JP3310254B2 - ２−メチルキノキサリンの微生物転換 - Google Patents
２−メチルキノキサリンの微生物転換Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、２−キノキサリン
カルボン酸の新規調製方法に関し、そしてより特定に
は、２−キノキサリンカルボン酸への２−メチルキノキ
サリンの微生物酸化に関する。
カルボン酸の新規調製方法に関し、そしてより特定に
は、２−キノキサリンカルボン酸への２−メチルキノキ
サリンの微生物酸化に関する。
【０００２】
【従来の技術】一定の芳香族複素環式物の微生物酸化及
び特に一定の芳香族複素環式物上のメチル基の微生物酸
化のための方法、たとえば次の２つの文献に記載される
方法は、当業界において知られている：“Gene Order o
f the TOL Catabolic PlasmidUpper Pathway Operon an
d Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol byt
he xy/A Product,”by S.Harayama など., J.Bacterio
l., 167(2): 455-461(1986)及び“Enzymatic Oxidation
of Methyl Groups on Aromatic Heterocycles:A Versa
tile Method for the Preparation of Heteroaromatic
Carboxylic Acids, ”by A. Keiner, Angew. Chem. In
t. Ed. Engl., 31(6): 774-775(1992) 。
び特に一定の芳香族複素環式物上のメチル基の微生物酸
化のための方法、たとえば次の２つの文献に記載される
方法は、当業界において知られている：“Gene Order o
f the TOL Catabolic PlasmidUpper Pathway Operon an
d Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol byt
he xy/A Product,”by S.Harayama など., J.Bacterio
l., 167(2): 455-461(1986)及び“Enzymatic Oxidation
of Methyl Groups on Aromatic Heterocycles:A Versa
tile Method for the Preparation of Heteroaromatic
Carboxylic Acids, ”by A. Keiner, Angew. Chem. In
t. Ed. Engl., 31(6): 774-775(1992) 。
【０００３】アメリカ特許第4,859,592 号は、化学的手
段によりピリジン生成物に転換され得るピコリン酸の生
成のための微生物方法を開示する。アメリカ特許第5,10
4,798 号；第5,213,973 号；及び第5,236,832 号は、ト
ルエン、キシレン又はシメンをインデューサーとして用
いて種プソイドモナスの細菌により実施される、一定の
芳香族５−又は６−員環の複素環式物におけるメチル基
のその対応するカルボン酸への酸化のための微生物方法
を開示する。そこに記載されるように、プソイドモナス
・プチダATCC No.33015 株によるトルエン基の安息香酸
への酸化がそれぞれ、トルエンモノオキシゲナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼにより触媒される3 種の段階を含んで成ることは当
業界において知られている。
段によりピリジン生成物に転換され得るピコリン酸の生
成のための微生物方法を開示する。アメリカ特許第5,10
4,798 号；第5,213,973 号；及び第5,236,832 号は、ト
ルエン、キシレン又はシメンをインデューサーとして用
いて種プソイドモナスの細菌により実施される、一定の
芳香族５−又は６−員環の複素環式物におけるメチル基
のその対応するカルボン酸への酸化のための微生物方法
を開示する。そこに記載されるように、プソイドモナス
・プチダATCC No.33015 株によるトルエン基の安息香酸
への酸化がそれぞれ、トルエンモノオキシゲナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼにより触媒される3 種の段階を含んで成ることは当
業界において知られている。
【０００４】Harayamaなどによる前記文献により前に記
載されたように、プソイドモナス・プチダmt-2のTOL プ
ラスミドｐWWO は、いくつかの芳香族炭化水素、たとえ
ばトルエン、ｍ−キシレン及びｐ−キシレンの酸化異化
作用のために必要とされるすべての酵素をコードする伝
達可能染色体外要素である。TOL プラスミドを担持する
細胞、たとえばプソイドモナス・プチダATCC No.33015
は、一定の芳香族炭化水素類をそれらの対応する芳香族
カルボン酸に転換することができ；キシレン分解の酵素
をコードするxyl オペロン、及びxyl 遺伝子の調節を担
当できる遺伝子の両者が、TOL プラスミドｐWWO 上に存
在する。上記酸化のために必要とされる酵素をコードす
るTOL プラスミドｐWWO 上の遺伝子は、そのような酵素
を生成するよう誘発されるべきである。従って、そのよ
うな誘発の記載が、前記アメリカ特許第5,104,798 号；
第5,213,973 号；及び第5,236,832 号に存在する。
載されたように、プソイドモナス・プチダmt-2のTOL プ
ラスミドｐWWO は、いくつかの芳香族炭化水素、たとえ
ばトルエン、ｍ−キシレン及びｐ−キシレンの酸化異化
作用のために必要とされるすべての酵素をコードする伝
達可能染色体外要素である。TOL プラスミドを担持する
細胞、たとえばプソイドモナス・プチダATCC No.33015
は、一定の芳香族炭化水素類をそれらの対応する芳香族
カルボン酸に転換することができ；キシレン分解の酵素
をコードするxyl オペロン、及びxyl 遺伝子の調節を担
当できる遺伝子の両者が、TOL プラスミドｐWWO 上に存
在する。上記酸化のために必要とされる酵素をコードす
るTOL プラスミドｐWWO 上の遺伝子は、そのような酵素
を生成するよう誘発されるべきである。従って、そのよ
うな誘発の記載が、前記アメリカ特許第5,104,798 号；
第5,213,973 号；及び第5,236,832 号に存在する。
【０００５】Gaucher など., Dev. Ind. Microbid., 22
: 219-232(1981)による文献に記載されるように、菌類
ペニシリウム・グリセオフラバル（Penicillium Griseo
fulvum）は、ｍ−クレゾールのｍ−ヒドロキシ安息香酸
への転換のための次の3 種の酵素を含む：ｍ−クレゾー
ルメチルヒドロキシラーゼ、ｍ−ヒドロキシベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼ及びｍ−ヒドロキシベンズア
ルデヒドヒドロキシラーゼ。
: 219-232(1981)による文献に記載されるように、菌類
ペニシリウム・グリセオフラバル（Penicillium Griseo
fulvum）は、ｍ−クレゾールのｍ−ヒドロキシ安息香酸
への転換のための次の3 種の酵素を含む：ｍ−クレゾー
ルメチルヒドロキシラーゼ、ｍ−ヒドロキシベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼ及びｍ−ヒドロキシベンズア
ルデヒドヒドロキシラーゼ。
【０００６】当業界において知られているようにして反
復すると、一定の菌類及び細菌は、一定の芳香族環上の
メチル基のそれらの対応するカルボン酸への酸化のため
の酵素を含む。そのような複素芳香族環上のメチル基
は、当業者により理解されるように、微生物を用いて、
それらの対応するカルボン酸に酸化され得ることは知ら
れているが、そのような微生物酸化の化学的及び光学的
収率は、たとえば選択される特定の微生物、基質の濃
度、基質の構造、および同様のものに実質的に依存し
て、一般的に変化する。
復すると、一定の菌類及び細菌は、一定の芳香族環上の
メチル基のそれらの対応するカルボン酸への酸化のため
の酵素を含む。そのような複素芳香族環上のメチル基
は、当業者により理解されるように、微生物を用いて、
それらの対応するカルボン酸に酸化され得ることは知ら
れているが、そのような微生物酸化の化学的及び光学的
収率は、たとえば選択される特定の微生物、基質の濃
度、基質の構造、および同様のものに実質的に依存し
て、一般的に変化する。
【０００７】広範囲の微生物、たとえば菌類及び細菌が
実質的に、２−メチルキノキサリンを２−キノキサリン
カルボン酸に酸化することが現在見出されている。さら
に、その主要方法は、２−キノキサリンカルボン酸の適
切な回収を可能にする。1998年2 月5 日に出願されたア
メリカ特許出願第60/073,801号（“‘801 出願”）、す
なわち現在では、1999年1 月18日に出願された国際出願
PCT/IB99/00067号は、たとえば炎症及び他の免疫障害を
処理するために有用である新規ジヒドロキシへキサン酸
の合成において中間体としての２−キノキサリンカルボ
ン酸の使用を開示する。
実質的に、２−メチルキノキサリンを２−キノキサリン
カルボン酸に酸化することが現在見出されている。さら
に、その主要方法は、２−キノキサリンカルボン酸の適
切な回収を可能にする。1998年2 月5 日に出願されたア
メリカ特許出願第60/073,801号（“‘801 出願”）、す
なわち現在では、1999年1 月18日に出願された国際出願
PCT/IB99/00067号は、たとえば炎症及び他の免疫障害を
処理するために有用である新規ジヒドロキシへキサン酸
の合成において中間体としての２−キノキサリンカルボ
ン酸の使用を開示する。
【０００８】本発明の新規方法により供給される２−キ
ノキサリンカルボン酸は、そのようなジヒドロキシヘキ
サン酸を合成するために使用され得る。本明細書に引用
されるすべての書類は、そのすべてを、引用により本明
細書に組み込まれる。本発明は、２−メチルキノキサリ
ンから２−キノキサリンカルボン酸を調製するための微
生物学的方法に関する。
ノキサリンカルボン酸は、そのようなジヒドロキシヘキ
サン酸を合成するために使用され得る。本明細書に引用
されるすべての書類は、そのすべてを、引用により本明
細書に組み込まれる。本発明は、２−メチルキノキサリ
ンから２−キノキサリンカルボン酸を調製するための微
生物学的方法に関する。
【０００９】より特定には、本発明は、下記式I:
【化１】
【００１０】で表される化合物を製造するための微生物
学的方法に関し、ここで前記方法は、下記式II:
学的方法に関し、ここで前記方法は、下記式II:
【化２】
【００１１】で表される化合物と、式I の化合物のカル
ボキシル基への式IIの化合物のメチル基の酸化を達成で
きる微生物とを接触せしめ、そして多量の式I の化合物
を生成するために適切な条件下で前記得られる混合物を
インキュベートすることを含んで成る。
ボキシル基への式IIの化合物のメチル基の酸化を達成で
きる微生物とを接触せしめ、そして多量の式I の化合物
を生成するために適切な条件下で前記得られる混合物を
インキュベートすることを含んで成る。
【００１２】従って、本発明は、式IIの化合物、すなわ
ち２−メチルキノキサリンの微生物酸化を実施するため
の方法を提供し、ここで前記方法は、式IIの化合物と、
微生物、又は当業者に知られており、又は他方では、得
ることができ、そして突然変異にかかわらず、その目的
の酸化を達成できるその変異体（“その適切な変異
体”）とを接触せしめ、そしてその得られる混合物を、
多量の式I の化合物、すなわち２−キノキサリンカルボ
ン酸を生成するのに十分な条件下でインキュベートする
ことを含んで成り、
ち２−メチルキノキサリンの微生物酸化を実施するため
の方法を提供し、ここで前記方法は、式IIの化合物と、
微生物、又は当業者に知られており、又は他方では、得
ることができ、そして突然変異にかかわらず、その目的
の酸化を達成できるその変異体（“その適切な変異
体”）とを接触せしめ、そしてその得られる混合物を、
多量の式I の化合物、すなわち２−キノキサリンカルボ
ン酸を生成するのに十分な条件下でインキュベートする
ことを含んで成り、
【００１３】ここで前記微生物は、アブシジア・グラウ
カ（Absidia glauca）ATCC No.22752,アブシジア・グラ
ウカATCC No.74480,アブシジア・プソイドシリンドロス
ポラ（Absidia pseudocylindrospora ） ATCC No.2416
9, アブシジア・レペンス（Absidia repens）ATTCC No.
14849, アブシジア・レペンスATCC No.74481,アクチノ
ムコル・エレガンス（Actinomucor elegans ）ATCC No.
6476, アルテルナリア・ソラニ（Alternaria solani ）
ATCC NO.11078,アスペルギラス・タマリ（Aspergillus
tamarii ）ATCC No.16865,コニオフォラ・プテアナ（Co
niophora puteana）ATCC No.12675,
カ（Absidia glauca）ATCC No.22752,アブシジア・グラ
ウカATCC No.74480,アブシジア・プソイドシリンドロス
ポラ（Absidia pseudocylindrospora ） ATCC No.2416
9, アブシジア・レペンス（Absidia repens）ATTCC No.
14849, アブシジア・レペンスATCC No.74481,アクチノ
ムコル・エレガンス（Actinomucor elegans ）ATCC No.
6476, アルテルナリア・ソラニ（Alternaria solani ）
ATCC NO.11078,アスペルギラス・タマリ（Aspergillus
tamarii ）ATCC No.16865,コニオフォラ・プテアナ（Co
niophora puteana）ATCC No.12675,
【００１４】クニングハメラ・エキヌレータ（Cunningh
amella echinulata ）ATCC No.8688a,クニングハメラ・
エキヌレータ（ATCC No.8688b,クニングハメラ・エキヌ
レータATCC No.8983, クニングハメラ・エクヌレータAT
CC No.9244, クニングハメラ・イキヌレータATCC No.92
45, クニングハメラ・エキヌレータATCC No.10028b,ク
ニングハメラ・エキヌレータATCC No.26269,クニングハ
メラ・エキヌレータATCC No.36190,クニングハメラ・エ
キヌレータATCC No.36112,クニングハメラ・ホモタリカ
（Cunninghamella homothallica ）ATCC No.16161,シリ
ドロカルポン・デストルクタンス（Cylindrocarpon des
tructans）ATCC No.66963,
amella echinulata ）ATCC No.8688a,クニングハメラ・
エキヌレータ（ATCC No.8688b,クニングハメラ・エキヌ
レータATCC No.8983, クニングハメラ・エクヌレータAT
CC No.9244, クニングハメラ・イキヌレータATCC No.92
45, クニングハメラ・エキヌレータATCC No.10028b,ク
ニングハメラ・エキヌレータATCC No.26269,クニングハ
メラ・エキヌレータATCC No.36190,クニングハメラ・エ
キヌレータATCC No.36112,クニングハメラ・ホモタリカ
（Cunninghamella homothallica ）ATCC No.16161,シリ
ドロカルポン・デストルクタンス（Cylindrocarpon des
tructans）ATCC No.66963,
【００１５】ジプロジア・ゴシピナ（Diplodia gossypi
na）ATCC No.20575,エピコカム・ネグレクタム（Epicoc
cum neglectum ）ATCC No.12723,グロメレラ・ラゲナリ
ア（Glomerella lagenaria）ATCC No.14724,ペニシリウ
ム・クラビホルメ（Penicillium clariforme）ATCC No.
