CZ2000512A3 - Způsob mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu - Google Patents

Abstract

Způsob mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2- chinoxalinkarboxylovou kyselinu zahrnuje uvádění 2- methylchinoxalinu do styku s mikroorganismem nebo jeho vhodným mutantem a inkubaci vzniklé směsi za podmínek, které jsou dostatečné pro získání 2-chinoxalinkarboxyIové kyseliny. Způsob výhodně zahrnuje izolaci a čištění 2- chinoxalinkarboxylové kyseliny

Description

Způsob mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu

Oblast techniky

Vynález se týká nových způsobů výroby 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, zejména mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu.

Dosavadní stav techniky

Způsoby mikrobiální oxidace určitých aromatických heterocyklů, a zejména mikrobiální oxidace methylskupin na některých aromatických heterocyklech, jsou známy z dosavadního stavu techniky. Tyto způsoby jsou například popsány v následujících dvou článcích: Gene Order of the TOL Catabolic Plasmid Upper Pathway Operon and Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol by the xy/A Product, S. Harayama et al., J. Bacteriol., 167(2): 455 až 461 (1986) and Enzymatic Oxidation of Methyl Groups on Aromatic Heterocycles:

A Versatile Method for the Preparation of Heteroaromatic Carboxylic Acids, A. Keiner, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 31(6): 774 až 775 (1992).

V US patentu č. 4 859 592 je popsán mikrobiální způsob výroby pikolinové kyseliny, kterou je následně možno chemickými způsoby převést na pyridinové produkty.

V US patentech č. 5 104 798, 5 213 973 a 5 236 832 je popsán mikrobiální způsob oxidace methylskupin v určitých aromatických heterocyklech s pěti- nebo šestičlenným kruhem na odpovídající karboxylové kyseliny, který provádí bakterie druhu Pseudomonas, která jako induktoru využívá toluenu, • · · · ·

xylenu nebo cymenu. Podle této publikace, je z dosavadního stavu techniky známo, že oxidace methylskupiny toluenu za vzniku benzoové kyseliny kmenem Pseudomonas putida ATCC č. 33015 zahrnuje tři stupně: první stupeň katalyzovaný toluen monooxygenasou, druhý stupeň katalyzovaný alkohol dehydrogenasou a třetí stupeň katalyzovaný aldehyd dehydrogenasou.

Jak bylo popsáno dříve, viz výše uvedený článek Harayama et al., TOL plasmid pWWO P. putida mt-2 je transmitovatelný extrachromosomální element, který kóduje všechny enzymy, které jsou potřebné pro oxidační katabolismus několika aromatických uhlovodíků, jako je toluen, m-xylen a p-xylen. Bakterie nesoucí TOL plasmidy, naříklad P. putida ATCC č. 33015, mohou převádět určité aromatické uhlovodíky na jim odpovídající aromatické karboxylové kyseliny: jak xyl operon, který kóduje enzymy degradace xylenu, tak geny, které jsou odpovědné za regulaci xyl genu, leží na TOL plasmidu pWWO. Aby geny na TOL plasmidu pWWO, které kódují enzymy potřebné pro výše uvedené oxidační procesy, takové enzymy produkovaly, musí být indukovány. Popis takové indukce je uveden ve výše citovaných US patentech č.

104 798, 5 213 973 a 5 236 832.

Jak se uvádí v článku Gaucher et al., Dev. Ind. Microbiol., 22: 219 až 232 (1981), houba Penicillium griseofulvum obsahuje tři enzymy pro konverzi m-kresolu na m-hydroxybenzoovou kyselinu: m-kresol methyl hydroxylasu, m-hydroxybenzyl alkohol dehydrogenasu a m-hydroxybenzaldehyd hydroxylasu.

Podle dosavadního stavu techniky tedy některé houby a bakterie obsahují enzymy pro oxidaci methylskupin na určitých aromatických kruzích na jim odpovídající karboxylové kyseliny. Je sice známo, že methylskupiny na takových heteroaromatických kruzích je možno oxidovat na jim odpoví• · ♦ ·

4 · · 4 · » · · • · · ·

4 4 »444 44

44 • · · · • 4 4 ·

4 4 4 4

4 4 4 ·· 44 dající karboxylové kyseliny za použití mikroorganismů (čehož si je odborník v tomto oboru vědom), avšak chemické a optické výtěžky takových mikrobiálních oxidací obvykle podstatně kolísají, například v závislosti na konkrétně zvoleném mikroorganismu, koncentraci substrátu, struktuře substrátu apod.

Nyní bylo zjištěno, že určitá skupina mikroorganismů, jako jsou houby a bakterie, v podstatné míře oxidují 2-methylchinoxalin na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu.

Kromě toho způsob podle vynálezu umožňuje vhodnou izolaci 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny.

V US prozatímní patentové přihlášce č. 60/073 801 (přihláška 801), podané 5. února 1998, nyní mezinárodní PCT přihlášce č. PCT/IB99/00067, podané 18. ledna 1999, je popsáno použití 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny jako meziproduktu při syntéze nových dihydroxyhexanových kyselin, které jsou užitečné pro léčení například zánětů a jiných imunitních poruch. 2-Chinoxalinkarboxylovou kyselinu získanou novými způsoby podle tohoto vynálezu, je možno použít pro syntézu takových dihydroxyhexanových kyselin.

Všechny výše a dále citované publikace jsou zde uváděny náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je mikrobiologický způsob výroby 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny z 2-methylchinoxalinu.

Konkrétně je předmětem vynálezu mikrobiologický způsob výroby sloučeniny vzorce I

00 • « « · • 0 · ·

0 0 0 ·

0 0 0

0 0· _N COOH (i) jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina vzorce II

N.^^CH3 (II) uvede do styku s mikroorganismem schopným provést oxidaci methylskupiny ve sloučenině vzorce II na karboxyskupinu sloučeniny vzorce I a vzniklá směs se za vhodných podmínek inkubuje za vzniku sloučeniny vzorce I.

Předmětem vynálezu je tedy způsob provádění mikrobiální oxidace sloučeniny vzorce II, 2-methylchinoxalinu, při němž se sloučenina vzorce II uvede do styku s mikroorganismem nebo jeho mutantem, který je známý nebo ho může získat odborník v příslušném oboru a který je přes tuto mutaci schopen provést uvedenou oxidaci (dále jeho vhodný mutant); a vzniklá směs se inkubuje za podmínek, které jsou dostatečné pro získání sloučeniny vzorce I, 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny;

přičemž mikroorganismus je zvolen ze souboru sestávajícího z Absidia glauca ATCC č. 22752, Absidia glauca ATCC č. 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC č. 24169, Absidia • · « · • » · · · ·

repens ATCC č. 14849, Apsidia repens ATCC č. 74481, Actinomucor elegans ATCC č. 6476, Alternaria solani ATCC č. 11078, Aspergillus tamarii ATCC č. 16865, Coniophora puteana ATCC č. 12675, Cunninghamella echinulata ATCC č. 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC č. 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC č. 8983, Cunninghamella echinulata ATCC č. 9244, Cunninghamella echinulata ATCC č. 9245, Cunninghamella echinulata ATCC č. 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC č. 26269, Cunninghamella echinulata ATCC č. 36190, Cunninghamella echinulata ATCC č. 36112, Cunninghamella homothallica ATCC č. 16161, Cylindrocarpon destructans ATCC č. 66963, Diplodia gossypina ATCC č. 20575, Epicoccum neglectum ATCC č. 12723, Glomerella lagenaria ATCC č. 14724, Penicillium claviforme ATCC č. 10426, Penicillium duclauxii ATCC č. 10440, Penicillium glabrum ATCC č. 11080, Pseudocochliobolus lunatus ATCC č. 24155, Pseudomonas putida ATCC č. 33015, Pseudomonas putida ATCC č. 202190, Rhodococcus rhodochrous ATCC č. 19067 a Thamnostylům piriformě ATCC č. 8686; a jejich vhodných mutantů; přičemž když je takovým mikroorganismem Pseudomonas putida ATCC č. 33015 nebo Pseudomonas putida ATCC č. 202190, je tento mikroorganismus před uvedením do styku s 2-methylchinoxalinem indukován interakcí s induktorem.

Způsoby podle vynálezu popřípadě dále zahrnují izolaci požadovaného produktu, 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, jakýmkoliv vhodným způsobem. Tak je například reakční směs možno extrahovat organickým rozpouštědlem, přednostně ethylacetátem a poté lze extrahovanou látku chromátografovát. Alternativně se 2-chinoxalinkarboxylová kyselina z reakční směsi naadsorbuje na pryskyřici, přednostně polymerní adsorpční pryskyřici, z níž se eluuje za použití organického rozpouštědla, přednostně ethylacetátu, a z eluované látky se izoluje vykrystalováním za použití organického rozpouštědla nebo kombinace organických • · · · rozpouštědel, přednostně ethylacetátu a methanolu.

2-Chinoxalinkarboxylovou kyselinu získanou způsoby podle vynálezu je dále možno nechat reagovat s vhodnou bázi, například hydroxidem sodným, což vede ke vzniku soli, například sodné soli, 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny. Alkalickou sůl 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny lze poté izolovat z média pro biokonverzi tak, že se z média filtrací nebo centrifugací odstraní buňky a médium zbavené buněk se následně zkoncentruje, například odpařením.

