KR100367806B1 - 2-메틸퀴녹살린의 미생물에 의한 전환 방법 - Google Patents

2-메틸퀴녹살린의 미생물에 의한 전환 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2-메틸퀴녹살린으로부터 2-퀴녹살린카르복실산을 미생물에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물을, 화학식 2의 화합물의 메틸기를 하기 화학식 1의 카르복실기로 산화시킬 수 있는 미생물과 접촉시키고, 생성 혼합물을 화학식 1의 화합물 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는, 화학식 1의 화합물의 미생물에 의한 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 2-메틸퀴녹살린으로부터 2-퀴녹살린카르복실산을 높은 수율로 수득할 수 있다.

Description

2-메틸퀴녹살린의 미생물에 의한 전환 방법{Microbial Conversion of 2-Methylquinoxaline}
본 발명은 2-퀴녹살린카르복실산의 신규 제조 방법, 보다 구체적으로는 2-메틸퀴녹살린의 2-퀴녹살린카르복실산으로의 미생물에 의한 산화 방법에 관한 것이다.
특정 방향족 헤테로싸이클의 미생물에 의한 산화 방법, 특히 특정 방향족 헤테로싸이클 상의 메틸기의 미생물에 의한 산화 방법은, 예를 들어 다음 2개의 문헌, 즉, 하라야마 (S. Harayama) 등의 J. Bacteriol., 167(2): 455-461 (1986), 'Gene Order of the TOL Catabolic Plasmid Upper Pathway Operon and Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol by the xylA Product' 및 케이너 (A. Keiner)의 Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 31(6): 774-775 (1992), 'Enzymatic Oxidation of Methyl Groups on Aromatic Heterocycles: A Versatile Method for the Preparation of Heteroaromatic Carboxylic Acids'에 기재된 방법에 공지되어 있다.
미국 특허 제4,859,592호에는 화학적 방법에 의해 피리딘 생성물로 전환될수 있는 피콜린산의 미생물에 의한 제조 방법이 개시되어 있다.
미국 특허 제5,104,798호, 동 제5,213,973호 및 동 제5,236,832호에는 인듀서(inducer)로서 톨루엔, 크실렌 또는 시멘을 이용하여 세균 종인 슈도모나스 (Pseudomonas)에 의해 수행되는, 특정 방향족 5원 또는 6원 고리 헤테로싸이클의 메틸기의 대응하는 카르복실산으로의 미생물에 의한 산화 방법이 개시되어 있다. 상기 특허에 개시되어 있는 바와 같이, 균주 슈도모나스 푸티다(putida) ATCC No. 33015에 의한 톨루엔의 메틸기의 벤조산으로의 산화가 각각 톨루엔 모노옥시게나제, 알콜 데히드로게나제 및 알데히드 데히드로게나제에 의해 촉매화되는 3단계를 포함함은 당업계에 공지되어 있다.
하라야먀 등의 상기 문헌에 이미 기술되어 있는 바와 같이, 피. 푸티다 mt-2의 TOL 플라스미드 pWWO는 톨루엔, m-크실렌 및 p-크실렌을 포함하여 몇개의 방향족 탄화수소의 산화적 이화작용에 필요한 모든 효소를 코딩하는 전달가능 염색체외 성분이다. TOL 플라스미드를 보유하는 세균, 예를 들어 피. 푸티다 ATCC No. 33015은 특정 방향족 탄화수소를 대응하는 방향족 카르복실산으로 전환시킬 수 있고, 크실렌 분해 효소를 코딩하는 xyl 오페론과 xyl 유전자의 조절 작용을 하는 유전자는 모두 TOL 플라스미드 pWWO 상에 존재한다. 상기 산화에 필요한 효소를 코딩하는 TOL 플라스미드 pWWO 상의 유전자는 상기 효소를 생산하기 위해서는 유도되어야 한다. 이와같은 유도에 대한 내용은 상기 미국 특허 제5,104,798호, 동 제5,213,973호 및 동 제5,236,832호에 기재되어 있다.
문헌 [Gaucher et al., Dev. Ind. Microbiol., 22: 219-232 (1981)]에 기재되어 있는 바와 같이, 진균 페니실리움 그리세오풀붐(Penicillium griseofulvum)은 m-크레졸의 m-히드록시벤조산으로의 전환에 필요한 3가지 효소인 m-크레졸 메틸 히드록실라제, m-히드록시벤질 알콜 데히드로게나제 및 m-히드록시벤즈알데히드 히드록실라제를 함유한다.
반복하지만, 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 진균 및 세균은 특정 방향족 고리 상의 메틸기를 대응하는 카르복실산으로 산화시키기 위한 효소를 함유한다. 상기 헤테로방향족 고리 상의 메틸기를 미생물을 이용하여 대응하는 카르복실산으로 산화시킬 수 있음이 공지되어 있지만, 상기 미생물에 의한 산화의 화학적 및 광학적 수율이 예를 들어 선택된 특정 미생물, 기질의 농도, 기질의 구조 등에 따라 실질적으로 변한다는 것을 당업계의 숙련자는 이해할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 미생물의 산화 작용을 이용하여 2-메틸퀴녹살린으로부터 2-퀴녹살린카르복실산을 높은 수율로 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하고자 연구를 거듭한 결과, 진균 및 세균을 포함하는 미생물이 2-메틸퀴녹살린을 2-퀴녹살린카르복실산으로 실질적으로 산화시키고, 이와 같이 생산된 2-퀴녹살린카르복실산을 적절하게 회수할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 2-메틸퀴녹살린으로부터 2-퀴녹살린카르복실산을 미생물에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물을, 화학식 2의 화합물의 메틸기를 하기 화학식 1의 화합물의 카르복실기로 산화시킬 수 있는 미생물과 접촉시키고, 생성 혼합물을 화학식 1의 화합물의 생산에 적합한 조건 하에 인큐베이션하는, 화학식 1의 화합물의 미생물에 의한 제조 방법에 관한 것이다.
<화학식 1>
<화학식 2>
따라서, 본 발명은 아브시디아 글라우카 (Absidia glauca) ATCC No. 22752, 아브시디아 글라우카 ATCC No. 74480, 아브시디아 슈도실린드로스포라 (pseudocylindrospora) ATCC No. 24169, 아브시디아 레펜스 (repens) ATCC No. 14849, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 74481, 악티노무코르 엘레간스 (Actinomucor elegans) ATCC No. 6476, 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani) ATCC No. 11078, 아스퍼길루스 타마리 (Aspergillus tamarii) ATCC No. 16865, 코니오포라 푸테아나 (Coniophora puteana) ATCC No. 12675, 쿠닝하멜라 에키눌라타 (Cunninghamella echinulata) ATCC No. 8688a, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 8688b, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 8983, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 9244, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 9245, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No.10028b, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 26269, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 36190, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 36112, 쿠닝하멜라 호모탈리카 (homothallica) ATCC No. 16161, 실린드로카르폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) ATCC No. 66963, 디플로디아 고시피나 (Diplodia gossypina) ATCC No. 20575, 에피코쿰 네글렉툼 (Epicoccum neglectum) ATCC No. 12723, 글로메렐라 라게나리아 (Glomerella lagenaria) ATCC No. 14724, 페니실리움 클라비포르메 (Penicillium claviforme) ATCC No. 10426, 페니실리움 두클라욱시 (duclauxii) ATCC No. 10440, 페니실리움 글라브룸 (glabrum) ATCC No. 11080, 슈도코클리오볼루스 루나투스 (Pseudocochliobolus lunatus) ATCC No. 24155, 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015, 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190, 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC No. 19067 및 탐노스틸룸 피리포르메 (Thamnostylum piriforme) ATCC No. 8686 및 적합한 이들의 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 미생물, 또는 돌연변이에도 불구하고 화학식 2의 화합물인 2-메틸퀴녹살린의 산화를 수행할 수 있고 당업계의 숙련자에게 공지되어 있거나 숙련자에 의해 수득될 수 있는 상기 미생물의 변이체와 화학식 2의 화합물을 접촉시키고, 생성되는 혼합물을, 일정량의 화학식 1의 2-퀴녹살린카르복실산을 생산하기에 충분한 조건 하에 인큐베이션시키는 것을 포함하되, 상기 미생물이 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 또는 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190인 경우에는, 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 또는 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190은 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 또는 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190과 상기 2-메틸퀴녹살린의 접촉 전에 인듀서와의 상호작용에 의해 유도되는 것인, 화학식 2의 2-메틸퀴녹살린의 미생물에 의한 산화를 수행하는 방법을 제공한다.
1998년 2월 5일 출원된 미국 특허 출원 제60/073,801호 (1999년 1월 18일자로 출원된 국제 특허 출원 제PCT/IB99/00067호)에는 예를 들어 염증 및 다른 면역 질환의 치료에 유용한 신규 디히드록시헥사노산의 합성 중간체로서의 2-퀴녹살린카르복실산의 용도를 개시하고 있다. 본 발명의 방법에 의해 제공되는 2-퀴녹살린카르복실산은 상기 디히드록시헥사노산의 합성에 사용할 수 있다.
상기 문헌을 포함하여 본원에서 인용되는 모든 문헌은 본원에 참고로 포함되는 것이다.
