BG61180B1

BG61180B1 - Нови щамове гъби и използуването им за получаване на антибиотици

Info

Publication number: BG61180B1
Application number: BG97421A
Authority: BG
Inventors: Jagroop Dahiya
Original assignee: Novopharm Limited
Priority date: 1992-02-10
Filing date: 1993-02-09
Publication date: 1997-02-28
Also published as: LV10502A; AU3212193A; HU9300330D0; NO930446L; PL297691A1; HUT67061A; HRP930134A2; EP0556699A1; SK5593A3; JPH0622780A; CZ17293A3; NZ245713A; FI930561A; EE03048B1; BR9300467A; LV10502B; BG97421A; SI9300068A; NO930446D0; FI930561A0

Abstract

1. Метод за получаване на ловастатин, който включва ферментация на хранителна среда с трансформирани микроскопични гъбички от щам аsреrgillus, подбран от видовете а.оrizае, а.nigеr, а.nidulаns, а.fiмigатus и а.flаvus, който щам е неспособен да експресира ловастатин, но който е трансформиран така, че да съдържа чуждеродна днк, кодираща комплект от ензими, синтезиращи ловастатин и селективен маркер, и възстановяване на ловастатина от хранителната среда.

Description

(54) НОВИ ЩАМОВЕ ГЪБИ И ИЗПОЛЗВАНЕТО ИМ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА АНТИБИОТИЦИ

Изобретението се отнася до нови генетично конструирани гъбични щамове и до използването им за получаване на антибиотици. По-специално изобретението се отнася до нови генетично конструирани щамове от Aspergillus и до използването им за получаване на лекарството ловастатин и на неговите аналози.

По своята химическа същност ловастатинът представлява [ 1S- [ 1 oc/R*/, 3α, 7β, 8β/ 2S⁺,4S⁺/, 8αβ] ]-диметилбутанова киселина 1,2,3,7,8,8а-хексахидро-3,7-диметил-8- [2-/ тетрахидро-4-хидрокси-6-оксо-2Н-пиран-2-ил/етил] -1-нафталенил естер и има химична формула

Това съединение е антихиперхолестеролемично средство в качеството му на потенциален инхибитор на HMG-CoA редуктаза - ензим, който контролира скоростта на холестероловата биосинтеза. Това е гьбичен метаболит, получаван при ферментационните процеси с помощта на подбрани щамове гъбички.

Антибиотици като ловастатина са метаболити, които изискват комплекс от ензими за синтезата си. За да стане възможно получаването им чрез молекулярно клониране на антибиотик продуциращи микроорганизми, са необходими етапи като изолация, анализ и вероятно модификация на кореспондиращи гени за няколко ензима. Опитите за изолиране на такива гени от подобни гъбични видове са свързани с получаването на клонове, носещи или индивидуални гени от комплекса, или само неокомплектован генен комплекс /вж.Ма!рагб<1а and Hopwood, Molecular Cloning of the Whole Biosynthetic Pathway of a Streptomyces Antibiotic and its Expression in a Heterologous Host”, Nature (1984), 309, p.p. 462-464./.

В патент CA 1,1291794 на Endo е описано получаването на ловастатин чрез ферментация с помощта на щам от вида Monnascus ruber.

В патент СА 1,161,380 на Monaghan et.al е описано получаването на ловастатин чрез ферментация с помощта на щамове гъбички от вида Aspergillus terreus.

В тези два източника, описващи нивото на техниката в областта, ловастатинът се продуцира успоредно с други много сходни химични компоненти в значителни количества, от които трябва да бъде сепариран. При получаването му с участието на Monascusruber, ловастатинът се получава успоредно с монаколин V. При получаването му с участието Aspergillus terreus ловастатинът се получава успоредно с хидроксикиселина. Доколкото хидроксикиселината може лесно да премине в ловастатин, дихидроловастатинът може да бъде сепариран от него.

Задачата на изобретението е да се осигурят нови генетично конструирани мутантни гъбични щамове, подходящи за използване във ферментационните процеси за получаване на ловастатин.

Задачата на изобретението е да се осигурят нови процеси за получаване на ловастатин чрез ферментация с участието на тези щамове.

