII que pueden prepararse y usarse tal como se describe en la presente memoria, incluyen los compuestos denominados 6, 17, 19 y 20 en la Figura 26.
Procedimientos para usar los compuestos que se describen en la presente memoria
Los análogos de didemnina y tamandarina que se describen en la presente memoria pueden usarse para afectar a una variedad de procesos fisiológicos. Cada uno de estos tipos de compuestos puede usarse para inhibir la síntesis de proteínas. Además, los compuestos pueden usarse para inhibir la progresión de una célula por el ciclo celular. Aunque sin comprometerse con ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que la actividad de inhibición del ciclo celular de los compuestos puede atribuirse a la inhibición de la síntesis de proteínas, a la inhibición de otras actividades celulares asociadas a la replicación de ADN o a la división celular, o a alguna combinación de estas actividades. Estos análogos de didemnina y tamandarina también inducen la apoptosis de las células. Las actividades fisiológicas que pueden atribuirse a estos análogos de didemnina y tamandarina hacen que estos compuestos sean de utilidad para aliviar una variedad de trastornos en los que uno o más de crecimiento, proliferación y supervivencia celulares son aberrantes. Ejemplos de tales trastornos incluyen cánceres en diversas etapas (por ejemplo, oncogénesis, crecimiento tumoral y metástasis) e infecciones víricas en diversas etapas (por ejemplo, infección de células por partículas víricas, producción de partículas víricas en una célula y supervivencia de células infectadas por virus).
Aunque todavía sin comprometerse con ninguna teoría particular de funcionamiento, se cree que las actividades fisiológicas que se pueden atribuir a los análogos de tamandarina y didemnina que se describen en la presente memoria son resultado de una o más interacciones entre tales análogos y al menos un componente celular. Esta(s)
interacción(es) provocan, de forma directa o indirecta, la respuesta celular observada. Por consiguiente, la invención comprende el uso de estos compuestos para identificar uno o más componentes celulares que contribuyen a un fenotipo de trastorno en un individuo. La identificación de tal componente celular puede indicar una vía de tratamiento eficaz para aliviar el trastorno. Ejemplos de compuestos de utilidad para este fin incluyen los análogos que comprenden un sustituyente fluorescente (por ejemplo, en R^{1} o R^{2}), una resto químico fotorreactivo, tal como un resto que tiene la estructura
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o un resto unido a un soporte.
Los análogos de tamandarina y didemnina fluorescentes y otros marcados de forma que puedan detectarse que se describen en la presente memoria (así como sus fragmentos fisiológicamente activos) pueden usarse para identificar células en las que esos análogos y fragmentos pueden ejercer sus efectos fisiológicos. Por ejemplo, pueden identificarse o aislarse las células que absorben o se unen a un análogo fluorescente. La identificación o el aislamiento de tales células pueden usarse para diagnosticar un trastorno asociado a la presencia de tales células. La identificación o aislamiento de estas células también puede indicar cuales de los análogos de didemnina y tamandarina son eficaces para tratar un trastorno que implique a las células.
Los análogos de tamandarina y didemnina que se describen en la presente memoria pueden usarse para fines antiproliferativos, antitumorales, antivirales, e inmunosupresores. Por ejemplo, estos compuestos pueden usarse en una preparación o medicamento farmacéuticos a administrar a un paciente que padece un trastorno en el que uno o más de síntesis de proteínas, crecimiento, proliferación y supervivencia celulares son aberrantes. Tales medicamentos pueden usarse para tratar trastornos tales como cánceres (por ejemplo, cáncer de mama), infecciones víricas, fúngicas, parasíticas y bacterianas, trastornos autoinmunitarios, alergias, otros trastornos inmunitarios y ateroesclerosis.
Ejemplos de actividades antitumorales que pueden exhibir los compuestos que se describen en la presente memoria incluyen inhibición de la oncogénesis, inhibición de la metástasis, inhibición del crecimiento celular tumoral, inhibición de la proliferación celular tumoral y potenciación de la apoptosis de las células tumorales. Deshidrodidemnina muestra actividad contra líneas celulares que se derivan de diversos tipos tumorales sólidos humanos, que incluyen cáncer de pulmón amicrocítico y líneas celulares tumorales de colon y muestra actividad antitumoral selectiva contra el cáncer amicrocítico, melanomas, cáncer de ovario y cáncer colorrectal (Depenbrock y cols., 1998. Brit. J. of Cancer 78(6):739-744). Los análogos de tamandarina y didemnina que se describen en la presente memoria muestran actividades antitumorales en células de una o más de estas líneas, así como en células del tipo tumoral correspondiente in vivo. La determinación de la eficacia de cualquier análogo particular contra cualquier tipo tumoral particular puede realizarse usando procedimientos estándar que impliquen, por ejemplo, uno o más de las 60 líneas celulares tumorales estándar que se mantienen en el programa de selección de fármacos del U.S. National Cancer Institute.
Ejemplos de actividades antivirales que pueden mostrar los análogos de tamandarina y didemnina que se describen en la presente memoria incluyen la inhibición de la unión de un virus con una diana celular, inhibición de la infección de una célula por un virus, inhibición de la síntesis celular de componentes víricos, inhibición del ensamblaje intracelular de partículas víricas, inhibición de la liberación de partículas víricas a partir de una célula infectada, inhibición del crecimiento de una célula infectada por un virus, inhibición de la proliferación de una célula infectada por un virus, e inducción de la muerte (es decir, apoptosis) de una célula infectada por un virus. La actividad antiviral de los compuestos que se describen en la presente memoria puede usarse, por ejemplo, para tratar o prevenir infecciones víricas de mamíferos y síntomas asociados. A modo de ilustración, el análogo de tamandarina o didemnina puede usarse para tratar o prevenir infecciones por virus tales como virus de la fiebre del valle del Rift, virus del dengue o cualquiera de los virus de la encefalitis.
Ejemplos de actividades inmunosupresoras que pueden mostrar los análogos de didemnina y tamandarina que se describen en la presente memoria incluyen la inhibición de la respuesta inmunitaria celular contra un inmunógeno (por ejemplo, un agente infeccioso o una célula o tejido trasplantados) y la inhibición de una respuesta inmunitaria humoral a un inmunógeno. Ejemplos de trastornos en los que puede ser deseable la inmunosupresion incluyen trastornos autoinmunitarios, trastornos de rechazo de trasplantes (por ejemplo, rechazo de un tejido sólido o de médula ósea), desarrollo de una respuesta inmunitaria contra un dispositivo implantado (por ejemplo un stent o una válvula cardiaca), hipersensibilidad inmunitaria y anafilaxia.
Los análogos de tamandarina y didemnina que se describen en la presente memoria pueden administrarse in vitro a una célula o tejido (por ejemplo, una célula o tejido cultivado, o una célula o tejido extraídos de un animal antes de la introducción en el mismo animal o en uno diferente). De forma alternativa, los análogos pueden administrarse a la célula o tejido in vivo administrando el análogo o una composición farmacéutica que comprende el análogo a un animal (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano) que comprende la célula o tejido.
En una realización de los procedimientos de tratamiento que se describen en la presente memoria, un análogo de tamandarina o didemnina que se describe en la presente memoria y que tiene un grupo que puede escindirse mediante enzimas unido al mismo (por ejemplo, un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XXI) se administra a un animal. Tras la escisión del grupo que puede escindirse mediante enzimas, el compuesto se transforma de una forma inactiva (o menos activa) en una forma activa (o más activa), tal como se muestra en las Figuras 23 y 24. Así, un análogo de tamandarina o didemnina puede activarse selectivamente en un lugar del cuerpo en el que se produce la actividad enzimática.
La enzima que se usa para escindir el análogo de tamandarina o didemnina que tiene unido un resto que puede escindirse enzimáticamente puede ser una enzima que se produce de forma natural en una localización del cuerpo de un animal. De forma alternativa, la enzima puede proporcionarse al animal, por ejemplo en forma de una composición que comprende la enzima o un ácido nucleico que codifica la enzima. Como ejemplo adicional, la enzima puede acoplarse (por ejemplo, de forma covalente, usando un agente de entrecruzamiento o mediante la expresión de una proteína de fusión de enzima y anticuerpo) con un anticuerpo que se une específicamente a un tejido (por ejemplo, células cancerosas tales como células leucémicas o células de tumor sólido) de una localización del cuerpo del animal y el complejo de anticuerpo y enzima puede administrarse a un animal. La administración de un análogo de tamandarina o didemnina que tiene un grupo unido que puede escindirse enzimáticamente al mismo animal provoca la activación preferente del compuesto en el tejido o localización del cuerpo. El efecto fisiológico del compuesto por lo tanto puede localizarse en el tejido o localización del cuerpo y así puede reducirse o minimizarse cualquier efecto secundario que pueda atribuirse al compuesto activado.
Para identificar células que comprenden, sobre sus superficies o en cualquier otro lugar proteínas receptoras, glucoproteínas y similares que tienen capacidad de interactuar o unirse al análogo puede usarse un análogo de tamandarina o didemnina unido a un soporte.
Como ejemplo, puede usarse un análogo de tamandarina o didemnina que tiene la estructura de la fórmula I o XXI y unirlo a un soporte en virtud de su interacción con un receptor celular particular, para identificar o aislar físicamente las células de un tipo particular (por ejemplo, células tumorales) que se caracterizan por la presencia de un receptor particular.
Procedimientos para preparar los compuestos que se describen en la presente memoria
La presente invención incluye procedimientos para preparar los análogos y fragmentos de didemnina que se describen en la presente memoria. Se han descrito procedimientos para preparar análogos de tamandarina y didemnina (por ejemplo, Harris y cols., 1987, Tetrahedron lett. 28:2831-2840; Harris y cols., 1988, Tetrahedron 44:3489-3500; Ewing y cols., 1986, Tetrahedron 42:5863-5868; Ewing. W.R.. 1988, Ph.D. Dissertation, University of Pennsylvania, Philadelphia PA: Ewing y cols. 1989, Tetrahedron Lett. 30:3757-3760; Li y cols., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:7659-7672; Mayer y cols. 1994, J. Org. Chem. 59:5192-5205; Mayer y cols. 1994. Tetrahedron:Asymmetry 5:519-522; Xiao y cols., 1997, Tetrahedron: Asymmetry 9:47-53; Pfizenmayer y cols., 1998, 8:3653-3656; solicitud de patente de Estados Unidos con número de serie 09/545.848, presentada el 7 de abril de 2000). El contenido de cada una de estas referencias y solicitudes de patente se incorpora a la presente memoria por referencia. El procedimiento preciso que se usa para preparar un macrociclo o análogo de tamandarina o didemnina no es crítico.
Preferiblemente, el procedimiento que se usa produce la síntesis estereoselectiva de un compuesto que se describe en la presente memoria. Por ejemplo, la síntesis de (-) tamandarina A ({(2S)Hiv^{2}}didemnina B; compuesto 101) se ejemplifica en la presente memoria en el Ejemplo 1.
Refiriéndose a procedimientos para preparar los análogos y fragmentos que se describen en la presente memoria, los sustituyentes R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10}, X, e Y, tienen los mismos significados que se usan anteriormente.
Tal como se usa en la presente descripción, una reacción de protección puede incluir cualquier reacción mediante la cual uno o más restos químicos se unen de forma covalente (pero reversible) a uno de un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre de una molécula. Tal unión evita que el átomo o átomos participen en reacciones químicas no deseadas, es decir, que se unan de forma covalente a otros restos químicos y que donen o acepten o protones o electrones de otros restos químicos. Un resto químico unido de este modo se denomina "un grupo protector". A modo de ejemplo, el átomo de nitrógeno de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula IX, tal como D-alo-isoleucina, puede protegerse usando un reactivo tal como carbobenciloxi-succinimida (CBZ-succinimida). El uso de este reactivo en un protocolo estándar proporciona una D-alo-isoleucina, es decir, N^{\alpha}-CBZ-D-alo-isoleucina, que tiene la estructura del compuesto 8 de la Figura 26A. En el compuesto 8, el resto CBZ actúa como grupo protector de amina y el átomo de nitrógeno al que está unido no puede sufrir reacciones químicas adicionales fácilmente. Además, a modo de ejemplo, cuando X es -(NH)-, puede usarse un grupo amina protegido (por ejemplo, -N(CBZ)-) en las reacciones que se describen en la presente memoria. Como ejemplo alternativo, el resto hidroxilo del compuesto 11 de la Figura 26A, puede protegerse usando un reactivo tal como triisopropilsililtriflato (TIPSOTf) proporcionando el compuesto 12 de la Figura 26A. En este compuesto, Y es un resto triisopropilsililo (TIPS) y actúa como grupo protector de hidroxilo, evitando reacciones químicas con el átomo de oxígeno al que está unido este resto.
Protocolos para realizar las reacciones de protección e información completa sobre restos químicos que pueden usarse como grupos protectores se encuentran en referencias tales como Green y Wutz (1999, Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York) y Bodansky (1993, Principles of Peptide Synthesis, Springer, Berlín).
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Los análogos y fragmentos de didemnina pueden prepararse convirtiendo un compuesto que tiene la estructura de la fórmula IX
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en un compuesto que tiene la estructura de la fórmula X
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Tal serie de reacciones pueden incluir, pero sin limitación, una reacción de protección, una reacción de activación, una reacción de esterificación y una reacción de hidrólisis de éster. El grupo amina de la fórmula IX preferiblemente es protegido antes de realizar las reacciones de esterificación e hidrólisis. Un ejemplo específico de la preparación de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula X se proporciona en el Ejemplo 1. En las fórmulas X-XVIII, "APG" se refiere a un grupo protector de amina tal como un resto carbobenciloxi (CBZ) o un resto terc-butiloxicarbonilo (BOC). También pueden usarse grupos protectores de amina alternativos tal como se describen en la presente memoria y en la técnica.
Un ejemplo de una reacción de activación incluida en el procedimiento de preparar un compuesto que tiene la estructura de la fórmula X se representa en la Figura 26A, reacción B. La activación de un compuesto tal como el compuesto 8 puede implicar un reactivo tal como pentafluorofenol (PFPOH) proporcionando el compuesto 9. El compuesto 9 es un ejemplo de un intermedio activado que más fácilmente sufre las reacciones subsiguientes, tales como esterificación, en el carbono del carbonilo de su resto éster de PFP. Para preparar un compuesto que tiene la estructura de la fórmula X pueden emplearse también las reacciones de esterificación que no requieren un intermedio activado.
Para preparar un compuesto que tiene la estructura de la fórmula X puede usarse cualquier procedimiento de hidrólisis de ésteres conocido en la técnica que no comprenda condiciones duras que favorezcan la racemización. A modo de ejemplo, un compuesto que tiene la estructura
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puede hidrolizarse usando una base fuerte en una mezcla de disolventes, tal como se ejemplifica en la Figura 26A, reacción F. Los reactivos y condiciones adecuadas para las hidrólisis de ésteres en condiciones más suaves (es decir, que incluyan condiciones que no favorezcan la racemización) pueden ser fácilmente seleccionadas por una persona de experiencia en la técnica.
Un compuesto que tiene la estructura
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puede esterificarse, por ejemplo con bromuro de alilo (por ejemplo, tal como se describe en Ejemplo 1), proporcionando un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XI
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Un compuesto que tiene la estructura de la fórmula IX y un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XI pueden acoplarse (por ejemplo esterificarse) proporcionando un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XII
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(por ejemplo, la reacción I de la Figura 26B). Opcionalmente, tal reacción puede realizarse usando un catalizador, un reactivo de acoplamiento o un reactivo de esterificación. Los reactivos y condiciones de utilidad para este tipo de reacción son conocidos en la técnica y se ejemplifican en el Ejemplo 1. Los fragmentos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula XII exhiben uno o más de las actividades farmacológicas que se describen en la presente memoria.
Un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XII puede hidrolizarse proporcionando un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XIII
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Tal como se describe en otros puntos de la presente memoria, las condiciones y reactivos de reacción adecuados para la hidrólisis de ésteres son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados fácilmente por una persona de experiencia en la técnica. Un ejemplo de este tipo de hidrólisis se representa en la Figura 26B, reacción J. Los fragmentos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula XIII muestran una o más de las actividades farmacológicas que se describen en la presente memoria.
El grupo carboxilo de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XIII puede activarse proporcionando un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XIV
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En la fórmula XIV, "ACT" se refiere a un grupo activador, tal como un resto pentafluorofenilo (PFP). Otro ejemplo de un grupo activador es un resto N-hidroxisuccinimida. La activación química puede realizarse usando reactivos tales como un reactivo activador, un catalizador, un grupo activador donante o similares. A modo de ejemplo, el compuesto 6, que se representa en la Figura 26C, se activa mediante la unión covalente de un grupo PFP proporcionando el compuesto 19. Los protocolos para activar un compuesto de la forma que se describe en la presente memoria son conocidos en la técnica. Los fragmentos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula XIV muestran una o más de las actividades farmacológicas que se describen en la presente memoria.
El compuesto activado que tiene la estructura de la fórmula XIV puede acoplarse con un tercer reactivo que tiene la estructura de la fórmula XV
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proporcionando un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XVI
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En las fórmulas XV y XVI, SEM se refiere a 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo. Un ejemplo de esta reacción se representa en la reacción M de la Figura 26C. En la que el compuesto 19 se acopla con el compuesto 18 proporcionando el compuesto 20. Los reactivos y condiciones necesarios para la preparación de un péptido protegido tal como el compuesto 18 se describen, por ejemplo, en Li y cols. (1990, J. Am. Chem. Soc. 112:7659-7672). Los análogos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula XVI muestran una o más de las actividades farmacológicas que se describen en la presente memoria.
Un análogo de didemnina que tiene una o más de las actividades farmacológicas que se describen en la presente memoria pueden preparase eliminando uno de los grupos protectores de amino y el grupo protector de carbonilo e hidroxilo de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XVI y ciclando del compuesto proporcionando un PSI que tiene la estructura de la fórmula XVII
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Un ejemplo de reacciones de este tipo se muestra en la etapa N de la Figura 26D. La desprotección química de un compuesto tal como uno que tiene la estructura de la fórmula XVI puede lograrse haciendo reaccionar el compuesto con uno o más reactivos para eliminar un grupo protector del compuesto. Las reacciones de desprotección se describen en la presente memoria, por ejemplo para el compuesto 20, tal como se muestra en la Figura 26D. En la técnica se conocen otros protocolos para desproteger un compuesto y pueden ser fácilmente aplicados por una persona de experiencia en la técnica para la desprotección de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XVI. La ciclación de un compuesto desprotegido que por lo demás tiene la estructura de la fórmula XVI puede lograrse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica para el macrociclado de péptidos. Por ejemplo, las condiciones de macrociclado pueden ser similares o idénticas a las que se usan en la ciclación que proporciona el compuesto 21, que se representa en la Figura 26D y que se describe en el Ejemplo 1. Los análogos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula XVII muestran una o más de las actividades terapéuticas que se describen en la presente memoria.
Uno o más de los grupos protectores de un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XVII pueden eliminarse proporcionando un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XVIII
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Este tipo de desprotección se ejemplifica en la reacción O de la Figura 26E. Los análogos de didemnina que tienen la estructura de la fórmula XVIII muestran una o más de las actividades terapéuticas que se describen en la presente memoria.
Todavía otro compuesto activo puede prepararse acoplando un compuesto que tiene la estructura de la fórmula XVIII y un reactivo que tiene la estructura de la fórmula XIX
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proporcionando un PSI que tiene la estructura de la fórmula XX
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Esta reacción se ejemplifica en la reacción N de la Figura 26E. R^{14} puede ser, por ejemplo, cualquiera de los restos que se describen anteriormente como R^{1}. El grupo sustituyente R^{14} puede englobar un resto que puede escindirse mediante enzimas, preferiblemente en, o cerca, del extremo distal del mismo (relativo al macrociclo). Tal resto puede ser escindible mediante enzimas, por ejemplo, un carboxipeptidasa, una \beta-lactamasa, una \beta-galactosidasa, una penicilina V-amidasa, una citosina desaminasa, una nitrorreductasa, una fosfatasa alcalina, una \beta-glucuronidasa y un anticuerpo catalítico. Un ejemplo de un resto R^{14} que comprende un resto que puede escindirse mediante enzimas es -(N-metil)leucina-(S)prolina-(S)-lactato-(S)glutamina-(S)piroglutamato. Otros ejemplos de restos que pueden escindirse mediante enzimas son que se describen en la presente memoria. A modo de ilustración los compuestos 131 y 132, que se representan en las Figuras 23 y 24, respectivamente, pueden prepararse usando los procedimientos que se describen en la presente memoria. Los análogos y fragmentos de didemnina que tienen un resto que puede escindirse mediante enzimas unido a los mismos y que en el resto tienen la estructura de una de las fórmulas XII-XVIII al escindir el grupo enzimáticamente escindible del mismo, muestran una o más de las actividades terapéuticas que se describen en la presente memoria.
La variación de los sustituyentes de los análogos y fragmentos de didemnina puede requerir ligeras modificaciones de los procedimientos generales que se describen en la presente memoria. Se entiende que la invención incluye tales modificaciones, ya que podrían ser fácilmente diseñadas por una persona de experiencia ordinaria en la técnica de la química sintética.
Los análogos de tamandarina y didemnina también pueden prepararse mediante un procedimiento que incluye la incorporación de un resto desoxo-prolina o un resto deshidro-prolina a la cadena lateral de un análogo de tamandarina o didemnina. El resto desoxo-prolina o el resto deshidro-prolina puede usarse en lugar de un resto prolina en cualquier análogo de tamandarina o didemnina conocido. Los análogos de didemnina y tamandarina que se contemplan particularmente son aquellos en los que el resto desoxoprolina o el resto deshidro-prolina está ligado al macrociclo mediante un resto leucina que tiene un resto amina metilada (es decir, un análogo de tamandarina o didemnina que contiene -(N-metil)leucina-(desoxo o deshidro)-prolina). Por supuesto, el resto (desoxo o deshidro)-prolina puede estar sustituido adicionalmente, por ejemplo por lactato, por piruvato, por lactato-fluoróforo, por lactato-glutamina-piroglutamato, por lactato-glutamina-ciclopentanoato, por -alanina-leucina-piroglutamato, o por -(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato. Uno o más de los restos (desoxo o deshidro)-prolina, lactato, glutamina, piroglutamato, ciclopentanoato y alanina es preferiblemente el enantiómero (S).
La incorporación de un resto desoxoprolina puede lograrse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Ejemplos de procedimientos para incorporar un residuo desoxo-prolina se incluyen en esta descripción en el Ejemplo 5 y en las Figuras 41-43.
