CZ17293A3

CZ17293A3 - Novel species of fungi and their use in production of antibiotics

Info

Publication number: CZ17293A3
Application number: CZ93172A
Authority: CZ
Inventors: Jagroop S Dahiya
Original assignee: Novopharm Ltd
Priority date: 1992-02-10
Filing date: 1993-02-10
Publication date: 1993-12-15
Also published as: PL297691A1; EE03048B1; SI9300068A; BG97421A; CN1076965A; BR9300467A; NZ245713A; IL104481A0; EP0556699A1; NO930446L; HUT67061A; FI930561A0; NO930446D0; BG61180B1; LV10502B; AU667498B2; HRP930134A2; LV10502A; HU9300330D0; JPH0622780A

Description

Předložený vynález se týká nových kmenů hub, zpracovaných genetickým inženýrstvím, a jejich použití při přípravě antibiotik . Specifičtěji se týká nových, genetickým inženýrstvím zpracovaných kmenů Agpergillus a jejich použití při přípravě léčiva lovastatinu a jeho analogů.

Dosavadní stav techniky

Lovastatin je chemicky 1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7dimethyl-8-/2- (tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl·)ethyl/-1-naftalenylester kyseliny /1S-/1 (S^s), 3ςς,7β,8/3> (2S*, 4S*), 8 //-2-me thyl butanové a má chemický vzorec

-2Je využitelný jako antihypercholesterolemické činidlo, protože je účinným inhibitorem HMG-CoA reduktázy, enzymu řídícího rychlost biosyntézy cholesterolu, úe houbovým metaboliten produkovaným fermentačním procesem za použití vybraných kmenů plísní.

Aitibiotika jako je lovastatin jsou metabolity, které pro svoji syntézu vyžadují soubor několika enzymů, -^ro umožnění jejich produkce molekulárním klonováním mikroorganismů, produkujících antibiotiku»je vyžadována izolace, analýza a snad modifikace odpovídajícího genu pro některé enzymy. Pokusy izolovat takové geny z příslušných kmenů plísní až dosud poskytly klony, nesoucí bud individuální geny souboru nebo pouze neúplný soubor genů- viz ^alpartida a Hopwood, Molecular Cloning of the Whole Biosynthetic Pathway of a Střeptornyces Aitibiotics and its Expression in a ⁿeterologous Host”, Nátuře (1984), 309, str. 462-464.

kanadský patent Č. 1129794 Endo, popisuje přípravu lovastatinu fermentací za použití kmene plísnového druhu ^onascus ruber.

kanadský patent č. 1161380 Monaghan a spol., popisuje přípravu lovastatinu fenmentací za použití kmenů druhu plísně Agpergillus terreus.

V obou těchto známých postupech je lovastatin produkován samotný spolu s jinými, velmi chemicky podobnými sloučeninami, ve větších množstvích a musí být od nich oddělován* Za použití Monascus ruber je lovastatin produkován s monacolinem J. Za použití Aspergillue terreus je doprovázen dihydrolovastatinem a hydroxykyselinou. Zatímco hydroxyskupina může být snadno laktonizována na lovastatin, dihydrolovastatin od něj musí být oddělen.

-3Podstata vynálezu

Objektem předloženého vynálezu je poskytnout nové, pomocí genetického inženýrství připravené mutanty kmenů plísní., které jsou schopny využití ve fermentačních procesech pro přípravu lovastatinu.

Dalším objektem vynálezu je poskytnutí nových způsobů přípravy lovastatinu za použití těchto kmenů při fermentaci.

