TWI223004B - Microbial conversion of 2-methylquinoxaline - Google Patents

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1223004 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（1 ) 本發明係關於2 -喹噁啉羧酸之製法，尤其關於將2 -甲基d奎噁啉予以微生物氧化成2 一喹噁啉羧酸之方法。 發明之背景 技藝中已知將某些芳族雜環予以微生物氧化，尤其將 位於某些芳族雜環上之甲基團予以微生物氧化之方法，諸 如於下列兩篇論文中所述者：、、Gene Order of the TOL Catabolic Plasmid Upper Pathway Oppron and Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol by the xy 1A Product" by S . Harayama e^al., J. Bacteriol., 1 6 7 ( 2 ): 4 5 5 — 4 6 1 ( 1 9 8 6 )及、、Enzymatic Oxidation of

Methyl Groups on Aromatic Heterocycles : A Versatile Method for the Preparation of Heteroaromatic Carboxylic Acids, 〃 by A. Keiner, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 31 (6) :774 - 775 (1992)。 美國專利第4，8 5 9 ，5 9 2號揭示皮考啉酸之微 (： 生物製法，其可繼而藉化學方法轉換成吼I淀產物。 美國專利第 5 ，104，798 ; 5 ，213 ， 973及5，236 ’ 832揭示將某些芳族5 —或6 -節環之雜環中之甲基團予以微生物氧化成相關竣酸之方法 ，其係藉使用假單胞菌種並使用甲苯’二甲苯或傘花烴作 爲誘導劑來進行’如同本文中所述’技藝中已將甲苯中之 甲基團藉惡臭假單胞菌（Pseudomenas putida ) A T C C 3 3 0 1 5號k型而氧化成苯甲酸之方法乃包括 (210 χ 297^¾) ~ ' J · _ —裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 ___B7___ 五、發明說明（2 ) 分別被甲苯單氧酶，醇去氫酶及醛去氫酶催化之三個步驟 〇 如同稍早上述Harayama等人之論文中所述，惡臭假 單胞菌m t — 2之T 〇 L質粒p W W〇爲可傳送式染色體 外兀素，彼乃編有所有供將·一些芳族烴，包括甲苯，間位 -二甲苯及對位-二甲苯進行氧化分解代謝所需之酵素之 密碼。帶有T〇L質粒之細菌，例如惡臭假單胞菌 A T C C 3 3 0 1 5號，可將某些芳族烴轉換成其相關之 芳族羧酸：編有二甲苯降解作用酵素密碼之X y 1操縱子 及負責xy 1基因調節之基因均座落在TO L質粒 p W W 0上，編有供上述氧化作用所需酵素密碼之T〇L 質粒p W W 0上之基因需予誘導以製造此酵素，因此，此 誘導作用之說明乃述於上述美國專利5，104，798 ;5，213，973;及5，236，832號中。 如同 Gaucher 等人於 Dev. Ind. Microbiol.，2 2 : 219 — 232 (1981)之論文中所述，灰黃青黴（ Penicillium gnseo fulvum )乃包含三種供將間位—甲酚轉 換成間位-羥基苯甲酸之酵素：間位-甲酚甲基羥化酶， 間位-羥基苄醇去氫酶及間位-羥基苯甲醛羥化酶。 再次地說明，如同技藝中已知，某些黴菌及細菌乃包 含供將位於某些芳族環上之甲基團氧化成其相關羧酸之酵 素，故而已知位於此雜芳族環上之甲基團可使用微生物而 氧化成其相關之羧酸。如同熟知技藝者所知，此微生物氧 化作用之化學及光學產^通常實質上依（例如）所選擇之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 5- J / 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223004 A7 B7 五、發明說明（3 ) 特定微生物，基質濃度’基質結構等而 如今 實質地將 此主題法 19 6 0/0 ^如今爲 請書P C 噁啉羧酸 疫病症之 供之2 — 本文 文中以供 變化。 已發現有一系列之微生物’包括黴菌及細菌’可 2 —甲基喹噁啉氧化成2 -喹噁啉羧酸。此外， 得以適當復收2 -喹噁啉羧酸 98年2月5日提出之美國暫 7 3，8 0 1 號（ 亦即、8 1999年1月18日提出之 T/IB99/00067 號 作爲中間體以合成有用以治療 新穎二羥基己酸之用途。本發 〇奎噁啉羧酸可用以合成此二羥 所引用之所有文件，包括前述 參考。 時專利 〇 1專利申請書） 國際p c T專利申 ，揭示使用2 -喹 例如炎症及其它免 明新穎方法中所提 基己酸。 者，均整體倂入本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明之略要說明 本發明係關於由2 —甲基喹噁啉中製備2 - d奎噁啉羧 酸之微生物學製法。 尤其，本發明係關於式I化合物之微生物學製法。 ^yC〇〇H k I 其係藉令式I I化合物、N] ii 爲可完成將式I I化合物中之甲基團氧化成式I化合物中

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 -6 - J 』 --------11*-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223004 A7 B7 五、發明說明（6 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 主題方法乃任更進一步包含藉任何適當方法將期望產 物，2 -喹噁啉羧酸，離析之作用，例如，反應混合物可 以有機溶劑，最好乙酸乙酯萃取，而後可將萃取材料予以 色層分離。另外，可將2 -喹噁啉羧酸由反應混合物中吸 附至樹脂，最好至聚合性吸附樹脂上，使用有機溶劑最好 乙酸乙酯由其中洗提出，再使用有機溶劑，或有機溶劑結 (合液，最好乙酸乙酯與甲醇之結合液由洗提之材料中結晶 出，此外，本法所製之2 -喹噁啉羧酸可以適當之鹼，例 如氫氧化鈉處理，因而形成2 -喹噁啉羧酸之鹽，例如鈉 鹽，2 -喹噁啉羧酸之鹼鹽可藉過濾法或離心法將細胞由 培養基中移除，繼而將不含細胞之培養基例如藉蒸發法濃 縮，而由生物轉換培養基中離析出。 主題微生物最好爲完整之微生物。 本發明之理想具體實施例中，微生物爲黴菌。 其中微生物爲黴菌之本發明理想具體實施例中，黴菌 係由犁頭黴，曲黴，鏈格孢，青黴，色二孢及小克銀漢黴 屬中所擇定。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其中微生物爲黴菌之本發明特別理想之具體實施例中 ，黴菌爲犁頭黴屬，其中微生物爲犁頭黴屬之黴菌之本發 明尤其理想之具體實施例中，微生物爲灰綠犁頭黴 A T C C 2 2 7 5 2號或灰綠犁頭黴7 4 4 8 0號，或其 適當突變種，或另爲製成遵守布達佩斯條約條款之任何寄 存之灰綠犁頭黴2 2 7 5 2號，或其適當突變種。 其中微生物爲犁頭黴1屬黴菌之本發明另一尤其理想之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSM4規格（210 X 297公釐） -9 - 1223004 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) 具體實施例中，微生物爲匍匐犁頭黴ATCC1 4 8 4 9 號或匍匐犁頭黴A T C C 7 4 4 8 1號，或其適當突變種 ’或另爲製成遵守布達佩斯條約條款之任何寄存之匍匐犁 頭黴ATCC 14849號，或其適當突變種。 本發明黴菌培養物之理想細胞密度由約1 〇至約3〇 克乾細胞重/升。 本發明之另一理想具體實施例中，微生物爲細菌。 其中微生物爲細菌之本發明理想具體實施例中，細菌 係由假單胞菌及玫紅球菌屬中所擇定。 其中微生物爲細菌之本發明特別理想具體實施例中， 細菌爲假單胞菌屬。 其中微生物爲假單胞菌屬細菌之尤其理想具體實施例 中’微生物爲惡臭假單胞菌ATCC 33015號或惡臭 假單胞菌ATCC 202190號，或其適當突變種，或 另爲製成遵守布達佩斯條約條款之任何寄存之惡臭假單胞 菌ATCC 33015號，或其適當突變種。 本發明細菌培養物之理想細胞密度爲於6 5 0 n m下 可提供約1 0至約3 0光密度之密度。 如上文所論及，其中微生物爲惡臭假單胞菌A T C C 3 3 0 1 5號或惡臭假單胞菌A T C C 2〇2 1 .9〇號， 或其適當突變種之本發明具體實施例中，微生物乃在接合 之前或接合期間誘導，接合作用最好在微生物完全誘導之 後發生。理想之誘導劑包括對位-二甲苯及間位-二甲苯 ，特別理想之誘導劑爲位一二甲苯。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -10- J.----II-----^裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223004 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7 五、發明說明（8 ) 其中微生物爲惡臭假單胞菌A T C C 3 3 0 1 5號或 惡臭假單胞菌ATCC 202190號，或其適當突變種 ，且微生物係於燒瓶內之生長培養基中培養之理想具體實 施例中，乃在將微生物與2 -甲基喹噁啉接合之前，先將 誘導劑加至此生長培養基中，再於此生長培養基中保溫一 段足以實質完成此誘導作用之時間，在將上述2 -甲基喹 噁啉與上述微生物接合之前，將誘導微生物之細胞藉將燒 瓶內容物離心，將消耗之生長培養基（故而主題誘導劑） 移除（例如傾析），將細胞九劑淸洗，令九劑再懸浮於水 性培養基諸如D P B S ( Biowhittaker )中而收集。 其中微生物爲惡臭假單胞菌ATCC 3 3 0 1 5號， 或惡臭假單胞菌ATCC 202190號，或其適當突變 種，且主題微生物係於醱酵器內之生長培養基中培養時之 本發明另一理想具體實施例中，乃在微生物與2 -甲基喹 噁啉進行主題接合之前，先將誘導劑連續或一再地加至此 生長培養基中，再於此生長培養基中保溫一段足以實質完 成此誘導作用之時間，而後於將上述2 -甲基d奎噁啉與上 述微生物接合之前予以中止。 本發明之另一理想具體實施例中，主題接合作用係藉 將2 -甲基喹噁啉加至含有主題微生物且主題微生物爲黴 菌之生長培養基中而完成。其中主題接合作用係藉將2 -甲基喹噁啉加至含有主題黴菌之生長培養基中而完成之本 發明理想具體實施例中，生長培養基爲玉米浸泡固體培養 基。特別理想之玉米浸泡1固體乃包含約2 0克至約4 0克 紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Π 1 - ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------— —訂· I I----- 1223004 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（9 ) /升之玉米浸泡固體及約2 0克/升右旋糖，其具有約 4 . 8 5之p Η，另一理想之生長培養基乃包含約2 0克 / 升 Pharma media ® ( Trader Protein )及約 2 0 克 / 升 右旋糖，其具有約7 . 2之p Η。 本發明之尙另一理想具體實施例中，接合作用係藉將 已接合至樹脂上之式I I化合物加入，例如，參見，].丁. Vicenzi et al·， 、、Large-Scale Stereoselective enzymatic ketone reduction with in situ product removal via polymeric adsorbent resin, 、、Enzyme and Microbial