Mikroorganismem pro účely tohoto vynálezu je přednostně intaktní mikroorganismus.

V přednostním provedení tohoto vynálezu je mikroorganismem houba.

V přednostním provedení tohoto vynálezu, je mikroorganismem houba, přičemž tato houba je zvolena ze souboru sestávajícího z rodů Absidia, Aspergillus, Alternaria, Pěnicillium, Diplodia a Cunninghamella.

Ve zvláště přednostním provedení tohoto vynálezu, podle něhož je mikroorganismem houba, je touto houbou houba rodu Absidia. V ještě výhodnějším provedení podle něhož je mikroorganismem houba rodu Absidia, je mikroorganismem A. glauca ATCC č. 22752 nebo A. glauca ATCC č. 74480 nebo jejich vhodný mutant nebo jakékoliv depozitum A. glauca ATCC č. 22752, které je v souladu s Budapešťskou smlouvou, nebo jeho vhodný mutant.

V jiném zvláště přednostním provedení tohoto vynálezu, podle něhož je mikroorganismem rodu Absidia, je touto houbou A. repens ATCC č. 14849 nebo A. repens ATCC 74481 nebo jejich vhodný mutant nebo jakékoliv depozitum A. repens ·* · • 4 ♦ ·

ATCC č. 14849, které je v souladu s Budapešťskou smlouvou, nebo jeho vhodný mutant.

Koncentrace buněk pro fungální kultury podle vynálezu je přednostně asi 10 až asi 30 g sušiny buněk/litr.

Podle jiného přednostního provedení tohoto vynálezu je mikroorganismem bakterie.

V přednostním provedení, podle kterého je mikroorganismem bakterie, je tato bakterie zvolena ze souboru sestávajícího z rodů Pseudomonas a Rhodococcus.

Ve zvláště přednostním provedení tohoto vynálezu je mikroorganismem bakterie, kterou je bakterie rodu Pseudomonas.

V ještě výhodnějším provedení tohoto vynálezu je mikroorganismem bakterie rodu Pseudomonas, kterou je P. putida ATCC 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190 nebo jejich vhodný mutant nebo dále jakékoliv depozitum P. putida ATCC 33015, které je v souladu s Budapešťskou smlouvou, nebo jeho vhodný mutant.

Koncentrace buněk pro bakteriální kultury podle vyná lezu je přednostně koncentrace, která při 650 nm vykazuje optickou hustotu asi 10 až asi 30.

Jak již bylo uvedeno výše, při provedeních vynálezu, kdy je mikroorganismem P. putida ATCC č. 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190 nebo jejich vhodný mutant, je mikroorganismus nebo jeho vhodný mutant před nebo v průběhu uvádění do styku se sloučeninou indukován. Přednost se dává provedení, kdy je mikroorganismus uváděn do styku se sloučeninou po dokončení jeho indukce. Jako přednostní induktory φ · · φφφφ *· *· · je možno uvést p-xylen a m-xylen. Zvláštní přednost se dává p-xylenu.

Podle přednostního provedení tohoto vynálezu se v případě, že je mikroorganismem P. putida ATCC č. 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190 nebo jejich vhodný mutant, se mikroorganismus pěstuje v nádobě s růstovým médiem, k tomuto růstovému médiu se před uvedením mikroorganismu do styku s 2-methylchinoxalinem přidá induktor a mikroorganismus se ve tomto růstovém médiu inkubuje po dobu dostatečnou pro řádné dokončení indukce. Buňky indukovaného mikroorganismu se shromáždí tak, že se obsah nádoby centrifuguje, a odstraní se, například dekantuje, vyčerpané růstové médium (a tedy i uvedený induktor). Buněčná peleta se omyje a resuspenduje ve vodném médiu, jako DPBS (Biowhittaker), a poté se tento mikroorganismus uvede do styku s 2-methylchinoxalinem.

Podle jiného přednostního provedení tohoto vynálezu se v případě, že je mikroorganismem P. putida ATCC č. 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190 nebo jejich vhodný mutant, se uvedený mikroorganismus pěstuje v růstovém médiu ve fermentoru, přičemž k růstovému médiu se před uvedením mikroorganismu do styku s 2-methylchinoxalinem, nepřetržitě nebo plynule přidává induktor, a inkubuje v tomto růstovém médiu po dobu dostatečnou pro řádné dokončení indukce, poté se tento proces přeruší a mikroorganismus se uvede do styku s 2-methylchinoxalinem.

Podle jiného přednostního provedení tohoto vynálezu se v případě, že mikroorganismem je houba, mikroorganismus uvede do styku s 2-methylchinoxalinem tak, že se 2-methylchinoxalin přidá k růstovému médiu, které obsahuje uvedený mikroorganismus. Mikroorganismus se uvádí do styku s 2-methylchinoxalinem s výhodou tak, že se 2-methylchinoxalin

9 9 9-9 9 • ·· · ·· : * • ·

9

9 přidá k růstovému médiu, které obsahuje příslušnou houbu, přičemž tímto růstovým médiem je médium obsahující sušinu kukuřičného extraktu. Takové médium zvláště přednostně obsahuje od asi 20 g do asi 40 g/litr sušiny kukuřičného extraktu a asi 20 g/litr dextrosy a jeho hodnota pH je asi 4,85. Jiné přednostní růstové médium obsahuje asi 20 g/litr Pharmamedia(^R) (Traders Protein) a asi 20 g/litr dextrosy a jeho pH je asi 7,2.

Podle jiného přednostního provedení tohoto vynálezu se mikroorganismus uvádí do styku se sloučeninou vzorce II adsorbovanou na pryskyřici (viz například článek J. T. Vincenzi et al., Large-scale stereoselective enzymatic ketone reduction with in šitu product removal via polymeric adsorbent resins, Enzyme and Microbial Technology, 20: 494 až 499 (1997)) .

Podle ještě dalšího přednostního provedení tohoto vynálezu se mikroorganismus uvádí do styku se sloučeninou vzorce II tak, že se 2-methylchinoxalin přidá k vodnému médiu, které obsahuje promyté buňky mikroorganismu.

Podle ještě dalšího přednostního provedení tohoto vynálezu se mikroorganismus předtím, než se uvede do styku s 2-methylchinoxalinem, promyje. Při tomto přednostním postupu se promytý mikroorganismus předtím, než se uvede do styku s 2-methylchinoxalinem, imobilizuje.

Podle jiného přednostního provedení tohoto vynálezu se mikroorganismus pěstuje v médiu obsahujícím sušinu kukuřičného extraktu po dobu asi 24 až asi 72 hodin, načež se uvede do styku s 2-methylchinoxalinem tak, že se tato sloučenina přidá do směsi vzniklé výše popsaným způsobem.

Způsoby podle vynálezu popřípadě dále zahrnují izolaci nebo separaci 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, která se provádí například extrakcí organickým rozpouštědlem, adsorpci na pryskyřici, krystalizaci nebo v případě že se získá sůl 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny s alkalickým kovem tak, že se médium zbavené buněk zkoncentruje odpařením, apod.

Dále je předmětem vynálezu použití 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny při syntéze nových dihydroxyhexanových kyselin popsaných ve výše citované přihlášce 801 podle kteréhokoliv ze způsobů popsaného v přihlášce 801 nebo za použití jakýchkoliv jiných způsobů takové syntézy.

Pojmům, kterých se používá pro objasnění tohoto vynálezu, odborník v tomto oboru snadno porozumí; takové pojmy jsou nicméně vysvětleny v bezprostředně následujícím textu.

Pod pojmem intaktní mikroorganismus se rozumí, že buňky mikroorganismu v podstatě vykazují svou inherentní (a/nebo indukovanou, pokud to přichází v úvahu) mechanickou, fyzikální a biochemickou integritu.

Pod pojmem mikrobiální oxidace se rozumí oxidace podle vynálezu prováděná intaktním mikroorganismem nebo jakýmkoliv jeho přípravkem apod.

Do rozsahu pojmu mikroorganismus spadá jakýkoliv intaktní mikroorganismus nebo přípravek, který je od něj odvozen, například mikroorganismus, který je podle konkrétního případu promytím zbavený například fermentačního média, růstového média, kultivační půdy apod., a mikroorganismus imobilizovaný například na sloupci, připojený k perlám apod.

4 4 4 • » • ·

4 ·

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Pokud není uvedeno jinak, mají zkratky v tomto textu a připojených patentových nárocích dále uvedené významy,

ACN - acetonitril,

DMSO - dimethylsulfoxid,

DPBS - Dulbeccův fosfátem pufrovaný solný roztok,

EtOAc - ethylacetát,

EtOH - ethanol,

HPLC - vysoceúčinná kapalinová chromatografie

MeOH - methanol

PBS - fosfátem pufrovaný solný roztok

TFA - trifluoroctová kyselina

Dále jsou uvedena sídla firem uváděných v tomto textu:

American National Can^^R^ - Menasha, Wisconsin, USA

Becton Dickinson^¹*) Labware - Franklin Lakes, New Jersey,

USA

Becton Dickinson^^R^ - Microbiology Systems, Sparks,

Maryland, USA

Biowhittaker(^R) - Walkersville, Maryland, USA

Column Engineering(^R) lne. - Ontario, California, USA IEc(^r) Centrifuge - Needham Heights, Massachusetts,

USA

Rohm and Haas^^R^ - Philadelphia, Pennsylvania, USA a

Traders Protein(^R) - Memphis, Tennessee, USA.