본 발명의 방법은 임의로는 목적 생성물인 2-퀴녹살린카르복실산의 적합한 방법에 의한 단리를 추가로 포함한다. 예를 들어, 반응 혼합물은 유기 용매, 바람직하게는 에틸 아세테이트로 추출될 수 있고, 추출된 물질은 크로마토그래피시킬 수 있다. 별법으로, 2-퀴녹살린카르복실산은 반응 혼합물로부터 수지, 바람직하게는 흡착성 중합체 수지 상에 흡착되고, 유기 용매, 바람직하게는 에틸 아세테이트를 사용하여 수지로부터 용출된 후, 유기 용매 또는 유기 용매의 조합물, 바람직하게는 에틸 아세테이트 및 메탄올을 사용하여 용출된 물질로부터 결정화될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 생산된 2-퀴녹살린카르복실산은 적합한 염기, 예를 들어 수산화나트륨으로 처리하여 2-퀴녹살린카르복실산의 염, 예를 들어 나트륨염을 형성시킬 수 있다. 이어서, 여과 또는 원심분리에 의해 배지로부터 세포를 제거한 후, 예를 들어 증발에 의해 세포 부재 배지를 농축하여 생물전환(bioconversion) 배지로부터 2-퀴녹살린카르복실산의 알칼리 염을 단리할 수 있다.
본 발명에 사용되는 미생물은 무손상(intact) 미생물이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 미생물은 진균이다.
미생물이 진균인 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 진균은 아브시디아, 아스퍼길루스, 알테르나리아, 페니실리움, 디플로디아 및 쿠닝하멜라 속으로 구성되는 군 중에서 선택된다.
미생물이 진균인 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 진균은 아브시디아 속이다. 미생물이 아브시디아 속의 진균인 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 미생물은 에이. 글라우카 ATCC No. 22752 또는 에이. 글라우카 ATCC No. 74480 또는 그의 적합한 변이체, 또는 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁된 에이. 글라우카 ATCC No. 22752 또는 적합한 그의 변이체의 임의의 기탁물이다.
미생물이 아브시디아 속의 진균인 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 미생물은 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 또는 에이. 레펜스 ATCC No. 74481 또는 그의 적합한 변이체, 또는 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁된 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 또는 적합한 그의 변이체의 임의의 기탁물이다.
본 발명의 진균 배양물의 바람직한 세포 밀도는 약 10 내지 30 g (건조 세포 중량)/l이다.
본 발명의 바람직한 다른 실시태양에서, 미생물은 세균이다.
미생물이 세균인 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 세균은 슈도모나스 및 로도코쿠스 속으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
미생물이 세균인 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 세균은 슈도모노나스 속의 세균이다.
미생물이 슈도모나스 속의 세균인 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 미생물은 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190 또는 그의 적합한 변이체, 또는 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁된 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 적합한 그의 변이체의 임의의 기탁물이다.
본 발명의 세균 배양물의 바람직한 세균 밀도는 650 nm에서 약 10 내지 약 30의 광학 밀도를 제공하는 밀도이다.
상기 논의한 바와 같이, 미생물이 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190 또는 그의 적합한 변이체인 본 발명의 실시태양에서, 미생물 또는 그의 적합한 변이체는 접촉 전에 또는 접촉 동안에 유도된다. 미생물의 유도 완료 후에 접촉시키는 것이 바람직하다. 바람직한 인듀서는 p-크실렌 및 m-크실렌을 포함한다. 특히 바람직한 인듀서는 p-크실렌이다.
미생물이 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190 또는 그의 적합한 변이체이고, 미생물이 플라스크 중의 성장 배지에서 배양되는 본 발명의 실시태양에서, 인듀서는 미생물과 2-메틸퀴녹살린의 접촉 전에 상기 성장 배지에 첨가되고, 상기 유도의 실질적인 완료에 충분한 시간 동안 상기 성장 배지 중에서 인큐베이션된다. 유도된 미생물의 세포는 상기 2-메틸퀴녹살린과 상기 미생물의 접촉 전에, 플라스크의 내용물을 원심분리하여 회수하고, 소비된 성장 배지 (따라서 인듀서)를 제거, 예를 들어 디캔팅(decanting)하고, 세포 펠렛을 세척하고 펠렛을 수성 매질, 예를 들어 DPBS (Biowhittaker) 중에 재현탁시킨다.
미생물이 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190 또는 그의 적합한 변이체이고, 미생물이 발효기 내의 성장 배지에서 배양되는 본 발명의 실시태양에서, 인듀서는 미생물과 2-메틸퀴녹살린의 접촉 전에 상기 성장 배지에 연속적으로 첨가되고, 상기 유도의 실질적인 완료에 충분한 시간 동안 상기 성장 배지 중에서 인큐베이션된 후, 상기 2-메틸퀴녹살린과 상기 미생물의 접촉 전에 중단된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 접촉은 2-메틸퀴녹살린을, 진균인 미생물을 포함하는 성장 배지에 첨가함으로써 수행된다. 대상 진균을 포함하는 성장 배지에 2-메틸퀴녹살린을 첨가함으로써 접촉을 수행하는 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 성장 배지는 콘스팁(cornsteep) 고형 배지이다. 특히 바람직한 콘스팁 고형 배지는 약 20 g 내지 약 40 g/l의 콘스팁 고형물 및 약 20 g/l의 덱스트로스를 포함하고, 약 4.85의 pH를 갖는다. 다른 바람직한 성장 배지는 약 20 g/l의 Pharmamedia (등록상표, Traders Protein) 및 약 20 g/l의 덱스트로스를 포함하고, 약 7.2의 pH를 갖는다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 접촉은 수지에 흡착된 화학식 2의 화합물을 첨가함으로써 수행된다 (예를 들어 문헌 [J.T. Vicenzi et al., 'Large-scale stereoselective enzymatic ketone reduction with in situ product removalvia polymeric adsorbent resins,' Enzyme and Microbial Technology, 20:494-499 (1997)] 참조).
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 접촉은 2-메틸퀴녹살린을 세척된 미생물 세포를 포함하는 수성 배지에 첨가함으로써 수행된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 미생물은 미생물을 2-메틸퀴녹살린과 접촉시키기 전에 세척된다. 미생물이 미생물과 2-메틸퀴녹살린과의 접촉 전에 세척되는 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 세척된 미생물은 접촉 전에 고정화된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, 미생물은 2-메틸퀴녹살린을 첨가함으로써 수행되는 접촉 전에 약 24시간 내지 약 72시간 동안 콘스팁 고형 배지에서 성장시킨다.
본 발명의 방법은 임의로 예를 들어 유기 용매를 사용한 추출, 수지 상에 흡착, 결정화에 의해 수행되는 2-퀴녹살린카르복실산의 단리 또는 분리 또는 상기 논의한 바와 같이 세포 부재 배지의 증발에 의한 농축에 의한 2-퀴녹살린카르복실산의 알칼리 염의 제공을 추가로 포함한다.
본 발명은 상기 미국 특허 출원 제60/073,801호에 개시된 방법에 따르거나 적합한 다른 방법을 사용하여 상기 미국 특허에 개시된 신규 디히드록시헥사노산의 합성에서의 2-퀴녹살린카르복실산의 용도를 추가로 포함한다.
당업계의 숙련자는 본 발명을 설명하기 위해서 본원에서 사용된 용어를 충분히 이해할 것이지만, 부연하자면 본원에서 사용된 다음 용어는 이하에서 설명한 바와 같은 의미를 갖는다.
'무손상 미생물'은 미생물 세포가 실질적으로 그의 본래의 (및(또는) 경우에 따라서 유도된) 기계적, 물리적 및 생화학적 완전함을 보유하고 있음을 의미한다.
'미생물에 의한 산화'는 무손상 미생물 또는 그의 임의의 제제 등에 의해 수행되는 본 발명의 산화를 의미한다.
'미생물'은 예를 들어 경우에 따라서 발효 배지, 성장 배지, 배양 브로쓰 등이 없는 세척된 미생물; 및 예를 들어 컬럼에 고정화되거나 비드에 부착된 미생물 등을 포함하는 임의의 무손상 미생물 또는 적합한 그의 제제를 포함한다.
다른 설명이 없으면, 본원에서 ℃는 섭씨 온도이고, %는 백분율이고, ACN은 아세토니트릴이고, DMSO는 디메틸술폭시드이고, DPBS는 둘베코스(Dulbeccos) 포스페이트 완충 염수이고, EtOAC는 에틸 아세테이트이고, EtOH는 에탄올이고, g는 그램이고, HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피이고, l은 리터이고, MeOH는 메탄올이고, mg은 밀리그램이고, min은 분이고, mm는 밀리미터이고, mmol은 밀리몰이고, ml은 밀리리터이고, m-크실렌은 메타-크실렌이고, N은 노르말 농도이고, nM은 나노몰 농도이고, PBS는 포스페이트 완충 염수이고, p-크실렌은 파라-크실렌이고, rpm은 분당 회전수이고, TFA는 트리플루오로아세트산이고, ㎕는 마이크로리터이고, v/v는 부피/부피이고, American National Can은 미국 위스콘신주 메나샤에 위치하고, Becton Dickinson Labware는 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크에 위치하고, Becton Dickinson Microbiology Systems는 미국 메릴랜드주 스파크스에 위치하고, Biowhittaker는 미국 메릴랜드주 워커스빌에 위치하고, Column Engineering, Inc.는 미국 캘리포니아주 온타리오에 위치하고, IEC Centrifuge는 미국 메사츄세츠주 니담 헤이츠에 위치하고, Rohm and Haas는 미국 펜실베니아주 필라델피아에 위치하고, Traders Protein은 미국 테네시주 멤피스에 위치한다.