En una realización, el procedimiento de incorporar un resto desoxoprolina comprende proteger los restos hidroxilo y amina de leucina, metilar el resto amina de leucina y desproteger el resto amina de leucina. Se protege el grupo amina de prolina y la función éster de la prolina se reduce a un aldehído (por ejemplo, usando una base fuerte tal como LiBH_{4} junto con oxidación con un agente oxidante tal como piridina-SO_{3}-. Puede usarse la aminación reductora (por ejemplo, en presencia de un disolvente no acuoso, una base fuerte y un catalizador de ácido carboxílico; por ejemplo, en presencia de Na (AcO)_{3}BH, AcOH y CH_{2}Cl_{2}) para acoplar la leucina con el hidroxilo protegido con la prolina con amina protegida (por ejemplo, para formar el compuesto 43 de la Figura 43, en una realización). La aminación reductora, por ejemplo, puede realizarse tal como describen Abdel-Magid y colaboradores (por ejemplo, Abdel-Magid y cols. 1990, Tetrahedron Lett.. 31:5595-5598: Abdel-Magid y cols., 1990, Syn. Lett. 537-539).
El dipéptido leucina-desoxo-prolina resultante puede sustituirse adicionalmente con otros restos (por ejemplo, con -lactato, -piruvato, -lactato-fluoróforo, -lactato-glutamina-piroglutamato, -lactato-glutamina-ciclopentanoato, -alanina-leucina-piroglutamato, o -(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato), eliminando (preferiblemente) o no primero los grupos protectores. El dipéptido leucina-desoxo-prolina (de forma opcional sustituido adicionalmente) puede unirse a un macrociclo de tamandarina o didemnina en la posición que se identifica como R^{1} en las fórmulas I y XXI.
La incorporación de un resto deshidro-prolina puede lograrse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Ejemplos de procedimientos para incorporar un resto deshidro-prolina se incluyen en esta descripción en el Ejemplo 6 y en la Figura 44.
En una realización, el procedimiento de incorporar un resto deshidro-prolina comprende proteger los grupos carboxilo y amino de 4-hidroxiprolinato, mesilar el resto hidroxilo, desplazar el resto mesilato con un resto ariloselenilo, eliminar oxidativamente el resto ariloselenilo y desproteger el resto carboxilo. El resto hidroprolina resultante puede acoplarse a uno o más restos aminoacídicos o ácidos orgánicos adicionales (por ejemplo, los que se identifican en la presente memoria, eliminando el grupo protector amino si fuera necesario o se deseara) y acoplarse a un macrociclo de tamandarina o didemnina preparado u obtenido por medios convencionales.
Composiciones farmacéuticas
La invención comprende composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de los análogos de tamandarina y didemnina y los fragmentos fisiológicamente activos que se describen en la presente memoria. Tales composiciones pueden comprender el análogo/fragmento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. A modo de ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y un análogo de tamandarina o didemnina que tiene la estructura de cualquiera de las fórmulas I, XXI y (a)-(d) como agente activo. Como ejemplo adicional, una composición farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más de los compuestos que se representan en las Figuras en esta descripción.
Tales composiciones farmacéuticas pueden usarse, por ejemplo, en los procedimientos que se describen en la presente memoria para inhibir uno o más de síntesis de proteínas, progreso del ciclo celular, oncogénesis, crecimiento y proliferación en una célula. Además, tales composiciones pueden usarse en los procedimientos que se describen en la presente memoria para potenciar la apoptosis en una célula.
Las composiciones farmacéuticas que son de utilidad en los procedimientos de la invención pueden administrarse sistémicamente en formulaciones orales sólidas, oftálmicas, supositorios, aerosoles, tópicas u otras formulaciones similares. Además del agente, tales composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes que se sabe que mejoran y facilitan la administración de fármacos. También pueden usarse otras formulaciones posibles, tales como nanopartículas, liposomas, eritrocitos liberados y sistemas con base inmunológica para administrar el agente activo de acuerdo con los procedimientos de la invención.
La invención engloba composiciones farmacéuticas que están formadas por el agente activo, en una forma adecuada para la administración a un sujeto o la composición farmacéutica puede comprender el agente activo y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales, o alguna combinación de éstos. El agente activo puede estar presente en la composición farmacéutica en forma de un éster o salfisiológicamente aceptable, tal como combinado con un catión o anión fisiológicamente aceptable, tal como es notorio en la técnica.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas que se describen en la presente memoria pueden prepararse mediante cualquier procedimiento conocido o desarrollado a partir de ahora en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen la etapa de asociar el agente activo a un vehículo u otro u otros ingrediente(s) accesorio(s) y después, si fuera necesario o deseable, modelar o envasar el producto en una unidad modosis o multidosis.
Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en la presente memoria se refieren principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración ética a seres humanos, una persona de experiencia en la técnica entenderá que tales composiciones son adecuadas de forma general para la administración a animales de todo tipo. La modificación de composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a seres humanos para hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a diversos animales es bien entendida y el farmacólogo veterinario de experiencia ordinaria puede diseñar y realizar tal modificación con una experimentación ordinaria, si fuera necesaria. Los sujetos para los que se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero sin limitación, seres humanos y otros primates y mamíferos que incluyen mamíferos de relevancia comercial tales como ganado vacuno, porcino, caballar, ovino, gatos y perros.
Las composiciones farmacéuticas que son de utilidad en los procedimientos de la invención pueden prepararse, envasarse o venderse en formulaciones adecuadas para la administración oral, rectal, vaginal, parenteral, tópica, pulmonar, intranasal, bucal, oftálmica u otra. Otras formulaciones contempladas incluyen nanopartículas, preparaciones con liposomas, eritrocitos liberados que contienen el agente activo y formulaciones con base inmunológica.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse a granel, en forma de monodosis o de una pluralidad de monodosis. Tal como se usa en la presente memoria, una "monodosis" es una cantidad independiente de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del agente activo. La cantidad del agente activo es generalmente igual a la dosis del agente activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de tal dosificación tal como, por ejemplo la mitad o un tercio de tal dosificación.
Además del agente activo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender además uno o más agentes farmacéuticamente activos tales como otros agentes para el tratamiento de tumores, otros agentes antiinfecciosos y similares.
Las formulaciones de liberación controlada o mantenida de una composición farmacéutica de la invención pueden prepararse usando tecnología convencional.
Una formulación de una composición farmacéutica de la invención adecuada para la administración oral puede prepararse, envasarse o venderse en forma de una monodosis sólida que incluye, pero sin limitación, un comprimido, una cápsula dura o blanda, una oblea, un trocisco o una pastilla, que contienen cada uno una cantidad predeterminada del agente activo. Otras formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen, pero sin limitación, una formulación en polvo o granulada, una suspensión acuosa u oleosa, una solución acuosa u oleosa, o una emulsión.
Tal como se usa en la presente memoria, un líquido "oleoso" es uno que comprende una molécula líquida que contiene carbono y que muestra un carácter menos polar que el agua.
Un comprimido que comprende el agente activo puede prepararse, por ejemplo, comprimiendo o moldeando el agente activo, opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Los comprimidos por compresión pueden prepararse comprimiendo, en un dispositivo adecuado, el agente activo en forma fluida libre tal como un polvo o preparación granular, opcionalmente mezclado con uno o más de un aglutinante, un lubricante, un excipiente, un agente tensioactivo y un agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando, en un dispositivo adecuado, una mezcla del agente activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable y líquido suficiente al menos para humedecer la mezcla. Excipientes farmacéuticamente aceptables que se usan en la fabricación de comprimidos incluyen, pero sin limitación, diluyentes inertes, agentes de granulación y disgregación, agentes aglutinantes y agentes lubricantes. Agentes dispersantes incluyen, pero sin limitación, almidón de patata y almidónglicolato sódico. Agentes tensioactivos conocidos incluyen, pero sin limitación, laurilsulfato sódico. Diluyentes conocidos incluyen, pero sin limitación, carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, celulosa microcristalina, fosfato cálcico, hidrogenofosfato cálcico y fosfato sódico. Agentes de granulación y disgregación conocidos incluyen, pero sin limitación, almidón de maíz y alginato. Agentes aglutinantes conocidos incluyen, pero sin limitación, gelatina, goma arábiga, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona e hidroxipropilmetilcelulosa. Agentes lubricantes conocidos incluyen, pero sin limitación, estearato de magnesio, estearato, sílice y talco.
Los comprimidos pueden no estar recubiertos o ser recubiertos usando procedimientos conocidos para lograr la disgregación retardada en el tubo gastrointestinal de un sujeto, proporcionando así liberación y absorción mantenidas del agente activo. A modo de ejemplo, pueden usarse un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo para recubrir comprimidos. A modo de ejemplo adicional, los comprimidos pueden recubrirse usando procedimientos que se describen en las patentes de Estados Unidos números 4.256.108; 4.160.452; y 4.265.874 formando comprimidos de liberación controlada por ósmosis. Los comprimidos además pueden comprender un agente edulcorante, un agente aromatizante, un agente colorante, un conservante, o alguna combinación de estos para proporcionar una preparación farmacéuticamente elegante y agradable al paladar.
Cápsulas duras que comprenden el agente activo pueden prepararse usando una composición fisiológicamente degradable, tal como gelatina. Tales cápsulas duras comprenden el agente activo y pueden comprender además ingredientes adicionales que incluyen, por ejemplo, un diluyente sólido inerte tal como carbonato cálcico, fosfato cálcico o caolín.
Cápsulas de gelatina blanda que comprenden el agente activo pueden prepararse usando una composición fisiológicamente degradable, tal como gelatina. Tales cápsulas blandas comprenden el agente activo, que puede mezclarse con agua o un medio oleoso tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Las formulaciones líquidas de una composición farmacéutica de la invención que son adecuadas para la administración oral pueden prepararse, envasarse y venderse o en forma líquida o en forma de un producto seco para ser reconstituido con agua u otro vehículo adecuado antes de usar.
Las suspensiones líquidas pueden prepararse usando procedimientos convencionales para lograr una suspensión del agente activo en un vehículo acuoso u oleoso. Vehículos acuosos incluyen, por ejemplo, agua y solución salina. Vehículos oleosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico, aceites vegetales tales como de cacahuete, oliva, sésamo o coco, aceites vegetales fraccionados y aceites minerales tales como parafina líquida. Las suspensiones líquidas pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, agentes de suspensión, agentes dispersantes o humectantes, agentes emulsionantes, demulcentes, conservantes, tampones, sales, aromas, agentes colorantes y agentes edulcorantes. Las suspensiones oleosas además pueden comprender un agente espesante. Agentes de suspensión conocidos incluyen, pero sin limitación, jarabe de sorbitol, grasas comestibles hidrogenadas, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto, goma arábiga y derivados de celulosa tales como carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa. Agentes dispersantes o humectantes conocidos incluyen, pero sin limitación, fosfoglicéridos naturales tales como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, con un alcohol alifático de cadena larga, con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol o con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, estearato de polioxietileno, heptadecaetilenoxicetanol, sorbitolmonooleato de polioxietileno y sorbitanmonooleato de polioxietileno respectivamente). Agentes emulsionantes adecuados incluyen, pero sin limitación, lecitina y goma arábiga. Conservantes conocidos incluyen, pero sin limitación, parahidroxibenzoatos metílico, etílico y n-propílico, ascorbato y sorbato. Agentes edulcorantes conocidos incluyen, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, sacarosa y sacarina. Agentes espesantes conocidos para suspensiones oleosas incluyen, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura y alcohol cetílico.
Pueden prepararse soluciones líquidas del agente activo en disolventes acuosos u oleosos sustancialmente del mismo modo que las suspensiones líquidas, con la diferencia principal de que el agente activo se disuelve en lugar de suspenderse en el disolvente. Las soluciones líquidas de la composición farmacéutica de la invención pueden comprender cada uno de los componentes que se describen con respecto a suspensiones líquidas, entendiéndose que los agentes de suspensión no ayudarán necesariamente a la disolución del agente activo en el disolvente. Disolventes acuosos incluyen, por ejemplo, agua y solución salina isotónica. Disolventes oleosos incluyen, por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, oliva, sésamo o coco, aceites vegetales fraccionados y aceites minerales tales como parafina líquida.
Las formulaciones granuladas y en polvo de una preparación farmacéutica de la invención pueden prepararse usando procedimientos conocidos. Tales formulaciones pueden administrarse directamente a un sujeto, usarse por ejemplo para formar comprimidos, para cargar cápsulas o para preparar una suspensión o solución acuosa u oleosa mediante la adición de un vehículo acuoso u oleoso a las mismas. Cada una de estas formulaciones puede comprender además uno o más de un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y un conservante. También pueden incluirse en estas formulaciones excipientes adicionales, tales como cargas y agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes agentes.
Una composición farmacéutica de la invención también puede prepararse, envasarse o venderse en forma de emulsión de aceite en agua o de una emulsión de agua en aceite. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal tal como aceite de oliva o cacahuete, un aceite mineral tal como parafina líquida o una combinación de éstos. Tales composiciones además pueden comprender uno o más agentes emulsionantes tales como gomas naturales tales como goma arábiga o goma tragacanto, fosfoglicéridos naturales, tales como fosfoglicéridos de soja o lecitina, ésteres o ésteres parciales derivados de combinaciones de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como monooleato de sorbitano y productos de condensación de tales ésteres parciales con óxido de etileno tales como sorbitanomonooleato de polioxietileno. Estas emulsiones también pueden contener ingredientes adicionales que incluyen, por ejemplo, agentes edulcorantes o aromatizantes.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para la administración rectal. Tal composición puede estar en forma, por ejemplo, de un supositorio, de una preparación de enema de retención y de una solución para la irrigación rectal o colónica.
Las formulaciones de supositorios pueden prepararse combinando el agente activo con un excipiente farmacéuticamente aceptable no irritante que sea sólido a la temperatura ambiente ordinaria (es decir, aproximadamente 20ºC) y que sea líquida a la temperatura rectal del sujeto (es decir,aproximadamente 37ºC en un ser humano sano). Excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, manteca de cacao, polietilenglicoles y diversos glicéridos. Las formulaciones de supositorios además pueden comprender diversos ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, antioxidantes y conservantes.
Las preparaciones o soluciones de enema de retención para la irrigación rectal o colónica pueden prepararse combinando el agente activo con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Tal como es notorio en la técnica, las preparaciones de enemas pueden administrarse usando y pueden envasarse en un dispositivo de administración adaptado a la anatomía rectal del sujeto. Las preparaciones de enemas pueden comprender además diversos ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, antioxidantes y conservantes.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para la administración vaginal. Tal composición puede estar en forma, por ejemplo, de un supositorio, un material que puede insertarse vaginalmente impregnado y recubierto tal como un tampón, una preparación en ducha o una solución para irrigación vaginal.
Los procedimientos para impregnar o recubrir un material con una composición química son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, procedimientos para depositar o unir una composición química sobre una superficie, procedimientos para incorporar una composición química a la estructura de un material durante la síntesis del material (es decir, tal como con un material fisiológicamente degradable) y procedimientos para absorber una solución o suspensión acuosa u oleosa sobre un material absorbente, con o sin el secado subsiguiente.
Las preparaciones o soluciones en ducha para la irrigación vaginal pueden prepararse combinando el agente activo con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Tal como es notorio en la técnica, las preparaciones en ducha pueden administrarse usando y pueden envasarse en un dispositivo de administración, adaptado a la anatomía vaginal de la sujeto. Las preparaciones en ducha pueden comprender además diversos ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, antioxidantes, antibióticos, agentes antifúngicos y conservantes.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral pueden comprender el agente activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Tales formulaciones pueden prepararse, envasarse o venderse en una forma adecuada para la administración embolada o para la administración continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, envasarse, o venderse en forma monodosis, tal como en ampollas o en envases multidosis que contienen un conservante. Las formulaciones para la administración parenteral incluyen, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación mantenida o biodegradables. Tales formulaciones además pueden comprender uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilización o dispersión. En una realización de una formulación para la administración parenteral, el agente activo se proporciona en forma seca (es decir en polvo o granulada) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua apirógena estéril) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse, envasarse o venderse en forma de una suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución puede formularse de acuerdo con la técnica conocida y puede comprender además del agente activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión que se describen en la presente memoria. Tales formulaciones inyectables estériles pueden prepararse usando un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero sin limitación, solución de Ringer; solución isotónica de cloruro sódico y aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones que pueden administrarse por vía parenteral que son de utilidad incluyen las que comprenden el agente activo en forma microcristalina, en una preparación de liposomas o como componente de un sistema de polímeros biodegradables. Las composiciones para la liberación o implante mantenido pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble o una sal escasamente soluble sal.
Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, pero sin limitación, preparaciones líquidas o semilíquidas tales como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua o agua en aceite tales como cremas, ungüentos o pastas y soluciones o suspensiones. Las formulaciones que pueden administrarse por vía tópica pueden comprender, por ejemplo, de aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (p/p) de agente activo, aunque la concentración del agente activo puede ser de hasta el límite de solubilidad del agente activo en el disolvente. Las formulaciones para la administración tópica pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales que se describen en la presente memoria.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para la administración pulmonar por vía bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprenden el agente activo y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 7 nanómetros y preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 nanómetros. Tales composiciones convenientemente están en forma de polvo seco para su administración usando un dispositivo que comprende un reservorio de polvo seco al que puede dirigirse un chorro de propelente para dispersar el polvo o usando un envase con disolvente autopropelente dispensador de polvo tal como un dispositivo que comprende el agente activo disuelto o suspendido en un propelente de punto de ebullición bajo, en un envase sellado. Preferiblemente, tal polvo está constituido por partículas en las que al menos el 98% de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 0,5 nanómetros y al menos el 95% de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 7 nanómetros. Más preferiblemente, al menos el 95% de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 1 nanómetro y al menos el 90% de las partículas en número tiene un diámetro inferior a 6 nanómetros. Las composiciones de polvo seco preferiblemente incluyen un diluyente en polvo fino sólido tal como azúcar y de forma conveniente se proporcionan en forma monodosis.
Los propelentes de punto de ebullición bajo generalmente incluyen propelentes líquidos que tienen un punto de ebullición inferior a 65ºF (18,33ºC) a presión atmosférica. Generalmente el propelente puede constituir del 50 al 99,9% (p/p)de la composición y el agente activo pude constituir del 0,1 al 20% (p/p) de la composición. El propelente además puede comprender ingredientes adicionales tales como un tensioactivo no iónico líquido o aniónico sólido o un diluyente sólido (que preferiblemente tiene un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el agente activo).
Las composiciones farmacéuticas de la invención formuladas para la administración pulmonar también pueden proporcionar el agente activo en forma de gotitas de solución o suspensión. Tales formulaciones pueden prepararse, envasarse o venderse en forma de soluciones o suspensiones acuosas o en alcoholes diluidos, opcionalmente estériles, que comprenden el agente activo y pueden administrarse de forma conveniente usando cualquier dispositivo de nebulización o atomización. Tales formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero sin limitación, un agente aromatizante tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponador, un agente tensioactivo o un conservante tal como hidroxibenzoato metílico. Las gotículas que proporciona esta vía de administración preferiblemente tienen un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 nanómetros.
Las formulaciones que se describen en la presente memoria como de utilidad para la administración pulmonar también son de utilidad para la administración intranasal de una composición farmacéutica de la invención.
Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo basto que comprende el agente activo y que tiene un tamaño medio de partícula de aproximadamente 0,2 a 500 micrómetros. Tal formulación se administra de la forma en la que se aspira el rape, es decir por inhalación rápida a través del pasaje nasal a partir de un envase del polvo que se mantiene cerca de las fosas.
Las formulaciones adecuadas para la administración nasal, por ejemplo, pueden comprender desde aproximadamente un mínimo del 0,1% (p/p) y hasta un máximo de 100% (p/p) del agente activo y puede comprender además uno o más de los ingredientes adicionales que se describen en la presente memoria.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para la administración bucal. Tales formulaciones, por ejemplo, pueden estar en forma de comprimidos o pastillas preparados usando procedimientos convencionales y por ejemplo, puede incluir de 0,1 a 20% (p/p) de agente activo, el equilibrio que comprende una composición que puede disolverse o degradarse oralmente y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales que se describen en la presente memoria. De forma alternativa, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo de una solución o suspensión en aerosol o atomizada que comprende el agente activo. Tales formulaciones en polvo aerosolizadas o en aerosol, cuando se dispersan, preferiblemente tienen un tamaño medio de partícula o gotícula en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 nanómetros y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales que se describen en la presente memoria.
Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse o venderse en una formulación adecuada para la administración oftálmica. Tales formulaciones, por ejemplo, pueden estar en forma de colirios que incluyen, por ejemplo, una solución o suspensión al 0,1-1,0% (p/p) del agente activo en un vehículo líquido acuoso u oleoso. Tales colirios pueden comprender además agentes tamponadores, sales, u otro u otros de los ingredientes adicionales que se describen en la presente memoria. Otras formulaciones que pueden administrarse por vía oftálmica que son de utilidad incluyen las que comprenden el agente activo en forma microcristalina o en una preparación en liposomas.
Tal como se usa en la presente memoria, "ingredientes adicionales" incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes; excipientes; agentes tensioactivos; agentes dispersantes; diluyentes inertes; agentes de granulación y disgregantes; agentes aglutinantes; agentes lubricantes; agentes edulcorantes; agentes aromatizantes; agentes colorantes; conservantes; composiciones fisiológicamente degradables tales como gelatina; vehículos y disolventes acuosos; vehículos y disolventes oleosos; agentes de suspensión; agentes de dispersión o humectantes; agentes emulsionantes, demulcentes; tampones; sales; agentes espesantes; cargas; agentes emulsionantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Otros "ingredientes adicionales" que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas de la invención son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo en Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, que se incorpora a la presente memoria por referencia.
Las cantidades del agente activo, del vehículo farmacéuticamente aceptable y de cualesquiera ingredientes adicionales de una composición farmacéutica de la invención variarán dependiendo de la identidad, tamaño y tipo y gravedad de la afección del sujeto tratado y dependiendo además de la vía por la va a administrarse la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1% y 100% (p/p) del agente activo.
Típicamente, las dosificaciones del agente activo que pueden administrarse a un animal, preferiblemente un ser humano, variaran en una cantidad desde 1 microgramo a aproximadamente 100 gramos por kilogramo de peso corporal del animal. Aunque la dosis precisa administrada variará dependiendo de cualquier número de factores, que incluyen pero sin limitación, el tipo de animal y tipo de estado de enfermedad que se esté tratando, la edad del animal y la vía de administración. Preferiblemente, la dosificación del agente activo variará desde aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 10 g por kilogramo de peso corporal del animal. Más preferiblemente, la dosificación variará desde aproximadamente 10 miligramos a aproximadamente 1 gramo por kilogramo de peso corporal del animal. De forma alternativa, la dosificación puede determinarse en unidades de metros cuadrados de superficie corporal de un animal (es decir, miligramos o kilogramos por metro cuadrado, mg/m^{2} o kg/m^{2}). Preferiblemente, esta dosis variará desde aproximadamente 0,1 miligramo a aproximadamente 5 gramos por metro cuadrado de superficie corporal del animal. Más preferiblemente, la dosificación variará desde aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 1 gramos por metro cuadrado de superficie corporal del animal.