Podle jednoho aspektu předloženého vynálezu jsou poskytnuty nové mutanty kmenů plísní vhodného druhu rodu Aspergillus, které jsou schopny exprese a sekrece lovastatinu. Tyto kmeny obsahují geny souboru enzymů produkujících lovastatin, ve funkčním vzájemném vztahu, odvozené od DNA kmenů éspergillus terreus, produkujících lovastatin. Jsou připraveny způsobem transformace protoplastů DNA z kmene -áspergillus terreus, produkujícího lovastatin, obsahující^ také vhodný selektovatelný markér, s jinými druhy ^spergillus, které neprodukují lovastatin a jsou vybrány ze skupiny, zahrnující A.oryzae, A.fumígatus, A.niger, A.nidulans a A,flavus, výběrem transformantů takto vytvořených, podle selektovatelného markéru, identifikací a izolací transformantů, produkujících lovastatin a jejich subklonováním.

Podle dalšího aspektu vynálezu je poskytnut způsob přípravy lovastatinu, který zahrnuje fermentaci živného media s transformantem mikroorganismu ^spergillus., obsahujícím geny odvozené od Aspergillus terreus a kódující sou bor enzymů, produkujících lovastatin a získání takto vytvořeného lovastatinu.

/.působ podle předloženého vynálezu produkuje lovastatin s výrazně menšími množstvími kontaminujícího dihydr olov astat inu a derivátů hydroxykyseliny ve srovnání s postupem, který využívá -Aspergillus terreus.

-4Y procesu přípravy transformantů podle předloženého vynálezu mohou být použity standardní techniky pro přípravu protoplastů z vybranghb lovastatin neprodukujícího kmene Aepergillusa standardní techniky extrakce LNA z lovastatin produkujícího kmene ^spergillus terreua. Tyto techniky jsou odborníkům dobře známé a není nutno se zde jimi podrobné zabývat. Podobně techniky a postupy transformace protoplastů, které jsou zde použity, jsou známé a standardní.

Výhodně je lovastatin neprodukujícím kmenem 4gpergillus kmen -Aspergillus oryzae, ale není podmínkou pro praktické úspěšné provedení vynálezu. Mohou být použity jiné druhy áspergillus, zejména 4.niger, A.nidulana, A. fumigatus a A.flavus. JLoryzae je zvolen jako výhodný vzhledem, k jeho inertnosti, která umožňuje snadnou a bezpečnou manipulaci s ním a fermentace v komerčním měřítku·

Za účelem oddělení transformantů mikroorganismů od. netransformovaných: po transformaci protoplastů, by DNA z A.terreus měla obsahovat selektovatelný markér· Existuji široký výběe selektovatelných markérů, dostupných a známých odborníkům a upřesnění volby není podstatné pro úspěšné provedení vynálezu. Mohou být použity markéry antibiotické rezistence jako je rezistence k ampicilinu, rezistence k rifampicinu, rezistence ke střeptornycínu atd a výsledná směs transformantů a netransformantů může být kultivována v mediu, obsahujícím vhodné antibiotikum tak, že pouze transformanty, které obsahují selektovatelný markér, budou přežívat izolaci.

Zvláště je jako selektovatelný markér, p_r0 snadnost, vhodná rezistence k cykloheximidu. Cykloheximid je inhibi tor syntézy proteinu, takže přítomnost cykloheximid-rezia tentního kmene nebo transformantů v kultivační půda, je snadno detegovatelná.

-5Po selekci transformantů na bázi selektovatelného markéru, jsou tyto prohledány na ty, které budou exprimovat a sekretovat lovastatin. Pouze relativně malý počet celkových transformantů produkovaných procesem transformace protoplastů, má tuto schopnost. Jsou rozpoznány separátní kultivací ve standardní kultivační půdě a analýzou výsledného media, např. pomocí HPLC, na přítomnost lovastatinu· Ty, které byly testem shledány jako pozitivní na přítomnost lovastatinu se subkultivují a rostou a poskytnou kolonie nových, lovastatin produkujících transformantů fungál ního mmkroorganisrnu rodu Aspergillus a výhodně druhu -^pergillus species·

Vynález, je dále popsán pro účely ilustrace v následující experimentální části.