Technology，20 : 494 — 499 (1997)之論文 〇 本發明之尙另一理想具體實施例中，接合作用係藉將 2 -甲基喹噁啉加至含已淸洗微生物細胞之水性培養基中 而完成。 本發明之尙另一理想具體實施例中，乃在將微生物與 2 -甲基喹噁啉淸洗之前，先將微生物淸洗。其中在將微 生物與2 -甲基喹噁啉淸洗之前，先將微生物淸洗之本發 明理想具體實施例中，乃在接合之前，先將已淸洗之微生 物固定。 本發明之另一理想具體實施例中，乃在藉加入2 -甲 基喹噁啉至其中以完成接合作用之前，先令微生物於玉米 浸泡固體培養基中生長約二十四小時至約七十二小時。 本發明法乃更進一步任包含2 -喹噁啉羧酸之離析或 分離法，其係藉以有機溶劑萃取’吸附至樹脂上，結晶， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -12- J . 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223004 A7 ___B7__ 五、發明說明（1〇) 或如上所述，當提供2 -喹噁啉羧酸之鹼鹽時，乃將不含 細胞之培養基藉濃縮，藉蒸發法進行。 本發明更進一步包括使用2 -喹噁啉羧酸藉 ‘ 8 0 1專利申請書中所揭示之下列任何方法或藉使用任何 ( 其它方法以合成上述’ 8 0 1專利申請書中所揭示之新穎 二羥基己酸上之用途。 熟知技藝者乃完全了解本文用以說明本發明之專有名 詞；然而，本文所用之下列專有名詞乃如同下列立即所述 者。 &完整微生物〃乃意指微生物之細胞實質上具有其固 有的（及/或看情況爲誘導的）機械，物理及生化完整性 〇 A微生物氧化作用〃乃意指藉完整微生物，或其任何 製劑所完成之本發明氧化作用。 \'微生物〃包括任何完整微生物或其適當製劑，例如 ，包括已淸洗之視情況不含（例如）醱酵培養基，生長培 養基，培養淸湯等之微生物；以及於柱中固定（接合至珠 粒上）之微生物。 本發明之詳細說明 除非另有說明，否則本專利說明書及附加之申請專利 書中： °C爲攝氏度數； %爲百分比； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裳--------訂----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -13- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 _ B7 五、發明說明（11 ) A C N爲乙腈； DMS〇爲二甲亞硕； D P B S爲達貝可斯（Dulbeccos )磷酸鹽緩衝鹽水 >

EtOAc爲乙酸乙酯； E t〇Η爲乙醇； g爲克， Η P L C爲高效能液體色層分離； L爲升； M e〇Η爲甲醇； m g爲毫克， m i η爲分鐘； m m爲毫米； m m ο 1爲毫莫耳； m L爲毫升； m —二甲苯爲間位一二甲苯； N爲莫耳（濃度）； nM爲毫微莫耳（濃度）； P B S爲磷酸鹽緩衝鹽水； p —二甲苯爲對位一二甲苯； r p m爲每分鐘之轉數； TFA爲三氟乙酸； // L爲微升； v / v爲每份體積中1之體積； J - 裝·-------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -14- 1223004 A7 ___ B7 五、發明說明（12) A m e r 1 c a η N a 11 ο n a丨C a η ®乃位於美國威斯康辛州馬拿夏

Becton Dickinson ®Labware位於美國新澤西州富蘭克 林湖；

Becton Dickinson® Microbiology Systems 位於美國馬 里蘭州司巴克斯；

Biowhittaker ©位在美國馬里蘭州渥克史維爾；

Column Engineering®，Inc位在美國加州安大略； IEC® Centrifuge位在美國麻州尼漢亥玆；

Rohm and Haas®位在美國賓夕法尼亞州費城；

Traders Protein®位在美國田納西州孟非斯， 此外，ATC C爲位在1 0 8 0 1林蔭大道大學’馬 拿薩斯，維吉尼亞州，美國之美國典型培養物保藏中心’ 下列表1乃列出本文所揭示之微生物及其寄存者（參見 WWW. ATCC. Com )

Ji!4 裝-------—訂 --------4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - 15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1223004 A7B7 五、發明說明（13) __ 表 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 黴菌菌種，ATCC號碼 寄存者 灰綠犁頭黴，22752 NRRL1 灰綠犁頭黴，74480 Pfizer Inc.2 假柱孢犁頭黴，24169 NRRL 匍匐犁頭黴，1 4849 v NRRL 匍匐犁頭黴，7448 1 Pfizer Inc .3 雅致放射毛黴，6476 J. A. Stevenson 爪哇鏈格孢，1 1078 P. W. Brian 溜曲黴，1 6865 K. B. Raper, D. I. Fennell 粉孢革菌，1 2675 F. F. Lombard 刺孢小克銀漢黴，8688a NRRL 刺孢小克銀漢黴，868 8b NRRL 刺孢小克銀漢黴，89 8 3 V. M. Cutter, Jr. 刺孢小克銀漢黴，9244 V. M. Cutter, Jr. 刺孢小克銀漢黴，9245 V. M. Cutter, Jr. 刺孢小克銀漢黴，1 0028b NRRL 刺孢小克銀漢黴，26269 J. J. Perry 刺孢小克銀漢黴，36190 NRRL 刺孢小克銀漢黴，361 12 J. J. Perry 同宗配合小克銀漢黴，1 6 1 6 1 IF〇- Institute for Fermentation 狄斯柱孢，6 6 9 6 3 G. J. Samuels 棉色二孢，20575 Hoffman-La Roche Ltd. 玉米附球菌，1 2723 Pfizer Inc. 鏈小叢殼，1 4724 Sanraku-Ocean Co., Ltd. 棒形青黴，10426 NRRL 杜克青黴，1 0440 NRRL 平滑青黴，11 0 8 0 P. W. Brian 新月假旋孢腔菌，24155 R. S. Byther 梨形柄枝黴，8686 NRRL 細菌菌種，ATCC號碼 寄存者 惡臭假單胞菌，330 1 5 ' P. A. Williams 惡臭假單胞菌，202 1 90 Pfizer Inc .4 玫紅色孢子玫紅球菌，1 9067 J. W. Foster .1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------訂---------. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -16- 1223004 Α7 _ Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 .五、發明說明（14) 1 NRRL is Northern Regional Research Laboratories ( Peoria, Illinois ) 2灰綠犁頭黴，22752，於1 999年1月13日在布達佩斯條約條款 之下寄存 3匍匐犁頭黴，1 4849，於1 999年1月13日在布達佩斯條約條 款之下寄存 4惡臭假單胞菌，3 3 0 1 5，於1 9 9 9年1月1 3日在布達佩斯條約條 款之下寄存 如上所論及，本發明係關於式I化合物之微生物學製 法 ,N C〇〇H * V i 其係藉令式I I化合物^VCH3 N ii 與可完成將式I I化合物，2 -甲基喹噁啉中之甲基團氧

