ES2208221T3 - Conversion microbiana de 2-metilquinoxalina. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la oxidación microbiana de 2- metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico que comprende poner en contacto dicha 2-metilquinoxalina con un microorganismo e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para producir una cantidad de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico, en el que dicho microorganismo se selecciona entre el grupo constituido por Absidia glauca ATCC Nº 22752, Absidia glauca ATCC Nº 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC Nº 24169, Absidia repens ATCC Nº 14849, Absidia repens ATCC Nº 74481, Actinomucor elegans ATCC Nº 6476, Alternaria solani ATCC Nº 11078, Aspergillus tamarii ATCC Nº 16865, Coniophora puteana ATCC Nº 12675, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8688a.

Description

Conversión microbiana de 2-metilquinoxalina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos novedosos para preparar ácido 2-quinoxalinacarboxílico y, más específicamente, se refiere a la oxidación microbiana de 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico.

Antecedentes de la invención

En la técnica se conocen procedimientos para la oxidación microbiana de ciertos heterociclos aromáticos y, en particular, para la oxidación microbiana de grupos metilo en ciertos heterociclos aromáticos, tales como, por ejemplo, los descritos en los dos artículos siguientes: "Gene order of the TOL Catabolic Plasmid Upper Pathway. Operon and Oxidation of Both Tolueno and Benzyl Alcohol by the xy/A Product" por S. Harayama y col., J. Bacteriol., 167 (2): 455-461 (1986) y "Enzymatic Oxidation of Methyl Groups on Aromatic Heterocycles: A Versatile Method for the Preparation of Heteroaromatic Carboxylic Acids," por A. Keiner, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 31 (6): 774 – 775 (1992).

La patente de Estados Unidos Nº 4.859.592 describe un procedimiento microbiano para la producción ácido picolínico que después se puede convertir en productos de piridina por medios químicos.

Las patentes de Estados Unidos números 5.104.798, 5.213.973 y 5.236.832 describen un procedimiento microbiano para la oxidación de grupos metilo ciertos heterociclos de anillos aromáticos de 5 ó 6 eslabones a los correspondientes ácidos carboxílicos que se realiza mediante una bacteria de la especie Pseudomonas utilizando toluendo, xileno o cimeno como inductor. Como se describe en estos documentos, se sabe en la técnica que la oxidación del grupo metilo de tolueno a ácido benzoico por la cepa Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 comprende tres etapas catalizadas por toluenomonooxigenasa, alcoholdeshidrogenasa y aldehídodeshidrogenasa, respectivamente.

Como se ha descrito anteriormente con referencia al artículo anteriormente mencionado de Harayama y col., el plásmido TOL pWWO de P. putida mt-2 es un elemento extracromosómico transmisible que codifica todas las enzimas requeridas para el catabolismo oxidante de varios hidrocarburos aromáticos, incluyendo tolueno, m-xileno y p-xileno. Las bacterias que llevan los plásmidos TOL, por ejemplo, P. putida ATCC Nº 33015, pueden convertir ciertos hidrocarburos aromáticos en sus correspondientes ácidos carboxílicos aromáticos: tanto el operón xyl que codifica las enzimas de la degradación de xileno como los genes que son responsables de la regulación del gen de xyl están situados en el plásmido TOL pWWO. Los genes en el plásmido TOL pWWO que codifican las enzimas requeridas para las oxidaciones anteriores se deben inducir para producir dichas enzimas. Por lo tanto, la descripción de dicha inducción en las patentes de Estados Unidos anteriormente mencionadas números 5.104.798, 5.213.973 y 5.236.832.

Como se describe en el artículo de Gaucher y col., en Dev. Ind. Microbiol., 22: 219-232 (1981), el hongo Penicillium griseofulvum contiene tres enzimas para la conversión de m-cresol a ácido m-hidroxibenzoico: m-cresolmetilhi-
droxilasa, m-hidroxibencilalcoholdeshidrogenasa y m-hidroxibencilalaldehídohidroxilasa.

Para reiterar, como se conoce en la técnica, ciertos hongos y bacterias contienen enzimas para la oxidación de los grupos metilo en ciertos anillos aromáticos a sus correspondientes ácidos carboxílicos. Aunque se sabe que después los grupos metilo en dichos anillos heteroaromáticos se pueden oxidar a sus correspondientes ácidos carboxílicos usando microorganismos, como apreciarán los expertos en la técnica, los rendimientos químicos y ópticos de dichas oxidaciones microbianas generalmente varían sustancialmente dependiendo de, por ejemplo, el microorganismo particular elegido, la concentración del sustrato, la estructura del sustrato y similares.

Ahora se ha encontrado que un grupo de microorganismo, que incluyen hongos y bacterias, sustancialmente oxidan 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalina carboxílico. Además, el procedimiento sujeto permite la recuperación adecuada del ácido 2-quinoxalinacarboxílico.

La solicitud de patente provisional de Estados Unidos Nº 60/073.801 ("la solicitud 801") presentada el 5 de febrero de 1998, ahora la solicitud PCT internacional Nº PCT/IB99/00067 presentada el 18 de enero de 1999, describe el uso de ácido 2-quinoxolinacarboxílico como un intermedio en la síntesis de ácidos dihidroxihexanoicos que son útiles para tratar, por ejemplo, la inflamación y otros trastornos inmunes. El ácido 2-quinoxalinacarboxílico proporcionado por los procedimientos novedosos de la presente invención se puede usar para sintetizar dichos ácidos dihidroxihexanoicos.

Todos los documentos citados en esta memoria descriptiva, incluyendo los anteriormente mencionados, se incorporan como referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento microbiológico para preparar el ácido 2-quinoxalinacarboxílico a partir de 2-metilquinoxalina.

Más particularmente, la presente invención se refiere a procedimientos microbiológicos para la preparación de los compuestos de fórmula I

1

poniendo en contacto el compuesto de fórmula II

2

con un microorganismo capaz de llevar a cabo la oxidación del grupo metilo del compuesto de fórmula II al grupo carboxilo del compuesto de fórmula I, e incubando la mezcla resultante en condiciones adecuadas para producir una cantidad del compuesto de fórmula I.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona los procedimientos para llevar a cabo la oxidación microbiana del compuesto de fórmula II, 2-metilquinoxalina, que comprende:

poner en contacto el compuesto de fórmula II con un microorganismo, o un mutante del mismo que se sabe o de otra manera se puede obtener por los expertos en la técnica relevante y capaz, a pesar de dicha mutación, de llevar a cabo la oxidación sujeto ("un mutante adecuado del mismo"), e

incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para producir una cantidad del compuesto de la fórmula I, ácido 2-quinoxalinacarboxílico,

en el que dicho microorganismo se selecciona entre el grupo constituido por Absidia glauca ATCC Nº 22752, Absidia glauca ATCC Nº 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC Nº 24169, Absidia repens ATCC Nº 14849, Absidia repens ATCC Nº 74481, Actinomucor elegans ATCC Nº 6476, Alternaria solani ATCC Nº 11078, Aspergillus tamarii ATCC Nº 16865, Coniophora puteana ATCC Nº 12675, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8983, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 9244, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 9245, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 26269, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 36190, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 36112, Cunninghamella homothallica ATCC Nº 16161, Cylindrocarpon destructans ATCC Nº 66963, Diplodia gossypina ATCC Nº 20575, Epicoccum neglectum ATCC Nº 12723, Glomerella lagenana ATCC Nº 14724, Penicillium claviforme ATCC Nº 10426, Penicillium duclauxii ATCC Nº 10440, Penicillium glabrum ATCC Nº 11080, Pseudocochliobolus lunatus ATCC Nº 24155, Pseudomonas putida ATCC Nº 33015, Pseudomonas putida ATCC Nº 202190, Rhodococcus rhodochrous ATCC Nº 19067 y Thamnostylum piriforme ATCC Nº 8686; y los mutantes adecuados de los mismos; con tal que cuando dicho microorganismo es dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 o Pseudomonas putida ATCC Nº 202190, dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015, o dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 202190 se induce mediante la interacción con un inductor antes a dicho contacto de dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 o dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 22190 con dicha 2-metilquinoxalina.

Los procedimientos objeto de la invención además opcionalmente comprenden el aislamiento del producto deseado, ácido 2-quinoxalinacarboxílico, mediante cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, la mezcla de reacción se puede extraer con un disolvente orgánico, preferiblemente, acetato de etilo, y después el material extraído se puede cromatografiar. Alternativamente, el ácido 2-quinoxalinacarboxílico se puede adsorber de la mezcla de reacción en una resina, preferiblemente una resina absorbente polimérica, y eluirse de la misma usando un disolvente orgánico, preferiblemente acetato de etilo y cristalizarse con el material eluido usando un disolvente orgánico, o una combinación de disolventes orgánicos, preferiblemente acetato de etilo y metanol. Todavía, además, el ácido 2-quinoxalinacarboxílico producido mediante el presente procedimiento se puede tratar con una base adecuada, por ejemplo, hidróxido sódico, dando como resultado la formación de una sal, por ejemplo, sal sódica, del ácido 2-quinoxalinacarboxílico. Después la sal alcalina del ácido 2-quinoxalinacarboxílico se puede aislar a partir del medio de bioconversión mediante la separación de las células del medio por filtración o centrifugación, seguido de la concentración del medio exento de células, por ejemplo mediante evaporación.