Připojené obrázky:

Obr.l je grafickým vyjádřením HPLC analýzy surového fungálního extraktu produkovaného pokusy podle příkladu 1 , který je uveden dále.

Obr.2 je ^H-NME spektrum lovastatinové sloučeniny získané a čištěné z hybridního kmene.

Obr.3 je hmotové spektrum téže sloučeniny.

Obr.4 je znázornění morfologických charakteristik nového transformantů AMt/NBJ-V.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiály a metody

-6Plísnové kultura - izoláty -“spergillus terreus a A. oryzae· použité v tomto pokuse, byly izolovány ze vzorků půdy orchideí z kolekce Agriculture Uanada, Research Station, Beaverlodge, Alberta, Canada.

Selekce mutantů rezistentních k cykloheximidu

Po kultivaci obou izolátu Aspergilli na Gzapekově dox mediu, obsahujícím cykloheximid (konc.0,1-5 mM) po b dnů při 28+ 2 °C, byly spory (10θ) každého izolátu A. terreus a A. oryzae rozděleny v 10 mM cykloheximid-Czapekově dox půdě (50 ml) a inkubovány 30 minut, odstřelovány při 10 000 g 10 minut a pak resuspendoványfce sterilní destilované vodě» Byly promyty třikrát mícháním a resedimentovány odstředěním» Spory byly pak suspendovány ve sterilním 1% (obj./obj.) roztoku Tritonu X-100 a jejich počet byl staaoven v podílu haeaocytoaetrem. Ve vhodném ředění byly rozděleny· na 10mM cykloheximidovém. selekčním mediu a po 10 dnech, inkubace při 28+ 2°G byly izolovány rezistentní mutanty· Izoláty byly zkoušeny na produkci lovastatinu. Pro další transformační studiii byl vybrán: k cykloheximidu rezistentní lovostatin produkující izolát A.terreus.

Příprava protoplastů a DNA

Izoláty Aeoergillus oryzae a k cykloheximidu rezistentní^lovastatin produkující A. terreus (označeného zde JAG-4703) byly kultivovány oddělena v 50 ml Czapekovy dox půdy. Kultury byly inkubovány 58 hodin při 28 + 2 °C na rotační třepačce (New Brunswick Scientific Ing.) při 200 ot.min“}, potom sklizeny a promyty sterilní destilovanou vodou s opakovaným odstředěním.

Protoplasty z kultur obou druhů byly získány za použití Novozymu 234 (Novo-Nordisk, Novo Alle, DK 2880, Bagsvaerd, Dánsko) pro odstranění buněčných stěn během 10 až 12hodinového štěpení, obecně podle metody popsané Dickinsonem

-7a Isenbergem, J.Gen.Microbiol. 128, str. 651-654 (1982). Podíly protoplastů z každého druhu regenerují životaschopné, jednotlivé buněčné spory se stěnami při 28 °C po 24 hodinách v regeraěním mediu (R), obsahujícím 0,1 g agara ÍDifco), 5 g sorbosy a 0,35 g EDTA v 50 ml destilované vody. Po geroinaci tyto spory mají všechny charakteristiky kultury rodičovské.