化成式I化合物中之羧基團之微生物接合，再將所得混 物於適當狀況下保溫以得2 -喹噁啉羧酸。 本發明法可輕易進行，將微生物培養，如有需要，例 如當微生物爲惡臭假單胞菌A T C C 3 3 0 1 5號或惡臭 假單胞菌A T C C 2 0 2 1 9 0號時，則予誘導，而後與 2 —甲基d奎噁啉接合以將2 -甲基喹噁啉中之甲基團氧化 成2 —喹噁啉羧酸中之一 C 0〇Η基團。2 —喹噁啉羧酸 可繼而（例如）藉上述；8 0 1專利申請書中所述之方法 η J > 裝·-------訂·-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -17- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 _________B7___ 五、發明說明（15) 反應以最終獲得‘ 8 0 1專利申請書中所揭示之新穎二羥 基己酸，彼乃有用以治療炎症及其它免疫病症。’8 0 1專 利申請書中揭示之有關新穎二羥基己酸之活性，測試活性 之方法，劑量，劑型，投服方法及背景資訊乃述於本文中 〇 : 如上所論及，任何適當微生物，或其適當突變種，可 用於本發明方法中，熟知技藝者鑑於本揭示文所了解，主 題方法之狀況係依（例如）微生物之種類及其特定製劑而 擇定。例如，醱酵培養基及有機溶劑之P Η，溫度，組份 濃度等，以及2 -甲基喹噁啉及誘導劑（如有需要）之濃 度乃予選擇以於使用經選定微生物時能得到特別期望之結 果。 理想之黴菌包括犁頭黴，放射毛黴，鏈格孢，曲黴， 粉孢革菌，小克銀漢黴，柱孢，色二孢，附球菌，鐮孢， 小叢殼，青黴，假旋孢腔菌，柄枝黴，及輪枝孢屬之成員 ，其種乃未特別限定，惟微生物，或其突變種，需爲可完 成主題氧化作用者。 特別理想之黴菌乃隸屬於犁頭黴，鏈格孢，曲黴，小 克銀漢黴，色二孢及青黴屬。 尤其理想之黴菌乃隸屬於犁頭黴屬。 尤其，理想之黴菌包括灰綠梨頭黴（Absidia glauca )A T C C 22752號，灰綠犁頭黴ATCC 7 4 4 8 0號，假柱孢犁頭黴（Absidia pseudocylindrospora ) A T C C 2 4 1 6 9 號，匍蔔犁頭 裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------綠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 __B7 ___ 五、發明說明（16) 黴（AbsicUa repens ) A T C C 1 4 8 4 9 號，匍匐犁頭 黴AT C C 7 4 4 8 1號，雅致放射毛黴（八<:1:丨11〇11111(：〇1-elegans ) AT C C 6 4 7 6 號，爪桂鏈格孢（Alter n aria solani ) AT C C 1 1 0 7 8 號，溜曲黴（Aspergillus tamirii ) A T C C 16865 號，粉孢革菌（Comophora puteana ) A T C C 1 2 6 7 5號，刺孢小克銀漢黴（ Cunninghamella echinulata ) A T C C 8 6 8 8 a 號，朿(J 孢小克銀漢黴A T C C 8 6 8 8 b號，刺孢小克銀漢黴 A T C C 8 9 8 3號，刺孢小克銀漢黴A T C C 9 2 4 4號，刺孢小克銀漢黴A T C C 9 2 4 5號，刺孢 小克銀漢黴A T C C 1 0 0 2 8 b號，刺孢小克銀漢黴 2 6 2 6 9號，刺孢小克銀漢黴A T C C 3 6 1 9 0號， 刺孢小克銀漢黴3 6 1 1 2號，同宗配合小克銀漢黴（ Cunninghamella homothallica ) A T C C 16161 號， 狄斯柱孢（Cylindrocarpon destructans ) A T C C 6 6 9 6 3 號，棉色二孢（Diplodia gossypina ) ATCC 2〇575 號，玉米附球菌（£?1〇〇(：(^111 neglectum ) A T C C 1 2 7 2 3 號，鏈小叢殼（

Glomerella lagenaria ) A T C C 1 4 7 2 4 號，棒形青黴 (Penicillium claviforme ) A T C C 1 〇 4 2 6 號，杜 克青黴（Penicillium duclauxii ) AT C C 1 0 4 4 0 號 ，平滑青黴（Penicillium glabrum ) A T C C 1 1 0 8 0 號，新月假旋孢腔菌（P s e u d o c o c h 11 o b o 1 u s lunatus ) A T C C 2 / 1 5 5號，及犁形柄枝黴（ 本k張尺度適用中國國家標準(CNS)A，1規格（210 x 297公釐） -19- 裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tr--------- 1223004 A7 ---- B7 ____ 五、發明說明（17 )

Thamnostylum piriforme ) A T C C 8686 號；及其適 當突變種。 更理想之黴菌包括灰綠犁頭黴A T C C 2 2 7 5 2號 ’灰綠犁頭黴A T C C 7 4 4 8 0號，匍匐犁頭黴 ATCC 14849號，匍匐犁頭黴74481號，爪桂 鏈格孢A T C C 1 1 0 7 8號，溜曲黴A T C C 1 6 8 6 5號，刺孢小克銀漢黴a T C C 8 9 8 3號，棉 色二孢ATCC 20575號及平滑青徽1 108 0號； 及其適當突變種。 特別理想之黴菌包括灰綠犁頭黴A T C C 2 2 7 5 2 號，灰綠犁頭黴ATCC 74480號，匍匐犁頭黴 ATCC 14849號及匍匐犁頭黴ATCC 7448 1號；及其適當突變種。 尤其理想之黴菌包括匍匐犁頭黴A T C C 1 4 8 4 9 號及匍匐犁頭黴A T C C 7 4 4 8 1號；及其適當突變種 〇 理想之細菌包括隸屬於桿菌（Bacnllus )，短桿菌（ Brevibacterium )，微球菌（Micrococcus )，假單胞菌 及玫紅球菌屬者，但其種並未特別限定，惟微生物，或其 突變種，需爲可完成主題氧化作用者。 特別理想之細菌包括隸屬於假單胞菌及玫紅球菌屬者 j - 裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-I ---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 C 〇 C 者 T 屬 A 菌菌 胞胞 單單 假假 於臭 屬惡 隸括 括j包 包菌 菌細 細之 之想 想理 理其 其尤 尤更 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -20- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 ______ B7___ 五、發明說明（18) 3 3 0 1 5號，惡臭假單胞菌2 0 2 1 9 0號及玫紅色孢 子玫紅球菌A T C C 1 9 0 6 7號；及其適當突變種。 尤其理想之細菌爲惡臭假單胞菌A T C C 3 3 0 1 5 號及惡臭假單胞菌2 0 2 1 9 0號；及其適當突變種。 如同稍早所論及，本發明包括任何適當微生物之任何 適當突變種之使用。此外，具有較期望性質，例如可氧化 較大量之基質，之突變種群（與母菌型對照之下）亦可用 於主題方法中，而這些新菌型可使用已知方法，包括，例 如，標準突變形成及選擇技術，及再組合方法包括（例如 )位點導向突變形成法製得。 標準突變形成法包括以N -甲基- N ’ 一亞硝基胍（ Delic 红吐.( 1 9 7 0 ) ，Mutat. Res. 9:167)， 亞硝酸（Crueger and Crueger( 1 9 8 4 )，

Biotechnology · A Textbook of Industrial Microbiology, P · 16 ? Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA )進行化學突變形成及以紫外線進行照射（Thrum ( 1 9 8 4 ) ，in Biotechnology of Industrial Antibiotics (