또한, ATCC는 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션이다. 하기 표 1은 본원에서 개시된 미생물 및 이들의 기탁자를 나열한 것이다 (인터넷 홈페이지 www.ATCC.org 참조).
진균 배양물, ATCC No. 기탁자
아브시디아 글라우카, 22752 NRRL1
아브시디아 글라우카, 74480 Pfizer, Inc.2
아브시디아 슈도실린드로스포라, 24169 NRRL
아브시디아 레펜스, 14849 NRRL
아브시디아 레펜스, 74481 Pfizer, Inc.3
악티노무코르 엘레간스, 6476 제이.에이. 스티븐슨
알테르나리아 솔라니, 11078 피. 더블유. 브라이언
아스퍼길루스 타마리, 16865 케이.비. 레이퍼, 디.아이. 페넬
코니오포라 푸테아나, 12675 에프.에프. 롬바드
쿠닝하멜라 에키눌라타, 8688a NRRL
쿠닝하멜라 에키눌라타, 8688b NRRL
쿠닝하멜라 에키눌라타, 8983 브이.엠. 쿠터 주니어
쿠닝하멜라 에키눌라타, 9244 브이.엠. 쿠터 주니어
쿠닝하멜라 에키눌라타, 9245 브이.엠. 쿠터 주니어
쿠닝하멜라 에키눌라타, 10028b NRRL
쿠닝하멜라 에키눌라타, 26269 제이.제이. 페리
쿠닝하멜라 에키눌라타, 36190 NRRL
쿠닝하멜라 에키눌라타, 36112 제이.제이. 페리
쿠닝하멜라 호모탈리카, 16161 IFO-Institute for Fermentation
실린드로카르폰 데스트럭탄스, 66963 지.제이. 사무엘스
디플로디아 고시피나, 20575 Hoffman-La Roche Ltd.
에피코쿰 네글렉툼, 12723 Pfizer, Inc.
글로메렐라 라게나리아, 14724 Sanraku-Ocean Co., Ltd.
페니실리움 클라비포르메, 10426 NRRL
페니실리움 두클라욱시, 10440 NRRL
페니실리움 글라브룸, 11080 피.더블유. 프라이언
슈도코클리오볼루스 루나투스, 24155 알.에스. 비터
탐노스틸룸 피리포르메, 8686 NRRL
세균 배양물, ATCC No. 기탁자
슈도모나스 푸티다, 33015 피.에이. 윌리암스
슈도모나스 푸티다, 202190 Pfizer, Inc.4
알. 로도크로우스, 19067 제이.더블유. 포스터
1: NRRL은 미국 일리노이주 페오리아 소재의 Northern Regional ResearchLaboratories이다.2: 1999년 1월 13일자로 부다페스트 조약의 규정 하에 기탁된 에이. 글라우카, 22752.3: 1999년 1월 13일자로 부다페스트 조약의 규정 하에 기탁된 에이. 레펜스, 14849.4: 1999년 1월 13일자로 부다페스트 조약의 규정 하에 기탁된 피. 푸티다, 33015.
상기 논의한 바와 같이, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물을, 화학식 2의 화합물인 2-메틸퀴녹살린의 메틸기를 하기 화학식 1의 화합물인 2-퀴녹살린카르복실산의 카르복실기로 산화시킬 수 있는 미생물과 접촉시키고, 2-퀴녹살린카르복실산을 생산하는 적합한 조건 하에 생성 혼합물을 인큐베이션하는, 화학식 1의 화합물의 미생물에 의한 제조 방법에 관한 것이다.
<화학식 1>
<화학식 2>
본 발명의 방법은 용이하게 수행된다. 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190 또는 이들의 적합한 변이체인 미생물을 필요한 경우 유도시켜 배양하고, 이어서 2-메틸퀴녹살린의 메틸기를 2-퀴녹살린카르복실산의 -COOH 기로 산화시키기 위해 2-메틸퀴녹살린과 접촉시킨다. 이어서, 2-퀴녹살린카르복실산은 예를 들어 염증 및 다른 면역 질환의 치료에 유용한, 상기 미국 특허 출원 제60/073,801호에 개시된 신규 디히드록시헥사노산을 최대로 수득하기 위해서 상기 미국 특허 출원에 기술된 방법에 의해 추가로 반응시킬 수 있다. 상기 미국 특허 출원에 개시된 신규 디히드록시헥사노산의 활성 시험 방법, 투여량, 투여 형태, 투여 방법 및 배경 정보는 상기 특허 출원 명세서에 개시되어 있다.
상기 설명한 바와 같이, 적합한 미생물 또는 이들의 적합한 변이체를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 당업계의 숙련자가 본원의 개시 내용에 비추어 충분히 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법의 조건은 미생물의 종류 및 그의 특정 제제에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어, 발효 배지의 pH, 온도, 성분의 농도등 및 유기 용매, 및 2-메틸퀴녹살린 및 인듀서 (사용되는 경우)의 농도는 선택된 비생물을 사용하여 특정 소망 결과를 제공하도록 선택될 것이다.
바람직한 진균은 아브시디아, 악티노무코르, 알테르나리아, 아스퍼길루스, 코니오포라, 쿠닝하멜라, 실린드로카르폰, 디플로디아, 에피코쿰, 푸사리움, 글로메렐라, 페니실리움, 슈도코클리오볼루스, 탐노스틸룸 및 베르티실리움 속의 성원을 포함하지만, 미생물 또는 변이체가 본 발명의 산화를 수행할 수 있다면 상기 속의 종들로 특별히 한정되지 않는다.
특히 바람직한 진균은 아브시디아, 알테르나리아, 아스퍼길루스, 쿠닝하멜라, 디플로디아 및 페니실리움에 속한다.
특히 바람직한 진균은 아브시디아 속에 속한다.
특히 더욱 바람직한 진균은 에이. 글라우카 ATCC No. 22752, 에이. 글라우카 ATCC No. 74480, 에이. 슈도실린드로스포라 ATCC No. 24169, 에이. 레펜스 ATCC No. 14849, 에이. 레펜스 ATCC No. 74481, 에이. 엘레간스 ATCC No. 6476, 에이. 솔라니 ATCC No. 11078, 에이. 타마리 ATCC No. 16865, 씨. 푸테아나 ATCC No. 12675, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 8688a, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 8688b, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 8983, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 9244, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 9245, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 10028b, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 26269, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 36190, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 36112, 씨. 호모탈리카 ATCC No. 16161, 씨. 데스트럭탄스 ATCC No. 66963, 디. 고시피나 ATCC No. 20575, 이. 네글렉툼 ATCC No. 12723, 지. 라게나리아 ATCC No. 14724, 피. 클라비포르메 ATCC No.10426, 피. 두클라욱시 ATCC No. 10440, 피. 글라브룸 ATCC No. 11080, 피. 루나투스 ATCC No. 24155 및 티. 피리포르메 ATCC No. 8686 및 적합한 그의 변이체를 포함한다.
보다 더 바람직한 진균은 에이. 글라우카 ATCC No. 22752, 에이. 글라우카 ATCC No. 74480, 에이. 레펜스 ATCC No. 14849, 에이. 레펜스 ATCC No. 74481, 에이. 솔라니 ATCC No. 11078, 에이. 타마리 ATCC No. 16865, 씨. 에키눌라타 ATCC No. 8983, 디. 고시피나 ATCC No. 20575 및 피. 글라브룸 ATCC No. 11080 및 이들의 적합한 변이체를 포함한다.
특히 바람직한 진균은 에이. 글라우카 ATCC No. 22752, 에이. 글라우카 ATCC No. 74480, 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 및 에이. 레펜스 ATCC No. 74481 및 이들의 변이체를 포함한다.
특히 바람직한 진균은 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 및 에이. 레펜스 ATCC No. 74481 및 이들의 적합한 변이체를 포함한다.
바람직한 세균은 바실러스(Bacillus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 로도코쿠스(Rhodococcus) 속에 속하는 것을 포함하지만, 미생물 또는 그의 변이체가 본 발명의 산화를 수행할 수 있다면 상기 속의 종들로 특별히 한정되지 않는다.
특히 바람직한 세균은 슈도모나스 및 로도코쿠스 속에 속하는 것을 포함한다.
특히 바람직한 세균은 슈도모나스 속에 속하는 것을 포함한다.
특히 더욱 바람직한 세균은 피. 푸티다 ATCC No. 33015, 피. 푸티다 ATCC No. 202190 및 알. 로도크로우스 ATCC No. 19067 및 이들의 적합한 변이체를 포함한다.
특히 바람직한 세균은 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190 및 이들의 적합한 변이체이다.
