JPH11318484A - 微生物による標識高度不飽和脂肪酸の製造方法 - Google Patents

微生物による標識高度不飽和脂肪酸の製造方法

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JPH11318484A
JPH11318484A JP10132436A JP13243698A JPH11318484A JP H11318484 A JPH11318484 A JP H11318484A JP 10132436 A JP10132436 A JP 10132436A JP 13243698 A JP13243698 A JP 13243698A JP H11318484 A JPH11318484 A JP H11318484A
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和郎 渡部
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東郎 中原
Toshihiro Yokochi
俊弘 横地
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 同位体で標識された高度不飽和脂肪酸又はそ
のエステル体の製造方法を提供する。 【解決手段】 海生菌シゾキトリウム sp. N1-27を13C
標識培地を用いて培養し、該培養物から13C標識ドコサ
ペンタエン酸および13C標識ドコサヘキサエン酸、ある
いは14C標識ドコサペンタエン酸および14C標識ドコサヘ
キサエン酸を採取することを特徴とする標識ドコサペン
タエン酸および標識ドコサヘキサエン酸の製造方法。 【効果】 13Cあるいは14Cでユニフォーマル標識された
ドコサペンタエン酸およびドコサへキサエン酸を効率よ
く発酵生産することができる。とくに安定同位体である
13Cでユニフォーマル標識されたドコサペンタエン酸お
よびドコサへキサエン酸は、安全であるため直接人体へ
の投与も可能である。また、標識化合物を用いることに
よって、これまで不明であったドコサペンタエン酸およ
びドコサヘキサエン酸の生理作用機作などを明かにする
ことができ、これら有用な高度不飽和脂肪酸の持つ薬理
作用をより有効に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物による標識高
度不飽和脂肪酸の製造方法に関するものであり、更に詳
しくは、ドコサペンタエン酸（以下ＤＰＡ）およびドコ
サヘキサエン酸（以下ＤＨＡ）の生産能の高い微生物を
用いた標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡの製造方法、並びに
該微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、同位体は原子番号が同じである
ことから、化学的、あるいは生化学的な性質が同じであ
ることに基づいて、トレーサー実験に用いられるが、質
量数の違いによる同位体効果が観察されることがある。
最も有名な例は、水素の同位体である二重水素からなる
水は植物の生育を阻害することである。微生物の培養に
用いる炭素源を炭素の同位体で置換した場合、それらの
比は水素の同位体の質量数の比よりも小さいので、同位
体効果も小さいと考えられるが、この仮定は証明されて
いない。また、同位体が脂肪酸に取り込まれる効率は、
微生物の代謝過程に依存するので、用いる炭素源によっ
て異なる。
【０００３】高度不飽和脂肪酸類、特にＤＰＡやＤＨＡ
を生産することが出来る微生物として、例えば、特表平
5-503425号公報(WO91/11918)には藻類である渦鞭毛虫の
クリプテコディニウム(Crypthecodinium)属に属する微
生物が開示されているが、この微生物は基質を選ぶこと
が明細書中に記載されている。また、13C標識ＤＨＡの