Vandamme，ed. ) ’ Marcel Dekker, New York, pp. 3 7 3 - 3 7 4 )。 選擇技術包括藉選擇離析菌落，選擇特定菌落形態及 選擇對已知或認爲是式I化合物之生物合成路徑中組份類 r似物具抗性者以進行菌型之簡單再離析（ Crueger and Crueger ( 1 9 8 4 ) ，Biotechnology : A Textbook of j

Industrial Microbiology， p · 2 4 — 2 5 ，Sinauer 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -21 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-----I I I -----I I I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 ______B7__ 五、發明說明（19)

Associates，Inc.，Sunderland，ΜΑ，USA )。 這些新穎菌型之所以用於主題方法中，乃因其（例如 )具有比其個自母菌型更爲改善之性質，例如彼等可製造 更多之2 -咱噁啉羧酸，彼等具有較不期望之2 -甲基D奎 n惡啉及/或2 -喹嚼啉殘酸及/或依（例如）所擇定特定 微生物而可能於本發明法中所產生之中間體化合物之內部 降解活性。此外，當使用突變種係因其可產生較多2 - d奎 噁啉羧酸時，則僅需令較小量之培養物生長以得可根據本 法產生一定量2 -喹噁啉羧酸所需之材料，最後可實質地 節省成本。 如同稍早所述，任何適當之微生物製劑可用於本發明 法中，例如於生長培養基中之微生物，已淸洗之不含（例 如）醱酵培養基，培養淸湯等之微生物，或固定於（例如 )柱（接合至珠粒上）中之微生物。 熟知技藝者由本文所提供之說明中了解如何製備適當 之固定化完整微生物，諸如A. Bauer等人於Biotechnology Letters, 1 8 ( 3 ) : 343 — 348 ( 1 9 9 6 )之論 文、、Polyvinyl alcoholimmobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitriles"中述及者。 理想之完整微生物可爲實質將2 -甲基喹噁啉氧化成 產物，尤其是2 -喹噁啉羧酸，同時使產物實質未改變’ 例如不含可能使主題方法任何階段之期望產物降解或負面 衝擊之內部活性等。 適於供主題微生物ά化作用所用之微生物可藉熟知相 i紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公髮) 22 - — T , _ 裝--------訂---------J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223004 Α7 Β7 五、發明說明（2Q) 關技藝者已知之任何適當方法製備，由市面所購原料以製 備微生物之適當方法實例乃提供如下，以包括下列所提供 方法之本揭不文爲基準，熟知技藝者了解如何改善這些方 法之任何一部分，例如製備自由或固定化微生物之方法； 將2 - D奎噁啉羧酸與微生物接合之方法；生長培養基組份 及狀況，例如溫度，p Η等；2 -甲基_噁啉，誘導劑（ 當使用時）之濃度；或保溫狀況；以求使用任何適當微生 物而獲得期望之結果。 其中微生物爲黴菌之本發明具體實施例中，2 -甲基 喹噁啉之理想濃度範圍由約〇 · 〇 1克/升至約2 · 5克 /升’特別理想之範圍由約〇 · 1克/升至約2 . 0 克/升，其中微生物爲由匍匐犁頭黴ATCC 14849 號，匍匐犁頭黴ATCC 7448 1號，灰綠犁頭黴 ATCC 22752號，灰綠犁頭黴74480號及其適 當突變種中所擇定之黴菌之本發明具體實施例中，2 -甲 基喹噁啉之理想濃度範圍由約〇 · 1克/升至約2 · 0 克/升。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 中至 例升 施 \ 實克 體 1 具 ο 明 · 發 ο 本約 之由 菌 圍 細範 爲度 物濃 生想 微理 中之 其啉 噁 喹 • T ο A 約菌 由胞 圍單 範假 之臭 C 想惡 C 理由 T 別係 A 特菌菌 ， 細胞 升中單 2 2 〇 ΊΧ 9 體克 g( IX 明 · 發 ο 本約 之由 時圍 中—約 例至 施升 克W號甲克 約 至 升 克 基 \ 甲克 其

Γ—I 假定 臭擇 惡所 ， 中 號種 5 變 突 當 適 其 及 範 度 濃 想 ΓΤΤ11 理 之 啉 噁 Di 基 升

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -23- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 B7_ 五、發明說明（21 )

此外，如同稍早所論及，供主題氧化作用所需之帶有 (T〇L質粒之細菌，例如惡臭假單胞菌A T C C 33015號或惡臭假單胞菌ATCC 202190號必 需予以誘導，其中惡臭假單胞菌ATCC 33015號或 惡臭假單胞菌2 0 2 1 9 0號係於醱酵器內之培養基中培 養之本發明具體實施例中，乃將誘導劑以約4 · 5毫莫耳 /升/小時至約6 · 5毫莫耳/升/小時之理想添加速率 ，尤其以約4 · 9毫莫耳/升/小時至約6 · 1毫莫耳/ 升/小時之特別理想添加速率加入。 其中惡臭假單胞菌ATCC 3 3 0 1 5號或惡臭假單 胞菌A T C C 2 0 2 1 9 0號係於燒瓶內之培養基中時之 本發明具體實施例中，誘導劑，最好對位一二甲苯係以氣 體形式連續加至培養基中，如同熟知本揭示文及上述論文 及專利（例如美國專利5，2 3 6，8 3 2號）技藝者所 了解’誘導劑之濃度乃予擇定以使其低於負責氧化作用之 酵素之最小抑制濃度。亦參見C1 a u s a n d W a 1 k e r，] . G e η.

Microbiol·，36:10 7 — 122(1964)。 將基質’ 2 -甲基喹螺啉，與微生物接合之任何適當 方法均可用於本發明中，基質可與微生物以任何適當次序 接合。例如，2 -甲基喧噁啉可加至含有微生物（自由或 固定化，或其結合）之培養基諸如培養淸湯中；或者培養 基可含有2 -甲基d奎噁啉，繼而將微生物加至此培養基中 ;或者2 -甲基d奎噁啉與微生物可共同加至此培養基中； 或者2 -甲基d奎噁啉或微!生物中之任一者可加至含有另一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公t ) 24 J · _ 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223004 A7 B7 五、發明說明（22) 者之適當溶劑中；或者2 -甲基d奎噁啉可吸附至樹脂上等 。熟知技藝者由本文之說明中了解如何依期望而改良主題 方法之任何部分。 如上所論及，本發明中理想之微生物爲惡臭假單胞菌 A T C C 2 2 7 5 2號，亦如上所論及，惡臭假單胞菌 A T C C 2 2 7 5 2號之低壓凍乾樣品係於1 9 9 9年1 月1 3日於布達佩斯條約條款下寄存於A T C C。此新寄 存之菌種則給予新寄存號A T C C 7 4 4 8 0號，因此， 本發明亦理想之微生物爲惡臭假單胞菌A T C C 7 4 4 8 0號。所有對所寄存眾微生物菌種之可取得性之 限制則因本發明專利說明書中專利之發布而不能變更地移 除。 亦如上所論及，本發明尤其理想之微生物爲匍匐犁頭 黴ATCC 14849號，匍匐犁頭黴ATCC 1 4 8 4 9號之低壓凍乾樣品係於1 9 9 9年1月1 3日 ，於布達佩斯條約條款下寄存於A T C C，此新寄存之菌 種乃給予新寄存號A T C C 7 4 4 8 1號。因此，本發明 亦尤其理想之微生物爲匍匐犁頭黴A T C C 7 4 4 8 1號 ，所有對所寄存眾微生物菌種之可取得性之限制則因本發 明專利說明書中專利之發布而不能變更地移除。 黴菌匍匐犁頭黴ATCC 14849號（或匍匐犁頭 黴A T C C 7 4 4 8 1號，灰綠犁頭黴2 2 7 5 2號，或 ( 灰綠犁頭黴7 4 4 8 0號）可由A 丁 C C獲得，由此可取 得原料中製備之適當方法1之實例乃即刻提供於下，材料菌 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -25 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