10426,ペニシリウム・デュクラウキシ（Penicilliumduc
lauxii ）ATCC No.10440,ペニシリウム・グラブラム（P
enicillium glabrum）ATCC No.11080,プソイドコキリオ
ボラス・ルナタス（Pseudocochliobolus lunatus）ATCC
No.24155,プソイドモナス・プチダ（Pseudomonas puti
da）ATCC No.33015,プソイドモナス・プチダATCC No.20
2190,
na）ATCC No.20575,エピコカム・ネグレクタム（Epicoc
cum neglectum ）ATCC No.12723,グロメレラ・ラゲナリ
ア（Glomerella lagenaria）ATCC No.14724,ペニシリウ
ム・クラビホルメ（Penicillium clariforme）ATCC No.
10426,ペニシリウム・デュクラウキシ（Penicilliumduc
lauxii ）ATCC No.10440,ペニシリウム・グラブラム（P
enicillium glabrum）ATCC No.11080,プソイドコキリオ
ボラス・ルナタス（Pseudocochliobolus lunatus）ATCC
No.24155,プソイドモナス・プチダ（Pseudomonas puti
da）ATCC No.33015,プソイドモナス・プチダATCC No.20
2190,
【００１６】ロドコカス・ロドクロウス（Rhodococcus
rhodochrous ）ATCC No.19067 及びタムノスチラム・ピ
リホルメ（Thamnostylum piriforme）ATCC No.8686; 並
びにそれらの適切な変異体から成る群から選択され；但
し、前記微生物が前記プソイドモナス・プチダATCC No.
33015 又は前記プソイドモナス・プチダATCC No.202190
である場合、前記プソイドモナス・プチダATCC No.3301
5 又は前記プソシドモナス・プチダATCC No.202190は、
前記プソイドモナス・プチダATCC No.33015 又は前記プ
ソイドモアス・ATCC No.202190と前記２−メチルキノキ
サリンとの前記接触の前、インデューサーとの相互作用
により誘発される。
rhodochrous ）ATCC No.19067 及びタムノスチラム・ピ
リホルメ（Thamnostylum piriforme）ATCC No.8686; 並
びにそれらの適切な変異体から成る群から選択され；但
し、前記微生物が前記プソイドモナス・プチダATCC No.
33015 又は前記プソイドモナス・プチダATCC No.202190
である場合、前記プソイドモナス・プチダATCC No.3301
5 又は前記プソシドモナス・プチダATCC No.202190は、
前記プソイドモナス・プチダATCC No.33015 又は前記プ
ソイドモアス・ATCC No.202190と前記２−メチルキノキ
サリンとの前記接触の前、インデューサーとの相互作用
により誘発される。
【００１７】本発明の方法は任意にはさらに、所望する
生成物、すなわち２−キノキサリンカルボン酸のいずれ
か適切な方法による単離を包含する。たとえば、反応混
合物は、有機溶媒、好ましくは酢酸エチルにより抽出さ
れ、そして次にその抽出された材料はクロマトグラフィ
ー処理され得る。他方では、２−キノキサリンカルボン
酸は、樹脂、好ましくはポリマー吸着樹脂上に前記反応
混合物から吸着され、有機溶媒、好ましくは酢酸エチル
を用いてそれらから溶出され、そして有機溶媒、又は有
機溶媒の組み合わせ、好ましくは酢酸エチル及びメタノ
−ルを用いて、前記溶出された材料から結晶化され得
る。
生成物、すなわち２−キノキサリンカルボン酸のいずれ
か適切な方法による単離を包含する。たとえば、反応混
合物は、有機溶媒、好ましくは酢酸エチルにより抽出さ
れ、そして次にその抽出された材料はクロマトグラフィ
ー処理され得る。他方では、２−キノキサリンカルボン
酸は、樹脂、好ましくはポリマー吸着樹脂上に前記反応
混合物から吸着され、有機溶媒、好ましくは酢酸エチル
を用いてそれらから溶出され、そして有機溶媒、又は有
機溶媒の組み合わせ、好ましくは酢酸エチル及びメタノ
−ルを用いて、前記溶出された材料から結晶化され得
る。
【００１８】さらに、本発明の方法により生成される２
−キノキサリンカルボン酸は、適切な塩基、たとえば水
酸化ナトリウムにより処理され、２−キノキサリンカル
ボン酸の塩、たとえばナトリウム塩の形成がもたらされ
る。次に、２−キノキサリンカルボン酸のアルカリ塩
が、濾過又は遠心分離による媒体からの細胞の除去、続
いて、たとえば蒸発による細胞−フリー媒体の濃縮によ
り生物転換媒体から単離される。対象微生物は好ましく
は、損なわれていない微生物である。本発明の好ましい
態様においては、微生物は菌類である。
−キノキサリンカルボン酸は、適切な塩基、たとえば水
酸化ナトリウムにより処理され、２−キノキサリンカル
ボン酸の塩、たとえばナトリウム塩の形成がもたらされ
る。次に、２−キノキサリンカルボン酸のアルカリ塩
が、濾過又は遠心分離による媒体からの細胞の除去、続
いて、たとえば蒸発による細胞−フリー媒体の濃縮によ
り生物転換媒体から単離される。対象微生物は好ましく
は、損なわれていない微生物である。本発明の好ましい
態様においては、微生物は菌類である。
【００１９】微生物が菌類である本発明の好ましい態様
においては、菌類は、アブシジア、アスペルギラス、ア
ルテルナリア、ペニシリウム、ジプロジア及びクニング
ハメラ属から成る群から選択される。微生物が菌類であ
る本発明の特に好ましい態様においては、菌類がアブシ
ジア属のものである。微生物がアブシジア属の菌類であ
る本発明の特に好ましい態様においては、微生物は、ブ
ダペスト条約に従って寄託された、アブシジア・グラウ
カATCC No.22752 又はアブシジア・グラウカATCC No.74
480 、又はそれらの適切な変異体、又はさらにアブシジ
ア・グラウカATCC No.22752 のいずれかの寄託物又はそ
の適切な変異体である。
においては、菌類は、アブシジア、アスペルギラス、ア
ルテルナリア、ペニシリウム、ジプロジア及びクニング
ハメラ属から成る群から選択される。微生物が菌類であ
る本発明の特に好ましい態様においては、菌類がアブシ
ジア属のものである。微生物がアブシジア属の菌類であ
る本発明の特に好ましい態様においては、微生物は、ブ
ダペスト条約に従って寄託された、アブシジア・グラウ
カATCC No.22752 又はアブシジア・グラウカATCC No.74
480 、又はそれらの適切な変異体、又はさらにアブシジ
ア・グラウカATCC No.22752 のいずれかの寄託物又はそ
の適切な変異体である。
【００２０】微生物がアブシジア属の菌類である本発明
のもう1 つの特に好ましい態様においては、微生物は、
ブダペスト条約に従って寄託された、アブシジア・レペ
ンスATCC No.14849 又はアブシジア・レペンスATCC No.
74481,又はその適切な変異体、又はさらに、アブシジア
・レペンスATCC No.14849 のいずれかの寄託物又はその
適切な変異体である。本発明の菌類培養物のための好ま
しい細胞密度は、約10〜約30g の乾量細胞/Lである。本
発明のもう1 つの好ましい態様においては、微生物は、
細菌である。
のもう1 つの特に好ましい態様においては、微生物は、
ブダペスト条約に従って寄託された、アブシジア・レペ
ンスATCC No.14849 又はアブシジア・レペンスATCC No.
74481,又はその適切な変異体、又はさらに、アブシジア
・レペンスATCC No.14849 のいずれかの寄託物又はその
適切な変異体である。本発明の菌類培養物のための好ま
しい細胞密度は、約10〜約30g の乾量細胞/Lである。本
発明のもう1 つの好ましい態様においては、微生物は、
細菌である。
【００２１】微生物が細菌である本発明の好ましい態様
においては、細菌はプソイドモナス及びロドコカス属か
ら成る群から選択される。微生物が細菌である本発明の
特に好ましい態様においては、細菌はプソイドモナス属
のものである。微生物がプソイドモナス属の細菌である
本発明の特に好ましい態様においては、微生物は、ブダ
ペスト条約に従って寄託された、プソイドモナス・プチ
ダATCCNo.33015 又はプソイドモナス・プチダATCC No.2
02190、又はその適切な変異体、又はさらに、プソイド
モナス・プチダATCC No.33015 のいづれかの寄託物又は
その適切な変異体である。
においては、細菌はプソイドモナス及びロドコカス属か
ら成る群から選択される。微生物が細菌である本発明の
特に好ましい態様においては、細菌はプソイドモナス属
のものである。微生物がプソイドモナス属の細菌である
本発明の特に好ましい態様においては、微生物は、ブダ
ペスト条約に従って寄託された、プソイドモナス・プチ
ダATCCNo.33015 又はプソイドモナス・プチダATCC No.2
02190、又はその適切な変異体、又はさらに、プソイド
モナス・プチダATCC No.33015 のいづれかの寄託物又は
その適切な変異体である。
【００２２】本発明の細菌培養物のための好ましい細胞
密度は、650nm で約10〜約30の光学密度を付与する密度
である。上記で論じられたように、微生物がプソイドモ
ナス・プチダATCC No.33015 又はプソイドモナス・プチ
ダATCC No.202190、又はその適切な変異体である本発明
の態様においては、微生物又はその適切な変異体は、接
触の前又は接触の間、誘発される。前記接触は、微生物
の誘発の完結の後に存在することが好ましい。好ましい
インデューサーは、ｐ−キシレン及びｍ−キシレンであ
る。特に好ましいインデューサーは、ｐ−キシレンであ
る。
密度は、650nm で約10〜約30の光学密度を付与する密度
である。上記で論じられたように、微生物がプソイドモ
ナス・プチダATCC No.33015 又はプソイドモナス・プチ
ダATCC No.202190、又はその適切な変異体である本発明
の態様においては、微生物又はその適切な変異体は、接
触の前又は接触の間、誘発される。前記接触は、微生物
の誘発の完結の後に存在することが好ましい。好ましい
インデューサーは、ｐ−キシレン及びｍ−キシレンであ
る。特に好ましいインデューサーは、ｐ−キシレンであ
る。
【００２３】微生物がプソイドモナス・プチダATCC NO.
33015 又はプソイドモナス・プチダATCC No.202190、又
はその適切な変異体であり、そして微生物がフラスコに
おける増殖培地において培養される本発明の好ましい態
様においては、インデューサーは、2 −メチルキノキサ
リンとの微生物の接触の前、そのような増殖培地に添加
され、そしてそのような培地において、そのような誘発
の実質的な完結のために十分な時間、インキュベートさ
れる。誘発された微生物の細胞は、フラスコ中の内容物
を遠心分離し、古い増殖培地（及び従って、対象のイン
デューサー）を除去し、たとえばデカントし、細胞ペレ
ットを洗浄し、そして前記微生物と前記2 −メチルキノ
キサリンとの接触の前、前記ペレットを水性媒体、たと
えばDPBSに再懸濁することによって集められる。
33015 又はプソイドモナス・プチダATCC No.202190、又
はその適切な変異体であり、そして微生物がフラスコに
おける増殖培地において培養される本発明の好ましい態
様においては、インデューサーは、2 −メチルキノキサ
リンとの微生物の接触の前、そのような増殖培地に添加
され、そしてそのような培地において、そのような誘発
の実質的な完結のために十分な時間、インキュベートさ
れる。誘発された微生物の細胞は、フラスコ中の内容物
を遠心分離し、古い増殖培地（及び従って、対象のイン
デューサー）を除去し、たとえばデカントし、細胞ペレ
ットを洗浄し、そして前記微生物と前記2 −メチルキノ
キサリンとの接触の前、前記ペレットを水性媒体、たと
えばDPBSに再懸濁することによって集められる。
【００２４】微生物がプソイドモナス・プチダATCC No.