製造法への言及もあるが実施例の記載はなく13C標識Ｄ
ＨＡの生成は確認されていない。
【０００４】ジャーナル・オブ・ファーメンテーション
・アンド・バイオエンジニアリング[例えば、Journal o
f Fermentation and Bioengineering Vol.81,No.1,76-7
8(1996)]には、ラビリンチュラ(Labyrinthulina)類のト
ラストキトリウム(Traustocytrium)属に属するトラスト
キトリム・アウレム(Thraustochytrium aureum)ATCC-34
304によるＤＨＡ生産の詳細な報告がある。また、ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・オイル・ケミスト・ソサエ
ティ［例えば、Journal of American Oil Chemists' So
ciety Vol. 73, No. 11, (1421-1426)］にはラビリンチ
ュラ類のシゾキトリウム（Schizochytrium）属に属する
新種、SR21によるＤＰＡ及びＤＨＡ生産の詳細な報告が
ある。しかし、いずれも標識ＤＰＡ及びＤＨＡの製造に
は言及されていない。
【０００５】微生物を用いて13Cでユニフォーマルに標
識された高度不飽和脂肪酸の製造方法としては、イコサ
ペンタエン酸やアラキドン酸(特開平5-246939号、特開
平6-340577号、特開平7-2724号公報)について知られて
いるが、13Cあるいは14Cでユニフォーマルに標識された
ＤＰＡやＤＨＡの報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ユニ
フォーマルに標識された13C標識ＤＰＡおよび13C標識Ｄ
ＨＡあるいは14C標識ＤＰＡおよび14C標識ＤＨＡの効率
的な製造方法およびこれを用いる新規微生物を提供する
ことである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上述の課題
を解決するために鋭意研究した結果、海生菌シゾキトリ
ウム(Schizochytrium) sp. N1-27が、ＤＰＡおよびＤＨ
Ａを選択的にかつ効率よく生産することを見出した。ま
た、この微生物の培養液中に安価な13Cあるいは14C標識
炭素源を添加することによって、同位体効果による生産
性の低下などの影響もなく、ユニフォーマルに標識され
た13C標識ＤＰＡおよび13C標識ＤＨＡあるいは14C標識
ＤＰＡおよび14C標識ＤＨＡが生成することを見出し、
本発明を完成させるに至った。
【０００８】すなわち本発明は、海生菌シゾキトリウム
(Schizochytrium) sp. N1-27を13Cあるいは14C標識炭素
源を添加した培地で培養し、該培養物から13Cあるいは
14C標識ＤＰＡおよびＤＨＡを採取することを特徴とす
る該化合物の製造方法、並びに該微生物を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】（１）13C標識ＤＰＡおよび13C標
識ＤＨＡあるいは14C標識ＤＰＡおよび14C標識ＤＨＡの
製造方法 海生菌シゾキトリウム sp. N1-27を培養してＤＰＡおよ
びＤＨＡを製造しようとする場合、基礎栄養培地として
はこの微生物が増殖し得るものであればいずれを使用し
てもよい。この培地は窒素源として例えば酵母エキス、
ポリペプトンなどの１種類又は複数種類を含有する。ま
た、この培地には標識炭素源としてグルコースの様な各
種の13Cあるいは14C標識糖類を加える。糖類のほかに13
Cあるいは14Cで標識された酢酸ナトリウム、アミノ酸
類、二酸化炭素等も標識炭素源として用いられる。この
培地には天然海水や人工海水を加えることが好ましい。
より具体的には、例えば13Cあるいは14C標識グルコース
3.0％、酵母エキス0.5％を50％濃度の人工海水に溶解し
た培地、あるいは13Cあるいは14C標識酢酸ナトリウム3.