裝·-------訂--------I ♦ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 ____ B7 ___ 五、發明說明（23 ) 種可由米菌種中製備，諸如：將含約5 0克棕米及約2〇 毫升蒸餾水之錐形瓶（2 5 0毫升）於約1 2 1 °C下壓熱 約30分鐘，匍匐犁頭黴ATCC 14849號（或匍蔔 犁頭黴ATCC 7 4 48 1號，灰綠犁頭黴22752號 ，或灰綠犁頭黴7 4 4 8 0號）營養細胞或孢子之懸浮液 係藉將一整除份之液體菌種或一抹之於傾斜琼脂培養基上 生長之菌種加至無菌蒸餾水中而製得。將每一個米燒瓶接 種上約5毫升之孢子或細胞懸浮液，再於約2 8 °C下保溫 約1 0天，此時孢子材料乃藉將米菌種以0 · 5 %吐溫 8 0之蒸餾水溶液淸洗，將孢子懸浮液由米中傾析掉，再 將約1 〇 %至約2 0 %甘油加入而製得，孢子材料係於約 —7 0 t：下貯存。 如同熟知所擇定任何黴菌，及下文實例中所提供之理 想灰綠犁頭黴ATCC 22752號或ATCC 74480號及尤其理想匍匐犁頭黴ATCC 14849 號或A T C C 7 4 4 8 1號技藝者所了解，製備所擇定黴 菌之適當方法如下：將（諸如）上述冷凍之黴菌營養細胞 或孢子材料菌種接種至含生長培養基（含有一整除份之包 括吐溫8 0，甘油及蒸餾水之無菌溶液，其組份乃更詳盡 述於下）之具金屬封口之燒瓶或玻璃管中。醱酵作用乃於 約2 2 °C至約3 2 °C下進行，最好於約2 9 °C下進行，同 時予以適度搖動，最好於約2 0 〇 r p m至約2 2 0 r p m ’尤其約2 1 0 r p m下搖動，如有需要，生長培 養基之p Η可藉將適當緩衝液置入醱酵培養基中及/或定 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） -26- τ ; 裝·-------訂·--------^^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 B7____ 五、發明說明（24) 期依所需加入鹼或酸調節而予保持，理想之P Η範圍由約 Ρ Η 6 至約 ρ Η 7。 微生物（亦即黴菌或細菌）生長之任何適當期間，微 生物與2 -甲基D奎噁啉之接合，及2 -甲基喹噁啉與微生 物之保溫可用於本發明中，微生物之適當生長可於（例如 )約2 4小時內達成，此時可將（a ) 2 一甲基喹噁啉本 身’ （b )適當整除份之溶於適當（例如不會不利地影響 微生物之生長或功能）溶劑，最好乙醇中之2 -甲基喹噁 啉溶液或（c )已吸附至樹脂上之2 -甲基喹噁啉加至菌 種中’保溫作用可繼而依（例如）發生生物轉換之容器， 保溫之培養基及狀況例如溫度，p Η及攪動狀況而持續（ 例如）約二至約二十四小時，保溫淸湯可繼而使用任何適 當萃取法萃取，例如（a )使用適當溶劑例如乙酸乙酯， 甲基異丁基酮，甲基乙酮，二氯甲烷等，最好乙酸乙酯， 以移除保溫淸湯中之有機組份或（b )藉將產物，2 -喹 噁啉羧酸，吸附至適當樹脂，最好至聚合性吸附樹脂上， 尤其至由商標名 Amberlite® ( Rohm and Haas )中所擇 定之樹脂上，最尤其至XAD 4 ( Amberlite樹脂中之 ί X A D 4 )上。將保溫淸湯以適當有機溶劑萃取，再將有 機及水性相分離後，含有機餘留物之化合物可使用任何適 當方法例如色層分離法測定，此外，使用樹脂將2 -哇喔 啉羧酸由保溫淸湯中萃取後，可使用適當溶劑，最好乙酸 乙酯或甲醇而將2 -哇噁啉羧酸由其中洗澡出，而後使用 (例如）乙酸乙酯及甲醇而由（例如）乙酸乙酯中結晶出 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -t--------IT---------. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -27- 1223004 A7 __ B7 __ 五、發明說明（25) 〇 任何適當之生長培養基均可用於本發明法中，適當之 生長培養基乃含有可同化之碳，可同化之氮及含有必要礦 物質之無機鹽之來源。通常，許多醣類例如葡萄糖，麥芽 糖，甘露糖，蔗糖，澱粉，甘油，小米凍，糖蜜，大豆等 ，可用以作爲可同化之碳源。可同化之氮源包括（例如） 材料諸如酵母及酪蛋白水解產物，初生酵母，酵母精，棉 花子粉，大豆固體，小麥胚芽，肉熬汁，腺，玉米浸泡液 ，玉米浸泡固體，及銨鹽。供本發明培養基中所用之適當 無機鹽營養物包括（例如）含鈉，鐵，鎂，鉀，鈷，磷酸 鹽等之慣用鹽。 尤其，適於供其中微生物爲黴菌之本發明所用之生長 培養基組份包括（例如）玉米浸泡液，玉米浸泡固體， Pharma media ®及麥芽精。玉米浸泡液培養基係使用約4〇 克/升玉米浸泡液及2 0克/升右旋糖製備，再於殺菌前 調整p Η至約4 · 8 5，玉米浸泡固體培養基則使用約 2 0克/升至約4 0克/升玉米浸泡固體及約2 0克/升 右旋糖製備，再於殺菌前調整ρ Η至約4 · 8 5，另一供 本發明法用之適當培養基係以約2 0克/升P h a 1· m a m e d i a ® 及約2 0克/升右旋糖製備，並於殺菌前調整p H至約 7 · 2，麥芽精培養基係使用約1 0克/升麥芽精，約 1〇克/升右旋糖，約5克/升腺及約2克/升酵母精製 備，並於殺菌前調整P Η至約7，另一供本發明法用之適 當培養基係以約2 0克/升右旋糖，約5克/升營養大豆 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----1--訂·-------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -28- 1223004 Α7 Β7 五、發明說明（26) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 粉，約5克/升酵母精，約5克/升氯化鈉及約5克/升 磷酸氫二鉀製備，並於殺菌前，使用硫酸調整p Η至約 Ρ Η 7 · 0，適用於本法之黴菌所用之特別理想生長培養 基爲上述之玉米浸泡固體培養基。 如上所論及，本發明中特別理想之微生物爲惡臭假單 胞菌A T C C 3 3 0 1 5號，亦如上所論及，惡臭假單胞 菌A T C C 3 3 0 1 5號之低壓凍乾樣品亦於1 9 9 9年 1月1 3日於布達佩斯條約條款下寄存於A T C C中，此 新寄存之菌種乃給予新寄存號ATCC 2 0 2 1 9 0號， 因此，本發明中亦理想之微生物爲惡臭假單胞菌A T C C 2 0 2 1 9 0號，所有對所寄存眾微生物菌種之可取得性 之限制則因本專利說明書中專利之發布而不能變更地移除 〇 此外，適於供其中微生物爲細菌之本發明用之生長培 養基包括任何適當之已知培養基，例如營養淸湯（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Nutrient Broth，約 3 2 克 / 升，Becton Dickinson Microbiology Systems )及甘油（約5克/升），如同熟知 所擇定之任何細菌，及下文實例中所特別提供之惡臭假單 胞菌A T C C 3 3 0 1 5號技藝者所了解，製備所擇定細 菌之適當方法如下：將依技藝中已知之法所製之冷凍細菌 材料菌種（約1 7 %甘油材料）接種至含生長培養基（含有 一整除份Z包括吐溫8 0 ’甘油及蒸觀水之無菌溶液，其 組份乃更詳盡述於下）之具有金屬封口或醱酵器之燒瓶或玻 璃管中，醱酵作用乃於約2 〇 °C至約4 0 °C下，最好於約 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4 1格(2】〇\ 297公爱) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 B7_ 五、發明說明（27) 2 5 °C至約3 2 °C下進行，同時予以適度搖動，最好於約 2〇〇r p m至約2 2 0 r p m下，尤其於約2 1 0 r p m下搖動，如有需要，生長培養基之ρ η可藉將適當 緩衝液置入醱酵培養基中及/或定期依所需加入鹼或酸調 節而予保持。理想之接種量由約1 %至約2 〇 %體積/體 積（接種量/培養基），理想之Ρ Η範圍由約ρ Η 6至約 Ρ Η 8 〇 必需注意的是，本揭示文之任何部分中有關特定緩衝 液，培養基，試劑接合作用或菌種狀況，所用基質之量及 誘導劑之量等並不欲予限制，但必需包括熟知技藝者已知 之在本論文所呈現特定文脈中所論及或具有價値之所有此 相關材料。例如，通常可以一種緩衝劑系統或培養基取代 另一者，以使用不同但已知之方式以達到與使用所提出之 方法，材料或組成物相同之目的。 主題之微生物氧化作用更進一步任包含期望產物，2 -喧噁啉羧酸，之離析作用，2 - _噁啉羧酸可依下述法 由培養基（其中係進行新穎之微生物氧化法）且，尤其由 依所擇定微生物，及保溫狀況而可能產生但未完全轉換成 2 - d奎噁啉羧酸之中間體化合物中離析出。 任何供將主題方法中之任何中間體或期望產物予以離 析及/或純化之適當方法均可用於本發明中，包括過濾法 (’萃取法，結晶法，柱色層分離法，薄層色層分離法，製 備性低壓液體色層分離法，Η P L C，樹脂吸附法，或此 些方法之任何適當合倂法1。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -30- J - t--------tr--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223004 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（28) 下列所提供之詳細說明乃顯示，一系列之微生物尤其 疋徽爾及細囷可將2 —甲基D奎丨丨惡琳氧化成2 一 D奎卩惡啉羧酸 ’而後可將其由不期望且未改變之2 -甲基D奎螺啉，或任 何中間體化合物中分離出，再更進一步根據技藝中詳知之 方法起反應以1% (例如） 8 0 1專利申請書之化合物 〇 雖然本揭示文主要係於主題方法中使用完整微生物， 然而熟知技藝者了解，主題之微生物法可藉由其適當製備 ’例如破碎及脫水之細胞製劑，含有可完成主題氧化作用 之微生物酵素之萃取材料，或酵素本身，加上任何需要之 輔助因素而達成。 本發明乃藉由下列實例說明，本發明之前述及下列說 明及各種不同之具體實施例並不欲限制本發明，而僅供說 明之目的，因此，本發明當然不被這些實例之特定細節所 ( 限制。 實例1 2 —甲基d奎噁啉於使用匍匐犁頭黴 ATCC 1 4849號之試管菌種中之氧化作用 A·使用匍匐犁頭黴ATCC 14849之生物轉換作用 三種 '、測試〃菌種（T 1，T 2及T 3 )及製備如下 :將約2 · 5毫升無菌生長培養基（約2 0克/升右旋糖 ，約5克/升營養大豆粉，約5克/升酵母精，約5克/ 升氯化鈉及約5克/升磷酸氫二鉀，並於殺菌前將ρ η調 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -31 - I. - 裝·-------訂·-------1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 ______ B7_ 五、發明說明（29 ) 整至約P Η 7 · 〇 )加至三個各具有一金屬封口之1 6 X 125毫米玻璃管之每一管（ΤΙ，Τ2及Τ3)中，繼 而將匍匐犁頭黴ATCC 14849號之孢子（約1%體 積/體積之孢子材料菌種）加至ΤΙ ，Τ2及Τ3中。 將三個試管菌種於約2 9 °C下保溫，同時於約2 1〇 r P m下搖動，約4 8小時（T 1 ) ，7 2小時（T 2 ) 或9 6小時（T 3 )後，將約〇 · 〇 5毫升2 —甲基喹噁 啉材料溶液（約5 0毫克/毫升之約1 0 〇 %乙醇液，最 終濃度約1毫克/毫升）加至試管菌種中。 更進一步於約2 9 °C下保溫（參見下列表2 )後，使 用4 N氫氯酸將試管菌種之醱酵淸湯調整至約p Η 2，再 將每一試管之內容物以等量之乙酸乙酯（純）萃取：將乙 酸乙酯加入，將試管菌種渦動，而後於約2 0 0 0 r p m 下（IEC Centnfuge )離心，繼而將乙酸乙酯層移出，將 水性層萃取第二次。再將結合之有機萃取液於氮下，於約 5 0 °C水浴中乾燥。 B ·藉逆相Η P L C所測定之2 -喹噁啉羧酸之產率 將每一種依上述法所製之萃取物再懸浮於約一毫升乙 腈：水（1 : 9，體積/體積）中，再將約2 0 L每一種 ί再懸浮萃取液藉注至Η P L C柱：Inertsil ® C 8 HPLC 柱（4 · 6X25 〇毫米，Column Engineering， Inc.)上予以分析，每一種注入之再懸浮萃取液內所含之 化合物係於流動相（乙腈1 : 〇 · 〇 5 %水性三氟乙酸， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -32- J · t--------IT---------!__ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^3004 五 A7 ^一 _ B7 _ 、發明說明（30) 1 : 4，體積/體積）中以約1 · 0毫升/分之速予以等 效分離。於這些狀況下，2 -喹噁啉羧酸於約8 · 6分時 洗提出，而2 -甲基喹噁啉於約1 5分鐘時洗提出。再由 H p L C分析法中測定數組實驗狀況（亦即T 1 ，T 2及 T 3 )下之2 —喹噁啉羧酸之產率，這些產率乃示於下列 表2中。 Μ_2 菌種 基質加入 初始基質濃 保溫時間 產率％ 時間（天） 度（克/升） (天數） T1 2 1 18 56 T2 3 1 14 76 T3 4 1 16 79 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂----I--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如同表2中τι ，Τ2及Τ3之資料所示，HPLC 分析顯示，主題微生物法可分別得到5 6 %，7 6 %及 7 9 %產率之期望2 -喹噁啉羧酸。 因此，加入完整微生物亦即匍匐犁頭黴A T C C 1 4 9 4 9號，可將2 -甲基喹噁啉氧化成2 -喹噁啉羧 酸，且其質量之2 -嘻噁啉羧酸仍保留完整。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） -33- 1223004 A7 B7 五、發明說明（31)