El microorganismo objeto de la invención es preferiblemente un microorganismo intacto.

En una realización preferida de la presente invención el microorganismo es un hongo.

En una realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo es un hongo, el hongo se selecciona del grupo constituido por el género Absidia, Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Diplodia y Cunninghamella.

En una realización particularmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo es un hongo, el hongo es del género Absidia. En una realización especialmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo en un hongo del género Absidia, el microorganismo es A. glauca ATCC Nº 22752 o A. glauca ATCC Nº 74480, o un mutante adecuado de los mismos, o, todavía, además, cualquier depósito de A. glauca ATCC Nº 22752, o cualquier mutante adecuado del mismo, hecho para cumplir con los términos del tratado de Budapest.

En otra realización especialmente preferida de la presente invención en el que el microorganismo es un hongo del género Absidia, el microorganismo es A. repens ATCC Nº 14849 o A. repens ATCC Nº 74481, o un mutante adecuado del mismo, o además, todavía, cualquier depósito de A. repens ATCC Nº 14849, o un mutante adecuado del mismo, hecho para cumplir con los términos del tratado de Budapest.

Una densidad celular preferida de los cultivos de hongos de la presente invención está entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 g de peso celular seco/l.

En otra realización preferida de la presente invención el microorganismo es una bacteria.

En una realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo es una bacteria, la bacteria se selecciona entre el grupo constituido por los géneros Pseudomonas y Rhodococcus.

En una realización particularmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo es una bacteria, la bacteria es del género Pseudomonas.

En una realización especialmente preferida de la presente invención en el que el microorganismo es una bacteria del género Pseudomonas el microorganismo es P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190, o un mutante adecuado de los mismos, o, además todavía, cualquier depósito de P. putida ATCC Nº 33015, o mutante adecuado de la misma, hecha para cumplir con los términos del tratado de Budapest.

Una densidad de células preferida para los cultivos bacterianos de la presente invención es una densidad que proporciona una densidad óptica entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 a 650 nm.

Como se ha descrito anteriormente, en las realizaciones de la presente invención en las que el microorganismo es P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190, o un mutante adecuado de las mismas, el microorganismo, o mutante adecuado del mismo, se induce antes del o durante el contacto. Se prefiere que el contacto se produzca después de la finalización de la inducción del microorganismo. Los inductores preferidos incluyen p-xileno y m-xileno. Un inductor particularmente preferido es p-xileno.

En una realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo es P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190, o un mutante adecuado de los mismos, y el microorganismo se cultiva en un medio de crecimiento en un matraz, el inductor se añade a dicho medio de crecimiento antes de poner en contacto el microorganismo con 2-metilquinoxalina y se incuba en dicho medio de crecimiento durante un período de tiempo suficiente para la realización sustancial de dicha inducción. Las células del microorganismo inducido se recogen centrifugando el contenido del matraz, separando, por ejemplo decantando, el medio de crecimiento consumido (y así el inductor sujeto), lavando el sedimento celular y resuspendiendo el sedimento en un medio acuoso; tal como DPBS (Biowhittaker), antes de poner en contacto dicho 2-metilquinoxalina con dicho microorganismo.

En otra realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo es P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190, o un mutante adecuado de los mismos, y el microorganismo sujeto se cultiva en un medio de crecimiento en un fermentador, el inductor se añade de manera continua a dicho medio de crecimiento antes de que la puesta en contacto sujeto del microorganismo con 2-metilquinoxalina y se incuba en dicho medio de crecimiento durante un período de tiempo suficiente para la realización sustancial de dicha inducción, y después se interrumpe antes de la puesta en contacto de dicho 2-metilquinoxalina con dicho microorganismo.

En una realización preferida adicional de la presente invención la puesta en contacto sujeto se lleva a cabo mediante la adición de 2-metilquinoxalina a un medio de crecimiento que comprende el microorganismo sujeto cuando el microorganismo es un hongo. En una realización preferida de la presente invención en la que la puesta en contacto sujeto se lleva a cabo mediante la adición de 2-metilquinoxalina a un medio de crecimiento que comprende el hongo sujeto, el medio de crecimiento es un medio sólido de macerado de maíz. Un medio de sólidos de macerado de maíz particularmente preferido comprende entre aproximadamente 20 g y aproximadamente 40 g/litro de sólidos de macerado de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, que tiene un pH de aproximadamente 4,85. Otro medio de crecimiento preferido comprende aproximadamente 20 g/l de Pharmamedia® de (Traders Protein) y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, que tiene un pH de aproximadamente 7,2.

Además en otra realización preferida de la presente invención la puesta en contacto es mediante la adición del compuesto de fórmula II adsorbido a una resina. Véase, por ejemplo, el artículo de J. T. Vicenzi y col., "Large-scale stereoselective enzymatic ketone reduction with in situ product renoval via polimeric adsorbent resins," Enzyme and Microbial Technology, 20. 494-499 (1997).

Además en otra realización preferida de la presente invención la puesta en contacto se lleva a cabo mediante la adición de 2-metilquinoxalina a un medio acuoso que comprende células lavadas del microorganismo.

Además en otra realización preferida de la presente invención el microorganismo se lava antes de poner en contacto el microorganismo con 2-metilquinoxalina En una realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo se lava antes de poner en contacto el microorganismo con 2-metilquinoxalina el microorganismo lavado se inmoviliza antes de la puesta en contacto.

En otra realización preferida de la presente invención el microorganismo se hace crecer en un medio de sólidos de macerado de maíz durante entre aproximadamente veinticuatro horas y aproximadamente setenta y dos horas antes de la puesta en contacto que se lleva a cabo mediante la adición de 2-metilquinoxalina al mismo.

Los procedimientos de la presente invención además opcionalmente comprenden el aislamiento o separación de ácido 2-quinoxalinacarboxílico, por ejemplo, llevada a cabo mediante extracción con un disolvente orgánico, adsorción en una resina, cristalización, o, como se ha descrito anteriormente, cuando la sal alcalina del ácido 2-quinoxalinacarboxílico se consigue mediante concentración por medio de evaporación de un medio exento de células, o similares.

La presente invención además incluye el uso de ácido 2-quinoxalinacarboxílico en la síntesis de los ácidos dihidroxihexanoicos descritos en la solicitud 801 anteriormente mencionada siguiendo cualquiera de los procedimientos deescritos en la solicitud 801 mediante cualquiera de otro procedimiento adecuado del mismo.

Los expertos en la técnica comprenderán completamente los términos usados en esta memoria descriptiva para describir la presente invención; no obstante, los siguientes términos usados en esta memoria descriptiva son como se describe inmediatamente a continuación.

"Microorganismo intacto" significa que las células del microorganismo sustancialmente poseen sus integridades mecánicas, físicas y bioquímicas inherentes (y/o inducidas, como puede ser el caso).

"Oxidación microbiana" significa la oxidación de la presente invención como se lleva a cabo por el microorganismo o cualquier preparación del mismo y similares.

"Microorganismo" incluye cualquier microorganismo intacto o preparación adecuada del mismo, incluyendo, por ejemplo, un microorganismo lavado, exento de, por ejemplo, medio de fermentación, medio de crecimiento, caldo de cultivo y similares, como puede ser el caso; y un microorganismo inmovilizado, por ejemplo, en una columna, unido a las perlas, y similares.