ATCC je sbírka mikroorganismů American Type Culture Collection, 10801, University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, USA. V následující tabulce 1 je uveden seznam mikroorganismů uváděných v tomto popisu a jejich deponentů (viz www.ATCC.com).

0« 0000 • 0

- 12 · ♦ 0

0 0 0

0 0 »« f · 0 0 *00 *0 ·

Tabulka 1

Fungální kultura ATCC č.	Deponent
Absidia glauca, 22752	NRRL1
Absidia glauca, 74480	Pfizer lne.2
Absidia pseudocylindrospora, 24169	NRRL
Absidia repens, 14849	NRRL
Absidia repens, 74481	Pfizer lne.3
Actinomucor elegans, 6476	J.A. Stevenson
Aiternaria solani, 11078	P.W. Brian
Aspergillus tamarii, 16865	K.B. Raper, D.l. Fennell
Coniophora puteana, 12675	F.F. Lombard
Cunninghamella echinulata, 8688a	NRRL
Cunninghamella echinulata, 8688b	NRRL
Cunninghamella echinulata, 8983	V.M. Cutter, Jr.
Cunninghamella echinulata, 9244	V.M. Cutter, Jr.
Cunninghamella echinulata, 9245	V.M. Cutter, Jr.
Cunninghamella echinulata, 10028b	NRRL
Cunninghamella echinulata, 26269	J.J. Perry
Cunninghamella echinulata, 36190	NRRL
Cunninghamella echinulata, 36112	J.J. Perry
Cunninghamella homothallica, 16161	I FO-Institute for Fermentation
Cylindrocarpon destructans, 66963	G.J. Samuels
Diplodia gossypina, 20575	Hoffman-La Roche Ltd.
Epicoccum neglectum, 12723	Pfizer, lne.
Glomerella lagenaria, 14724	Sanraku-Ocean Co., Ltd.
Penicillium claviforme, 10426	NRRL
Penicillium duclauxii, 10440	NRRL
Penicillium glabrum, 11080	P.W. Brian
Pseudocochliobolus lunatus, 24155	R.S. Byther
Thamnostylum piriforme, 8686	NRRL
Bakteriální kultura ATCC č.	Deponent
Pseudomonas putida, 33015	P.A. Williams
Pseudomonas putida, 202190	Pfizer lne4
R. rhodochrous, 19067	J.W. Foster

NRRL = Northern Regional Research Laboratories (Peoria,

Illinois, USA) ² A. glauca 22752 - uložena v souladu s Budapešťskou smlouvou

13. ledna 1999 ³ A. repens 14849 - uložena v souladu s Budapešťskou smlouvou

13. ledna 1999

P. putida 33015 - uložena v souladu s Budapešťskou smlouvou

13. ledna 1999

- 13 44 4*·» • 4 9 • * • 4 • ♦ * «449 4·

2 « 4 · * • 1 4 4 4 4 4 • 9 4 4 4 ·

444 444 ·4 44

Jak již bylo uvedeno výše, vynález se týká mikrobiologického způsobu výroby sloučeniny vzorce I

tyCOOH

N (i)

jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina vzorce II _(II)

NT uvede do styku s mikroorganismem schopným provést oxidaci methylskupiny sloučeniny vzorce II, 2-methylchinoxalinu, na karboxyskupinu sloučeniny vzorce I, 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, a vzniklá směs se inkubuje za vhodných podmínek, čímž se získá 2-chinoxalinkarboxylová kyselina.

Způsob podle vynálezu se provádí snadno. Mikroorganismus se kultivuje, pokud je to nezbytné s indukcí, například pokud je mikroorganismem P. putida ATCC č. 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190 nebo jejich vhodný mutant, a poté uvede do styku s 2-methylchinoxalinem za účelem oxidace methylskupiny 2-methylchinoxalinu na skupinu -COOH 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny. 2-Chinoxalinkarboxylovou kyselinu je poté například možno nechat reagovat dále způsoby popsanými ve výše uvedené přihlášce 801, čímž se na závěr získají nové dihydroxyhexanové kyseliny, které jsou v přihlášce 801 popsány jako sloučeniny užitečné pro léčení zánětů a jiných imunitních poruch. Účinnost, způsoby zkoušení účinnosti, dávkování, dávkovači formy, způsoby podávání «« 9999 a základní informace, které se vztahují k těmto novým dihydroxyhexanovým kyselinám jsou uvedeny v přihlášce 801.

Jak již bylo uvedeno výše, je při způsobech podle vynálezu možno použít jakéhokoliv vhodného mikroorganismu nebo jeho vhodného mutantu. Jak bude odborníku v tomto oboru ve světle tohoto popisu zřejmé, podmínky pro provádění způsobu podle vynálezu jsou závislé například na typu mikroorganismu a jeho konkrétním přípravku. Například pH, teplota, koncentrace složek apod. fermentačního média a organického rozpouštědla, jakož i koncentrace 2-methylchinoxalinu a induktor (pokud se ho používá) se zvolí tak, aby se dosáhlo konkrétně požadovaného výsledku za použití zvoleného mikroorganismu.

Jako příklady přednostních hub je možno uvést houby rodu Absidia, Actinomucor, Alternaria, Aspergillus, Coniophora, Cunninghamella, Cylindrocarpon, Diplodia, Epicoccum, Fusarium, Glomerella, Penicillium, Pseudocochliobolus, Thamnostylum a Verticillium, jejichž druhy nejsou zvlášt omezeny, přičemž však tyto mikroorganismy nebo jejich mutanti musí být schopni provést uvedenou oxidaci.

Houby, kterým se dává zvláštní přednost, náleží do rodu Absidia, Alternaria, Aspergillus, Cunninghamella, Diplodia a Penicillium.

Ještě větší přednost se dává houbám rodu Absidia.

Jako příklad zvláště přednostních hub je možno uvést A. glauca ATCC č. 22752, A. glauca ATCC č. 74480, A. pseudocylindrospora ATCC č. 24169, A. repens ATCC č. 14849, A. repens ATCC č. 74481, A. elegans ATCC č. 6476, A. solani ATCC č. 11078, A. tamarii ATCC č. 16865, C. puteana ATCC č. 12675, C. echinulata ATCC č. 8688a, C. echinulata ATCC č.

«44 4

4

4«

8688b, C. echinulata ATCC č. 8983, C. echinulata ATCC č. 9244, C. echinulata ATCC č. 9245, C. echinulata ATCC č. 10028b, C. echinulata ATCC č. 26269, C. echinulata ATCC č. 36190, C. echinulata ATCC č. 36112, C. homothallica ATCC č. 16161, C. destructans ATCC č. 66963, D. gossypina ATCC č. 20575, E. neglectum ATCC č. 12723, G. lagenaria ATCC č. 14724, P. claviforme ATCC č. 10426, P. duclauxii ATCC č. 10440, P. glabrum ATCC č. 11080, P. lunatus ATCC č. 24155 a T. piriformě ATCC č. 8686; a jejich vhodné mutanty.

Větší přednost se dává A. glauca ATCC č. 22752, A. glauca ATCC č. 74480, A. repens ATCC č. 14849, A. repens ATCC č. 74481, A. solani ATCC Č. 11078, A. tamarii ATCC č. 16865, C. echinulata ATCC č. 8983, D. gossypina ATCC č.

20575 a P. glabrum ATCC č. 11080; a jejich vhodným mutantům.

Přednost se dává zejména A. glauca ATCC č. 22752,

A. glauca ATCC č. 74480, A. repens ATCC č. 14849, A. repens ATCC č. 74481; a jejich vhodným mutantům.

Zvláštní přednost se dává A. repens ATCC č. 14849, A. repens ATCC č. 74481; a jejich vhodným mutantům.

Jako příklady přednostních bakterií je možno uvést bakterie, které náleží do rodu Bacillus, Brevibacterium, Micrococcus, Pseudomonas a Rhodococcus, jejichž druhy nejsou konkrétně omezeny, přičemž však tyto mikroorganismy nebo jejich mutanti musí být schopni provést uvedenou oxidaci.

Větší přednost se dává bakteriím rodu Pseudomonas a Rhodococcus.

Zvláštní přednost se dává bakteriím rodu

Pseudomonas.

- 16 999 9

999

9 9

9 9 9

9 9 « «· ··

Přednostními bakteriemi jsou zejména P. putida ATCC č. 33015, P. putida ATCC Č. 202190 a R. rhodochrous ATCC č.; a jejich vhodné mutanty.

Ještě větší přednost se dává bakteriím P. putida NiCC 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190; a jejich vhodným mutantům.

Jak již bylo uvedeno výše, tento vynález zahrnuje použití jakýchkoliv vhodných mutantů jakéhokoliv vhodného mikroorganismu. Kromě toho je při způsobu podle vynálezu možno použít skupiny mutantů, které vykazují výhodnější vlastnosti, například schopnost oxidovat větší množství substrátu ve srovnání s rodičovským kmenem, přičemž tyto nové kmeny mohou být získány za použití známých postupů, jako například postupy standardní mutagenese a selekčními technikami nebo rekombinantními postupy, které například zahrnují místně cílenou mutagenesi.

