JP2000245442A - イコサペンタエン酸を産生する微生物及びイコサペンタエン酸の製造方法 - Google Patents

イコサペンタエン酸を産生する微生物及びイコサペンタエン酸の製造方法

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JP2000245442A
JP2000245442A JP11046997A JP4699799A JP2000245442A JP 2000245442 A JP2000245442 A JP 2000245442A JP 11046997 A JP11046997 A JP 11046997A JP 4699799 A JP4699799 A JP 4699799A JP 2000245442 A JP2000245442 A JP 2000245442A
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和郎 渡部
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正純 鎌田
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潤二郎 照屋
Akiko Yamada
章子 山田
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玲子 湯
Ryuichiro Kurane
隆一郎 倉根
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ３０℃以上で生育し、且つイコサペンタエン
酸（EPA）生合成能を有するEPA産生細菌を新たに分離す
る。 【解決手段】 シーワネラ属に属し、イコサペンタエン
酸を産生する微生物であって、その産生温度の上限が３
２℃である微生物、及びこの微生物を培養し、得られる
培養物から脂質画分を単離することから成るイコサペン
タエン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はイコサペンタエン酸
(以下EPA)を産生する微生物であって、その産生温度の
上限が３２℃である微生物、及び該微生物を用いたEP
A、特にEPAを含有するリン脂質を製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】EPAは、n-3系列の高度不飽和脂肪酸とし
てn-6系列のイコサノイドの生成を競合的に抑制するこ
とによって、血栓性疾患による生活習慣病の発症を抑制
することが知られている。EPAエチルエステルはこのよ
うな効果に関してすでに医薬品として認可され、市販さ
れている。現在のEPA生産源は天然資源の魚油である
が、将来的に安定かつ大量供給できる生産源として微生
物が検討されている。そのなかで、海洋から分離したバ
クテリアはEPA生産源としては唯一の原核生物であり、
他のEPA生産源である真核生物と比較すると、EPAの生合
成酵素群をコードした遺伝子の組み換え操作が容易であ
り、他の生物にEPA生合成能を付与することも可能であ
る。これまでにEPA産生海洋細菌からクローニングされ
たEPA生合成遺伝子群によって大腸菌を形質転換して、E
PA生合成能を付与した技術が確立されている（特開平８
−２４２８６７号）。この遺伝子によるEPA生合成能
は、２５℃から低下し始め３０℃では失活する。従っ
て、３０℃以上に至適生育温度を有する多くの生物では
この遺伝子は作動しない。
【０００３】これまでに多くのEPA産生細菌が分離され
ているが、EPA生合成遺伝子群がクローニングされた例
はほかにない。現在知られているEPA産生細菌の生育温
度の上限は３０℃付近である。従って、これらのEPA生
合成遺伝子群のEPA生合成能も３０℃では失活すること
が予想できる。
【０００４】EPA産生細菌の特長の一つは、EPA生合成遺
伝子群をEPAの大量生産を可能にする酵母や油糧植物あ
るいは食品の原料となる他の生物に組み込み、これらの
生物にEPA産生能が付与できることである。しかしなが
ら、上述の生産温度の制限はこの特長を著しく制限す
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、３０
℃以上でもEPA生合成能を有するEPA生合成遺伝子群のク
ローニングをするために、３０℃以上で生育し、且つEP
A生合成能を有するEPA産生細菌を新たに分離することで
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上述の課題
を解決するために鋭意研究した結果、シーワネラ(Shewa
nella)属に属する微生物が、常圧、３０℃以上でEPA特
にEPA含有リン脂質を生産することを見出し、本発明を
完成させるに至った。
【０００７】すなわち本発明は、シーワネラ属に属し、
EPAを産生する微生物であって、その産生温度の上限が
３２℃である微生物、及びこの微生物を培養し、得られ
る培養物から脂質画分を単離することを特徴とするEPA
の製造方法を提供する。本発明の製造方法においては、
EPAは主にリン脂質の形で得られる。
【０００８】
【発明の実施の形態】（１）微生物 本発明の微生物は、シーワネラ属に属し、EPAを生産
し、かつその生産温度の上限が３２℃であるものであれ
ばいずれでもよく、このような微生物は自然界から新た
に分離することができ、あるいはその変異株であっても
よい。
【０００９】本発明のシーワネラ属に属する微生物とし
ては新菌株であるSCRC-1171及びSCRC-4337を挙げること
ができる。これらの菌株は１９９８年１２月１８日に、
工業技術院生命工学工業技術研究所に各々受託番号FERM
P-17095及びFERM P-17096として寄託されている。
【００１０】前記新菌株は次のようにして分離した。ま
ず、表１に示す組成の培地を調製した。
【００１１】