El agente activo puede administrarse a un animal con una frecuencia de hasta varias veces al día, o puede administrarse con una frecuencia menor, tal como una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes o con una frecuencia incluso menor, tal como una vez cada varios meses o incluso una vez al año o menos. La frecuencia de la dosis puede determinarla una persona de experiencia en la técnica y depende de diversos factores que incluyen, pero sin limitación, el tipo y gravedad de la enfermedad que se está tratando, el tipo y edad del animal, etc.
La invención se describe ahora haciendo referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan con fines únicamente ilustrativos y la invención no está limitada por estos Ejemplos, sino que engloba todas las variaciones que son evidentes como resultado de las enseñanzas que se proporcionan en la presente memoria.
Ejemplos
A continuación se presentan los reactivos y procedimientos que se usaron en los Ejemplos.
A no ser que se indique lo contrario, todas las reacciones se realizaron en presencia de atmósfera inerte (por ejemplo, argón o nitrógeno). Todos los disolventes eran de pureza analítica (por ejemplo, disolventes para destilación, disolventes de cromatografía y disolventes de procesamiento de la reacción) o de calidad para HPLC (es decir, disolventes de reacción). El éter dietílico anhidro y el tetrahidrofurano (THF) se destilaron a partir de sodio y benzofenona. El intervalo de punto de ebullición del hexano que se usó era de 38-55ºC. El cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}), el benceno, el tolueno y la N,N-dimetilformamida (DMF) se destilaron a partir de hidruro cálcico (CaH_{2}). Los ácidos y bases orgánicos eran de pureza analítica. La trietilamina (Et_{3}N), la diisopropiletilamina (DIPEA), la morfolina y la N-metilmorfolina se destilaron a partir de hidruro cálcico (CaH_{2}). Todos los otros reactivos, que incluyen dimetilaminofenol y 1,3-acetonadicarboxilato dietílico, eran de la pureza más alta disponible en el mercado. La cromatografía analítica en capa fina (TLC) se realizó usando placas de gel de sílice de EM Separations Tech/Merck (60-F254) de (0,25 milímetros) recubiertas previamente con un indicador fluorescente. La visualización se realizó usando luz ultravioleta (254 nanómetros), ácido fosfomolíbdico (al 7% p/v) en etanol al 95%. Los puntos de fusión (pf) se determinaron usando un aparato de punto de fusión capilar Thomas-Hoover y se expresan sin corrección. Los espectros de protones y de resonancia magnética de carbono (RMN de ^{1}H y ^{13}C, respectivamente) se registraron en un espectrómetro por transformada de Fourier Bruker AM-500 (500 MHz) y los desplazamientos químicos se expresaron en partes por millón (ppm) relativas a CHCl_{3} como patrón interno (7,24 ppm para ^{1}H y 77,0 para ^{13}C). Las multiplicidades se denominan singlete (s), doblete (d), doblete de dobletes (dd), doblete de tripletes (dt), triplete (t), cuartete (q) multiplete (m) y singlete ancho (brs). Los espectros infrarrojos (IR) se obtuvieron usando un espectrofotómetro Perkin-Elmer Modelo 1600 FT-IR. Las absorciones se expresan en números de onda (cm^{-1}). Las rotaciones ópticas (en grados) se midideron usando un polarímetro Perkin-Elmer Modelo 341. Los espectros de masas de alta resolución (EMAR) se obtuvieron usando o un VG 70-70HS o un Micromass AutoSpect. Los análisis elementales se realizaron usando un analizador Perkin-Elmer 2400 Series II CHNS/O. La cromatografía ultrarrápida en columna se realizó usando gel de sílice Merck 60 (malla de 240-400) usando los sistemas de disolventes que se indican para los experimentos individuales.
Ejemplo 1 Síntesis total de (-)tamandarina A
En este ejemplo se describe un procedimiento para sintetizar (-) tamandarina A. El procedimiento se ilustra en la Figura 26. El procedimiento se inicia mediante la síntesis del compuesto 13, que se representa en la Figura 26A.
Reacción A de la Figura 26A: Síntesis del Compuesto 8
Una solución que comprende 5,13 mililitros (36,9 milimoles) de Et_{3}N se añadió gota a gota a una solución que comprendía 1,56 gramos (11,9 milimoles) de compuesto 7, D-alo-isoleucina y 50 mililitros de CH_{2}Cl_{2} recién destilado a 0ºC. A la mezcla resultante se añadieron 3,114 gramos (12,5 milimoles) de carbobenciloxisuccinimida (Cbz-succinimida). Esta reacción se agitó a 0ºC durante 1 hora y se mantuvo agitando a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de reacción se concentró, se diluyó con 20 mililitros de una solución saturada de NaHCl y se lavó dos veces con alícuotas de 10 mililitros de éter. Las fases de éter combinadas se extrajeron con 10 mililitros de una solución saturada de bicarbonato sódico (NaHCO_{3}). Las fases acuosas combinadas se enfriaron a 0ºC, se acidificaron a pH 2 mediante la adición gota a gota de KHSO_{4} 1 normal y se extrajeron tres veces con 20 mililitros de acetato de etilo (EtOAc). Las fases de EtOAc se combinaron, se lavaron con 20 mililitros de una solución saturada de NaCl y se secaron en presencia de sulfato sódico anhidro (Na_{2}SO_{4}). La solución resultante se filtró y se concentró a presión reducida proporcionando 3,13 gramos del compuesto 8 (rendimiento del 99%). El Compuesto 8 se obtuvo en forma de un aceite incoloro y se usó directamente en la etapa siguiente sin purificación. Los datos analíticos para el Compuesto 8 fueron los siguientes: R_{f} 0,08 (acetato de etilo:hexano 20:80); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,86-0,90 (m, 3H), 0,93-0,97 (m, 3H), 1,20-1,27 (m, 1H) y 1,42-1,47 (m, 1H), 1,98-2,09 (m, 1H), 4,47-4,50 (dd, J_{1} = 9,1 Hz, J_{2} = 3,4 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,17-5,19 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,29-7,35 (m, 5H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 11,69, 14,35, 26,20, 37,42, 56,9,6, 67,20, 128,14, 128,24, 128,55, 135,06, 156,42, 177,41; IR (CHCl_{3}) 2470-3540, 3440, 2980, 2950, 2890, 1720, 1510, 1455, 1405, 1385, 1325-1355, 1230-1280, 1165, 1095, 1040, 1005, 910 cm^{-1}.
Reacciones B y C de la Figura 26A: Síntesis del Compuesto 10
Una solución que comprendía 3,534 gramos (13,3 milimoles) del Compuesto 8 (es decir, Cbz-D-alo-isoleucina) y 50 mililitros de CH_{2}Cl_{2} anhidro se enfrió en un baño de hielo a 0ºC. Cada uno de los siguientes se añadió en forma sólida a la solución fría: 2,574 gramos (14,0 milimoles) de pentafluorofenol (PFPOH), 3,064 gramos (16,0 milimoles) de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC\cdotHCl) y 0,325 gramos (2,7 milimoles) de 4-dimetilaminopiridina (DMAP). La mezcla resultante se mantuvo a 0ºC durante media hora agitando y a temperatura ambiente durante 4 horas más. La mezcla se diluyó con 50 mililitros de CH_{2}Cl_{2}. La fase de CH_{2}Cl_{2} se lavó una vez usando 25 mililitros de una solución al 10% de ácido clorhídrico (HCl), una vez usando 25 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 25 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase lavada de CH_{2}Cl_{2} se secó en presencia de Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró a presión reducida. El éster de PFP resultante, el compuesto 9 (5,70 gramos), se obtuvo en forma de un aceite incoloro y se usó en la etapa siguiente sin purificación. Para el compuesto 9 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,52 (EtOAc:hexano 20:80); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,90-1,12 (m, 6H), 1,29-1,39 (m, 1H) y 1,45-1,52 (m, 1H), 2,05-2,15 (m, 1H), 4,79-4,84 (m, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,12-5,14 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,29-7,37 (m, 5H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 11,68, 14,25, 26,24, 37,64, 57,09, 67,45, 128,20, 128,35, 128,59 y 135,95, 136,9, 139,0, 140,0 y 142,0,156,13, 168,87.
Una solución que comprendía 5,70 gramos del compuesto 9 y 25 mililitros de THF anhidro se enfrió a -78ºC. Se preparó una solución en enolato que comprendía el enolato de litio de acetato de metilo enfriando una solución que comprendía 49,2 milimoles de dialdehído de litio y 25 mililitros de THF anhidro en un baño de hielo carbónico a -78ºC, añadiendo a la solución 3,92 mililitros (49,2 milimoles) de acetato de metilo mediante una jeringuilla y manteniendo la solución resultante en agitación a -78ºC durante 1 hora. La solución de enolato resultante se añadió gota a gota a la solución que comprendía el compuesto 9 y la mezcla resultante se mantuvo agitando durante 0,75 horas a -78ºC. La reacción se inactivó a -78ºC añadiendo 50 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio acuoso (NH_{4}Cl). La reacción inactivada se llevó a temperatura ambiente y el THF se eliminó a presión reducida. La solución acuosa resultante se extrajo 3 veces con alícuotas de 25 mililitros de CH_{2}Cl_{2}. Las fases de CH_{2}Cl_{2} combinadas se lavaron una vez usando 25 mililitros de una solución al 10% de ácido clorhídrico (HCl), una vez usando 25 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 25 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase de CH_{2}Cl_{2} lavada se secó en presencia de Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró a presión reducida. Esta reacción proporcionó un aceite amarillo que se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna. El aceite amarillo se aplicó a una columna de gel de sílice y se eluyó con una solución que comprendía EtOAc y hexano en una proporción de 10 a 95, respectivamente. El producto obtenido de la cromatografía era de 3,42 gramos de un aceite incoloro que correspondía al \beta-cetoéster, compuesto 10. El rendimiento del compuesto 10 fue del 80%, según se calculó para ambas reacciones B y C. Para el compuesto 10 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,42 (EtOAc:hexano 35:65); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,75-0,79 (m, 3H), 0,90-0,98 (m,3H), 1,26-1,30 (m, 1H) y 1,42-1,46 (m, 1H), 1,97-1,99 (m, 1H), 3,53 (s, 2H), 3,72 (s, 3H), 4,56-4,58 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,26-5,28 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 7,30-7,36 (m, 5H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 11,83, 13,79, 26,83, 36,12, 46,56, 52,46, 63,00, 67,19, 128,10, 128,24, 128,56, 136,16, 156,42, 166,96, 201,68: IR (CHCl_{3}) 3349,1, 2964,4, 1748,3, 1712,9, 1520,6, 1454,8, 1328,2, 1232,1 cm^{-1}: EMAR m/z calculada para C_{17}H_{23}NO_{5}Na (M^{+}Na^{+}): 344,1498, hallada 344,1490: [\alpha]_{D}^{20} -27,85 (c 0,53 CHCl_{3}); Anal. calculada para C_{17}H_{23}NO_{5}: C, 63,52; H, 7,22; N, 4,36. Hallada: C, 63,32; H, 7,15; N, 4,24.
Reacción D de la Figura 26A: Síntesis del Compuesto 11
Una solución que comprendía 2,797 gramos (8,7 milimoles) del compuesto 10 y 30 mililitros de metanol (MeOH) de calidad para HPLC se enfrió a -78ºC y se añadieron 1,644 gramos (30,5 milimoles) de borohidruro potásico (KBH_{4}) en porciones. La mezcla resultante inicialmente se mantuvo agitando a -78ºC durante 10 minutos. El recipiente de reacción después se calentó a -20ºC y se mantuvo agitando durante 30 minutos, después de lo cual, el recipiente de reacción se calentó a 0ºC y se mantuvo agitando durante 10 minutos. La mezcla resultante se inactivó a 0ºC añadiendo gota a gota una solución que comprendía ácido acético glacial hasta que el pH de la fase acuosa era no menos de pH 6 al analizar con papel de tornasol. La solución bifásica resultante neutralizada se concentró a presión reducida y se añadieron 50 mililitros de una solución que comprendía EtOAc y H_{2}O en una proporción de 1 a 1. La fase orgánica se separó de la fase acuosa y se lavó con 10 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase orgánica lavada se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} se filtró y se concentró a presión reducida. El producto en bruto así obtenido era de 2,786 gramos de un aceite incoloro constituido por una proporción 11:1 del compuesto 11 y su estereosiómero, respectivamente. La cristalización del aceite incoloro en una solución que comprendía éter y hexano proporcionó el compuesto 11 puro en forma de un sólido cristalino blanco con un rendimiento del 99%. Para el compuesto 11 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,29 (EtOAc:hexano 35:65); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,83-0,85 (m, 3H), 0,89-0,92 (m, 3H), 1,19-1,23 (m, 1H) y 1,32-1,34 (m, 1H), 1,91,1,93 (m, 1H), 2,45-2,51 (dd, J_{1} = 16,7 Hz, J_{2} = 9,1 Hz, 1H) y 2,58-2,62 (dd, J_{1} = 16,7 Hz, J_{2} = 2,7 Hz, 1H), 3,12-3,14 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,90-3,91 (m, 1H), 4,62-4,65 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,07-5,08 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 7,29-7,35 (m, 5H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 12,10, 13,64, 27,52, 34,28, 38,74, 52,25, 57,57, 67,39, 69,43, 128,50, 128,61, 128,97 y 136,82, 157,08, 174,09; IR (CHCl_{3}) 3421, 3316, 2951, 1709, 1537, 1443, 1229 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{17}H_{25}NO_{5}Na (M^{+}Na^{+}): 346,1630, hallada 346,1645; [\alpha]_{D}^{20} -10,9 (c 0,595, CHCl_{3}); Anal. calculada para C_{17}H_{25}NO_{5}: C, 63,12; H, 7,80, N,4,33. Hallada: C, 63,23; H, 7,85; N, 4,06.
Reacción E de la Figura 26A: Síntesis del Compuesto 12
Una solución que comprendía 0,8636 gramos (2,67 milimoles) de compuesto 11 en forma de un aceite incoloro y 10 mililitros de CH_{2}Cl_{2} se introdujo en atmósfera de argón y se enfrió a 0ºC. Se añadió una solución que comprendía 0,778 mililitros (6,68 milimoles) de 2,6-lutidina, seguida de la adición de una solución que comprendía 1,08 mililitros (4,01 milimoles) de triflato de triisopropilsililo (i-Pr_{3}SiOTf). La mezcla de reacción inicialmente se mantuvo agitando a 0ºC durante 30 minutos, después de lo cual, la mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla resultante se diluyó con 20 mililitros de CH_{2}Cl_{2}. La fase de CH_{2}Cl_{2} se lavó una vez usando 15 mililitros de una solución al 10% de ácido clorhídrico (HCl), una vez usando 15 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 15 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase de CH_{2}Cl_{2} lavadaresultantese secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión. El residuo concentrado se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna, eluyendo con soluciones formadas por éter y hexano en una proporción desde 2 a 98, respectivamente, hasta 15 a 85, respectivamente. La cromatografía proporcionó 1,204 gramos (rendimiento del 94%) del compuesto 12 como isómero principal en forma de un aceite incoloro. Para el compuesto 12 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,65 (EtOAc:hexano 35:65); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,84-0,91 (m, 6H), 0,99-1,05 (m, 21 H), 1,12-1,34 (m, 2H), 1,81-1,84(m, 1H), 2,54-2,62 (m, 2H), 3,54 (s, 3H), 3,73-3,75 (m, 1H), 4,34-4,36 (m,1H), 4,69-4,71 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 5,01-5,04 (d, J = 12,3 Hz, 1H) y 5,09-5,11 (d, J = 12,3 Hz, 1H), 7,28-7,34 (m, 5H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 12,50, 12,74, 13,97, 18,08, 27,44, 34,40, 40,45, 51,54, 58,62, 66,67, 70,49, 128,03, 128,08, 128,46 y 136,67, 156,51, 172,00; IR (CHCl_{3}) 3450, 3359, 2944, 2863, 1728, 1510, 1459, 1434, 1384, 1308, 1232, 1171, 1090 cm^{-1} ; EMAR m/z calculada para C_{26}H_{45}NSiO_{5}Na (M^{+}Na^{+}): 480,3145, hallada 480,3128; [\alpha]_{D}^{20} +15,88 (c 0,57, CHCl_{3}); Anal. calculada para C_{17}H_{25}NO_{5}: C, 65,09; H, 9,46, N, 2,92. Hallada: C, 64,80; H, 9,41, N, 2,69.
Reacción F de la Figura 26A: Síntesis del Compuesto 13
Una solución que comprendía NaOH 1 normal (20 mililitros, 11 milimoles) se añadió a una solución que comprendía 0,84 gramos (1,753 milimoles) de compuesto 12, 10 mililitros de THF y 10 mililitros de MeOH, enfriado a 0ºC. Esta mezcla de reacción se mantuvo agitando a 0ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción después se mantuvo agitando a temperatura ambiente toda la noche. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se diluyó con 10 mililitros de H_{2}O. La mezcla resultante se enfrió a 0ºC en un baño de hielo, se acidificó a pH 2 añadiendo una solución que comprendía KHSO_{4} 1 normal y se extrajo 3 veces con alícuotas de 10 mililitros deEtOAc. Las fases de EtOAc se combinaron, se lavaron con 10 mililitros de una solución saturada de NaCl, se secaron en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron. Esta reacción proporcionó 0,7709 gramos (rendimiento del 95%) del compuesto 13 en forma de una espuma blanca. El compuesto 13 se usó en la reacción subsiguiente sin purificación. Los datos analíticos para el compuesto 13 fueron los siguientes: R_{f}, 0,08 (acetato de etilo:hexano 35:65); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,86-1,00 (m, 6H), 1,06-1,08 (m, 21H), 1,19-1,24 (m, 1H) y 1,64-1,72 (m, 1H), 1,85-1,92 (m, 1H), 2,50-2,80 (m, 2H), 3,60-3,80 (m, 1H), 4,28-4,33 (m, 1H), 4,86-4,88 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 5,06-5,22 (m, 2H), 7,29-7,45 (m, 5H).
Reacción G de la Figura 26B: Síntesis del Compuesto 15
La síntesis de una forma protegida de (2S)-\alpha-hidroxiisovalerilisostatina (6) se representa en la Figura 26B. En la reacción G de la Figura 26B, Li-valina (14), se disolvió en una solución que comprendía nitrito sódico (NaNO_{2}) y ácido sulfúrico 1 normal (H_{2}SO_{4}). La reacción se llevó a cabo usando un procedimiento estándar tal como se describe por ejemplo en Green y Wutz (1999, Protecting Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York) o Bodansky (1993, Principles of Peptide Synthesis, Springer, Berlín).
Esta reacción proporcionó \alpha-hidroxivalina (15).
Reacción H de la Figura 26B: Síntesis del Compuesto 16
En la reacción H, se añadieron 2,46 gramos (17,78 milimoles) de carbonato potásico anhidro (K_{2}CO_{3}) y 1,25 gramos (3,4 milimoles) de yoduro de tetrabutilamonio (Bu_{4}NI) a una solución que comprendía 2 gramos (16,93 milimoles) de \alpha-hidroxivalina (15) y 20 mililitros de DMF redestilada seguido de la adición gota a gota de 5,86 mililitros (67,72 milimoles) de bromuro de alilo. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, se diluyó con 20 mililitros de H_{2}O y se extrajo tres veces con alícuotas de 20 mililitros de éter. Las fases orgánicas combinadas se lavaron una vez usando 15 mililitros de una solución al 10% de ácido clorhídrico (HCl), una vez usando 15 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 15 mililitros de una solución saturada de NaCl. Las fases orgánicas lavadas resultantes se secaron en presencia de Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a presión reducida. Esta reacción proporcionó 2,53 gramos (rendimiento del 96%) de compuesto 16 en forma de un aceite naranja. El Compuesto 16 se usó en la reacción subsiguiente sin purificación. Para el compuesto 16 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,50 (EtOAc:hexano 25:75); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,71-0,86 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,92-1,00 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 2,04-2,10 (m, 1H), 2,65-2,66 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,03-4,05 (dd, J_{1} = 5,9 Hz, J_{2} = 3,5 Hz, 1H), 4,62-4,70 (m, 2H), 5,24-5,27 (dd, J_{1} = 10,4 Hz, J_{2} = 1,1 Hz, 1H) y 5,31-5,35 (dd, J_{1} = 17,2 Hz, J_{2} = 3,5 Hz, 1H), 5,86-5,94 (m, 1H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta15,93, 18,76, 32,17, 66,04, 75,03, 119,12, 131,48, 174,62; IR (CHCl_{3}) 3521-3458, 2964, 2880, 1735, 1646, 1462, 1367, 1257, 1204, 1136, 1073, 1026, 983, 931 cm^{-1}.
Reacción I de la Figura 26B: Síntesis del Compuesto 17
Una solución que comprendía 0,6827 gramos (1,47 milimoles) de compuesto 13 y 2,5 mililitros de tolueno recién destilado se introdujo en atmósfera inerte y se enfrió a 0ºC. Se añadió una solución que comprendía 0,232 gramos (1,47 milimoles) de compuesto 16 y 2,5 mililitros de tolueno gota a gota a la solución fría de compuesto 13, seguida de la adición de 0,333 gramos (1,61 milimoles) de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 0,036 gramos (0,29 milimoles) de DMAP. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 2 horas y se mantuvo a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se inactivó añadiendo 2 mililitros de una solución que comprendía MeOH y ácido acético (AcOH) en una proporción de 1:2 y EtOAc y se agitó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla resultante se concentró a presión reducida. El residuo que quedó tras este procedimiento se disolvió en 10 mililitros de éter, lo que provocó la formación de un sólido, que se eliminó por filtración. El filtrado se lavó una vez usando 10 mililitros de una solución al 10% de ácido cítrico, una vez usando 10 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 10 mililitros de solución de salmuera (es decir, un solución saturada de NaCl). La fase orgánica se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna, eluyendo con una mezcla de disolventes que comprendía éter y hexano en una proporción desde 2 a 98, respectivamente, hasta 12 a 88 respectivamente. La concentración del eluyente a presión reducida proporcionó 0,5774 gramos (rendimiento del 65%) de compuesto 11 en forma de un aceite incoloro. Para el compuesto 17 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,55 (acetato de etilo:hexano 20:80); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,85-1,08 (m, 33H), 1,16-1,19 (m, 1H), 1,34-1,36 (m, 1H), 1,80-1,82 (m, 1H), 2,18-2,21 (m, 1H), 2,68-2,73 (m, 2H), 3,78-3,82 (m, 1H), 4,37-4,42 (m, 1H), 4,55-4,64 (m, 2H), 4,77-4,78 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,86-4,88 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 5,07 (s, 2H), 5,21-5,23 (dd, J_{1} = 9,4 Hz, J_{2} = 0,9 Hz, 1H), 5,28-5,32 (dd, J_{1} = 17,0 Hz, J_{2} = 1,2 Hz, 1H), 5,83-5,87 (m, 1H), 7,27-7,34 (m, 5H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 12,69, 12,93, 14,14, 17,25, 18,12, 18,78, 26,33, 29,98, 34,48, 40,28, 58,15, 66,69, 68,67, 70,66, 76,74, 118,82, 128,01, 128,40, 128,47, 136,75, 131,63, 156,48, 169,13, 170,78; IR (CHCl_{3}) 3380, 2964, 2861, 1743, 1508, 1463, 1374, 1201, 1129, 994, 882 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{33}H_{55}NSiO_{7}Na (M^{+}Na^{+}): 628,364552. hallada 628,365878; Anal. calculada para C_{33}H_{55}NSiO_{7}: C, 65,41; H, 9,16. Hallada: C, 65,09; H, 9,05.