Съгласно един аспект от изобретението нови мутантни щамове от подходящи видове на род Aspergillus са осигурени с оглед на това да бъдат подходящи за експресия и секретиране на ловастатин. Тези щамове съдържат гените на ловастатин продуциращия ензимен комплекс във функционално отношение, получени от ДНК на ловастатинпродуциращи щамове Aspergillus terreus. Те са получени по пътя на протопластната трансформация на ДНК от ловастатинпродуциращ щам на Aspergillus terreus, също съдържащ подходящ селективен маркер, с друг непродуциращ ловастатин щам, подбран от групата на Asp.species, включваща A. oryzae, A.fumigali^A. niger, A.nidulans и A. flavus. Селекцията на трансформантите е осъществена на базата на селективните маркери, идентификацията и изолацията на ловастатинпродуциращите трансформанти и тяхното субклониране.

Съгласно друг аспект на изобретението се осигурява метод за получаване на ловастатин, който включва ферментация на хранителната среда с трансформантен микроорганизъм Aspergillus, съдържащ гени, получени от Aspergillus terreus и кодиращи комплекс от ловастатинпродуциращи ензими, и възстано2 вяване на така формирания ловастатин.

С метода от изобретението се осигурява получаването на ловастатин със забележително малко количество контаминанти от дихидроловастатин и хидроксикисели деривати в сравнение с процеса с участието на Aspergillus terreus.

В процеса на получаване на трансформантите съгласно изобретението могат да бъдат използвани стандартни техники за селекция на несъдържащите ловастатин щамове Aspergillus, както и за екстракция на ДНК от ловастатинпродуциращ щам на Asp.terreus. Тези техники са добре известни на специалистите и не се нуждаят от детайлно описване. По същия начин техниките и процесите на протопластна трансформация, полезни за преследваната в изобретението цел, са добре познати и стандартни.

Предпочитаният избор на непродуциращия ловастатин щам Asp. е A. oryzae, но той не е единственият, прилаган за получаването на успешен резултат. Други видове, като А. niger, A.nidulans, A, fumigaUsH A. flavus също могат да бъдат използвани. A.oryzae е избран като предпочитан вид отчитайки неговата инертност, което улеснява работата и допринася за безопасността на работата в лаборатория и при ферментация в търговски мащаб.

За подбиране на трансформираните микроорганизми от нетрансформираните, след процеса на протопластна трансформация ДНК от А. следва да съдържа селекционния маркер. Налице са широк /богат/ избор от селекционни маркери, подходящи или/и подбрани от специалистите в областта, като прецизният избор не е от особено значение за получаването на добър резултат съгласно изобретението. Маркерите на резистентност на антибиотици, например ампицилинова резистентност, рифамицинова резистентност, стрептомицинова резистентност и други, могат да бъдат използвани и получената в резултат смес от трансформирани и не трансформирани микроорганизми може да бъде култивирана в среда, съдържаща подходящ антибиотик, така че само трансформантите, съдържащи селективния маркер, да преживеят за изолиране.

Практически като предпочитан селективен маркер за по-удобно се използва устойчивостта на циклохексимид. Циклохексимидът е инхибитор на протеиновата синтеза, така че присъствието на циклохексимидрезистентен щам или трансформант в културалната течност лесно се открива.

След подбор на трансформантите на основата на селекционния маркер те се изследват за откриване на тези, които ще експресират и секретарят ловастатин. Само релативно малко количество от общия брой на трансформантите, получени при протопластната трансформация, имат тази способност. Те се разпознават чрез разделно култивиране в стандартната културална течност и анализът на резултантната среда, т.е. чрез HPLC, за присъствие на ловастатин. Онези, показали положителен резултат от тестуването, се субкултивират и оставят да прорастнат за получаване на колонии от нови ловастатинпродуциращи трансформанти на гъбни микроорганизми от род Aspergillus и за предпочитане от вида Aspergillus oryzae.

Изобретението е пояснено със следните експериментални примери, придружени с фигури, от които:

фигура 1 представлява графично представяне на HPLC анализ на суровия гъбичен екстракт, продуциран съгласно пример, описан по-нататък;

фигура 2 - Ή-NMR спектъра на съединението ловастатин, получено и пречистено от хибридния щам;

фигура 3 - спектралната маса на същото съединение;

фигура 4 - изображение на морфологичната характеристика на новия трансформант AoAt/NBJ-V.