Celková DNA byla izolována z protoplastů Aspergillus terreus postupeh. podle práce Schliefa a Wensinka, Practical Methods in Molecular Biology, 33, 21-29 (1981). Protoplasty byly suspendovány v roztoku, obsahujícím 10 mg/ml SDS, Q,1M NaCl a 0,1M tris-HCl, pH 9,0. Byl přidán stejný objem fenolu nasyceného tris-HCl pufrem. Směs byla odstřelována při 12000 g 10 min v Eppendorfově odstředivkové zkumavce (Brinkmann Instruments, CanadaLtd., Rexdale, Ontario). Horní fáze, obsahující DNA byla odstraněna, smíšena s 95½ ethanolem, uchovávána při -20 °C 60 min, pak jako předtím odstřeďována 10 min. Peleta byla resuspendována v pufru pH 7,0 a inkubována a RNásou (Sigma, Stw Louis, MO, USA) zpracovanou s fenolem a DNA byla vysrážena z vodné vrstvy. Izolovaná DNA byla čištěna adsorpcí a promýváním na DEAE-celuloze (DE-52, Whatman),předem smočené v 1Q mM tris-HCl pufru, pH 7,5 a 0,3M NaCl a umístěné v Pasteurově pipetě. DNA byla eluována 10 mM trisHCl pufrem, pH 7,5, obsahujícím 1,5M NaCl. Tento roztok byl zředěn na Q,2M NaCl a DNA byla vysrážena dvěma objemy ethanolu. Čistota DNA byla hodnocena z 200-320 nm spektra stanovením poměru ^qq absorbance. Pouze DNA s poměry mezi 1,50 a 2,00 byly použity v transformaci. Šest vzorků, každý 0,1 mg izolované DNA,byl» inkubován» v regeneračním mediu pro zajištění nepřítomnosti životaschopných protoplastů a žádný z nich nevyvíjel jakékoliv kolonie.

-8—

Protopíast-DNA inkubace

Přibližně 5,2 χ 10⁴ protoplastů A.oryzae, hodnoceno haemocytometrovým počítačem, bylo inkubováno s 10-100 ng A.terreus DNA v 5 ml regeneračního media, jehož složení je popsáno výše a regenerováno jak je popsáno výše. Za účelem studie možných chemických vlivů DNA na expresi lovastatinu bylo s podobným množství protoplastů A.oryzae inkubováno 10 až 100 /ug telecího thymu (Sigma Chemical Co., St.Louis,MO, USA), DNA (Bethesda Research Laboratories, Gaitheberg, MD,USA) a homologní DNA A.oryzae. Po zahrnutí DNA do inkubací, byla regenerace⁷ protoplastů snížena na méně než 10 % a srovnatelný počet takto zpracovaných protoplastů (10⁴) postrádá jakoukoliv rezistenci k cykloheximidu.

Produkce lovastatinu a studie

Suspenze spor vyvinutých z protoplastů A.oryzae inkubovaných s DNA A.Terreus byla inokulována, 1 ml na ^etriho misku, na Czapekovo dox agarové medium, obsahující 10 mM cykloheximidu. Po 48hodinové inkubaci při 28+2 °C, dosáhly kultury průměru 6-8 mm. Každá se vyvinula odděleně z jednotlivé spory za těchto podmínek. Ty, které rostou na cykloheximidovém mediu byly každá separátně inokulovány na Czapekovu dox živnou půdu (50 ml v 500ml Erlenmeyerově bance), inkubovány na rotační třepačce (200 ot.rnin“¹ ) při 28+2 °C po 12 dnů. Každé růstové medium bylo hodnoceno na produkci lovastatinu dále popsaným způsobem a analyzováno pomocí HPLC.

Extrakce

FerT.entovaná bůda (50 ml) byla okyselena na pH 4,0 17N HC1 a pak rozdělena ethylacetátem (100 ml, 3x). Spojené ethylacetátové frakce byly sušeny ve vakuu při 30 °C,zbytek

-9byl shromážděn v acetonitrilu (5 ml) a pak analyzován pomocí HPLC.

HPLC analýza

HPLC zařízení (Beckman i^odel 420) bylo dosáno firmou Beckman Instruments, Toronto, Kanada a obsahovalo ALtex čerpadlo (model 110 A) a injekční ventil. LC-UV detektor byl nastaven na 237 nm. Byla použita kolona hypersil C-18 ODS silica (25 x 0,46 cm, vnitřní průměr) a rozpouštědlový systém acetonitril a voda (55:45, obj./obj.) při průtokové rychlosti 1,0 ml.min*”¹. Produkce lovastatinu byla srovnávána a kvantifikována ze standardní křivky pro Ιον astat in.