33015 又はプソイドモナス・プチダATCC No.202190、又
はその適切な変異体であり、そして対象微生物が発酵器
における増殖培地において培養される本発明のもう1 つ
の好ましい態様においては、インデューサーは、2 −メ
チルキノキサリンと微生物との接触の前、そのような増
殖倍地に連続して又は連続的に添加され、そしてそのよ
うな誘発の実質的な完結のために十分な時間、そのよう
な増殖培地においてインキュベートされ、そして次に、
前記微生物と前記2 −メチルキノキサリンとの接触の
前、中断される。
33015 又はプソイドモナス・プチダATCC No.202190、又
はその適切な変異体であり、そして対象微生物が発酵器
における増殖培地において培養される本発明のもう1 つ
の好ましい態様においては、インデューサーは、2 −メ
チルキノキサリンと微生物との接触の前、そのような増
殖倍地に連続して又は連続的に添加され、そしてそのよ
うな誘発の実質的な完結のために十分な時間、そのよう
な増殖培地においてインキュベートされ、そして次に、
前記微生物と前記2 −メチルキノキサリンとの接触の
前、中断される。
【００２５】本発明のさらに好ましい態様においては、
本発明の接触は、微生物が菌類である対象微生物を含ん
で成る増殖培地に2 −メチルキノキサリンを添加するこ
とによって達成される。本発明の接触が対象の菌類を含
んで成る増殖培地に2 −メチルキノキサリンを添加する
ことによって達成される本発明の好ましい態様において
は、増殖培地は全浸潤性（cornsteep ）固形培地であ
る。特に好ましい全浸潤性固形培地は、約20g 〜約40g/
L の全浸潤性固形物及び約4.85のpHを有する約20g/L の
デキストロースを含んで成る。もう1 つの好ましい増殖
培地は、約20g/LのPharmamedia （登録商標）（Traders
Protein ）及び約7.2 のpHを有する約20g/L のデキス
トロースを含んで成る。
本発明の接触は、微生物が菌類である対象微生物を含ん
で成る増殖培地に2 −メチルキノキサリンを添加するこ
とによって達成される。本発明の接触が対象の菌類を含
んで成る増殖培地に2 −メチルキノキサリンを添加する
ことによって達成される本発明の好ましい態様において
は、増殖培地は全浸潤性（cornsteep ）固形培地であ
る。特に好ましい全浸潤性固形培地は、約20g 〜約40g/
L の全浸潤性固形物及び約4.85のpHを有する約20g/L の
デキストロースを含んで成る。もう1 つの好ましい増殖
培地は、約20g/LのPharmamedia （登録商標）（Traders
Protein ）及び約7.2 のpHを有する約20g/L のデキス
トロースを含んで成る。
【００２６】本発明のさらにもう1 つの好ましい態様に
おいては、接触は、樹脂に吸収される式IIの化合物を添
加することによってである。たとえば、J.T.Viceziな
ど., "Large-scale stereoselective enzymatic ketone
redustion with in situ product removal via polymer
ic absorbent resins,"Enzyme and Microbial Technolo
gy, 20 : 494-499(1997)による文献を参照のこと。本発
明のさらにもう1 つの好ましい態様においては、接触
は、微生物の洗浄された細胞を含んで成る水性培地に2
−メチルキノキサリンを添加することによって達成され
る。
おいては、接触は、樹脂に吸収される式IIの化合物を添
加することによってである。たとえば、J.T.Viceziな
ど., "Large-scale stereoselective enzymatic ketone
redustion with in situ product removal via polymer
ic absorbent resins,"Enzyme and Microbial Technolo
gy, 20 : 494-499(1997)による文献を参照のこと。本発
明のさらにもう1 つの好ましい態様においては、接触
は、微生物の洗浄された細胞を含んで成る水性培地に2
−メチルキノキサリンを添加することによって達成され
る。
【００２７】本発明のさらにもう1 つの好ましい態様に
おいては、微生物は、2 −メチルキノキサリンと微生物
とを接触する前に洗浄される。微生物が、2 −メチルキ
ノキサリンと微生物とを接触する前に洗浄される本発明
の好ましい態様においては、洗浄された微生物は、接触
の前、固定される。本発明のもう1 つの好ましい態様に
おいては、微生物は、それらに2 −メチルキノキサリン
を添加することによって達成される接触の前、約24時間
〜約72時間、全浸潤性固形培地において増殖される。
おいては、微生物は、2 −メチルキノキサリンと微生物
とを接触する前に洗浄される。微生物が、2 −メチルキ
ノキサリンと微生物とを接触する前に洗浄される本発明
の好ましい態様においては、洗浄された微生物は、接触
の前、固定される。本発明のもう1 つの好ましい態様に
おいては、微生物は、それらに2 −メチルキノキサリン
を添加することによって達成される接触の前、約24時間
〜約72時間、全浸潤性固形培地において増殖される。
【００２８】本発明の方法は、さらに任意には、たとえ
ば有機溶媒による抽出、樹脂上への吸着、結晶化、又上
記に論ぜられるように、2 −キノキサリンカルボン酸の
アルカリ塩が提供される場合、細胞フリー培地の蒸発、
又は同様の手段により実施される、2 −キノキサリンカ
ルボン酸の単離又は分離を包含する。本発明はさら
に、'801出願に開示されるいずれかの方法に従って、又
はそのためのいずれか他の適切な方法を用いることによ
って、前記 '801 出願に開示される新規ジヒドロキシヘ
キサン酸の合成への2 −キノキサリンカルボン酸の使用
を包含する。
ば有機溶媒による抽出、樹脂上への吸着、結晶化、又上
記に論ぜられるように、2 −キノキサリンカルボン酸の
アルカリ塩が提供される場合、細胞フリー培地の蒸発、
又は同様の手段により実施される、2 −キノキサリンカ
ルボン酸の単離又は分離を包含する。本発明はさら
に、'801出願に開示されるいずれかの方法に従って、又
はそのためのいずれか他の適切な方法を用いることによ
って、前記 '801 出願に開示される新規ジヒドロキシヘ
キサン酸の合成への2 −キノキサリンカルボン酸の使用
を包含する。
【００２９】当業者は、本発明を記載するために本明細
書に使用される用語を十分に理解できるであろう；それ
にもかかわらず、本明細書に使用される次の用語は、下
記の通りである。“損なわれていない微生物”とは、微
生物の細胞がそれらの固有（及び/ 又は場合によって
は、誘発された）の機械的、物理的及び生化学的完全性
を実質的に有することを意味する。
書に使用される用語を十分に理解できるであろう；それ
にもかかわらず、本明細書に使用される次の用語は、下
記の通りである。“損なわれていない微生物”とは、微
生物の細胞がそれらの固有（及び/ 又は場合によって
は、誘発された）の機械的、物理的及び生化学的完全性
を実質的に有することを意味する。
【００３０】“微生物性酸化”とは、損なわれていない
微生物、又はそのいずれかの調製物、および同様のもの
により達成されるような本発明の酸化を意味する。“微
生物”とは、損なわれていない微生物又はそれからの適
切な調製物、たとえば場合によっては、発酵培地、増殖
培地、培養ブイヨン及び同様のものが無いよう洗浄され
た微生物；及びたとえばカラムに固定された、ビーズに
結合された及び同様のものの微生物を包含する。
微生物、又はそのいずれかの調製物、および同様のもの
により達成されるような本発明の酸化を意味する。“微
生物”とは、損なわれていない微生物又はそれからの適
切な調製物、たとえば場合によっては、発酵培地、増殖
培地、培養ブイヨン及び同様のものが無いよう洗浄され
た微生物；及びたとえばカラムに固定された、ビーズに
結合された及び同様のものの微生物を包含する。
【００３１】特にことわらない限り、本明細書を通し
て、下記用語が使用される：℃は、度センチグレートで
あり；％は、パーセントであり；ACN は、アセトニトリ
ルであり；DMSOは、ジメチルスルホキシドであり；DPBS
は、ダルベッコ リン酸緩衝溶液であり；EtOAC は、酢
酸エチルであり；EtOHは、エタノールであり；ｇは、グ
ラムであり；HPLCは、高性能液体クロマトグラフィーで
あり；
て、下記用語が使用される：℃は、度センチグレートで
あり；％は、パーセントであり；ACN は、アセトニトリ
ルであり；DMSOは、ジメチルスルホキシドであり；DPBS
は、ダルベッコ リン酸緩衝溶液であり；EtOAC は、酢
酸エチルであり；EtOHは、エタノールであり；ｇは、グ
ラムであり；HPLCは、高性能液体クロマトグラフィーで
あり；
【００３２】L は、リットルであり；MeOHは、メタノー
ルであり；mgは、ミリグラムであり；min は、分であ
り；mmは、ミリメートルであり；m モルは、ミリモルで
あり；mLは、ミリリットルであり；m −キシレンは、メ
ターキシレンであり；N は、標準（濃度）であり；nM
は、ナノモル（濃度）であり；
ルであり；mgは、ミリグラムであり；min は、分であ
り；mmは、ミリメートルであり；m モルは、ミリモルで
あり；mLは、ミリリットルであり；m −キシレンは、メ
ターキシレンであり；N は、標準（濃度）であり；nM
は、ナノモル（濃度）であり；
【００３３】PBS は、リン酸緩衝溶液であり；p −キシ
レンは、パラ−キシレンであり；rpm は、回転数/ 分で
あり；TFA は、トリフルオロ酢酸でありμL は、マイク
ロリットルであり；v/v は、体積/ 体積であり；Americ
an National Can （登録商標）は、Menasha, Wisconsi
n, U.S.A.に位置する；Becton Dickinson（登録商標）L
abware は、Franklin Lakes, New Jersey, U.S.A.に位
置する；Becton Dickinson（登録商標）Microbiology S
ystemsは、Sparks, Maryland,U.S.A.に位置する；
レンは、パラ−キシレンであり；rpm は、回転数/ 分で
あり；TFA は、トリフルオロ酢酸でありμL は、マイク
ロリットルであり；v/v は、体積/ 体積であり；Americ
an National Can （登録商標）は、Menasha, Wisconsi
n, U.S.A.に位置する；Becton Dickinson（登録商標）L
abware は、Franklin Lakes, New Jersey, U.S.A.に位
置する；Becton Dickinson（登録商標）Microbiology S
ystemsは、Sparks, Maryland,U.S.A.に位置する；
【００３４】Biowhittaker（登録商標）は、Walkersvil
le, Maryland, U.S.A.に位置する；Column Engineering
（登録商標）, Inc,は、Ontario, California, U.S.A.
に位置する；IEC （登録商標）Centrifugeは、Needham
Heights, Massachusetts, U.S.A.に位置する；Rohm and
Haas （登録商標）は、Philadelphia, Pennsylvania,
U.S.A.に位置する；そして、Traders Protein （登録商
標）は、Memphis, Tennessee, U.S.A.に位置する；さら
に、ATCCは、10801 University Boulevard, Manassas,
Virginia, 20110-2209, U.S.A.に位置するAmerican Typ
e Culture Collectionである。下記表１は、本明細書に
開示される微生物及びそれらの寄託者を列挙する（www.
ATCC.comを参照のこと）。
le, Maryland, U.S.A.に位置する；Column Engineering
（登録商標）, Inc,は、Ontario, California, U.S.A.
に位置する；IEC （登録商標）Centrifugeは、Needham
Heights, Massachusetts, U.S.A.に位置する；Rohm and
Haas （登録商標）は、Philadelphia, Pennsylvania,
U.S.A.に位置する；そして、Traders Protein （登録商
標）は、Memphis, Tennessee, U.S.A.に位置する；さら
に、ATCCは、10801 University Boulevard, Manassas,
Virginia, 20110-2209, U.S.A.に位置するAmerican Typ
e Culture Collectionである。下記表１は、本明細書に
開示される微生物及びそれらの寄託者を列挙する（www.
ATCC.comを参照のこと）。
【００３５】
【表１】 １：NRRLは、Northern Regional Research Laboraterie
s (Peoria, Illinois)である。 ２：1999年1 月13日にブタペスト条約下で寄託されたA.
グラウカ、22752 。 ３：1999年1 月13日にブタペスト条約下で寄託されたA.
レペンス、14849 。 ４：1999年1 月13日にブタペスト条約下で寄託されたP.
プチダ、33015 。 上記で論じたように、本発明は下記式１：
s (Peoria, Illinois)である。 ２：1999年1 月13日にブタペスト条約下で寄託されたA.
グラウカ、22752 。 ３：1999年1 月13日にブタペスト条約下で寄託されたA.
レペンス、14849 。 ４：1999年1 月13日にブタペスト条約下で寄託されたP.
プチダ、33015 。 上記で論じたように、本発明は下記式１：
【００３６】
【化３】 で表される化合物を調製するための微生物方法に関し、
ここで前記方法は、下記式II：
ここで前記方法は、下記式II：
【００３７】
【化４】
【００３８】で表される化合物を、式II、すなわち2 −
メチルキノキサリンのメチル基の、式I 、すなわち2 −
キノキサリンカルボン酸のカルボキシル基への酸化を達
成できる微生物とを接触し；そしてその得られる混合物
を、2 −キノキサリンカルボン酸を生成するのに適切な
条件下でインキュベートすることを含んで成る。
メチルキノキサリンのメチル基の、式I 、すなわち2 −
キノキサリンカルボン酸のカルボキシル基への酸化を達
成できる微生物とを接触し；そしてその得られる混合物
を、2 −キノキサリンカルボン酸を生成するのに適切な
条件下でインキュベートすることを含んで成る。
【００３９】本発明の方法は容易に実施され得る。前記
微生物は、必要な場合、誘発物を伴って培養され、ここ
で前記微生物はプソイドモナス・プチダATCC No.33015
もしくはプソイドモナス・プチダATCC No.202190、又は
その適切な変異体であり、そして次に、2 −キノキサリ
ンカルボン酸の−COOH基に2 −メチルキノキサリンのメ
チル基を酸化するために、2 −メチルキノキサリンと接
触せしめられる。
微生物は、必要な場合、誘発物を伴って培養され、ここ
で前記微生物はプソイドモナス・プチダATCC No.33015
もしくはプソイドモナス・プチダATCC No.202190、又は
その適切な変異体であり、そして次に、2 −キノキサリ
ンカルボン酸の−COOH基に2 −メチルキノキサリンのメ
チル基を酸化するために、2 −メチルキノキサリンと接
触せしめられる。
【００４０】次に、2 −キノキサリンカルボン酸は、炎
症及び他の炎症性疾患を処置するために有用である、'8
01出願に開示される新規ジヒドロキシヘキサン酸を究極
的には生成するために、前記 '801 出願に記載される方
法により、さらに反応せしめられ得る。前記 '801 出願
に開示される新規ジヒドロキシヘキサン酸に関する活
性、活性を試験するための方法、投与量形、投与方法及
びバックグラウンド情報が本明細書に示されている。
症及び他の炎症性疾患を処置するために有用である、'8
01出願に開示される新規ジヒドロキシヘキサン酸を究極
的には生成するために、前記 '801 出願に記載される方
法により、さらに反応せしめられ得る。前記 '801 出願
に開示される新規ジヒドロキシヘキサン酸に関する活
性、活性を試験するための方法、投与量形、投与方法及
びバックグラウンド情報が本明細書に示されている。
【００４１】上記で論じたように、いずれかの適切な微
生物、又はその適切な変異体が、本発明の方法に使用さ
れ得る。当業者により理解されるように、本発明の方法
の条件は、たとえば微生物の種類及びその特定の調製に
依存して選択される。たとえば、発酵培地及び有機溶媒
のpH、温度、成分濃度及び同様のもの、並びに2 −メチ
ルキノキサリン及びインデューサー（使用される場合）
の濃度は、選択された微生物を用いて特定の所望する結
果を提供するために選択されるであろう。
生物、又はその適切な変異体が、本発明の方法に使用さ
れ得る。当業者により理解されるように、本発明の方法
の条件は、たとえば微生物の種類及びその特定の調製に
依存して選択される。たとえば、発酵培地及び有機溶媒
のpH、温度、成分濃度及び同様のもの、並びに2 −メチ
ルキノキサリン及びインデューサー（使用される場合）
の濃度は、選択された微生物を用いて特定の所望する結
果を提供するために選択されるであろう。
【００４２】好ましい菌類は、アブシジア、アクチノム
コル、アルテルナリア、アスペルギラス、コニオフォ
ラ、クニングハメラ、シリンドロカルボン、ジプロジ
ア、エピコカム、フサリウム、グロメレラ、ペニシリウ
ム、プソイドコキリオボラス、タムノスチラム、及びベ
ルチシリウム属のそれらのメンバーを包含するが、しか
しそれらの種も特別に限定されないが、但しそれらの微
生物又はそれらの変異体は本発明の酸化を達成できるべ
きである。特に好ましい菌類は、アブシジア、アルテル
ナリア、アスペルギラス、クニングハメラ、ジプロジア
及びペニシリウム属に属する。特に好ましい菌類は、ア
ブシジア属に属する。
コル、アルテルナリア、アスペルギラス、コニオフォ
ラ、クニングハメラ、シリンドロカルボン、ジプロジ
ア、エピコカム、フサリウム、グロメレラ、ペニシリウ
ム、プソイドコキリオボラス、タムノスチラム、及びベ
ルチシリウム属のそれらのメンバーを包含するが、しか
しそれらの種も特別に限定されないが、但しそれらの微
生物又はそれらの変異体は本発明の酸化を達成できるべ
きである。特に好ましい菌類は、アブシジア、アルテル
ナリア、アスペルギラス、クニングハメラ、ジプロジア
及びペニシリウム属に属する。特に好ましい菌類は、ア
ブシジア属に属する。
【００４３】より具体的には、好ましい菌類は、次のも
のを包含する：アブシジア・グラウカATCC No.22752,ア
ブシジア・グラウカATCC No.74480,アブシジア・プソイ
ドシリンドロスポラATCC No.24169,アブシジア・レペン
スATTCC No.14849, アブシジア・レペンスATCC No.7448
1,アクチノムコル・エレガンスATCC No.6476, アルテル
ナリア・ソラニATCC NO.11078,アスペルギラス・タマリ
ATCC No.16865,コニオフォラ・プテアナATCC No.12675,
クニングハメラ・エキヌレータATCC No.8688a,クニング
ハメラ・エキヌレータ（ATCC No.8688b,クニングハメラ
・エキヌレータATCC No.8983, クニングハメラ・エキヌ
レータATCC No.9244, クニングハメラ・エキヌレータAT
CC No.9245, クニングハメラ・エキヌレータATCC No.10
028b,
のを包含する：アブシジア・グラウカATCC No.22752,ア
ブシジア・グラウカATCC No.74480,アブシジア・プソイ
ドシリンドロスポラATCC No.24169,アブシジア・レペン
スATTCC No.14849, アブシジア・レペンスATCC No.7448
1,アクチノムコル・エレガンスATCC No.6476, アルテル
ナリア・ソラニATCC NO.11078,アスペルギラス・タマリ
ATCC No.16865,コニオフォラ・プテアナATCC No.12675,
クニングハメラ・エキヌレータATCC No.8688a,クニング
ハメラ・エキヌレータ（ATCC No.8688b,クニングハメラ
・エキヌレータATCC No.8983, クニングハメラ・エキヌ
レータATCC No.9244, クニングハメラ・エキヌレータAT
CC No.9245, クニングハメラ・エキヌレータATCC No.10
028b,
【００４４】クニングハメラ・エキヌレータATCC No.26
269,クニングハメラ・エキヌレータATCC No.36190,クニ
ングハメラ・エキヌレータATCC No.36112,クニングハメ
ラ・ホモタリカATCC No.16161,シリドロカルポン・デス
トルクタンスATCC No.66963,ジプロジア・ゴシピナATCC
No.20575,エピコカム・ネグレクタムATCC No.12723,グ
ロメレラ・ラゲナリアATCC No.14724,ペニシリウム・ク
ラビホルメATCC No.10426,ペニシリウム・デュクラウキ
シATCC No.10440,ペニシリウム・グラブラムATCC No.11
080,プソイドコキリオボラス・ルナタスATCC No.24155,
及びタムノスチラム・ピリホルメATCC No.8686；並びに
それらの適切な変異体。
269,クニングハメラ・エキヌレータATCC No.36190,クニ
ングハメラ・エキヌレータATCC No.36112,クニングハメ
ラ・ホモタリカATCC No.16161,シリドロカルポン・デス
トルクタンスATCC No.66963,ジプロジア・ゴシピナATCC
No.20575,エピコカム・ネグレクタムATCC No.12723,グ
ロメレラ・ラゲナリアATCC No.14724,ペニシリウム・ク
ラビホルメATCC No.10426,ペニシリウム・デュクラウキ
シATCC No.10440,ペニシリウム・グラブラムATCC No.11
080,プソイドコキリオボラス・ルナタスATCC No.24155,
及びタムノスチラム・ピリホルメATCC No.8686；並びに
それらの適切な変異体。
【００４５】より好ましい菌類は、次のものを包含す
る：アブシジア・グラウカATCC No.22752,アブシジア・
グラウカATCC No.74480,アブシジア・レペンスATCC No.