Descripción detallada de la invención

Salvo que se indique lo contrario, a lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas:

ºC es grado centígrado;

% es porcentaje;

ACN es acetonitrilo;

DMSO es dimetilsulfóxido;

DPBS es solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco;

EtOAC es acetato de etilo;

EtOH es etanol;

g es gramo;

HPLC es cromatografía líquida de alto rendimiento;

l es litro;

MeOH es metanol;

mg es miligramo;

min es minuto o minutos;

mm es milímetro;

mmol es milimoles;

ml es mililitro;

m-xileno es meta-xileno;

N es normal (concentración);

nM es nanomolar (concentración);

PBS es solución salina tamponada con fosfato;

p-xileno es para-xileno;

rpm es revoluciones por minuto;

TFA es ácido trifluoroacético;

\mul es microlitro;

v/v es volumen por volumen;

American National Can® se localiza en Menasha, Wisconsin, Estados Unidos;

Becton Dickinson® Labware se localiza en Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos;

Becton Dickinson® Microbiology Systems, Sparks, Maryland, Estados Unidos;

Biowhittaker® se localiza en Walkersville, Maryland, Estados Unidos;

Column Engineering®, Inc. se localiza en Ontario, California, Estados Unidos;

IEC® Centrifuge se localiza en Needham Heights, Massachussets, Estados Unidos;

Rohm y Hass® se localiza en Filadelfia, Pensilvania, Estados Unidos; y

Traders Protein® se localiza en Menfis, Ténesis, Estados Unidos;

Además, ATTC es la Colección Americana de Cultivos Tipo que está localizada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209; Estados Unidos. La tabla 1 más adelante enumera los microorganismos descritos en esta memoria descriptiva y su (s) depositante (s) (véase, www.ATCC.com)

TABLA 1

Cultivo fúngico, Nº de ATCC	Depositante
Absidia glauca, 22752	NRRL^{1}
Absidia glauca, 74480	Pfizer Inc.^{2}
Absidia pseudocylindrospora 24169	NRRL
Absidia repens, 14849	NRRL
Absidia repens, 74481	Pfizer Inc.^{3}
Actinomucor elegans, 6476	J. A. Stevenson
Alternaria solani, 11078	P. W. Brian
Aspergillus tamarii, 16865	K. B. Raper, D. I. Fennell

TABLA 1 (continuación)

Cultivo fúngico, Nº de ATCC	Depositante
Coniophora puteana, 12675	F. F. Lombard
Cunninghamella echinulata, 8688a	NRRL
Cunninghamella echinulata, 8688b	NRRL
Cunninghamella echinulata, 8983	V. M. Cutter, Jr
Cunninghamella echinulata, 9244	V. M. Cutter, Jr
Cunninghamella echinulata, 9245	V. M. Cutre, Jr
Cunninghamella echinulata, 10028b	NRRL
Cunninghamella echinulata, 26269	J. J. Perry
Cunninghamella echinulata, 36190	NRRL
Cunninghamella echinulata, 36112	J. J. Perry
Cunninghamella homothallica, 16161	Instituto IFO de fermentación
Cylindrocarpon destructans, 66963	G. J. Samuels
Diolodia gossypina, 20575	Hoffman-La Roche Ltd.
Epicoccum neglectum, 12723	Pfizer Inc.
Glomerella lagenana, 14724	Sanraku-Ocean Co., Ltd.
Penicillium claviforme, 10426	NRRL
Penicillium duclauxii, 10440	NRRL
Penicillium glabrum, 11080	P. W. Brian
Pseudochliobolus lunatus, 24155	R. S. Byther
Thamnostylum pirforme, 8686	NRRL
Cultivo bacteriano, Nº de ATCC	Depositante
Pseudomonas putida, 33015	P. A. Williams
Pseudomonas putida, 202190	Pfizer Inc.
R. rhodochrous, 19067	J. W. Foster
^{1} NRRL es Laboratorios Regionales de investigación del Norte (Peoria, Illinois).
^{2}A. glauca, 22752, depositada bajo los términos del tratado de Budapest el 13 de enero de 1999.
^{3}A. repens, 14849, depositada bajo los términos del tratado de Budapest el 13 de enero de 1999.
^{4}P. putida, 33015, depositada bajo los términos del tratado de Budapest el 13 de enero de 1999.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se refiere a procedimientos microbiológicos para la preparación de los compuestos de fórmula I

3

poniendo en contacto el compuesto de fórmula II

4

con un microorganismo capaz de llevar a cabo la oxidación del grupo metilo de la fórmula II, 2-metilquinoxalina al grupo carboxilo de fórmula I, ácido 2-quinoxalinacarboxílico, e incubando la mezcla resultante en condiciones adecuadas para producir el ácido 2-quinoxalinacarboxílico.

Los procedimientos de la presente invención se llevan a cabo fácilmente. El microorganismo se cultiva, con inducción si es necesario, por ejemplo, cuando el microorganismo es P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190, o un mutante adecuado del mismo, y después puesto en contacto con 2-metilquinoxalina para oxidar el grupo metilo de 2-metilquinoxalina al grupo -COOH del ácido 2-quinoxalinacarboxílico. Después el ácido 2-quinoxalinacarboxílico se puede, por ejemplo, además hacer reaccionar mediante los procedimientos descritos en la solicitud 801 anteriormente mencionada para por último producir los ácidos dihidroxihexanoicos novedosos descritos en la solicitud 801 que son útiles para tratar inflamación y otros trastornos inmunes. La actividad, procedimientos para actividades de ensayo, dosificaciones, formas de dosificación, procedimientos de administración en información antecedente concerniente a los ácidos dihidroxihexanoicos descritos en la solicitud 801 se exponen en ese documento.

Como se ha descrito anteriormente, cualquier microorganismo adecuado, o mutante adecuado del mismo, se puede usar en los procedimientos de la presente invención. Como comprenderían los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción, las condiciones de los procedimientos sujetos se elegirían dependiendo de, por ejemplo, el tipo de microorganismo y la preparación particular de los mismos. Por ejemplo, el pH, temperatura, concentraciones de los componentes, y similares de, por ejemplo, el medio de fermentación y el disolvente orgánico, así como las concentraciones de 2-metilquinoxalina y el inductor (si se emplea) se elegirán para proporcionar el resultado deseado particular usando el microorganismo seleccionado.

Los hongos preferidos incluyen los miembros del género Absidia, Actinomucor, Alternaria, Aspergillus, Coniophora, Cunninghamella, Cylindrocarpon, Diplodia, Epicoccum, Fusarium, Glomerella, Penicillium, Pseudocochliobolus, Thamnostylum y Verticillium, pero la especie de los mismos no se limita particularmente con tal que el microorganismo, o mutantes del mismo, sean capaces de llevar a cabo la oxidación sujeto.

Los hongos particularmente preferidos pertenecen al género Absidia, Alternaria, Aspergillus, Cunninghamella, Diplodia y Penicillium.

Los hongos particularmente preferidos pertenecen al género Absidia.

Más particularmente, los hongos preferidos incluyen A. glauca ATCC Nº 22752, A. glauca ATCC Nº 74480, A. pseudocylindrospora ATCC Nº 24169, A. repens ATCC Nº 14849, A. repens ATCC Nº 74481, A. elegans ATCC Nº 6476, A. solani ATCC Nº 11078, A. tamarii ATCC Nº 16865, C. puteana ATCC Nº 12675, C. echinulata ATCC Nº 8688a, C. echinulata ATCC Nº 8688b, C. echinulata ATCC Nº 8983, C. echinulata ATCC Nº 9244, C. echinulata ATCC Nº 9245, C. echinulata ATCC Nº 10028b, C. echinulata ATCC Nº 26269, C. echinulata ATCC Nº 36190, C. echinulata ATCC Nº 36112, C. homothallica ATCC Nº 16161, C. destructans ATCC Nº 66963, D. gossypina ATCC Nº 20575, E. neglectum ATCC Nº 12723, G. lagenana ATCC Nº 14724, P. claviforme ATCC Nº 10426, P. duclauxii ATCC Nº 10440, P. glabrum ATCC Nº 11080, P. lunatus ATCC Nº 24155 y T. piriforme ATCC Nº 8686; y los mutantes adecuados de los mismos.

Los hongos más preferidos incluyen A. glauca ATCC 22752, A. glauca ATCC Nº 74480, A. repens ATCC Nº 14849, A. repens ATCC Nº 74481, A. solani ATCC Nº 11078, A. tamarii ATCC Nº 16865, C. echinulata ATCC Nº 8983, D. gossypina ATCC Nº 20575 y P. glabrum ATCC Nº 11080; y los mutantes adecuados de los mismos.

Los hongos particularmente preferidos incluyen A. glauca ATCC 22752, A. glauca ATCC Nº 74480, A. repens ATCC Nº 14849 y A. repens ATCC Nº 74481, y los mutantes adecuados de los mismos.

Los hongos especialmente preferidos son A. repens ATCC Nº 14849 y A. repens ATCC Nº 74481, y los mutantes adecuados de los mismos.

Las bacterias preferidas incluyen las pertenecientes al género: Bacillus, Brevibacterium, Micrococcus, Pseudomonas y Rhodococcus, pero la especie de los mismos no es particularmente limitante con tal que los microorganismos, o mutantes de los mismos sean capaces de llevar a cabo la oxidación sujeto.

Las bacterias particularmente preferidas incluyen las pertenecientes al género Pseudomonas y Rhodococcus.

Las bacterias especialmente preferidas incluyen las pertenecientes al género Pseudomonas.

Más particularmente, las bacterias preferidas incluyen P. putida ATCC 33015, P. putida ATCC Nº 202190 y R. rhodochrous ATCC Nº; y los mutantes adecuados de los mismos.

Las bacterias especialmente preferidas son P. putida ATCC 33015 o P. putida ATCC Nº 202190; y los mutantes adecuados de los mismos.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención incluye el uso de cualquier mutante adecuado de cualquiera de los microorganismos adecuados. Además, un grupo de mutantes con propiedades más deseables, por ejemplo, capaces de oxidar cantidades mayores de sustrato comparado con la cepa madre, también se puede usar en el procedimiento sujeto, y estas cepas nuevas se pueden preparar usando los procedimientos conocidos que incluyen, por ejemplo, la mutagénesis habitual, y las técnicas de selección, y los procedimientos recombinantes que incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio.