Příklad 1 - výsledky

Sedmdesát devět k cykloheximidu rezistentních izolátů, zahrnujících čtyři lovastatin produkující izoláty, c

bylo získáno z 5,2 x 10^ A.oryzae protoplastů inkubovaných s DNA z lovastatin produkujícího mutantu A.terreus rezistentního k cykloheximidu. Transformační pokusy byly provedeny šestkrátt

Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 1.

-10<*ÍR-R-R· Μ· < Η- Η>

t

Ο

Ν' •

ο

	IV		vi	VI	-3	►3 O
4»		w	w	v		ΓΙ-
ΟΛ	ctí	o	IV	IV	-R	Ο
K	X	X	X	X	X	Ό R»
						© CO
o	o	o	o	o	O	rT
VI	VI	VI	VI	VI	VI	<<

--rouu^ — ví -υ ~q — —

X X X X X X

Ο Ο Ο Ο Ο Ο νι νι νι νι νι νι

*O	Ό	Ό
►3	•3	O
O	O	Cx
ΓΙ-	ΓΙ-	Φ
Ο	Ο	rt-
Ό	Ό
H¹	R«	»3
©	©	Φ
CO	CO	OU
ř*	(-Γ	Φ
O	P>	©
X·	w	Φ *3
	Ό	O
	O
	H>	§
3	Cx
R·	N	O
	R-	ST

>3

-J σ\ -j -q σ\ νι φ ο νι ο γό ο Ολ ος

Φ

Ο φ

© ο

Φ — ΙΌ VI -q Ο Ο Ο VI Ο V, ο α

>► □

συ

Ο Ο Ο ΓΌ ΓΟ Ο

R*	“O	R·	Ό
O	T	N	O
<	O	O	CH
©	Cu	I—*	ro
CO	c	©X	rt-
ří-	Ν'	ΓΙ-
© r·- R- ©	c CJ. Rx O Rx O ©*	Ο·

Tabulka 1 Protoplasty k cykloheaimidu rezistentního a lovastatin exprimujícího

Agpergillus oryzae inkubované s DNA z matantu Aspergillus terreus rezistentního k oykloheximidu a produkujícího lovaetatin

-11Jedna z transformovaných kultur AD-II si udržuje své originální transformované charakteristiky šest měsíců· Obr.l ilustruje HPLC analýzu extraktů získaných z recipientních a donorovýoh kultur A. Oryzae a těch, která byly zpracovány s DNA A.Terreus. Produkce lovastatinu transformovanými izoláty je uvedena dále v tabulce· 2.

Tabulka 2

Produkce lovastatinu transformovanými izoláty -Aspergillus oryzae v Czšpekově dox půdě (pH 6,8) izolát výtěžek lovastatinu (mg/1)

AD-I AD-II AD-III

15,36 + 1,78 26,89 + 3,76 13,46 + 4,56 9,67 + 0,75

Izolát č. AD-I byl subkultivován pětkrát pro poskytnutí transformantů AoAt - N3J/5, který byl deponován 25. února 1992, jako jeho životaschopná, permanentní kultura v? Jberioan Type Culture Collection pod označením ACCC 74135.

Lovastatin je produkován spolu se svým hydroxykyselinovým analogem, který je snadno převeditelný na lovastatin např. refluxováním v toluenu pro provedení laktoni— zace a tak se výtěžek lovastatinu zvyšuje'. Laktonizace v těchto pokusech nebyla provedena.

Lovastatin produkovaný rodičovskou kulturou A.terreus v Czapekově dox půdě byl v koncentraci 166,72 + 5,92 mg/1 a rodičovský Aiorazae neprodukoval žádný lovastatin.

-12Obr.2 připojených obrázků představuje ^H-NMR spektrum lovastatinové sloučeniny čištěné pomocí HPLC z hybridního kmene. Při srovnání se známým, standardním spektrem lovastatinu, potvrzuje toto spektrum identitu produktu.