14849,アブシジア・レペンスATCC No.74481,アルテルナ
リア・ソラニATCC No.11078,アスペルギラス・タマリAT
CC No.16865,クニングハメラ・エキヌレータATCC No.89
83, ジプロジア・ゴシピナATCC No.20575 及びペニシリ
ウム・グラブラムATCC No.11080;並びにそれらの適切な
変異体。
る：アブシジア・グラウカATCC No.22752,アブシジア・
グラウカATCC No.74480,アブシジア・レペンスATCC No.
14849,アブシジア・レペンスATCC No.74481,アルテルナ
リア・ソラニATCC No.11078,アスペルギラス・タマリAT
CC No.16865,クニングハメラ・エキヌレータATCC No.89
83, ジプロジア・ゴシピナATCC No.20575 及びペニシリ
ウム・グラブラムATCC No.11080;並びにそれらの適切な
変異体。
【００４６】特に好ましい菌類は、次のものを包含す
る：アブシジア・グラウカATCC No.22752,アブシジア・
グラウカATCC No.74480,アブシジア・レペンスATCC No.
14849及びアブシジア・レペンスATCC No.74481;並びに
それらの適切な変異体。特に好ましい菌類は、次のもの
を包含する：アブシジア・レペンスATCC No.14849 及び
アブシジア・レペンスATCC No.74481;並びにそれらの適
切な変異体。
る：アブシジア・グラウカATCC No.22752,アブシジア・
グラウカATCC No.74480,アブシジア・レペンスATCC No.
14849及びアブシジア・レペンスATCC No.74481;並びに
それらの適切な変異体。特に好ましい菌類は、次のもの
を包含する：アブシジア・レペンスATCC No.14849 及び
アブシジア・レペンスATCC No.74481;並びにそれらの適
切な変異体。
【００４７】好ましい菌類は、バチルス（Bacillus）、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ミクロコーカ
ス（Micrococcus ）、プソイドモナス（Pseudomonas ）
及びロドコカス（Rhodococcus ）属に属するものを包含
するが、しかしそれらの種も特別に限定されないが、但
し、それらの微生物又はそれらの変異体は本発明の酸化
を達成できるべきである。特に好ましい細菌は、プソイ
ドモナス及びロドコカスの属に属するものを包含する。
特に好ましい細菌は、プソイドモナス属に属するものを
包含する。
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ミクロコーカ
ス（Micrococcus ）、プソイドモナス（Pseudomonas ）
及びロドコカス（Rhodococcus ）属に属するものを包含
するが、しかしそれらの種も特別に限定されないが、但
し、それらの微生物又はそれらの変異体は本発明の酸化
を達成できるべきである。特に好ましい細菌は、プソイ
ドモナス及びロドコカスの属に属するものを包含する。
特に好ましい細菌は、プソイドモナス属に属するものを
包含する。
【００４８】より具体的には、好ましい細菌は、プソイ
ドモナス・プチダATCC No.33015,プソイドモナス・プチ
ダATCC No.202190及びロドコカス・ロドクロウスATCC N
o.19067;及びそれらの適切な変異体を包含する。特に好
ましい菌類は、プソイドモナス・プチダATCC No.33015
又はプソイドモナス・プチダATCC No.202190; 及びそれ
らの適切な変異体である。
ドモナス・プチダATCC No.33015,プソイドモナス・プチ
ダATCC No.202190及びロドコカス・ロドクロウスATCC N
o.19067;及びそれらの適切な変異体を包含する。特に好
ましい菌類は、プソイドモナス・プチダATCC No.33015
又はプソイドモナス・プチダATCC No.202190; 及びそれ
らの適切な変異体である。
【００４９】上記で論じたように、本発明は、適切な微
生物のいずれかの適切な変異体のいずれかの使用を包含
する。さらに、親株に比較して、より多くの量の基質を
酸化できるより所望の性質を有する変異体のグループも
また、本発明の方法に使用され得、そしてそれらの新規
株は、既知の方法、たとえば標準の突然変異誘発及び選
択技法、並びに組換え方法、たとえば特定部位の突然変
異誘発を用いて製造され得る。
生物のいずれかの適切な変異体のいずれかの使用を包含
する。さらに、親株に比較して、より多くの量の基質を
酸化できるより所望の性質を有する変異体のグループも
また、本発明の方法に使用され得、そしてそれらの新規
株は、既知の方法、たとえば標準の突然変異誘発及び選
択技法、並びに組換え方法、たとえば特定部位の突然変
異誘発を用いて製造され得る。
【００５０】標準の突然変異誘発は、N −メチル−N'−
ニトロソグアニジン（Delic など.(1970), Mutal. Res.
9:167 ）、亜硝酸（Crueger and Crueger (1984), Bio
technology: A Textbook of Industrial Microbiology,
P.16, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, U
SA ）、及び紫外線による照射（Thrum(1984), Biotechn
ology of Industrial Antibiotics (Vandamme, ed.), M
arcel Dekker, New York, pp. 373-374）による化学的
突然変異誘発を包含する。
ニトロソグアニジン（Delic など.(1970), Mutal. Res.
9:167 ）、亜硝酸（Crueger and Crueger (1984), Bio
technology: A Textbook of Industrial Microbiology,
P.16, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, U
SA ）、及び紫外線による照射（Thrum(1984), Biotechn
ology of Industrial Antibiotics (Vandamme, ed.), M
arcel Dekker, New York, pp. 373-374）による化学的
突然変異誘発を包含する。
【００５１】選択技法は、単離されたコロニーの選択、
特定コロニー形態学の選択、及び式I の化合物の生合成
路において知られているか又は考えられる成分の類似体
に対する耐性についての選択による株の単純な再単離を
包含する（Crueger and Crueger(1984), Biotechnolog
y: A Textbook of Industrial Microbiology, p.24-25,
Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA
）。
特定コロニー形態学の選択、及び式I の化合物の生合成
路において知られているか又は考えられる成分の類似体
に対する耐性についての選択による株の単純な再単離を
包含する（Crueger and Crueger(1984), Biotechnolog
y: A Textbook of Industrial Microbiology, p.24-25,
Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA
）。
【００５２】それらの新規株は本発明の方法に使用され
る。なぜならば、それらはそれらのそれぞれの親株に比
較して改良された性質を有し、たとえばそれらはより多
くの2 −キノキサリンカルボン酸を生成し、すなわち、
たとえば選択された特定の微生物に依存して、本発明の
方法において生成され得る2 −メチルキノキサリン及び
/ 又は2 −キノキサリンカルボン酸及び/ 又は中間体化
合物の不所望の固有の分解活性をほとんど示さないから
である。さらに、変異体が、その使用がより多くの2 −
キノキサリンカルボン酸をもたらすので、使用される場
合、実質的な費用倹約をもたらす、本発明に従って多量
の2 −キノキサリンカルボン酸を生成するために必要な
材料を得るために増殖されるべきより少ない量の培養物
を必要とする。
る。なぜならば、それらはそれらのそれぞれの親株に比
較して改良された性質を有し、たとえばそれらはより多
くの2 −キノキサリンカルボン酸を生成し、すなわち、
たとえば選択された特定の微生物に依存して、本発明の
方法において生成され得る2 −メチルキノキサリン及び
/ 又は2 −キノキサリンカルボン酸及び/ 又は中間体化
合物の不所望の固有の分解活性をほとんど示さないから
である。さらに、変異体が、その使用がより多くの2 −
キノキサリンカルボン酸をもたらすので、使用される場
合、実質的な費用倹約をもたらす、本発明に従って多量
の2 −キノキサリンカルボン酸を生成するために必要な
材料を得るために増殖されるべきより少ない量の培養物
を必要とする。
【００５３】上記のように、微生物のいずれか適切な調
製物、たとえば増殖培地における微生物、発酵培地、培
養物ブイヨン及び同様のものを有さない洗浄された微生
物、又はたとえばカラムに固定された、ビーズに結合さ
れた、及び同様のものの微生物が、本発明の方法に使用
され得る。当業者は、Biotechnology Letters, 18(3):
343-348(1996) に公開される文献“Polyvinyl alcohol-
immobilized whole-cell preparations of biotransfor
mation of nitriles”12, A. Bauerなど. により記載さ
れる固定された損なわれていない適切な微生物をいかに
して調製するかを本明細書に提供される記載から理解す
るであろう。
製物、たとえば増殖培地における微生物、発酵培地、培
養物ブイヨン及び同様のものを有さない洗浄された微生
物、又はたとえばカラムに固定された、ビーズに結合さ
れた、及び同様のものの微生物が、本発明の方法に使用
され得る。当業者は、Biotechnology Letters, 18(3):
343-348(1996) に公開される文献“Polyvinyl alcohol-
immobilized whole-cell preparations of biotransfor
mation of nitriles”12, A. Bauerなど. により記載さ
れる固定された損なわれていない適切な微生物をいかに
して調製するかを本明細書に提供される記載から理解す
るであろう。
【００５４】好ましい損なわれていない微生物は、本発
明の方法のいずれの段階ででも所望する生成物を分解し
又は他方では、負の衝撃を与える固有の活性を有さな
い、実質的に変更されていない生成物を付与しながら、
2 −メチルキノキサリンを、生成物、特に2 −キノキサ
リンカルボン酸に実質的に酸化する微生物である。本発
明の微生物酸化への使用のために適切な微生物は、当業
者に知られているいずれかの適切な方法により調製され
得る。
明の方法のいずれの段階ででも所望する生成物を分解し
又は他方では、負の衝撃を与える固有の活性を有さな
い、実質的に変更されていない生成物を付与しながら、
2 −メチルキノキサリンを、生成物、特に2 −キノキサ
リンカルボン酸に実質的に酸化する微生物である。本発
明の微生物酸化への使用のために適切な微生物は、当業
者に知られているいずれかの適切な方法により調製され
得る。
【００５５】市販の原物（stock ）からの微生物の調製
のための適切な方法の例は、下記に提供される。下記に
提供される方法を包含する本発明の開示に基づいて、当
業者は、それらの方法のいずれかの部分、たとえば遊離
又は固定された微生物を調製するための方法；2 −キノ
キサリンカルボン酸と微生物とを接触するための方法；
増殖培地成分及び条件、たとえば温度、pH及び同様のも
の；2 −メチルキノキサリン、インデューサー（使用さ
れる場合）の個々の濃度；又はインキュベーション条件
を、いずれかの適切な微生物を用いて所望する結果を達
成するためにいかにして修飾するかを理解するであろ
う。
のための適切な方法の例は、下記に提供される。下記に
提供される方法を包含する本発明の開示に基づいて、当
業者は、それらの方法のいずれかの部分、たとえば遊離
又は固定された微生物を調製するための方法；2 −キノ
キサリンカルボン酸と微生物とを接触するための方法；
増殖培地成分及び条件、たとえば温度、pH及び同様のも
の；2 −メチルキノキサリン、インデューサー（使用さ
れる場合）の個々の濃度；又はインキュベーション条件
を、いずれかの適切な微生物を用いて所望する結果を達
成するためにいかにして修飾するかを理解するであろ
う。
【００５６】微生物が菌類である本発明の態様において
は、2 −メチルキノキサリンの好ましい濃度範囲は、約
0.01g/L 〜約2.5g/Lであり、そして特に好ましい範囲は
約0.1g/L〜約2.0g/Lである。微生物がA.レペンスATCC N
o.14849, A. レペンスATCC No.74481, A. グラウカATCC
No.22752, A. グラウカATCC No.74480 及びそれらの適
切の変異体から成る群から選択された菌類である本発明
の態様においては、2−メチルキノキサリンの好ましい
濃度範囲は、約0.1g/L〜約2.0g/Lである。
は、2 −メチルキノキサリンの好ましい濃度範囲は、約
0.01g/L 〜約2.5g/Lであり、そして特に好ましい範囲は
約0.1g/L〜約2.0g/Lである。微生物がA.レペンスATCC N
o.14849, A. レペンスATCC No.74481, A. グラウカATCC
No.22752, A. グラウカATCC No.74480 及びそれらの適
切の変異体から成る群から選択された菌類である本発明
の態様においては、2−メチルキノキサリンの好ましい
濃度範囲は、約0.1g/L〜約2.0g/Lである。
【００５７】微生物が細菌である本発明の態様において
は、2 −メチルキノキサリンの好ましい濃度範囲は、約
0.01g/L 〜約1.5g/Lであり、そして特に好ましい範囲は
0.1g/L〜約1.0g/Lである。細菌がP.プチダATCC No.3301
5, P. プチダATCC No.202190及びそれらの適切な変異体
から成る群から選択される本発明の態様においては、2
−メチルキノキサリンの好ましい濃度範囲は、約0.1g/L
〜約1.0g/Lである。
は、2 −メチルキノキサリンの好ましい濃度範囲は、約