實例I I 2 -甲基喹噁啉於使用在四種不同生長 培養基內之匍匐犁頭黴ATCC 1 4849號 試管菌種中之氧化作用 A.四種不同生長培養基之製備 培養基1係以約4 0克/升玉米浸泡液及約2 〇 克/升右旋糖製備，並於殺菌前調整至約p Η 4 . 8 5。 培養基2係以約4 0克/升玉米浸泡固體及約2 〇 克/升右旋糖製備，並於殺菌前調整至約Ρ Η 4 . 8 5。 培養基3係以約2 0克/升Pharmamedia⑧及約2〇 克/升右旋糖製備，並於殺菌前調整至PH7 · 2。 培養基4係以1 0克/升麥芽精，約1 0克/升右旋 糖，約5克/升腺，及約2克/升酵母精製備，並於殺菌 前調整至約Ρ Η 7 ° Β ·使用匍匐犁頭黴A T C C 1 4 8 4 9號之生物轉換作 用 八種、、測試"菌種（T 1 a ，丁 1 b，T 2 a ’ (丁2匕，丁33，丁313，丁43及丁41))乃製備如下 :將約2 · 5毫升無菌生長培養基（分別爲培養基1 ’培 養基2，培養基3及培養基4 )加至八個各具有一金屬封 口之1 6 X 1 2 5毫米玻璃管之每一管（T 1 a ’ T 1 b ，T2a，T2b，T3a，T3b，T4a 及 T4b) 中，繼而將匍匐犁頭黴A1 T C C 1 4 8 4 9號之孢子（約 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ,丨 — — — — — — 丨 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -34- 1223004 A7 B7__ 五、發明說明（32 ) 1 %體積/體積之孢子材料菌種）加至所有試管菌種中。 將八個試管菌種於約2 9 °C下保溫，同時於約2 1〇 r p m下搖動，約4 8小時（T 1 a ，T 2 a ，T 3 a及 T 4 a )或約 7 2 小時（T 1 b，T 2 b，T 3 b 及 丁 4 b )後，將約〇 · 0 5毫升2 —甲基d奎噁啉材料，溶 液（約5 0毫克/毫升之二甲亞硕液，最終濃度約1毫克 /毫升）加至試管菌種中。 更進一步於約2 9 °C下保溫1 2天後，依實例1所述 之法，將每一試管菌種之醱酵淸湯萃取，再將結合之有機 萃取液乾燥。 C ·藉逆相Η P L C所測定之2 -喹噁啉羧酸之產率 (將每一種依上述法所製之萃取物依實例1所述之逆相Η Ρ L C予以處理及分析，再由此Η P L C分析法中測定數組 實驗狀況（亦即 Τ 1 a ，Τ 1 b ，丁 2 a ，丁 2 b ，Τ 3 a，T 3 b，T 4 a及T 4 b )下之2 -鸣噁啉羧酸之產 率，這些產率乃示於下列表3中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1223004 A7 B7 五、發明說明（33 ) 表 培養基 菌種 基質加入 産率％ 時間（天） 1 Tla 2 36 Tib 3 43 2 T2a 2 73 T2b 3 69 3 T3a 2 49 T3b 3 52 4 T4a 2 31 T4b 3 28 裳--------訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如同表3中之資料所示，HP L C分析顯示，其中微 生物爲匍匐犁頭黴ATCC 14849號之主題微生物法 口丁使所有測試之培養基中均產生2 - _ !1惡啉殘酸，表3之 資料亦指出，在四種測試培養基中，培養基2可得到最高 %產率之期望產物，2 —喹噁啉羧酸。