Postupy standardní mutagenese zahrnují chemickou mutagenesi za použití N-methyl-N'-nitrosoguanidinu (Delic et al., 1970, Mutat. Res. 9: 167), kyseliny dusité (Crueger a Crueger, 1984, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, str. 16, Sinauer Associates, lne., Sunderland, MA, USA) a ozáření ultrafialovým světlem (Thrum, 1984, Biotechnology of Industrial Antibiotics, Vandamme ed.,

Marcel Dekker, New York, str. 373 až 374).

Jako příklady selekčních technik je možno uvést jednoduchou reizolaci kmene selekcí izolované kolonie, selekci kolonie se specifickou morfologií a selekci na resistenci vůči analogům nebo složkám, o nichž je známo nebo o nichž se má za to, že patří do biosyntetické dráhy sloučeniny vzorce I (Crueger a Crueger, 1984, Biotechnology:

4 •

···«

44 4 •

♦ 4

4

4

444

4<

♦ ·

4 4 4 *4

44

A Textbook of Industrial Microbiology, str. 24 a 25, Sinauer Associates, lne., Sunderland, MA, USA).

Těchto nových kmenů se používá při způsobech podle vynálezu, protože například vykazují zlepšené vlastnosti vzhledem ke svým rodičovským kmenům, například produkují větší množství 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny; vykazují méně nežádoucí vlastní degradační aktivity na 2-methylchinoxalin a/nebo 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu a/nebo meziprodukty, které mohou vznikat při způsobu podle vynálezu v závislosti například na zvoleném konkrétním mikroorganismu. Kromě toho, pokud se použije mutantu, jehož použití vede k získání většího množství 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, je pro vznik daného množství 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny způsobem podle vynálezu potřebný menší objem pěstované kultury, což vede k podstatným snížením nákladů.

Jak již bylo uvedeno výše, je při způsobech podle vynálezu možno použít jakéhokoliv vhodného přípravku mikroorganismu, jako je například mikroorganismus v růstovém médiu, mikroorganismus promytím zbavený například fermentačního média, kultivační půdy apod., nebo mikroorganismus imobilizovaný například na sloupci, na perlách apod.

Na základě tohoto popisu bude odborník v tomto oboru schopen připravit vhodné imobilizované intaktní mikroorganismy, například způsobem popsaným v článku A. Bauer et al., Polyvinyl alcohol-immobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitriles, Biotechnology Letters, 18(3): 343 až 348 (1996).

Přednostními intaktními mikroorganismy jsou mikroorganismy, které v podstatné míře oxidují 2-methylchinoxalin za vzniku produktu, konkrétně 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, zatímco tento produkt ponechávají v podstatě «« »·«· • 9

9 · • 9 9»

9 9 9 «999 99 999 · • «9 « • 9 9 ♦ ·9 9

9 9 9

9« nezměněný, tj. bez vnitřní aktivity, jež může degradovat nebo jinak negativně ovlivnit požadovaný produkt ve kterémkoliv stupni způsobu podle vynálezu.

Mikroorganismy, které jsou vhodné pro mikrobiální oxidaci podle vynálezu, je možno připravovat jakýmkoliv vhodným způsobem, jenž je znám odborníkům v tomto oboru. Příklad vhodného způsobu přípravy mikroorganismu z obchodně dostupného produktu je uveden dále. Na základě tohoto popisu a způsobů, které jsou popsány dále, bude odborníku v tomto oboru zřejmé jak modifikovat kteroukoliv část těchto postupů, jako je například způsob přípravy mikroorganismu, volného nebo imobilizovaného; způsob uvedení 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny do styku s mikroorganismem; složky růstového média a podmínky, například teplota, pH apod.; koncentrace 2-methylchinoxalinu, koncentrace induktoru (pokud se ho používá); nebo podmínky inkubace; aby se dosáhlo požadovaných výsledků za použití jakéhokoliv vhodného mikroorganismu.

V provedeních vynálezu, kde je mikroorganismem houba, je koncentrace 2-methylchinoxalinu přednostně v rozmezí od asi 0,01 g/litr do asi 2,5 g/litr, zvláště přednostně v rozmezí od asi 0,1 g/litr do asi 2,0 g/litr. V provedeních vynálezu, kde je mikroorganismem houba zvolená ze souboru sestávajícího z A. repens ATCC č. 14849, A. repens ATCC č. 74481, A. glauca ATCC č. 22752, A. glauca ATCC č. 74480 a jejich vhodných mutantů, je koncentrace 2-methylchinoxalinu přednostně v rozmezí od asi 0,1 g/litr do asi 2,0 g/litr.

V provedeních vynálezu, kde je mikroorganismem bakterie, je koncentrace 2-methylchinoxalinu přednostně v rozmezí od asi 0,01 g/litr do asi 1,5 g/litr, zvláště přednostně v rozmezí od asi 0,1 g/litr do asi 1,0 g/litr.

V provedeních vynálezu, kde je bakterie zvolena ze souboru

- 19 «0 » 0 0

0 ♦ 0 0 » 0 0 <

► 0 0 I » 0 0 4 » 0 0 4 ««

33015, P. putida ATCC č. je koncentrace 2-methylsestávajícího z P. putida ATCC č.

202190 a jejich vhodných mutantů, chinoxalinu přednostně v rozmezí od asi 0,1 g/litr do asi 1,0 g/litr.

Kromě toho, jak již bylo uvedené výše, bakterie, které nesou plasmid TOL, například P. putida ATCC č. 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190, je pro oxidaci podle vynálezu, nutno indukovat. V provedeních podle tohoto vynálezu, při nichž se P. putida ATCC č. 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190 kultivuje v médiu ve fermentoru, se induktor, přednostně p-xylen, přidává přednostně rychlostí od asi 4,5 mmol/litr/h do asi 6,5 mmol/litr/h, zvláště přednostně od asi 4,9 mmol/litr/h do asi 6,1 mmol/litr/h.

V provedeních tohoto vynálezu, podle nichž P. putida ATCC č. 33015 nebo P. putida ATCC č. 202190 jsou v médiu v nádobě, se induktor, přednostně p-xylen, přidává k médiu průběžné ve formě plynu. Odborníku v tomto oboru bude na základě tohoto popisu a výše citovaných článků a patentů (například US patentu č. 5 236 832) zřejmé, že koncentrace induktoru se obvykle volí tak, aby byla nižší než minimální inhibiční koncentrace vzhledem k enzymu odpovědnému za oxidaci. Viz také Claus a Walker, J. Gen. Microbiol., 36:

107 až 122 (1964).

Při provádění tohoto vynálezu je možno substrát, 2-methylchinoxalin, uvádět do styku s mikroorganismem jakýmkoliv vhodným způsobem. Substrát je možno uvádět do styku s mikroorganismem v jakémkoliv vhodném pořadí. Tak je například 2-methylchinoxalin možno přidat k médiu, jako kultivační půdě, které obsahuje mikroorganismus, ať už volný nebo imobilizovaný, nebo kteroukoliv jejich kombinaci; nebo médium může obsahovat 2-methylchinoxalin, a mikroorganismus lze přidat k takovému médiu následně; nebo se 2-methylchinoxalin a mikroorganismus mohou k takovému médiu přidat společně; nebo se 2-methylchinoxalin může přidat k vhodnému rozpouštědlu obsahujícímu mikroorganismus nebo se naopak mikroorganismus může přidat k vhodnému rozpouštědlu obsahujícímu 2-methylchinoxalin; nebo 2-methylchinoxalin může být adsorbován na pryskyřici apod. Tento popis poskytne odborníku v tomto oboru vodítko jakým způsobem modifikovat kteroukoliv část způsobu podle vynálezu tak, aby se dosáhlo požadovaného záměru.

Jak již bylo uvedeno výše, přednostním mikroorganismem pro účely tohoto vynálezu je A. glauca ATCC 22752. Lyofilizovaný vzorek A. glauca ATCC č. 22752 byl uložen ve sbírce ATCC 13. ledna 1999 za podmínek Budapešťské smlouvy. Této nově uložené kultuře bylo přiděleno nové přírůstkové číslo ATCC 74480. Mikroorganismu A. glauca ATCC č. 74480 se tedy také dává přednost. Veškerá omezení veřejné dostupnosti této kultury mikroorganismu budou odstraněna po udělení patentu na vynález popsaný v tomto textu.

Jak již bylo uvedeno výše, přednostním mikroorganismem pro účely tohoto vynálezu je A. repens ATCC 14849. Lyofilizovaný vzorek A. repens ATCC č. 14849 byl uložen ve sbírce ATCC 13. ledna 1999 za podmínek Budapešťské smlouvy. Této nově uložené kultuře bylo přiděleno nové přírůstkové číslo ATCC 74481. Mikroorganismu A. repens ATCC č. 74481 se tedy také dává přednost. Veškerá omezení veřejné dostupnosti této kultury mikroorganismu budou odstraněna po udělení patentu na vynález popsaný v tomto textu.