Пример 1.

Материали и методи

Гъбична култура - гьбични изолати на Aspergillus terreus и A. oryzae, използван в настоящото изследване, са изолирани от проби на почва, в която растат орхидеи, събрани от Agriculture Canada, Research Station, BeaVeridge, Alberta, Canada.

Подбор на мутанти резистентни на циклохексимид

Прорастналите изолати на Aspergillus върху среда на Czapek (Чапек), съдържащ циклохексимид /концентр.0,1-5 тМ/ за 6 дена при 28 ± 2°С, спори /10⁸/ от всеки изолат на A.terreus и A.oryzae, се диспергират в среда на Чапек /50 ml/ и се инкубират за 30 min, центрофугират се при 10 000 g за 10 min, и след това се ресуспендират в стерилна дестилирана вода.

Промиват се трикратно при разбъркване и отново се утаяват чрез центрофугиране. След това спорите се суспендират в стерилен разтвор на Тритон Х-100 - 1% /v/V/ и броят им се определя в хемоцитометър. В 10 тМ циклохексимид на селективна среда се диспергира подходящ разтвор и резистентните мутанти се изолират след 10 дена при температура на инкубацията 28°С ± 2°С. Изолатите се изпитват за продукция на ловастатин. Циклохексимид резистентният ловастатин, продуциращ изолат от A.terreus, се подбира за по-нататъшно изследване на трансформацията.

Получаване на протопласти и ДНК

A. oryzae и циклохексимидрезистентният ловастатинпродуциращ изолат на A.terreus/ означен като JAG - 4703/, се култивират разделно в 50 ml културална течност на Чапек. Културите се инкубират в продължение на 58 часа при 28 ± 2°С на ротационен шейкър /New Brunswick Scientific Inc./ при 200 rpm, след това се събират и промиват с дестиелирана вода чрез неколкократно центрофугиране.

Протопластите от култивирането на двата вида са получени с помощта на Novozym 234 /Novo-Nordisk, Novo Alle, DK 2880, Bagsvaerd, Denmark/ - за отстраняване на клетъчните стени по време на 10-12-часово разграждане, следвайки метода, описан от Dickinson & Isenberg, J.Gen. Microbiol. 128, p.651-654 /1982/. Еднакви количества от протопласти от всички видове регенерирани, жизнеспособни единични спори с клетъчни стени се получават след регенериране в регенерационна среда при 28°С за 24 h, съдържаща 0,1 g arap /Difco / 5 g сорбоза и 0,35 g EDTA в 50 ml дестилирана вода. При развитието си тези спори проявяват всички културални характеристики на техните родители.

Общото количество на ДНК е изолирано от протопласти на A.terreus съгласно процедурата, описана от Schlief & Wensink, “Practical Methods in Molecular Biology”, 33,21-29 /1981/. Протопластите се суспендират в разтвор, състоящ се от 10 mg/ml SDS, 0,1 М NaCl и 0,1 Μ трис-HCl, pH 9,0. Еднакъв обем от разреден с трис-HCl буфер фенол се добавя към този разтвор и сместа се центрофугира при 12000 g за 10 min в епруветка за центрофугиране на Eppendorf /Brinkmann Instrument, Canada, Ltd., Rexdale, Ontario/. Горната фаза, съдържаща ДНК, се отстранява, смесва се с 95% етанол, оставя се за 60 min при -20°С, след това се центрофугира, както преди за 10 min. Пелетите се ресуспендират в буфер, pH 7,0, и се инкубират с RNa3a /Sigma, St. Louis, MO, USA/, третира се с фенол и ДНК се преципитира от течния слой. Изолираната ДНК се пречиства чрез адсорбция и се промива върху ДЕАЕ целулоза /ДЕ-52, Whatman/, отново се омокря с трис-HCl буфер, pH 7,5 и 0,3M NaCl и се помества в пастьорова пипета. ДНК се елуира с 10 тМ трис-HCl буфер, pH 7,5, съдържащ 1,5М NaCl. Този разтвор се разрежда до 0,2 М с NaCl и ДНК се преципитира с два обема етанол. Чистотата на ДНК се изпитва на 200-320 nm спектър чрез определяне на А₂₆₀/А₂₈₀ абсорбционната скорост. Само онези ДНК със скорости между 1,50 и 2,00 могат да бъдат използвани за трансформациите. Шест проби, всяка от 0,1 mg от изолираната ДНК се инкубират в регенерационна среда за установяване отсъствието на жизнеспособни протопласти и нито една от тях не развива както и да е колония.