實例III 2 —甲基d奎噁啉於使用匍匐犁頭黴 ATCC 1 4849號或灰綠犁頭黴ATCC 2275 2號 i 之燒瓶菌種中之氧化作用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -36- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 Α7 Β7 五、發明說明（34) A ·使用匍匐犁頭黴A T C C 1 4 8 4 9號或灰綠犁頭黴 A T C C 2 2 7 5 2號之生物轉換作用 四種、、測試〃菌種（T 1 a ，T 1 b，T 2 a及 T 2 b )乃製備如下：將約2 5毫升無菌生長培養基（約 2 0克/升右旋糖，約5克/升營養大豆粉，約5克/升 酵母精），約5克/升氯化鈉及約5克/升磷酸氫二鉀， 並於殺菌前將p Η調整至p Η 7 · 0 )加至四個圓錐形燒 瓶（3 0 0毫升）之每一瓶中，繼而將匍匐犁頭黴 ATCC 14849號（Tla，Tib)或灰綠犁頭黴 ATCC 22752 號（T2a，T2b)之孢子（約 1 %體積/體積之孢子材料菌種）加入。 將四個燒瓶菌種於約2 9 °C下保溫，同時於約2 1 0 r p m下搖動。接種後立即（T 2 a )，或約2 4小時後 (T 2 b )，將約0 · 5毫升2 —甲基_ π惡啉材料溶液（ 約5 0毫克/毫升之約1 〇 0 %乙醇液，最終濃度約1毫 克/毫升）加至匍匐犁頭黴A T C C 1 4 8 4 9之燒瓶菌 種中。 更進一步於約2 9 °C下保溫2 4 ( 丁 1 a ) ，1 6 (

Tib) ，25 ( 丁 2a)或 24 (T2b)天後，使用 4 N氫氯酸將燒瓶菌種之醱酵淸湯調整至約p Η 2，再將 每一燒瓶菌種之內容物以兩次2 5毫升整除份之乙酸乙酯 萃取，而後將溶劑於減壓下由結合之乙酸乙酯萃取液中移 除以得粗製產物。 J · 裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -37- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223004 A7 ____B7___ 五、發明說明（35 ) B ·藉逆相Η P L C所測定之2 -喹噁啉羧酸之產率 將每一種依上述法所製之萃取物再懸浮於約5毫升甲 醇：乙腈（3 : 2，體積/體積）中，再以水稀釋1 : 1 9以供Η P L C分析。Η P L C分析係依實例1所述之 法進行。並由Η P L C分析法中測定數組實驗狀況（亦即 丁 la ，Tib ，丁 2a及T 2b)下之2 —喹噁啉羧酸 之產率，這些產率乃示於下列表4中。 菌種 基 質加入 初始基質濃 保溫時間 產率％ 時 間（天） 度（克/升） (天） Tla 2 1 24 80 一 Tib 3 1 16 72 一 T2a 0 1 25 44 一 T2b 1 1 24 5 3 _ 如同表4之資料所示，加入完整之微生物亦即灰綠犁 頭黴ATCC 22752號或匍匐犁頭黴ATCC 1 4 8 4 9號可將2 —甲基d奎噁啉氧化成2 —喹噁啉羧酸 。T 1 a ，Τ 1 b，T 2 a及T 2 b中所留下之原材料亦 即2 —甲基奎噁啉之％分別爲約7 %，7 %，6 %及6 % -------—訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -38- 1223004 A7R7 五、發明說明（36) 實例I v 對2 -甲基喹噁啉微生物氧化成 2 -喹噁啉羧酸之篩檢 令各種不同之微生物細胞於含有實例1所述2 . 5毫 升右旋糖，營養大豆粉培養基之試管中生長。在個別試管 內接種上以冷凍甘油懸浮液形式貯存之各種不同微生物之 孢子或營養細胞（約1 %體積/體積之孢子或營養細胞材 料菌種），再邊於旋轉搖動器上攪動（2 1 0 r p m )邊 ( 於約2 9 t：下保溫，約4 8小時後，將0 · 0 5毫升1〇 毫克/毫升2 —甲基喹噁啉之二甲亞硕溶液加至每一試管 中，約4天保溫後，將每一試管之內容物萃取，再將個別 萃取物藉實例1所述之Η P L C法分析，2 -喹噁啉羧酸 之產率則藉Η P L C測定，結果乃槪略示於表5中。 裝--------訂·---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 黴菌菌種，ATCC號碼 產率％ 灰綠犁頭黴，22752 83 匍匐犁頭黴，1 4849 83 溜曲黴，1 6865 53 爪哇鏈格孢，1 1078 53 平滑青黴，11080 47 棉色二孢，20575 31 i 刺孢小克銀漢黴，898 3 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -39- 1223004 A7 B7 五、發明說明（37)

實例V 2 -甲基d奎噁啉於使用惡臭假單胞菌 ATCC 330 1 5號之燒瓶菌種中之氧化作用 將惡臭假單胞菌A T C C 3 3 0 1 5號細胞於培養基 5 (營養淸湯（約3 2克/升）及甘油（約5克/升）中 生長。在含有約3 0毫升培養基之六個圓錐形燒瓶（ 3〇0毫升）內接種上已事先於約- 7 C下貯存之 0.10毫升惡臭假單胞菌ATCC 33015號細胞之 甘油懸浮液。將1 5毫升圓錐形聚丙烯離心管（Falcon ® ，Becton Dickinson Labware )中所含之約2毫升對位—二 甲苯加入後，將燒瓶以石蠟紙Parafilm® ( American Natienal Can )密封，再於旋轉搖動器上，於約2 9 °C下 攪動（約2 2 5 r p m )，這些燒瓶菌種於6 5 0 n m下 (所測得之光密度約1 . 9，藉過濾法收集六個燒瓶中之細 胞，以約2 5 0毫升D P B S淸洗一次，再懸浮於3 0 0 毫升圓錐形燒瓶內之約2 0毫升P B S ( Biowhittaker ) 中。 生物轉換作用係藉將約0 · 1毫升約1 0 0毫克/毫 升2 -甲基喹噁啉之二甲亞硕溶液（相當於約0 · 5 克/升之初始濃度）加入而開始，再於約2 9 °C下持續保 溫約4天，同時於約2 2 5 r p m下攪動，將生物轉換作 用之淸湯樣品於各種不同時間移出，藉離心法移出細胞後 ，依所需以甲醇稀釋，並藉Η P L C分析將約2 0微升之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -40- 1223004 A7 B7 五、發明說明（38 ) 每〜個樣品藉注至Inertsil® HPLC C 8柱（4 · 6 X 2 5 〇毫米）上分析。並將每一柱以含有乙腈：約 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 · 0 5 %水性三氟乙酸（1 : 4，體積/體積）之流動 相以約1 · 0毫升/分之速洗提。保溫約1，2及4天後 ’ 2 —喹噁啉羧酸之產率分別爲約8 6 %，9 0 %及9 4 % 〇

實例V I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 -甲基喹噁啉於使用惡臭假單胞菌 ATCC 3 30 1 5號之醱酵器菌種中之氧化作用 令惡臭假單胞菌ATCC 3 3 0 1 5號於含有約10 升培養基5之醱酵器中生長，在醱酵器內接種上各於含約 5 0毫升培養基5之圓錐形燒瓶（3 0 0毫升）中生長之 六個惡臭假單胞菌菌種。將每一燒瓶菌種接種上約1 7 5 微升惡臭假單胞菌A T C C 3 3 0 1 5號之孢子材料’再 將含約2毫升對位-二甲苯之15毫升聚丙烯離心管插入 ，並將燒瓶以石蠟紙Parafilm ®密封。而後將這些燒瓶菌 種於約2 9 °C下保溫約1 7小時’同時於約2 1 0 r p m 下攪動。將醱酵器接種上6個燒瓶菌種後，將對位-二甲 苯以約每2 0分鐘約2毫升整除份之量加至醱酵器中達2 小時，其後，約每2 0分鐘將約2 · 5毫升整除份之對位 -二甲苯加至醱酵器中達約3 · 5小時，繼而停止加入二 甲苯，將2 -甲基咱噁啉於接種後之約5 · 2 5小時（約 1 . 9 5克）及約7 · 71 5小時（約7 · 7 6克）加入， -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1223004 A7 _B7 五、發明說明（39 ) 加入最終之2 -甲基喹噁啉後，持續保溫約2 2小時，而 後將保溫培養基之樣品離心以移出細胞，以甲醇稀釋並使 用實例V所述之方法藉Η P L C法分析，此分析顯示約有 8 1 %產率之2 —喹噁啉羧酸。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂·--------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -42-