Kultury houby A. repens ATCC 14849 nebo A. repens ATCC č. 74481, A. glauca ATCC č. 22752 nebo A. glauca ATCC č. 74480 lze získat ze sbírky ATCC. Příklad vhodného způsobu přípravy z takového dostupného zásobního zdroje je uveden bezprostředně dále. Zásobní kultury je možno připravit z • 4 «4 «··*

4 4 • · * * • · ·

9999 99 • 44

9 9 · • 4 4 4

4 4 4 • 4 4 4

4 ·» kultur na rýži například takto: Erlenmeyerovy baňky (250 ml) obsahující asi 50 g neloupané rýže a asi 20 ml destilované vody se asi 30 minut zahřívají v autoklávu při asi 121°C. Suspenze vegetativních buněk nebo spor A. repens ATCC 14849 nebo A. repens ATCC č. 74481, A. glauca ATCC č. 22752 nebo A. glauca ATCC č. 74480 se připraví tak, že se alikvot kapalné kultury nebo stěr z kultur na šikmém agaru přidá ke sterilní destilované vodě. Každá baňka s rýží se zaočkuje asi 5 ml suspenze spor nebo buněk a inkubuje asi 10 dní při asi 28°C. Poté se připraví zásobní suspenze spor tak, že se kultura na rýži promyje asi 0,5% roztokem Tween 80 v destilované vodě, suspenze spor se slije z rýže a přidá se k ní asi 10 až asi 20% glycerol. Zásobní suspenze spor se skladuje při asi -70°C.

Odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že pro všechny zvolené houby je vhodný způsob přípravy (jehož specifická provedení jsou uvedena v příkladech pro přednostní mikroorganismy A. glauca ATCC č. 22752 nebo ATCC č. 74480 a zvláště přednostní mikroorganismy A. repens ATCC č. 14849 nebo ATCC č. 74481), který je možno popsat takto: Fungálním inokulem ze zmrazené zásobní kultury vegetativních buněk nebo spor, jako je zásobní kultura uvedená výše, se zaočkuje růstové médium (obsahující alikvot sterilního roztoku s obsahem Tween 80, glycerolu a destilované vody), jehož složení je přesněji popsáno dále, v baňce nebo skleněné zkumavce s kovovým uzávěrem. Fermentace se provádí při teplotách od asi 22 do asi 32°C, přednostně při teplotě asi 29°C, za vhodného třepáni, přednostně s frekvencí od asi 200 min¹ do asi 220 min^-1 a nejvýhodněji při asi 210 min^-1. Pokud je to žádoucí je pH růstového média možno udržovat za použití vhodných pufrů, které se začlení do fermentačního média a/nebo je pH možno periodicky nastavovat podle potřeby přídavkem báze nebo kyseliny. Hodnota pH leží přednostně v rozmezí od asi 6 do asi 7.

«4 4994 • ·

• 4 • 4 4 4 4 4

Při provádění tohoto vynálezu je možno využít jakékoliv vhodné doby růstu mikroorganismu (tj. houby nebo bakterie), doby styku mikroorganismu s 2-methylchinoxalinem a doby inkubace 2-methylchinoxalinu s mikroorganismem. Vhodného růstu mikroorganismu je možno dosáhnout například během asi 24 hodin, kdy je ke kultuře možno přidat buď (a) 2-methylchinoxalin samotný, (b) vhodný alikvot roztoku 2-methoxychinoxalinu ve vhodném rozpouštědle (které například nevykazuje nežádoucí účinek na růst nebo funkci mikroorganismu) , přednostně ethanolu nebo (c) 2-methylchinoxalin adsorbovaný na pryskyřici. Poté je možno pokračovat v inkubaci, například po dobu asi 2 až asi 24 dní, například v závislosti na nádobě, v níž dochází k biokonverzi, médiu a podmínkách inkubace, například teplotě, pH a míchání. Poté je inkubační půdu možno extrahovat za použití jakékoliv vhodné extrakční techniky, například (a) postupu extrakce vhodným rozpouštědlem, například ethylacetátem, methylisobutylketonem, methylethylketonem, methylenchloridem apod., přednostně ethylacetátem, čímž se z inkubační půdy odstraní organické složky nebo (b) adsorpcí produktu, 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, na vhodné pryskyřici, přednostně polymerní pryskyřici, zvláště přednostně na pryskyřici zvolené ze souboru sestávajícího z Amberlite^^R^ (Rohm and Haas), nejvýhodněji typu XAD4. Po extrakci inkubační půdy vhodným organickým rozpouštědlem a oddělení organické a vodné fáze je sloučeniny obsahující organický zbytek možno stanovit za použití jakéhokoliv vhodného postupu, například chromatograficky. Alternativně je po extrakci 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny z inkubační půdy za použití pryskyřice, je 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu z pryskyřice možno eluovat za použití vhodného rozpouštědla, přednostně ethylacetátu nebo methanolu, a poté ji nechat vykrystalovat například z ethylacetátu, například za použití ethylacetátu a methanolu.

- 23 • Φ φφφφ • · · • · • · · • · · • ΦΦΦ ΦΦ • φ · · φ φ · φ « · » · • Φ φφ

Při způsobu podle vynálezu je možno použít jakékoliv vhodné růstové médium, přičemž vhodné růstové médium bude obsahovat zdroj nebo zdroje asimilovatelného uhlíku, asimilovatelného dusíku a anorganické soli obsahující esenciální minerály. Obvykle je jako zdrojů asimilovatelného uhlíku možno použít řadu sacharidů, jako například glukosu, maltosu, mannosu, sacharosu, škrob, glycerol, želé z prosa, melasu, sojové boby apod. Jako příklady zdrojů asimilovatelného dusíku je možno uvést látky jako je kvasinkový nebo kaseinový hydrolyzát, primární kvasinky, kvasinkový extrakt, moučku ze semen bavlníku, sušinu sojových bobů, pšeničné klíčky, masové extrakty, pepton, nálev z kukuřičného extraktu, sušinu kukuřičného extraktu a amonné soli. Jako příklady anorganických solí, kterých lze použít jako živných látek v kultivačním médiu, je možno uvést obvyklé soli obsahující sodík, železo, hořčík, draslík, kobalt, fosfát apod.

Jako příklady složek růstového média, které je vhodné pro použití při provádění tohoto vynálezu, jež jako mikroorganismus obsahuje houbu, je konkrétně možno uvést například nálev z kukuřičného extraktu, sušinu z kukuřičného extraktu, Pharmamedia^^R^ a sladový extrakt. Médium na bázi nálevu z kukuřičného extraktu se připraví za použití asi 40 g/litr kukuřičného extraktu a asi 20 g/litr dextrosy a jeho pH se před sterilizací nastaví na asi 4,85. Médium na bázi sušiny z kukuřičního extraktu se připraví za použití asi 20 g/litr až asi 40 g/litr sušiny z kukuřičného extraktu a asi 20 g/litr dextrosy a jeho pH se před sterilizací nastaví na asi 4,85. Jiné médium vhodné pro použití při provádění tohoto vynálezu se připraví za použití asi 20 g/litr Pharmamedia(^R) a asi 20 g/litr dextrosy a jeho pH se před sterilizací nastaví na asi 7,2. Médium na bázi sladového extraktu se připraví za použití asi 10 g/litr sladového extraktu, asi 10 g/litr dextrosy, asi 5 g/litr peptonu a asi ·· ···· • · · • · • · · • · · ···· ·· ·· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· g/litr kvasinkového extraktu a jeho pH se před sterilizací nastaví na asi 7. Jiné médium vhodné pro použití při provádění tohoto vynálezu se připraví za použití asi 20 g/litr dextroxy, asi 5 g/litr moučky nutrisoy, asi 5 g/litr kvasinkového extraktu, asi 5 g/litr chloridu sodného a asi 5 g/litr K₂HPO₄ a jeho pH se před sterilizací nastaví na asi 7,0 pomocí kyseliny sírové. Zvláštní přednost se při způsobu podle tohoto vynálezu, kde je mikroorganismem houba, dává výše popsanému médiu obsahujícímu sušinu z kukuřičného extraktu.

Jak již bylo uvedeno výše, zvláštní přednost se dává mikroorganismu P. putida ATCC č. 33015. Lyofilizovaný vzorek P. putida ATCC č. 33015 byl uložen ve sbírce ATCC

13. ledna 1999 za podmínek Budapešťské smlouvy. Této nově uložené kultuře bylo přiděleno nové přírůstkové číslo ATCC 202190. Mikroorganismu P. putida ATCC č. 202190 se tedy také dává přednost. Veškerá omezení veřejné dostupnosti této kultury mikroorganismu budou odstraněna po udělení patentu na vynález popsaný v tomto textu.

Jako příklady růstových médií vhodných pro použití při provádění tohoto vynálezu, kdy je mikroorganismem bakterie, je dále možno uvést Nutrient Broth (asi 32 g/litr, Becton Dickinson Microbiology Systems) a glycerol (asi 5 g/litr). Vhodný postup pro přípravu zvolené bakterie (který je v dále uvedených příkladech konkrétně popsán pro P. putida ATCC č. 33015) je možno popsat takto: Bakteriálním inokulem ze zmrazené zásobní kultury připravené postupem známým z dosavadního stavu techniky (asi 17% zásobní roztok glycerolu) se zaočkuje růstové médium (obsahující alikvot sterilního roztoku s obsahem Tween 80, glycerolu a destilované vody), jehož složení je přesněji popsáno dále, v baňce nebo skleněné zkumavce s kovovým uzávěrem nebo ve fermentoru. Fermentace se provádí při teplotách od asi 20 do asi

- 25 • · · · ♦ »· · • · · · · · • ······ • · · · · · • · · *·· ·» · · °C, přednostně při teplotě asi 25“C do asi 32 °C, za vhodného třepáni, přednostně s frekvencí od asi 200 min“¹ do asi 220 min“¹ a nejvýhodněji při asi 210 min“¹. Hodnotu pH růstového média je podle potřeby možno udržovat za použití vhodných pufrů, které se začlení do fermentačního média a/nebo je pH možno periodicky nastavovat podle potřeby přídavkem báze nebo kyseliny. Koncentrace inokula v médiu je přednostně 1 až 20 % (objem inokula/objem média). Hodnota pH leží přednostně v rozmezí od asi 6 do asi 8.