0.01g/L 〜約1.5g/Lであり、そして特に好ましい範囲は
0.1g/L〜約1.0g/Lである。細菌がP.プチダATCC No.3301
5, P. プチダATCC No.202190及びそれらの適切な変異体
から成る群から選択される本発明の態様においては、2
−メチルキノキサリンの好ましい濃度範囲は、約0.1g/L
〜約1.0g/Lである。
【００５８】さらに、及び前で論じたように、TOL プラ
スミドを担持する細菌、たとえば本発明の酸化のために
必要とされるP.プチダATCC No.33015 又はP.プチダATCC
No.202190は、誘発されるべきである。P.プチダATCC N
o.33015 又はP.プチダATCC No.202190が発酵器における
培地において培養される本発明の態様においては、イン
デューサー、好ましくはｐ−キシレンが、約4.5mモル/L
/ 時〜約6.5mモル/L/時の好ましい添加速度、及び約4.9
mモル/L/ 時〜約6.1mモル/L/ 時の特に好ましい添加速
度で添加される。
スミドを担持する細菌、たとえば本発明の酸化のために
必要とされるP.プチダATCC No.33015 又はP.プチダATCC
No.202190は、誘発されるべきである。P.プチダATCC N
o.33015 又はP.プチダATCC No.202190が発酵器における
培地において培養される本発明の態様においては、イン
デューサー、好ましくはｐ−キシレンが、約4.5mモル/L
/ 時〜約6.5mモル/L/時の好ましい添加速度、及び約4.9
mモル/L/ 時〜約6.1mモル/L/ 時の特に好ましい添加速
度で添加される。
【００５９】P.プチダATCC No.33015 又はP.プチダATCC
No.202190がフラスコにおける培地に存在する本発明の
態様においては、インデューサー、好ましくはｐ−キシ
レンが培地に気体の形で連続的に添加される。本発明の
開示、及び前記文献及び特許（たとえばアメリカ特許第
5,236,832 号）から当業者により理解されるように、イ
ンデューサー濃度は通常、それが酸化を担当する酵素の
最小阻害濃度よりも低くなるように選択される。またCl
aus and Walker, J. Gen. Microbiol., 36: 107-122(19
64) を参照のこと。
No.202190がフラスコにおける培地に存在する本発明の
態様においては、インデューサー、好ましくはｐ−キシ
レンが培地に気体の形で連続的に添加される。本発明の
開示、及び前記文献及び特許（たとえばアメリカ特許第
5,236,832 号）から当業者により理解されるように、イ
ンデューサー濃度は通常、それが酸化を担当する酵素の
最小阻害濃度よりも低くなるように選択される。またCl
aus and Walker, J. Gen. Microbiol., 36: 107-122(19
64) を参照のこと。
【００６０】基質2 −メチルキノキサリンと微生物とを
接触するいずれかの適切な方法が、本発明において使用
され得る。基質は微生物をいずれかの適切な順序で接触
せしめられ得る。たとえば、2 −メチルキノキサリン
は、培地、たとえば遊離の又は固定された、又はその組
み合わせで微生物を含んで成る培養ブイヨンに添加され
得；又は培地は2 −メチルキノキサリンを含むことがで
き、そして次に微生物がそのような培地に添加され得；
又は2 −メチルキノキサリン及び微生物がそのような培
地に一緒に添加され得；又は2 −メチルキノキサリン又
は微生物のいずれかが、他のものを含んで成る適切な溶
媒に添加され得；又は2 −メチルキノキサリンが樹脂に
吸着され得；そして同様のことが存在する。当業者は、
本発明の方法にいずれかの部分を所望によりいかにして
改良するかを、本明細書に提供される記載から理解する
であろう。
接触するいずれかの適切な方法が、本発明において使用
され得る。基質は微生物をいずれかの適切な順序で接触
せしめられ得る。たとえば、2 −メチルキノキサリン
は、培地、たとえば遊離の又は固定された、又はその組
み合わせで微生物を含んで成る培養ブイヨンに添加され
得；又は培地は2 −メチルキノキサリンを含むことがで
き、そして次に微生物がそのような培地に添加され得；
又は2 −メチルキノキサリン及び微生物がそのような培
地に一緒に添加され得；又は2 −メチルキノキサリン又
は微生物のいずれかが、他のものを含んで成る適切な溶
媒に添加され得；又は2 −メチルキノキサリンが樹脂に
吸着され得；そして同様のことが存在する。当業者は、
本発明の方法にいずれかの部分を所望によりいかにして
改良するかを、本明細書に提供される記載から理解する
であろう。
【００６１】上記で論じたように、微生物はA.グラウカ
ATCC No.22752 であることが本発明においては好まし
い。また上記で論じたように、A.グラウカATCC No.2275
2 の凍結乾燥されたサンプルが、1999年1 月13日、ブダ
ペスト条件下でATCCに寄託された。この新しく寄託され
た培養物は、ATCC No.74480 の新しい寄託番号を与えら
れた。従って、微生物がA.グラウカATCC No.74480 であ
ることもまた、本発明において好ましい。そのような寄
託された微生物培養物の公的利用性に対する制限は、本
発明の明細書から特許の発行に基づいて変更しないで排
除されるであろう。
ATCC No.22752 であることが本発明においては好まし
い。また上記で論じたように、A.グラウカATCC No.2275
2 の凍結乾燥されたサンプルが、1999年1 月13日、ブダ
ペスト条件下でATCCに寄託された。この新しく寄託され
た培養物は、ATCC No.74480 の新しい寄託番号を与えら
れた。従って、微生物がA.グラウカATCC No.74480 であ
ることもまた、本発明において好ましい。そのような寄
託された微生物培養物の公的利用性に対する制限は、本
発明の明細書から特許の発行に基づいて変更しないで排
除されるであろう。
【００６２】また、上記で論じたように、微生物がA.レ
ペンスATCC No.14849 であることは、本発明において特
に好ましい。A.レペンスATCC No.14849 の凍結乾燥され
たサンプルは、1999年1 月13日、ブダペスト条約に基づ
いて、ATCCに寄託された。この新しく寄託された培養物
は、ATCC No.74481 の新しい寄託番号を与えられた。従
って、微生物がA.レペンスATCC No.74481 であることも
また、本発明において好ましい。そのような寄託された
微生物培養物の公的利用性に対するすべての制限は、本
発明の明細書から特許の発行に基づいて変更しないで排
除されるであろう。
ペンスATCC No.14849 であることは、本発明において特
に好ましい。A.レペンスATCC No.14849 の凍結乾燥され
たサンプルは、1999年1 月13日、ブダペスト条約に基づ
いて、ATCCに寄託された。この新しく寄託された培養物
は、ATCC No.74481 の新しい寄託番号を与えられた。従
って、微生物がA.レペンスATCC No.74481 であることも
また、本発明において好ましい。そのような寄託された
微生物培養物の公的利用性に対するすべての制限は、本
発明の明細書から特許の発行に基づいて変更しないで排
除されるであろう。
【００６３】菌類A.レペンスATCC No.14849 ( またはA.
レペンスATCC No.74481, A. グラウカATCC No.22752,又
はA.グラウカATCC No.74480)の培養物はATCCから得ら
れ、そしてそのような入手できる原物からの適切な調製
方法の例が下記に提供される。原物培養物は次の通りに
してイネ培養物から調製され得る：約50g のブラウンラ
イス及び約20mLの蒸留水を含む三角フラスコ（250mL ）
を、約121 ℃で約30分間オートクレーブし、A.レペンス
ATCC No.14849 ( 又はA.レペンスATCC No.74481,A. グ
ラウカATCC No.22752 又はA.グラウカATCC No.74480)栄
養生殖細胞又は胞子の懸濁液が、無菌蒸留水に、液体培
養物のアリコート、又は寒天培地上で増殖されたスラン
ト培養物からのスワブのいずれかを添加することによっ
て調製される。
レペンスATCC No.74481, A. グラウカATCC No.22752,又
はA.グラウカATCC No.74480)の培養物はATCCから得ら
れ、そしてそのような入手できる原物からの適切な調製
方法の例が下記に提供される。原物培養物は次の通りに
してイネ培養物から調製され得る：約50g のブラウンラ
イス及び約20mLの蒸留水を含む三角フラスコ（250mL ）
を、約121 ℃で約30分間オートクレーブし、A.レペンス
ATCC No.14849 ( 又はA.レペンスATCC No.74481,A. グ
ラウカATCC No.22752 又はA.グラウカATCC No.74480)栄
養生殖細胞又は胞子の懸濁液が、無菌蒸留水に、液体培
養物のアリコート、又は寒天培地上で増殖されたスラン
ト培養物からのスワブのいずれかを添加することによっ
て調製される。
【００６４】個々のイネフラスコを、約5mL の胞子又は
細胞懸濁液により接種し、そして約28℃で約10日間イン
キュベートし、この時点で、胞子原液は、イネ培養物
を、蒸留水中、Tween 80の0.5 ％溶液により洗浄し、イ
ネから胞子懸濁液をデカントし、そして約10％〜約20％
のグリセロールを添加することによって調製される。胞
子原液は、約−70℃で貯蔵される。
細胞懸濁液により接種し、そして約28℃で約10日間イン
キュベートし、この時点で、胞子原液は、イネ培養物
を、蒸留水中、Tween 80の0.5 ％溶液により洗浄し、イ
ネから胞子懸濁液をデカントし、そして約10％〜約20％
のグリセロールを添加することによって調製される。胞
子原液は、約−70℃で貯蔵される。
【００６５】選択されるいずれかの菌類について当業者
により理解されるように、及び好ましいA.グラウカATCC
No.22752 又はATCC No.74480 、及び特に好ましいA.レ
ペンスATCC No.14849 又はATCC No.74481 について例に
おいてこの後、特別に提供されるように、選択された菌
類を調製するための適切な方法は次の通りである：上記
のような凍結された栄養生殖細胞又は胞子原液培養物か
らの菌類を、この組成は下記においてより詳細に記載さ
れる増殖培地（Tween 80, グリセロール及び蒸留水を含
む無菌溶液を含む）を含む、フラスコ又は金属クロージ
ャーを有するガラス管中に接種する。
により理解されるように、及び好ましいA.グラウカATCC
No.22752 又はATCC No.74480 、及び特に好ましいA.レ
ペンスATCC No.14849 又はATCC No.74481 について例に
おいてこの後、特別に提供されるように、選択された菌
類を調製するための適切な方法は次の通りである：上記
のような凍結された栄養生殖細胞又は胞子原液培養物か
らの菌類を、この組成は下記においてより詳細に記載さ
れる増殖培地（Tween 80, グリセロール及び蒸留水を含
む無菌溶液を含む）を含む、フラスコ又は金属クロージ
ャーを有するガラス管中に接種する。
【００６６】発酵は、約22℃〜約32℃及び好ましくは約
29℃の温度で、適切な振盪を伴って、好ましくは約200r
mp〜約220rmp, 及び最も好ましくは、約210rpmで振盪し
ながら、実施され得る。所望には、増殖培地のpHは、発
酵培地中に組み込まれる適切な緩衝液の使用により維持
され得、そして/ 又は必要な場合、塩基又は酸の添加に
より定期的に調節され得る。好ましいpH範囲は、約6 〜
約7 のpHである。
29℃の温度で、適切な振盪を伴って、好ましくは約200r
mp〜約220rmp, 及び最も好ましくは、約210rpmで振盪し
ながら、実施され得る。所望には、増殖培地のpHは、発
酵培地中に組み込まれる適切な緩衝液の使用により維持
され得、そして/ 又は必要な場合、塩基又は酸の添加に
より定期的に調節され得る。好ましいpH範囲は、約6 〜
約7 のpHである。
【００６７】微生物（すなわち、菌類又は細菌）の増
殖、微生物と2 −メチルキノキサリンとの接触、及び微
生物と2 −メチルキノキサリンとのインキュベーション
のいずれかの適切な期間が、本発明において使用され得
る。微生物の適切な増殖、たとえば約24時間以内に達成
され得、この時点で、（ａ）2 −メチルキノキサリン自
体、（ｂ）適切な、たとえば微生物の増殖又は機能に影
響を与えない溶媒、好ましくはEtOHにおける2 −メチル
キノキサリンの溶液の適切なアリコート、又は（ｃ）樹
脂に吸着された2 −メチルキノキサリンのいずれかが、
培養物に添加され得る。
殖、微生物と2 −メチルキノキサリンとの接触、及び微
生物と2 −メチルキノキサリンとのインキュベーション
のいずれかの適切な期間が、本発明において使用され得
る。微生物の適切な増殖、たとえば約24時間以内に達成
され得、この時点で、（ａ）2 −メチルキノキサリン自
体、（ｂ）適切な、たとえば微生物の増殖又は機能に影
響を与えない溶媒、好ましくはEtOHにおける2 −メチル
キノキサリンの溶液の適切なアリコート、又は（ｃ）樹
脂に吸着された2 −メチルキノキサリンのいずれかが、
培養物に添加され得る。
【００６８】次に、インキュベーションは、たとえば生
転換が起こる容器、培地、及びインキュベーションの条
件、たとえば温度、pH及び撹拌に依存して、約2 〜約24
時間、続けられ得る。次に、インキュベーションブイヨ
ンは、いずれかの適切な抽出方法を用いて、たとえば
（ａ）適切な溶媒、たとえばEtOAc 、メチルイソブチル
ケトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン及び同様の
もの、好ましくはEtOAcによるインキュベーションブイ
ヨンからの有機成分の除去により、又は（ｂ）適切な樹
脂、好ましくはポリマー吸着樹脂、より好ましくは商標
Amberlite （登録商標）(Rohm and Haas) から選択され
た樹脂、最も好ましくはXAD4 (Amberlite樹脂の) 上へ
の生成物、すなわち2 −キノキサリンカルボン酸の吸着
により抽出され得る。
転換が起こる容器、培地、及びインキュベーションの条
件、たとえば温度、pH及び撹拌に依存して、約2 〜約24
時間、続けられ得る。次に、インキュベーションブイヨ
ンは、いずれかの適切な抽出方法を用いて、たとえば
（ａ）適切な溶媒、たとえばEtOAc 、メチルイソブチル
ケトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン及び同様の