Obr.3 připojených obrázků představuje hmotnvé spektrum téhož produktu a ukazuje, že lovastatin byl získán v čistotě 99 %»

Koncentrace DNA v rozmezí od 5 do 20 ng na ml media neovlivňují ani regenerační kapacitu protoplastů A.oryzae ani získání rezistence k cykloheximidu azlovastatin produkujících izolátů z inkubací s DNA A.terreus. Tyto hodnoty indikují, že tyto koncentrace¹ nejsou limitním faktorem při produkci lovastatinu. Podobně, DNA z telecího thymu, DNA a homologní DNA A.or^zae v koncentracích od 5 ng; do 5 /Ug- na ml media neovlivňují regeneraci protoplastů A.oryzae- ve srovnání s neošetřenými kontrolami.

Avšak DNA v koncentracích 10 a 100 ^ug na ml media redukuje regeneraci maximálně na 26 a 1 í. Tato zpracování s DNA neeelicitují expresi lovastatinu.

Regenerační medium poskytuje počet protoplastů srovnatelný s počtem získaným podle Achá a spol., J.Gen. Microbiol., 45, 515-523 (1966), za použití komplexnějšího minerálního media. Konidie a čerstvě vzklíčené konidie produkují lepší výsledky životaschopných protoplastů a DNA než mycelia. Tvorba buněčných agregátů během regenerace protoplastů popsaná Asha-em a spol. (1966) nebyla v tomto systému pozorována. Zřejmý transfer faktorů zodpovědných za expresi rezistence k cykloheximidu a expresi lovastatinu z A.terreus do A.oryzae' indikuje mezidruhovou transformaci DNA. Ko-transformace rezistence k cykloheximidu a produkce lovastatinu je neočekávaně bezpečná a potvrzuje fyzickou příbuznost a možné shlukování genů zahrnutou ve vyjádření těchto charakteristik.

-13Morfologie nových transformantů AjAt-NSJ/5 je znázorněny na obr.4 a může být charakterizována následovně:

Morfologie AoAfc-NBJ/5

Konidiální hlavy sloupcovítá, světle hnědé. Konidiofory hladké, bezbarvé. Vesikula hemisférická, potažená až do jedné poloviny nebo dvou. třetin phialidy uspořádanými ve dvou vrstvách. Konidia kulovitá nebo elipsovitá, hladké kolonie na Czapekově agaru rostoucí velmi rychle, buď chomáčkovité nebo samětové skořicově hnědé během tvorby konidií. Oranžový exsudát, mění se ze žluté na hnědou.

Tyto pokusy demonstruji že, v zásadě, geneticky determinovaná produkce antibiotik, charakteristicky produkavaná jedním druhem plísni, může být exprimována v jiném druhu.

Příklad 2

Způsob výroby

Kultura plísně: Pro produkci lovastatinu byla použita transformovaná kultura Agpergillus oryzae (ATCC č. 74135)

Ao Afr/NBJ-V.

Perm ea táce:

Příprava očkovací kultury: Plísnová kultura (lyofilizo» váná lahvička) byla asepticky přenesena na brambor-dextrozový šikmý agar a ponechána růst pří 25 °C 4-5 dnů. Na konci inkubace byla konidiální suspenze připravena přídavkem 10 ml roztoku tritonu X-100 (0,01 %}, intenzivně míchána a konidiální suspenze byla přenesena na sterilní rýži (50 g) v Erlenmeyerově baňce (250 ml objem). Baňka byla doplněna dalšími 10 ml sterilní vody, intenzívně mí-14chána a inkubována při 28 °C 5 až 7 dnů. Na konci inkubační periody byla přidána sterilní voda (50 ml).