Veškeré pufry, média, reakční činidla, podmínky uvádění do styku nebo podmínky kultivace, množství substrátu, množství induktoru apod. uváděné v kterékoliv části tohoto popisu, je třeba chápat jako neomezující příklady takových látek, podmínek, množství apod., a je možno je nahradit látkami příbuznými nebo podobnými hodnotami. Posouzení takových modifikací je v kompetenci odborníka v tomto oboru, který je na základě výše uvedené diskuse schopen jejich hodnocení v konkrétním kontextu. Tak je například často možné nahradit jeden pufrovací systém za jiný, takže se pro dosažení stejného cíle, na který je použití navrženého postupu, látky nebo složení zaměřeno, použije odlišného, ale známého, způsobu. Takovou modifikaci je možno také provést u kultivačních médií. Do rozsahu tohoto vynálezu dále spadají modifikace za účelem zvětšení měřítka způsobu podle vynálezu pro obchodní účely.

Mikrobiální oxidace podle vynálezu popřípadě dále zahrnuje izolaci požadovaného produktu, 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny. 2-Chinoxalinkarboxylovou kyselinu je možno izolovat níže popsaným způsobem z média, v němž se nový způsob mikrobiální oxidace provádí, a zejména od jakéhokoliv meziproduktu, který může vzniknout, ale nemusí být zcela převeden na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu, například v závislosti na zvoleném mikroorganismu a podmínkách inkubace.

Pro izolaci a purifikaci kteréhokoliv z meziproduktů nebo požadovaného produktu způsobu podle vynálezu je možno použit jakýchkoliv vhodných postupů, jako je například filtrace, extrakce, krystalizace, sloupcová chromatografie, chromatografie na tenké vrstvě, preparátivní nízkotlaká kapalinová chromatografie, vysokotlaká kapalinová chromatograf ie, adsorpce na pryskyřici nebo jakákoliv vhodná kombinace těchto postupů.

Jak je podrobně ilustrováno v následujících příkladech, řada mikroorganismů, konkrétně hub a bakterií, oxiduje 2-methylchinoxalin za vzniku 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, kterou je poté možno oddělit od jakéhokoliv nežádoucího nezreagovaného 2-methylchinoxalinu nebo jakéhokoliv meziproduktu, a dále ji nechat reagovat způsoby dobře známými odborníkům v tomto oboru, například za vzniku sloučenin popsaných v přihlášce 801.

Ačkoliv je tento vynález především zaměřen na využití intaktních mikroorganismů, odborníku v tomto oboru bude zřejmé, že způsoby podle vynálezu je možno provádět za použití vhodných mikrobiálních přípravků, například přípravku z rozbitých a dehydratovaných buněk, extrahovaných látek obsahujících mikrobiální enzymy schopné provést oxidaci podle vynálezu, nebo enzymů samotných, spolu s nezbytnými kofaktory apod.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a vynález v žádném ohledu neomezují.

•4·· * · ·· ·« ·· 4 4 4 · · · · · 4

4 4 4 · · ·

44 · 444444 __ 27 — 444 4 4 4444 ^Λ’ 444444 444444 4· 44

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Oxidace 2-methylchinoxalinu v kulturách ve zkumavce za použití A. repens ATCC č. 14849

A. Biokonverze za použití houby A. repens ATCC č. 14849

Následujícím způsobem se připraví tři zkouškové kultury (TI, T2 a T3): Do tří skleněných zkumavek (16 x 125 mm) s kovovým uzávěrem (TI, T2 a T3) se předloží vždy asi

2,5 ml sterilního růstového média o následujícím složení: dextrosa (asi 20 g/litr), moučka nutrisoy (asi 5 g/litr), kvasinkový extrakt (asi 5 g/litr), chlorid sodný (asi 5 g/litr) a K₂HPO₄ (asi 5 g/litr), jehož pH bylo před sterilizací kyselinou sírovou nastaveno na asi 7,0). Poté se k médiu ve zkumavkách TI, T2 a T3 přidají spory [asi 1% (objem/objem) zásobní kultura spor] A. repens ATCC 14849.

Tyto tři kultury ve zkumavkách se inkubují při asi 29°C za třepání o frekvenci asi 210 min^-1. Po asi 48 hodinách (TI), 72 hodinách (T2) a 96 hodinách (T3) se k příslušné kultuře přidá asi 0,05 ml zásobního roztoku (asi 50 mg/ml v přibližně 100% ethanolu, konečná koncentrace asi 1 mg/ml) 2-methylchinoxalinu.

Po další inkubaci při asi 29°C (viz dále uvedená tabulka 2) se hodnota pH fermentační půdy kultur ve zkumavkách 4M kyselinou chlorovodíkovou nastaví na asi 2. Obsah každé zkumavky se extrahuje stejným objemem ethylacetátu (in substancia) tak, že se ethylacetát přidá k obsahu zkumavky a vzniklá směs se vortexuje a poté centrifuguje při asi 2000 min^-1 (centrifuga IEC). Ethylacetátová vrstva se oddělí a vodná vrstva se znovu extrahuje. Spojené organické » 0 0

0 0 • · 0

0 ·

0 extrakty se vysuší pod atmosférou dusíku za vodní lázni o teplotě asi 50 °C.

zahřívání ve

B. Výtěžek 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny stanovený vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi

Každý z extraktů získaných výše popsaným postupem se resuspenduje v asi 1 ml směsi acetonitrilu a vody v poměru 1 : 9 (objemově). Asi 20 μΐ každého resuspendovaného extraktu se analyzuje nastříknutím na sloupec pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii: Inertsil^^R^ C8 (4,6 x 250 mm, Column Engineering, lne.). Sloučeniny obsažené v každém nastříknutém resuspendovaném extraktu se isokraticky rozdělí za použití směsi acetonitrilu a 0,05% vodné kyseliny trifluoroctové v poměru 1 : 4 (objemově), jako mobilní fáze, při rychlosti eluce 1,0 ml/min. Za těchto podmínek se 2-chinoxalinkarboxylová kyselina eluuje v čase

8,6 min a 2-methylchinoxalin v čase asi 15 min. Výtěžky 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny se stanoví pomocí HPLC analýzy pro několik modifikací experimentálních podmínek (tj. TI, T2 a T3). Tyto výtěžky jsou uvedeny dále v tabulce 2.

Kultura	Tabulka 2	Výtěžek (%)
Doba přídavku substrátu (dny)	Počáteční koncentrace substrátu (g/litr)	Doba inku- bace (dny)
TI	2	1	18	56
T2	3	1	14	76
T3	4	1	16	79

- 29 ·· 44 * · · ·

4 4 ·

4 4 4 4

4 4 4

Jak je ilustrováno údaji v tabulce 2 pro Tl, T2 a T3, HPLC analýzy ukazují, že mikrobiální způsob podle vynálezu vede k 56%, 76% a 79% výtěžku požadované 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny.

Použití intaktního mikroorganismu, tj. A. repens ATCC č. 14949 tedy vede k oxidaci 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu a podstatné množství 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny zůstává nedotčeno.

Příklad II

Oxidace 2-methylchinoxalinu v kulturách ve zkumavce za použití A. repens ATCC č. 14849 ve čtyřech různých růstových médiích

A. Příprava čtyř různých růstových médií

Médium 1 se připraví za použití asi 40 g/litr nálevu z kukuřičného extraktu a asi 20 g/litr dextrosy. Hodnota pH média se před sterilizací nastaví na asi 4,85.

Médium 2 se připraví za použití asi 40 g/litr sušiny kukuřičného extraktu a asi 20 g/litr dextroxy.

Hodnota pH média se před sterilizací nastaví na asi 4,85.

Médium 3 se připraví za použití asi 20 g/litr Pharmamedia(^R) a asi 20 g/litr dextrosy. Hodnota pH média se před sterilizací nastaví na asi 7,2.

Médium 4 se připraví za použití asi 10 g/litr sladového extraktu, asi 10 g/litr dextrosy, asi 5 g/litr peptonu a asi 2 g/litr kvasinkového extraktu. Hodnota pH média se před sterilizací nastaví na asi 7.

I · « · ·

B. Biokonverze za použití houby A. repens ATCC č. 14849

Následujícím způsobem se připraví osm zkouškových kultur (Tla, Tib, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a a T4b): Do každé z osmi skleněných zkumavek (16 x 125 mm) s kovovým uzávěrem (Tla, Tib, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a a T4b) se předloží vždy asi 2,5 ml sterilního růstového média (média 1, média 2, média 3 a média 4). Poté se k médiu ve všech zkumavkách přidají spory [asi 1% (objem/objem) zásobní kultura spor) A. repens ATCC 14849.

Těchto 8 kultur ve zkumavkách se inkubuje při asi 29°C za třepání o frekvenci asi 210 min^-1. Po asi 48 hodinách (Tla, T2a, T3a a T4a) nebo asi 72 hodinách (Tib, T2b, T3b a T4b) se k příslušné kultuře přidá asi 0,05 ml zásobního roztoku (asi 50 mg/ml v DMSO, konečná koncentrace asi 1 mg/ml) 2-methylchinoxalinu.