앞에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 적합한 미생물의 적합한 변이체의 사용을 포함한다. 또한, 보다 바람직한 특성, 예를 들어 모(母) 균주보다 다량의 기질을 산화시킬 수 있는 능력을 갖는 일군의 변이체를 본 발명의 방법에 사용할 수 있고, 이들 신규 균주는 예를 들어 표준 돌연변이 유발법 및 선발 기술, 및 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발법을 포함하는 재조합 방법을 포함하는 공지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
표준 돌연변이 유발법은 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 (Delic et al., 1970, Mutat. Res. 9:167), 아질산 (Crueger and Crueger (1984), Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, p. 16, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA)을 사용한 화학적 돌연변이 유발 및 자외선 조사 (Thrum (1984), Biotechnology of Industrial Antibiotics (Vandamme, ed.), Marcel Dekker, New York, pp. 373-374)를 포함한다.
선발 기술은 단리된 콜로니의 선발에 의한 균주의 간단한 재단리, 특정 콜로니의 형태학적 선발 및 화학식 1의 화합물의 생합성 경로에 존재하는 것으로 알려지거나 생각되는 성분의 유사체에 대한 내성에 따른 선발을 포함한다 (Crueger andCrueger (1984), Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, p. 24-25, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA).
상기 신규 균주는 예를 들어 이들이 이들의 각각의 모 균주에 비해 개선된 특성, 예를 들어 보다 많은 양의 2-퀴녹살린카르복실산을 생산하고, 2-메틸퀴녹살린 및(또는) 2-퀴녹살린카르복실산 및(또는) 예를 들어 선택된 특정 미생물에 따라 본 발명의 방법에서 생성될 수 있는 중간체 화합물의 원치않는 고유의 분해 활성이 보다 작기 때문에 본 발명의 방법에 사용된다. 또한, 보다 많은 2-퀴녹살린카르복실산을 생산할 수 있기 때문에 변이체를 사용하는 경우, 본 발명의 방법에 따라 일정량의 2-퀴녹살린카르복실산의 생성에 필요한 물질을 수득하기 위해 보다 소량의 배양 용량이 미생물의 성장에 필요하고, 따라서 생산 비용을 실질적으로 저하시킬 수 있다.
상기한 바와 같이, 예를 들어 성장 배지 중의 미생물, 발효 배지, 배양 브로쓰 등이 없는 세척된 미생물 또는 예를 들어 컬럼에 고정화되거나 비드에 부착된 미생물 등과 같은 임의의 적합한 미생물 제제를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
당업계의 숙련가는 본원의 설명으로부터 문헌 [예를 들어 A. Bauer et al., 'Polyvinyl alcohol-immobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitriles', Biotechnology Letters, 18(3):343-348 (1996)]에 기재되어 있는 적합한 고정화된 무손상 미생물을 제조하는 방법을 이해할 것이다.
바람직한 무손상 미생물은 2-메틸퀴녹살린을 생성물, 구체적으로 2-퀴녹살린카르복실산으로 실질적으로 산화시키지만, 생성물을 실질적으로 변경시키지 않는,예를 들어 본 발명의 방법의 임의의 단계에서 목적 생성물을 분해하거나 생성물에 부정적인 영향을 줄 수 있는 본래의 활성을 갖지 않는 것이다.
상기 미생물에 의한 산화에 사용하기 적합한 미생물은 관련 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적절한 방법으로 준비할 수 있다. 시판되는 스톡으로부터 미생물을 준비하는 적절한 방법의 예를 아래에 설명했다. 당업자라면 아래에 제시된 방법들을 비롯해서 본 명세서에 공개된 내용에 기초하여 이들 방법의 어떤 일부, 예컨데 자유 또는 고정 상태의 미생물 준비 방법, 미생물을 2-퀴녹살린카르복실산과 접촉시키는 방법, 증식 배지 성분 및 온도, pH 등의 증식 조건, 2-메틸퀴녹살린의 농도, 인듀서 (사용되는 경우)의 농도, 또는 인큐베이션 조건 등을 어떻게 변형하여 임의의 적절한 미생물을 사용하여 원하는 결과를 얻는지를 이해할 것이다.
미생물이 진균인 본 발명의 실시태양에서는 2-메틸퀴녹살린의 바람직한 농도 범위가 약 0.01 g/ℓ 내지 약 2.5 g/ℓ이며, 그 중에서도 특히 약 0.1 g/ℓ 내지 약 2.0 g/ℓ이 바람직하다. 미생물이 에이. 레펜스 ATCC No. 14849, 에이. 레펜스 ATCC No. 74481, 에이. 글라우카 ATCC No. 22752, 에이. 글라우카 ATCC No. 74480 및 이들의 적절한 돌연변이체로 구성된 군에서 선택된 진균인 본 발명의 실시태양에서는 2-메틸퀴녹살린의 바람직한 농도 범위가 약 0.1 g/ℓ 내지 약 2.0 g/ℓ이다.
미생물이 세균인 본 발명의 실시태양에서는 2-메틸퀴녹살린의 바람직한 농도 범위가 약 0.01 g/ℓ 내지 약 1.5 g/ℓ이며, 그 중에서도 특히 약 0.1 g/ℓ 내지 약 1.0 g/ℓ이 바람직하다. 세균이 피. 푸티다 ATCC No. 33015, 피. 푸티다 ATCCNo. 202190 및 이들의 적절한 돌연변이체인 본 발명의 실시태양에서는 2-메틸퀴녹살린의 바람직한 농도 범위가 약 0.1 g/ℓ 내지 약 1.0 g/ℓ이다.
더욱이 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 산화에 필요한 TOL 플라스미드 보유 세균, 예를 들면 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190는 유도되어야 한다. 피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190를 발효기 내의 배지에서 증식시키는 본 발명의 실시태양에서는 인듀서로서 바람직하게는 p-크실렌을 1 시간에 약 4.5 mmol/ℓ 내지 약 6.5 mmol/ℓ의 바람직한 첨가 속도로 첨가한다. 이 첨가 속도는 특히 1 시간에 약 4.9 mmol/ℓ 내지 약 6.1 mmol/ℓ인 것이 바람직하다.
피. 푸티다 ATCC No. 33015 또는 피. 푸티다 ATCC No. 202190를 플라스크 내의 배지에서 배양하는 본 발명의 실시태양에서는 인듀서로서 바람직하게는 p-크실렌을 기체 상태로 연속적으로 배지에 첨가한다. 당업자라면 본 명세서와 상기한 논문 및 특허 (예를 들면 미국 특허 제5,236,832호)로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 인듀서 농도는 산화를 일으키는 효소의 최소 억제 농도보다 낮게 선정하는 것이 일반적이다. 이와 관련해서 문헌 (Claus and Walker, J. Gen. Microbiol., 36: 107-122 (1964))도 참조할 수 있다.
기질인 2-메틸퀴녹살린을 미생물과 접촉시키는 적절한 방법은 어떤 것이든 본 발명에 사용할 수 있다. 이 기질은 임의의 적절한 순서로 미생물과 접촉시킬 수 있다. 예를 들면 미생물이 자유 또는 고정 상태 또는 이 둘의 병행 상태로 함유된 배양 브로쓰 등의 배지에 2-메틸퀴녹살린을 첨가하거나, 배양 브로쓰 등의 배지에 2-메틸퀴녹살린을 첨가한 후에 미생물을 첨가하거나, 또는 2-메틸퀴녹살린과 미생물을 함께 배양 브로쓰 등의 배지에 첨가하거나, 2-메틸퀴녹살린과 미생물 중 어느 하나를 다른 하나가 함유된 적절한 용매에 첨가하거나, 2-메틸퀴녹살린을 수지에 흡착시키는 등의 방법이 가능하다. 당업자라면 여기에 제시된 설명으로부터 원하는 해당 방법의 일부를 변형시키는 방법을 알 것이다.
상기한 바와 같이 본 발명에서는 미생물이 피. 글라우카 ATCC No. 22752인 것이 바람직하다. 또한 이미 설명한 대로 피. 글라우카 ATCC No. 22752의 동결 건조 샘플을 부다페스트 조약의 규정에 따라서 1999년 1월 13일에 ATCC에 기탁했다. 새로 기탁된 이 배양물에게는 새 기탁번호인 ATCC No. 74480가 부여되었다. 따라서 본 발명에서는 미생물이 피. 글라우카 ATCC No. 74480인 것도 바람직하다. 위와 같이 기탁된 미생물 배양물을 일반인이 입수하는데 대한 모든 제한은 본 발명의 명세서로부터 특허가 허여되는 즉시 제거될 것이다.
또한 앞서 설명한 바와 같이 본 발명에서는 미생물이 에이. 레펜스 ATCC No. 14849인 것이 특히 바람직하다. 에이. 레펜스 ATCC No. 14849의 동결건조 샘플을 부다페스트 조약의 규정에 따라서 1999년 1월 13일에 ATCC에 기탁했다. 새로 기탁된 이 배양물에게는 새 기탁번호인 ATCC No. 74481가 부여되었다. 따라서 본 발명에서는 미생물이 에이. 레펜스 ATCC No. 74481인 것도 바람직하다. 위와 같이 기탁된 미생물 배양물을 일반인이 입수하는데 대한 모든 제한은 본 발명의 명세서로부터 특허가 허여되는 즉시 제거될 것이다.
