JP2797331B2

JP2797331B2 - 新規微生物及びジベレリン類の製造方法

Info

Publication number: JP2797331B2
Application number: JP21675788A
Authority: JP
Inventors: 恵美春木; 隆三川; 治行大岸
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1988-08-31
Filing date: 1988-08-31
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: JPH0265775A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は植物の成長を直接制御している植物ホルモン
の一つとして知られているジベレリン類を産生する新規
な微生物及び当該微生物を培養して、ジベレリン類を製
造する方法に関する。

（従来技術）現在までに微生物及び植物起源のジベレリンが74種知
られている〔日本農芸化学会誌、14,1526（1938）、Arc
h.Biochem.Biophys.,54,240（1955）〕。

ジベレリンの植物に対する最も顕著な生理作用は無傷
植物に対する成長促進効果で、幼植物や、わい生植物に
於て顕著に現われる。他に、ある種の植物の休眠打破効
果、トマト、キュウリ、葡萄などに単為結実を誘起させ
る効果を示すことも知られている。特に、葡萄のデラウ
エア等の品種における種なし化は実用化されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来、ジベレリン類は、専ら稲馬鹿苗病菌Gibberella
fujikuroi（Fusarium moniliforme）から生産されてい
たが、近年キャツサバに寄生する病原菌Sphaceloma man
ihoticolaからGA₄が単離され〔Biochem.Biophys.Res.Co
mm.,91,35（1979）〕、Neurospora crassaからGA₃が同
定された〔Agric.Biol.Chem.,47（７）,1693（198
3）〕。これは、G.fujikuroi以外のかびがジベレリンを
生産することを示した最初の例である。

しかし、依然として、ジベレリン類を生産する菌の数
は少ないのが現状であった。そこで、本発明者はGibber
ella fujikuroi以外で、ジベレリンを生産する菌を提供
すべく、鋭意検討した結果、フェオスフェリア（Phaeos
phaeria）属菌がジベレリンA₄（GA₄）及び、ジベレリン
A₉（GA₉）を生産することを見いだし、本発明を完成す
るに至った。

（発明の構成）即ち、本発明の要旨は、GA₄及びGA₉産生能を有するフ
ェオスフェリア・エスピーＬ−487（Phaeosphaeria sp.
L−487）に存する。

以下、本発明を説明するに、本発明に係わるフェオス
フェリア・エスピーＬ−487は、小房子嚢菌のフェオス
フェリア属に属し、その菌学的性質は、以下に示す通り
である。

（１）形態学的特徴（第２図参照）子嚢果は宿主植物上に散在し、はじめ植物表皮下に埋
没して生じる。のちに表皮を破り、乳頭状の頸部を突出
させる。子嚢果の形状は球形〜亜球形、又は円錐形で、
大きさは直径150〜280μｍである。殻壁は２〜３層の薄
い層から成り、その細胞は多角状で、比較的柔軟であ
る。頸部は乳頭状で、頸部孔口内面はペリフィシスを欠
く。子嚢は多数生じ、その形状は円筒形〜棍棒形で、基
部に向かって細まっており、頂端は丸く、厚膜、二重壁
構造、８胞子性で、偽側糸は豊富に生じ、糸状、隔壁を
有する。大きさは95〜130×10〜12μｍである。子嚢胞
子は子嚢内に２列状に配列しており、形状が長い楕円形
〜長い円筒形で、大きさ20〜50×４〜4.7μｍの、黄褐
色を呈し３〜８隔壁を有する（通常７隔壁を有する）も
のである。子嚢胞子の各細胞は顕著な膨大細胞を欠き、
また狭窄した細胞も欠いており、たまにゼラチン鞘にお
おわれているものもある。

（２）各種培地上における培養上の特徴（イ）ジャガイモ・ブドウ糖寒天培地（PDA）上、27
℃、３週間の培養コロニーはビロード状で、中央部〜周辺部で黄褐色を
呈し、裏面は砂色を呈する。気生菌糸は幅2.5−3.7μｍ
に至り、隔壁を有し、分枝しており、外観は淡黄色を呈
する。基底菌糸は放射状に伸長し、分枝しており、幅1
4.0μｍに至る。又、多数の隔壁を有し、外観は黄褐色
を呈する。PDA上、３週間の培養では、完全世代及び不
完全世代の生殖器官の形成は観察されなかった。