【表１】 表１ ────────────────── ペプトン 0.5% 酵母エキス 0.1% 寒天 1.5% 1/2濃度の人工海水 pH 7.0 ──────────────────
【００１２】この組成の寒天平板培地に、各地の海洋よ
り採取した海洋性生物体サンプルを滅菌した1/2濃度の
人工海水で適度に希釈して接種し、２５℃で３〜５日間
培養した。出現したコロニーを、表１の培地組成から寒
天を除いた液体培地に植菌して、２５℃で静置培養し
た。さらに、３０℃以上の振盪培養を行った。EPA生産
能は得られた培養液より後記の方法により検定した。こ
うして３２℃でEPAを顕著に生産する下記の株を得た。
これらのサンプルは日本国神奈川県の相模湾で採取され
た。これらの菌株は次の表２に示す菌学的性質を有す
る。
【００１３】
【表２】 表２ ────────────────────────────────── 観察項目 SCRC-1171 SCRC-4337 ────────────────────────────────── I形態 1 細胞の形 桿菌 桿菌 2 大きさ 1×2μm 1×2.5μm 3 多形性の有無 無 無 4 運動性の有無 無 無 5 胞子の有無 無 無 6 グラム染色 陰性 陰性 II各培地における生育状況 1 海水寒天培地 a)コロニーの形状（直径）0.8mm 1.2mm b)コロニーの形 円形 円形 c)コロニー表面の形状 平滑 平滑 d)コロニーの隆起状態 低い凸状 低い凸状 e)コロニーの周縁 全縁 全縁 f)コロニーの色調 クリーム色 灰色 g)コロニーの透明度 半透明 不透明 ──────────────────────────────────
【００１４】
【表３】 表２のつづき ────────────────────────────────── 観察項目 SCRC-1171 SCRC-4337 ────────────────────────────────── III生理学的性質 1 OFテスト NC O 2 硝酸塩の還元 ＋ ＋ 3 ウレアーゼ − − 4 オキシダーゼ ＋ ＋ 5 カタラーゼ ＋ ＋ 6 MR − − 7 VP ＋ − 8 生育の範囲 1〜32℃ 1〜32℃ 9 酸素に対する態度 好気的 好気的 10 糖類からの酸の産生 a)グルコース − − b)マルトース − − c)フラクトース − − d)ソルビトール − − e)ショ糖 − − f)キシロース − − 11 キノン型 Q-8 12 GC含量 40.7% 13 その他の諸性質 a)インドール生成 − − b)硫化水素生成 ＋ − c)0/129感受性(150μg) − − d)キチン分解能 − − e)Tween80分解能 ＋ ＋ f)ゼラチン分解能 ＋ ＋ g)でんぷん分解能 − − h)DNase − ＋ ──────────────────────────────────
【００１５】上記の菌学的性質に基づき、これらの菌株
を以下の文献に従って次のように同定した。
【００１６】SCRC-1171及びSCRC-4337は運動性を確認で
きなかったが、カタラーゼオキシダーゼ活性を有するグ
ラム陰性の桿菌であることから、文献イに従えばシュー
ドモナス科に属することが推定された。しかしながら、
SCRC-1171のキノン組成は既知種とは異なる。又、16SrR
NAの塩基配列の相同性からは２株ともシーワネラ属に最
も近いが、既知種の中に一致する種はない。従って、こ
れら２株はシーワネラ属の新種と考えられる。
【００１７】文献イ Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol.
1 (1984)ロ The Prokaryotes 2Ed., vol.1〜4 (1992)ハ Cowan and Steel's Manual for the Identification
of Medical Bacteria 3Ed.,(1993)ニ Manual of Non-fermenting Gram-negative Bacteria
(1985)ホ Identification Method in Applied and Environment
al Microbiology (1992)ヘ Manual of Clinical Microbiology 6Ed., (1995)
【００１８】以上、自然界から分離した菌株について詳
述したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性の
高い菌株を得ることもできる。本発明の菌株は常法に従
って保存することができ、例えば寒天スラント培地上
で、または凍結乾燥法により、またはグリセロール法に
より保存することができる。寒天スラント培地として
は、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用するこ
とができる。また、凍結乾燥保存、グリセロール保存の
常法に従って行うことができる。
【００１９】(2)EPAの製造方法 前記の微生物を培養してEPA、特にEPA含有リン脂質を製
造しようとする場合、基礎栄養培地として、本発明の微
生物が増殖し得るものであればいずれを使用してもよ
い。この培地は窒素源として例えば酵母エキス、ペプト
ン、肉エキスなどの１種類または複数種類を含む。ま
た、この培地には必要に応じて炭素源として各種の糖類
を加えることができる。この培地には天然海水や人工海
水を加えることが好ましい。培養は固体培地または液体
培地のいずれを用いてもよいが、目的とするEPA、特にE
PA含有リン脂質を多量に得るためには、液体培地を用
い、静置培養もしくは振盪培養、通気・撹拌培養などに
より好気的条件下で培養を行うことが好ましい。培養温
度は菌が生育し、EPAが生産される温度範囲であればい
ずれの温度でもよく、4〜32℃である。pHは6〜9、好ま
しくは7〜8の範囲である。培養時間は採取し得る量のEP
