HRP930134A2 - Novel fungal strains and the use thereof in the antibiotic production - Google Patents
Novel fungal strains and the use thereof in the antibiotic production Download PDFInfo
- Publication number
- HRP930134A2 HRP930134A2 HR930134A HRP930134A HRP930134A2 HR P930134 A2 HRP930134 A2 HR P930134A2 HR 930134 A HR930134 A HR 930134A HR P930134 A HRP930134 A HR P930134A HR P930134 A2 HRP930134 A2 HR P930134A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- lovastatin
- aspergillus
- oryzae
- fungal
- strain
- Prior art date
Links
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 title claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 18
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title description 5
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 claims description 66
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 claims description 64
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 26
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 23
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 claims description 22
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 14
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims description 5
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 claims description 5
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims description 5
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000007273 lactonization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 claims 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IFIFFBWHLKGTMO-SJIDJMGWSA-N [(1s,3s,4ar,7s,8s,8as)-8-[2-[(2r,4r)-4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl]ethyl]-3,7-dimethyl-1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahydronaphthalen-1-yl] (2s)-2-methylbutanoate Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=C[C@H]2C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 IFIFFBWHLKGTMO-SJIDJMGWSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000031003 Monascus ruber Species 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 2
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 lovastatin compound Chemical class 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 244000223760 Cinnamomum zeylanicum Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000326 anti-hypercholesterolaemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002925 chemical effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000017803 cinnamon Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000006787 czapek-dox agar Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000002038 ethyl acetate fraction Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000054 fungal extract Substances 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- ZDFOBOYQVYMVCW-IRUSZSJRSA-N monacolin J Chemical compound C([C@@H]1[C@H]2[C@@H](O)C[C@H](C=C2C=C[C@@H]1C)C)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 ZDFOBOYQVYMVCW-IRUSZSJRSA-N 0.000 description 1
- ZDFOBOYQVYMVCW-UHFFFAOYSA-N monocolin J Natural products CC1C=CC2=CC(C)CC(O)C2C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 ZDFOBOYQVYMVCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010090409 novozym 234 Proteins 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- VABRZWDEEDQLRD-UHFFFAOYSA-N streptomyces antibiotic uk-63052 Chemical compound CN1C(=O)C(N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(COC(=O)C2(C(C2)C)N(C)C2=O)NC(=O)C=3C(=CC4=CC=CC=C4N=3)O)C(SC(C)CC)SCC2N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(NC(=O)C=2C(=CC3=CC=CC=C3N=2)O)COC(=O)C21CC2C VABRZWDEEDQLRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A20/00—Water conservation; Efficient water supply; Efficient water use
- Y02A20/40—Protecting water resources
- Y02A20/402—River restoration
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Ovaj izum se odnosi na nove, genetički izvedena sojeve gljivica i njihovu upotrebu u proizvodnji antibiotika. Detaljnije, odnosi se na nove, genetički izvedene sojeve Aspergillus i njihovu upotrebu u proizvodnji lijeka lovastatin i njegovih analoga.
Lovastatin je kemijski [1S-[la (R*), 3α, 7β, 8β (2S*,4S*),8αβ]]-2-methylbutanska kiselina 1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7-dimethyl-8-[2-(tetrahydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl)-ethyl]-l-naphthalenyl ester i ima kemijsku formulu:
[image]
Koristan je kao antihiperholesterolemik jer ima snažno inhibicijsko djelovanje na HMG-CoA reduktazu, enzim koji kontrolira enzim u holesterol biosintezi. On je metabolit gljivica dobiven fermentacijskim postupcima uz upotrebu odabranih gljivičnih sojeva.
Antibiotici, kakav je lovastatin, su metaboliti koji traže izbor nekoliko enzima za njihove sinteze. Da bi se omogućila njihova proizvodnja molekularnim kloniranjem mikroorganizama koji proizvode antibiotike, potrebna je izolacija, analiza i, možda modifikacija odgovarajućih gena za nekoliko enzima. Pokušaji da se izoliraju takvi geni iz takvih gljivičnih vrsta, za sada rezultiraju klonima koji nose ili individualne gene iz kompleta ili samo nekompletne genetske grupe - vidi Malpartida and Hopwood, "Molecular Cloning of the Whole Biosynthetic Pathway of a Streptomyces Antibiotic and its Expression in a Heterologous Host", Nature (1984), 309 pp 462-464.
Kanadski patent 1,129,749 Endo, opisuje pripremu lovastatina fermentacijom, upotrebljavajući soj gljivične vrste Monascus ruber.
Kanadski patent 1,161,380 Monaghan i suradnici opisuje pripremu lovastatina fermentacijom, upotrebljavajući sojeve gljivične vrste Aspergillus terreus.
U oba ova prijašnja postupka, lovastatin je proizveden zajedno sa ostalim, kemijski vrlo sličnim spojevima, u znatnim količinama, od kojih mora biti odijeljen. U njegovoj proizvodnji uz upotrebu Monascus ruber, lovastatin se javlja uz monacolin J. U proizvodnji uz upotrebu Aspergillus terreus, javlja se uz dihydrolovastatin i uz hydroxy kiselinu. Dok hydroxy kiselina može biti lako laktonizirana do lovastatina, dihydrolovastatin mora biti odijeljen.