Konidiální suspenze?prošla sterilní mušelinovou látkou a filtrát, obsahující 1 r 10⁸ konidií/ml, byl přenesen do očkovacího fermentoru (50 1 kapacita) se 30 1 očkovacího media. Složení očkovacího media bylo následující:

D-glukóza 20 g/l sladový extrakt 20 g/1 neo-pepton 3 g/1 vodovodní voda 1 1 pH 6,8 (upraveno 10% NaOH). (Medium bylo sterilováno při

121 °C po 30 min (15 psi). Očkovací kultura byla ponechána růst 17 až 20 hodih. při 28 °C (rychlost vzduchování 0,3 — 0,5 m) s 80 až 100 % rozpuštěného kyslíku (200 ot.ain~¹)·

Produkce lovastatinu

Očkovací kultura	(30 1) byla přenesena do nádoby pro-
dukčního fermentoru (1000 1 pracovní objem), obsahujícího
produkční medium. Složení produkčního media bylo nésledu-
jící:
laktoza	60 g/1
ard amine pH	10 g/1
sojový protein	2 g/1
KC1	2 g/1
	0,8 g/1
MnS0₄.4H₂0	0,03 g/1
betain	0,6 g/1
^P2000	2 ml
vodovodní voda	1 1
pH 6,8-(před sterilací	, upraveno 105 NaOH/H^SO^), steri-
lizace při 121 °C po 1	hodinu při 15 až 20 psi.

Po inokulaci byla kultura ponechána růst 7 až £ dnů při 28 °C se řízeným pH mezi 6,0 a 6,2 (10% HgSO^).

-15Rychlost pro vzdušilo vání byla udržována mezi. 0,7 - 1,0 vvm. (% rozpuštěného kyslíku 80 - 100 %).

Druhé produkční stadium.

dní stará fermentovaná půda (50 1) byla přenesena asepticky do očkovacího fermentoru (2000 1 pracovní objem), obsahujícího 1500 1 očkovacího media (složení uvedeno výše).

Očkovací kultura byla ponechána růst 24 hodin při 28 °C (200 it.min“') rozp.kyslík 80 až 100 Půda (200 1) byla asepticky převedena do produkčního fermentoru (30000 1) kapacity s pracovním objemem 20000 1), obsahujícího 18000 1 produkčního media. Kultura byla ponechána růst dalších

7-9 dnů při 28 ®C se řízeným pH 6,0 až 6,2. Po 60 hodinách fermentace nebylo pH kontrolováno. Fermentační půda byla doplňována živným mediem (rychlost 10 l/h) po 5 dnů.

Složení živného media bylo následující:

D-glukozs 285,7 g/1 ardamine pH 71,4 g/1 sojový protein 14,3 g/1 vodovodní voda 1 1 pff 6,8 (před sterilací) sterilováno při 121 °C po 30 až min. Na konci fermentace byla půda okyselena na pH 4,0 10N HC1 a odstředěna. Plísnový koláč byl sušen při 55 °C a extrahován.

Extrakce a čištění

Sušený plísnový koláč (20 kg) se homogenizuje- se studeným ethylacetátem (i0 - 15 min) a homogenizovaný materiál se refluxuje při 80 až 85 °C 4 až 6 hodin, ponechá vychladnout a filtruje. Filtrát se suší ve vakuu na černý dehtovitý materiál (2,5 kg až 3 kg). Černý dehtovitý materiál se smísí se silikagelem (2,5 kg) a CHgClg (5 litrů).

CHgClg se odpaří ve vakuu a se silikagelem smísený surový

-16dehtovitý materiál se nalije na silikagelovou skleněnou kolonu (100 cm délky x 22,5 cm průměr) vyvíjenou pomocí EtOAcihexanu (1:2 obj/dbj.). Vzorky (2000>1, 12x) se· odebírají. Po 24 hodinách se eluční směs rozpouštědel nahradí EtOJb:hexanem (1:1 obj./obj.)a ponechá se dalších 24 hodin. Vzorky, obsahující produkt se: spojí, suší (230 g) a krystalují s methanolem.