A含有リン脂質が生産される時間を選べばよく、通常10
〜72時間である。
【００２０】次に得られた培養物からEPAが採取され
る。その方法としては、脂質を単離する通常の脂質製造
方法を用いることができる。例えば、培養液から遠心分
離、ろ過などの常用の手段によって菌体を集める。次に
この菌体を所望により水、食塩水、または緩衝液、例え
ばリン酸緩衝液などにより洗浄した後、これらの液中に
再懸濁する。この懸濁液を脂質の抽出のために常用され
ている溶剤、例えばクロロホルム／メタノール混合物に
より抽出し、相分離してクロロホルム相を得る。次にこ
のクロロホルム相を蒸発除去することによりEPA含有リ
ン脂質を含む材料が得られる。得られたEPA含有リン脂
質を常法によりけん化することによって遊離のEPAまた
はその塩を得ることができ、更にエステル化によりEPA
エステルが得られる。
【００２１】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。ただし、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２２】
【実施例】実施例１；シーワネラsp. SCRC-1171（FERM
P-17095）からのEPA含有リン脂質およびEPAメチルエス
テルの生産 ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%を50%濃度の人工海水に
溶解し、pH7.0に調整した培地100mlを121℃、15分間加
熱滅菌した後、シーワネラsp. SCRC-1171(FERM P-1709
5)を接種し、32℃で24時間好気的に培養した。培養後、
遠心分離機で菌体を採取して凍結乾燥を行い、乾燥重量
0.175gの菌体を得た。菌体を5%塩酸メタノール溶液に溶
解して１時間加熱して脂肪酸メチルエステルを調製し
た。これをガスクロマトグラフにて定量分析した結果、
EPAメチルエステルとして0.071mg含まれていることがわ
かった。
【００２３】実施例２；シーワネラsp. SCRC-4337（FER
M P-17096）からのEPA含有リン脂質およびEPAメチルエ
ステルの生産 ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%を50%濃度の人工海水に
溶解し、pH7.0に調整した培地100mlを121℃、15分間加
熱滅菌した後、シーワネラsp. SCRC-4337(FERM P-1709
6)を接種し、32℃で24時間好気的に培養した。培養後、
遠心分離機で菌体を採取して凍結乾燥を行い、乾燥重量
0.164gの菌体を得た。菌体を5%塩酸メタノール溶液に溶
解して１時間加熱して脂肪酸メチルエステルを調製し
た。これをガスクロマトグラフにて定量分析した結果、
EPAメチルエステルとして0.041mg含まれていることがわ
かった。
【発明の効果】本発明の微生物を使用することにより、
最高温度３２℃までEPAを発酵生産することができる。
すなわち、この微生物からクローニングされるEPA生合
成遺伝子を他の生物に組み込んだ場合も、最高温度３２
℃までEPAを生産できるので利用可能な生物種が多様に
なる。本発明で得られるEPA及びEPA濃縮物は医薬、薬物
キャリヤー、食品添加剤、健康食品として用いられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 長畑 ゆみ子 神奈川県相模原市相模台２−18−３ (72)発明者 渡部 和郎 神奈川県相模原市南台１−９−２ (72)発明者 鎌田 正純 神奈川県相模原市星が丘１−15−16 (72)発明者 照屋 潤二郎 神奈川県相模原市西大沼４−４−１ (72)発明者 山田 章子 神奈川県相模原市若松６−１−27−Ｂ− 305 (72)発明者 湯 玲子 神奈川県横浜市緑区霧が丘３−24−４− 108 (72)発明者 倉根 隆一郎 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B064 AD90 CA02 CE02 CE08 CE17 DA01 4B065 AA01X AC12 BA22 CA13 CA44

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 シーワネラ属に属し、イコサペンタエン
    酸を産生する微生物であって、その産生温度の上限が３
    ２℃である微生物。
  2. 【請求項２】 微生物がシーワネラsp.SCRC-1171又はシ
    ーワネラsp.SCRC-4337である請求項１に記載の微生物。
  3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の微生物を培養
    し、得られる培養物から脂質画分を単離することを特徴
    とするイコサペンタエン酸の製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2009060814A (ja) * 2007-09-05 2009-03-26 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 微生物を用いた高度不飽和脂肪酸及び高度不飽和脂質の製造方法
WO2023157948A1 (ja) * 2022-02-21 2023-08-24 Dic株式会社 経口用組成物

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JP2009060814A (ja) * 2007-09-05 2009-03-26 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 微生物を用いた高度不飽和脂肪酸及び高度不飽和脂質の製造方法
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