0％、酵母エキス0.5％を50％濃度の人工海水に溶解した
培地を用いる。
【００１０】培養は固体培地又は液体培地のいずれを用
いてもよいが、目的とする標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡ
を多量に得るためには、液体培地を用い、静置培養もし
くは振盪培養、通気・撹拌培養などにより好気的条件下
で培養を行なうことが好ましい。培養温度は菌が生育
し、標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡが生産される温度範囲
であればいずれの温度でもよく、好ましくは１５〜３５
℃であり、より好ましくは１８〜３０℃である。pHは６
〜９の範囲である。培養時間は採取し得る量の標識ＤＰ
Ａおよび標識ＤＨＡ含有脂質が生産される時間を選べば
よく好ましくは１〜７日間である。
【００１１】次に得られた培養物から標識ＤＰＡおよび
標識ＤＨＡが採取される。採取法としては通常の脂質精
製法を用いることができる。例えば、培養液から遠心分
離、濾過などの常用の手段によって菌体を集める。次に
この菌体を所望により水、食塩水、又は緩衝液、例えば
リン酸緩衝液などにより洗浄した後、これらの液中に再
懸濁する。この懸濁液を脂質の抽出のために常用されて
いる溶剤、例えばクロロホルム／メタノール混合物によ
り抽出し、相分離してクロロホルム相を得る。次にこの
クロロホルム相を蒸発除去することにより標識ＤＰＡお
よび標識ＤＨＡ含有脂質を含む材料が得られる。常法に
よりこれをけん化することによって遊離の標識ＤＰＡお
よび標識ＤＨＡ、又はその塩を得ることができ、エステ
ル化によって標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡエステルが得
られる。これら標識ＤＰＡおよび標識ＤＨＡの精製は、
硝酸銀処理シリカゲル薄層クロマトグラフィー(TLC)や
硝酸銀処理シリカゲルクロマトグラフィーによって行う
ことができる。
【００１２】菌体中のあらゆる脂肪酸誘導体の脂肪酸組
成は、培養された菌体を凍結乾燥後、常法により塩酸メ
タノールあるいはナトリウムメチラート等でメチルエス
テル化またはエチルエステル化し、GC-MSで分析するこ
とができる。また、湿菌体あるいは乾操菌体から適当な
有機溶剤などを用いて脂質を抽出し、シリカゲルTLCに
て脂質を分画した後、各々脂質についてもその構成脂肪
酸組成を同様にして分析できる。なお、本発明において
エステル体とはメチルエステル、エチルエステル、プロ
ピルエステル等のアルキルエステル、モノ、ジ及びトリ
グリセリド、リン脂質などを意味する。
【００１３】（２）微生物 本発明の海生菌シゾキトリウム(Schizochytrium) sp. N
1-27は次のようにして分離した。まず、表１に示す組成
の培地を調製した。
【００１４】
【表１】表１ ────────────────────── グルコース 0.2 % ポリペプトン 0.5 % 酵母エキス 0.05 % 寒天 1.5 % クロラムフェニコール 0.015 % 1／2濃度の人工海水 pH6.0〜7.0 ──────────────────────
【００１５】滅菌海水と滅菌松花粉を入れた試験管に、
茨城県那珂湊港より採取した表層海水を加え、常温で３
〜５日間置いた後、水表面に浮遊している松花粉を拾っ
てこの組成の寒天平板培地に播種し、25℃で２〜４日間
培養した。出現したコロニーを、表1の培地組成から寒
天とクロラムフェニコールを除いた液体培地に植菌し
て、25℃で静置培養した。n−3およびn−6高度不飽和脂
肪酸生産能は得られた培養液を前記の方法により検定し
た。このようにして、ＤＰＡおよびＤＨＡを顕著に生産
する海生菌シゾキトリウム(Schizochytrium) sp. N1-27
（海生菌 N1-27）を得た。この菌株は、工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号 ＦＥＲＭ−Ｐ１６７５
７として寄託された。この菌株は、炭素源の利用能につ
いて次の表２に示す特徴を有する。
【００１６】