진균인 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 (또는 에이. 레펜스 ATCC No. 74481,또는 에이. 글라우카 ATCC No. 22752, 또는 에이. 글라우카 ATCC No. 74480)의 배양물은 ATCC로부터 입수할 수 있으며, 그러한 입수가능한 스톡으로부터의 적절한 준비 방법의 예를 바로 다음에 설명한다. 스톡 배양물은 다음과 같이 쌀 배양액으로부터 제조할 수 있다. 예를 들면 현미 약 50 g과 증류수 약 20 ml가 들어있는 에렌마이어 플라스크 (250 ml)를 약 121 ℃에서 약 30 분간 오토클레이브한다. 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 (또는 에이. 레펜스 ATCC No. 74481, 또는 에이 글라우카 ATCC No. 22752, 또는 에이. 글라우카 ATCC No. 74480) 영양 세포 또는 포자의 현탁액은 액체 배양물 중 일부를 멸균 증류수에 첨가하거나 아가 배지 상에서 증식된 사면 배양물을 면봉으로 긁어서 멸균 증류수에 첨가하여 제조한다. 각각의 쌀 배양액이 담긴 플라스크를 포자 또는 세포 현탁액 약 5 ml로 접종하고, 약 28 ℃에서 약 10 일간 인큐베이션시키며, 그 후 증류수에 트윈 80을 용해한 약 0.5 % 용액으로 쌀 배양물을 세척하고 포자 현탁액을 가만히 따라서 쌀과 분리하고, 약 10 % 내지 약 20 %의 글리세롤을 첨가하여 포자 스톡을 제조한다. 이 포자 스톡은 약 -70 ℃에 보관한다.
선정된 임의의 진균에 대해 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 그리고 바람직한 에이. 글라우카 ATCC No. 22752 또는 ATCC No. 74480와 특히 바람직한 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 또는 ATCC No. 74481에 대해 다음의 실시예에서 구체적으로 제시한 바와 같이, 선정된 진균을 준비하는 적절한 방법은 다음과 같다. 상기한 바와 같은 냉동된 영양 세포 또는 포자 스톡 배양물로부터 얻은 진균으로 증식 배지 (트윈 80, 글리세롤 및 증류수를 포함하는 멸균 용액의 분액을 포함하는 것이며, 그 조성은 아래에 구체적으로 설명하였음)가 들어있는 금속 마개가 달린 플라스크 또는 유리 튜브를 접종했다. 발효는 약 22 ℃ 내지 약 32 ℃, 바람직하게는 약 29 ℃에서 적절히 진탕시키면서, 바람직하게는 약 200 rpm 내지 약 220 rpm, 가장 바람직하게는 약 210 rpm으로 진탕시키면서 수행한다. 필요하다면 증식 배지의 pH는 적절한 완충액을 발효 배지에 추가하여 유지하고(거나) 필요하다면 염기나 산 중에 어느 하나를 첨가하여 주기적으로 조절할 수 있다. 바람직한 pH는 약 pH 6 내지 약 pH 7이다.
미생물 (즉, 진균이나 세균)의 증식, 2-메틸퀴녹살린과 미생물의 접촉 및 2-메틸퀴녹살린과 미생물의 인큐베이션은 임의의 적절한 시간 동안 본 발명에 수행될 수 있다. 미생물의 적절한 증식은 예를 들면 약 24 시간 안에 이루어질 수 있으며, 이 때 (a) 2-메틸퀴녹살린 자체, 또는 (b) 적절한 용매, 예를 들면 미생물의 증식이나 기능에 나쁜 영향을 주지 않는 용매 (바람직하게는 EtOH) 중의 2-메틸퀴녹살린 용액의 적절한 분액, 또는 (c) 수지에 흡착시킨 2-메틸퀴녹살린을 배양물에 첨가할 수 있다. 그 다음 인큐베이션을 예를 들면 약 2 내지 약 24 일 동안 계속할 수 있으며, 그 시간은 생물전환이 일어나는 용기, 배지 및 인큐베이션의 온도, pH, 교반 등의 조건에 따라 달라진다. 그 후 인큐베이션 브로쓰를 적절한 추출법으로, 예를 들면 (a) EtOAc, 메틸 이소부틸케톤, 메틸 에틸케톤, 메틸렌 클로라이드 등의 적절한 용매, 바람직하게는 EtOAc를 사용하여 인큐베이션 브로쓰로부터 유기 성분을 제거하든가 (b) 생성물인 2-퀴녹살린카르복실산을 적절한 수지 (바람직하게는 중합체 흡착 수지, 더 바람직하게는 Amberlite(등록상표) (Rohm and Haas제품), 가장 바람직하게는 XAD4 (Amberlite 수지 중의 하나)) 상으로 흡착시켜서 추출할 수 있다. 인큐베이션 브로쓰를 적절한 유기 용매로 추출한 후 유기상 및 수상을 분리하고, 생성된 화합물이 함유된 유기 잔류물을 적절한 방법, 예컨데 크로마토그래피를 이용하여 결정할 수 있다. 이와 다르게는 2-퀴녹살린카르복실산을 인큐베이션 브로쓰로부터 수지를 써서 추출한 후 적절한 용매, 바람직하게는 EtOAc 또는 MeOH로 2-퀴녹살린카르복실산을 희석시키고, 이어서 예를 들면 EtOAc로부터 EtOAc 및 MeOH 등을 사용하여 결정화시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서 증식 배지는 적절한 것이면 어떤 것도 사용할 수 있으며, 그런 적절한 증식 배지는 동화성 탄소, 동화성 질소, 및 필수 무기질을 포함하는 무기염의 공급원을 포함할 것이다. 일반적으로 글루코오스, 말토오스, 만노오스, 수크로스, 전분, 글리세린, 기장 젤리, 당밀, 대두 등의 많은 탄수화물이 동화성 탄소의 공급원으로 사용될 수 있다. 동화성 질소의 공급원으로는 예를 들면 효모 및 카세인 가수분해물, 원시 효모 (primary yeast), 효모 추출물, 목화씨 가루, 대두 고형물, 맥아, 고기 추출물, 펩톤, 콘스팁액, 콘스팁 고형물, 및 암모늄염 등의 물질이 있다. 본 발명의 배양 배지에 사용하기 적절한 무기염 양분으로는 예를 들면 나트륨, 철, 마그네슘, 칼륨, 코발트, 인산염 등을 포함하는 통상의 염이 있다.
더욱 구체적으로 미생물이 진균인 본 발명에 사용하기 적절한 증식 배지의 성분으로는 예를 들면 콘스팁액, 콘스팁 고형물, Pharmamedia (등록상표) 및 엿기름 추출물 등이 있다. 콘스팁액 배지는 콘스팁액 약 40 g/ℓ과 덱스트로스 약 20g/ℓ으로 제조하며, 멸균시키기 전에 pH를 약 4.85로 조정한다. 콘스팁 고형물 배지는 콘스팁 고형물 약 20 g/ℓ 내지 약 40 g/ℓ와 덱스트로오즈 약 20 g/ℓ로 제조하며, 멸균시키기 전에 pH를 약 4.85로 조정한다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 다른 배지는 Pharmamedia (등록상표) 약 20 g/ℓ와 덱스트로스 약 20 g/ℓ로 제조하고, 멸균시키기 전에 pH를 약 7.2로 조정한다. 엿기름 추출물 배지는 엿기름 추출물 약 10 g/ℓ, 덱스트로스 약 10 g/ℓ, 펩톤 약 5 g/ℓ와 효모 추출물 약 2 g/ℓ로 제조하며, 멸균시키기 전에 약 pH 7로 조정한다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 또다른 배지는 덱스트로스 약 20 g/ℓ, 뉴트리소이 (nutrisoy) 가루 약 5 g/ℓ, 효모 추출물 약 5 g/ℓ, NaCl 약 5 g/ℓ및 K2HPO4약 5 g/ℓ로 제조하며, pH는 멸균시키기 전에 H2SO4를 써서 약 pH 7.0으로 조절한 것이다. 본 발명의 방법에 적합한 진균을 위한 특히 바람직한 증식 배지는 상기한 콘스팁 고형물 배지이다.
앞서 설명한 바와 같이 본 발명에서 미생물이 피. 푸티다 ATCC No. 33015인 것이 특히 바람직하다. 이미 설명한 바와 같이 피. 푸티다 ATCC No. 33015의 동결건조 샘플을 부다페스트 조약의 규정에 따라 1999년 1월 13일에 ATCC에 기탁했다. 새로 기탁된 이 배양물에게는 새 기탁번호인 ATCC No. 202190가 부여되었다. 따라서 본 발명에서는 미생물이 피. 푸티다 ATCC No. 202190인 것도 바람직하다. 위와 같이 기탁된 미생물 배양물을 일반인이 입수하는 데 대한 모든 제한은 본 발명의 명세서로부터 특허가 허여되는 즉시 제거될 것이다.