Los procedimientos de mutagénesis habituales incluyen mutagénesis química con N-metil-N'-nitrosoguanidina (Delic y col., (1970), Mutat. Res. 9: 167), ácido nitroso, (Crueger y Crueger (1984), Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, p. 16, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, Estados Unidos) e irradiación con luz ultravioleta (Thrum (1984), en Biotechnology of Industrial Antibiotics (ediciones Vandamme), Marcel Dekker, Nueva York, pp. 373-374).

Las técnicas de selección incluyen el reaislamiento simple de la cepa mediante la selección de una colonia aislada, selección de morfologías de colonias específicas y selección para resistencia a los análogos de los componentes que se sabe o se cree que están en la ruta biosintética del compuesto de la fórmula I (Crueger y Crueger (1984), Biotechnology: A Textbookof Industrial Microbiology, p. 24-25, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, Estados Unidos).

Estas nuevas cepas se usan en los procedimientos sujetos debido a que, por ejemplo, han mejorado las propiedades con relación a sus cepas madres, por ejemplo, producen más ácido 2-quinoxalinacarboxílico, muestran menos actividad degradante intrínseca no deseada de 2-metilquinoxalina y/o ácido 2-quinoxalinacarboxílico y/o los compuestos intermedios que se pueden generar en el procedimiento de la presente invención dependiendo de, por ejemplo, el microorganismo particular elegodo. Además, cuando el mutante se utiliza porque su uso produce más ácido 2-quinoxalinacarboxílico, se necesita menos volumen del cultivo a desarrollarse para obtener el material necesario con el fin de generar una cantidad de ácido 2-quinoxalinacarboxílico según el presente procedimiento que puede dar como resultado ahorros de coste sustanciales.

Como se ha descrito anteriormente, se puede usar cualquier preparación adecuada del microorganismo en el procedimiento de la presente invención tales como, por ejemplo, un microorganismo en medio de crecimiento, un microorganismo lavado exento de, por ejemplo, medio de fermentación, caldo de cultivo y similares, o un microorganismo inmovilizado, por ejemplo, en una columna, unido a las perlas y similares.

Los expertos en la técnica comprenderán de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva cómo preparar un microorganismo intacto inmovilizado adecuado tal como se describe, por ejemplo, en el documento de Bauer y col., en el artículo "Polyvinyl alcohol-immovilized whole-cell preparations for biotransformation of nitrites" publicado en Biotechnology Letters, 18 (3): 343-348 (1996).

Los microorganismos intactos preferidos serán los que sustancialmente oxiden 2-metilquinoxalina al producto, específicamente, ácido 2-quinoxalinacarboxílico, mientras que dejan los productos sustancialmente inalterados, por ejemplo, exentos de la actividad intrínseca que pudieran degradar o de otra manera impactar negativamente en el producto deseado en cualquier estado de los procedimientos sujetos.

Los microorganismos adecuados para uso en la oxidación microbiana sujeto se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica relevante. Un ejemplo de un procedimiento adecuado para la preparación de un microorganismo a partir de una cepa madre comprada comercialmente se proporciona más adelante. Basándose en la presente descripción que incluye los procedimientos proporcionados más adelante, los expertos en la técnica comprenderían cómo modificar cualquier parte de estos procedimientos, por ejemplo, el procedimiento de preparación del microorganismo, libre o inmovilizado; el procedimiento de puesta en contacto del ácido 2-quinoxalinacarboxílico con el microorganismo; los componentes del medio de crecimiento y las condiciones, por ejemplo, temperatura, pH y similares; las concentraciones respectivas de 2-metilquinoxalina, inductor (cuando se usa); o condiciones de incubación; para llevar a cabo el resultado deseado usando cualquier microorganismo deseado.

En las realizaciones de la invención en las que el microorganismo es un hongo, un intervalo de concentración preferido de 2-metilquinoxalina está entre aproximadamente 0,01 g/l y aproximadamente 2,5 g/l, un intervalo particularmente preferido está entre aproximadamente 0,1 g/l y aproximadamente 2,0 g/l. En las realizaciones de la presente invención en las que el microorganismo es un hongo seleccionado entre el grupo constituido por A. repens ATCC Nº 14849, A. repens ATCC Nº 74481, A. glauca ATCC Nº 22752, A. glauca ATCC Nº 74480 y los mutantes adecuados de los mismos, un intervalo de concentración preferido de 2-metilquinoxalina está entre aproximadamente 0,1 g/l y aproximadamente 2,0 g/l.

En las realizaciones de la presente invención en las que el microorganismo es una bacteria, un intervalo de concentración preferido de 2-metilquinoxalina está entre aproximadamente 0,01 g/l y aproximadamente 1,05,g/l, y un intervalo particularmente preferido está entre aproximadamente 0,1 g/l y aproximadamente 1,0 g/l. En las realizaciones de la presente invención en las que la bacteria se selecciona del grupo constituido por P. putida ATCC Nº 33015, P. putida ATCC Nº 202190 y los mutantes adecuados de los mismos, un intervalo de concentración preferido de 2-metilquinoxalina está entre aproximadamente 0,1 g/l y aproximadamente 1,0 g/l.

Además, y como se ha descrito anteriormentee, se debe inducir la bacteri que lleva un plásmido TOL, por ejemplo, P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190, requerida para la oxidación sujeto. En las realizaciones de la presente invención en las que P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190 se cultiva en un medio en un fermentador, el inductor, preferiblemente p-xileno, se añade a una velocidad preferida de adición entre aproximadamente 4,5 mmoles/l/hora y aproximadamente 6,5 mmoles/l/hora y a una velocidad particularmente preferida de adición entre aproximadamente 4,9 mmoles/l/hora y aproximadamente 6,1 mmoles/l/hora.

En las realizaciones de la presente invención en la que P. putida ATCC Nº 33015 o P. putida ATCC Nº 202190, está en un medio en un matraz, el inductor, preferiblemente p-xileno, se añade continuamente en forma gaseosa al medio. Como los expertos en la técnica entenderían de la presente descripción y de los artículos y patentes anteriormente mencionados (por ejemplo, la patente de estados Unidos 5.236.832), la concentración del inductor se selecciona habitualmente de manera que sea menor que la concentración mínima inhibitoria de las enzimas responsables de la oxidación. Véase también, Claus y Walker, J. Gen. Microbiol., 36: 107-122 (1964).

Cualquier procedimiento adecuado de poner en contacto el sustrato, 2-metilquinoxalina, con el microorganismo se puede usar en la presente invención. El sustrato se puede poner en contacto con el microorganismo en cualquier orden adecuado. Por ejemplo, 2-metilquinoxalina se puede añadir a un medio, tal como un caldo de cultivo, que comprende el microorganismo, libre o inmovilizado, o alguna combinación del mismo; o el medio puede comprender 2-metilquinoxalina y el microorganismo se puede después añadir a dicho medio; o 2-metilquinoxalina y el microorganismo se pueden añadir juntos a dicho medio; o bien 2-metilquinoxalina o el microorganismo se puede añadir a un disolvente adecuado que comprende el otro, o la 2-metoxiquinoxalina se puede adsorber a una resina; y similares. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva cómo modificar cualquier parte de los procedimientos sujetos según se desee.

Como se ha descrito anteriormente, en la presente invención se prefiere que el microorganismo sea A. glauca ATCC Nº 22752. Como también se ha descrito anteriormente, una muestra liofilizada de A. glauca ATCC Nº 22752 se depositó en la ATCC en los términos del tratado de Budapest en 13 de enero de 1999. A este cultivo recientemente depositado se le dio el nuevo número de depósito de ATCC Nº 74480. Por lo tanto, también se prefiere en la presente invención que el microorganismo sea A. glauca ATCC Nº 74480. Todas las restricciones en la disponibilidad para el público del cultivo de microorganismo así depositado, irrevocablemente se retirarán tras la concesión de una patente de la memoria descriptiva de la presente invención.

También como se ha descrito anteriormente, se prefiere especialmente en la presente invención que el microorganismo sea A. repens ATCC Nº 14849. Una muestra liofilizada de A. repens ATCC Nº 14849 se depositó en la ATCC en los términos del tratado de Budapest el 13 de enero de 1999. A este cultivo recientemente depositado se le dio el nuevo número de depósito de ATCC Nº 74481. Por lo tanto, también se prefiere en la presente invención que el microorganismo sea A. repens ATCC Nº 74481. Todas las restricciones en la disponibilidad para el público del cultivo de microorganismo así depositado, irrevocablemente se retirarán tras la concesión de una patente de la memoria descriptiva de la presente invención.