【表２】 表２ 炭素源の利用 ─────────────────────────────────── 炭素源 N1-27 SR21 T. aureum (ATCC34304) ─────────────────────────────────── フマル酸 + ++ ++ L-リンゴ酸 + + ++ コハク酸メチル - ++ +++ 臭化コハク酸 - + + L-グルタミン酸 - ++ + g-アミノ酪酸 - ++ ++ a-ケトグルタル酸 + ++ ++ 2-ケトグルコン酸 + - + D-グルコン酸 + - + デキストリン + ++ ++ イヌリン +++ + + セルビオース + t t ゲンチオビオース - +++ +++ ショ糖 - - t D-トレハロース ++ - t N-アセチル-D-グルコサミン - t t a-D-グルコース + +++ ++ D-ガラクトース ++ +++ ++ D-プシコース - + + b-メチル-D-グリコシド t +++ t アミグダリン ++ - t サリシン + ++ + D-マンニトール - + - ───────────────────────────────────
【００１７】
【表３】 表２つづき ─────────────────────────────────── 炭素源 N1-27 SR21 T. aureum (ATCC34304) ─────────────────────────────────── D-ソルビトール - ++ t キシリトール - - t グリセリン + +++ +++ トゥイーン80 +++ + + D-リボース ++ - t D-キシロース + - + コハク酸メチル＋D-キシロース ++ ++ +++ D-グルクロン酸＋D-キシロース - + + デキストリン＋D-キシロース ++ ++ ++ D-ガラクトース＋D-キシロース + +++ ++ ─────────────────────────────────── 表中、炭素利用能が高い順に、「+++」、「++」、
「+」、「t」で示し、「-」は増殖が検出できなかった
ことを示す。
【００１８】海生菌シゾキトリウム sp.N1-27は、ＤＨ
Ａ生産能が報告されている前出のシゾキトリウムsp.SR2
1及びトラストキトリム・アウレムATCC34304と炭素源の
利用能において明らかに異なる。さらに、シゾキトリウ
ム sp.N1-27の炭素源利用能のスペクトルは、n-3高度不
飽和脂肪酸の製造において報告されたシゾキトリウム属
とトラストキトリウム属の微生物（特表平８−５０９３
５５号）とも異なる。
【００１９】また、菌学的特徴の指標の一つである塩分
要求性については、シゾキトリウムsp. N1-27は海水濃
度の1.5倍に極大値を示した。一方、トラストキトリム
・アウレムATCC34304の塩分要求性は海水濃度の0.5倍に
極大値を示すことが報告されている［Journal of Ferme
ntation and Bioengineering Vol. 81, No. 1, (76-7
8)］。
【００２０】本発明の菌は好気性で、長さの異なる二本
の鞭毛を有する遊走子を経る増殖をし、また寒天培地上
では酵母様のコロニーを作る。このような特徴から、本
菌株は海洋環境に広く分布する菌類として扱われてきた
ラビリンチュラ類に属する。ラビリンチュラ類の主要な
属としては、シゾキトリウム属の他にトラストキトリウ
ム属がある。液体培地中においてシゾキトリウム属の生
長細胞は二分裂増殖を繰り返し、細胞塊を形成するのに
対して、トラストキトリウム属ではこのような増殖と細
胞塊を形成しないことからこれらの属は区別される［My
cological Research Vol. 102, No. 4, (439-448)］。
従って、本菌は上述のような細胞の分裂様式により、シ
ゾキトリウム（Schizochytrium）属に分類される。さら
に、炭素源利用能が既知の種と一致しないことから、シ
ゾキトリウム属の新種と同定された。
【００２１】以上、自然界から分離した菌株について詳
細に記述したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生
産性の高い菌株を得ることもできる。本発明の菌株は常
法に従って保存することができ、例えば寒天スラント培
地上で、または凍結乾燥法により、又はグリセロール法
により保存することができる。寒天スラント培地とし
て、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用するこ