이에 더하여, 미생물이 세균인 본 발명에서 사용하기 적합한 증식 배지로는 임의의 적절한 공지된 배지가 있으며, 예를 들면 영양 브로쓰 (Nutrient Broth) (약 32 g/ℓ, Becton Dickinson Microbiology Systems 제품) 및 글리세롤 (약 5 g/ℓ)이 있다. 선정된 임의의 세균에 대해 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 그리고 피. 푸티다 ATCC No. 33015에 대해 다음의 실시예에서 구체적으로 제시한 바와 같이, 선정된 세균을 준비하는 적절한 방법은 다음과 같다. 당업계에 공지된 바와 같이 제조된 냉동 스톡 배양물 (약 17 % 글리세롤 스톡)로부터 얻은 세균으로 증식 배지 (트윈 80, 글리세롤 및 증류수를 포함하는 멸균 용액의 분액을 포함하는 것이며, 그 조성은 아래에 구체적으로 설명하였음)가 들어있는 금속 마개가 달린 플라스크나 유리 튜브, 또는 발효기를 접종했다. 발효는 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 32 ℃에서 적절히 진탕시키면서, 바람직하게는 약 200 rpm 내지 약 220 rpm, 가장 바람직하게는 약 210 rpm으로 진탕시키면서 수행한다. 필요하다면 증식 배지의 pH는 적절한 완충액을 발효 배지에 추가하여 유지하고(거나) 필요하다면 염기나 산 중 어느 하나를 첨가하여 주기적으로 조절할 수 있다. 바람직한 접종물은 약 1 % 내지 약 20 % (v/v) (접종물/배지)이다. 바람직한 pH 범위는 약 pH 6 내지 약 pH 8이다.
본 명세서의 어떤 부분에서든 언급된 구체적인 완충액, 배지, 반응물, 접촉 또는 배양 조건, 기질의 양, 인듀서의 사용량 등은 이것으로 제한하려는 것이 아니라, 본 명세서에 제시된 특정 맥락 안에서 당업자가 관심있거나 중요한 것이라고 인식할만한 관련 수단이라면 모두 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어제시된 방법, 물질, 조성물의 사용이 관계된 것과 동일한 목적을 달성하기 위해서 다른 것이지만 공지된 방식을 사용하여 어떤 완충계 또는 배양 배지를 다른 것으로 대체하는 것이 대개는 가능하다. 또한 본 발명은 상업적 목적으로 본 발명의 공정의 규모를 대규모화하는 것도 포함하는 것임이 인식되어야 한다.
본 발명의 미생물에 의한 산화는 원하는 생성물인 2-퀴녹살린카르복실산의 단리도 경우에 따라 추가로 포함한다. 2-퀴녹살린카르복실산은 본 발명의 신규한 미생물에 의한 산화 방법이 수행된 배지로부터, 그리고 더욱 구체적으로 말하자면, 선정된 미생물 및 인큐베이션 조건 등에 따라 생성되었을 수 있으나 2-퀴녹살린카르복실산으로 완전히 전환되지 않은 임의의 중간체로부터 다음과 같이 단리할 수 있다.
본 발명의 방법의 목적 생성물 또는 임의의 중간체를 단리 및(또는) 정제하는 임의의 적절한 방법이 본 발명에 사용될 수 있는데, 그 예로는 여과, 추출, 결정화, 컬럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피, 예비 저압 액체 크로마토그래피, HPLC, 수지 흡착, 또는 이런 방법의 적절한 병용 등이 있다.
다음에 제시한 상세한 실시예는 일정 범위의 미생물, 특히 진균 및 세균이 2-메틸퀴녹살린을 산화시켜 2-퀴녹살린카르복실산을 얻은 후 불필요한 비변형 2-메틸퀴녹살린 또는 임의의 중간체 화합물로부터 분리하고 여기서 더 나아가 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 추가로 반응시켜 예를 들면 미국 특허 출원 제60/073,801호의 화합물을 얻을 수 있다.
본 명세서에 공개된 내용은 주로 무손상 미생물을 본 발명의 방법에 사용하는 것에 관한 것이지만, 당업자라면 이 미생물에 의한 산화 방법이 파괴되고 탈수된 세포 제제 또는 이 산화를 수행할 수 있는 미생물 효소가 함유된 추출물 또는 효소 그 자체에 의해 필요한 임의의 보조인자 등과 함께 수행될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명을 다음의 실시예를 통해 예시한다. 본 발명에 대한 앞의 설명과 다음의 설명 및 여러 실시태양은 본 발명을 제한하는 것이라기 보다는 본 발명의 예이다. 따라서 본 발명이 이런 실시예의 구체적인 사항으로 제한되는 것으로 이해되어서는 안된다.
<실시예 1>
에이. 레펜스 ATCC No. 14849를 사용한 튜브 배양물 내에서 2-메틸퀴녹살린의 산화
A. 진균인 에이. 레펜스 ATCC No. 14849를 사용한 생물전환
'시험' 배양물 3개 (T1, T2 및 T3)를 다음과 같이 준비했다. 멸균 증식 배지 (덱스트로스 약 20 g/ℓ, 뉴트리소이 가루 약 5 g/ℓ, 효모 추출물 약 5 g/ℓ, NaCl 약 5 g/ℓ 및 K2HPO4약 5 g/ℓ, pH는 멸균 전에 H2SO4를 써서 약 7.0으로 조정함) 약 2.5 ml씩을 금속 마개가 달린 16 x 125 mm 유리 튜브 3개 (T1, T2, T3)에 넣은 후, 에이. 레펜스 ATCC No. 14849의 포자 (포자 스톡 배양물의 약 1 %v/v)를 T1, T2, T3에 첨가했다.
이 튜브 배양물 3개를 약 29 ℃에서 약 210 rpm으로 진탕시키면서 인큐베이션했다. T1은 약 48 시간 후, T2는 약 72 시간 후, T3는 96 시간 후에 2-메틸퀴녹살린의 스톡 용액 (약 100 % EtOH 중의 약 50 mg/ml, 최종 농도 약 1 mg/ml) 약 0.05 ml를 튜브 배양물에 첨가했다.
약 29 ℃에서 추가로 인큐베이션시킨 후 (아래 표 2 참조), 튜브 배양물 중의 발효 브로쓰의 pH를 4 N HCl를 써서 약 2로 조절했다. 각 튜브 배양물의 내용물을 그와 같은 부피의 EtOAc (순수)로 추출했는데, 이것은 우선 EtOAc를 첨가하고 튜브 배양물을 볼텍싱한 후 약 2,000 rpm으로 원심분리 (IEC 원심분리기)하여 수행했다. EtOAc층을 덜어내고, 수층을 재차 추출했다. 유기 추출물을 한데 합하여 질소 상태에서 약 50 ℃의 수조내에서 건조했다.
B. 역상 HPLC에 의한 2-퀴녹살린카르복실산의 수율 결정
상기한 바와 같이 제조한 각 추출물을 ACN : 물 (1 : 9 v/v) 약 1 ml에 재현탁시키고, 재현탁 추출물 각각의 약 20 ㎕를 HPLC 컬럼 (Inertsil (등록상표) C8 HPLC 컬럼, 4.6 x 250 mm, Column Engineering, Inc. 제품)으로 주사하여 분석했다. 각각의 주사된 재현탁 추출물에 함유된 화합물을 모두 똑같이 약 1.0 ml/분의 이동상 (ACN : 0.05 % TFA 수용액, 1 : 4 v/v)으로 분리했다. 이런 조건에서는 2-퀴녹살린카르복실산이 약 8.6 분에 용출되며, 2-메틸퀴녹살린은 약 15 분에 용출된다. 이러한 HPLC 분석 결과로부터 여러 세트의 시험 조건 (즉, T1, T2 및 T3)에 대해 2-퀴녹살린카르복실산의 수율을 결정했으며, 이 수율은 다음 표 2에 제시했다.
배양물 기질 첨가 시점 (일) 초기 기질 농도 (g/ℓ) 인큐베이션 기간 (일) 수율 (%)
T1 2 1 18 56
T2 3 1 14 76
T3 4 1 16 79
표 2의 T1, T2 및 T3에 대한 데이타를 통해 보인 바와 같이, HPLC 분석 결과는 해당 미생물에 의한 산화 공정의 목적하는 2-퀴녹살린카르복실산 수율이 각기 56 %, 76 % 및 79 %임을 보여준다.
따라서 무손상 미생물, 즉 에이. 레펜스 ATCC No. 14849를 포함시키면 2-메틸퀴녹살린이 2-퀴녹살린카르복실산으로 산화되며, 2-퀴녹살린카르복실산의 상당량이 손상되지 않고 남아있다.
<실시예 2>
4가지 증식 배지에 에이. 레펜스 ATCC No. 14849를 사용한 튜브 배양물 내에서 2-메틸퀴녹살린의 산화
A. 4가지 증식 배지의 제조
배지 1은 콘스팁액 약 40 g/ℓ와 덱스트로스 약 20 g/ℓ로 제조하고 멸균 전에 pH를 약 4.85로 조절한 것이었다.
배지 2는 콘스팁 고형물 약 40 g/ℓ와 덱스트로스 약 20 g/ℓ로 제조하고 멸균 전에 pH를 약 4.85로 조절한 것이었다.
배지 3은 Pharmamedia (등록상표) 약 20 g/ℓ와 덱스트로스 약 20 g/ℓ로 제조하고 멸균 전에 pH를 약 7.2로 조절한 것이었다.
배지 4는 엿기름 추출물 약 10 g/ℓ, 덱스트로스 약 10 g/ℓ, 펩톤 약 5 g/ℓ 및 효모 추출물 약 2 g/ℓ로 제조하고 멸균 전에 pH를 약 7로 조절한 것이었다.