Протопластна ДНК инкубация

Приблизително 5,2х10⁴ протопласти на A.oryzae, изпитани на хемоцитометьрно броене, се инкубират с 10 - 100 ng A.terreus -на ДНК в 5 ml регенерационна среда, съставянето на която е като описаното по-горе, а така също и регенерирането й. За да се изследва възможният химичен ефект на ДНК върху ловастатиновата експресия, 10-100 pg ДНК от телешки тимус /Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,USA/, ДНК /Bethesda Researcn Lab., Caithberg, MD, USA/ и хомоложна ДНК от A. oryzae се инкубират с аналогични порции от протопласти на A.orilae. Когато е включена в инкубацията ДНК, протопластната регенерация се редуцира до помалко от 10% като аналогичен брой от така третирани протопласти не успяват да прорастнат и да покажат каквато и да е циклохексимидна резистентност.

Продуциране на ловастатин и изпитване

Суспенсия от спори, развили се от А. oryzae протопласти, инкубирани с A.terreus ДНК, се инокулира в количество 1 ml за една петриева паничка, върху агарова среда на Чапек, съдържаща 10 тМ циклохексимид. След инкубиране за 48 часа на температура 28 ± 2°С, културите достигат диаметър от 6-8 mm. Всяка от тях се развива от единична спора при тези условия. Онези, които растат върху циклохексимидна среда се инокулират поотделно върху среда на Чапек - течна в 500 ml ерленмайерови колби и се инкубират върху ротационен шейкер /200 грт/ при 28 ± 2°С за 12 дни. Всяка културална среда се изследва за 5 продукция на ловастатин по начин, описан погоре и HPLC анализ.

Екстракция

Ферментационната среда /50 ml/ се подкиселява до pH 4,0 със 17 N НС1 и след това се фракционира срещу етилацетат /100 ml, 3 пъти/. Етилацетатните фракции се изсушават под вакуум на 30°С, остатъкът се събира в ацетонитрил /5 ml/ и се подлага на HPLC анализ.

HPLC Анализ

HPLC оборудването /Модел Beckman 420/ е осигурено от Beckman Instruments, Toronto, Canada и се състои от помпа Altex /Модел

110 А/ и инжекционен клапан. LC-UV детекторът се установява на 237 nm. Използват се С-18 ODS силициева колона /25 х 0,46 cm, i.d./ система на разтваряне, състояща се от ацетонитрил и вода /55:45, V/V/ при бавна скорост от 1,0 ml/min. Продуцираният ловастатин е сравнен и количествено определен от конструираната стандартна ловастатинова крива.

Пример 1. Резултати

Седемдесет и девет циклохексимид - резистентни изолати, включително и четири ловастатинпродуциращи изолати са получени от протопласти на A.oryzea, инкубирани с ДНК от циклохексимидрезистентен ловастатинпро15 дуциращ мутант на A.terreus. Трансформационните експерименти се провеждат шесткратно.

Резултатите са дадени в следващата таблица 1.

Таблица 1

Циклохексимидрезистентни и ловастатинекспресиращи протопласти от A.oryzae, инкубирани с ДНК от циклохексимидрезистентен ловастатинпродуциращ мутант на A.terreus.

№	Протопласти ml	Брой на реген. протопласти след прот. фузия, №/ml	% Регенерация	ДНК /ng/	Брой на ловастатин продуциращи изолати
1.	7,4 х 10*	4,1 х 10⁵	56	100	0
2.	5,2 х 10⁵	3,1 х 10⁵	60	75	2
3.	5,2 х 10⁵	3,7 х 10⁵	72	50	2
4.	4,0 х 10⁵	2,7 х 10^s	70	25	0
5.	2,6 х 10⁵	1,5 х 10⁵	65	10	0
6.	1,6 х 10⁵	1,1 х 10*	70	0	0

Една от трансформираните култури АОII, получава своите оригинални трансформационни характеристики за шест месеца. На фигура 1 е илюстриран HPLC анализът на екстрактите, получени от реципиентната и донорната култура от A.oryzae, и на онези, третирани с ДНК, получена от A.terreus. Продукцията на ловастатин с помощта на трансформирани изолати е показана по-нататък на таблица 2.