Predmet prikazanog izuma je da osigura nove, genetički uređene mutantne gljivične sojeve sposobne za upotrebu u fermentacijskim postupcima za dobivanje lovastatina.
Daljnji predmet izuma je da osigura novi postupak za dobivanje lovastatina fermentacijom uz upotrebu takvih sojeva.
Prema jednom aspektu prikazanog izuma, osigurani su novi mutantni gljivični sojevi odgovarajućih vrsta roda Aspergillus, koji su sposobni proizvoditi i izlučivati lovastatin. Ovi sojevi sadrže gene enzimskog seta za proizvodnju lovastatina, u funkcionalnom odnosu, dobivene iz DNA Aspergillus terreus sojeva koji proizvode lovastatin. Oni su proizvedeni postupkom protoplast transformacije DNA iz soja Aspergillus terreus koji proizvodi lovastatin, a koji također sadrži odgovarajući selektabilni marker, s drugim vrstama Aspergillus koji ne proizvode lovastatin, a izabrane su između A. oryzae, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans i A. flavus, izbor tako formiranih transformanta je na osnovi selektibilnog markera, identifikaciji i izolaciji lovastatin- producirajućih transformanata i subkloniranja iz njih.
Prema drugom aspektu izuma, osiguran je postupak za pripremu lovastatina koji obuhvaća fermentaciju hranjive podloge s transformantom Aspergillus mikroorganizma koji sadrži gene dobivene od Aspergillus terreus i kodeks za izbor lovastatin-producirajućih enzima, a isto tako i otkrivanje tako formiranog lovastatina.
Postupak prema prikazanom izumu daje lovastatin sa signifikantno manjim iznosima kontaminirajućih dihydrolovastatina i hydroxy kiselinskih derivata, u usporedbi s postupcima uz upotrebu Aspergillus terreus.
U postupku pripreme transformanata prema prikazanom izumu, mogu se koristiti uobičajene tehnike pripremanja protoplasta iz izabranih sojeva Aspergillus koji ne proizvode lovastatin, kao i uobičajene tehnike za ekstrakciju DNA iz lovastatin producirajućih sojeva Aspergillus terreus. Ove tehnike su stručnjacima dobro poznate i ne zahtjevaju detaljniju obradu na ovom mjestu. Slično tome korištene tehnike i postupci za transformaciju protoplasta su poznatne i standardne.
Preferirani izbor Aspergillus sojeva koji ne proizvode lovastatin je soj Aspergillus oryzae, ali to nije odlučujuće za uspjeh izvedbe izuma. I ostale vrste Aspergillus, pojedinačno A. niger, A. nidulans, A. fumigatus i A. flavus se mogu upotrijebiti. A. oryzae je izabran kao preferirana vrsta zbog svoje inertnosti koja omogućava lako i sigurno rukovanje u laboratoriju i zbog komercijalnih razloga s obzirom na fermentaciju.
Da bi se izabrao promjenjen mikroorganizam među nepromijenjenima nakon postupka transformacije protoplasta, DNA iz A. terreus treba sadržavati selektibilan marker. Postoji širok izbor raspoloživih selektibilnih markera koje iskusni stručnjak može izabrati i točan izbor nije odlučujući za uspjeh u radu prema ovom izumu. Markeri antibiotskih rezistenata kao što su ampicillin rezistenti, rifampicin rezistenti, streptomycin rezistenti itd, mogu biti upotrebljeni, te rezultirajuća smjesa transformanata i netransformanata može biti kultivirana u mediju koji sadrži odgovarajući antibiotik, tako da će jedino transformant koji sadrži selektivni marker preživjeti izolaciju.
Posebno preferiran kao selektivni marker, sa stanovišta praktičnosti, je cycloheximide rezistent. Cycloheximide je inhibitor sinteze proteina, tako da je prisustvo cycloheximide rezistent soja ili transformanta u bujonu kulture lako uočljivo.
Nakon selekcije transformanata na osnovi selektabilnog markera, oni su pregledani s obzirom na proizvodnju i lučenje lovastatina. Samo relativno mali broj od ukupnog broja proizvedenih transformanata u postupku protoplast transformacije ima tu sposobnost. Oni se prepoznaju po odijeljenom uzgoju u standardnoj bujon kulturi, i zatim analizom rezultirajućeg medija npr. HPLC tehnikom na prisustvo lovastatina.Oni koji su u testiranju pozitivni na prisustvo lovastatina su subkulturirani i uzgajani da bi dali kolonije novih, lovastatin-producirajucih transformant gljivičnih mikroorganizama roda Aspergillus i posebno Aspergillus oryzae vrste.
Zbog ilustrativnih razloga izum je nadalje opisan. pomoću slijedećih eksperimentalnih prikaza.
U pratećim crtežima:
SLIKA 1 je grafički prikaz HFLC analize nepročišćenih gljivičnih ekstrakata dobivenih prema eksperimentima primjera 1 dalje opisanim,
SLIKA 2 je 1H-NMR spektar lovastatin spoja dobivenog i pročišćenog iz hibridnog soja;
SLIKA 3 je maseni spektar istog spoja;
SLIKA 4 je prikaz morfoloških karakteristika novog transformanta AoAt/NBJ-V.