（ロ）麦芽寒天培地（MA）上、27℃、３週間の培養コロニーは綿毛状で、中央部で淡黄茶色、周辺は黄褐
色を呈し、裏面は茶灰色を呈する。気生菌糸は幅2.0〜
3.8μｍに至り、隔壁を有し、外観は淡黄色を呈する。
基底菌糸は放射状に伸長し、分枝しており、幅5.7−6.0
μｍに至る。又、多数の隔壁を有し、外観は黄褐色を呈
する。MA上、３週間の培養では、完全世代及び不完全世
代の生殖器官の形成は観察されなかった。

（ハ）オートミル寒天培地（OA）上、27℃、３週間の
培養コロニーは綿毛状に広がり、中央部〜周辺部で暗い黄
茶色を呈し、裏面は暗い黄茶色を呈する。気生菌糸は分
枝しており、幅3.7μｍに至る。又、隔壁を有し、外観
は淡黄色を呈する。基底菌糸は放射状に伸長し、分枝し
ており、幅4.7−5.0μｍに至る。又、多数の隔壁を有
し、外観は黄褐色を呈する。OA上３週間の培養では、完
全世代及び不完全世代の生殖器官の形成は観察されなか
った。

（ニ）レオニアン寒天培地（Leonian's agar）上、27
℃、３週間の培養コロニーはビロード状に拡がる、中央部はうすい黄茶
色で、周辺部は暗い黄茶色を呈し、裏面は茶灰色を呈
す。気生菌糸は分枝しており、幅3.0μｍに至る。又、
隔壁を有し、外観は淡黄色を呈する。基底菌糸は放射状
に伸長し、分枝しており、幅7.5−8.0μｍに至る。又、
多数の隔壁を有し、外観は黄褐色を呈する。Leonian's
agar上、３週間の培養では、完全世代及び不完全世代の
生殖器官の形成は観察されなかった。

（３）生理的性質（イ）最適生育条件最適pH:7〜８（LCA液体培地〔三浦、工藤、日本菌学
会報、11巻,116〜118頁、1970年〕中、14日間培養）最適温度:20〜27℃（PDA寒天培地上、14日間培養）（ロ）生育の範囲 pH:3〜９（LCA液体培地〔三浦、工藤、日本菌学会
報、11巻,116〜118頁、1970年〕中、14日間培養）温度:5〜30℃（PDA寒天培地上、14日間培養）（４）分類学的考察（イ）高次の分類学上の位置本菌株（Ｌ−487）は、イネ科植物体上に着生して生
じ、フラスコ状の子嚢果を形成する。永続性の偽側糸
（Pseudoparaphysis）を持ち、子嚢は二重壁構造を有す
る。子嚢胞子は隔壁を有し、多室である等の主な特徴を
持つことから、L.Holm,Symb.Botan.Upsal.,14（３）１
−188（1957）;E.S.Lutterell,Loculoascomycetes,The
Fungi,Vol.4A（ed.G.C.Ainsworth et al.）,135−219
（1973）;J.A.von Arx ＆ E.Mller,Stud.Mycol.,9,1
−159（1975）等によって分類されている小房子嚢菌網
（ロキュロアスコミセイテス,Loculoascomycetes）−プ
レオスポラ目（Pleosporales）−プレオスポラ科（Pleo
sporaceae）に帰属する。

（ロ）属レベルの同定本菌株（Ｌ−487）は、１）子嚢果は球形〜亜球形又
は円錐形、２）子嚢果殻壁は豊富な褐色糸状菌糸におお
われており、剛毛を欠く、３）隔壁は２−３層の薄い層
から成る、その細胞は多角状、柔軟、４）子嚢胞子は３
〜８隔壁から成り（通常７隔壁を有す）、黄褐色を呈
し、胞子はゼラチン鞘におおわれる、という特徴を有す
る。これらの性状について、L.Holm,Symb.Botan.Upsa
l.,14（３）;1−188;E.S.Lutterell,Loculoascomycete
s,The Fungi,Vol.4A（ed.G.C.Ainsworth et al.）,135
−219（1973）;J.A.von Arx ＆ E.Mller,Stud.Myco
l.,9;1−159（1975）のプレオスポラ科に関する分類学
的文献によって検索したところ、本菌株（Ｌ−487）は
フェオスフェリア属（Phaeosphaeria）に帰属すること
が判明した。