Reacción J de la Figura 26B: Síntesis del Compuesto 6
En la reacción J, se añadió tetrakis(trifenilfosfina)paladio (Pd(PPh_{3})_{4}, 0,044 gramos, 0,038 milimoles) a una solución que comprendía 0,2315 gramos (0,38 milimoles) del éster arílico de isostatina-Hiv, compuesto 17, y 3 mililitros de THF recién destilado. Se añadió morfolina recién destilada (0,33 mililitros, 3,8 milimoles) gota a gota a la mezcla resultante. La adición de reactivos se realizó en una campana oscura y la mezcla de reacción se mantuvo agitando a temperatura ambiente y en una campana oscura durante al menos 8 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se diluyó con 5 mililitros de CH_{2}Cl_{2}. La solución obtenida por este procedimiento se lavó una vez con 5 mililitros de una solución que comprendía HCl 1 normal y una vez usando 5 mililitros de H_{2}O. La fase orgánica lavada se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en 5 mililitros de éter, se filtró y se concentró de nuevo a presión reducida. El residuo que quedó después de este procedimiento era una espuma blanca que correspondía al compuesto 6 (0,218 gramos, rendimiento cuantitativo). El compuesto 6 se usó en la reacción subsiguiente sin purificación.
La síntesis de un compuesto hexapéptido linear (20) se representa en la Figura 26C. El compuesto 5 se preparó tal como describen (Li y cols., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:7659-7672).
Reacción K de la Figura 26C: Síntesis del Compuesto 18
Una solución que comprendía 0,6653 gramos (0,74 milimoles) de compuesto 5 y 10 mililitros de MeOH se añadió a una suspensión que comprendía 0,1996 gramos de paladio al 10% sobre carbono (Pd/C), 10 mililitros de MeOH y 10 mililitros de EtOAc. La mezcla de reacción se agitó usando un aparato Parr durante 5 horas a temperatura ambiente. La suspensión resultante se filtró con Celite® y el Celite® se lavó con un exceso de una mezcla de disolventes que comprendía MeOH y EtOAc en una proporción de 1 a 1. El filtrado se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida proporcionando el compuesto 18 (0,552 gramos, rendimiento del 98%). El compuesto 18 (es decir, Leucilprolil-N,O-dimetiltirosina-N-Boc-O-SEM-treonina) se obtuvo en forma de un sólido blanco usando este procedimiento y se usó en la reacción subsiguiente sin purificación. Para el compuesto 18 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,03 (acetona:hexano 40:60); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta -0,001 (s, 9H), 0,64-0,86 (m, 2H), 0,88-0,96 (m, 6H), 1,19-1,21 (d, J = 6,3 Hz), 1,33-1,34 (d, J = 6,3 Hz, 3H, RI), 1,44 (s, 9H), 1,63-1,92 (m, 3H), 1,92-2,01, 2,08-2,24 (m, 4H), 2,73 (s, 3H), 2,86-2,96 (m), 3,10-3,19 (m, 2H), 3,45-3,72 (m, 4H), 3,75 (s, 3H), 4,34-4,69 (m, 3H), 4,78-4,81 (dd, J, = 8,0 Hz, J_{2} = 3,3 Hz, 1H), 5,01-5,10 (m, 1H), 5,17-5,52 (m), 7,58-7,60 (d, J = 9,7 Hz, 3H), 6,77-6,83 (m, 2H), 7,00-7,10 (m, 2H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta -1,46, 16,87, 17,96, 22,00, 23,19, 23,76, 25,14, 28,16, 29,31, 33,65, 39,31, 47,34, 50,54, 55,37, 55,46, 58,66, 62,25, 68,16, 72,36, 81,15, 89,83, 114,39, 128,75, 128,75, 130,47, 157,04, 158,84, 168,15, 168,95, 169,57, 173,13; IR (CHCl_{3}) 3285, 2951, 1740, 1709, 1641, 1511, 1448, 1365, 1250, 1161 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{37}H_{63}N_{4}SiO_{10} (M^{+}H^{+}): 751,4314, hallada 751,4343; [\alpha]_{D}^{20} -44,68 (c 1,03, CHCl_{3}); Anal. calculada para C_{37}H_{62}N_{4}SiO_{10}: C, 59,17; H, 8,33; N, 7,46. Hallada: C, 59,11; H, 8,35; N, 7,26.
Reacción L de la Figura 26C: Síntesis del Compuesto 19
En la reacción L, todo el producto del compuesto 6 de la reacción J se disolvió en 1 mililitro de CH_{2}Cl_{2} recién destilado y se enfrió a 0ºC. A esta solución se añadieron 0,074 gramos (0,40 milimoles) de PFPOH, 0,088 gramos, (0,46 milimoles) de EDAC-HCl y 0,0093 gramos (0,076 milimoles) de DMAP. La mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante otras 4 horas más y se diluyó con 10 mililitros de CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se lavó una vez usando 5 mililitros de una solución al 10% de HCl, una vez usando 5 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 5 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase de CH_{2}Cl_{2} se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna, eluyendo con una mezcla de disolventes que comprendía éter y hexano en una proporción desde 3 a 97, respectivamente, hasta 7 a 93 respectivamente. La concentración del eluyente a presión reducida proporcionó 0,2315 gramos de un aceite incoloro que correspondía al éster de PFP, compuesto 19 (rendimiento del 83% para la reacción J de la Figura 26B y la reacción L de la Figura 26C). Para el compuesto 19 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f}0,57(EtOAc:hexano 20:80); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,86-1,09 (m, 33H), 1,18-1,20 (m, 1H), 1,27,1,29 (m, 1H), 1,84,1,86 (m, 1H), 2,31-2,36 (m, 1H), 2,69-2,72 (m, 1H), 2,80-2,85 (m, 1H), 3,79-3,82 (m, 1H), 4,38-4,42 (m, 1H), 4,78-4,80 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 4,97-4,98 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,00-5,06 (m, 2H), 7,25-7,29 (m, 5H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 12,72, 12,95, 14,01, 17,20, 18,09, 18,45, 27,52, 30,19, 34,40, 40,12, 58,17, 65,82, 66,74, 70,47, 127,92, 128,18, 128,33, 136,57, 138,83, 140,06, 140,65, 141,97, 156,56, 165,68, 170,76; IR (CHCl_{3}) 3480, 2962, 2868, 1793, 1730, 1516, 1464, 1381, 1214, 1094, 995, 880 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{36}H_{50}NF_{5}SiO_{7}Na (M^{+}Na^{+}): 754,3174, hallada 754,3191.
Reacción M de la Figura 26C: Síntesis del Compuesto 20
Una solución que comprendía 0,2855 gramos (0,39 milimoles) de compuesto 19 y 1,5 mililitros de CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. A esta solución se añadieron 0,17 mililitros (0,98 milimoles) de DIEA gota a gota y la mezcla resultante se mantuvo agitando a 0ºC durante 20 minutos. Una solución que comprendía 0,522 gramos de compuesto 18, 0,0095 gramos (0,078 milimoles) de DMAP y 1,5 mililitros de CH_{2}Cl_{2} se añadió a la solución que comprendía el compuesto 19 usando una jeringuilla. La mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 1 hora y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora más. La reacción se inactivó a 0ºC añadiendo 3 mililitros de una solución saturada de NH_{4}Cl y diluyendo la reacción con 10 mililitros de CH_{2}Cl_{2}. La mezcla resultante se separó a temperatura ambiente. La fase acuosa se extrajo 3 veces usando alícuotas de 10 mililitros de CH_{2}Cl_{2} y las fases orgánicas combinadas se lavaron una vez usando 10 mililitros de una solución al 10% de HCl, una vez usando 10 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 10 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase orgánica lavada se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. Esta reacción proporcionó 0,4861 gramos (rendimiento del 96%) del hexapéptido precursor completamente protegido, el compuesto 20. El compuesto 20 se obtuvo en forma de un espuma blanca usando este procedimiento y se usó en la reacción subsiguiente sin purificación adiciona. Los datos analíticos para el hexapéptido 20 fueron los siguientes: R_{f} 0,47 (acetona: CH_{2}Cl_{2} 05:95); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta -0,0008 (s, 9H), 0,7-0,83 (m, 2H), 0,85-0,92 (m, 9H), 0,92-1,08 (m, 21H), 1,45 (s, 9H), 1,13-2,19 (m, 11H), 2,43-2,46 (m, 1H) y 2,54-2,58 (m, 1H), 2,64 y 2,88 (s, 3H, RI), 3,09-3,17 (m, 2H), 3,44-3,73 (m, 4H), 3,75 (s, 3H), 3,79-3,89 (m, 1H), 4,38-4,45 (m, 1H), 4,21-4,35 (m, 3H), 4,70-4,81 (m, 1H), 4,96-5,06 (m, 3H), 5,18-5,43 (m, 3H) y 8,32-8,34 (d, J = 9,0 Hz, 3H), 5,46-5,48 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 6,14-6,83 (m, 2H), 6,95-7,11 (m, 2H), 7,25-7,38 (m, 5H), 7,75-7,71 (d, J = 8,5 Hz) y 8,85-8,87 (d, J = 10,1 Hz, 2H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta -1,45, 11,73, 12,73, 14,47, 16,54, 17,73, 17,99, 18,14, 18,92, 21,40, 23,54, 24,42, 25,13, 28,21, 28,21, 29,20, 29,67, 30,13, 33,59, 34,86, 39,58, 39,73, 46,87, 49,04, 55,13, 55,39, 56,90, 58,94, 62,24, 66,42, 68,12, 70,96, 72,25, 78,71, 80,39, 89,85, 113,92, 114,37, 127,70, 127,76, 127,86, 128,35, 128,45, 128,81, 128,91, 137,01, 130,44, 130,86, 156,39, 158,40, 158,82, 169,20, 169,75, 169,97, 170,58, 171,77, 173,85; IR (CHCl_{3}) 3275, 2952, 2868, 1735, 1704, 1636, 1511, 1454, 1380, 1365, 1250, 1167, 1110, 1047 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{67}H_{111}N_{5}Si_{2}O_{16}Na (M^{+}Na^{+}): 1320,7462, hallada 1320,7520; [\alpha]_{D}^{20} -44,56 (c 1,13, CHCl_{3}); Anal. calculada para C_{67}H_{111}N_{5}Si_{2}O_{16}: C, 61,95; H, 8,62; N, 5,40. Hallada: C, 61,75: H, 8,59; N, 5,15.
La ciclación del hexapéptido 20 para proporcionar el compuesto 21 se representa en la Figura 26D.
Reacción N de la Figura 26D: Síntesis del Compuesto 21
Una solución que comprendía 0,3505 gramos (0,27 milimoles) de compuesto 20 y 5 mililitros de CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC y se añadieron 0,21 gramos (0,81 milimoles) de eterato de bromuro de magnesio (MgBr_{2}-Et_{2}O). La mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 2 horas y se mantuvo a temperatura ambiente durante otras 4 horas más. La mezcla de reacción se diluyó añadiendo 10 mililitros de CH_{2}Cl_{2} y se lavó una vez usando 10 mililitros de una solución al 10% de HCl y una vez usando 10 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase de CH_{2}Cl_{2} se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. La espuma blanca obtenida como producto de esta reacción de desprotección se usó en la reacción de hidrogenólisis subsiguiente sin purificación. Toda la espuma blanca producto (0,3195 gramos) se disolvió en 10 mililitros de MeOH y se sometió a hidrogenólisis tal como se describe para la preparación del compuesto 18. Esta reacción de hidrogenólisis proporcionó 0,296 gramos de una espuma blanca que se usaron en la reacción de acoplamiento subsiguiente sin purificación. El producto de la hidrogenólisis se disolvió en 27 mililitros de DMF recién destilada y se enfrió a 0ºC. A la solución fría se añadieron 0,123 gramos (0,32 milimoles) de hexafluorofosfato de 2-(1H-9-azobenzotriazol,1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), seguido de la adición gota a gota de 0,141 mililitros (0,81 milimoles) de DlEA. La mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 1 hora y se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante al menos 8 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, se diluyó con 10 mililitros de EtOAc y se lavó una vez usando 10 mililitros de una solución al 10% de HCl, una vez usando 10 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 10 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase de CH_{2}Cl_{2} se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo bruto obtenido a partir de este procedimiento se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna usando una mezcla de disolventes que comprendía acetona y hexano en una proporción desde 5 a 95, respectivamente, hasta 15 a 85, respectivamente. El eluyente resultante se concentró a presión reducida proporcionando 0,173 gramos del macrociclo protegido, compuesto 21 en forma de una espuma blanca. El rendimiento del compuesto 21 representa un rendimiento del 63% para las tres reacciones empezando por el compuesto 20 (es decir, las reacciones de desprotección, hidrogenólisis y acoplamiento). Para el compuesto 21 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,55 (acetona:hexano 30:70); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,78-1,07 (m, 39H), 1,21-1,48 (m, 17H), 1,56-1,92 (m, 4H), 1,95-2,11 (m, 2H), 2,4-2,44 (m, 1H), 3-11-3,17 (m, 1H), 2,53 (s, 3H), 2,89-3,02 (m, 1H), 3,30-3,34 (m, 1H), 3,49-3,52 (m, 1H), 3,60-3,62 (m, 1H), 3,66-3,70 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 4,14-4,19 (m, 1H), 4,37-4,43 (m, 1H), 4,46-4,48 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,55-4,86 (m, 1H), 4,88-4,91 (m), 7,60-7,68 (m, 4H), 6,82-8,83 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,06-7,07 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,41-7,48 (m, 2H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 12,24, 12,66, 14,21, 15,11, 15,61, 17,98, 18,60, 18,74, 19,31, 21,10, 23,92, 25,24, 27,21, 28,42, 30,48, 34,87, 37,92, 39,00, 41,65, 47,10, 48,52, 55,67, 56,16, 57,25, 63,26, 66,33, 68,65, 71,78, 80,46, 81,66, 114,50, 130,31, 130,82, 156,40, 159,01, 169,13, 170,90, 171,34, 172,78, 176,75; IR (CHCl_{3}) 3330, 2952, 2876, 1735, 1629, 1508, 1447, 1243, 1168, 1024, 843 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{53}H_{89}N_{5}SiO_{12}Na (N4^{+}Na^{+}): 1038,6175, hallada 1038,6166.
Las reacciones finales de la síntesis global de (-) Tamandarina A, 101, se representan en la Figura 26E. El compuesto 4 se preparó de la forma que se reseña anteriormente en Li y cols. (1990, J. Am. Chem. Soc. 112:7659-7672).
Reacción O de la Figura 26E: Síntesis del Compuesto 22
Una solución que comprendía 167 miligramos (0,165 milimoles) de macrociclo protegido (compuesto 21) y 20 mililitros de EtOAc se enfriaron a -30ºC. Se introdujo HCl gaseoso en la solución y la temperatura de la mezcla de reacción se mantuvo entre -10ºC y -20ºC durante la introducción de HCl. La mezcla de reacción se agitó y se mantuvo a una temperatura de entre -10ºC y -20ºC durante otros 30 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 0ºC y se mantuvo a 0ºC durante 1 hora. El recipiente de reacción se purgó con gas N_{2} durante al menos 30 minutos mientras que la temperatura del recipiente se mantenía a 0ºC. La solución purgada se calentó a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo que quedaba después de la concentración de la reacción se trituró y se lavó por decantación usando tres alícuotas de 5 mililitros de una mezcla de disolventes que comprendía terc-butilmetiléter y hexano en una proporción de 1 a 4 respectivamente. El sólido que se produjo mediante este procedimiento se recolectó por filtración y se secó a presión reducida proporcionando 127,5 miligramos (rendimiento cuantitativo) de la sal clorhidrato del compuesto 22. El compuesto 22 se obtuvo en forma de un sólido blanco y se usó en la reacción de acoplamiento final sin purificación.
Reacción P de la Figura 26E: Síntesis de (-) Tamandarina A (Compuesto 101)
Una solución que comprendía 63,3 miligramos (0,082 milimoles) de compuesto 22, 37,7 miligramos (0,12 milimoles) de compuesto 4 y 0,50 mililitros de CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. A esta solución fría se añadieron 53,1 miligramos (0,12 milimoles) de hexanuorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio (BOP) y 0,035 mililitros (0,32 milimoles) de NMM. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a 0ºC y se dejó calentar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante al menos 8 horas más. La solución resultante se diluyó con 2 mililitros de una solución saturada de NaCl y se extrajo con 10 mililitros de EtOAc. La fase orgánica extraída se lavó una vez usando 10 mililitros de una solución al 10% de HCl, una vez usando 10 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 10 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase orgánica lavada se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna usando una mezcla de disolventes que comprendía MeOH y CH_{2}Cl_{2} en una proporción de 2 a 98, respectivamente, a 5 a 95, respectivamente. Este procedimiento proporcionó 0,0411 gramos de tamandarina A (compuesto 101) en forma de un sólido amarillo verdoso. El rendimiento del compuesto 101 fue del 56%, calculado para ambas reacciones O y P y 12% calculado para las reacciones A-F, I, J y L-P (es decir, empezando a partir de D-alo-isoleucina). Para tamandarina A (101) se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,57 (MeOH:CH_{2}Cl_{2} 10:90); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,86-1,08 (m, 24H), 1,19-2,30 (dd, J_{1} = 17,1 Hz, J_{2} = 7,9 Hz, 1H), 3,29-3,33 (d, J = 17,0 Hz, 1H), 2,62 (s, 3H), 3,14 (s, 3H), 3,16-3,21 (dd, J_{1} = 14,4 Hz, J_{2} = 11,1 Hz, 1H), 3,41-3,45 (m, 1H), 3,59-3,80 (m, 5H), 3,82 (s, 3H), 3,90-3,95 (m, 1H), 4,03-4,08 (m, 1H), 4,29-4,30 (m, 1H), 4,37-4,42 (m, 1H), 4,67-4,69 (m, 1H), 4,74-4,77 (m, 1H), 4,89-4,93 (m, 1H), 5,06 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 5,31-5,35 (q, J_{1} = 11,6 Hz, J_{2} = 3,3 Hz, 1H), 5,44-5,46 (m, 1H), 6,86-6,88 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,09-7,11 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,37-7,39 (d, J = 9,1 Hz,1H), 7,48-7,50 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,78-7,80 (d, J = 9,7 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (260 MHz, CDCl_{3}) \delta 11,78, 14,07, 16,52, 17,55, 18,93, 20,28, 20,90, 21,32, 23,47, 23,79, 24,83, 24,90, 25,98, 27,33, 27,96, 28,40, 30,11, 31,26, 33,55, 33,93, 35,73, 38,70, 39,41, 39,65, 46,66, 47,02, 48,28, 54,91, 55,27, 56,71, 56,97, 51,90, 66,07, 66,22, 68,98, 70,70, 78,87, 114,08, 130,07, 130,33, 156,62, 168,52, 169,57, 170,11, 170,35, 170,59, 171,09, 172,67, 173,84, 174,53; IR (CHCl_{3}) 3330, 2952, 2816, 1735, 1629, 1508, 1447, 1243, 1168, 1024, 843 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{54}H_{85}N_{7}O_{14}Na (M^{+}Na^{+}): 1078,6052, hallada 1078,6044; [\alpha]_{D}^{20} -43,93 (c 1,05, CHCl_{3}).
Los inventores creen que la serie de reacciones que se describe anteriormente representa la primera síntesis estereoselectiva de (-) Tamandarina A.
Ejemplo 2 Actividad biológica de Tamandarina A
Los experimentos que se describen en este ejemplo demuestran que tamandarina A es un inhibidor de la síntesis de proteínas y agente antitumoral eficaz. En la Tabla 1 se muestran los resultados de la inhibición de la biosíntesis de proteínas (columna 1), citotoxicidad (columna 2) y actividad antitumoral (columna 3) de tamandarina A, comparados con el compuesto antitumoral relacionado didemnina B. Los resultados de la Tabla 1 se expresan en unidades de concentración del compuesto seleccionado.
TABLA 1
53
Tal como se usa en la presente memoria, "IC_{50}" se refiere a la dosis de un compuesto que es capaz de producir una inhibición del 50% del crecimiento celular. La IC_{50} se evalúa comparando el crecimiento de las células a las que se ha administrado un compuesto con el crecimiento de las mismas células a las que no se ha administrado el compuesto.
Tal como se usa en la presente memoria, "CL_{50}" se refiere a la dosis de un compuesto que es capaz de producir una letalidad del 50% en las células. La CL_{50} se evalúa comparando la muerte de las células en una población de células a las que se ha administrado un compuesto con la muerte de las células en una población de las mismas células a las que no se ha administrado el compuesto.
"NCI-60" se refiere a una línea tumoral 60 del Nacional Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). "NCI-60 Media" es la IC_{50} o LC_{50} medias para el grupo tratado con el compuesto seleccionado.
Los hallazgos in vitro indican que tamandarina A muestra una potencia comparable a la de didemnina A, un agente anticanceroso conocido. Tamandarina A es significativamente menos citotóxico en estos ensayos que didemnina B. La comparación indica la utilidad de tamandarina A y otros análogos de didemnina como agentes farmacológicos que tienen actividades anticancerosas y otras actividades características de la didemnina B.
Ejemplo 3 Síntesis de (-)Deshidrotamandarina
En este ejemplo se describe un procedimiento para sintetizar (-) deshidrotamandarina. El procedimiento implica al compuesto macrocíclico 22, que puede generarse tal como se describe en el Ejemplo 1. El procedimiento que se describe en este Ejemplo se ilustra en la Figura 37 y comienza con la síntesis del compuesto 27, que se representa en la Figura 37A.