もの、好ましくはEtOAcによるインキュベーションブイ
ヨンからの有機成分の除去により、又は（ｂ）適切な樹
脂、好ましくはポリマー吸着樹脂、より好ましくは商標
Amberlite （登録商標）(Rohm and Haas) から選択され
た樹脂、最も好ましくはXAD4 (Amberlite樹脂の) 上へ
の生成物、すなわち2 −キノキサリンカルボン酸の吸着
により抽出され得る。
【００６９】適切な有機溶媒によるインキュベーション
ブイヨンの抽出及び有機及び水性相の分離の後、有機残
基を含む化合物が、いずれか適切な方法、たとえばクロ
マトグラフィーを用いて決定され得る。他方では、樹脂
を用いてのインキュベーションブイヨンからの2 −キノ
キサリンカルボン酸の抽出の後、2 −キノキサリンカル
ボン酸がそれから、適切な溶媒、好ましくはEtOAc 又は
MeOHを用いて抽出され、そして次に、たとえばEtOAc 及
びMeOHを用いてEtOAｃから結晶化され得る。
ブイヨンの抽出及び有機及び水性相の分離の後、有機残
基を含む化合物が、いずれか適切な方法、たとえばクロ
マトグラフィーを用いて決定され得る。他方では、樹脂
を用いてのインキュベーションブイヨンからの2 −キノ
キサリンカルボン酸の抽出の後、2 −キノキサリンカル
ボン酸がそれから、適切な溶媒、好ましくはEtOAc 又は
MeOHを用いて抽出され、そして次に、たとえばEtOAc 及
びMeOHを用いてEtOAｃから結晶化され得る。
【００７０】いずれか適切な増殖培地が本発明の方法に
使用され得、そして適切な増殖培地は同化できる炭素、
同化できる窒素及び必須鉱物を含む無機塩の源を含むで
あろう。一般的に、多くの炭水化物、たとえばグルコー
ス、マルトース、マンノース、スクロース、スターチ、
グリセリン、キビジェリー、糖密、大豆、及び同様のも
のが、同化できる炭素源として使用され得る。同化でき
る窒素源は、たとえば材料、たとえば酵母及びカゼイン
加水分解物、一次酵母、酵母抽出物、綿実粉末、大豆固
形物、小麦胚芽、肉抽出物、ペプトン、トウモロコシ含
浸流体、トウモロコシ含浸固体及びアンモニウム塩を包
含する。本発明の培養培地への使用のための適切な無機
塩栄養物は、ナトリウム、鉄、マグネシウム、カリウ
ム、コバルト、ホスフェート及び同様のものを含む慣習
的な塩を包含する。
使用され得、そして適切な増殖培地は同化できる炭素、
同化できる窒素及び必須鉱物を含む無機塩の源を含むで
あろう。一般的に、多くの炭水化物、たとえばグルコー
ス、マルトース、マンノース、スクロース、スターチ、
グリセリン、キビジェリー、糖密、大豆、及び同様のも
のが、同化できる炭素源として使用され得る。同化でき
る窒素源は、たとえば材料、たとえば酵母及びカゼイン
加水分解物、一次酵母、酵母抽出物、綿実粉末、大豆固
形物、小麦胚芽、肉抽出物、ペプトン、トウモロコシ含
浸流体、トウモロコシ含浸固体及びアンモニウム塩を包
含する。本発明の培養培地への使用のための適切な無機
塩栄養物は、ナトリウム、鉄、マグネシウム、カリウ
ム、コバルト、ホスフェート及び同様のものを含む慣習
的な塩を包含する。
【００７１】より特別には、微生物が菌類である本発明
への使用のために適切な増殖培地中の成分は、たとえば
トウモロコシ含浸流体、トウモロコシ含浸固体、Pharma
media （登録商標）及び麦芽抽出物を包含する。トウモ
ロコシ含浸液体培地は、約40g/L のトウモロコシ含浸流
体及び約20g/L のデキストロースにより調製され、そし
て殺菌の前、約4.85のpHに調節される。トウモロコシ含
浸固体培地は、約20g/L 〜約40g/L のトウモロコシ含浸
固体及び約20g/L のデキストロースにより調製され、そ
して殺菌の前、約4.85のpHに調節される。本発明の方法
への使用のためのもう1 つの適切な培地は、約20g/L の
Pharmamedia （登録商標）及び約20g/Lのデキストロー
スにより調製され、そして殺菌の前、約7.2 のpHに調節
される。
への使用のために適切な増殖培地中の成分は、たとえば
トウモロコシ含浸流体、トウモロコシ含浸固体、Pharma
media （登録商標）及び麦芽抽出物を包含する。トウモ
ロコシ含浸液体培地は、約40g/L のトウモロコシ含浸流
体及び約20g/L のデキストロースにより調製され、そし
て殺菌の前、約4.85のpHに調節される。トウモロコシ含
浸固体培地は、約20g/L 〜約40g/L のトウモロコシ含浸
固体及び約20g/L のデキストロースにより調製され、そ
して殺菌の前、約4.85のpHに調節される。本発明の方法
への使用のためのもう1 つの適切な培地は、約20g/L の
Pharmamedia （登録商標）及び約20g/Lのデキストロー
スにより調製され、そして殺菌の前、約7.2 のpHに調節
される。
【００７２】麦芽抽出物培地は、約10g/L の麦芽抽出
物、約10g/L のデキストロース、約5g/Lのペプトン及び
約2g/Lの酵母抽出物により調製され、そして殺菌の前、
約7 のpHに調節される。本発明の方法への使用のための
もう1 つの適切な培地は、約20g/L のデキストロース、
約5g/Lの大豆栄養物（nutrisoy）粉末、約5g/Lの酵母抽
出物約5g/LのNaCl及び約5g/LのK2PO4 により調製され、
そして殺菌の前、H2SO4により約7.0 のpHに調節され
る。本発明の方法のために適切な菌類のための特に好ま
しい増殖培地は、前記トウモロコシ含浸固体培地であ
る。
物、約10g/L のデキストロース、約5g/Lのペプトン及び
約2g/Lの酵母抽出物により調製され、そして殺菌の前、
約7 のpHに調節される。本発明の方法への使用のための
もう1 つの適切な培地は、約20g/L のデキストロース、
約5g/Lの大豆栄養物（nutrisoy）粉末、約5g/Lの酵母抽
出物約5g/LのNaCl及び約5g/LのK2PO4 により調製され、
そして殺菌の前、H2SO4により約7.0 のpHに調節され
る。本発明の方法のために適切な菌類のための特に好ま
しい増殖培地は、前記トウモロコシ含浸固体培地であ
る。
【００７３】上記で論じられたように、微生物はP.プチ
ダATCC No.33015 であることが、本発明において特に好
ましい。また上記で論じられたように、P.プチダATCC N
o.33015 の凍結乾燥されたサンプルは、1999年1 月13
日、ブダペスト条約下でATCCに寄託された。この新しく
寄託された増養物は、ATCC No.202190の新しい寄託番号
を与えられた。従って、微生物がP.プチダATCC No.2021
90であることは、本発明においてまた好ましい。そのよ
うな寄託された微生物培養物の公衆への利用性に対する
すべての制限は、本発明の明細書からの特許の発行に基
づいて変更しないで排除されるであろう。
ダATCC No.33015 であることが、本発明において特に好
ましい。また上記で論じられたように、P.プチダATCC N
o.33015 の凍結乾燥されたサンプルは、1999年1 月13
日、ブダペスト条約下でATCCに寄託された。この新しく
寄託された増養物は、ATCC No.202190の新しい寄託番号
を与えられた。従って、微生物がP.プチダATCC No.2021
90であることは、本発明においてまた好ましい。そのよ
うな寄託された微生物培養物の公衆への利用性に対する
すべての制限は、本発明の明細書からの特許の発行に基
づいて変更しないで排除されるであろう。
【００７４】さらに、微生物が細菌である本発明への使
用のために安定した増殖培地は、いずれかの適切な既知
培地、たとえば栄養物ブイヨン（約32g/L, Becton Dick
inson Microbiology Systems）及びグリセロール（約5g
/L）を含む。選択されるいずれかの細菌について当業者
により理解されるように、及びP.プチダATCC No.33015
について例においてこの後、特別に提供されるように、
選択される細菌を調製するための適切な方法は次の通り
である：細菌が、当業者において知られているようにし
て調製された凍結原物培養物（約17％のグリセロール原
物）から、この組成は下記により詳細に記載されている
増殖培地（Tween 80, グリセロール及び蒸留水を含む無
菌溶液からのアリコートを含む）を含む、フラスコ、金
属クロージャーを有するガラス管、又は発酵器中に接種
される。
用のために安定した増殖培地は、いずれかの適切な既知
培地、たとえば栄養物ブイヨン（約32g/L, Becton Dick
inson Microbiology Systems）及びグリセロール（約5g
/L）を含む。選択されるいずれかの細菌について当業者
により理解されるように、及びP.プチダATCC No.33015
について例においてこの後、特別に提供されるように、
選択される細菌を調製するための適切な方法は次の通り
である：細菌が、当業者において知られているようにし
て調製された凍結原物培養物（約17％のグリセロール原
物）から、この組成は下記により詳細に記載されている
増殖培地（Tween 80, グリセロール及び蒸留水を含む無
菌溶液からのアリコートを含む）を含む、フラスコ、金
属クロージャーを有するガラス管、又は発酵器中に接種
される。
【００７５】発酵は、約20℃〜約40℃、及び好ましくは
約25℃〜約32℃の範囲の温度で、適切な振盪を伴って、
好ましくは約200rpm〜約220rpm, 及び最も好ましくは、
約210rpmで振盪しながら行われる。所望する場合、増殖
培地のpHは、発酵培地中に組み込まれる適切な緩衝液の
使用により維持され、そして/ 又は必要な場合、塩基ま
たは酸の添加により定期的に調節される。好ましい接種
率は、約1 ％〜約20％（v/v ）（接種物/ 培地）であ
る。好ましいpH範囲は、約6 〜約8 である。
約25℃〜約32℃の範囲の温度で、適切な振盪を伴って、
好ましくは約200rpm〜約220rpm, 及び最も好ましくは、
約210rpmで振盪しながら行われる。所望する場合、増殖
培地のpHは、発酵培地中に組み込まれる適切な緩衝液の
使用により維持され、そして/ 又は必要な場合、塩基ま
たは酸の添加により定期的に調節される。好ましい接種
率は、約1 ％〜約20％（v/v ）（接種物/ 培地）であ
る。好ましいpH範囲は、約6 〜約8 である。
【００７６】本発明の開示のいずれかの部分における、
特定の緩衝液、培地、試薬、接触又は培養時間、基質の
量、使用される場合、インデューサーの量及び同様のも
のに関する言及は、限定することを意図するものではな
く、当業者が、本明細書における議論が示す特定の内容
において興味あり又は価値あるものとして認識するであ
ろうすべてのそのような関連する材料を読み取るべきで
あることが注目されるべきである。たとえば、1 つの緩
衝液システム又は培養培地を、もう1 つのものと交換す
ることがしばしば可能であり、その結果、異なっている
が、しかし既知の手段が、提案された方法、材料又は組
成物の使用が指図される目的と同じ目的を達成するため
に使用される。さらに、本発明は、商業目的のために本
発明の方法の拡大を包含することが理解されるべきであ
る。
特定の緩衝液、培地、試薬、接触又は培養時間、基質の
量、使用される場合、インデューサーの量及び同様のも
のに関する言及は、限定することを意図するものではな
く、当業者が、本明細書における議論が示す特定の内容
において興味あり又は価値あるものとして認識するであ
ろうすべてのそのような関連する材料を読み取るべきで
あることが注目されるべきである。たとえば、1 つの緩
衝液システム又は培養培地を、もう1 つのものと交換す
ることがしばしば可能であり、その結果、異なっている
が、しかし既知の手段が、提案された方法、材料又は組
成物の使用が指図される目的と同じ目的を達成するため
に使用される。さらに、本発明は、商業目的のために本
発明の方法の拡大を包含することが理解されるべきであ
る。
【００７７】本発明の微生物酸化はさらに任意には、所
望する生成物、すなわち2 −キノキサリンカルボン酸の
単離を含んで成る。2 −キノキサリンカルボン酸は、新
規の微生物酸化工程が行われる培地から、及びより特定
には、選択される微生物及びインキュベーションの条件
に依存して、生成されているが、しかし完全には2 −キ
ノキサリンカルボン酸に転換されてはいないいずれかの
中間体から下記のようにして単離され得る。
望する生成物、すなわち2 −キノキサリンカルボン酸の
単離を含んで成る。2 −キノキサリンカルボン酸は、新
規の微生物酸化工程が行われる培地から、及びより特定
には、選択される微生物及びインキュベーションの条件
に依存して、生成されているが、しかし完全には2 −キ
ノキサリンカルボン酸に転換されてはいないいずれかの
中間体から下記のようにして単離され得る。
【００７８】本発明の方法の中間体又は所望する生成物
のいずれかを単離し、そして/ 又は精製するためのいず
れか適切な方法、たとえば濾過、抽出、結晶化、カラム
クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分離
用低圧液体クロマトグラフィー、HPLC、樹脂吸着または
そのような方法のいずれかの適切な組み合わせを包含す
る方法が、本発明において使用され得る。
のいずれかを単離し、そして/ 又は精製するためのいず
れか適切な方法、たとえば濾過、抽出、結晶化、カラム
クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分離
用低圧液体クロマトグラフィー、HPLC、樹脂吸着または
そのような方法のいずれかの適切な組み合わせを包含す
る方法が、本発明において使用され得る。
【００７９】下記に提供される詳細な例は、広範囲の微
生物、特に菌類及び細菌が2 −メチルキノキサリンを酸
化し、2 −キノキサリンカルボン酸を生成し、次にこれ
が所望しない無関係の2 −メチルオノキサリン又はいず
れかの中間体化合物から分離され、そしてさらに、たと
えば '801 の出願の化合物を生成するために、当業者に
おいて良く知られている方法に従って反応せしめあられ
ることを示す。
生物、特に菌類及び細菌が2 −メチルキノキサリンを酸
化し、2 −キノキサリンカルボン酸を生成し、次にこれ
が所望しない無関係の2 −メチルオノキサリン又はいず
れかの中間体化合物から分離され、そしてさらに、たと
えば '801 の出願の化合物を生成するために、当業者に
おいて良く知られている方法に従って反応せしめあられ
ることを示す。
【００８０】本発明の開示は本発明の方法への損なわれ
ていない微生物の使用に主に向けられているが、当業者
は、本発明の微生物方法が、その適切な調製物、たとえ
ば分解され、そして脱水された細胞調製物、本発明の酸
化を達成できる微生物酵素又は酵素自体、並びにいずれ