Primjer 1
MATERIJALI I POSTUPCI
KULTURA GLJIVICA-izolirane gljivice Aspergillus terreus i A. oryzae upotrijebljene u prikazanom proučavanju su izolirane iz uzoraka orhideja skupljenih s Agriculture Canada, Research Station, Beaverlodge, Alberta, Canada.
IZBOR CYCLOHEXIMIDE REZISTENT MUTANATA
Oba izolirana Aspergillus-a su uzgojena na Czapek-dox-ovoj podlozi koja sadrži cycloheximide (konc. 0.1-5 mM) tokom 6 dana na 28±2°C, Spore (108 ) svakog izoliranog A. terreus i A. oryzae su stavljene u lo mM cycloheximide Czapek-dox-ovog bujona (5o ml) i inkubirane tokom 30 minuta, centrifugirane na 10,000 g tokom 10 minuta i zatim re-suspendirane u sterilnoj destiliranoj vodi. Isprane su tri puta uz mućkanje i resedimentaciju centrifugiranjem. Spore se zatim suspendiraju u sterilnoj 1% (v/V) Triton X-100 otopini i njihovi brojevi se odrede kao alikvot na hemocitometru. Priredi se odgovarajuće razrjeđenje na 10 mM cycloheximide selekcijskom mediju i rezistant mutanti se izoliraju nakon 10 dana inkubacije na 28±2°C. Izolati se pregledaju s obzirom na stvaranje lovastatina. Cycloheximide rezistant lovastatin producirajući izolat od A. terreus je izabran za daljnje transformacijsko proučavanje.
PRIPREMANJE PROTOPLASTA I DNA
Aspergillus oryzae i cycloheximide rezistant lovastatin-producirajuci A. terreus (dalje označen kao JAG-4703) izolati su odijeljeno kultivirani u 50 ml Czapek-dox bujona. Kulture su inkubirane tokom 58 sati na 28±2 °C na spravi za rotiranje i trešenje (New Brunswick Scientific Inc.) na 200 okretaja u minuti, zatim se kulture pokupe i isperu sa sterilnom destiliranom vodom uz ponovljeno centrifugiranje.
Protoplasti iz kultura obiju vrsta su dobiveni upotrebljavajući Novozym 234 (Novo-Nordisk, Novo Alle, DK 2880, Bagsvaerd, Denmark) da bi se uklonile stijenke stanica za vrijeme 10-12 satne digestije, uglavnom slijedeći postupak opisan od Dickinson and Isenberg, J. Gen. Microbiol. 128, p. 651-654 (1982). Alikvoti protoplasta sposobni za život regeneriraju se od svake vrste, a pojedinačne spore dobivaju stanične stjenke na 28°C nakon 24 sata u regenerirajućem mediju (R) koji sadrži 0.1 g agara (Difco), 5 g sorboze i 0.35 g EDTA u 50 ml destilirane vode. Kod nicanja ovih spora razvijaju se sve kulturalne osobine njihovih roditelja.
Ukupna DNA je izolirana iz Aspergillus tereus protoplasta prema postupku opisanom od Schlief and Wensink, "Practical Methods in Molecular Biology", 33, 21-29 (1981). Protoplasti se suspendiraju u otopini koja se sastoji od 10 mg/ml SDS, 0.l M NaCl i 0.l M tris-HCl, pH 9.0. Doda se ekvivalentni volumen fenola zasićenog s tris-HCI puferom. Smjesa se centrifugira na 12,000 g tokom 10 minuta u Eppendorf Centrifuge tube (Brinkmann Instruments, Canada Ltd., Rexdale, Ontario). Gornja faza koja sadrži DNA se ukloni, pomješa s 95%-tnim etanolom, čuva na -20 C tokom 60 minuta i zatim se centrifugira kao i prethodno tokom 10 minuta. Kuglica se resuspendira u puferu, pH 7.0, inkubira s RNase (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.) tretira s fenolom i DNA precipitira iz vodenog sloja. Izolirana DNA se pročisti adsorpcijom i ispiranjem na DEAE-celulozi (DE-52, Whatman), namoči u 10 mM tris-HCl puferu, pH 7.5 i 0.3 M NaCl i stavi u pasteur pipetu. DNA se eluira s 10 mM tris-HCl puferom, pH 7.5 koji sadrži 1.5 M NaCl. Ova otopina se razrijedi do 0.2 M NaCl i DNA preciptira s dva volumena etanola. čistoća DNA je procjenjena pomoću 200-300 nm spektra određivanjem A260/A280 apsorpcijskog odnosa. Samo DNA s odnosima između 1.50 i 2.00 se upotrijebe u transformacijama. Šest primjera, svaki s po 0.1 mg izolirane DNA se inkubira uregenerirajućem mediju da bi se osigurala odsutnost životno sposobnih protoplasta i nijedan od njih nije razvio nikakvu koloniju.