Reacción O de la Figura 37 A: Síntesis del Compuesto 26
A una solución que comprendía 0,1084 gramos (0,33 milimoles) de compuesto 25 y 1 mililitro de CH_{2}Cl_{2} recién destilado se añadieron 0,182 g (0,43 milimoles) de peryodinano de Dess-martin. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 10 mililitros de éter y se vertió en 6 mililitros de una solución saturada de NaHCO_{3} que comprendía Na_{2}SO_{4} al 5%. Se añadió otra alícuota de 10 mililitros de éter a la mezcla bifásica y se separaron las fases. La fase orgánica se lavó una vez usando 10 mililitros de una solución saturada de NaHCO_{3} y una vez usando 10 mililitros de agua. La fase orgánica lavada se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo obtenido por este procedimiento se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna, eluyendo con una mezcla de disolventes que comprendía MeOH y CH_{2}Cl_{2} en una proporción de 5 a 95, respectivamente, proporcionando 0,083 gramos de compuesto 26 purificado (rendimiento del 77%) en forma de una espuma blanca. Para el compuesto 26 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,61 (MeOH:CH_{2}Cl_{2} 10:90); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,86-1,05 (m, 6H), 1,41-1,54 (m, 1H), 1,70-1,74 (m, 2H), 1,87-1,89 (m,3H) y 2,05-2,19 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 2,91 (s, 2H), 3,59-3,63 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 4,95-4,98 (t, J = 7,97Hz, 1H), 5,11-5,13 (m, 1H); EMAR m/z calculada para C_{16}H_{26}N_{2}O_{5} (M^{+}H^{+}): 327,1920, hallada 327,1912; [\alpha]_{D}^{20} +1,14 (c 0,49, CHCl_{3}).
Reacción R de la Figura 37 A: Síntesis del Compuesto 27
Una solución que comprendía 0,0678 gramos (0,21 milimoles) de compuesto 26, 4 mililitros de THF destilado y 4 mililitros de MeOH se enfrió a 0ºC. A esta solución, se añadieron 8 mililitros de una solución que comprendía LiOH 0,2 molar. La mezcla de reacción inicialmente se mantuvo agitando a 0ºC durante 1 hora, después la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se mantuvo agitando durante al menos 8 horas más. La mezcla resultante se concentró a presión reducida, se enfrió a 0ºC y se acidificó a pH 3 añadiendo KHSO_{4} 1 normal. La mezcla acidificada se extrajo tres veces con alícuotas de 5 mililitros de EtOAc. Las fases de EtOAc combinadas se secaron en presencia de Na_{2}SO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida proporcionando 0,042 gramos (rendimiento del 64%) de compuesto 27 en forma de un sólido blanco. Para el compuesto 27 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,86-1,03 (m, 6H), 1,35-1,50 (m, 1H), 1,70-1,77 (m, 2H), 1,85-1,93 (m, 2H) y 2,07-2,18 (m, 2H), 2,33 (s, 3H), 3,02 (s, 3H), 3,58-3,86 (m, 2H), 4,78-4,81 (m, 1H), 5,08-5,12 (m, 1H); RMN de ^{13}C (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 21,26 y 22,55, 23,21, 24,64, 26,36 y 28,17, 31,16, 37,09, 45,70, 56,79, 58,66, 163,32, 173,12, 174,59, 199,07.
Reacción S de la Figura 37B: Síntesis de (-) Deshidrotamandarina (Compuesto 133)
Una solución que comprendía 19,7 miligramos (0,063 milimoles) de compuesto 27, 33,4 miligramos (0,042 milimoles) de compuesto 22 y 0,50 mililitros de CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. A esta solución fría se añadieron 28 miligramos (0,063 milimoles) de BOP y 0,0185 mililitros (0,17 milimoles) de NMM. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a 0ºC y se dejó calentar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante al menos 8 horas más. La solución resultante se diluyó con 2 mililitros de una solución saturada de NaCl y se extrajo con 10 mililitros de EtOAc. La fase orgánica extraída se lavó una vez usando 5 mililitros de una solución al 10% de HCl, una vez usando 5 mililitros de una solución al 5% de NaHCO_{3} y una vez usando 5 mililitros de una solución saturada de NaCl. La fase orgánica lavada se secó en presencia de Na_{2}SO_{4} se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna, eluyendo con una combinación de mezclas de disolventes que comprendía MeOH y CH_{2}Cl_{2} en proporciones desde 2 a 98, respectivamente, hasta 10 a 90 respectivamente, proporcionando 18,1 miligramos de deshidrotamandarina (compuesto 133) en forma de un sólido amarillo blanquecino. El rendimiento del compuesto 133 fue del 41%, calculado para ambas reacciones O (es decir, la desprotección del compuesto 21 proporcionando el compuesto 22 del Ejemplo 1) y S. Para deshidrotamandarina A se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,48 (MeOH:CH_{2}Cl_{2} 10:90); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,80-1,00 (m, 24H), 1,16-1,45 (m, 11H), 1,51-2,25 (m, 10H), 2,38-2,48 y 3,19-3,30 (m, 2H), 2,52-2,53 (d, J = 6,2Hz, 3H), 2,57 (s, 3H), 3,04 y 3,08 (s, 3H, rotámeros), 3,12-3,16 (m, 1H) y 3,31-3,35 (m, 1H), 3,53-3,72 (m, 5H), 3,77 (s, 3H), 3,81-4,03 (m, 1H), 4,05-4,10 (m, 1H), 4,25-4,26 (m, 1H), 4,61-4,65 (m, 1H), 4,68-4,71 (m, 1H), 4,85-4,88 (m, 1H), 5,00-5,01 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 5,15-5,20 (m, 1H), 5,28-5,31 (m, 1H), 6,81-6,83 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,05-7,07 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,28-7,30 (d, J = 9,8 Hz, 1H) y 7,33-7,35 (d, J = 10,2 Hz, 1H), 7,39-7,40 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 7,72-7,74 (d, J = 9,7 Hz, 1H) y 7,78-7,80 (d, J = 9,7 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 11,80, 14,11, 16,52, 17,63, 18,91, 20,87, 21,33, 22,32, 23,53, 24,89 (superposición), 24,83, 27,08, 27,35, 27,99, 29,62, 30,13, 31,00, 33,56, 34,04, 35,10, 35,84, 38,90, 39,65, 46,72, 48,29, 48,81, 54,78, 55,27 (superposición), 56,91, 57,46, 58,91, 66,10, 68,92, 70,90, 78,94, 114,12, 130,00, 130,36, 158,68, 161,50, 168,43, 169,59, 170,61, 171,00, 172,26, 173,00, 174,52, 197,36: IR (KBr) 3339, 2960, 2927, 2872, 1736 1715, 1655, 1633, 1508, 1460, 1438, 1248, 1177, 1085,1031, 830 cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{54}H_{53}N_{7}O_{14}Na (M^{+}Na^{+}): 1076,5896, hallada 1076,5946;
[\alpha]_{D}^{20} - 35,29 (c 0,35, CHCl_{3}).
Ejemplo 4 Síntesis de análogos de tamandarina fluorescentes
En este ejemplo se describe un procedimiento para sintetizar un compuesto de didemnina fluorescente, compuesto 108. Como en el Ejemplo 3, el procedimiento que se ilustra en este Ejemplo implica al compuesto macrocíclico 22, que puede generarse tal como se describe en el Ejemplo 1. El procedimiento que se describe en este Ejemplo se ilustra en la Figura 38 y comienza con la síntesis del compuesto 206a, que se representa en la Figura 38A.
Reacción T de la Figura 38A: Síntesis del Compuesto 205a
Una solución que comprendía 10,00 gramos (49,5 milimoles) de 1,3-acetonadicarboxilato dietílico, 7,12 gramos (51,9 milimoles) de m-dimetilaminofenol, 8,56 gramos (62,8 milimoles) de cloruro de cinc y 25 mililitros de etanol absoluto se mantuvieron a reflujo durante 13 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 50 mililitros de EtOAc y se lavó usando25 mililitros de H_{2}O. La fase acuosa obtenida a partir de este procedimiento se extrajo tres veces con alícuotas de 50 mililitros de EtOAc. Las fases de EtOAc combinadas se secaron en presencia de sulfato de magnesio anhidro (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron a presión reducida. El sólido en bruto resultante se recristalizó en etanol absoluto proporcionando 2,64 gramos (rendimiento del 20%) de compuesto 205a en forma de cristales naranjas. Para el compuesto 205B se obtuvieron los siguientes datos analíticos: pf 131-132ºC; R_{f} 0,20 (acetona/hexano 30:70); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,22 (3H, t, J = 7,1 Hz), 3,01 (6H, 5), 3,64 (2H, s), 4,15 (2H, q, J =7,2 Hz), 6,02 (1H, s), 6,48 (1H, d, J = 2,6 Hz), 6,58 (1 H, dd, J_{1} = 2,6 Hz, J_{2} = 8,9 Hz), 1,37 (1H, d, J = 8,9); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 14,02, 38,16, 40,01, 61,49, 98,28, 108,45, 108,93, 110,63,125,22, 148,39, 152,91, 155,89, 161,65, 169,01; IR (KBf) 2901 (w), 1720 (s), 1600 (s), 1534 (m), 1484 (m), 1427 (m), 1405 (s), 1371 (m), 1330 (m), 1232 (m) cm^{-1}; EMAR calculada para C_{15}H_{15}NO_{4} (M^{+}H): 276,1236, hallada 276,1244, Anal. calculada para C_{15}H_{17}NO_{4}: C, 65,43; H, 6,23; N, 5,09. Hallada: C, 65,26; H, 6,36; N, 5,03.
Reacción U de la Figura 38A: Síntesis del Compuesto 205b
Una solución que comprendía 0,46 gramos (11,0 milimoles) de hidróxido de litio (LiOH-H_{2}O) y 25 mililitros de H_{2}O se añadió a una solución que comprendía 1,50 gramos (5,5 milimoles) de compuesto 205b y 10 mililitros de THF. La mezcla de reacción se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La solución resultante se lavó con 10 mililitros de éter y se acidificó a pH 2. Al acidificar se formó un precipitado y se recolectó por filtración. El precipitado estaba que comprendía 0,364 gramos de compuesto 205b en forma de cristales amarillos. Para el compuesto 205b se obtuvieron los siguientes datos analíticos: pf 166-167ºC, RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}/DMSO) \delta 3,01 (6H, s), 3,62 (2H, 5), 6,00 (1H, 5), 6,44 (1H, d, J = 2,3 Hz), 6,58 (1H, del, J_{1} = 2,4 Hz, J_{2} = 8,9 Hz), 1,40 (1H, d, J = 9,0 Hz); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}/DMSO) \delta 38,42, 40,25, 98,34, 108,89, 109,35, 110,67, 125,84, 149,59, 153,22, 156,15, 162,00, 111,33; IR (KBr) 2923(m), 1690(s), 1619(s), 1534(m), 1404(m), 1248(m), 1145 (m), 1055(m) cm^{-1}; EMAR calculada para C_{13}H_{14}NO_{4} (M^{+}H): 248,0922, hallada 248,0929.
Reacción V de la Figura 38A: Síntesis del Compuesto 206a
Una solución que comprendía 0,364 gramos (1,47 milimoles) de compuesto 205b y 5 mililitros de CH_{2}Cl_{2} recién destilado se introdujo en atmósfera de argón y se enfrió a ºC. A esta solución se añadieron 0,282 gramos (1,47 milimoles) de EDAC\cdotHCl y 0,035 gramos (0,29 milimoles) de DMAP. La mezcla resultante se agitó durante 10 minutos y se añadieron 0,246 gramos (1,47 milimoles) de éster terc-butílico de glicina. La mezcla de reacción se mantuvo agitando a 0ºC durante 2 horas, se calentó a temperatura ambiente y se mantuvo a temperatura ambiente durante al menos 8 horas más. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó una vez usando 10 mililitros de una solución al 10% de HCl y una vez usando 10 mililitros de una solución saturada de NaCl. Las fases combinadas, lavadas con CH_{2}Cl_{2} se secaron en presencia de MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna, eluyendo con una mezcla de disolventes que comprendía cantidades iguales de EtOAc y CH_{2}Cl_{2} proporcionando 0,250 gramos (rendimiento del 42%) de compuesto 206a en forma de un sólido amarillo. Para el compuesto se obtuvieron los siguientes datos analíticos 206a: RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,42 (s, 9H), 3,03 (s, 6H), 3,64 (s, 2H), 3,88 (d, J = 5,12 Hz, 2H), 6,05 (s, 1H), 6,48 (brs, 1H), 6,58 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,60 (dd, J_{1} = 2,6 Hz, J_{2} = 8,9 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 8,9 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 168,5, 167,8, 161,6, 156,0, 153,1, 149,2, 125,6, 110,5, 109,2, 108,3, 98,3, 82,5, 42,4, 40,3, 40,1, 27,9; IR (CHCl_{3}) 3450, 1679, 1618, 1530, 1405, 1310, 1230, 1151 cm^{-1}; EMAR (Cl) m/z calculada para C_{19}H_{24}N_{2}O_{5} (M^{+}): 360,1685, Hallada 360,1686. Anal. calculada para C_{19}H_{24}N_{2}O_{5}: C, 63,30; H, 6,72; N, 7,78. Hallada: C, 62,99; H, 6,60;
N, 7,52.
Reacción W de la Figura 38B: Síntesis del Compuesto 207a
Una solución que comprendía 0,250 gramos (0,69 milimoles) de éster terc-butílico de Gly-DACA, compuesto 206a y CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC y se mantuvo durante 10 minutos. A la solución fría se añadió una solución que comprendía ácido trifluoroacético al 10% (TFA) gota a gota. Esta adición se completó en 10 minutos. La mezcla resultante se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante al menos 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad usando una rotavator y el residuo resultante, compuesto por 0,033 gramos (0,108 milimoles) de compuesto 206b, se usó en la reacción subsiguiente sin purificación adicional.
Una solución que comprendía 0,033 gramos (0,108 milimoles) de compuesto 206b y CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC. A la solución fría se añadieron 0,027 gramos (0,108 milimoles) de BOP y 0,012 gramos (0,108 milimoles) de NMM. La mezcla resultante se mantuvo en agitación durante 30 minutos. Se añadió un exceso de éster metílico de N-metil-D-leucina a la mezcla en agitación, después mantener la reacción agitando a 0ºC durante al menos 8 horas. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó una vez usando 10 mililitros de una solución al 10% de HCl y una vez usando 10 mililitros de una solución saturada de NaCl. Las fases de CH_{2}Cl_{2} combinadas y lavadas se secaron en presencia de MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna, eluyendo con una mezcla de disolventes que comprendía cantidades iguales de EtOAc y CH_{2}Cl_{2}. La evaporación del eluyente proporcionó 0,030 gramos (rendimiento del 63%) de compuesto 201a en forma de un sólido amarillo. Para el compuesto 207a se obtuvieron los siguientes datos analíticos: [\alpha]_{D}^{20} +19,08 (c 0,865, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,87 (d, J = 6,52 Hz, 3H), 0,91 (d, J = 6,79 Hz, 3H), 1,40 (m, 1H), 1,69 (m, 2H), 2,85 (s, 3H), 3,01 (s, 6H), 3,63 (s, 2H), 3,67 (s, 3H), 4,06 (m, 2H), 5,22 (dd, J_{1} = 10,6 Hz, J_{2} = 5,2 Hz, 1H), 6,04 (s, 1H), 6,47 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,57 (dd, J_{1} = 2,5 Hz, J_{2} = 8,9 Hz, 1H), 6,76 (brs, 1H), 7,42 (d, J = 8,9 Hz, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 171,7, 168,6, 167,8, 161,6, 155,9, 152,9, 149,1, 125,4, 110,5, 109,1, 108,4, 98,3, 54,7, 52,3, 41,8, 40,1, 39,9, 37,1, 30,0, 24,8, 23,1, 21,3 cm^{-1}, EMAR m/z calculada para C_{23}H_{31}N_{3}O_{6} (M^{+}Na^{+}): 468,2111, Hallada 468,2133.
Reacción X de la Figura 38B: Síntesis del Compuesto 207b
Una solución que comprendía 0,135 gramos (0,304 milimoles) de compuesto 207b y THF se enfrió a 0ºC y se añadió una solución que comprendía 0,025 gramos (0,606 milimoles) de LiOH\cdotH_{2}O en 2 mililitros de agua. Esta adición se completó en un periodo de 5 minutos. La mezcla resultante se mantuvo agitando a 0ºC durante 30 minutos y después se calentó a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 1,5 horas y después se lavó dos veces usando alícuotas de 4 mililitros de éter. La fase acuosa lavada se evaporó a sequedad a presión reducida. El residuo resultante, que comprendía el compuesto 207b, se disolvió en una solución que comprendía 2 mililitros de agua y 4 mililitros de EtOAc, se enfrió a 0ºC y se acidificó a pH 2 añadiendo una solución que comprendía KHSO 1 normal. La fase acuosa separada formada por este procedimiento se lavó dos veces con alícuotas de 4 mililitros de EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron en presencia de MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad a presión reducida. El residuo resultante de este procedimiento comprendía 0,010 gramos (0,023 milimoles) de compuesto 207b y se usó en la reacción subsiguiente sin purificación.
Reacción Y de la Figura 38C: Síntesis del Compuesto 107
Una solución que comprendía 0,010 gramos (0,023 milimoles) de compuesto 207b y CH_{2}Cl_{2} se enfrió a 0ºC. A esta solución fría se añadieron 0,010 gramos (0,023 milimoles) de BOP y 0,010 mililitros (0,092 milimoles) de NMM. La mezcla resultante se mantuvo agitando a 0ºC durante 10 minutos y se añadió la sal clorhidrato del compuesto 22 (0,018 gramos, 0,023 milimoles). La reacción se mantuvo a 0ºC durante 1 hora y a temperatura ambiente durante al menos otras 8 horas. La solución resultante se diluyó con 1 mililitro de salmuera y se extrajo dos veces usando alícuotas de 2 mililitros de EtOAc. La fase orgánica formada por extracción se lavó una vez usando 1 mililitro de una solución al 10% de HCl y dos veces usando alícuotas de 1 mililitro de agua. La fase orgánica lavada se secó en presencia de MgSO_{4} anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida, eluyendo con una mezcla de disolventes que comprendía acetona y hexano en una proporción de 30 a 70 respectivamente. La evaporación del eluido proporcionó 0,008 gramos (rendimiento del 30%) de compuesto 107 fluorescente. Para el compuesto 107 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: [\alpha]_{D}^{20} -160,1 (c 0,3, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,73-0,93 (m, 24H), 1,07-1,74 (m, 15H), 2,04 (m, 2H), 2,14 (s, 3H), 2,15 (m, 2H), 2,31 (m, 2H), 2,53 (s, 4H), 2,84 (s, 2H), 3,03 (5, 6H), 3,17 (brd, J = 10,4 Hz, 2H), 3,35 (m, 1H), 3,51 (m, 2H), 3,68 (s, 2H), 3,78 (s, 3H), 3,99 (brd, 2H), 4,08-4,12 (m, 3H), 4,55-4,56 (m, 1H), 4,78-4,80 (m, 1H), 4,82-5,01 (m, 2H), 5,13-5,14 (brd, 1H), 6,08 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 6,61 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,54 Hz, 2H), 7,07 (d, J = 8,35 Hz, 2H), 7,24-7,41 (m, 3H), 7,51 (d, J = 8,90 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 8,65 Hz, 1H); IR (KBr) 3462, 2953, 2358, 1732, 1658, 1632, 1555, 1538, 1456 cm^{-1}: EMAR m/z calculada para C_{64}H_{92}NaO_{16} (M^{+}Na^{+}): 1251, 6529. Hallada 1251, 6528,
Ejemplo 5 Síntesis de un resto de cadena lateral de desoxoprolina y acoplamiento a un macrociclo de didemnina
Se usó un enlace sencillo de aminometileno para sustituir el enlace amida entre D-leucina y L-prolina de la cadena lateral de didemnina B. En síntesis, el enlace aminometileno se preparó mediante aminación reductora, tal como describen (Abdel-Magid y cols., 1990, Tetrahedron lett. 31:5595-5598; Abdel-Magid y cols., 1990, Synlett. 537-539).
En un primer procedimiento de síntesis, se realizó una metilación exhaustiva de Cbz-D-leucina usando dimetilsulfato, tal como se ilustra en la Figura 41. El grupo Cbz se eliminó usando hidrogenólisis proporcionando la amina libre de D-leucina dimetildada (Compuesto 40). La amina se usó en la aminación reductora sin purificación. L-prolina disponible comercialmente se esterificó primero usando SOCl_{2} en MeOH y su grupo amino se protegió subsiguientemente usando BOC_{2}O. Después de purificar, la función éster se redujo a un aldehído en dos etapas. NaBH_{4} se combinó con LiCl generando LiBH_{4} in situ y este compuesto se usó para reducir el éster al alcohol correspondiente. La oxidación con reactivo SO_{3}\cdotpiridina proporcionó el aldehído, denominado compuesto 42, con buen rendimiento. Podía realizarse la reducción del éster al aldehído en una etapa usando DIBAL, pero dependía de lo fresco que estuviera el reactivo reductor y no era muy reproducible. La aminación reductora entre el aldehído denominado compuesto 40 y la amina libre (compuesto 42) proporcionó el compuesto 43. El grupo Boc del compuesto 43 se eliminó usando TFA/CH_{2}Cl_{2}. La amina libre resultante se acopló a ácido pirúvico usando BOP proporcionando la cadena lateral \psi(CH_{2}NH) protegida denominada compuesto 44.
La etapa siguiente era la hidrólisis del éster metílico del compuesto 44. Pero esta etapa demostró no ser trivial. Quizá debido a un impedimento estérico, el éster metílico era difícil de escindir usando 2 equivalentes de LiOH\cdotH_{2}O en THF/H_{2}O.
Cuando la cantidad de LiOH\cdotH_{2}O se aumentó a 10 equivalentes, el éster metílico pareció hidrolizarse, dado que el espectro de masas de la mezcla de reacción mostró el pico ácido. Pero el ácido era tan hidrófilo y estaba tan enterrado en el exceso de sales inorgánicas, que no fue posible extraerlo con ningún disolvente orgánico. Los presentes inventores también trataron de precipitar el ácido usando éter pero sólo precipitaron las sales inorgánicas. Debido a este problema de purificación, los presentes inventores decidieron no usar el éster metílico para proteger el ácido. Los presentes inventores necesitaban un grupo protector que pudiera sobrevivir a todas las etapas de síntesis pero no necesitara condiciones acuosas para su eliminación. Se encontró que el grupo bencilo servía bien para este fin.
El procedimiento de síntesis se modificó tal como se indica en la Figura 42. Para ser compatible con el éster bencílico, el grupo amino de leucina se protegió mediante Boc en lugar de Cbz. La metilación selectiva del grupo amino proporcionó el ácido denominado compuesto 46. El ácido libre se benciló proporcionando el éster bencílico deseado, el compuesto 47. El grupo protector Boc se eliminó usando TFA. La amina resultante (compuesto 48) se condensó con prolina protegida mediante aminación reductora. La eliminación del grupo protector Boc y el enfriamiento subsiguiente con ácido pirúvico proporcionó el compuesto 50. Se usó hidrogenólisis para eliminar el grupo bencilo y proporcionó la cadena lateral \psi(CH_{2}NH) deseada en forma del ácido libre (compuesto 51). El acoplamiento de la cadena lateral del ácido libre con un macrociclo de didemnina proporcionó el análogo de didemnina con desoxoprolina deseado denominado compuesto 12.