か必要な補因子を含んで成る抽出された材料、および同
様のものにより達成され得ることを理解するであろう。
本発明は次の例により示される。本発明の前述及び次の
記載及び種々の態様は、本発明を限定するものではな
く、本発明を例示するものである。従って、本発明はそ
れらの例の特定の詳細に限定されないことが理解される
であろう。
ていない微生物の使用に主に向けられているが、当業者
は、本発明の微生物方法が、その適切な調製物、たとえ
ば分解され、そして脱水された細胞調製物、本発明の酸
化を達成できる微生物酵素又は酵素自体、並びにいずれ
か必要な補因子を含んで成る抽出された材料、および同
様のものにより達成され得ることを理解するであろう。
本発明は次の例により示される。本発明の前述及び次の
記載及び種々の態様は、本発明を限定するものではな
く、本発明を例示するものである。従って、本発明はそ
れらの例の特定の詳細に限定されないことが理解される
であろう。
【００８１】
【実施例】例１．A.レペンスATCC No.14849 を用いての
管培養における2 −メチルキノキサリンの酸化 A.菌類A.レペンスATCC No.14849 を用いての生転換 3 種の“試験”培養物（T1, T2, 及びT3）を次の通りに
して精製した：約2.5mL の無菌増殖培地（約20g/L のデ
キストロース、約5g/Lの大豆栄養物粉末、約5g/Lの酵母
抽出物、約5g/LのNaCl及び約5g/LのK2HPO4;pH は殺菌の
前、H2SO4 により約7.0 に調節されている）を、金属ク
ロージャーを有する3 本の16×125mm ガラス管（T1, T
2, 及びT3）の個々に添加し、続いてA.レペンスATCC N
o.14849 の胞子（胞子原物培養物の約１％（v/v ））を
T1, T2及びT3に添加した。
管培養における2 −メチルキノキサリンの酸化 A.菌類A.レペンスATCC No.14849 を用いての生転換 3 種の“試験”培養物（T1, T2, 及びT3）を次の通りに
して精製した：約2.5mL の無菌増殖培地（約20g/L のデ
キストロース、約5g/Lの大豆栄養物粉末、約5g/Lの酵母
抽出物、約5g/LのNaCl及び約5g/LのK2HPO4;pH は殺菌の
前、H2SO4 により約7.0 に調節されている）を、金属ク
ロージャーを有する3 本の16×125mm ガラス管（T1, T
2, 及びT3）の個々に添加し、続いてA.レペンスATCC N
o.14849 の胞子（胞子原物培養物の約１％（v/v ））を
T1, T2及びT3に添加した。
【００８２】3 本の管培養物を、約210rpmで振盪しなが
ら、約29℃でインキュベートした。約48時間後（T1）、
約72時間後（T2）又は96時間後（T3）、約0.05mLの原液
（約100 ％EtOH中、約50mg/mL 、約1mg/mLの最終濃度）
の2 −メチルキノキサリンを管培養物に添加した。約29
℃でさらにインキュベートした後（下記表2 を参照のこ
と）、管培養物の発酵ブイヨンを、4NのHCl により約pH
2 に調節した。個々の管培養物の内容物を等体積のEtOA
c （正味）により抽出し、ErOAc を添加し、管培養物を
かきまぜ、そして次に、約2,000rpmで遠心分離した（IE
C 遠心分離機）。組み合わされた有機抽出物を、約50℃
で水浴において窒素下で乾燥せしめた。
ら、約29℃でインキュベートした。約48時間後（T1）、
約72時間後（T2）又は96時間後（T3）、約0.05mLの原液
（約100 ％EtOH中、約50mg/mL 、約1mg/mLの最終濃度）
の2 −メチルキノキサリンを管培養物に添加した。約29
℃でさらにインキュベートした後（下記表2 を参照のこ
と）、管培養物の発酵ブイヨンを、4NのHCl により約pH
2 に調節した。個々の管培養物の内容物を等体積のEtOA
c （正味）により抽出し、ErOAc を添加し、管培養物を
かきまぜ、そして次に、約2,000rpmで遠心分離した（IE
C 遠心分離機）。組み合わされた有機抽出物を、約50℃
で水浴において窒素下で乾燥せしめた。
【００８３】B.逆相HPLCにより決定される場合の2 −キ
ノキサリンカルボン酸の収率 上記のようにして調製された抽出物の個々を、約1mL の
ACN ：水（1 ：9 、v/v ）に再懸濁し、そして約200mL
の個々の再懸濁された抽出物を、HPLCカラム：Inertsil
（登録商標）C8 HPLC カラム（4.6 ×250mm, Column En
gineering, Inc. ）上への注入により分析した。個々の
注入される再懸濁された抽出物内に含まれる化合物を、
移動相（ACN ：0.05％の水性TFA 、1 ：4, v/v）におい
て約1.0mL/分で平等に分離した。
ノキサリンカルボン酸の収率 上記のようにして調製された抽出物の個々を、約1mL の
ACN ：水（1 ：9 、v/v ）に再懸濁し、そして約200mL
の個々の再懸濁された抽出物を、HPLCカラム：Inertsil
（登録商標）C8 HPLC カラム（4.6 ×250mm, Column En
gineering, Inc. ）上への注入により分析した。個々の
注入される再懸濁された抽出物内に含まれる化合物を、
移動相（ACN ：0.05％の水性TFA 、1 ：4, v/v）におい
て約1.0mL/分で平等に分離した。
【００８４】それらの条件下で、2 −キノキサリンカル
ボン酸は8.6 分で溶離し、そして2−メチルキノキサリ
ンを、約15分で溶離した。2 −キノキサリンカルボン酸
の収率を、いくつかの組の実験条件（すなわち、T1, T2
及びT3）下で、HPLC分析から決定し、そしてそれらの
収率は下記表2 に提供される。
ボン酸は8.6 分で溶離し、そして2−メチルキノキサリ
ンを、約15分で溶離した。2 −キノキサリンカルボン酸
の収率を、いくつかの組の実験条件（すなわち、T1, T2
及びT3）下で、HPLC分析から決定し、そしてそれらの
収率は下記表2 に提供される。
【００８５】
【表２】
【００８６】表2 のT1, T2及びT3についてのデータによ
り示されるように、HPLC分析は、本発明の微生物方法
が、それぞれ56％, 76％及び79％の収率での所望する2
−キノキサリンカルボン酸をもたらすことを示す。従っ
て、損なわれていない微生物、すなわちA.レペンスATCC
No.14949 の包含は、2 −キノキサリンカルボン酸への
2 −メチルキノキサリンの酸化をもたらし、そして実質
的な量の2 −キノキサリンカルボン酸は損なわれないま
ま存続する。
り示されるように、HPLC分析は、本発明の微生物方法
が、それぞれ56％, 76％及び79％の収率での所望する2
−キノキサリンカルボン酸をもたらすことを示す。従っ
て、損なわれていない微生物、すなわちA.レペンスATCC
No.14949 の包含は、2 −キノキサリンカルボン酸への
2 −メチルキノキサリンの酸化をもたらし、そして実質
的な量の2 −キノキサリンカルボン酸は損なわれないま
ま存続する。
【００８７】例２．4 種の異なった増殖培地においてA.
レペンスATCC No.14849 を用いての管培養での2 −メチ
ルキノキサリンの酸化 A.4 種の異なった増殖培地の調製 培地１を、約40g/L のとうもろこし含浸流体及び約20g/
L のデキストロースにより調製し、そして殺菌の前、pH
を約4.85に調節した。培地2 を、約40g/L のトウモロコ
シ含浸流体及び約20g/L のデキストロースにより調製
し、そして殺菌の前、pHを約4.85に調節した。
レペンスATCC No.14849 を用いての管培養での2 −メチ
ルキノキサリンの酸化 A.4 種の異なった増殖培地の調製 培地１を、約40g/L のとうもろこし含浸流体及び約20g/
L のデキストロースにより調製し、そして殺菌の前、pH
を約4.85に調節した。培地2 を、約40g/L のトウモロコ
シ含浸流体及び約20g/L のデキストロースにより調製
し、そして殺菌の前、pHを約4.85に調節した。
【００８８】培地３を、約20g/L のPharmaedia（登録商
標）及び約20g/L のデキストロースにより調製し、そし
て殺菌の前、pHを約7.2 に調節した。培地4 を、約10g/
L の麦芽抽出物、約10g/L のデキストロース、約5g/Lの
ペプトンおよび約2g/Lの酵母抽出物により調製し、そし
て殺菌の前、pHを約7 に調節した。
標）及び約20g/L のデキストロースにより調製し、そし
て殺菌の前、pHを約7.2 に調節した。培地4 を、約10g/
L の麦芽抽出物、約10g/L のデキストロース、約5g/Lの
ペプトンおよび約2g/Lの酵母抽出物により調製し、そし
て殺菌の前、pHを約7 に調節した。
【００８９】B.菌類A.レペンスATCC No.14849 を用いて
生転換 8 種の“試験”培養物（T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3
b, T4a 及びT4b ）を次の通りにして調製した：約2.5ml
の無菌増殖培地（それぞれ、培地1 、培地2 、培地3
及び培地4 ）を、金属クロージャーを有する8 本の16×
125mm ガラス管（T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a
及びT4b ）の個々に添加し、続いて、前期管培養物のす
べてに、A.レペンスATCC No.14849 の胞子（胞子原物培
養物の約１％（v/v ））を添加した。
生転換 8 種の“試験”培養物（T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3
b, T4a 及びT4b ）を次の通りにして調製した：約2.5ml
の無菌増殖培地（それぞれ、培地1 、培地2 、培地3
及び培地4 ）を、金属クロージャーを有する8 本の16×
125mm ガラス管（T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a
及びT4b ）の個々に添加し、続いて、前期管培養物のす
べてに、A.レペンスATCC No.14849 の胞子（胞子原物培
養物の約１％（v/v ））を添加した。
【００９０】8 本の管培養物を、約210rpmで振盪しなが
ら、約29℃でインキュベートした。約48時間後（T1a, T
2a, T3a 及びT4a ）又は約72時間後（T1b, T2b, T3b 及
びT4b ）、2 −メチルキノキサリンの原液（DMSO中、約
50mg/mL 、約1mg/mLの最終濃度）約0.05mLを、管培養物
に添加した。さらに、約29℃で12日間インキュベートし
た後、個々の管培養物の発酵ブイヨンを抽出し、そして
組み合わされた有機抽出物を、例I に記載のようにして
乾燥せしめた。
ら、約29℃でインキュベートした。約48時間後（T1a, T
2a, T3a 及びT4a ）又は約72時間後（T1b, T2b, T3b 及
びT4b ）、2 −メチルキノキサリンの原液（DMSO中、約
50mg/mL 、約1mg/mLの最終濃度）約0.05mLを、管培養物
に添加した。さらに、約29℃で12日間インキュベートし
た後、個々の管培養物の発酵ブイヨンを抽出し、そして
組み合わされた有機抽出物を、例I に記載のようにして
乾燥せしめた。
【００９１】C.逆相HPLCにより決定される場合の2 −キ
ノキサリンカルボン酸の収率 次に、上記のようにして調製された抽出物の個々を、例
I に記載のようにして逆相HPLCのために加工し、そして
それにより分析した。2 −キノキサリンカルボン酸の収
率を、いくつかの組の実験条件（すなわち、T1a, T1b,
T2a, T2b, T3a,T3b, T4a 及びT4b ）に関して、そのよ
うなHPLC分析から決定し、そしてそれらの収率は下記表
3 に提供される。
ノキサリンカルボン酸の収率 次に、上記のようにして調製された抽出物の個々を、例
I に記載のようにして逆相HPLCのために加工し、そして
それにより分析した。2 −キノキサリンカルボン酸の収
率を、いくつかの組の実験条件（すなわち、T1a, T1b,
T2a, T2b, T3a,T3b, T4a 及びT4b ）に関して、そのよ
うなHPLC分析から決定し、そしてそれらの収率は下記表
3 に提供される。
【００９２】
【表３】
【００９３】表３のデータにより示されるように、HPLC
分析は、微生物がA.レペンスATCC No.14849 である対象
微生物方法は、試験されたすべての培地において2 −キ
ノキサリンカルボン酸生成をもたらすことを示す。表3
のデータは、試験された4 種の培地のうち、培地2 は、
所望する生成物、すなわち2 −キノキサリンカルボン酸
の最高％収率を付与した。
分析は、微生物がA.レペンスATCC No.14849 である対象
微生物方法は、試験されたすべての培地において2 −キ
ノキサリンカルボン酸生成をもたらすことを示す。表3
のデータは、試験された4 種の培地のうち、培地2 は、
所望する生成物、すなわち2 −キノキサリンカルボン酸
の最高％収率を付与した。
【００９４】例３．A.レペンスATCC No.14849 又はA.グ
ラウカATCC No.22752 を用いてのフラスコ培養物におけ
る2 −メチルキノキサリンの酸化 A.菌類A.レペンスATCC No.14849 又は菌類A.グラウカAT
CC No.22752 を用いての生転換 4 種の試験培養物（T1a, T1b, T2a 及びT2b ）を次の通
りにして調製した：約25mLの無菌増殖培地（約20g/L の
デキストロース、約5g/Lの大豆栄養物粉末、約5g/Lの酵
母抽出物、約5g/LのNaCl及び約5g/LのK2HPO4;pH は、殺
菌の前、H2SO4により約7.0 に調節されている）を、4
個の円錐型フラスコ（300mL ）の個々に添加し、続い
て、A.レペンスATCC No.14849 (T1a, T1b)又はA.グラウ
カATCC No.22752 (T2a, T2b)のいずれかの胞子（胞子原
液培養物の役１％（v/v ））を添加した。
ラウカATCC No.22752 を用いてのフラスコ培養物におけ
る2 −メチルキノキサリンの酸化 A.菌類A.レペンスATCC No.14849 又は菌類A.グラウカAT
CC No.22752 を用いての生転換 4 種の試験培養物（T1a, T1b, T2a 及びT2b ）を次の通
りにして調製した：約25mLの無菌増殖培地（約20g/L の
デキストロース、約5g/Lの大豆栄養物粉末、約5g/Lの酵
母抽出物、約5g/LのNaCl及び約5g/LのK2HPO4;pH は、殺
菌の前、H2SO4により約7.0 に調節されている）を、4
個の円錐型フラスコ（300mL ）の個々に添加し、続い