Claims (1)

1223004

A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 附件 2 : 第8 9 1 0 3 5 1〇號專利申請案 修正後無劃線之中文申請專利範圍替換查 民國93年4月2日修正 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 · 一種利用微生物將2 -甲基d奎噁啉氧化成2〜d奎 噁啉羧酸之方法，其包括將上述2 -甲基_噁啉與微生物 接觸，再將所得混合物於足以獲得一定量上述2 -喹噁啉 羧酸之狀況下定溫培養，其中，上述微生物係選自灰綠犁 頭黴（Absidia glauca )，匍 ® 犁頭黴（Absidia repens ) ’ 爪桂鏈格孢（Alter na r ia solani )，溜曲黴 (Aspergillus tamirii )，刺孢小克銀漢黴（ Cunninghamella echinulata )，棉色二孢（Diplodia gossypina ) ’ 平滑青黴（Penicillium glabrum )，惡 臭假單胞菌；唯其中該微生物爲惡臭假單胞菌A T C C 3 3 0 1 5 s虎或惡臭假單胞菌ATCC 2〇2 1 9 0號 時’則在惡臭假早胞囷A T C C 3 3 0 1 5號或惡臭假 單胞菌ATC C 2 0 2 1 9 0與2 -甲基喹噁啉接觸之 前’令惡臭假單胞菌ATCC 3301 5號或惡臭假單 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 胞囷AT C C 2 0 2 1 9 0號與誘導劑交互反應而誘導 〇 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其更進一步包括 將2 - _噁啉羧酸予以離析。 3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該離析作用 係藉由將該混合物以有機溶劑萃取而進行。 本紙張尺度適用中國國家標睪（CNS } A4規石TTf〇x 297公愛]^-- 1223004 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 4 ·如申請專利範圍第3項之方法，其中該有機溶劑 爲乙酸乙酯。 5 .如申請專利 令上述萃取物接受色 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 ·如申 用係藉將上述 上，再將由上 機溶劑洗提而 7 .如申 聚合性吸附樹 8 ·如申 劑爲乙酸乙酯 9 ·如申 將上述洗提之 1 0 ·如 含將上述洗提 結晶。 1 1 ·如 物爲完整之微 1 2 .如 生物爲已淸洗 1 3 ·如 包含將上述已 1 4 .如 範圍第4項之方法，其更進一步包括 層分離。 請專利範圍第2項之方法，其中上述離析作 2 - D奎D惡啉殘酸由上述混合物中吸附至樹脂 述樹脂中所得之經吸附2 -咱噁啉羧酸以有 進行。 請專利 脂。 請專利 或甲醇 請 先 閱 讀 背 © 之 注 意 事 項 範圍第6項之方法，其中上述樹脂爲 範圍第7項之方法，其中上述有機溶 請專利 2 -喹 申請專 之2 - 申請專 生物。 申請專 之微生 申請專 淸洗之 申請專 範圍第8項之方法，其更進一步包含 噁啉羧酸由乙酸乙酯中予以，結晶。 利範圍第8項之方法，其吏進一步包 喹噁啉羧酸由乙酸乙酯及甲醇φ $ & 利範圍第1項之方法，其中± 利範圍第1 1項之方法 物細胞。 利範圍第1 2項之方法 細胞固定。 利範圍第1 2項之方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2- 述微生 其中上述 其更進 微 步 其中上述已 1223004 ABCD 六、申請專利範圍 淸洗之細胞係於水性溶劑中。 1 5 ·如申g靑專利範圍第1 4項之方法，其中上述接 觸作用係藉將上述2 -甲基d奎噁啉加至上述溶劑中。 1 6 ·如申請專利範圍第1 ;[項之方法，其中上述微 生物係於生長培養基中。 1 7 ·如申請專利範圍第丨6項之方法，其中上述接 觸作用係將上述2 -甲基鸣嚼啉加至上述生長培養基中。 1 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中上述微生 物係選自灰綠犁頭黴A T C C . 2 2 7 5 2號，灰綠犁頭 黴ATCC 74480號，匍匐犁頭黴ATCC 14849號’匍匐犁頭黴ATCC 74481號，爪 睦鏈格孢ATCC 1 1078號，溜曲黴ATCC 1 6 8 6 5號，刺孢小刺銀漢黴a T C C 8 9 8 3號及 棉色二孢ATCC 20575號。 1 9 ·如申請專利範圍第i 8項之方法，其中上述微 生物係選自灰綠犁頭黴A T C C 2 2 7 5 2號，灰綠犁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 頭黴ATCC 74480號，匍匐犁頭黴ATCC 14849號，匍匐犁頭黴ATCC 74481號，爪 哇鏈格孢A T C C 1 1 〇 7 8號及溜曲黴A T C C 1 6 8 6 5 號。 2 〇 ·如申請專利範圍第1 9項之方法，其中上述微 生物係選自灰綠犁頭黴A T C C 2 2 7 5 2號，灰綠犁 頭黴ATCC 74480號，匍匐犁頭黴ATCC 1 4 8 4 9號及匍匐犁頭黴a 丁 C C 7 4 4 8 1號。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(21〇x 297公釐）-3 - 1223004 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 2 1 ·如申請專利範圍第2 0項之方法，其中上述微 生物爲匍匐犁頭黴ATCC 14849號或匍匐犁頭黴 ATCC 74481 號。 2 2 · —種利用微生物將2 —甲基鸣噁啉氧化成2 -喹噁啉羧酸之方法，其包括將該2 -甲基喹噁啉與微生物 接觸，再將所得混合物於足以獲得一定量上述2 -喹噁啉 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 羧酸之 A T C 7 4 4 2 物係於 2 作用係 2 爲惡臭 A 丁 C 2 劑爲對 2 單胞菌 A T C 2 一二甲 2 狀況下定溫培養，其中該微生物爲匍匐犁頭黴 C 14849號或匍匐犁頭黴ATCC 8 1號。 3 ·如申請專利範圍第2 2項之方法，其中該微生 生長培養基中。. 4 ·如申請專利範圍第2 3項之方法，其中該接觸 藉將上述2 -甲基喹噁啉加至上述生長培養基中。 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物 假單胞菌ATCC 33015號或惡臭假單胞菌 C 2 0 2 1 9 0 號。 6 ·如申請專利範圍第2 5項之方法，其中該誘導 位二甲苯。 7 ·如申請專利範圍第2 6項之方法，其中惡臭假 ATCC 33015號或該惡臭假單胞菌 C 202190號係於生長培養基中。 8 ·如申請專利範圍第2 7項之方法，其中該對位 苯係加至上述生長培養基中。 9 .如申請專利範圍第2 8項之方法，其中該生長

裝 旁 訂 I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -4 - 1223004 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5、申請專利範圍 培養基係於燒瓶中。 3〇.如申請專利範圍第2 9項之方法，其更進一步 包括在誘導作用完全之後，將該微生物收集之步驟。 3 1 ·如申請專利範圍第3 〇項之方法，其中該收集 作用係藉由將燒瓶之內容物離心，將流體傾析，將細胞團 塊淸洗，而後將該團塊再懸浮於緩衝劑中而完成。 3 2 ·如申請專利範圍第3 1項之方法，其中該接觸 作用係藉由再懸浮後，將2 —甲基曈噁啉加至緩衝劑中而 完成。 3 3 ·如申請專利範圍第2 8項之方法，其中該生長 培養基係於醱酵器中。 3 4 ·如申請專利範圍第3 3項之方法，其中將該對 位一二甲苯加至生長培養基之作用係於該誘導作用後中止 〇 3 5 ·如申請專利範圍第3 4項之方法，其中該接觸 作用係於對位一二甲苯進行上述中止作用後，藉將上述2 一甲基喹噁啉加至上述生長培養基中。 3 6 . —種利用微生物將2 -甲基d奎噁啉氧化成2 - 曈噁啉羧酸之方法，其包括將微生物之酵素藉與誘導劑交 互反應而誘導後，將2 -甲基喹噁啉與上述微生物接觸， 再將所得混合物於足以獲得一定量上述2 -喹噁啉羧酸之 狀況下定溫培養，其中該微生物係選自惡臭假單胞菌 ATCC 33015及惡臭假單胞菌ATCC 2 0 2 1 9 0 號。 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再丨 旁 I 鰣裝 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29<7公釐） _ 5 _ 1223004 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍3 7 .如申請專利範圍第3 6項之方法，其中該誘導 劑爲對位一二甲苯或間位一二甲苯。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 -