Po následující dvanáctidenní inkubaci při asi 29°C se fermentační půda každé z kultur ve zkumavkách extrahuje a spojené organické extrakty se vysuší způsobem popsaným v příkladu I.

C. Výtěžek 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny stanovený pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi

Každý z extraktů připravených výše popsaným postupem se zpracuje a analyzuje pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi za podmínek popsaných v příkladu I. Výtěžky 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny se stanoví na základě takové HPLC analýzy pro několik modifikací experimentálních podmínek (tj. Tla, Tib, T2a, T2b,

T3a, T3b, T4a a T4b). Tyto výtěžky jsou uvedeny dále v tabulce 3.

0 0 0 • 0

00

- 31 Tabulka 3

Médium	Kultura	Doba přídavku substrátu (dny)	Výtěžek (%)
1	Tla	2	36
	Tib	3	43
2	T2a	2	73
	T2b	3	69
3	T3a	2	49
	T3b	3	52
4	T4a	2	31
	T4b	3	28

Jak je ilustrováno údaji v tabulce 3 HPLC analýza ukazuje, že mikrobiální způsob podle vynálezu za použití za použití mikroorganismu A. repens ATCC 14849 ve všech médiích vede k produkci 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny. Z údajů z tabulky 3 také vyplývá, že ze čtyř zkoušených médií se nejvyššího procentického výtěžku požadovaného produktu, 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny, dosáhlo za použití média 2.

Příklad III

Oxidace 2-methylchinoxalinu v kulturách v baňce za použití A. repens ATCC č. 14849 nebo A. glauca ATCC č. 22752

A. Biokonverze za použití houby A. repens ATCC č. 14849 nebo houby A. glauca ATCC č. 22752

Čtyři zkouškové kultury (Tla, Tib, T2a a T2b) se připraví následujícím postupem: Do čtyř kónických baněk (300 ml) se předloží vždy asi 25 ml sterilního růstového média

0000 o následujícím složení: dextrosa (asi 20 g/litr), moučka nutrisoy (asi 5 g/litr), kvasinkový extrakt (asi 5 g/litr), chlorid sodný (asi 5 g/litr) a K₂HPO₄ (asi 5 g/litr), jehož pH bylo před sterilizací kyselinou sírovou nastaveno na asi 7,0. Poté se k médiu v baňkách přidají spory [asi 1% (objem/objem) zásobní kultura spor] A. repens ATCC 14849 (baňky Tla a Tib) nebo A. glauca ATCC 22752 (baňky T2a a T2b).

Tyto čtyři kultury v baňkách se inkubují při asi

29°C za třepání o frekvenci asi 210 min^-1. Ihned po zaočkování (T2a) nebo po asi 24 hodinách (T2b) se ke kulturám A. glauca ATCC č. 22752 přidá asi 0,5 ml zásobního roztoku (asi 50 mg/ml v přibližně 100% ethanolu, konečná koncentrace asi 1 mg/ml) 2-methylchinoxalinu nebo po 48 hodinách (Tla) nebo 72 hodinách (Tib) se ke kulturám A. repens ATCC č. 14849 v baňkách přidá asi 0,5 ml zásobního roztoku (asi 50 mg/ml v přibližně 100% ethanolu, konečná koncentrace asi l mg/ml) 2-methylchinoxalinu.

Po následné inkubaci při asi 29°C po dobu 24 hodin (Tla), 16 hodin (Tib), 25 hodin (T2a) nebo 24 hodin (T2b) se hodnota pH fermentační půdy kultur v baňkách 4M kyselinou chlorovodíkovou nastaví na asi 2. Obsah každé baňky se extrahuje dvěma 25ml alikvoty ethylacetátu. Ze spojených ethylacetátových extraktů se za sníženého tlaku odstraní ethylacetát, čímž se získá surový produkt.

B. Výtěžek 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny stanovený vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi

Každý z extraktů připravených výše popsaným způsobem se resuspenduje v asi 5 ml směsi methanolu a acetonitrilu v poměru 3 : 2 (objemově). Vzniklá suspenze se za účelem ·♦·· • · · φφ ·

9 Φ • · · · • · · · • φ · « ·· «· φ · ♦ ♦ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ

HPLC analýzy zředí v poměru 1 : 19 vodou. Analýza HPLC se provede postupem popsaným v příkladu I. Výtěžky 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny se stanoví na základě takové HPLC analýzy pro několik modifikací experimentálních podmínek (tj. Tla, Tib, T2a a T2b). Tyto výtěžky jsou uvedeny dále v tabulce 4.

Tabulka 4

Kultura	Doba přídavku substrátu (dny)	Počáteční koncentrace substrátu (g/litr)	Doba inku- bace (dny)	Výtěžek (%)
Tla	2	1	24	80
Tib	3	1	16	72
T2a	0	1	25	44
T2b	1	1	24	53

Jak ilustrují údaje v tabulce 4, použití intaktního mikroorganismu, tj. A. glauca ATCC č. 22752 nebo A, repens ATCC č. 14849, vede k oxidaci 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu. Výchozí látky, tj. 2-methylchinoxalinu, zbývá v případě kultury Tla 7 %, Tib 7 %, T2a 6 % a T2b 6 %.

Příklad IV

Hodnocení mikrobiální konverze 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu

Ve zkumavkách, které obsahují 2,5 ml média obsahujícího dextrosu a moučku nutrisoy, se podle příkladu I pěstují buňky různých mikroorganismů. Jednotlivé zkumavky ·♦»·

- 34 9 9 9

9

9 9

9 9

9999 99 se zaočkují sporami nebo vegetativními buňkami (asi 1% (objemově) zásobní kultury spor nebo vegetativních buněk) různých mikroorganismů uchovávaných ve formě zmrazené suspenze v glycerolu. Zaočkované zkumavky se inkubují při asi 29°C za třepání v rotační třepačce při frekvence 210 min^-1. Po asi 48 hodinách se do každé zkumavky přidá 0,05 ml roztoku 2-methylchinoxalinu v dimethylsulfoxidu o koncentraci 10 mg/ml. Po přibližně čtyřdenní inkubaci se obsahy všech zkumavek extrahují a jednotlivé extrakty se analyzují pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie za podmínek popsaných v příkladu I. Výtěžky 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny se stanoví pomocí HPLC. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5

Fungální kultura

Výtěžek (%)

glauca, ATCC č. 22752	83
repens, ATCC č. 14849	83
tamarii, ATCC č. 16865	53
solani, ATCC č. 11078	53
glabrum, ATCC č. 11080	47
gossypina, ATCC č. 20575	31
echinulata, ATCC č. 8983	25

Příklad V

Oxidace 2-methylchinoxalinu v kulturách v baňce za použití P. putida ATCC č. 33015

Buňky P. putida ATCC č. 33015 se pěstují v médiu 5 [Nutrient Broth (asi 32 g/litr) a glycerol (asi 5 g/litr)]. Šest kónických baněk (300 ml) obsahujících asi 30 ml média • 4 • 4 4 ·· ·4 94·· • 9 · · 4 · ♦ · • · · 4 49494· ·4· 4 4 4 4 4 4 • 444 44 444 994 49 44 se inokuluje asi 0,10 ml suspenze buněk P. putida ATCC č. 33015 v glycerolu, která byla skladována při asi -70°C. Po přídavku asi 2 ml p-xylenu obsaženého v 15ml kónické polypropylenové centrifugační zkumavce (Falcon^^R^, Becton Dickinson Labware) se zkumavky uzavřou voskem Parafilir/^R) (American National Can) a třepou v rotační třepačce po dobu asi 18 hodin při asi 29°C a frekvenci asi 225 min . Kultury v baňkách mají optickou densitu asi 1,9, měřeno při 650 nm. Buňky ze šesti baněk se shromáždí centrifugací, promyjí jednou asi 250 ml DPBS a resuspendují v asi 20 ml PBS (Biowhittaker) ve 300 ml kónické baňce.

Biokonverze se zahájí přídavkem asi 0,1 ml roztoku 2-methylchinoxalinu v dimethylsulfoxidu o koncentraci asi 100 mg/ml, což odpovídá počáteční koncentraci asi 0,5 g/litr. Inkubace se provádí po dobu asi 4 dnů při asi 29°C za třepání při frekvenci 225 min^-1. V různých dobách se odeberou vzorky biokonverzní půdy a centrifugací se z nich odstraní buňky. Vzorky se podle potřeby zředí methanolem a analyzují pomocí HPLC. Analýza se provádí tak, že se asi 20 μΐ každého z těchto vzorků nastříkne na sloupec Inertsil^^R^ HPLC C8 (4,6 x 250 mm). Každý sloupec se eluuje mobilní fází, která je tvořena směsí acetonitrilu a asi 0,05% vodné kyseliny trifluoroctové v objemovém poměru 1 : 4 rychlostí asi 1,0 ml/min. Zjistí se následující výtěžky 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny: po 1 dnu inkubace - asi 86 %, po 2 dnech inkubace - asi 90 % a po 4 dnech inkubace - asi 94 %.