PROTOPLAST-DNA INKUBACIJE
Aproksimativno 5.2 x 104 protoplasta A. oryzae, proračunato pomoću hemocytometarskog brojača, je inkubirano s 10-100 ng DNA od A. terreus u 5 ml regenerirajućeg medija, čiji je sastav već prethodno opisan i regenerira se po već opisanom postupku. Da bi se proučili mogući kemijski učinci DNA na stvaranje lovastatina, 10-100 mg DNA iz telećeg thymusa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.,U.S.A.), DNA (Bethesda Research Laboratories, Gaitherberg, MD, U.S.A.) i homolog A. oryzae DNA se inkubiraju u sličnim iznosima s protoplastom A. oryzae. Kada se uključi DNA u inkubaciji, regeneracija protoplasta se smanji na manje od 10% i usporediv broj tako tretiranih proto-plasta (105) ne uspijeva dati bilo kakvu cycloheximide rezistenciju.
PRIPREMA 1 TESTIRANJE LOVASTATINA
Suspenzija spora dobivena od A. oryzae protoplasta inkubiranih s A. terreus DNA je inokulirana, 1 ml po Petrijevoj zdjelici, na Czapek-dox-ov agar koji sadrži 10 mM cycloheximida. Nakon inkubacije tokom 48 sata na 28±2°C, kulture dosežu u dijametru 6-8 mm. Svaka se zasebno razvija iz pojedinačne spore pod ovakvim uvjetima. One koje su porasle na cycloheximide mediju, se svaka pojedinačno inokulira na Czapek'dox bujon (50 ml u 500 ml Erlenmeyer tikvici), inkubiraju se na spravi za rotirajuće trešenje (200 o/min) na 28±2°C tokom 12 sati. Svaki rastući medij se ispita na produkciju lovastatina postupkom koji je kasnije opisan i HPLC analizom.
EKSTRAKCIJA
Fermentirani bujon (50 ml) se zakiseli do pH 4.0 s 17 N HCl i zatim frakcionira s ethylacetatom (100 ml, 3x). Ujedinjene ethylacetatne frakcije se suše u vakuumu na 30°0, ostatak se stavi u acetonitril (5 ml) izatim se podvrgne HPLC analizi.
HPLC ANALIZA
HPCL oprema (Beckman Model 420) je nabavljena ocL Beckman Instruments, Toronto, Canada i sastoji se od Altex pumpe (Model 110 A) i injekcijskog ventila.LC-UV detektor se namjesti na 237 nm. Upotrijebljena je hypersil C-18 ODS silicijeva kolona (25 x 0.46 cm, i.d.) i sistem otapala acetonitrila i vode (55:45, v/v) pri brzini protoka od 1.0 ml/min. Proizveden lovastatin je uspoređen i kvantitativno određen iz standardne lovastatin krivulje.
Primjer 1 – Rezultati
Sedamdesetdevet cycloheximide-rezistent izolata, uključujući četiri lovastin-producirajuća izolata je dobiveno iz 5.2 x 105 A. oryzae protoplasta inkubiranih s DNA dobivenom od cycloheximide-rezistent lovastatin-producirajućeg mutanta A. terreus. Transformacijski eksperimenti su provedeni šest puta.
Rezultati su prikazani u slijedećoj tabeli 1.
[image]
Jedna od transformiranih kultura AO-II, zadržava svoja originalna transformirana svojstva tokom šest mjeseci. Slika 1 prikazuje EPLC analize ekstrakta dobivenih iz kultura primalaca i davalaca A. oryzae, te onih tretiranih s DNA A. terreus. Proizvodnja lovastatina u transformiranim izolatima je prikazana u tabeli 2.
[image]
Izolat broj AC-I je bio pet puta sub-kulturiran, da bi dao transformant AoAt-NBJ/5 koji je bio pohranjen 25. veljače 1992. kao životno sposobna, permanentna kultura u American Type Culture Collection pod brojem ATCC 74135.
Lovastatin je proizveden zajedno sa svojim hydroxy kiselinskim analogom koji se može prevesti u lovastatin npr. refluksom u toluenu i tako završiti laktonizaciju, te tako povećati prinos lovastatina. Laktonizacija nije bila provedena u ovim primjerima.
Bilo je proizvedeno 166.72±5.92 mg/I lovastatina na A. terreus ishodnoj kulturi u Czapek'dox bujonu, a ishodni A.oryzae nije proizveo lovastatin.
Slika 2 na pratećim crtežima, je 1H-NMR spektar spoja lovastatina pročišćenog pomoću HPLC od hibridnog spoja. Usporedbom s poznatim standardnim lovastatin spektrom, ovaj spektar potvrđuje identitet produkta.
Slika 3 na pratećim crtežima je maseni spektar istog produkta i pokazuje da je dobiveni lovastatin čistoće 99%.
Koncentracija DNA se kreće u rasponu od 5-20 ng/ml medija i ne utječe niti na kapacitet regeneracije protoplasta A. oryzae niti na postizanje cycloheximide rezistenata i lovastatin producirajućih izolata iz inkubacije s DNA A. terreus. Ti podaci upućuju da ove koncentracije nisu bile limitirajući faktor u produkciji lovastatina. Slično, DNA iz telećeg thymusa, DNA i homolozi DNA A. oryzae pri koncentracijama od 5 ng do 5 mg na ml medija nisu imali učinak na regeneraciju protoplasta A. oryzae kada se usporedi s netretiranim kontrolnim uzorcima. Naravno, DNA pri koncentraciji 10 i 100 Mg/ml medija smanjuje regeneraciju do maksimuma od 26% i 1%. Ovi DNA postupci ne izazivaju oslobađanje lovastatina.