Таблица 2

Получаване на ловастатин, изразено в mg/Ι, от трасформирани изолати от Aspergillus oryzae в хранителен бульон на Чапек /рН 6,8/

Изолат №	Ловастатинова продуктивност /mg/1/
AO - I	15,36 ± 1,78
АО - 11	26,89 ± 3,76
AO - III	13,46 ± 4,56
AO - IV	9,67 ± 0,75

Изолат № AO-Ι се субкултивира петкратно за получаване на трансформант АоАт NBJ/5, който е депозиран на 25 февруари, 1992 като жизнеспособна, постоянна култура в АТСС под № 74135.

Ловастатинът се продуцира в асоциация с хидроксикисел негов аналог, който лесно се трансформира в ловастатин, например чрез сливане в толуен за осъществяване на лактонизацията и поради това - за повишаване продуктивността на ловастатин. Лактонизацията е обезателна в тези експеримент.

Ловастатинът, продуциран от A.terreus ната родителска култура в хранителния бульон на Чапек, е 166,72 ± 5,92 mg/1, а родителската култура на A. oryzae не продуцира каквото и да е количество ловастатин.

Фигура 2 представлява Ή-NMR спектъра на ловастатиновото съединение, пречистено с HPLC от хибридния щам. При сравнение със стандартния познат спектър на ловастатина този спектър представя идентичността на продукта.

Фигура 3 - представя спектрална маса на същия продукт и показва, че ловастатинът е получен с чистота 99%.

Концентрациите на ДНК са от 5 до 29 ng за ml от средата, без да влияе нито на регенерационния капацитет на протопластите от A.oryzae, нито на възстановяването на циклохексимидната резистентност и ловастатинпродуциращите изолати от инкубациите с ДНК. Данните показват, че тези концентрации не са лимитиращ фактор в продукцията на ловастатин. По същия начин ДНК от телешки тимус, ДНК и хомоложна ДНК от A.oryzae с концентрации от 5 ng до 5 pg за ml от средата и не влияе върху регенерацията на протопластите от A.oryzae в сравнение с нетретираните контроли. Обаче, при 10 и 100 μ g за ml от средата ДНК редуцира регенерацията до максимум от 26% и 1% респ. Тези ДНК третирания не изявяват ловастатинова експресия.

Регенерационната среда води до количество протопласти, сравнимо с онези, получени от Acha et al. J.Cen.Microbiol., 45, 515523 /1966/, използвайки по-богата на минерали среда. Конидиите и прясно съзрелите конидии продуцират повече от жизнеспособните протопласти и от ДНК от мицелиума. Формирането на клетъчните агрегати по време на протопластната регенерация, описана от Acha et.al. /1966/, не се наблюдава в тази система. Явният трансфер на фактори, отговорни за експресията на циклохексимидната резистентност и ловастатиновата експресия от A.terreus към A.oryzae, показва междувидовата трансформацията на ДНК. Ко-трансформацията на циклохексимидната резистентност и ловастатиновата продуктивност са неочаквано задоволителни и предполага физическа близост и вероятно натрупване на гените, включени в експресията на тези характеристики.

Морфология на новия трансформант АоАт - NBJ/5 е показана на фигура 4 и може да бъде охарактеризирана, както следва.

Морфоложния на AoAt - NBJ/5

Конидиални главички, удължени и светлокафяви. Конидиефори гладки и безцветни. Зародишови торбички - хемисферични, покрити до половината или до една трета от фиалиди /последното разклонение на конидиеносеца или самия конидиеносец/, подредени в два слоя. Конидиите са сферични или елипсовидни, гладки колонии на агарова среда на Чапек, растящи твърде бързо, както пухкави, така и като кадифе в цвят кестеняво-кафяво до образуването на конидии. Оранжев ексудат, преминаващ от жълто в кафяво.