Los cultivos del hongo A. repens ATCC Nº 14849 (o A. repens ATCC Nº 74481, A. glauca ATCC Nº 22752, o A. glauca ATCC Nº 74480) se pueden obtener de la ATCC, y en un ejemplo de un procedimiento adecuado para la preparación de dichas existencias disponibles se proporciona inmediatamente más adelante. Los cultivos madres se pueden preparar a partir de cultivos de arroz tales como, por ejemplo, como sigue: matraces Erlenmeyer (250 ml) que contienen aproximadamente 50 g de arroz pardo y aproximadamente 20 ml de agua destilada se autoclavan a aproximadamente 121ºC durante aproximadamente 30 minutos, una suspensión de células vegetativas de A. repens ATCC Nº 14849 (o A. repens ATCC Nº 74481, A. glauca ATCC Nº 22752, o A. glauca ATCC Nº 74480), o esporas se prepara mediante la adición bien de un cultivo líquido o de un escobillón de un cultivo inclinado desarrollado en un medio de agar a agua estéril destilada. Cada matraz de arroz se inocula con aproximadamente 5 ml de la suspensión de esporas o de células y se incuba durante aproximadamente 10 días a aproximadamente 28ºC, momento en el que las existencias de esporas se preparan lavando el cultivo de arroz con aproximadamente 0,5% de una solución de Tween 80 en agua destilada, extrayendo por decantación la suspensión de esporas del arroz, y añadiendo entre aproximadamente 10% y aproximadamente 20% de glicerol. Las existencias de esporas se almacenan a aproximadamente -70ºC.

Como entenderán los expertos en la técnica de los hongos seleccionados, y como se proporciona específicamente posteriormente en esta memoria descriptiva en los ejemplos para los A. glauca ATCC Nº 22752 o ATCC Nº 74480 preferidos y el especialmente preferido A. repens ATCC Nº 14849º ATCC Nº 74481, un procedimiento adecuado para preparar el hongo seleccionado es como sigue: el hongo se inocula a partir de las células vegetativas congeladas o cultivo madre de esporas como se ha descrito anteriormente en un matraz o un tubo de vidrio con un cierre metálico que contiene un medio de crecimiento (que contiene una alícuota de una solución estéril que incluye Tween 80, glicerol y agua destilada) cuya composición se describe en más detalle más adelante. La fermentación se lleva a cabo e temperaturas que varían entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente 32ºC, y preferiblemente a aproximadamente 29ºC, con agitación adecuada, preferiblemente entre aproximadamente 200 rpm y aproximadamente 220 rpm, y más preferiblemente a aproximadamente 210 rpm. Si así se desea, el pH del medio de crecimiento se puede mantener mediante el uso de tampones adecuados incorporados en el medio de fermentación y/o ajustados periódicamente mediante la adición de cualquier base o ácido según se requiera. Un intervalo de pH preferido está entre aproximadamente pH 6 y aproximadamente pH 7.

Cualquier duración adecuada de crecimiento del microorganismo (por ejemplo, hongo, o bacteria), que pone en contacto el microorganismo con 2-metilquinoxalina, y la incubación del 2-metilquinoxalina con el microorganismo se puede usar en la presente invención. El crecimiento adecuado del microorganismo se puede llevar a cabo, por ejemplo, en aproximadamente 24 horas, tiempo en el que se puede añadir al cultivo bien (a) la propia 2-metilquinoxalina, (b) una alícuota adecuada de una solución de 2-metilquinoxalina en un disolvente adecuado, por ejemplo, no afecta indeseablemente el crecimiento o función de los microorganismos, preferiblemente EtOH o (c) 2-metilquinoxalina adsorbida a una resina. Después la incubación se puede continuar durante, por ejemplo, entre aproximadamente dos y aproximadamente veinticuatro horas, dependiendo de, por ejemplo, el recipiente en que se produce la bioconversión, el medio y las condiciones de incubación, por ejemplo, temperatura, pH y agitación. Después el caldo de incubación se puede extraer usando cualquier procedimiento de extracción adecuado, por ejemplo, (a) en el que un disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, EtOAc, metilisobutilcetona, metiletilcetona, cloruro de metileno y similares, preferiblemente EtOAc, separa los componentes orgánicos del caldo de incubación o (b) mediante adsorción del producto, ácido quinoxalinacarboxílico, en una resina adecuada, preferiblemente una resina adsorbente polimérica, más preferiblemente una resina seleccionada de las de nombre comercial Amberlite® (Rohm y Hass), más preferiblemente XAD4 (de las resinas Amberlite). Después de la extracción del caldo de incubación con un disolvente orgánico adecuado y la separación de las fases orgánicas y acuosas, los compuestos que comprenden el resto orgánico se puede determinar usando cualquier procedimiento adecuado, tal como por ejemplo, cromatografía. Alternativamente, después de la extracción del ácido quinoxalinacarboxílico del caldo de incubación usando una resina, el ácido quinoxalinacarboxílico, se puede eluir de la misma usando un disolvente adecuado, preferiblemente EtOAc o MeOH y después cristalizado con, por ejemplo, EtOAc, usando por ejemplo EtOAc y MeOH.

Cualquier medio de crecimiento adecuado se puede usar en el procedimiento de la presente invención, y el medio de crecimiento contendrá una fuente o fuentes de carbono asimilable, nitrógeno asimilable y sales orgánicas que contienen minerales esenciales. En general, muchos carbohidratos tales como, por ejemplo, glucosa, maltosa, manosa, sacarosa, almidón, glicerina, gelatina de mijo, melazas, aceite de soja y similares, se pueden usar como fuentes de carbono asimilable. Las fuentes de nitrógeno asimilable incluyen, por ejemplo, materiales tales como hidrolizados de levadura y caseína, levadura primaria, extractos de levadura, harina de semilla de algodón, sólidos de soja, germen de trigo, extractos de carne, peptona, licor de macerado de maíz y sales de amonio. Los nutrientes de sales inorgánicas adecuados para uso en el medio de cultivo de la presente invención incluyen, por ejemplo, las sales habituales que contienen sodio, hierro, magnesio, potasio, cobalto, fosfato y similares.

Más particularmente, los componentes de medio de crecimiento adecuados para uso en la presente invención cuando los microorganismos es un hongo incluyen, por ejemplo, licor de macerado de maíz, sólidos de macerado de maíz, Pharmamedia® y extracto de malta. El medio de licor de macerado de maíz se prepara con aproximadamente 40 g/l de licor de macerado de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajusta hasta aproximadamente pH 4,85 antes de la esterilización. El medio de sólidos de macerado de maíz se prepara con entre aproximadamente 20 g/l y aproximadamente 40 g/l de sólidos de macerado de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajustó hasta aproximadamente pH 4,85 antes de esterilización. Otro medio adecuado para uso en los procedimientos de la presente invención se prepara con aproximadamente 20 g/l de Pharmamedia® y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajusta hasta aproximadamente 7,2 antes de la esterilización. El medio de extracto de malta se prepara con aproximadamente 10 g/l de extracto de malta, aproximadamente 10 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de peptona y aproximadamente 2 g/l de extracto de levadura, y se ajusta hasta aproximadamente 7 antes de esterilización. Otro medio adecuado para uso en los procedimientos de la presente invención se prepara con aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5g/l de sémola de soja, aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCl y aproximadamente 5 g/l de K_{2}HPO_{4}, con el pH ajustado hasta aproximadamente pH 7,0 con H_{2}SO_{4} antes de la esterilización. Un medio adecuado de crecimiento particularmente preferido para los hongos para el procedimiento presente es el medio de sólidos de macerado de maíz mencionado anteriormente.

Como se ha descrito anteriormente, en la presente invención se prefiere particularmente que el microorganismo sea P. putida ATCC Nº 33015. Como se ha descrito anteriormente, una muestra liofilizada de P. putida ATCC Nº 33015 se depositó en la ATCC bajo el término del tratado de Budapest el 13 de enero de 1999. A este cultivo recientemente depositado se le dio el nuevo número de depósito de ATCC Nº 202190. Por lo tanto, también se prefiere en la presente invención que el microorganismo sea P. putida ATCC Nº 202190. Todas las restricciones en la disponibilidad para el público del cultivo de microorganismo así depositado, irrevocablemente se retirarán tras la concesión de una patente de la memoria descriptiva de la presente invención.