Regeneracijski medij daje brojne protoplaste usporedive s onim dobivenim od Acha i sur., J. Gen. Microbiol., 45, 515-523 (1966), upotrebljavajući kompleksniji mineralni medij. Konidija i svježe niknute konidije daju bolji prinos životno sposobnih protoplasta i DNA u usporedbi s micelijima. Formiranje celularnih agregata za vrijeme regeneracije protoplasta, opisano od Acha i sur. (1966) nije primijećeno u ovom sistemu. Očevidan prijenos faktora odgovornih za javljanje cycloheximide rezistencije i oslobađanje lovastatina od A. terreus do A. oryzae upućuje na prijenos DNA među vrstama. Ko-transformacija cyclo-heximide rezistencije i lovastatin produkcije je neočekivano zadovoljavajuća i upućuje na fizičko srodstvo i moguće skupljanje gena dobivenih ekspresijom ovih karakteristika.
Morfologija novog transformanta AoAt-NBJ/5 je prikazana na slici 4 i može biti karakterizirana na slijedeći način:
MORFOLOGIJA AoAt-NBJ/5
Konidijske glave u obliku stupa, svjetlo smeđe. Konidiofore glatke, bezbojne. Vezikule hemisferične, pokriveno do jedne polovine ili do dvije trećine s fialidama u dva sloja. Konidije su okrugle ili elipsoidne, glatke kolonije na Czapekovom agaru rastu veoma brzo ili pahuljaste ili baršunasto cimet smeđe zahvaljujući produkciji konidija. Narančasti eksudat, mijenja žuto u smeđe.
Ovi eksperimenti pokazuju da, u principu, genetički određene karakteristike proizvodnje antibiotika na jednoj vrsti gljivica mogu biti iskazane i na drugoj.
Primjer 2 - Postupak rada
Kultura gljivica: Transformirana kultura Aspergillus oryzae (ATCC-74135) AoAt/NBJ-V je upotrijebljena za proizvodnju lovastatina.
FERMENTACIJA
Priprema sjemena: Kultura gljivica (liofilizirana bočica) se aseptički prenese na kosi krumpir-dekstroza agar i dozvoli se rast na 25°C tokom 4-5 dana. Na kraju inkubacije, priredi se suspenzija konidija dodatkom 10 ml triton X-100 (0.01%) otopine, snažno se protrese i suspenzija konidija se prenese na sterilnu rižu (50 g) u Erlenmayer-ovoj tikvici (zapremine 250 ml). Bočica je dopunjena s dodatnih 10 ml sterilne vode, snažno se protrese i inkubira na 28°C tokom 5-7 dana. Na kraju inkubacijskog perioda dodano je 50 ml sterilne vode.
Suspenzija konidija se propusti kroz sterilni muslin i filtrat koji sadrži 1 x 108 konidija/ml se prenese na fermenter (kapaciteta 50 L) sa 30 L sjemenog medija. Sastav upotrijebljenog sjemenskog medija je bio slijedeći:
D-glukoza 20 g/L
Malt ekstrakt 20 g/L
Neo peptone 3 g/L
Voda iz vodovoda 1 L
pH 6.8 (podešen s 10% NaOH). Medij se sterilizira na 12l°C tokom 30 minuta (15 psi). Sjeme raste tokom 17-20 sati na 28°C (brzina prozračivanja 0.3-0.5 vvm) s 80-100 % otopljenog kisika (200 o/min).
PROIZVODNJA LOVASTATINA
Sjeme (30 L) se prenese u fermentacijsku posudu (1000 L radni volumen) koja sadrži proizvodni medij. Proizvodni medij je bio slijedećeg sastava:
Laktose 60 g/L
Ardamine pH 10 g/L
Soy protein 2 g/L
KCL 2 g/L
KH2PO4 0.8 g/L
MnSO4 x 4H2O 0.03 g/L
Betaine 0.6 g/L
P2000 2 ml
voda iz vodovoda 1 L'
pH 6.8 (prije sterilizacije namješten s 10%NaOH/H2SO4), sterilizacija na 121°C tokom 1 sata na 15-20 psi.
Nakon inokulacije, kultura raste tokom 7-8 dana na 28°C s kontrolom pH 6.0-6.2 (s 10% H2SO4).
Brzina prozračivanja je zadržavana između 0.7 - 10 vvm (% otopljenog kisika je 80 - 100%).
DRUGA FAZA PROIZVODNJE
Sedam dana stari fermentacijski bujon (50 L) se aseptički prenese u sjemeni fermenter (2000 L radnog volumena) koji sadrži 1500 L sjemenog medija (prethodno opisanog sastava). Sjeme raste tokom 24 sata na 28°C (200 o/min) otopljenog kisika 80 do 100%. Bujon (200 L) se aseptički prenese u produkcijski fermenter (30,000 L kapaciteta s radnim volumenom 20,000 L) koji sadrži 18,000 L produkcijskog medija. Dozvoli se rast kulture daljnjih 7 - 9 dana na 28°C s pH kontrolom 6.0 - 6.2.