とができる。又、凍結乾燥保存、グリセロール保存も常
法に従って行なうことができる。
【００２２】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。ただし、本発明はそれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００２３】
【実施例】参考例１ [13C]グルコース(13C;25%) 3%、コーンスティープリカ
0.05%、酵母エキス 0.05%、酢酸ナトリウム 0.25%、硫
酸アンモニウム 0.1%、人工海水 50%からなる培地20ml
にトラストキトリム・アウレムATCC-34304を植菌して25
℃で振盪培養した。培養64時間で菌体密度は最高値に達
した。このときの乾燥菌体重量は140mgであった。乾燥
菌体中の構成脂肪酸を塩酸メタノール法でメチルエステ
ルとしてGC-MS分析を行った。その結果、DHAメチルエス
テルの親イオンとしてm/z=342, 344, 346, 348, 350, 3
52, 354のイオンが検出された。非標識グルコースの培
地で培養した菌体から得たDHAメチルエステルのm/zが34
2であるので、標識率は0〜55%であり、最も生成量の多
い13C標識DHAの標識率は27%であった。また、ドコサペ
ンタエン酸(DPA)の親イオンとしてm/z=344, 346, 348,
350, 352, 354のイオンが検出された。非標識グルコー
スの培地で培養した菌体から得たDHAメチルエステルのm
/zが344であるので、標識率は0〜45%であり、最も生成
量の多い13C標識DHAの標識率は27%であった。同じ試料
のGLC分析から、これらの13C標識DHAと13C標識DPAは各
々26mgと6.8mg生成したことがわかった。
【００２４】参考例２ 非標識n−3およびn−6高度不飽
和脂肪酸の調製 酢酸ナトリウム3.0％、酵母エキス0.5％を50％濃度の人
工海水に溶解した培地200mlを加熱滅菌した後、海生菌
シゾキトリウム sp．N1-27を接種し、25℃で120時間好
気的に培養した。培養後、遠心分離器で菌体を採取し、
湿重量2.1gの菌体を得た。この菌体を凍結乾燥後、塩酸
メタノールを加えて加熱し脂肪酸メチルエステルを得
た。メチルエステルをガスクロマトグラフィで分析した
結果を表３に示した。
【００２５】
【表４】表３ 海生菌 N1-27株の脂肪酸組成 ─────────────── FA mg/l mol％ ─────────────── C14:O 196 7.4 C15:O 85 3.0 C16:0 971 32.8 C16:1n-7 130 4.4 C17:0 28 0.9 C18:0 31 0.9 C18:1n-9 146 4.9 C20:4n-3 14 0.4 C20:5n-3 23 0.7 C22:5n-6 518 13.7 C22:5n-3 23 0.6 C22:6n-3 1130 30.2 ─────────────── total 3294 100．0 ───────────────
【００２６】実施例１；13Cユニフォーマル標識n-3およ
びn-6高度不飽和脂肪酸の調製 [13C]グルコース(13C;25 atom%)3.0%、酵母エキス0.05
%、コーンステイープリカー0.05%、酢酸ナトリウム0.25
%、硫酸アンモニウム0.1%を50%濃度の人工海水に溶解
し、PHを6.0に調製した培地20mlを加熱およびろ過によ
って滅菌した後、海生菌シゾキトリウム sp.N1-27を接
種し、25℃で145時間好気的に培養した。培養後、遠心
分離器で菌体を採取し、湿重量168mgの菌体を得た。こ
の菌体を凍結乾操後、塩酸メタノールを加えて加熱し脂
肪酸メチルエステルを得た。n-3高度不飽和脂肪酸とし
てドコサへキサエン酸を68mg、n-6高度不飽和脂肪酸と
してドコサペンタエン酸を28mg得た。これらの脂肪酸メ
チルエステルを質量分析計で測定し、親イオンの値から
標識率を求めたところ、ドコサヘキサエン酸、ドコサペ
ンタエン酸とも平均18%、最高55％であった。
【００２７】実施例2;13Cユニフォーマル標識n-3および
n-6高度不飽和脂肪酸の調製 [13C]酢酸ナトリウム(13C;99 atom%)3.0%、酵母エキス0.