Se sintetizó un segundo análogo de didemnina con desoxoprolina (denominado compuesto 72a) usando una estrategia de síntesis similar, tal como se ilustra en la Figura 43 y se describe en detalle a continuación
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Una solución de N-Boc-D-leucina (1,0 gramo, 4,1 milimoles) en 20 mililitros de DMF se enfrió a 0ºC. Se añadió LiCO_{3} finalmente molido (1,5 gramos, 20,5 milimoles), seguido de la adición de bromuro de bencilo (2,43 mililitros, 20,5 milimoles). La mezcla de reacción se agitó durante 6 horas y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con H_{2}O y se extrajo con EtOAc tres veces. Los extractos en EtOAc se combinaron y se lavaron con salmuera. La DMF se eliminó a vacío. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna eluyendo con acetona al 20% en hexano proporcionando el compuesto 46 con un rendimiento del 78%. Para el compuesto 46 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,60 (acetona al 40% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} +16 (c = 1,0, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,92 (m, 6H), H_{b}) 1,48 (s, 9H), H_{c}) 1,50-1,59 (m, 1H), H_{d}) 1,60-1,69 (dd, 2H), H_{e}) 4,36 (m, 1H), H_{f}) 4,90 (d, 1H), H_{g}) 5,11-5,20 (m, 2H), H_{h}) 7,33(m, 5H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 21,8, C_{a'}) 22,7, C_{c}) 24,7, C_{b}) 28,2, C_{d}) 41,6, C_{e}) 52,1, C_{g}) 66,7, C_{i}) 79,6, C_{h}) 128,0, 128,2, 128,4, C_{i}) 135,5, C_{j}) 155,3, C_{k}) 173,2; IR (puro) 3367 (br), 2958 (s), 1732 (s), 1715 (s), 1500 (s), 1455 (m), 1366 (w), 1120 (m) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{11}H_{23}N_{4}O_{2} (M^{+}H) 322,2011, encontrada 322,2018.
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Una solución de compuesto 46 (1,2 gramos, 3,74 milimoles) en 200 mililitros de THF se enfrió a 0ºC. Se añadió NaHMDS (1 molar en THF; 5,6 mililitros, 5,6 ml/mol), seguido de la adición de yoduro metílico (1,0 mililitro, 18,7 milimoles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con éter. La fase orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO_{3} al 5% y salmuera. La solución resultante se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con acetona al 20% en hexano proporcionando el compuesto 47 con un rendimiento del 71%. Para el compuesto 47 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,56 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} +20,4 (c = 1,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{d}) H_{a}) 0,85-0,90 (m, 6H), H_{c}) y H_{d}) 1,35-1,65 (m, 3H), H_{b}) 1,45 (s, 9H), H_{e}) 2,75 (d, 3H), H_{f}) 4,53-4,58 y 4,81-4,88 (rm, 1H), H_{g}) 5,10(s, 2H), H_{h}) 7,15-7,28 (m, 5H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 22,0 y 23,5, C_{b}) 25,8, C_{c}) 29,0, C_{d}) 31,0, C_{e}) 38,0, C_{f}) 57,0, C_{g}) 66,1, C_{i}) 80,2, C_{h}) 128,0, 128,2, 128,4, C_{l}) 136,5, C_{j})156,3, C_{k}) 173,2; IR (puro) 2958,3 (m), 1742,7 (s), 1696,8 (s), 1455,6 (s), 1390,7 (s), 1366,6 (s), 1323,5 (s), 1151,3 (s) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{11}H_{23}N_{4}O_{2} (M^{+}H) 336,2174, hallada 336,2178.
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Compuesto 47 (0,1 gramos) se disolvió en HCl\cdotdioxano (5 mililitros) y se agitó a temperatura ambiente. Cuando se completó la reacción, el disolvente se eliminó a vacío. Se añadió tolueno dos veces y se concentró. El residuo se secó a presión reducida toda la noche proporcionando la sal HCl deseada (compuesto 48) en un 98%. Para el compuesto 48 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f}: inicial (MeOH al 10% / CH_{2}Cl_{2}): [\alpha]_{D}^{25} 1,1 +48,5 (c = 0,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,91 (d, 6H), H_{b}) 1,75 (m, 1H), H_{c}) 1,90-1,95 (dd, 2H), H_{d}) 2,71 (s, 3H), H_{e}) 3,83 (t, 1H), H_{f}) 5,20-5,30 (rm, 2H), H_{g}) 7,35-1,40 (m, SH), H_{h}) 9,85 y 10,15(br, 2H): RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 21,8 y 23,4, C_{c}) 25,8, C_{b}) 31,9, C_{d}) 38,2, C_{e}) 60,1, C_{f}) 68,8, C_{g}) 128,4, 128,6, 128,8, C_{j}) 134,6, C_{i}) 168,2; IR (puro) 2958,3 (m), 1742 (s), 1696 (s), 1455 (s), 1390 (s), 1366 (s), 1323 (s), 1151 (s) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{11}H_{23}N_{4}O_{2} (M^{+}H) 336,2174, hallada 336,2178.
57
N-Boc-L-prolina disponible comercialmente (5,0 gramos, 23,2 milimoles) se disolvió en acetona (200 mililitros). Se añadió K_{2}CO_{3} (3,8 gramos, 27,84 milimoles) a 0ºC, seguido de la adición de Mel (2,9 mililitros, 46,4 milimoles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche. La reacción se inactivó con solución de NaHCO_{3} al 5% y se extrajo con éter. Las fases de éter combinadas se lavaron con HCl al 5% y salmuera y se concentraron proporcionando el producto en bruto (compuesto 41) con un rendimiento del 91%. Este compuesto se purificó por cromatografía en columna eluyendo con acetona al 20% en hexano. Para el compuesto 41 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,4 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} -61,2 (c = 0,8, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 1,45 (s, 9H), H_{b}) 1,98 (dd, 2H), H_{c}) 1,88 y 2,22 (m, rm, 2H), H_{d}) 3,42-3,58 (m, 2H), H_{e}) 3,74 (s, 3H), H_{f}) 4,24 y 4,35 (rm, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{b}) 24,2 y 24,4, C_{a}) 28,3, C_{c}) 31,6 y 31,8, C_{d}) 47,3, C_{f}) 52,1, C_{e}) 59,7, C_{g}) 80,1, C_{h}) 153,8, C_{i}) 174,0; IR (puro) 2915 (m), 1749 (s), 1700 (s), 1396 (s), 1365 (s), 1200 (s), 1161 (s), 1151 (s); EMAR m/z calculada para C_{11}H_{23}N_{4}O_{2} (M^{+}H) 230,1391, hallada 230,1389.
58
El compuesto 41 se disolvió en 200 mililitros de THF/EtOH (1:1). Se añadió LiCl (1,8 gramos, 32,7 milimoles) y NaBH_{4} (1,2 gramos, 32,7 milimoles) en porciones a 0ºC. La mezcla de reacción se agitó toda la noche y se controló por TLC; se añadieron más LiCI y NaBH_{4} durante la operación. Cuando se completó la reacción, el sólido blanco se recolectó y se lavó con éter. El disolvente se eliminó usando una rotavator. El residuo se neutralizó a pH 4 y después se extrajo dos veces con EtOAc. Los extractos en EtOAc se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron y se concentraron. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna eluyendo con acetona al 10% en hexano proporcionando el alcohol deseado (compuesto 41a) con un rendimiento del 83%. Para el compuesto 41a se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,30 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} -60,0 (c = 0,8, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 1,48 (s, 9H), H_{b}) 1,60 y 2,05 (rm, 2H) H_{c}) 1,83-1,98 (dd, 2H), H_{d}) 3,35 y 3,45 (rm, 2H), H_{e}) 3-61-3,70 (m, 2H), H_{f}) 4,03 (m, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{c}) 23,8, C_{a}) 28,4, C_{b}) 28,9, C_{f}) 47,3, C_{e}) 59,9, C_{d}) 67,3, C_{g}) 80,0, C_{h})156,8; IR (puro) 3424 (br), 2973 (s), 2877 (s), 1695 (s), 1670 (s), 1477 (s), 1406 (s), 1366,2 (s); EMAR m/z calculada para C_{11}H_{23}N_{4}O_{2} (M^{+}H) 202,1443, hallada 202,1449.
59
Una solución de compuesto 41a (2,0 gramos, 9,9 milimoles) y Et_{3}N en 200 mililitros de CH_{2}Cl_{2} se enfrió a -78ºC. Se añadió complejo de SO_{3}-piridina (4,7 gramos, 29,7 milimoles) en DMSO (30 mililitros) a la solución anterior. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente, se agitó toda la noche y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con éter. La fase orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO_{3} al 5% y salmuera. La solución resultante se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. La mezcla en bruto se purificó con una columna corta proporcionando el aldehído deseado (compuesto 42) con un rendimiento del 81%. Para el compuesto 42 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,55 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} +20,4- (c = 1,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 1,45 (s, 9H), H_{b}) 1,75-1,90 (m, 2H), H_{c}) 1,90-2,15 (m, 2H), H_{d}) 3,20-3,50 (t, 2H), H_{e}) 3,90-4,20 (d, 1H), H_{f}) 9,72 (d, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{b}) 24,0, C_{c}) 27,3, C_{a}) 28,9, C_{d}) 47,5, C_{e}) 65,5, C_{g}) 80,1, C_{h}) 154,2, C_{i}) 200,1.
60
El compuesto 42 (0,1 gramos, 0,5 milimoles) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (8 mililitros) y se añadió la amina libre del compuesto 48 (0,15 gramos, 0,55 milimoles) agitando eficazmente. A 0ºC, se añadió AcOH (0,02 mililitros, 0,3 milimoles) en forma de catalizador y se agitó durante 10 minutos antes de añadir NaBH(OAc)_{3} (0,13 gramos, 0,6 milimoles) a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2}. El exceso de reactivo se inactivó mediante la adición gota a gota de solución saturada de NH_{4}Cl. La fase orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO_{3} al 5% y salmuera, se secó y se concentró. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida, eluyendo con EtOAc al 20% en éter de petróleo proporcionando la amina deseada (compuesto 43).
Para el compuesto 43 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,50 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} -44,0 (c = 1,1, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,92 (m, 6H), H_{b}) 1,45 (s, 9H), H_{c}), H_{d}) y H_{e}) 1,50-1,90 (m, 5H), H_{f}) y H_{g}) 2,3-2,45 (m, 5H), H_{h1}) 2,22-2,90 (m, 1H), H_{h2}) y H_{i}) 3,25-3,4 (m, 3H), H_{j}) y H_{k}) 3,70-3,95 (m, 2H), H_{l}) 5,35 (m, 5H), H_{m}) 7,30 (m, 5H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 22,2, C_{d}) 23,4, C_{c}) 25,6, C_{b}) 28,4, C_{e}) 28,8, C_{g}) 36,6, C_{f}) 38,4, C_{h}) 46,2, C_{I}) 56,1, C_{j})58,5, C_{i}) 56,2, C_{k}) 66,0, C_{n}) 79,6, C_{m}) 128,2, C_{q}) 136,2, C_{o}) 154,1, C_{p}) 174,2; IR (puro) 2955 (s), 2868 (s), 1730 (s), 1693 (s), 1455 (s), 1392 (s),1364 (s), 1170 (s) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{24}H_{38}N_{2}O_{4} (M^{+}H) 419,2910, hallada 419,2897.
61
El compuesto 43 (0,1 gramos) se disolvió en HCl-dioxano (5 mililitros) y la solución se agitó a temperatura ambiente. Cuando se completó la reacción, todo el disolvente se eliminó a vacío. Se añadió tolueno dos veces y se concentró. El residuo se secó a presión reducida toda la noche proporcionando la sal HCl deseada (compuesto 44) con un rendimiento del 98%. Para el compuesto 44 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} inicial (AE al 60% en EP); [\alpha]_{D}^{25} +15,3 (c = 0,6, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,91-1,10 (d, 6H), H_{b}), H_{c}) y H_{d}) 1,6-2,30 (m, 5H), H_{e}) 2,83 (dd, 2H), H_{i}) 3,12 (s, 3H), H_{g}) y H_{h}) 3,31-3,65 (m, 4H), H_{i}) y H_{j}) 4,11-4,30 (m, 2H), H_{k}) 5,28 (s, 2H), H_{k}) 7,40 (m, 5H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{c}) 20,8, C_{b}) 23,5, C_{a}) 25,9, C_{d}) 26,1, C_{e}) 36,2, C_{f}) 462, C_{g}) 55,8, C_{h}) 61,6, C_{i}) 64,2, C_{j}) 61,0, C_{k}) 68,2, C_{l}) 125,0, 128,0, 128,8, 128,9 y 134,1, C_{n}) 137,9, C_{m}) 167,0; IR (puro) 2954 (s), 2360 (s), 2336 (s), 1740 (s), 1455 (s), 1389 (s), 1197 (s), 1141 (s); cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{19}H_{30}N_{2}O_{2} (M^{+}H) 319,2386, hallada 319,2392.
62
El compuesto 44 (20 miligramos, 0,063 milimoles) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (0,5 mililitros) y se añadió ácido láctico (5,55 miligramos, 0,063 milimoles) a 0ºC, seguido de la adición de BOP (28 miligramos, 0,063 milimoles y NMM (0,035 mililitros, 0,31 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla de reacción se diluyó con éter. La fase orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO_{3} al 5% y salmuera. La solución resultante se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con acetona al 30% en hexano proporcionando el compuesto 50a con un rendimiento del 61%. Para el compuesto 50a se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,50 (acetona al 50% /hexano); [\alpha]_{D}^{25} +21,0 (c = 0,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,82-0,92 (d, 6H), H_{b}) 1,20 (d, 3H), H_{c}) 1,45-1,66 (m, 2H), H_{d}) 1,66-1,72 (m, 1H), H_{e}) y H_{f}) 1,76-1,90 (m, 4H), H_{g}) y H_{h}) 225-2,45 (m, 5H), H_{i}), H_{j}) y H_{k}) 3,19-3,85 (m, 4H), H_{l}) 4,10-4,21 (rm, 1H), H_{m}) 5,05-5,18 (s, 2H), H_{n}) 1,12-7,38 (m, 5H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 22,0, C_{c}) 22,8, C_{d}) 24,2, C_{e}) 24,8, C_{b}) 25,4, C_{f}) 28,1, C_{g}) 37,8, C_{h}) 38,6, C_{i}) 45,8, C_{j}) 46,2, C_{k}) 56,0, C_{l}) 56,8, C_{m}) 66,0, C_{n}) 128,8, C_{o}) 136,1, C_{p}) 173,8, C_{q}) 114,1; IR (puro), 3415 (br), 2955 (s), 2869 (m), 1729 (s), 1638 (s), 1455 (m), 1379 (m), 1366 (m), 1147 (m), 1126 (m): EMAR m/z calculada para -N_{2}O_{4} (M^{+}Na) 413,2416, hallada 413,2423.
63
El compuesto 50a (20 miligramos, 0,063 milimoles) se disolvió en 0,5 mililitros de MeOH/EtOAc (1:1). La mezcla se añadió a una solución de MeOH y EtOH (1:1) que contenía catalizador Pd/C (10 miligramos). La mezcla de reacción se agitó en un hidrogenador Parr en atmósfera de H_{2} (40 libras por pulgada cuadrada (2,815 kilogramos por centímetro cuadrado)) y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, el catalizador se eliminó por filtración. La solución restante se concentró a vacío. El producto en bruto (compuesto 51a) se usó directamente en la etapa siguiente. Para el compuesto 51a se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,20 (MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}); [\alpha]_{D}^{25} +65,0 (c = 0,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,82-0,92 (d, 6H), H_{b}) 1,34 (d, 3H), H_{c}) 1,45-1,55 (m, 1H), H_{d}) 1,78-1,91 (m, 2H), H_{e}) 1,91-2,0 (m, 2H), H_{f}) 2,0-2,18 (m, 2H), H_{g}) 2,81 (s, 3H), H_{h}) 3,03-3,18 (d, 2H), H_{i}) 3,45-3,54 (m, 1H), H_{j}) 3,56-3,68 (t, 2H), H_{k}) 4,25-4,35 (m, 1H), H_{i}) 4,40-4,49 (m, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 21,0, C_{b}) 22,8, C_{c}) 23,4, C_{d}) 24,8, C_{e}) 25,8, C_{f}) 29,4, C_{g}) 36,5, C_{h}) 38,6, C_{i}) 47,2, C_{j}) 55,2, C_{k}) 66,4, C_{l}) 68,2, C_{m}) 172,4, C_{n}) 176,2; IR (puro), 3336 (br), 2957 (s), 2870 (m), 1718 (m), 1621 (s), 1466 (s), 1368 (s), 1250 (m), 1197 (w), 1128 (w); EMAR m/z calculada para C_{15}H_{27}N_{2}O_{4} (M^{+}Na) 323,1947, hallada 323,1939.
64
El ácido en bruto (12,5 miligramos, 0,038 milimoles) se combinó con la sal HCl del macrociclo (15,0 miligramos, 0,019 milimoles) en CH_{2}Cl_{2} (0,25 mililitros) a 0°C. Se añadieron HATU (8,2 miligramos, 0,020 milimoles) y DIEA (0,026 mililitros, 4 equivalentes). La reacción se agitó a 0ºC toda la noche y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla se diluyó con Et_{2}O y la fase orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO_{3} al 5% y salmuera. La solución resultante se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El residuo en bruto se purificó por cromatografía en columna eluyendo con MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} proporcionando el producto deseado (compuesto 72a) con rendimiento del 72%. Para el compuesto 72a se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,40 (MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}): [\alpha]_{D}^{25} +81,2 (c = 0,15, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,85-0,97 (m, 24H), H_{b}) 1,17-1,27 (m, 2H), H_{c}) 1,28-1,39 (s, 3H), H_{d}) 1,40 (d, 3H), H_{e}) 1,43 (d, 3H), H_{f}) 1,46-1,50 (m, 1H) y 1,61 (t, 1H), H_{g}) 1,68-1,73 (m, 1H), H_{h}) 1,74-1,79 (m, 1H), H_{i}) 1,82-1,88 (m, 2H), 2,02-2,08 (m, 1H) y 2,11-2,17 (m, 2H), H_{j}) 2,34,2,31 (m, 1H), H_{k}) 2,57 (s, 3H), H_{l}) 2,38 (d, 2H), H_{m}) 3,18 y 3,39 (dd, 1H), H_{n}) 2,83 (s, 3H), H_{o}) 3,37-3,57 (m, 2H), H_{p}) 3,60 (d, 1H), H_{q}) 3,70-3,73 (m, 1H), H_{r}) 3,80 (s, 3H), H_{s}) 4,05-4,14 (m, 3H) y 4,36-4,48 (m, 2H), H_{t}) 4,27 (q, 1H), H_{u}) 4,56 (dd, 1H), H_{v}) 4,65 (dd, 1H), H_{w}) 4,81 (1, 1H), H_{x}) 5,19 (d, 1H), H_{y}) 5,35 (dd, 1H), H_{z}) 5,42 (dd, 1H), H_{aa}) 5,61 (dd,1H), H_{bb}) 5,71-5,75 (m, 1H), H_{cc}) 6,11 (dd, 1H), H_{dd}) 6,85 (d, 2H), H_{ee}) 7,08 (d, 2H), H_{ff}) 7,20 (d, 1H), H_{gg}) 7,54 (d, 1H), H_{hh}) 7,78 (d, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}), C_{c}) 11,7, 14,7, 15,2, 16,3, 16,9, 18,6, 20,1 y 20,9, C_{d}) 23,3, C_{e}) 23,7, C_{b}) 24,8 y 27,2, C_{i}) 24,9, 25,0 y 33,9, C_{f}) 27,9, C_{g})31,2, C_{h}) 31,3, C_{j}) 33,9, C_{l}) 36,2, C_{m}) 38,7, C_{k}) 38,8, C_{n}) 41,3, C_{o}) 46,9, C_{q}) 49,46, C_{s}) 49,52,53,0 y 67,9, C_{r}) 55,3, G_{v}) 55,4, C_{w)} 55,5, C_{u}) 57,2, C_{y}) 57,6, C_{t}) 63,9, C_{aa}) 65,9, C_{s}) 66,4, C_{p}) 66,5, C_{x}) 10,4, C_{z}) 81,5, C_{dd}) 114,1, C_{cc}) 124,0, C_{bb}) 129,1, C_{ii}) 130,0, C_{ee}) 130,3, C_{ij}) 158,6, C_{kk}) 168,6, 169,3, 170,5, 170,6, 171,3, 171,5, 172,4, 173,9, C_{ll}) 204,9; IR (puro) 3331 (br), 2956 (s), 2871 (m), 1732 (s), 1638,3 (br, superposición), 1543 (m), 1513 (s), 1448 (m), 1379 (m), 1247 (w), 1167 (w) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{57}H_{91}N_{7}O_{14} (M^{+}H) 1098,6702, hallada 1098,6726.
Ejemplo 6 Síntesis de un resto de cadena lateral de 3,4-deshidro-prolina y acoplamiento a un macrociclo de didemnina
La síntesis de la unidad 3,4-deshidroprolina empezó con trans-4-hidroxi-L-prolina (compuesto 62), que se produjo tal como describen (Rueger y cols., 1982, Can. J. Chem. 60:2918; véase la Figura 44). El ácido se protegió primero en forma de su éster etílico. El grupo amino se protegió además usando Boc_{2}O proporcionando el compuesto 53. El grupo hidroxilo se mesiló usando MsCl y piridina. El mesilato (es decir, el residuo de sulfonato metílico del compuesto 53) fue desplazado por bencenoselenuro sódico con inversión de la estereoquímica proporcionando el compuesto 54. La eliminación oxidativa del grupo fenilselenio proporcionó el alqueno correspondiente (compuesto 55) con un rendimiento del 73%.
Si el compuesto 54 se exponía directamente a condiciones de eliminación básica, podían generarse dos regioisómeros. Pero la eliminación oxidativa del compuesto 54 con fenilselenio como intermedio proporcionó sólo el regioisómero deseado. Esta regioselectividad puede deberse al hecho de que el estado de transición que produce el isómero no deseado tiene un momento bipolar mayor con energía más elevada.
La hidrólisis del éster etílico (compuesto 55) proporcionó el ácido de deshidroprolina libre (compuesto 58), que se acopló a éster de D-leucina proporcionando el compuesto 57. La hidrólisis del éster metílico proporcionó el ácido libre, que se acopló a la sal del macrociclo de didemnina usando HATU proporcionando el compuesto 58. El grupo protector Boc se eliminó usando gas HCl y la sal HCl se neutralizó usando solución saturada de NaHCO_{3} proporcionando el análogo final, el compuesto 59.