Nakon 60 sati fermentacije, pH nije kontroliran. Fermentirani bujon je dopunjen s hranjivim medijem (brzina 10 L/sat) tokom 5 dana. Sastav medija je slijedeći:
D-glucose 285.7 g/L
Ardamine pH 71.4 g/L
Soy protein 14.3 g/L –
Voda iz vodovoda 1 L
pH 6.8 (prije sterilizacije), sterilizacija na 121°C tokom 30 - 45 minuta. Na kraju fermentacije, bujon se zakiseli do pH 4.0 s 10 N HCl i centrifugira. Pogača gljivica se suši na 55°C i podvrgne ekstrakciji.
EKSTRAKCIJA 1 PROČIŠĆAVANJE
Suha pogača gljivica (20 kg) se homogenizira s hladnim ethyl acetatom (10-15 min) i homogenizirani materijal se refluksira na 80-85°C tokom 4-6 sati, ohladi se i filtrira. Filtrat se osuši u vakuumu do crnog ostatka (2.5-3 kg). Crni materijal se pomiješa sa silika gelom (2.5 kg) i CH2CI2 (5 L). CH2Cl2 se evaporira u vakuumu, a sirov crni materijal pomiješan sa silika gelom se stavi na silika gel staklenu kolonu (100 cm dugu x 22.5 cm dijametra) i razvije se sa EtOAc/Hexane (1:2 v.v). Uzorci (2.000 jl, 12x) se skupe. Nakon 24 sata eluacije, smjesa otapala se promijeni u EtOAc/Hexane (1:1 v.v) i eluira daljnjih 24 sata. Uzorci koji sadrže produkt se ujedine, osuše (280 g) i kristaliziraju s metanolom.
KRISTALIZACIJA
Žuti osušeni produkt (280 g) se otopi u 2.8 L metanola i vrije tokom 40-60 minuta na 60-65°C. Vruća metanolna smjesa se filtrira i filtrat se inkubira tokom 4-6 sati na 4°C. Bijeli kristalni dijelovi se odijele od osnovne tekućine i isperu s hladnim metanolom. Kristali se osuše u vakuumu, izvažu (190 g) i drže u desikatoru na 4°C.
Postupak prikazanog izuma može rezultirati prinosom lovastatina koji je dovoljno velik da uzrokuje rupture na staničnim stjenkama novih Aspergillus oryzae transformanata, tako da na taj način liziranje stanica prije otkrivanja lovastatina može biti uklonjeno. To pojednostavljuje otkrivanje i postupak pročišćavanja. Kao što je prethodno opisano, lovastatin prema prikazanom postupku može biti otkriven postupkom ekstrakcije s otapalom, bez potrebe formiranja estera, soli itd. Ekstrakcija otapalom je mnogo jednostavniji i mnogo ekonomičniji postupak otkrivanja i pročišćavanja od kromatografije.
Iako je izum prikazan detaljima i zapisima specifičnih eksperimenata, jasno je da nije ograničen samo na to. Njegov opseg je definiran u pripadajućim patentnim zahtjevima.
Claims (13)
1. Postupak za pripremu lovastatina, naznačen time, da sadrži fermentaciju hranjivog medija s transformiranim gljivičnim mikroorganizmom Aspergillus soja izabranog između grupe vrsta A. oryzae, A. niger, A. nidulans, A. fumigatus i A. flavus, čiji sojevi su nesposobni za izlučivanje lovastatina, ali koji su transformirani tako da sadrže stranu DNA kodiranu da izabere enzime sposobne za sintezu lovastatina i selektibilni marker, te otkrivanje lovastatina iz hranjivog medija.
2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da transformirani mikroorganizam sadrži stranu DNA dobivenu iz lovastatin-producirajuće Aspergillus terreus vrste.
3. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time, da je rečeni Aspergillus soj, soj vrste A. oryzae.
4. Postupak prema bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačen time, da je strana DNA uvedena u transformant koji sadrži cycloheximide-rezistentne gene kao selektivni marker.
5. Postupak prema bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačen time, da je transformant AoAt-NBJ/5 kao što je opisano i definirano u tekstu.
6. Postupak prema bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačen time, da uključuje dodatni korak laktonizacije hydroxykiselinskog analoga formiranog u fermentacijskom postupku lovastatina.
7. Postupak prema bilo kojem prethodnom zahtjevu, naznačen time, da je otkrivanje lovastatina obavljeno ekstrakcijom s otapalom.
8. Novi gljivični transformanti, naznačen time, da su sposobni izabrati enzime za sintezu lovastatina, rečeni transformanti su sojevi Aspergillus sp. izabrani između A. oryzae, A. niger, A. nidulans, A. fumigatus i A. flavus koji su prirodno nesposobni izlučivati lovastatin, ali sadrže stranu DNA koja sadrži genetski kod za izbor enzima sposobnih za sintezu lovastatina.
9. Gljivični transformant prema zahtjevu 8, naznačen time, da je Aspergillus sp. izabran između grupe koja se sastoji od A. oryzae, A. niger, A. nidulans, A. fumigatus i A. flavus.
10. Gljivični transformant prema zahtjevu 9, naznačen time, da je Aspergillus sp. A. oryzae.
11. Gljivični transformant prema zahtjevu 10, naznačen time, da je strana DNA dobivena od lovastatin-oslobađajućeg soja vrste Aspergillus terreus.