Příklad VI

Oxidace 2-methylchinoxalinu v kultuře ve fermentoru za použití P. putida ATCC 33015

P. putida ATCC 33015 se pěstuje ve fermentoru, který obsahuje asi 10 litrů média 5. Fermentor se zaočkuje

• · 9 • 9 • · · 9 9 9

9999 99 šesti kulturami P. putida ATCC 33015 pěstovanými jednotlivě v kónických 300ml baňkách s obsahem asi 50 ml média 5. Každá banková kultura se inokuluje asi 175 μΐ zásobního vzorku spor P. putida ATCC 33015, do baňky se vloží 15ml polypropylenová centrifugační zkumavka obsahující asi 2 ml p-xylenu a baňka se uzavře voskem Parafilm^^R^. Tyto kultury v baňkách se 17 hodin inkubují při 29°C za třepání při frekvenci asi 210 min^-1. Po inokulaci šesti kulturami z baněk se do fermentoru během dvou hodin každých 20 minut přidává p-xylen po asi 2ml alikvotech. Poté se do fermentoru po dobu 3,5 hodiny každých 20 minut přidává p-xylen po asi 2,5ml alikvotech. Přidávání xylenu se přeruší a ke vzniklé směsi se asi 5,25 hodiny po zaočkování přidá 2-methylchinoxalin (asi 1,95 g). Další dávka 2-methylchinoxalinu se přidá asi 7,75 hodiny po zaočkování (asi 7,76 g). Po posledním přídavku 2-methylchinoxalinu se směs inkubuje asi 22 hodin. Vzorek inkubačního média se centrifugací zbaví buněk, zředí se methanolem a analyzuje pomocí HPLC za podmínek popsaných v příkladu V. Tato analýza ukáže asi 81% výtěžek 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny.

Claims (37)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu, vyznačuj i cí se tím, že zahrnuje uvádění 2-methylchinoxalinu do styku s mikroorganismem a inkubaci vzniklé směsi za podmínek, které jsou dostatečné pro získání 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny;

   přičemž mikroorganismus je zvolen ze souboru sestávajícího z Absidia glauca ATCC č. 22752, Absidia glauca ATCC č. 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC č. 24169, Absidia repens ATCC č. 14849, Apsidia repens ATCC č. 74481, Actinomucor elegans ATCC č. 6476, Alternaria solani ATCC č. 11078, Aspergillus tamarii ATCC č. 16865, Coniophora puteana ATCC č. 12675, Cunninghamella echinulata ATCC č. 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC č. 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC č. 8983, Cunninghamella echinulata ATCC č. 9244, Cunninghamella echinulata ATCC č. 9245, Cunninghamella echinulata ATCC č. 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC č. 26269, Cunninghamella echinulata ATCC č. 31690, Cunninghamella echinulata ATCC č. 36112, Cunninghamella homothallica ATCC č. 16161, Cylindrocarpon destructans ATCC č. 66963, Diplodia gossypina ATCC č. 20575, Epicoccum neglectum ATCC č. 12723, Glomerella lagenaria ATCC č. 14724, Penicillium claviforme ATCC č. 10426, Penicillium duclauxii ATCC č. 10440, Penicillium glabrum ATCC č. 11080, Pseudocochliobolus lunatus ATCC č. 24155, Pseudomonas putida ATCC č. 33015, Pseudomonas putida ATCC č. 202190, Rhodococcus rhodochrous ATCC č. 19067 a Thamnostylum piriformě ATCC č. 8686; a jejich vhodných mutantů; přičemž když je takovým mikroorganismem Pseudomonas putida ATCC č. 33015 nebo Pseudomonas putida ATCC č. 202190, je tento mikroorganismus před uvedením do styku s 2-methylchinoxalinem indukován interakcí s induktorem.

   «4 44·4

   4 4 4 44 44 «4·
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , že popřípadě dále zahrnuje izolaci 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t i m , že se izolace extrakcí směsi organickým rozpouštědlem.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t i m , že organickým rozpouštědlem je ethylacetát.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t i m , že se extrakt dále podrobí chromatografii.
6. 6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t i m , že se izolace provádí adsorpci 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny ze směsi na pryskyřici a elucí adsorbované 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny z pryskyřice organickým rozpouštědlem.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t i m , že pryskyřicí je polymerní adsorpční pryskyřice.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m , že organickým rozpouštědlem je ethylacetát nebo methanol.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t i m , že dále zahrnuje krystalizaci eluované 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny z ethylacetátu.
10. 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t i m , že dále zahrnuje krystalizaci eluované 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny z ethylacetátu a methanolu.

    000 0

    0 0 0 · · 00 00·· 00 0 0 0000

    0 00 * 000000 000 0 0 0000

    0000 00 000 000 *0 00
11. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující tím, že mikroorganismem je intaktní mikroorganismus,
12. 12. Způsob podle nároku se t i m , že mikroorganismus tohoto mikroorganismu.

    11, vyznačujíc zahrnuje promyté buňky
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t i m , že dále zahrnuje imobilizaci promytých buněk.
14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující tím, že promyté buňky jsou ve vodném rozpouštědle.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující tím, že se uvádění do styku provádí přidáním 2-methylchinoxalinu k rozpouštědlu.
16. 16. Způsob podle nároku 11, vyznačující tím, že mikroorganismus je v růstovém médiu.
17. 17.

    se tím

    Způsob podle nároku 16, vyznačující že se uvádění do styku provádí přidáním 2-methylchinoxalinu k růstovému médiu.
18. 18. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že mikroorganismus je zvolen ze souboru sestávajícího z Absidia glauca ATCC č. 22752, Absidia glauca ATCC č. 74480, Absidia repens ATCC č. 14849, Absidia repens ATCC č. 74481, Aiternaria solani ATCC č. 11078, Aspergillus tamarii ATCC č. 16865, Cunninghamella echinulata ATCC č.

    8983 a Diplodia gossypina ATCC č. 20575 a jejich mutantů.
19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se t i m , že mikroorganismus je zvolen ze souboru sestávajícího z Absidia glauca ATCC č. 22752, Absidia glauca ATCC «» ··«·

    č. 74480, Absidia repens ATCC č. 14849, Absidia repens ATCC č. 74481, Alternaria solani ATCC č. 11078 a Aspergillus tamarii ATCC č. 16865 a jejich mutantů.
20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se t i m , že mikroorganismus je zvolen ze souboru sestávajícího z Absidia glauca ATCC č. 22752, Absidia glauca ATCC č. 74480, Absidia repens ATCC č. 14849 a Absidia repens ATCC č. 74481 a jejich mutantů.
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t i m , že mikroorganismem je Absidia repens ATCC č. 14849 nebo Absidia repens ATCC č. 74481.
22. 22. Způsob mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu, vyznačuj i cí se tím, že zahrnuje uvádění 2-methylchinoxalinu do styku s mikroorganismem a inkubaci vzniklé směsi za podmínek, které jsou dostatečné pro získání 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny; přičemž mikroorganismus je zvolen ze souboru sestávajícího z Absidia repens ATCC č. 14849 a Absidia repens ATCC č. 74481 a jejich mutantů.
23. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující tím, že mikroorganismus je v růstovém médiu.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující tím, že se uvádění do styku provádí přidáním 2-methylchinoxalinu k růstovému médiu.
25. 25. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že mikroorganismem je Pseudomonas putida ATCC č. 33015 nebo Pseudomonas putida ATCC č. 202190.

    99 9999 • · 9 • 9

    9 9 9 • 9 9

    99·9 99

    99 9

    99 99 • 9 9 9

    9 · » *

    9 9 9 9 9

    9 9 9 9

    99 99
26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se t í m , že induktorem je p-xylen.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se t i m , že Pseudomonas putida ATGC č. 33015 nebo Pseudomonas putida ATCC č. 202190 je v růstovém médiu.
28. 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se t í m , že k růstovému médiu se přidá p-xylen.
29. 29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se t i m , že růstové médium je v baňce.
30. 30. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se t i m , že dále zahrnuje shromáždění mikroorganismu po dokončení indukce.
31. 31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se t i m , že se shromáždění provádí centrifugací obsahu baňky, dekantací kapaliny a promytím buněčné pelety a jejím resuspendováním v pufru.
32. 32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se t i m , že se uvádění do styku provádí přidáním 2methylchinoxalinu k pufru po resuspendování.
33. 33. Způsob podle nároku 28, vyznačuj ící se t i m , že růstové médium je ve fermentoru.
34. 34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se t i m , že se po indukci přeruší přidávání p-xylenu k růstovému médiu.
35. 35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že se uvádění do styku provádí přidáním 24444

    - 42 4

    44 4 4 • 4 *4 »4

    44 44 4 4 4 4 e 4 · · » · • ·*···· < 4 4 C * 4 »44 »44 44 44

    -methylchinoxalinu k růstovému médiu po přerušení přidávání p-xylenu.
36. 36. Způsob mikrobiální oxidace 2-methylchinoxalinu na 2-chinoxalinkarboxylovou kyselinu, vyznačuj ιοί se tím, že zahrnuje uvádění 2-methylchinoxalinu do styku s mikroorganismem poté, co enzymy mikroorganismu byly indukovány interakcí s induktorem, a inkubaci vzniklé směsi za podmínek, které jsou dostatečné pro získání 2-chinoxalinkarboxylové kyseliny; přičemž mikroorganismus j zvolen ze souboru sestávajícího z Pseudomonas putida ATCC č 33015, Pseudomonas putida ATCC č. 202190 a jejich vhodných mutantů.
37. 37. Způsob podle nároku 36, vyznačujíc se t i m , že induktorem je p-xylen nebo m-xylen.