Además, los medios de crecimiento para uso en la presente invención en los que el microorganismo es una bacteria incluyen cualquier medio conocido adecuado, por ejemplo, caldo Nutritivo (aproximadamente 32 g/l, Becton Dickinson Microbiology Systems) y glicerol (aproximadamente 5 g/l). Como entenderían los expertos en la técnica para cualquier bacteria seleccionada, y como se proporciona específicamente posteriormente en esta memoria descriptiva en los ejemplos para P. putida ATCC Nº 33105, un procedimiento adecuado para la preparación de la bacteria seleccionada es como sigue: la bacteria se inocula a partir de un cultivo madre congelado preparado como se sabe en la técnica (aproximadamente unas existencias de glicerol al 17%) en un matraz o tubo de vidrio con un cierre metálico o un fermentador que contiene un medio de crecimiento (que contiene una alícuota de una solución estéril que incluye Tween 80, glicerol y agua destilada) cuya composición se describe con más detalle más adelante. La fermentación se lleva a cabo a temperaturas que varían entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 40ºC, y preferiblemente a temperaturas que varían entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente 32ºC, con agitación adecuada, preferiblemente entre aproximadamente 200 rpm y aproximadamente 220 rpm, y más preferiblemente, a aproximadamente 210 rpm. Cuando se desee, el pH del medio de crecimiento se puede mantener mediante el uso de los tampones adecuados incorporados en el medio de fermentación y/o se ajusta periódicamente mediante la adición de bien una base o ácido según se requiera. Un inóculo preferido está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 20% v/v (inóculo/medio). Un intervalo preferido de pH está entre aproximadamente 6 y aproximadamente pH 8.

Se debe destacar que con referencia a los tampones particulares, medios, reactivos, condiciones de contacto o cultivo, cantidad de sustrato, cantidad de inductor cuando se usa, y similares, en cualquier parte de la presente descripción no se tiene la intención de que sean limitantes, pero se debe leer que incluyen todos estos materiales relativos que los expertos en la técnica reconocerían que son de interés o valor en el contexto particular en el que se presenta la descripción en esta memoria descriptiva. Por ejemplo, a menudo es posible sustituir un sistema de tampón o medio de cultivo por otro, de manera que se use una forma diferente pero conocida para lograr los mismos objetivos como a los que se refiere el uso de un procedimiento, material o composición sugerida. Además, se entenderá que la presente invención incluye la adaptación a la escala del procedimiento sujeto para propósitos comerciales.

La oxidación microbiana objeto de la invención además comprende opcionalmente el aislamiento del producto deseado, ácido 2-quinoxalinacarboxílico. El ácido 2-quinoxalinacarboxílico se puede aislar como se describe más adelante a partir del medio en el que se lleva a cabo el procedimiento novedoso de oxidación y, más específicamente, a partir de los compuestos intermedios que se han producido pero no convertido completamente a ácido 2-quinoxalinacarboxílico dependiendo de, por ejemplo, el microorganismo seleccionado y las condiciones de incubación.

Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para aislamiento y/o purificación de los intermedios o el producto deseado del procedimiento sujeto en la presente invención incluyendo filtración, extracción, cristalización, cromatografía en columna, cromatografía en capa fina, cromatografía preparativa líquida de baja presión, HPLC, adsorción por resina, o cualquier combinación adecuada de dichos procedimientos.

Los ejemplos detallados proporcionados más adelante muestran que un grupo de microorganismos, específicamente, hongos y bacterias, oxidan la 2-metilquinoxalina para producir el ácido 2-quinoxalinacarboxílico que después de puede separar de cualquier 2-metilquinoxalina inalterada no deseada, o cualquier compuesto intermedio, y además reaccionar según los procedimientos bien conocidos en la técnica para producir, por ejemplo, los compuestos de la aplicación 801.

Aunque la presente descripción se refiere principalmente al uso de microorganismos intactos en los procedimientos objeto de la invención, los expertos en la técnica comprenderán que los procedimientos microbianos objeto de la invención se puede lograr mediante las preparaciones adecuadas de los mismos, por ejemplo, las preparaciones de células rotas y deshidratadas, los materiales extraídos que comprenden las enzimas microbianas capaces de llevar a cabo las oxidaciones sujetos, o las enzimas por sí mismas, junto con los cofactores necesarios y similares.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos. La descripción anterior y siguiente de la presente invención y las diversas realizaciones no tienen la intención de ser limitantes de la invención sino más bien son ilustrativas de las misma. Por lo tanto, se entenderá que la invención no se limita a los detalles específicos de estos ejemplos.

Ejemplo I Oxidación de 2-metilquinoxalina en cultivos en tubo usando A. repens ATCC Nº 14849 A. Bioconversión usando el hongo A. repens ATCC Nº 14849

Tres cultivos de "ensayo" (T1, T2 y T3) se prepararon como sigue: aproximadamente 2,5 ml de medio de crecimiento estéril (aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de sémola de soja, aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCl y aproximadamente 5 g/l de K_{2}HPO_{4} con el pH ajustado hasta aproximadamente pH 7,0 con H_{2}SO_{4} antes de esterilización) se añadió a cada uno de los tres tubos de vidrio de 16 x 125 mm teniendo cada uno un cierre metálico (T1, T2 y T3), seguido de la adición de esporas (aproximadamente 1% v/v de cultivo madre de esporas) de A. repens ATCC Nº 14849 a T1, T2 y T3.

Tres cultivos en tubo se incubaron a aproximadamente 29ºC, con agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de aproximadamente 48 horas (T1), 72 horas (T2) o 96 horas (T3), se añadieron a los cultivos en tubo aproximadamente 0,05 ml de solución madre (aproximadamente 50 mg/ml en aproximadamente 100% de EtOH, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml) de 2-metilquinoxalina.

Después de una incubación adicional a aproximadamente 29ºC (véase la tabla 2 más adelante), los caldos de fermentación de los cultivos en tubo se ajustaron hasta aproximadamente pH 2 con HCl 4 N. Los contenidos de cada cultivo en tubo se extrajeron con un volumen igual de EtOAc (limpio): se añadió el EtOAc, el cultivo en tubo se agitó en un aparato Vortex y después se centrifugó a aproximadamente 2.000 rpm (centrífuga IEC). Se retiró la fase de EtOAc y la fase acuosa se extrajo por segunda vez. Los extractos orgánicos combinados se secaron, en atmósfera de nitrógeno, en un baño de agua a aproximadamente 50ºC.

B. Rendimiento de ácido 2-quinoxalinacarboxílico determinado mediante HPLC de fase inversa

Cada uno de los extractos, preparados como se ha descrito anteriormente, se resuspendió en aproximadamente un ml de ACN:agua (1:9, v/v), y se analizó aproximadamente 20 \ssearrow l de cada extracto resuspendido mediante la inyección en una columna de HPLC: columna de HPLC Inertsill® C8 (4,6 x 250 mm. Column Engineering, Inc). Los compuestos contenidos en cada extracto resuspendido inyectado se separaron isocráticamente a aproximadamente 1,0 ml por minuto en una fase móvil (ACN:0,05% de TFA acuoso, 1:4, v/v). En estas condiciones, el ácido 2-quinoxalinacarboxílico eluido a aproximadamente 8,6 minutos y 2-metilquinoxalina eluida a aproximadamente 15 minutos. Los rendimientos de ácido 2-quinoxalinacarboxílico se determinaron a partir de dichos análisis de HPLC durante varios conjuntos de condiciones experimentales (es decir, T1, T2 y T3) y estos rendimientos se proporcionan en la tabla 2 más adelante.

TABLA 2

Cultivo	Tiempo de adición de	Concentración	Tiempo de	Rendimiento
	sustrato (días)	inicial de sustrato (g/l)	incubación (días)	(%)
T1	2	1	18	56
T2	3	1	14	76
T3	4	1	16	79

Como se ilustra por los datos de T1, T2 y T3 de la Tabla 2, el análisis de HPLC muestra que el procedimiento microbiano sujeto da como resultado 56%, 76% y 79% de rendimiento, respectivamente, del ácido 2-quinoxalinacarboxílico deseado.

De acuerdo con lo anterior, la inclusión del microorganismo intacto, es decir A. repens ATCC Nº 14949, da como resultado la oxidación de 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico, y una cantidad sustancial de ácido 2-quinoxalinacarboxílico permanece intacta.

Ejemplo II Oxidación de 2-metilquinoxalina en cultivos en tubo usando A. repens ATCC Nº 14849 en cuatro medios de crecimiento diferentes A. Preparación de cuatro medios de crecimiento diferentes

El medio 1 se preparó con aproximadamente 40 g/l de licor de macerado de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajustó hasta aproximadamente pH 4,85 antes de la esterilización.

El medio 2 se preparó con aproximadamente 40 g/l de sólidos de macerado de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajustó hasta aproximadamente pH 4,85 antes de la esterilización.

El medio 3 se preparó con aproximadamente 20 g/l de Pharmamedia® y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajustó hasta aproximadamente pH 7,2 antes de la esterilización.

El medio 4 se preparó con aproximadamente 10 g/l de extracto de malta, aproximadamente 10 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de peptona y aproximadamente 2 g/l de extracto de levadura, y se ajustó hasta aproximadamente pH 7 antes de la esterilización.

B. Bioconversión usando el hongo A. repens ATCC Nº 14849

Ocho cultivos de "ensayo" (T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a y T4b) se prepararon como sigue: aproximadamente 2,5 ml de medio de crecimiento estéril (Medio 1, medio 2, Medio 3 y Medio a, respectivamente) se añadieron a cada uno de los ocho tubos de vidrio de 16 x 125 mm teniendo cada uno un cierre metálico (T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a y T4b) seguido de la adición de esporas (aproximadamente 1% v/v de cultivo madre de esporas) de A. repens ATCC Nº 14849 a todos los cultivos en tubo.