12. Gljivični transformant prema zahtjevu 11, naznačen time, da sadrži produkt transformacije protoplasta ukupne DNA iz recenog soja A. terreus u rečeni soj A. oryzae.
13. Gljivični transformant AoAt-NBJ/5, naznačen time, da je opisan i definiran u tekstu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83349692A | 1992-02-10 | 1992-02-10 | |
| CA002062023A CA2062023A1 (en) | 1992-02-10 | 1992-02-27 | Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP930134A2 true HRP930134A2 (en) | 1995-10-31 |
Family
ID=25674996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR930134A HRP930134A2 (en) | 1992-02-10 | 1993-02-08 | Novel fungal strains and the use thereof in the antibiotic production |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0556699A1 (hr) |
| JP (1) | JPH0622780A (hr) |
| CN (1) | CN1076965A (hr) |
| AU (1) | AU667498B2 (hr) |
| BG (1) | BG61180B1 (hr) |
| BR (1) | BR9300467A (hr) |
| CZ (1) | CZ17293A3 (hr) |
| EE (1) | EE03048B1 (hr) |
| FI (1) | FI930561A (hr) |
| HR (1) | HRP930134A2 (hr) |
| HU (1) | HUT67061A (hr) |
| IL (1) | IL104481A0 (hr) |
| LV (1) | LV10502B (hr) |
| NO (1) | NO930446L (hr) |
| NZ (1) | NZ245713A (hr) |
| PL (1) | PL297691A1 (hr) |
| SI (1) | SI9300068A (hr) |
| SK (1) | SK5593A3 (hr) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5766939A (en) * | 1989-05-05 | 1998-06-16 | Baylor College Of Medicine | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms |
| US5571691A (en) * | 1989-05-05 | 1996-11-05 | Baylor College Of Medicine | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using CDNA sequences in various organisms |
| US6100054A (en) * | 1989-05-05 | 2000-08-08 | Baylor College Of Medicine | Production for recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using DNA sequences in various organisms |
| IL94183A (en) | 1989-05-05 | 2003-09-17 | Baylor College Medicine | cDNA SEQUENCE CODING FOR HUMAN LACTOFERRIN PROTEIN OR PORTION THEREOF AND LACTOFERRIN PROTEIN PRODUCED FROM SAID SEQUENCE |
| US5849881A (en) * | 1989-05-05 | 1998-12-15 | Baylor College Medicine | Production of recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptides using cDNA sequences in various organisms |
| SI9300303A (en) * | 1993-06-08 | 1994-12-31 | Krka Tovarna Zdravil | Process for isolation of hypolipemic effective substance |
| WO1995012661A1 (en) * | 1993-11-02 | 1995-05-11 | Merck & Co., Inc. | Dna encoding triol polyketide synthase |
| CN1171400A (zh) * | 1996-03-05 | 1998-01-28 | 武田药品工业株式会社 | 呫吨衍生物,其制备和用途 |
| US6111081A (en) * | 1996-05-31 | 2000-08-29 | Baylor College Of Medicine | Lactoferrin variants and uses thereof |
| EP0970236B1 (en) * | 1997-02-20 | 2006-05-24 | DSM IP Assets B.V. | Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media |
| NZ500870A (en) * | 1998-03-20 | 2002-03-01 | Biogal Gyogyszergyar | Metabolic controlled fermentation process for preparing mevinolin (lovastatin) |
| US6391583B1 (en) | 1998-12-18 | 2002-05-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of producing antihypercholesterolemic agents |
| EP1176208A1 (en) * | 2000-07-28 | 2002-01-30 | Société des Produits Nestlé S.A. | Koji molds and use thereof for preparing cholesterol-lowering products |
| WO2002064809A2 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-22 | Unilever N.V. | Process for the preparation of one or more statins by fermentation |
| KR100423892B1 (ko) * | 2001-12-03 | 2004-03-22 | 씨제이 주식회사 | 스타틴의 제조에 있어서 새로운 락톤화 방법 |
| WO2006035295A1 (en) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | Ranbaxy Laboratories Limited | Process for the purification of lovastatin |
| CN102533893A (zh) * | 2010-12-09 | 2012-07-04 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种制备莫那可林j的方法 |
| CN104277980B (zh) * | 2013-07-09 | 2020-04-21 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 分离纯化米曲霉转化子的方法 |
| CN105602856B (zh) * | 2015-12-16 | 2019-04-16 | 浙江师范大学 | 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 |
| CN108118042B (zh) * | 2016-11-30 | 2021-01-15 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林j的曲霉菌株及其构建方法与应用 |
| CN111117894B (zh) * | 2019-11-26 | 2023-11-10 | 漳州大北农农牧科技有限公司 | 一株米曲霉菌株及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU535944B2 (en) * | 1979-06-15 | 1984-04-12 | Merck & Co., Inc. | Hypocholestermic fermentation products from aspergillus |