（ハ）種レベルの同定 L.Holm,Symb.Botan.Upsal.,14（３）;1−188（1957）
及びG.A.Hedjaroude,Sydowia22:57−107（1968）のフェ
オスフェリア属（Phaeosphaeria）に関する分類学的文
献によれば、本属には21種が記載されている。これらの
種はそれぞれ、子嚢胞子の諸性質、即ち、胞子の形、大
きさ、隔壁数、膨大細胞の位置、ゼラチン鞘の有無、胞
子の色調等によって識別されている。

本菌株（Ｌ−487）は、１）子嚢胞子は長い楕円形〜
円筒形で、大きさ20〜50×４〜4.7μｍ、２）３〜８隔
壁を有す、３）膨大細胞を欠く、４）黄褐色を呈する、
５）たまにゼラチン鞘におおわれているものもある、と
いう特徴を有する。これらの性状について、上述の文献
を検索したところ、本菌株（Ｌ−487）に合致する種は
見出されなかった。

よって、本菌株（Ｌ−487）は、フェオスフェリア属
（Phaeosphaeria）の新菌種と推定されるが、正式な種
の命名は今後の分類学的検討を待つことにして現段階で
はフェオスフェリア・エスピー（Phaeosphaeria sp.）
Ｌ−487と同定した。

Ｌ−487株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第10237号（FERM Ｐ−10237）として寄託されて
いる。

一般に、フェオスフェリア・エスピー（Phaeosphaeri
a sp.）Ｌ−487は、他の菌類の場合にみられるようにそ
の性状が変化しやすい。例えば、Ｌ−487株の、又はこ
の株に由来する突然変異株（自然発生又は誘発性）、形
質接合体もしくは遺伝子組換え体であっても、ジベレリ
ンA₄及びジベレリンA₉の生産能を有するものはすべて本
発明の方法に使用することができる。

本発明においては、前記の菌を通常の微生物が利用し
うる栄養物を含有する培地で培養する。栄養源として
は、グルコース、水飴、デキストリン、シュークロー
ス、でんぷん、糖蜜、動・植物油等を使用できる。また
窒素源として、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティーブ・
リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫
酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。そ
の他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びそ
の他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加す
ることは有効である。

培養法としては、好気的条件下での培養法が適してい
る。培養に適当な温度は、20〜30℃であるが、多くの場
合20〜27℃付近で培養する。ジベレリンの生産は培地や
培養条件により異なるが、振とう培養、タンク培養とも
通常３〜10日の間でその蓄積が最適に達する。培養物中
のジベレリンの蓄積量が最高になった時に培養を停止
し、培養液から目的物質を単離精製する。

本発明のジベレリンは、脂溶性物質であるので、培養
物からジベレリンの単離、精製に当たっては、その特性
を利用して行なうことができる。即ち、酢酸エチル、ク
ロロホルム等による溶媒抽出法；シリカゲル、アルミナ
等によるカラムクロマトグラフィー；更にシリカゲルを
単体とした分取薄層クロマトグラフィー等が有効であ
る。

以上のような方法により、あるいはこれらを適宜組み
合わせることにより、前述の理化学的性質を有する高純
度のジベレリンが得られる。

尚、各精製行程に於けるジベレリンの検定に当たって
は、はくさいの種子を被験液の入ったシャーレ中で、25
℃４日間生育させた後、はくさいの胚軸の長さを測定
し、コントロールと比較した。

〔発明の効果〕

本発明のフェオスフェリア・エスピーＬ−487（Phaeo
sphaeria sp.L−487）は新規微生物であり、植物の成長
ホルモンとして有用なジベレリン類を産生する。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１培養水飴4.0％、大豆油0.3％、大豆粉2.0％、綿実粕1.0
％、サングレイン0.5％、CaCO₃0.3％、FeSO₄・7H₂O0.00
1％、CoCl₂・6H₂O0.0001％及び、NiCl₂・6H₂O0.0001％
を含有する種培地（pH6.0）を40mlずつ200mlの三角フラ
スコ10本に分注して、121℃ 20分間高圧滅菌した。