Тези експерименти показват, че генетично детерминираните характеристики за продуциране на антибиотик от един гъбичен вид могат да бъдат експресирани в друг.

Пример 2. Метод за получаване

Гъбичната култура е трансформирана култура от Aspergillus oryzae /АТСС № 74135/ AoAt - NBJ/V и се използва за получаване на ловастатин.

Ферментация

Подготвяне на семената. Гъбичната култура /лиофилизирана/ се прехвърля по асептичен начин върху картофено-декстрозен агар и се оставя да прорастне при 25°С за 4-5 дни. Към края на инкубацията, конидиалната суспенсия се изготвя чрез добавяне на 10 ml тритон X - 100/0,01%/ разтвор, разбърква се и конидиалната суспенсия се прехвърля върху стерилен ориз /50 g/, поместен в ерленмайерови колби /250 ml капацитет/. Колбата се допълва с още 10 ml стерилна вода, разклаща се внимателно и се инкубира при 28°С за 5 - 7 дни. Към края на инкубационния период се добавя стерилна вода /50 ml/.

Конидиалната суспенсия се прекарва през стерилна марля и филтратът, съдържащ 1x10’ конидии/ml се прехвърля във ферментатор с капацитет 501 с 30 1 хранителна среда. Съставът на хранителната среда съдържа в g/l следните съставки: Д - глюкоза 20; малцов екстракт 20; неопептон 3 и водопроводна вода 1 1.

pH е 6,8, доведено с 10%-NaOH. /Средата е стерилизирана на 121 °C за 30 min /15 psi/. Семената се оставят да прораснат за 17-20 h при 28°С/ скорост на аерацията 0,3 - 0,5 VVM6 с 80-100% разтворим кислород. /200 грт/.

Продукция на ловастатин

Семената /30 1/ се прехвърлят във ферментатор съд /1000 1, работен обем/, съдържащ ферментационната среда. Съставът на средата е следният:

Лактоза	60 g/l
Ардамин pH	10 g/l
Соев протеин	2 g/l
КС1	2 g/l
КН₂РО₄	0,8/1
MnS0₄H₂0	0,03 g/l

Бетаин 0,6 g/l

Р200 2 ml

Водопроводна вода 1 1 pH е 6,8 /преди стерилизация, доведено със 105 NaOH/H₂0₄/, стерилизация на 121°С за 1 час при 15-20 psi.

След инокулация културата се оставя да расте за 7-8 дни на 28°С с pH контрол при 6,0-6,2 /с 10% H₂S0₄/.

Скоростта на аерация се поддържа между 0,7 - 1,0 VVM /% разтворен кислород 80100%/.

2ND Продукционен етап

Седем дневна ферментационна течност /50 1/ се прехвърля по асептичен начин във ферментатор /2,000 1 работен обем/, съдържащ 1500 1 хранителна среда /състав, изложен по-горе/. Посевната култура се оставя да прорасне за 24 часа на 28°С /200 грт/ Д.О. 80-100%. Ферментационната течност /200 1/ се прехвърля по асептичен начин във ферментатор с вместимост 30 000 1 и с работен обем 20 000 1, съдържащ 18 000 1 от хранителната среда. Културата се оставя да прорасне за 7-9 дни на 28°С с pH контрол при 6,0 - 6,2. След 60 часа ферментиране, pH вече не се контролира. Ферментационната течност се допълва с подхранваща среда /скорост 10 Ι/h/ за 4 дни. Подхранващата среда съдържа следните съставки: Д-глюкоза 285,7 g/l; Ардамин pH

71,4 g/l Соев протеин 14,3 g/l и водопроводна вода 1 1.

pH 6,8 /преди стерилизирането/ - стерилизация при 121°С за 30-45 min. Към края на ферментацията, ферментационната течност се подкислява до pH 4,0 с 10 N NC1 и се центрофугира. Гъбичният остатък се изсушава на 55°С и се подлага на екстракция.