| EP0463707A1 (en) * | 1985-12-17 | 1992-01-02 | Lubrizol Genetics Inc. | Production of polyketide antibiotics |
| FI104984B (fi) * | 1988-08-11 | 2000-05-15 | Dsm Nv | Menetelmä biosynteettisten tai säätelygeenien identifioimiseksi ja käyttämiseksi sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi |
-
1993
- 1993-01-20 NZ NZ245713A patent/NZ245713A/en unknown
- 1993-01-22 IL IL104481A patent/IL104481A0/xx unknown
- 1993-01-28 AU AU32121/93A patent/AU667498B2/en not_active Ceased
- 1993-02-02 SK SK55-93A patent/SK5593A3/sk unknown
- 1993-02-03 BR BR9300467A patent/BR9300467A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-02-08 HR HR930134A patent/HRP930134A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1993-02-09 BG BG97421A patent/BG61180B1/bg unknown
- 1993-02-09 FI FI930561A patent/FI930561A/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-02-09 EP EP93102016A patent/EP0556699A1/en not_active Withdrawn
- 1993-02-09 NO NO93930446A patent/NO930446L/no unknown
- 1993-02-10 JP JP5061492A patent/JPH0622780A/ja active Pending
- 1993-02-10 HU HU9300330A patent/HUT67061A/hu unknown
- 1993-02-10 SI SI19939300068A patent/SI9300068A/sl unknown
- 1993-02-10 CN CN93102686A patent/CN1076965A/zh active Pending
- 1993-02-10 PL PL29769193A patent/PL297691A1/xx unknown
- 1993-02-10 CZ CZ93172A patent/CZ17293A3/cs unknown
- 1993-02-10 LV LVP-93-115A patent/LV10502B/en unknown
-
1994
- 1994-11-14 EE EE9400129A patent/EE03048B1/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0622780A (ja) | 1994-02-01 |
| EE03048B1 (et) | 1997-10-15 |
| SI9300068A (en) | 1993-09-30 |
| LV10502B (en) | 1995-08-20 |
| NO930446L (no) | 1993-08-11 |
| NZ245713A (en) | 1994-12-22 |
| AU3212193A (en) | 1993-08-12 |
| HUT67061A (en) | 1995-01-30 |
| SK5593A3 (en) | 1993-12-08 |
| BR9300467A (pt) | 1993-08-17 |
| PL297691A1 (en) | 1994-01-24 |
| IL104481A0 (en) | 1993-05-13 |
| BG97421A (bg) | 1994-03-24 |
| AU667498B2 (en) | 1996-03-28 |
| BG61180B1 (bg) | 1997-02-28 |
| FI930561A (fi) | 1993-08-11 |
| FI930561A0 (fi) | 1993-02-09 |
| CZ17293A3 (en) | 1993-12-15 |
| HU9300330D0 (en) | 1993-04-28 |
| EP0556699A1 (en) | 1993-08-25 |
| LV10502A (lv) | 1995-02-20 |
| NO930446D0 (no) | 1993-02-09 |
| CN1076965A (zh) | 1993-10-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HRP930134A2 (en) | Novel fungal strains and the use thereof in the antibiotic production | |
| US5362638A (en) | Fungal strains and use thereof in antibiotic production | |
| KR20020013483A (ko) | 항고콜레스테롤혈증 제제의 제조 방법 | |
| CN115197172B (zh) | 二倍半萜化合物、其合成基因簇与合成方法 | |
| O'Connor | Strategies for engineering plant natural products: the iridoid-derived monoterpene indole alkaloids of Catharanthus roseus | |
| JP4197312B2 (ja) | プラバスタチンナトリウム | |
| CN101454453B (zh) | 编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列 | |
| WO1999010499A1 (en) | Statin production by fermentation | |
| CN109402086A (zh) | 一种2-甲基丁酸侧链水解酶及其表达菌株和应用 | |
| CA2562805A1 (en) | Process for the production of macrolides using a novel strain, streptomyces sp. bicc 7522 | |
| US5200342A (en) | Squalene synthetase inhibitors and processes therefrom | |
| CN107674881A (zh) | 紫杉二烯过表达载体及其应用 | |
| CN118063531B (zh) | 大环内酯类化合物PA-46101s C-E的制备及其应用 | |
| ES2208221T3 (es) | Conversion microbiana de 2-metilquinoxalina. | |
| CN110527636A (zh) | 一种合成环匹阿尼酸衍生物的突变菌株及其构建方法和应用 | |
| JP2797331B2 (ja) | 新規微生物及びジベレリン類の製造方法 | |
| US20030195146A1 (en) | FO-6979 substances and process for producing the same | |
| US5250424A (en) | Processes for preparing novel squalene synthetase inhibitors | |
| RU2252258C2 (ru) | Микробный способ получения правастатина | |
| JP3779719B2 (ja) | サッカロスリックス新株、これを用いてプラバスタチンを生産する方法及び（ＨＭＧ）−ＣｏＡリダクターゼの単離方法 | |
| KR101610970B1 (ko) | 갈보놀라이드 생합성에 관여하는 유전자 | |
| CN115261239A (zh) | 一种peptaibols类抗菌肽的诱导生产方法 | |
| CZ2000512A3 (cs) | Způsob mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu | |
| JPH05239023A (ja) | 生理活性物質ｍｂｐ０３９−０６およびその製造法 | |
| KR20110044613A (ko) | 로바스타틴 생산균주 탐색을 위한 ｐｃｒ 프라이머 및 이를 이용한 탐색방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODBC | Application rejected |