Los ocho cultivos en tubo se incubaron a aproximadamente 29ºC, con agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de aproximadamente bien 48 horas (T1a, T2a, T3a y T4a) o aproximadamente 72 horas (T1b, T2b, T3b y T4b) aproximadamente 0,05 ml de una solución madre (aproximadamente 50 mg/ml en DMSO, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml) de 2-metilquinoxalina se añadió a los cultivos en tubo.

Después de una incubación adicional a aproximadamente 29ºC durante 12 días, se extrajo el caldo de fermentación de cada cultivo en tubo y los extractos orgánicos combinados se secaron como se ha descrito en el ejemplo I.

C. Rendimiento de ácido 2-quinoxalinacarboxílico determinado mediante HPLC de fase inversa

Cada uno de los extractos, se preparó como se ha descrito anteriormente, después se procesó y se analizó mediante HPLC de fase inversa como se ha descrito en el ejemplo I. Los rendimientos de ácido 2-quinoxalinacarboxílico se determinaron a partir de dichos análisis de HPLC durante varios conjuntos de condiciones experimentales (es decir, T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a y T4b) y estos rendimientos se proporcionan en la tabla 3 más adelante.

TABLA 3

Medio	Cultivo	Tiempo de adición de	Rendimiento (%)
		sustrato (días)
1	T1a	2	36
	T1b	3	43
2	T2a	2	73
	T2b	3	69
3	T3a	2	49
	T3b	3	52
4	T4a	2	31
	T4b	3	28

Como se ilustra por los datos de Tabla 3, el análisis de HPLC muestra que el procedimiento microbiano sujeto en el que el microorganismo es A. repens ATCC Nº 14849 da como resultado la producción del ácido 2-quinoxalinacarboxílico en todos los medios ensayados. Los datos de la tabla 3 también indican que, de los cuatro medios ensayados, el medio 2 proporcionó el mayor % de rendimiento del producto deseado, ácido 2-quinoxalinacarboxílico.

Ejemplo III Oxidación de 2-metilquinoxalina en cultivos en matraz usando A. repens ATCC Nº 14849 o A. glauca ATCC Nº 22752 A. Bioconversión usando el hongo A. repens ATCC Nº 14849 o el hongo A. glauca ATCC Nº 22752

Cuatro cultivos de "ensayo" (T1a, T1b, T2a y T2b) se prepararon como sigue: aproximadamente 25 ml de medio de crecimiento estéril (aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de sémola de soja, aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCl y aproximadamente 5 g/l de K_{2}HPO_{4} con el pH ajustado hasta aproximadamente pH 7,0 con H_{2}SO_{4} antes de esterilización) se añadieron a cada uno de los cuatro matraces cónico (300 ml), seguido de la adición de esporas (aproximadamente 1% v/v de cultivo madre de esporas) de A. repens ATCC Nº 14849 (T1a, T1b) o A. glauca ATCC Nº 22752 (T2a, T2b).

Los cuatro cultivos en matraz se incubaron a aproximadamente 29ºC, con agitación a aproximadamente 210 rpm. Inmediatamente después de la inoculación (T2a), o después de aproximadamente 24 horas (T2b), se añadieron aproximadamente 0,5 ml de solución madre (aproximadamente 50 mg/ml en aproximadamente 100% de EtOH, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml) de 2-metilquinoxalina a los cultivos en matraz de A. glauca ATCC Nº 22752 y después de aproximadamente 48 horas (T1a) o 72 horas (T1b), se añadieron aproximadamente 0,5 ml de una solución madre (aproximadamente 50 mg/ml en aproximadamente 100% de EtOH, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml) de 2-metilquinoxalina a los cultivos en matraz de A. repens ATCC Nº 14849.

Después de una incubación adicional a aproximadamente 29ºC durante 24 (T1a), 16 (T1b), 25 (T2a) o 24 (2b) días, los caldos de fermentación de lo cultivos en matraz se ajustaron hasta aproximadamente pH 2 con HCl 4 N. Los contenidos de cada cultivo en matraz se extrajeron con dos alícuotas de 25 ml de EtOAc, y el disolvente se retiró de los extractos de EtOAc a presión reducida para producir los productos brutos.

B. Rendimiento de ácido 2-quinoxalinacarboxílico determinado mediante HPLC de fase inversa

Cada uno de los extractos, preparado como se ha descrito anteriormente, se resuspendió en aproximadamente 5 ml de MeOH:ACN (3:2, v/v) y se diluyó 1:19 con agua para análisis de HPLC. Los análisis de HPLC se realizaron como se ha descrito en el ejemplo I. Los rendimientos de ácido 2-quinoxalinacarboxílico se determinaron a partir de dichos análisis de HPLC durante varios conjuntos de condiciones experimentales (es decir, T1a, T1b, T2a y T2b) y estos rendimientos se proporcionan en la tabla 4 más adelante.

TABLA 4

Cultivo	Tiempo de adición	Concentración	Tiempo de	Rendimiento
	de sustrato (días)	inicial de sustrato (g\l)	incubación (días)	(%)
T1a	2	1	24	80
T1b	3	1	16	72
T2a	0	1	25	44
T2b	1	1	24	53

Como se ilustra por los datos de Tabla 4, la inclusión del microorganismo intacto, es decir A. glauca ATCC Nº 22752 o A. repens ATCC Nº 14849, da como resultado la oxidación de 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico. El % del material de partida, es decir 2-metilquinoxalina, que permanece en T1a, T1b, T2a y T2b es aproximadamente 7%, 7%, 6% y 6%, respectivamente.

Ejemplo IV Selección para la conversión microbiana de 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico

Se desarrollaron células de diversos microorganismos en los tubos que contenían 2,5 ml del medio de dextrosa, sémola de soja en el ejemplo I. Los tubos individuales se inocularon con esporas o células vegetativas (aproximadamente 1% v/v de cultivo madre de esporas o células vegetativas) de diversos microorganismos almacenados en forma de suspensiones en glicerol congeladas y se incubaron a aproximadamente 29ºC con agitación (210 rpm) en un agitador rotatorio. Después de aproximadamente 48 horas, se añadieron 0,05 ml de una solución 10 mg/ml de 2-metilquinoxalina en DMSO a cada uno de los tubos. Después de aproximadamente 4 días de incubación, se extrajo el contenido de cada tubo, y los extractos individuales se analizaron mediante HPLC como se ha descrito en el ejemplo I. Los rendimientos de ácido 2-quinoxalinacarboxílico se determinaron mediante HPLC y los resultados se resumen en la tabla 5.

TABLA 5

Cultivo fúngico, Nº de ATCC	Rendimiento (%)
A. Glauca, 22752	83
A.repens, 14849	83
A. tamarii, 16865	53
A. solani, 11078	53
P. glabrum, 11080	47
D. gossypina, 20575	31
C. echinulata, 8983	25

Ejemplo V Oxidación de 2-metilquinoxalina en cultivos en matraz usando P. putida ATCC Nº 33015

Se desarrollaron células de P. putida ATCC nº 33015 en medio 5 (caldo nutritivo (aproximadamente 32 g/l) y glicerol (aproximadamente 5 g/l)). Seis matraces cónicos (300 ml) que contenían aproximadamente 30 ml de medio se inocularon con aproximadamente 0,10 ml de suspensión en glicerol de P. putida ATCC nº 33015 previamente almacenada a aproximadamente -70ºC. Después de añadir aproximadamente 2 ml de p-xileno contenido en un tubo de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml (Falcon®, Becton Dickinson Labware) los matraces se cerraron herméticamente con Parafilm®, (American National Can) y se agitaron (aproximadamente 225 rpm) en un agitador rotatorio durante aproximadamente 18 horas a aproximadamente 29ºC. Estos cultivos en matraces tenían una densidad óptica de aproximadamente 1,9 medida a 650 nm. Las células se recogieron de los seis matraces mediante centrifugación, se lavaron una vez más con aproximadamente 250 ml de DBPS, y se resuspendieron en aproximadamente 20 ml de PBS (Biowhittaker) en un matraz cónico de 300 ml.

La bioconversión se comenzó mediante la adición de aproximadamente 0,1 ml de una solución de aproximadamente 100 mg/ml de 2-metilquinoxalina en DMSO, correspondiente a una concentración inicial de aproximadamente 0,5 g/l. La incubaciones se continuaron durante aproximadamente 4 días a aproximadamente 29ºC con agitación a aproximadamente 225 rpm. Las muestras de caldo de bioconversión se retiraron a diversos tiempos y, después de retirar las células mediante centrifugación, y dilución con MeOH según se requiera, se analizaron mediante HPLC. Aproximadamente 20 \mul de cada una de estas muestras se analizaron mediante inyección en una columna de HPLV Inertsill® C8 (4,6 x 250 mm). Cada columna se eluyó a aproximadamente 1,0 ml/min con una fase móvil que consistía en ACN:aproximadamente 0,05% de TFA acuoso (1:4, v/v). Los rendimientos de ácido 2-quinoxalinacarboxílico eran aproximadamente 86%, 90% y 94% después de 1, 2 y 4 días de incubación, respectivamente.