B. 진균인 에이. 레펜스 ATCC No. 14849를 사용한 생물전환
'시험' 배양물 8개 (T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a 및 T4b)를 다음과 같이 준비했다. 멸균 증식 배지 (각기 배지 1, 배지 2, 배지 3 및 배지 4) 약 2.5 ml씩을 금속 마개가 달린 16 x 125 mm 유리 튜브 8개에 넣은 후, 에이. 레펜스 ATCC No. 14849의 포자 (포자 스톡 배양물의 약 1 %v/v)를 각 튜브에 첨가했다.
이 튜브 배양물 8개를 약 29 ℃에서 약 210 rpm으로 진탕시키면서 인큐베이션했다. T1a, T2a, T3a 및 T4a은 약 48 시간 후, T1b, T2b, T3b 및 T4b는 약 72 시간 후에 2-메틸퀴녹살린의 스톡 용액 (약 DMSO 중의 약 50 mg/ml, 최종 농도 약 1 mg/ml) 약 0.05 ml씩을 튜브 배양물에 첨가했다.
약 29 ℃에서 12일간 더 인큐베이션시킨 후 각 튜브 배양물의 발효 브로쓰를 추출하고 한데 합한 유기 추출물을 실시예 1에서와 같이 건조했다.
C. 역상 HPLC에 의한 2-퀴녹살린카르복실산의 수율 결정
상기한 바와 같이 제조한 각 추출물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리하여 역상 HPLC로 분석했다. 이러한 HPLC 분석 결과로부터 여러 세트의 시험 조건 (즉, T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a 및 T4b)에 대해 2-퀴녹살린카르복실산의 수율을 결정했으며, 이 수율은 다음 표 3에 제시했다.
배지 배양물 기질 첨가 시점 (일) 수율 (%)
1 T1a 2 36
T1b 3 43
2 T2a 2 73
T2b 3 69
3 T3a 2 49
T3b 3 52
4 T4a 2 31
T4b 3 28
표 3의 데이타를 통해 보인 바와 같이, HPLC 분석 결과는 시험된 모든 배지에서 에이. 레펜스 ATCC No. 14849에 의한 산화 공정에 의해 2-퀴녹살린카르복실산이 생산됨을 보여준다. 또한 표 3의 데이타는 시험된 4개 배지 중 배지 2가 원하는 생성물인 2-퀴녹살린카르복실산의 수율이 가장 높다는 것을 보여준다.
<실시예 3>
에이. 레펜스 ATCC No. 14849 또는 에이. 글라우카 ATCC No. 22752를 사용한 플라스크 배양물 내에서 2-메틸퀴녹살린의 산화
A. 진균인 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 또는 진균인 에이. 글라우카 ATCC No. 22752를 사용한 생물전환
'시험' 배양물 4개 (T1a, T1b, T2a 및 T2b)를 다음과 같이 준비했다. 멸균 증식 배지 (덱스트로스 약 20 g/ℓ, 뉴트리소이 가루 약 5 g/ℓ, 효모 추출물 약 5 g/ℓ, NaCl 약 5 g/ℓ 및 K2HPO4약 5 g/ℓ, pH는 멸균 전에 H2SO4를 써서 약 7.0으로 조정함) 약 25 ml씩을 원뿔형 플라스크 (300 ml) 4개에 넣은 후, 에이. 레펜스 ATCC No. 14849 (T1a, T1b) 또는 에이. 글라우카 ATCC No. 22752 (T2a, T2b)의 포자 (포자 스톡 배양물의 약 1 %v/v)를 각 튜브에 첨가했다.
이 플라스크 배양물 4개를 약 29 ℃에서 약 210 rpm으로 진탕시키면서 인큐베이션했다. T2a는 인큐베이션 직후, T2b는 약 24 시간 후에 2-메틸퀴녹살린의 스톡 용액 (약 100 % EtOH 중의 약 50 mg/ml, 최종 농도 약 1 mg/ml) 약 0.05 ml를 에이. 글라우카 ATCC No. 22752의 플라스크 배양물에 첨가했다. T1a는 약 48 시간 후, T1b는 약 72 시간 후에 2-메틸퀴녹살린의 스톡 용액 (약 100 % EtOH 중의 약 50 mg/ml, 최종 농도 약 1 mg/ml) 약 0.05 ml를 에이. 레펜스 ATCC No. 14849의 플라스크 배양물에 첨가했다.
약 29 ℃에서 T1a는 24 일 동안, T1b는 16 일 동안, T2a는 25 일 동안, T2b는 24 일 동안 추가로 인큐베이션시킨 후, 플라스크 배양물 중의 발효 브로쓰의 pH를 4 N HCl를 써서 약 2로 조절했다. 각 플라스크 배양물의 내용물을 EtOAc 25 ml 분액으로 2회 추출하고, 합한 유기 EtOAc 추출물로부터 감압하에서 용매를 제거하여 조생성물을 얻었다.
B. 역상 HPLC에 의한 2-퀴녹살린카르복실산의 수율 결정
상기한 바와 같이 제조한 각 추출물을 MeOH : ACN (3 : 2 v/v) 약 5 ml에 재현탁시키고, 재현탁 추출물을 HPLC 분석을 위해 1 : 19로 희석했다. HPLC 분석은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행했다. 이러한 HPLC 분석 결과로부터 여러 세트의 시험 조건 (즉, T1a, T1b, T2a 및 T2b)에 대해 2-퀴녹살린카르복실산의 수율을 결정했으며, 이 수율은 다음 표 4에 제시했다.
배양물 기질 첨가 시점 (일) 초기 기질 농도 (g/ℓ) 인큐베이션 기간 (일) 수율 (%)
T1a 2 1 24 80
T1b 3 1 16 72
T2a 0 1 25 44
T2b 1 1 24 53
표 4의 데이타를 통해 보인 바와 같이, 무손상 미생물, 즉 에이. 글라우카 ATCC No. 22752 또는 에이. 레펜스 ATCC No. 14849를 이용하면 2-메틸퀴녹살린이 2-퀴녹살린카르복실산으로 산화된다. 출발 물질인 2-메틸퀴녹살린의 %는 T1a, T1b, T2a 및 T2b에서 각기 약 7 %, 7 %, 6 % 및 6 %로 남아있다.
<실시예 4>
미생물에 의한 2-메틸퀴녹살린의 2-퀴녹살린카르복실산으로의 전환에 대한 스크리닝
실시예 1에 기재된 덱스트로스, 뉴크리소이 가루 배지 2.5 ml가 들어있는 튜브에서 여러 미생물 세포를 증식시켰다. 개별 튜브를 냉동 글리세롤 현탁액으로 보관된 각종 미생물의 포자 또는 영양 세포 (포자 또는 영양 세포 스톡 배양물의 약 1 % v/v)로 접종하고, 약 29 ℃에서 회전 진탕기로 교반시키면서 (210 rpm) 인큐베이션시켰다. 약 48 시간 후에 DMSO 중의 10 mg/ml 2-메틸퀴녹살린 0.05 ml를 각 튜브에 첨가했다. 약 4일간의 인큐베이션 후, 각 튜브의 내용물을 추출하고, 각각의 추출물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 HPLC로 분석했다. 2-퀴녹살린카르복실산의 수율을 HPLC로 결정하여 그 결과를 표 5에 요약했다.
진균 배양물, ATCC 번호 수율 (%)
에이. 글라우카, 22752 83
에이. 레펜스, 14849 83
에이. 타마리, 16865 53
에이. 솔라니, 11078 53
피. 글라브룸, 11080 47
디. 고시피나, 20575 31
C. 에키눌라타, 8983 25
<실시예 5>
피. 푸티다 ATCC No. 33015 세포를 배지 5 (영양 브로쓰 약 32 g/ℓ와 글리세롤 약 5 g/ℓ)에서 증식시켰다. 배지가 약 30 ml씩 들어있는 원뿔형 플라스크 (300 ml) 6개를, 사전에 약 -70 ℃로 보관해 둔 피. 푸티다 ATCC No. 33015 세포의 글리세롤 현탁액 약 0.10 ml로 접종했다. 15 ml 원뿔형 폴리프로필렌 원심분리 튜브 (Flacon (등록상표), Becton Dickinson Labware)에 들어있는 p-크실렌 약 2 ml를 첨가한 후, 플라스크를 파라필름 (등록상표) (American National Can 제품)으로 밀봉하고, 약 29 ℃에서 약 18 시간 동안 회전 진탕기로 교반시켰다 (225 rpm). 이들 플라스크 배양물은 흡광도 (650 nm)가 약 1.9인 것으로 측정되었다. 원심분리를 통해 플라스크 6개로부터 세포를 수거하고 DPBS 약 250 ml로 1회 세척한 후, 300 ml 원뿔형 플라스크 중의 PBS (Biowhittaker) 약 20 ml에 재현탁시켰다.