5%を50%濃度の人工海水に溶解し、PHを6.0に調製した培
地33mlを加熱滅菌した後、海生菌シゾキトリウム sp.Nl
-27を接種し、25℃で118時間好気的に培養した。培養
後、遠心分離器で菌体を採取し、湿重量222mgの菌体を
得た。この菌体を凍結乾燥後、塩酸メタノールを加えて
加熱し脂肪酸メチルエステルを得た。n-3高度不飽和脂
肪酸としてドコサヘキサエン酸を24mg、n-6高度不飽和
脂肪酸としてドコサペンタエン酸を8mg得た。これらの
脂肪酸メチルエステルを質量分析計で測定し、親イオン
の値から標識率を求めたところ、ドコサへキサエン酸、
ドコサペンタエン酸とも100%であった。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、13Cあるいは14Cでユニフ
ォーマル標識されたドコサペンタエン酸およびドコサへ
キサエン酸を効率よく発酵生産することができる。とく
に安定同位体である13Cでユニフォーマル標識されたド
コサペンタエン酸およびドコサへキサエン酸は、安全で
あるため直接人体への投与も可能である。これによっ
て、これまで実験が不可能であったヒトのインビボ(in
vivo)におけるドコサペンタエン酸/ドコサへキサエン酸
の代謝を検討することができ、高度不飽和脂肪酸などの
個体差を考慮した使用が可能になる。また、標識化合物
を用いることによって、これまで不明であったドコサペ
ンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の生理作用機作な
どを明かにすることができ、これら有用な高度不飽和脂
肪酸の持つ薬理作用をより有効に利用できる。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年３月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】ジャーナル・オブ・ファーメンテーション
・アンド・バイオエンジニアリング[例えば、Journal o
f Fermentation and Bioengineering Vol.81,No.1,76-7
8(1996)]には、ラビリンチュラ(Labyrinthuliae)類のス
ラウストキトリウム(Thraustochytrium)属に属するスラ
ウストキトリウム・アウレム(Thraustochytrium aureu
m)ATCC-34304によるＤＨＡ生産の詳細な報告がある。ま
た、ジャーナル・オブ・アメリカン・オイル・ケミスト
・ソサエティ［例えば、Journal of AmericanOil Chemi
sts' Society Vol. 73, No. 11, (1421-1426)］にはラ
ビリンチュラ類のシゾキトリウム（Schizochytrium）属
に属する新種、SR21によるＤＰＡ及びＤＨＡ生産の詳細
な報告がある。しかし、いずれも標識ＤＰＡ及びＤＨＡ
の製造には言及されていない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】微生物を用いて13Cでユニフォーマルに標
識された高度不飽和脂肪酸の製造方法としては、イコサ
ペンタエン酸やアラキドン酸(特開平5-246939号、特開
平6-340577号、特開平7-2424号公報)について知られて
いる。また、ＤＰＡやＤＨＡについては、鞭毛藻類から
の14Cでユニフォーマル標識物が報告されているだけで
（Biochimica et Biophysica ACTA Vol.137,420-426(19
67);Biochimica et Biophysica ACTA Vol.187,201-207
(1969)）、その標識率や生産量に関する知見はない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】海生菌シゾキトリウム sp.N1-27は、ＤＨ
Ａ生産能が報告されている前出のシゾキトリウムsp.SR2
1及びスラウストキトリウム・アウレムATCC34304と炭素
源の利用能において明らかに異なる。さらに、シゾキト
リウム sp.N1-27の炭素源利用能のスペクトルは、n-3高
度不飽和脂肪酸の製造において報告されたシゾキトリウ
ム属とスラウストキトリウム属の微生物（特表平８−５
０９３５５号）とも異なる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】また、菌学的特徴の指標の一つである塩分
要求性については、シゾキトリウムsp. N1-27は海水濃
度の1.5倍に極大値を示した。一方、スラウストキトリ
ウム・アウレムATCC34304の塩分要求性は海水濃度の0.5
倍に極大値を示すことが報告されている［Journal of F
ermentation and Bioengineering Vol. 81, No. 1, (76
-78)］。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】本発明の菌は好気性で、長さの異なる二本
の鞭毛を有する遊走子を経る増殖をし、また寒天培地上
では酵母様のコロニーを作る。このような特徴から、本
菌株は海洋環境に広く分布する菌類として扱われてきた
ラビリンチュラ類に属する。ラビリンチュラ類の主要な
属としては、シゾキトリウム属の他にスラウストキトリ
ウム属などが提案されている。液体培地中においてシゾ
キトリウム属の生長細胞は二分裂増殖を繰り返し、細胞
塊を形成するのに対して、スラウストキトリウム属では
このような増殖と細胞塊を形成しないことからこれらの
属は区別される［Mycological Research Vol. 102, No.