Ejemplo VI Oxidación de 2-metilquinoxalina en un cultivo en fermentador usando P. putida ATCC Nº 33015

P. putida ATCC Nº 33015 se desarrolló en un fermentador con aproximadamente 10 l de medio 5. El fermentador se inoculó con seis cultivos de P. putida cada uno desarrollados en un matraz cónico (300 ml) que contenía aproximadamente 50 ml de medio 5. Cada cultivo en matraz se inoculó con aproximadamente 175 \mul de unas existencias de esporas de P. putida ATCC Nº 33015, se insertó un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml que contenía aproximadamente 2 ml de p-xileno, y el matraz se cerró herméticamente con Parafilm®. Estos cultivos en matraces se incubaron a aproximadamente 29ºC durante aproximadamente 17 horas con agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de la inoculación del fermentaador con los cultivos de los matraces, se añadió p-xileno al fermentador en alícuotas de aproximadamente 2 ml aproximadamente cada 20 minutos durante 2 horas. Más tarde, se añadieron aproximadamente alícuotas de 2,5 ml de p-xileno al fermentador aproximadamente cada 20 minutos durante aproximadamente 3,5 horas. Después se interrumpió la adicción de xileno y se añadió 2-metilquinoxalina a aproximadamente 5,25 horas (aproximadamente 1,95 g) y aproximadamente 7,75 horas (aproximadamente 7,76 g) después de la inoculación. Se continuó la incubación durante aproximadamente 22 horas después de la adicción final de 2-metilquinoxalina. Se centrifugó una muestra del medio de incubación para separar las células, se diluyó con MeOH y se analizó mediante HPLC usando el procedimiento descrito en el ejemplo V. Este análisis reveló aproximadamente un 81% de rendimiento de ácido 2-quinoxalinacarboxílico.

Claims (37)

1. Un procedimiento para la oxidación microbiana de 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico que comprende poner en contacto dicha 2-metilquinoxalina con un microorganismo e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para producir una cantidad de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico, en el que dicho microorganismo se selecciona entre el grupo constituido por Absidia glauca ATCC Nº 22752, Absidia glauca ATCC Nº 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC Nº 24169, Absidia repens ATCC Nº 14849, Absidia repens ATCC Nº 74481, Actinomucor elegans ATCC Nº 6476, Alternaria solani ATCC Nº 11078, Aspergillus tamarii ATCC Nº 16865, Coniophora puteana ATCC Nº 12675, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8983, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 9244, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 9245, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 26269, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 31690, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 36112, Cunninghamella homothallica ATCC Nº 16161, Cylindrocarpon destructans ATCC Nº 66963, Diplodia gossypina ATCC Nº 20575, Epicoccum neglectum ATCC Nº 12723, Glomerella lagenana ATCC Nº 14724, Penicillium claviforme ATCC Nº 10426, Penicillium duclauxii ATCC Nº 10440, Penicillium glabrum ATCC Nº 11080, Pseudocochliobolus lunatus ATCC Nº 24155, Pseudomonas putida ATCC Nº 33015, Pseudomonas putida ATCC Nº 202190, Rhodococcus rhodochrous ATCC Nº 19067 y Thamnostylum piriforme ATCC Nº 8686; y los mutantes adecuados de los mismos; con tal que cuando dicho microorganismo sea dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 o dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 202190, dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015, o dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 202190 se induce mediante la interacción con un inductor antes de dicha puesta en contacto de dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 o dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 22190 con dicha 2-metilquinoxalina.

2. El procedimiento según se ha definido en la reivindicación 1 que comprende además el aislamiento del ácido 2-quinoxalinacarboxílico.

3. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 2, en el que dicho aislamiento se lleva a cabo mediante extracción de dicha mezcla con un disolvente orgánico.

4. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 3, en el que dicho disolvente orgánico es acetato de etilo.

5. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 4 que comprende además someter dicha extracción a cromatografía.

6. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 2, en el que dicho aislamiento se lleva a cabo mediante adsorción de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico de dicha mezcla en una resina y elución de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico adsobido de dicha resina con un disolvente orgánico.

7. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 6, en el que dicha resina es una resina adsorbente polimérica.

8.El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 7, en el que dicho disolvente orgánico es acetato de etilo o metanol.

9. El procedimiento según se ha definido en la reivindicación 8 que comprende además la cristalización de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico con acetato de etilo.

10. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 8 que comprende además la cristalización de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico con acetato de etilo y metanol.

11. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo es un microorganismo intacto.

12. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 11, en el que dicho microorganismo comprende células lavadas de dicho microorganismo.

13. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 12 que comprende además la inmovilización de dichas células lavadas.

14. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 12, en el que dichas células lavadas están en un disolvente acuoso.

15. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 14, en el que dicho contacto es mediante la adición de dicho 2-metilquinoxalina a dicho disolvente.

16. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 11, en el que dicho microorganismo está en un medio de crecimiento.

17. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 16, en el que dicha puesta en contacto es mediante la adición de 2-metilquinoxalina a dicho medio de crecimiento.

18. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por dichos Absidia glauca ATCC Nº 22752, Absidia glauca ATCC Nº 74480, Absidia repens ATCC Nº 14849, Absidia repens ATCC Nº 74481, Alternaria solani ATCC Nº 11078, Aspergillus tamarii ATCC Nº 16865, Cunninghamella echinulata ATCC Nº 8983, y Diplodia gossypina ATCC Nº 20575; y dichos mutantes de los mismos.

19. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 18, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por dichos Absidia glauca ATCC Nº 22752, Absidia glauca ATCC Nº 74480, Absidia repens ATCC Nº 14849, Absidia repens ATCC Nº 74481, Alternaria solani ATCC Nº 11078, Aspergillus tamarii ATCC Nº 16865; y dichos mutantes de los mismos.

20. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 19, en el que dicho microorganismo se selecciona del grupo constituido por dichos Absidia glauca ATCC Nº 22752, Absidia glauca ATCC Nº 74480, Absidia repens ATCC Nº 14849 y Absidia repens ATCC Nº 74481; y dichos mutantes de los mismos.

21. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 20, en el que dicho microorganismo es Absidia repens ATCC Nº 14849 o Absidia repens ATCC Nº 74481.

22. Un procedimiento para la oxidación microbiana de 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico que comprende poner en contacto dicha 2-metilquinoxalina con un microorganismo e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para producir una cantidad de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico, en el que dicho microorganismo es Absidia glauca ATCC Nº 14849 o Absidia repens ATCC Nº 74481; y los mutantes adecuados de los mismos.

23. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 22, en el que dicho microorganismo está en un medio de crecimiento.

24. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 23, en el que dicho contacto es mediante la adición de dicha 2-metilquinoxalina a dicho medio de crecimiento.

25. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo es dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 o dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 202190.

26. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 25, en el que dicho inductor en p-xileno.

27. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 26, en el que dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 o dicha Pseudomonas putida ATCC Nº 202190 está en un medio de crecimiento.

28. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 27, en el que dicho p-xileno se añade a dicho medio de crecimiento.

29. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 28, en el que dicho medio de crecimiento está en un matraz.

30. El procedimiento definido en la reivindicación 29, que comprende además la etapa de recoger dicho microorganismo después de la finalización de dicha inducción.

31. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 30, en el que dicha recogida es mediante la centrifugación del contenido de dicho matraz, decantando el fluido, lavando el sedimento celular y resuspendiendo dicho sedimento en un tampón.

32. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 31, en el que dicho contacto es mediante la adición de dicha 2-metilquinoxalina a dicho tampón después de dicha resuspensión.

33. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 28, en el que dicho medio de crecimiento está en un fermentador.

34. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 33, en el que dicha adición de dicho p-xileno a dicho medio de crecimiento se interrumpe después de dicha inducción.

35. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 34, en el que dicho contacto es mediante la adición de dicha 2-metilquinoxalina a dicho medio de crecimiento después de dicha interrupción de dicho p-xileno.

36. Un procedimiento para la oxidación microbiana de 2-metilquinoxalina a ácido 2-quinoxalinacarboxílico que comprende poner en contacto 2-metilquinoxalina con un microorganismo después de que las enzimas de dicho microorganismo se inducen mediante la interacción con un inductor y se incuba la mezcla resultante en condiciones suficientes para producir una cantidad de dicho ácido 2-quinoxalinacarboxílico, en el que dicho microorganismo se selecciona entre el grupo constituido por Pseudomonas putida ATCC Nº 33015 y Pseudomonas putida ATCC Nº 202190; o los mutantes adecuados de los mismos.

37. El procedimiento como se ha definido en la reivindicación 36, en el que dicho inductor en p-xileno o m-xileno.