ついで、フェオスフェリア・エスピーＬ−487を１
白金耳ずつ植菌し、26℃で４日間210回転して振とう培
養し、種培養液を調製した。

別に、水飴2.0％、大豆油0.15％、大豆粉1.0％、綿実
粕0.5％、サングレイン0.25％、CaCO₃0.1％、FeSO₄・7H
₂O0.0005％、CoCl₂・6H₂O0.00005％及び、NiCl₂・6H₂O
0.00005％を含有する主醗酵培地（pH6.0）を調製し、そ
の80mlを500ml三角フラスコ100本に分注し、121℃に於
て20分間高圧滅菌した。

この主醗酵培地に前記種培養液を4mlずつ接種し、26
℃に於て５日間、210回転にて振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離して、培養上清と培養菌体を得た。

精製方法前記の培養濾液20リットルを酸性（pH＝3.0）に調整
後、酢酸エチル15リットルで抽出した。その酢酸エチル
層を減圧濃縮後、抽出物3.5gからベンゼン−アセトン
（10:1）可溶部を調製し、それを低圧液クロ〔CQ3シリ
カゲル〕にかけ、0.5％ギ酸を含むベンゼン−アセトン
（8:1）混合溶媒により分画したところ、強い活性区と
弱い活性区１つが見られた（第１図）。強い活性区のう
ち、初めに溶出されたものを活性区Ｉ（91mg）、後の方
を活性区II（141mg）とし、各々を低圧液クロ、分取TLC
を繰り返すことにより精製した。

その結果、活性区Ｉより活性物質１、無色柱状結晶3.
1mg（mp 198〜199℃、結晶溶媒：ヘキサン−酢酸エチ
ル）を、また、活性区IIより活性物質２、無色針状結晶
6.6mg（mp210〜211℃、結晶溶媒：ヘキサン−酢酸エチ
ル）を得た。

活性物質１及び２のNMR,MS,IRのスペクトルデータを
以下に示す。

〔活性物質１〕EI−MS ｍ／ｚ:316（M⁺）,298,272,229,
203,183,159,129,91,79.IRνmax（KBr）cm^-1:3100,294
0,2800〜2400,1770,1735,1653,880.¹ H−NMR（CDCl₃）δ:1.10（3H,S.）,2.47および2.71
（各1H,ABq.J＝11Hz）,4.83（1H,br.S.）,4.94（1H,br.
S.）〔活性物質２〕〔α〕_Ｄ−10゜（ｃ＝0.18,MeOH）,EI−
MSｍ／ｚ:332（M⁺）,314,296,286,270,256,242,241,21
4,203,183,157,105,91,79. IRνmax（KBr）cm^-1:3500,3360,2930,2700〜2400,1734,
1718,1653,870. 上記のNMR,MS,ISのスペクトルデータにより、前記活
性物質１及び２は、下記構造式（Ｉ）及び（II）に示し
たジベレリンA₉（GA₉）及びジベレリンA₄（GA₄）と同定
された（表１参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、フェオスフェリア・エスピーＬ−487培養
物の酢酸エチル抽出物を低圧液体クロマトグラフィーに
かけたときの溶出パターンを示す。横軸はフラクション
番号を示し、縦軸ははくさいの胚軸の長さ（mm）を示
す。第２図は、フェオスフェリア・エスピーＬ−487の形
態の概略図を示す。 A.子嚢果断面図宿主表皮下に埋没している子嚢果断面 B.殻壁の拡大図２〜３層の多角状細胞を示す C.未熟な子嚢二重壁構造を示す D.8胞子を含有した成熟した子嚢 E.子嚢先端の拡大図明瞭な二重壁構造 F.子嚢胞子３〜８個の隔壁で仕切られている状態、あるものはゼラ
チン鞘におおわれている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:645） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 1/14 C12P 7/42

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ジベレリン類産生能を有するフェオスフェ
リア・エスピーＬ−487（Phaeosphaeria sp.L−487）。
【請求項２】フェオスフェリア属に属するジベレリン類
生産菌を培養し、その培養物からジベレリン類を採取す
ることを特徴とするジベレリン類の製造方法。