4, (439-448)］。従って、本菌は上述のような細胞の
分裂様式により、シゾキトリウム（Schizochytrium）属
に分類される。さらに、炭素源利用能が既知の種と一致
しないことから、シゾキトリウム属の新種と同定され
た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】
【実施例】参考例１ [13C]グルコース(13C;25%) 3%、コーンスティープリカ
0.05%、酵母エキス 0.05%、酢酸ナトリウム 0.25%、硫
酸アンモニウム 0.1%、人工海水 50%からなる培地20ml
にスラウストキトリウム・アウレムATCC-34304を植菌し
て25℃で振盪培養した。培養64時間で菌体密度は最高値
に達した。このときの乾燥菌体重量は140mgであった。
乾燥菌体中の構成脂肪酸を塩酸メタノール法でメチルエ
ステルとしてGC-MS分析を行った。その結果、DHAメチル
エステルの親イオンとしてm/z=342,344, 346, 348, 35
0, 352, 354のイオンが検出された。非標識グルコース
の培地で培養した菌体から得たDHAメチルエステルのm/z
が342であるので、標識率は0〜55%であり、最も生成量
の多い13C標識DHAの標識率は27%であった。また、ドコ
サペンタエン酸(DPA)の親イオンとしてm/z=344, 346, 3
48, 350, 352, 354のイオンが検出された。非標識グル
コースの培地で培養した菌体から得たDHAメチルエステ
ルのm/zが344であるので、標識率は0〜45%であり、最も
生成量の多い13C標識DHAの標識率は27%であった。同じ
試料のGLC分析から、これらの13C標識DHAと13C標識DPA
は各々26mgと6.8mg生成したことがわかった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】
【発明の効果】本発明により、13Cあるいは14Cでユニフ
ォーマル標識されたドコサペンタエン酸およびドコサへ
キサエン酸を効率よく発酵生産することができる。とく
に安定同位体である13Cでユニフォーマル標識されたド
コサペンタエン酸およびドコサへキサエン酸は、安全で
あるため直接人体への投与も可能である。これによっ
て、これまで実験が不可能であったヒトのインビボ(in
vivo)におけるドコサペンタエン酸/ドコサへキサエン酸
の代謝を検討することができ、個体差を考慮した高度不
飽和脂肪酸などの使用が可能になる。また、標識化合物
を用いることによって、これまで不明であったドコサペ
ンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の生理作用機作な
どを明かにすることができ、これら有用な高度不飽和脂
肪酸の持つ薬理作用をより有効に利用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 中原 東郎 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 横地 俊弘 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 海生菌シゾキトリウム sp. N1-27を13C
    標識炭素源あるいは14C標識炭素源を添加した培地で培
    養し、該培養物から13C標識ドコサペンタエン酸および
    13C標識ドコサヘキサエン酸、あるいは14C標識ドコサペ
    ンタエン酸および 14C標識ドコサヘキサエン酸を採取す
    ることを特徴とする標識高度不飽和脂肪酸の製造方法。
  2. 【請求項２】 標識ドコサペンタエン酸および標識ドコ
    サヘキサエン酸を産生する海生菌シゾキトリウム sp. N
    1-27およびその変異株。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003000292A (ja) * 2001-06-22 2003-01-07 Patent Capital Inc 高度不飽和脂肪酸の製造方法
WO2015182787A1 (ja) * 2014-05-30 2015-12-03 国立大学法人 宮崎大学 オーランチオキトリウム属に属する新規微生物およびそれを用いた液体燃料の製造方法
WO2017131188A1 (ja) * 2016-01-28 2017-08-03 日本水産株式会社 高度不飽和脂肪酸を含む油脂の製造方法
CN111235035A (zh) * 2019-12-30 2020-06-05 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用

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