생물전환은 DMSO 중의 2-메틸퀴녹살린의 100 mg/ml 용액 (약 0.5 g/ℓ의 초기 농도와 상응) 약 0.1 ml를 첨가함으로써 시작되었다. 인큐베이션은 약 29 ℃에서 약 225 rpm으로 교반시키면서 약 4일간 계속했다. 생물전환 브로쓰의 샘플을 여러번 채취하고, 원심분리를 통해 세포를 제거한 후, 필요하다면 MeOH로 희석시키고 HPLC로 분석했다. 이 샘플 마다 약 20 ㎕씩을 Inertsil (등록상표) HPLC C8 컬럼 (4.6 x 250 mm)으로 주사하여 분석했다. ACN : 약 0.05 % TFA 수용액 (1 : 4 v/v)로 이루어진 이동상을 약 1.0 ml/분으로 흘려주어 각 컬럼을 용출했다. 2-퀴녹살린카르복실산의 수율은 인큐베이션 약 1, 2, 및 4일 후에 각기 약 86 %, 90 %, 94 %였다.
<실시예 6>
피. 푸티다 ATCC No. 33015를 사용한 발효기 배양에서의 2-메틸퀴녹살린의 산화
피. 푸티다 ATCC No. 33015를 배지 5가 약 10 리터 들어있는 발효기에서 증식시켰다. 배지 5가 약 50 ml 들어있는 원뿔형 플라스크 (300 ml)에서 증식시킨 피. 푸티다의 배양물 6개로 이 발효기를 접종했다. 상기 각 플라스크 배양물은 피. 푸티다 ATCC No. 33015의 포자 스톡 약 175 ㎕로 접종하고 약 2 ml의 p-크실렌이 들어있는 15 ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브를 삽입하고, 플라스크를 파라필름 (등록상표)로 밀봉한 후, 약 29 ℃에서 약 17 시간 동안 약 210 rpm에서 진탕시키면서 인큐베이션한 것이었다. 상기 발효기를 6개 플라스크 배양물로 접종한 후에 2 시간 동안 매 20 분마다 약 2 ml씩의 p-크실렌 분액을 발효기에 첨가했다. 그 다음 p-크실렌 분액 약 2.5 ml를 약 3.5 시간 동안 매 20 분마다 발효기에 첨가했다. 그 후 크실렌 첨가는 중단하고, 접종한지 약 5.25 시간만에 2-메틸퀴녹살린을 약 1.95 g, 약 7.75 시간만에 약 7.76 g을 첨가했다. 인큐베이션은 마지막 2-메틸퀴녹살린 첨가한 후 약 22 시간 동안 계속했다. 인큐베이션 배지의 샘플을 원심분리하여 세포를 세거하고 MeOH로 희석한 후 실시예 5에 기재된 방법으로 HPLC 분석을 수행했다. 이 분석 결과 2-퀴녹살린카르복실산의 수율은 약 81 %로 드러났다.
본 발명의 방법에 따르면, 2-메틸퀴녹살린으로부터 2-퀴녹살린카르복실산을 높은 수율로 수득할 수 있다.

Claims (37)

  1. 2-메틸퀴녹살린을, 아브시디아 글라우카 (Absidia glauca) ATCC No. 22752, 아브시디아 글라우카 ATCC No. 74480, 아브시디아 슈도실린드로스포라 (pseudocylindrospora) ATCC No. 24169, 아브시디아 레펜스 (repens) ATCC No. 14849, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 74481, 악티노무코르 엘레간스 (Actinomucor elegans) ATCC No. 6476, 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani) ATCC No. 11078, 아스퍼길루스 타마리 (Aspergillus tamarii) ATCC No. 16865, 코니오포라 푸테아나 (Coniophora puteana) ATCC No. 12675, 쿠닝하멜라 에키눌라타 (Cunninghamella echinulata) ATCC No. 8688a, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 8688b, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 8983, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 9244, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 9245, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 10028b, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 26269, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 36190, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 36112, 쿠닝하멜라 호모탈리카 (homothallica) ATCC No. 16161, 실린드로카르폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans) ATCC No. 66963, 디플로디아 고시피나 (Diplodia gossypina) ATCC No. 20575, 에피코쿰 네글렉툼 (Epicoccum neglectum) ATCC No. 12723, 글로메렐라 라게나리아 (Glomerella lagenaria) ATCC No. 14724, 페니실리움 클라비포르메 (Penicillium claviforme) ATCC No. 10426, 페니실리움 두클라욱시 (duclauxii) ATCC No. 10440, 페니실리움 글라브룸 (glabrum) ATCC No. 11080, 슈도코클리오볼루스 루나투스 (Pseudocochliobolus lunatus) ATCC No. 24155, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) ATCC No. 33015, 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190, 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) ATCC No. 19067 및 탐노스틸룸 피리포르메 (Thamnostylum piriforme) ATCC No. 8686, 및 이들의 적합한 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택되되, 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 또는 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190의 경우에는, 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 또는 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190과 상기 2-메틸퀴녹살린의 접촉 전에 인듀서와의 상호작용에 의해 유도되는 것인 미생물과 접촉시키고, 생성되는 혼합물을 일정량의 2-퀴녹살린카르복실산을 생산하기에 충분한 조건 하에 인큐베이션시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 2-메틸퀴녹살린의 2-퀴녹살린카르복실산으로의 미생물에 의한 산화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 2-퀴녹살린카르복실산을 단리하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단리가 상기 혼합물을 유기 용매로 추출함으로써 수행되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유기 용매가 에틸 아세테이트인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 추출물에 대해 크로마토그래피를 실시하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 단리가 상기 혼합물로부터 상기 2-퀴녹살린카르복실산을 수지 상에 흡착시키고, 상기 수지로부터 상기 흡착된 2-퀴녹살린카르복실산을 유기 용매를 사용하여 용출시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 수지가 흡착성 중합체 수지인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유기 용매가 에틸 아세테이트 또는 메탄올인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 용출된 2-퀴녹살린카르복실산을 에틸 아세테이트로부터 결정화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 용출된 2-퀴녹살린카르복실산을 에틸 아세테이트 및 메탄올로부터 결정화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 무손상 미생물인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 미생물이 상기 미생물의 세척된 세포를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세척된 세포를 고정화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 세척된 세포가 수성 용매 중에 존재하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 접촉이 상기 2-메틸퀴녹살린을 상기 용매에 첨가함으로써 수행되는 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 미생물이 성장 배지 중에 존재하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 접촉이 상기 2-메틸퀴녹살린을 상기 성장 배지에 첨가함으로써 수행되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 상기 아브시디아 글라우카 ATCC No. 22752, 아브시디아 글라우카 ATCC No. 74480, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 14849, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 74481, 알테르나리아 솔라니 ATCC No. 11078, 아스퍼길루스 타마리 ATCC No. 16865, 쿠닝하멜라 에키눌라타 ATCC No. 8983 및 디플로디아 고시피나 ATCC No. 20575, 및 이들의 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 미생물이 상기 아브시디아 글라우카 ATCC No. 22752, 아브시디아 글라우카 ATCC No. 74480, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 14849, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 74481, 알테르나리아 솔라니 ATCC No. 11078 및 아스퍼길루스 타마리 ATCC No. 16865, 및 이들의 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 미생물이 상기 아브시디아 글라우카 ATCC No. 22752, 아브시디아 글라우카 ATCC No. 74480, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 14849 및 아브시디아 레펜스 ATCC No. 74481, 및 이들의 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 미생물이 상기 아브시디아 레펜스 ATCC No. 14849 또는 아브시디아 레펜스 ATCC No. 74481인 방법.
  22. 2-메틸퀴녹살린을, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 14849, 아브시디아 레펜스 ATCC No. 74481 또는 이들의 적합한 변이체와 접촉시키고, 일정량의 2-퀴녹살린카르복실산의 생산에 충분한 조건 하에 생성 혼합물을 인큐베이션하는 것을 특징으로 하는, 2-메틸퀴녹살린의 2-퀴녹살린카르복실산으로의 미생물에 의한 산화 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 미생물이 성장 배지 중에 존재하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 접촉이 상기 2-메틸퀴녹살린을 상기 성장 배지에 첨가함으로써 수행되는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 또는 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 인듀서가 p-크실렌인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 또는 상기 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190이 성장 배지 중에 존재하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 p-크실렌이 상기 성장 배지에 첨가되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 성장 배지가 플라스크 내에 존재하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 유도 완료 후에 상기 미생물을 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 회수가 상기 플라스크의 내용물을 원심분리하고, 유체를 따라내고, 세포 펠렛을 세척한 후, 상기 펠렛을 완충액 중에 재현탁시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 접촉이 상기 재현탁 후에 상기 2-메틸퀴녹살린을 상기 완충액에 첨가함으로써 수행되는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 성장 배지가 발효기 내에 존재하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 p-크실렌의 상기 성장 배지에의 첨가가 상기 유도 후에 중단되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 접촉이 상기 p-크실렌의 첨가 중단 후에 상기 2-메틸퀴녹살린을 상기 성장 배지에 첨가함으로써 수행되는 것인 방법.
  36. 2-메틸퀴녹살린을, 인듀서와의 상호작용에 의해 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 33015 및 슈도모나스 푸티다 ATCC No. 202190, 및 이들의 적합한 변이체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 미생물의 효소를 유도한 후에 상기 미생물과 접촉시키고, 일정량의 상기 2-퀴녹살린카르복실산의 생산에 충분한 조건 하에 생성 혼합물을 인큐베이션하는 것을 특징으로 하는, 2-메틸퀴녹살린의 2-퀴녹살린카르복실산으로의 미생물에 의한 산화 방법
  37. 제36항에 있어서, 상기 인듀서가 p-크실렌 또는 m-크실렌인 방법.
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