Las etapas de esta síntesis se describen a continuación en mayor detalle.
65
N-Boc-trans-4-hidroxiprolinato etílico (compuesto 53). Sal clorhidrato de trans-4-hidroxi prolinato etílico (1,0 gramos. 0,005 moles) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} saturado (10 mililitros). Se añadió Et_{3}N (2,09 mililitros, 0,015 moles) a 0ºC, seguido de la adición de Boc_{2}O (2,23 g, 0,01 moles). La mezcla de reacción se agitó toda la noche. Cuando se completó la reacción, se midió el pH y entonces era de 8. La mezcla de reacción se lavó con éter y la fase de éter se desechó. La fase acuosa se acidificó con KHSO_{4} 1 normal a pH 4, seguido de la extracción tres veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron y se concentraron. La mezcla en bruto se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con acetona al 20% en hexano proporcionando el producto deseado (compuesto 53) con un rendimiento del 71%.
Para el compuesto 53 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,50 (acetona al 40% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} +71,3 (c = 0,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 1,07-1,13 (1, 6H), H_{b}) 1,32-1,36 (m, 9H), H_{c}) 1,84-2,15 (m, dr, 2H), H_{d}) 3,23-3,49 (m, dr, 2H), H_{e}) 3,78-3,95 (br, 1H), H_{f}) 3,96-4,09 (m, 2H), H_{g}) 4,17-4,26 (m, 1H), H_{h}) 4,27-4,32 (t, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 14,0, C_{b}) 28,1, C_{c}) 38,2, C_{d}) 54,2, C_{f}) 57,7, C_{g}) 61,0, C_{h}) 69,0, C_{i}) 80,0, C_{j}) 153,9, C_{k}) 172,6: IR (puro) 3448 (br), 2978 (s), 2935 (m), 1746 (m), 1702 (s), 1676 (s), 1477 (m), 1402 (s), 1367 (m), 1339 (m) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{11}H_{23}N_{4}O^{2} (M^{+}H) 260,1497, hallada 260,1503.
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N-Boc-cis-4-fenilselenil-L-prolinato etílico (compuesto 54). Borohidruro sódico (0,15 gramos, 0,004 moles) se añadió en porciones pequeñas, a temperatura ambiente, a una solución de diselenuro difenílico (0,556 gramos, 0,0018 moles) en EtOH. La mezcla se agitó durante aproximadamente 5 minutos, hasta que desapareció el color amarillo brillante. Se añadió el mesilato preparado anteriormente (1,0 gramo, 0,003 moles), la solución se sometió a reflujo durante 2 horas y el disolvente se eliminó a vacío. El residuo se diluyó con Et_{2}O (5 mililitros) y la fase orgánica se lavó con H_{2}O (10 mililitros) y salmuera. La fase orgánica resultante se secó y se concentró. El aceite en bruto se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con acetona al 10% /hexano proporcionando el producto (compuesto 54) con un rendimiento del 85%. Para el compuesto 54 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,53 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} -16,4 (c = 0,3, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 1,21-1,24 (t, 3H), H_{b}) 1,45 (s, 9H), H_{c}) 2,05 y 2,66 (dr, 2H), H_{d}) 3,40 (m, 1H), H_{e}) 3,58 (m, 1H), H_{f1}) 3,95 (m, 1H), H_{f2}) y H_{g}) 4,10-428 (m, 2H), H_{h}) 7,25-7,55 (m, 5H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 14,0, C_{b}) 28,2, C_{c}) 36,1, C_{d}) 39,8, C_{e}) 53,6, C_{f}) 58,8, C_{g}) 60,8, C_{i}) 80,2, C_{h}) 127,0, 128,2, 134,3, C_{j}) 152,8, C_{k}) 171,8; IR (puro) 2977,0, 1747,1, 1701,9, 1477,4, 1394,4, 1190,1, 1114,1 (m) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{18}H_{25}NO_{4}Se (M^{+}H) 399,0948, hallada 399,0957.
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N-Boc-3,4-deshidro-L-protinato etílico (compuesto 55). Una mezcla de compuesto 54 (0,9 gramos, 2,26 milimoles) y CH_{2}Cl_{2} inicialmente se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Se añadió piridina (0,27 mililitros, 3,4 milimoles) gota a gota a esta solución. Después se añadió gradualmente una solución acuosa de H_{2}O_{2} al 30% (0,58 mililitros) durante un periodo de 5 minutos. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se diluyó con EtOAc. La fase orgánica se lavó con HCl al 5%, solución saturada de Na_{2}CO_{3} y salmuera. La solución resultante se secó y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna proporcionando el producto deseado (compuesto 55) con un rendimiento del 73%. Para el compuesto 55 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: Rf 0,63 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} -32,3 (c = 0,3, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 1,15-1,30 (t, 3H), H_{b}) 1,45 (s, 9H), H_{c}) y H_{d}) 4,15-4,30 (m, 4H), H_{e}) 4,98 (d, 1H), H_{f}) 5,75 (dt, 1H), H_{g}) 5,95 (dd, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 14,1, C_{b}) 29,2, C_{c}) 53,8, C_{d}) 61,8, C_{e}) 67,0, C_{h}) 80,1, C_{f}) 125,0, C_{g}) 129,2, C_{i}) 154,0, C_{j}) 170,2; IR (puro) 3458 (br), 2979 (s), 1786 (s), 1750 (s), 1710 (s), 1448 (m), 1395 (m), 1369 (s), 1318 (s), 1258 (m), 1159 (s), 1896 (m) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{12}H_{19}NO_{4} (M^{+}H) 242,1392, hallada 242,1386.
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68 
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N-Boc-3,4-deshidro-L-prolina (compuesto 56). El éster etílico 55 (0,18 gramos, 0,8 milimoles) se disolvió en THF/H_{2}O (1:1, 10 mililitros). Se añadió LiOH-H_{2}O (0,33 gramos, 8 milimoles) a la solución a 0ºC. La mezcla se agitó durante aproximadamente 6 horas y se controló por TLC. Cuando la reacción se completó, el THF se eliminó a vacío. Se añadió solución saturada de NaHCO_{3} y se lavó con éter dos veces. Todas las fases acuosas se combinaron y se acidificaron a pH 4 con KHSO_{4} 1 normal. Se usó acetato de etilo para extraer la solución acuosa acidificada tres veces. Los extractos se secaron y se concentraron proporcionando el ácido deseado (compuesto 56) con un rendimiento del 92%. Para el compuesto 56 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,20 (acetona al 30% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} +8,4 (c = 0,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 1,49 (s, rm, 9H), H_{b}) 4,25 (d, 2H), H_{c}) 5,05 (d, 1H), H_{d}) 5,80 (dt, 1H), H_{e}) 6,01 (dd, 1H), H_{f}) 8,40 (br, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 28,9, C_{b}) 53,9, C_{c}) 66,2, C_{g}) 81,8, C_{d}) 124,2, C_{e}) 129,9, C_{h}) 154,5, C_{i}) 165,3; IR (puro) 3000-3400 (br), 2957 (s), 1736 (s), 1704 (s), 1666 (s), 1400,2 (s), 1367 (m), 1177 (s), 1136 (s) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{10}H_{15}NO_{4} (M^{+}H) 213,1079, hallada 242,1086.
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N-Boc-3,4-deshidro-L-prolil-metil-N-metil-Leucinato (compuesto 57). El compuesto 56 (0,1 gramos, 0,469 milimoles) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (5 mililitros). A 0ºC, se añadió HATU (0,26 gramos, 0,58 milimoles), seguido de la adición de DIEA (0,26 mililitros, 1,88 milimoles). Finalmente se añadió sal clorhidrato de D-leucina (0,09 gramos, 0,469 milimoles) a la mezcla. La mezcla de reacción se agitó durante 6 horas y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla se diluyó con Et_{2}O y la fase orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO_{3} al 5% y salmuera. La solución resultante se secó y se concentró. El residuo en bruto se purificó por cromatografía en columna proporcionando el producto deseado (compuesto 57) con un rendimiento del 76%. Para el compuesto 57 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,32 (acetona al 30% en hexano): [\alpha]_{D}^{25}-22,7 (c = 0,4,CHCl_{3}): RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,90-1,05 (d, rm, 6H), H_{b}) 1,48 (s, rm, 9H), H_{c}) y H_{d}) 1,65-1,80 (m, 3H), H_{e}) 3,05 (s, 3H), H_{f}) 3,75 (s, 3H), H_{g}) 4,26-4,35 (m, 2H), H_{h}) 5,28 (t, 1H), H_{i}) 5,40(d, 1H), H_{j}) 5,70 (dt, 1H), H_{k}) 6,01 (dd, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 22,0, 23,8, C_{c}) 25,2, C_{b}) 29,0, C_{d}) 37,8, C_{e}) 52,2, C_{h}) 53,8, C_{i}) 65,8, C_{l}) 80,0, C_{j}) 124,0, C_{k}) 129,2, C_{m}) 159,5, C_{n}) 171,0, C_{o}) 172,2; IR (puro) 2956 (s), 1743 (s), 1705 (s), 1661 (s),1400 (s), 1366 (m), 1316 (w), 1258 (w), 1177 (m), 1128 (m) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{18}H_{30}N_{2}O_{5} (M^{+}H) 355,2233, hallada 355,2225.
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N-Boc-3,4-Deshidro-L-Prolil-N-Metil-leucina (compuesto 57a). El compuesto 57 (0,13 gramos, 0,37 milimoles) se disolvió en THF/H_{2}O (1:1,5 mililitros). Se añadió LiOH\cdotH_{2}O (0,15 gramos, 3,7 milimoles) a la solución a 0ºC. La mezcla se agitó durante aproximadamente 6 horas y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, el THF se eliminó a vacío. Se añadió solución saturada de NaHCO_{3} y se lavó con éter dos veces. Todas las fases acuosas se combinaron y se acidificaron a pH 4 con KHSO_{4} 1 normal, se usó acetato de etilo para extraer la solución acuosa acidificada tres veces. Los extractos se secaron y se concentraron proporcionando el ácido deseado (compuesto 57a) con un rendimiento del 92%. Para el compuesto 57a se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,20 (acetona al 40% en hexano); [\alpha]_{D}^{25} +52,3 (c = 0,2, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,85-1,05 (d, rm, 6H), H_{b}) 1,48 (s, rm, 9H), H_{e}) y H_{d}) 1,65-1,92 (m, 3H), H_{e}) 3,12 (s, rm, 3H), H_{f}) br, 1H, H_{g}) 4,10-4,28 (m, 2H), H_{h}) 5,15 (t, 1H), H_{i}) 5,35 (d, 1t,f), H_{j}) 5,70 (dt, 1H), H_{k}) 6,01 (dd,1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 23,3, 24,5, C_{c}) 25,0, C_{b}) 28,3, C_{d}) 31,5, C_{g}) 38,5, C_{e}) 53,6, C_{i}) 55,8, C_{h}) 65,2, C_{l}) 80,0, C_{j}) 124,1, C_{k}) 129,5, C_{m}) 153,8, C_{n}) 171,3, C_{o}) 175,3: IR (puro) 3300 (br), 2957 (s), 1731 (m), 1783 (s), 1667 (s), 1612 (m), 1481 (m), 1400 (s), 1367 (m), 1177 (s), 1136,7 (s) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{17}H_{25}N_{2}O_{5} (M^{+}H) 341,2076, hallada 341,2063.
71
Ciclo[N-(N-Boc-3,4-deshidro-L-prolil-N-metil-D-leucil)-O[[N-[(2S,3S,4S)-4[(3S,4R,5S)-4-amino-3-hidroxi-5-
metil-heptanoil]oxi-3-oxo-2,5-dimetilhexanoil)-L-leucil]-L-prolil-N,O-dimetil-L-tirosil]-L-treonilo) (compuesto 58). El ácido en bruto 57a (5,0 miligramos, 0,012 milimoles) se combinó con la sal HCl del macrociclo (14,9 miligramos, 0,012 milimoles) en CH_{2}Cl_{2} (0,1 mililitro) a 0ºC. Se añadieron HATU (48 miligramos, 0,012 milimoles) y DIEA (0,048 mililitros, 0,048 milimoles). La reacción se agitó a 0ºC toda la noche y se controló por TLC. Cuando se completó la reacción, la mezcla se diluyó con Et_{2}O y la fase orgánica se lavó con HCl al 5%, NaHCO_{3} al 5% y salmuera. La solución resultante se secó y se concentró. El residuo en bruto se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con MeOH al 5% en CH_{2}Cl_{2} proporcionando el producto deseado (compuesto 58) con un rendimiento del 72%. Para el compuesto 58 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,40 (MeOH al 10% en CH_{2}Cl_{2}); [\alpha]_{D}^{25} -83,2 (c = 0,3, CHCl_{3}); RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,85-0,97 (m, 24H), H_{b}) 1,17-1,27 (m, 3H), H_{c}) 1,45 (s, 9H), H_{d}) 1,40 (d, 3H), H_{e}) 1,43 (d, 3H), H_{f}) 1,46-1,50 (m, 1H) y 1,61 (t, 1H), H_{g}) 1,68-1,73 (m, 1H), H_{h}) 1,74-1,79(m, 1H), H_{i}) 1,82-1,88 (m, 2H), 2,02-2,08 (m, 1H) y 2,11-2,17 (m, 2H), H_{j}) 2,34-2,37 (m, 1H), H_{k}) 2,57 (s, 3H), H_{l}) 2,63 (dd, 1H) y 2,95 (d,1H), H_{m}) 3,18 y 3,39 (dd, 1H), H_{n}) 3,23 (s, 3H), H_{o}) 3,57-3,61 (m, 2H), H_{p}) 3,33 (d, 1H), H_{q}) 3,69-3,71 (m, 1H), H_{r}) 3,80 (s, 3H), H_{s}) 4,05-4,14 (m, 2H) y 4,36-4,48 (m, 2H), H_{t}) 4,27 (q, 1H), H_{u}) 4,56 (dd, 1H), H_{v}) 4,65 (dd, 1H), H_{w}) 4,81 (t, 1H), H_{x}) 5,19 (d, 1H), H_{y}) 5,35 (dd, 1H), H_{z}) 5,42 (dd, 1H), H_{aa}) 5,61 (dd, 1H), H_{bb}) 5,73-5,75 (m, 1H), H_{cc}) 6,11 (dd, 1H), H_{dd}) 6,85 (d, 2H), H_{ee}) 7,08 (d, 2H), H_{ff}) 7,20 (d,1H), H_{gg}) 7,54 (d, 1H), H_{hh}) 7,78 (d, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 11,7, 14,7, 15,2, 16,3, 16,9, 18,6, 20,1 y 20,9, C_{d}) 23,3, C_{e}) 23,7, C_{a}) 24,8 y 27,2, C_{i}) 24,9, 25,0 y 33,9, C_{f}) 27,9, Cc) 28,6, C_{g}) 31,2, C_{h}) 31,3, C_{j}) 33,9, C_{l}) 36,2, C_{m}) 38,7, C_{k}) 38,8, C_{n}) 41,3, C_{o}) 46,9, C_{q}) 49,46, C_{s}) 49,52, 53,0 y 67,9, C_{r}) 55,3, C_{v}) 55,4, C_{w}) 55,5, C_{u}) 57,2, C_{y}) 57,6, C_{t}) 63,9, C_{aa}) 65,9, C_{p}) 66,5, C_{x}) 70,4, C_{z}) 81,5, C_{z}) 81,7, C_{dd}) 114,1, C_{ee}) 124,0, C_{bb}) 129,1, C_{ii}) 130,0, C_{ee}) 130,3, C_{jjj}) 158,6, C_{kk}) 168,6, 169,3, 170,5, 170,6, 171,3, 171,5, 172,4, 173,9, 204,9; IR (puro) 3337 (s), 2959 (s), 2870 (m), 1733 (s), 1645 (s), 1640 (s), 1543 (m), 1514 (m), 1454 (m), 1407 (m), 1368 (m), 1302 (w), 1248 (m), 1171 (m) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{59}H_{91}N_{7}O_{15} (M^{+}Na) 1160,6471, hallada 1160,6415.
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72
Ciclo[N-(N-3,4-dehidro)L-prolil-N-metil-D-leucil)-O[[N-[(2S,3S,4S)-4[(3S,4R,5S)-4-amino-3-hidroxi-5-metil-
heptanoil]oxi-3-oxo-2,5-dimetilhexanoil)-L-leucil]-L-profil-N,O-dimetil-L-tirosil)-L-treonilo] (compuesto 59). El
compuesto 58 (4 miligramos) se disolvió en HCl/dioxano (0,5 mililitros) y se agitó a temperatura ambiente. Cuando se completó la reacción, el disolvente se eliminó a vacío. Se añadió tolueno dos veces y la solución se concentró. El residuo se secó a vacío toda la noche proporcionando la sal HCl deseada en un 98%. La sal HCl se disolvió en EtOAc, se lavó con NaHCO_{3} saturado y la fase orgánica se lavó de nuevo con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró proporcionando el producto deseado (compuesto 59) con un rendimiento del 75%. Para el compuesto 59 se obtuvieron los siguientes datos analíticos: R_{f} 0,20 (MeOH al 10% /CH_{2}Cl_{2}); [\alpha]_{D}^{25} -242,3 (c = 0,2, CHCl_{3}): RMN de ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}) \delta H_{a}) 0,79-0,97 (m, 24H), H_{b}) 1,12-1,23 (m, 3H), H_{d}) 1,32-1,40 (d, 3H), H_{e}) 1,43 (d, 3H), H_{f})) 1,46-1,50 (m, 1H) y 1,61 (t, 1H), H_{g}) 1,68-1,73 (m, 1H), H_{h}) 1,74-1,79 (m, 1H), H_{i}) y H_{j}) 1,82-1,88 (m, 2H), 2,02-2,08 (m, 1H) y 2,11-2,17 (m, 3H), H_{k}) 2,25 (s, 3H), H_{l}) 2,51 (d, 2H), H_{m}) 3,18 y 3,39 (dd, 1H), H_{n}) 2,95 (s, 3H), H_{o}) 3,57-3,61 (m,2H), H_{p}) 3,33 (d, 1H), H_{q}) 3,69-3,71 (m, 1H), H_{r}) 3,73 (s, 3H), H_{s}) 3,90-4,18 (m, 2H), H_{t}) 4,49 (q, 1H), H_{u}) 4,56 (dd, 1H), H_{v}) 4,65 (dd, 1H), H_{w}) 4,81 (t, 1H), H_{x}) 5,19 (m, 3H), H_{bb}) y H_{aa}) 5,73-5,75 (m, 3H), H_{cc}) y H_{z}) 6,01 (dd, 3H), H_{dd}) 6,85 (d, 2H), H_{ee}) 7,08 (d, 2H), H_{ff}) 7,20 (d, 1H), H_{gg}) 7,54 (d, 1H), H_{hh}) 7,78 (d, 1H); RMN de ^{13}C (125 MHz, CDCl_{3}) \delta C_{a}) 11,7, 14,7, 15,2, 16,3, 16,9, 18,6, 20,1 y 20,9, C_{d}) 23,3, C_{e}) 23,7, C_{a}) 24,8 y 27,2, C_{i}) 24,9, 25,0 y 33,9, C_{f}) 27,9, C_{c}) 28,6, C_{g}) 31,2, G_{h}) 31,3, C_{j}) 33,9, C_{l}) 36,2, C_{m}) 38,7, C_{k}) 38,8, C_{n}) 41,3, C_{o}) 46,9, C_{q}) 49,46, C_{s}) 49,52, 53,0, y 67,9, C_{r}) 55,3, C_{v}) 55,4, C_{w}) 55,5, C_{u}) 57,2, C_{y}) 57,6, C_{t}) 63,9, C_{aa}) 65,9, C_{p}) 66,5, C_{x}) 70,4, C_{z}) 81,5, C_{dd}) 114,1, C_{cc}) 124,0, C_{bb}) 129,1, C_{ii}) 130,0, C_{ee}) 130,3, C_{jj}) 158,6, C_{kk}) 168,6, 169,3, 170,5, 171,3, 171,5, 172,4, 173,9, C_{ll}) 204,9; IR (puro) 3337 (s), 2958 (s), 2861 (m), 1734 (s), 1642 (s), 1638 (s), 1547 (m), 1514 (m), 1451 (m), 1385 (w), 1243 (w),1166 (w) cm^{-1}; EMAR m/z calculada para C_{54}H_{83}N_{7}O_{13} (M^{+}H) 1038,6127, hallada 1038,6103.
Ejemplo 7 Síntesis y evaluación biológica de los análogos de didemnina con fotoafinidad
Se han identificado dos proteínas que se unen a las didemninas, en concreto el factor de elongación eucariótico 1\alpha (EF-1a; Crews y cols., 1994 J. Biol. Chem. 269:15411-15414) y palmitoil proteína tioesterasa 1 (PPT1; Crews y cols., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4316-4319). Sin embargo, la interacción estructural exacta entre didemnina B y estas dos proteínas no se comprende del todo. Los experimentos que se describen en este Ejemplo se realizaron para generar derivados de didemnina fotorreactivos que puedan usarse para investigar la unión de las didemninas correspondientes a estas y otras dianas celulares y que puedan sintetizarse derivados de tamandarina fotorreactivos.
En este ejemplo se describe la síntesis de los análogos de didemnina denominados compuestos 403, 404, 405 y 406. Estos compuestos tienen la estructura de la fórmula XXI, en la que R^{2} es un sustituyente que tiene la estructura de la fórmula III. R^{3} es metilo. R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} Es un radical hidruro. R^{7} es un radical metoxi. R^{10} es una cadena lateral de leucina. X es -O-, Y es un radical hidruro y R^{1} tiene la identidad que se muestra en las Figuras 47A, 47B, 47C y 47D respectivamente.
Cada uno de compuestos 403, 404, 405 y 406 es un derivado de didemnina A y cada una de estas moléculas comprende un residuo ácido 4-benzoilbenzoico. Este tipo de derivado de benzofenona se seleccionó como grupo fotorreactivo debido a sus múltiples ventajas en el marcado de fotoafinidad, tal como describen (Dorman y cols., 1994. Biochemistry 33:5661-5673; Fleming, 1995. Tetrahedron 51:12479-12520). Las benzofenonas se manipulan fácilmente con luz ambiental, pero son fotoactivadas por la luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 350 nanómetros. La luz que tiene esta longitud de onda, generalmente no daña las proteínas y se usó para evitar los cambios inducidos por la luz en las proteínas diana que se usaron en estos experimentos. El dirradical de benzofenona activado tiende a evitar las moléculas de disolvente y los nucleófilos y se entrecruza de forma preferente con centros de carbono no reactivos. Debido a que la fotoexcitación de las benzofenonas es reversible, una molécula dada del análogo que no esté próxima al sitio de unión de los ligandos puede sufrir varios ciclos de excitación y relajación sin sufrir reacciones secundarias no específicas, como resultado, las benzofenonas tienden a entrecruzarse con una mayor especificidad de sitio que los fotóforos tales como arilazidas, que sufren reacciones de fotólisis irreversibles.