Екстракция и пречистване

Изсушеният гъбичен остатък /20 kg/ се подлага на хомогенизация със студен етилацетат /10-15 min/ и хомогенизираният материал се връща на 80-85°С за 4-6 часа, оставя се да се охлади и се филтрира. Филтратът се изсушава под вакуум до черен материал със смолиста консистенция /2,5 kg - 3 kg/. Материалът се смесва със силикагел /2,5 kg/ и СН₂С1₂ /5 1/. СН₂С1₂ се изпарява под вакуум и смесеният със силиций суров материал се налива в силикагелна стъклена колона /100 cm в дължина х 22,5 cm в диаметър/ с EtOAc: Хексан /1:2 V.V/. Пробите /2,000 11,12 х/ се събират.

След 24 часа елуационната смес се сменя на EtOAc: Хексан /1:1 V.V/ и се пропуска за други 24 часа. Пробите, съдържащи продукта, се отливат, изсушават се /280 g/ и се кристализират с метанол.

Кристализация

Жълтият изсушен продукт /280 g/ се разтваря в 2,8 1 метанол и се вари за 40-60 min при 60-65°С. Горещата метанолова смес се филтрува и филтратът се инкубира за 4-6 часа при 4°С. Белите кристални иглички се отделят от майчината течност и се изплакват със студен метанол. Кристалите се изсушават под вакуум, претеглят се /190 g/ и се държат в десикатор при 4°С

Методът съгласно изобретението може да резултира в получаване на ловастатин, който е достатъчен да причини разкъсване на клетъчните стени на новите трансформанти от A.oryzae, така че този етап на лизис на клетките може да бъде елиминиран преди възстановяването на ловастатина. Това съществено опростява поточното възстановяване и пречистване на продукта. Както е описано по-горе, ловастатинът съгласно настоящия процес, може да бъде възстановен чрез разтворима екстракция, без необходимост от формиране на естери, соли и други по време на периода на възстановяване. Разтворимата екстракция е много по-опростена и е много по-икономичен процес за възстановяване и пречистване, отколкото хроматографията.

Доколкото изобретението е описано в подробности чрез приведените специфични експерименти, следва да се разбира, че не се ограничава от тях. Обхватът му е дефиниран от формулираните патентни претенции.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване на ловастатин, който включва ферментация на хранителна среда с трансформирани микроскопични гъби от щам Aspergillus, подбран от видовете A.oryzae, A.niger, A.nidulans, A. fumigalis и A. flavus, който щам е неспособен да експресира ловастатин, но който е трансформиран, така че да съдържа чуждеродна ДНК, кодираща комплекс от ензими, синтезиращи ловастатин и селективен маркер, и възстановяване на ловастатина от хранителната среда.
2. Метод съгласно претенция 1, по който трансформираният микроорганизъм съдържа чужда ДНК, получена от ловастатинпродуциращ вид Aspergillus terreus.
3. Метод съгласно претенция 2, по който този щам микроорганизъм е щам от вида A.oryzae.
4. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, по който чуждата ДНК, въведена в трансформанта, съдържа циклохексимидрезистентни гени като селективен маркер.
5. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, по който трансформантът е АоАт - NBJ/5, регистриран в АТСС под № 74135.
6. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, включващ допълнителен етап на лактонизация на хидроксикисел аналог, формиран във ферментационния процес до ловастатин.
7. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, по който възстановяването на ловастатина се осъществява чрез разтворима екстракция.
8. Нови гъбични трансформанти, носители на комплекс от ензими, способни да синтезират ловастатин, като тези трансформанти в качеството си на щамове от вида A.species са подбрани от A.oryzae, A.niger, A.nidulans, A.fumigalis и A.flavus и са природно неспособни да експресират ловастатин, но съдържайки чужда ДНК, съдържаща гени, кодиращи комплекс от ензими, стават способни да синтезират ловастатин.
9. Гъбични трансформанти съгласно претенция 9, като Aspergillus е подбран от A.oryzae, A.niger,A.nidulans и A.fumigalis.
10. Гъбични трансформанти съгласно претенция 10, като A.species е A.oryzae.
11. Гъбични трансформанти съгласно претенция 11, като чуждата ДНК е получена от ловастатинекспресиращ щам от вида А. terreus.
12. Гъбични трансформанти съгласно претенция 12 и включващи продукта на протопластна трансформация на общата ДНК от щам A.terreus в щам A.oryzae.
13. Гъбични трансформанти AoAt - NBJ/ 5, регистрирани в АТСС под № 74135.