Krystalizace

Žlutý sušený produkt (280 g) se rozpustí ve 2,8 1 methanolu a vaří se: 40 až 60 minut při 60 až 65 °C. Horká methanolová směs se zfiltruje a filtrát se inkubuje 4 až 6 hodin při 4 °C. Bílé krystalické jehličky se oddělí od matečného louhu a propláchnou se studeným methanolem. Krystaly se suší ve vakuu, zváží (190 g) a uloží v exsikétoru při 4 °C.

Způsob podle předloženého vynálezu může poskytovat výtěžky lovastatinu, které jsou dosti vysoké, což je způsobeno rupturou buněčných stěn. nových transformantů Agpergillus oryzae, takže v tomto postupu může být eliminován, stupeň lýze buněk před získáním lovastatinu. Toto podstatně zjednodušuje: souproudé získávání a čištění. Jak je popsáno výše, lovastatin podle předloženého způsobu může být získáván extrakcí rozpouštědly, bez nutnosti tvorby esterů, solí atd* během získávání. Extrakce rozpouštědly je mnohem jednodušší a ekonomičtější způsob získávání a čištění než chromatografie.

Ve specifických příkladech byl vynález detailně popsán, není však jimi nikterak omezen. Jeho rozsah je definován v připojených patentových nárocích.

-17v., i ’Ξ i '-D

CO

Claims

PATENTOVÉ N A*fi 0 Κ Ϊ

1. 5^>ůsob přípravy lovastatinu, vyznačující se t i m, že se fermentuje živné medium s transformovaným fungálním mikroorganismem z kmene Agpergillus vybraným ze skupinyjdruhů A.fíryzae, A.niger, A.nidulans·, A.fumigatus a A.flsvus, kde tento kmen je neschopen exprese lovastatinu, ale byl transformován, tak, že obsahuje cizí DRA kódující soubor enzymů schopných syntézy lovastatinu, a selektovatelný markér, a lovastatin se získá ze živného media·
2· Způsob podle nároku 1, vyznaču jící se t í m, že transformovaný mikroorganismus obsahuje cizí DRA získanou z lovastatin produkujících druhů Aspergillus terreuss.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že kmenem -áepergillas je kmen druhu A.oryzae.
4· Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že cizí DRA zaváděná do transformantu obsahuje geny rezistence k cykloheximidu jako selektovatelný markér.
5. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se t í m, že transformantem je AoAt-NBJ/5 jak je popsán a definován.
6. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje další stupen laktonizace hydroxykyselinového analogu vzniklého při fermantační přípravě lovastatinu.

-187· Způsob podle kteréhokoliv z předcházející nároků, vyznačující se tím, že získání lovastatinu. je provedeno extrakcí rozpouštědlem.
8. Nové fungélní transformanty schopné produkce enzymů schopných syntézy lovastatinu, kde uvedenými transfoi>manty jsou kmeny Aspergillus sp. vybrané z A.oryzae, A. nidulans, A.fumigatus a A.flsvus, které jsou přirozeně neschopné exprese lovastatinu, ale obsahující cizí DNA obsahující geny kódující produkci enzymů schopných syntetizovat lovastatin.
9. Fungální transformanty podle nároku 9, kde Aspergillus sp. je vybrán ze skupiny, zahrnující Á.oryzae, A. niger, A.nidulans a A.fumigalis.
10. Fungální transf ormanty podle nároku 10, kde Aspergillus sp. je A.oryzae.
11. Fungální transformanty podle nároku 11, kde cizí DNA je odvozena z lovastatin exprimujícího kmene druhu Aspergillus terreus.
12. Fungální transformanty podle nároku 12 a zahrnující produkt transformace protoplastů celkovou DNA z uvedeného kmene A. terreus do uvedeného kmene A.oryzae.
13. Fungální transformanty AoAt-N3J/5 jak jsou zde popsány a definovány.