Se sintetizaron las porciones de las cadenas laterales de los compuestos 403, 404, 405 y 406 y después se acoplaron a un intermedio macrólido avanzado como etapa final. La Figura 48 muestra la síntesis del residuo D-leucina que es común a los cuatro análogos. D-leucina se convirtió en su carbamato de bencilo (compuesto 407) usando cloroformiato de bencilo en NaHCO_{3} y agua. El compuesto 407 se dialquiló usando sulfato dimetílico en presencia de KOH en polvo. THF, y Bu_{4}N^{+}HSO_{4}^{-}. La hidrogenólisis catalítica del carbamato sobre un catalizador de Pd/C en presencia de hidrógeno y acetato de etilo:metanol (1:1), seguido de atrapamiento con HCl en presencia de metanol proporcionó la sal clorhidrato de la amina, el compuesto 409. Tal como se muestra en la Figura 49, el compuesto 409 se acopló con ácido 4-benzoilbenzoico manteniendo el ácido con BOP-Cl, un reactivo que es generalmente de utilidad en el acoplamiento de N-metilaminas en presencia de NMM y DMF a 0ºC durante 30 minutos y después poniendo en contacto el producto de reacción con el compuesto 409. La eliminación del grupo metilo mediante saponificación del éster proporcionó el compuesto 412.
El derivado de benzofenona denominado compuesto 410 (véase la Figura 50) se alongó mediante acoplamiento mediado por BOP con un enlazador de éster metílico de glicina en presencia de BOP, NMM, DMF y la sal clorhidrato del éster metílico de glicina. La saponificación del éster, compuesto 413, en presencia de LiOH, agua, THF y metanol, seguido de acoplamiento con la sal de amina 409 en presencia de BOP-Cl, NMM y DMF y la subsiguiente saponificación en presencia de LiOH, agua, THF y metanol proporcionó el compuesto 415. El compuesto 417 se preparó de forma análoga, usando un éster metílico del ácido aminohexanoico. El compuesto 419 se preparó mediante acoplamiento dos veces del compuesto 410 con éster metílico del ácido aminohexanoico antes del acoplamiento con el compuesto 409 y la subsiguiente saponificación.
Los compuestos 412, 415, 417 y 419 se acoplaron con la sal macrocíclica descrita anteriormente (preparada tal como describen, Mayer y cols., 1994, J. Org. Chem. 59:5192-5205; Mayer y cols. 1995. Acta Crystallogr. C51:1609-1614) usando el reactivo de acoplamiento BOP para obtener los compuestos 403, 404, 405 y 406, respectivamente, con un rendimiento del 68-81%.
Para evaluar su idoneidad para el marcado por fotoafinidad de la proteína de unión de EF-1a, se evaluaron los compuestos 403, 404, 405 y 406 para determinar la potencia de inhibición de la biosíntesis de proteínas. Los resultados de esta evaluación se recogen en la Tabla 2. El ensayo de traducción en un sistema sin células fue tal como describen (SirDeshpande y cols., 1995, Biochemistry 34:9177-9184; Ahuja y cols., J. Med. Chem. 2000 43:4212-4218). En este ensayo, didemnina B mostró una concentración inhibidora semimáxima (CI_{50}) de 3 micromolar. Los resultados de la Tabla 2 demuestran que la potencia de inhibición de la biosíntesis de proteínas sigue intacta incluso cuando se incorpora un gran residuo de benzofenona a la estructura de didemnina B. La longitud del enlazador parece ejercer un efecto marginal, siendo las dos cadenas laterales más cortas (es decir, los compuestos 403 y 404) casi equipolentes a didemnina B. El aumento de la longitud de la cadena se correlaciona con reducciones modestas de la potencia inhibidora. Estos resultados son consistentes con los obtenidos por otros (Sakai y cols., 1996, J. Med. Chem. 39:2819-2834; Ahuja y cols. J. Med. Chem. 2000 43:4212-4218) y demuestran que la inhibición de la biosíntesis de proteínas es muy tolerante a la modificación de las cadenas laterales.
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TABLA 2
Compuesto Rendimiento del acoplamiento CI_{50}
Didemnina B 3,0
403 68% 4,0
404 78% 4,5
405 74% 24
406 81% 19
La Tabla 3 recoge los resultados preliminares obtenidos usando la prueba de selección en células tumorales NCI-60 (que se describe en Boyd y cols., 1995, Drug Dev. Res. 34: 91-109). Los datos de la Tabla 3 indican que los análogos de benzofenona con fotoafinidad pueden usarse para estudiar la actividad antitumoral de las didemninas. El examen del parámetro de la inhibición del crecimiento al 50% (IC_{50}) muestra que los cuatro análogos mantienen una potencia comparable a didemnina B. Al contrario que con los resultados obtenidos con respecto a la biosíntesis deproteínas in vitro, no parece haber ninguna relación clara entre la longitud del enlazador y la actividad. Sin embargo, la inhibición del crecimiento total (ICT) para los cuatro análogos requiere unas concentraciones significativamente mayores de las que requiere didemnina B. De forma interesante, los cuatro análogos exhiben de tres a diez veces menos toxicidad medida según el parámetro de concentración letal CL_{50}
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TABLA 3
Compuesto IC_{50} ICT CL_{50}
(nanomolar) (micromolar) (micromolar)
Didemnina B 13 0,066 3,8
403 3,0 0,35 15
404 13 2,0 23
405 4,3 20,5 19
406 17 5,0 48
Los resultados de los experimentos que se presentan en este Ejemplo demuestran que los análogos de didemninas que contienen benzofenona pueden prepararse totalmente por síntesis. La evaluación biológica de los análogos indica que la incorporación de benzofenona las cadenas laterales es una estrategia factible para el marcado por fotoafinidad de dianas moleculares de las didemninas.
La descripción de cada patente, solicitud y publicación de patente que se citan en la presente memoria se incorpora por la presente a la presente memoria por referencia en su totalidad.
Aunque esta invención ha sido descrita con referencia a realizaciones específicas, otras personas de experiencia en la técnica pueden elaborar realizaciones y variaciones de esta invención sin alejarse del espíritu y alcance verdaderos de la invención. Las reivindicaciones anexas incluyen todas tales realizaciones y variaciones equivalentes.

Claims (78)

1. Una composición que comprende un análogo de tamandarina que tiene la estructura
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73 
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en la que:
i) R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-H,
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato.
ii) o
(a) R^{3} se selecciona del grupo constituido por -CH_{3} y -H; y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura
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74
o
(b) R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente, que tiene la estructura
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75
iii) cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -C_{2}H_{5};
iv) R^{4} es una cadena lateral de isoleucina;
v) X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-;
vi) Y se selecciona del grupo constituido por -H y un grupo protector de hidroxilo;
vii) R^{10} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina y una cadena lateral de lisina; y
viii) la molécula no es tamandarina A.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-H,
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-(S)-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato.
3. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-H,
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato.
4. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{2} es
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76 
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R^{3} es metilo, cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} es un radical hidruro, R^{7} es metoxi, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O- e Y es un radical hidruro.
\newpage
5. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de tamandarina es
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77 
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6. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de tamandarina es
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78 
\vskip1.000000\baselineskip
7. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{1} es -(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-lactato.
8. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{1} es -(N-metil-R-leucina).
9. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{1} es -(N-metil-R-leucina)-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-gluta-
mina-(S)-piroglutamato, Y es -H y X es -O-.
10. La composición de la reivindicación 9, en la que el análogo de tamandarina es
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79
o
80 
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11. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{1} es -(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo).
12. La composición de la reivindicación 11, en la que el análogo de tamandarina se selecciona del grupo constituido por
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81 
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\vskip1.000000\baselineskip
82
83 
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y
\vskip1.000000\baselineskip
84 
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13. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{1} es -(N-metil)leucina-(S)-prolina-piruvato.
14. La composición de la reivindicación 13, en la que el análogo de tamandarina es
\vskip1.000000\baselineskip
85 
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o
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86
15. La composición de la reivindicación 1, en la que Y es -H, y en la que R^{2} tiene la estructura
87
16. La composición de la reivindicación 1, en la que R^{2} es una cadena lateral de lisina e Y es -H.
17. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de tamandarina tiene la siguiente estructura
88
en la que FL es un fluoróforo.
18. La composición de la reivindicación 1, en la que X es -(NH)-.
19. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de tamandarina se selecciona del grupo constituido por
89 
\global\parskip0.990000\baselineskip
90
y
91
20. La composición de la reivindicación 1, en la que el análogo de tamandarina se selecciona del grupo constituido por
92 
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93
94
95
96
97 
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98 
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99 
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100
101
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103
y
104
21. La composición de la reivindicación 1, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
22. Un soporte que tiene el análogo de tamandarina de la reivindicación 1 unido covalentemente al mismo.
23. Una composición que comprende un compuesto que tiene la estructura que se selecciona del grupo constituido por
105 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
106 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
107
108
en la que:
i) o
(a) R^{3} se selecciona del grupo constituido por -CH_{3} y -H; y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de prolina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura
109
o
(b) R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente, que tiene la estructura
110
ii) cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -C_{2}H_{5};
iii) R^{4} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina y una cadena lateral de valina;
iv) X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-;
v) Y se selecciona del grupo constituido por -H y un grupo protector de hidroxilo;
vi) R^{10} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina y una cadena lateral de lisina; y
vii) R^{13} es un resto escindible enzimáticamente que puede escindirse mediante una enzima, que se selecciona del grupo constituido por una carboxipeptidasa, una \beta-lactamasa, una \beta-galactosidasa, una penicilina V-amidasa, una citosina desaminasa, una nitrorreductasa, una fosfatasa alcalina, una \beta-glucuronidasa y un anticuerpo catalítico.
24. La composición de la reivindicación 25, en la que R^{13} tiene la estructura
111
25. La composición de la reivindicación 25, en la que R^{13} tiene la estructura
112
26. Una composición que comprende un análogo de didemnina que tiene la estructura
113
en la que:
i) R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato.
ii) o
(a) R^{3} se selecciona del grupo constituido por -CH_{3} y -H; y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura
114
(b) R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente, que tiene la estructura
115
iii) cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -C_{2}H_{5};
iv) R^{4} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina y una cadena lateral de valina;
v) X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-;
vi) Y se selecciona del grupo constituido por -H y un grupo protector de hidroxilo; y
vii) R^{10} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina y una cadena lateral de lisina.
27. La composición de la reivindicación 26, en la que R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-(S)-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato.
28. La composición de la reivindicación 26, en la que R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato y
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato.
29. La composición de la reivindicación 26, en la que R^{2} es
\vskip1.000000\baselineskip
116
R^{3} es metilo, R^{4} es una cadena lateral de isoleucina, cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} es un radical hidruro, R^{7} es metoxi, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O- e Y es un radical hidruro.
30. La composición de la reivindicación 26, en la que el análogo de didemnina es
\vskip1.000000\baselineskip
117
31. La composición de la reivindicación 26, en la que el análogo de didemnina es
118
32. La composición de la reivindicación 26, en la que R es -(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-lactato.
33. La composición de la reivindicación 26, en la que Y es -H, y en la que R^{2} tiene la estructura
119
34. La composición de la reivindicación 26, en la que R^{2} es una cadena lateral de lisina e Y es -H.
35. La composición de la reivindicación 26, en la que X es -(NH)-.
36. La composición de la reivindicación 26, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
37. Un soporte unido de forma covalente al análogo de didemnina de la reivindicación 26.
38. Un procedimiento para preparar un análogo de tamandarina de la reivindicación 1 o un análogo de didemnina de la reivindicación 26, cuya mejora comprende incorporar un resto desoxo-prolina en lugar de un resto prolina del análogo, en el que R^{1} comprende un residuo de desoxo-prolina.
39. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que el análogo comprende un resto (N-metil)leucina-prolina y en el que el resto (N-metil)leucina-prolina está sustituido por un resto (N-metil)leucina-desoxo-prolina.
40. El procedimiento de la reivindicación 39, en el que el resto (N-metil)leucina-desoxo-prolina se prepara reduciendo la función éster de prolina a una función aldehído; y acoplando la prolina al resto (N-metil)leucina mediante aminación reductora para proporcionar el resto (N-metil)leucina-desoxo-prolina.
41. El procedimiento de la reivindicación 40, en el que el resto amina de la prolina se protege con un grupo protector de amina antes de la aminación reductora.
42. El procedimiento de la reivindicación 40, en el que la función éster de la prolina se reduce a una función aldehído poniendo en contacto la prolina con una base fuerte y después poniendo en contacto la prolina con un agente de oxidación.
43. El procedimiento de la reivindicación 40, en el que la aminación reductora se realiza en un disolvente no acuoso en presencia de una base fuerte y un catalizador de ácido carboxílico.
44. Un procedimiento para preparar un análogo de tamandarina de la reivindicación 1 o un análogo de didemnina de la reivindicación 26, cuya mejora comprende incorporar un resto deshidro-prolina en lugar de un resto prolina del análogo, en el que R^{1} comprende un residuo de deshidro-prolina.
45. El procedimiento de la reivindicación 44, en el que el análogo comprende un resto (N-metil)leucina-prolina y en el que el resto (N-metil)leucina-prolina está sustituido por un resto N-(metil)leucina-deshidro-prolina.
46. El procedimiento de la reivindicación 44, en el que el resto deshidro-prolina se prepara protegiendo los restos carboxilo y amino de 4-hidroxiprolinato, alquilosulfonilando el resto 4-hidroxilo, desplazando el resto sulfonato de alquilo con un resto ariloselenilo, eliminando oxidativamente el resto ariloselenilo para proporcionar un resto deshidro-prolina que tiene restos carboxilo y amina protegidos, y acoplando el resto deshidro-prolina con un resto amina del análogo.
47. El procedimiento de la reivindicación 46, en el que el resto sulfonato de alquilo es un resto sulfonato metílico.
48. El procedimiento de la reivindicación 46, en el que el resto ariloselenilo es un resto feniloselenilo.
49. El procedimiento de la reivindicación 44, en el que el 4-hidroxiprolinato es trans-4-hidroxiprolinato.
50. Una composición que comprende un fragmento de didemnina que tiene la estructura
120
en la que
i) Y se selecciona del grupo constituido por -H y un grupo protector de hidroxilo;
ii) X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-;
iii) R^{4} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina y una cadena lateral de valina;
iv) APG es un grupo protector de amina; y
v) R^{11} se selecciona del grupo constituido por -OH, -NH_{2}, -O(alilo), -O(pentafluorofenilo) y un sustituyente que tiene la estructura
121
en el que
a) R^{1} se selecciona del grupo constituido por -H y un grupo protector de amina
b) o
(i) R^{3} se selecciona del grupo constituido por -CH_{3} y -H; y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de prolina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura
122
o
(ii) R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente, que tiene la estructura
123
c) cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y –C_{7}H_{5};
d) R^{10} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de lisina y una cadena lateral de lisina protegida; y
e) R^{12} se selecciona del grupo constituido por -H y 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo.
51. Un procedimiento para fabricar un fragmento de didemnina, que comprende acoplar un primer reactivo que tiene la estructura
124
y un segundo reactivo que tiene la estructura
125
para proporcionar un primer fragmento de didemnina que tiene la estructura
126
en los que X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-; en los que APG es un grupo protector de amina; en los que Y es un grupo protector de hidroxilo; y en los que R^{4} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina y una cadena lateral de valina.
52. El procedimiento de la reivindicación 51, en el que Y es -triisopropilsililo.
53. El procedimiento de la reivindicación 52, que además comprende hidrolizar el primer fragmento de didemnina para proporcionar un segundo fragmento de didemnina que tiene la estructura
127 
\newpage
54. El procedimiento de la reivindicación 53, que además comprende añadir un activador al resto carbonilo del segundo fragmento de didemnina para proporcionar un tercer fragmento de didemnina que tiene la estructura
128
en el que -ACT es un activador.
55. El procedimiento de la reivindicación 54, que además comprende acoplar el tercer fragmento de didemnina y un tercer reactivo que tiene la estructura
129
para proporcionar un cuarto fragmento de didemnina que tiene la estructura
130
en el que:
i) o
(a) R^{3} se selecciona del grupo constituido por -CH_{3} y -H; y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de prolina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura
131
o
(b) R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente, que tiene la estructura
132 
\vskip1.000000\baselineskip
ii) cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -C_{2}H_{5};
iii) APG es un grupo protector de amina;
iv) SEM es 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo y
v) R^{10} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina y una cadena lateral de lisina.
56. Un procedimiento de fabricar un análogo de didemnina, en el que el procedimiento comprende eliminar el resto SEM y el resto APG, que protege el grupo amino unido al átomo de carbono al que está unido R^{4}, del cuarto fragmento de didemnina de la reivindicación 55 y ciclar el cuarto fragmento de didemnina para proporcionar un primer análogo de didemnina que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
133 
\vskip1.000000\baselineskip
57. El procedimiento de la reivindicación 56, que además comprende eliminar el grupo APG del primer análogo de didemnina para proporcionar un segundo análogo de didemnina que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
134 
\vskip1.000000\baselineskip
58. El procedimiento de la reivindicación 56, en el que el grupo APG se selecciona del grupo constituido por un resto carbobenciloxi y un resto terc-butiloxicarbonilo.
59. El procedimiento de la reivindicación 57, que además comprende acoplar el segundo análogo de didemnina y un cuarto reactivo que tiene la estructura
135
para proporcionar un tercer análogo de didemnina que tiene la estructura
136
en el que R^{14} se selecciona del grupo constituido por
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato;
y
uno cualquiera de los restos anteriores unido a un resto escindible enzimáticamente que puede escindirse mediante una enzima que se selecciona del grupo constituido por una carboxipeptidasa, una \beta-lactamasa, una \beta-galactosidasa, una penicilina V-amidasa, una citosina desaminasa, una nitrorreductasa, una fosfatasa alcalina, una \beta-glucuronidasa y un anticuerpo catalítico.
60. El procedimiento de la reivindicación 59, en el que Y es un grupo protector de hidroxilo, comprendiendo el procedimiento además eliminar el grupo protector de hidroxilo del segundo análogo de didemnina para proporcionar un cuarto análogo de didemnina que tiene la estructura
137
61. Uso de una cualquiera de las composiciones de la reivindicación 1, 23, 26 ó 50 para preparar un medicamento para inhibir la síntesis de proteínas en una célula.
62. Uso de una cualquiera de las composiciones de la reivindicación 1, 23, 26 ó 50 para preparar un medicamento para inhibir el crecimiento de una célula.
63. Uso de una cualquiera de las composiciones de la reivindicación 1, 23, 26 ó 50 para preparar un medicamento para inhibir la proliferación de una célula.
64. Uso de una cualquiera de las composiciones de la reivindicación 1, 23, 26 ó 50 para preparar un medicamento para inhibir la ocnogénesis en una célula.
65. Uso de una cualquiera de las composiciones de la reivindicación 1, 23, 26 ó 50 para preparar un medicamento para potenciar la apóptosis de una célula.
66. Una composición que comprende un análogo de tamandarina que tiene la estructura
138
en el que
i) R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-H,
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato;
ii) o
(a) R^{3} se selecciona del grupo constituido por -CH_{3} y -H; y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura
139
o
(b) R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente, que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
140 
\vskip1.000000\baselineskip
iii) cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -C_{2}H_{5};
iv) R^{4} es una cadena lateral de valina;
v) X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-;
vi) Y se selecciona del grupo constituido por -H y un grupo protector de hidroxilo;
vii) R^{10} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina y una cadena lateral de lisina; y
viii) la molécula no es tamandarina B.
67. La composición de la reivindicación 66, en la que R^{4} es una cadena lateral de valina, Y es -H y X es -O-.
68. Un análogo de tamandarina que se selecciona del grupo constituido por
141 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
142
143 
\vskip1.000000\baselineskip
144 
\vskip1.000000\baselineskip
145
y
146 
\newpage
69. La composición de la reivindicación 67, en la que el análogo de tamandarina es
147
70. Una composición que comprende un análogo de didemnina que tiene la estructura
148
en el que
i) R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-H,
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-prolina-alanina-leucina-piroglutamato y
-(N-metil)-leucina-deshidro-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato;
ii) o
(a) R^{3} se selecciona del grupo constituido por -CH_{3} y -H; y R^{2} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de isoleucina, una cadena lateral de valina, una cadena lateral de alanina, una cadena lateral de norleucina, una cadena lateral de norvalina, una cadena lateral de leucina, una cadena lateral de histidina, una cadena lateral de triptófano, una cadena lateral de arginina, una cadena lateral de lisina, un segundo fluoróforo y un sustituyente que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
149
o
(b) R^{2} y R^{3} juntos son un sustituyente, que tiene la estructura
150
iii) cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{7}, R^{8} y R^{9}, cuando están presentes se seleccionan independientemente del grupo constituido por -H, -OH, -OCH_{3}, -CO(C_{6}H_{5}), -Br, -I, -F, -Cl, -CH_{3} y -C_{2}H_{5};
iv) R^{4} es una cadena lateral de valina;
v) X se selecciona del grupo constituido por -O- y -(NH)-;
vi) Y se selecciona del grupo constituido por un radical hidruro y un grupo protector de hidroxilo;
vii) R^{10} se selecciona del grupo constituido por una cadena lateral de leucina y una cadena lateral de lisina.
71. La composición de la reivindicación 70, en la que R^{1} se selecciona del grupo constituido por
-H,
-(terc-butiloxicarbonilo),
-leucina,
-(N-metil)leucina,
-(N-metil)leucina-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(N-metil-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina.
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo).
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(S)-lactato-glutamina-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-alanina-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-deshidro-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-leucina-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato, y
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-piruvato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(un primer fluoróforo),
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-piroglutamato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-lactato-(S)-glutamina-(S)-ciclopentanoato,
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(S)-alanina-(S)-leucina-(S)-piroglutamato y
-(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-(N-metil-S-alanina)-(S)-leucina-(S)-piroglutamato.
72. La composición de la reivindicación 70, en la que R^{2} es
151
R^{3} es metilo, cada uno de R^{5}, R^{6}, R^{8} y R^{9} es un radical hidruro, R^{7} es metoxi, R^{10} es una cadena lateral de leucina, X es -O- e Y es un radical hidruro.
73. La composición de la reivindicación 70, en la que R es -(N-metil)leucina-desoxo-(S)-prolina-lactato.
74. La composición de la reivindicación 70, en la que Y es -H, y en la que R^{2} tiene la estructura
152
75. La composición de la reivindicación 70, en la que R^{2} es una cadena lateral de lisina e Y es -H.
76. La composición de la reivindicación 70, en la que X es -(NH)-.
77. La composición de la reivindicación 70, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
78. Un soporte unido de forma covalente al análogo de didemnina de la reivindicación 70.
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