て、A.レペンスATCC No.14849 (T1a, T1b)又はA.グラウ
カATCC No.22752 (T2a, T2b)のいずれかの胞子（胞子原
液培養物の役１％（v/v ））を添加した。
【００９５】4 個のフラスコ培養物を、約210rpmで振盪
しながら、約29℃でインキュベートした。接種の後すぐ
に（T2a ）又は約24時間後（T2b ）、2 −メチルキノキ
サリンの原液（約100 ％EtOH中、約50mg/mL 、約1mg/mL
の最終濃度）約0.5mL を、A.グラウカATCC No.22752 の
フラスコ培養物に添加し、そして約48時間（T1a ）又は
72時間（T1b ）後、2 −メチルキノキサリンの原液（約
100 ％EtOH中、約50mg/mL,約1mg/mLの最終濃度）約0.5m
l をA.レペンスATCC No.14849 のフラスコ培養物に添加
した。
しながら、約29℃でインキュベートした。接種の後すぐ
に（T2a ）又は約24時間後（T2b ）、2 −メチルキノキ
サリンの原液（約100 ％EtOH中、約50mg/mL 、約1mg/mL
の最終濃度）約0.5mL を、A.グラウカATCC No.22752 の
フラスコ培養物に添加し、そして約48時間（T1a ）又は
72時間（T1b ）後、2 −メチルキノキサリンの原液（約
100 ％EtOH中、約50mg/mL,約1mg/mLの最終濃度）約0.5m
l をA.レペンスATCC No.14849 のフラスコ培養物に添加
した。
【００９６】24(T1a), 16(T1b), 25(T2a) 又は24(T2b)
日間、約29℃でさらにインキュベートした後、フラスコ
培養物の発酵ブイヨンのpHを、４N のHCl により約2 に
調節した。個々のフラスコ培養物の内容物を、EtOAc の
2 つの25mLアリコートにより抽出し、そして溶媒を減圧
下で組み合わされたEtOAc 抽出物から除去し、粗生成物
を生成した。
日間、約29℃でさらにインキュベートした後、フラスコ
培養物の発酵ブイヨンのpHを、４N のHCl により約2 に
調節した。個々のフラスコ培養物の内容物を、EtOAc の
2 つの25mLアリコートにより抽出し、そして溶媒を減圧
下で組み合わされたEtOAc 抽出物から除去し、粗生成物
を生成した。
【００９７】B.逆相HPLCにより決定される場合の2 −キ
ノキサリンカルボン酸の収率 上記に記載のようにして調製された抽出物の個々を、約
5mL のMeOH：ACN （3:2, v/v）に再懸濁し、そしてHPLC
分析のために、水により1 ：19に希釈した。HPLC分析を
例I に記載のようにして実施した。2 −キノキサリンカ
ルボン酸の収率を、いくつかの組の実験条件（すなわ
ち、T1a, T1b, T2a 及びT2b ）についてそのようなHPLC
分析から決定し、そしてそのような収率を下記表4 に提
供する。
ノキサリンカルボン酸の収率 上記に記載のようにして調製された抽出物の個々を、約
5mL のMeOH：ACN （3:2, v/v）に再懸濁し、そしてHPLC
分析のために、水により1 ：19に希釈した。HPLC分析を
例I に記載のようにして実施した。2 −キノキサリンカ
ルボン酸の収率を、いくつかの組の実験条件（すなわ
ち、T1a, T1b, T2a 及びT2b ）についてそのようなHPLC
分析から決定し、そしてそのような収率を下記表4 に提
供する。
【００９８】
【表４】
【００９９】表4 のデータにより示されるように、損な
われていない微生物、すなわちA.グラウカATCC No.2275
2 又はA.レペンスATCC No.14849 の包含は、2 −キノキ
サリンカルボン酸への2 −メチルキノキサリンの酸化を
もたらす。T1a, T1b,T2a及びT2b に残存する出発材料、
すなわち2 −メチルキノキサリンの％は、それぞれ約7
％, 7%, 6%及び6 ％である。
われていない微生物、すなわちA.グラウカATCC No.2275
2 又はA.レペンスATCC No.14849 の包含は、2 −キノキ
サリンカルボン酸への2 −メチルキノキサリンの酸化を
もたらす。T1a, T1b,T2a及びT2b に残存する出発材料、
すなわち2 −メチルキノキサリンの％は、それぞれ約7
％, 7%, 6%及び6 ％である。
【０１００】例４．2 −キノキサリンカルボン酸への2
−メチルキノキサリンの微生物転換のためのスクリーン 種々の微生物の細胞を、例I に記載のようにして、2.5m
L のデキストロース、大豆栄養物粉末培地を含む管にお
いて増殖せしめた。個々の管を、凍結されたグリセロー
ル懸濁液として貯蔵される種々の微生物の胞子又は栄養
生殖細胞（約１％（v/v ）の胞子又は栄養生殖細胞原物
培養物）により接種し、そして回転振盪機上で攪拌（２
10rpm ）しながら約29℃でインキュベートした。約48時
間後、DMSO中、2 −メチルキノキサリンの10mg/mL 溶液
0.05mLを、個々の管に添加した。約4 日間のインキュベ
ーションの後、個々の管中の内容物を抽出し、そして個
々の抽出物を、例I に記載のようにしてHPLCにより分析
した。2 −キノキサリンカルボン酸の収率がHPLCにより
決定され、そしてその結果が表5 に要約される。
−メチルキノキサリンの微生物転換のためのスクリーン 種々の微生物の細胞を、例I に記載のようにして、2.5m
L のデキストロース、大豆栄養物粉末培地を含む管にお
いて増殖せしめた。個々の管を、凍結されたグリセロー
ル懸濁液として貯蔵される種々の微生物の胞子又は栄養
生殖細胞（約１％（v/v ）の胞子又は栄養生殖細胞原物
培養物）により接種し、そして回転振盪機上で攪拌（２
10rpm ）しながら約29℃でインキュベートした。約48時
間後、DMSO中、2 −メチルキノキサリンの10mg/mL 溶液
0.05mLを、個々の管に添加した。約4 日間のインキュベ
ーションの後、個々の管中の内容物を抽出し、そして個
々の抽出物を、例I に記載のようにしてHPLCにより分析
した。2 −キノキサリンカルボン酸の収率がHPLCにより
決定され、そしてその結果が表5 に要約される。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】例５．P.プチダATCC No.33015 を用いての
フラスコ培養物における2 −メチルキノキサリンの酸化 P.プチダATCC No.33015 の細胞を、培地5 （栄養物ブイ
ヨン（約32g/L ）及びグリセロール（約5g/L））におい
て増殖した。約30mLの培地を含む6 個の円錐フラスコ
（300ml ）を、約−70℃で前もって貯蔵されたP.プチダ
ATCC No.33015 細胞のグリセロール懸濁液約0.10mLによ
り接種した。
フラスコ培養物における2 −メチルキノキサリンの酸化 P.プチダATCC No.33015 の細胞を、培地5 （栄養物ブイ
ヨン（約32g/L ）及びグリセロール（約5g/L））におい
て増殖した。約30mLの培地を含む6 個の円錐フラスコ
（300ml ）を、約−70℃で前もって貯蔵されたP.プチダ
ATCC No.33015 細胞のグリセロール懸濁液約0.10mLによ
り接種した。
【０１０３】15mLの円錐ポリプロピレン遠心分離機（Fa
lcon（登録商標）, Becton Dickinson Labware）に含ま
れるp −キシレン約2mL を添加した後、フラスコをPara
film（登録商標）(American National Can) により密封
し、そして回転振盪機上で約18時間、約29℃で攪拌した
（約225rpm）。それらのフラスコ培養物は、650nm で測
定される場合、約1.9 の光学密度を有した。細胞を、6
個のフラスコから遠心分離により集め、約250mL のDPBS
により1 度洗浄し、そして300mL の円錐フラスコにおけ
る約20mLのPBS （Biowhittaker）に再懸濁した。
lcon（登録商標）, Becton Dickinson Labware）に含ま
れるp −キシレン約2mL を添加した後、フラスコをPara
film（登録商標）(American National Can) により密封
し、そして回転振盪機上で約18時間、約29℃で攪拌した
（約225rpm）。それらのフラスコ培養物は、650nm で測
定される場合、約1.9 の光学密度を有した。細胞を、6
個のフラスコから遠心分離により集め、約250mL のDPBS
により1 度洗浄し、そして300mL の円錐フラスコにおけ
る約20mLのPBS （Biowhittaker）に再懸濁した。
【０１０４】生転換を、約0.5g/Lの初期濃度に対応す
る、DMSO中、２−メチルキノキサリンの約100mg/mL溶液
約0.1mL の添加により開始した。インキュベーション
を、約225rpmで攪拌しながら、約29℃でよく4 時間続け
た。生転換ブイヨンのサンプルを種々の時間で除去し、
そして遠心分離により細胞を除去し、そして必要な場
合、MeOHにより希釈した後、HPLCにより分析した。それ
らのサンプルの個々（約20μL ）を、Inertsil（登録商
標）HPLC C8 (4.6×250mm)上への注入により分析した。
個々のカラムを、ACN ：約0.05％水生TFA （1 ：４、v/
v ）から成る移動相により約1.0mL/分で溶出した。2 −
キノキサリンカルボン酸の収率は、それぞれ約１、2 、
及び4 日間のインキュベーションの後、約86％、90％及
び94％であった。
る、DMSO中、２−メチルキノキサリンの約100mg/mL溶液
約0.1mL の添加により開始した。インキュベーション
を、約225rpmで攪拌しながら、約29℃でよく4 時間続け
た。生転換ブイヨンのサンプルを種々の時間で除去し、
そして遠心分離により細胞を除去し、そして必要な場
合、MeOHにより希釈した後、HPLCにより分析した。それ
らのサンプルの個々（約20μL ）を、Inertsil（登録商
標）HPLC C8 (4.6×250mm)上への注入により分析した。
個々のカラムを、ACN ：約0.05％水生TFA （1 ：４、v/
v ）から成る移動相により約1.0mL/分で溶出した。2 −
キノキサリンカルボン酸の収率は、それぞれ約１、2 、
及び4 日間のインキュベーションの後、約86％、90％及
び94％であった。
【０１０５】例６．P.プチダATCC No.33015 を用いての
発酵器培養物における2 −メチルキノキサリンの酸化 P.プチダATCC No.33015 を、約10L の培地5 を含む発酵
器において増殖せしめた。発酵器を、約50mLの培地5 を
含む円錐フラスコ（300mL ）においてそれぞれ増殖され
たP.プチダの6 種の培養物により接種した。個々のフラ
スコ培養物を、P.プチダATCC No.33015 の胞子原物約17
5 μL により接種し、約2mL のp −キシレンを含む15mL
のポリプロピレン遠心分離管を挿入し、そしてフラスコ
をParafilm（登録商標）により密封した。それらのフラ
スコ培養物を、約210rpmで振盪しながら、約29℃で約17
時間インキュベートした。
発酵器培養物における2 −メチルキノキサリンの酸化 P.プチダATCC No.33015 を、約10L の培地5 を含む発酵
器において増殖せしめた。発酵器を、約50mLの培地5 を
含む円錐フラスコ（300mL ）においてそれぞれ増殖され
たP.プチダの6 種の培養物により接種した。個々のフラ
スコ培養物を、P.プチダATCC No.33015 の胞子原物約17
5 μL により接種し、約2mL のp −キシレンを含む15mL
のポリプロピレン遠心分離管を挿入し、そしてフラスコ
をParafilm（登録商標）により密封した。それらのフラ
スコ培養物を、約210rpmで振盪しながら、約29℃で約17
時間インキュベートした。
【０１０６】6 種のフラスコ培養物による発酵器の接種
の後、p −キシレンを、2 時間、20分ごとに、約2mL の
アリコートで発酵器に添加した。その後、p −キシレン
の約2.5mL アリコートを、約3.5 時間、20分ごとに、発
酵器に添加した。次に、キシレン添加を中断し、そして
2 −メチルキノキサリンを、接種の約5.25時間（約1.95
g ）及び約7.75時間（約7.76g ）で添加した。インキュ
ベーションを、最終2−メチルキノキサリン添加の後、
約22時間続けた。インキュベーション培地のサンプルを
遠心分離し、細胞を除去し、MeOHにより希釈し、そして
例V に記載される方法を用いて、HPLCにより分析した。
この分析は、2 −キノキサリンカルボン酸の81％収率を
示した。
の後、p −キシレンを、2 時間、20分ごとに、約2mL の
アリコートで発酵器に添加した。その後、p −キシレン
の約2.5mL アリコートを、約3.5 時間、20分ごとに、発
酵器に添加した。次に、キシレン添加を中断し、そして
2 −メチルキノキサリンを、接種の約5.25時間（約1.95
g ）及び約7.75時間（約7.76g ）で添加した。インキュ
ベーションを、最終2−メチルキノキサリン添加の後、
約22時間続けた。インキュベーション培地のサンプルを
遠心分離し、細胞を除去し、MeOHにより希釈し、そして
例V に記載される方法を用いて、HPLCにより分析した。
この分析は、2 −キノキサリンカルボン酸の81％収率を
示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 17/12 (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:66） Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 17/12 (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 17/12 (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:80） Ｃ１２Ｒ 1:80） (72)発明者 ジョン ウイン ウオン アメリカ合衆国，コネチカット 06340, グロトン，イースターン ポイント ロ ード，ファイザー インク (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 17/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (38)
- 【請求項１】 ２−メチルキノシサリンと微生物とを接
触し、そして得られる混合物を、多量の２−キノキサリ
ンカルボン酸を生成するのに十分な条件下でインキュベ
ートすることを含んで成る、２−キノキサリンカルボン
酸への２−メチルキノキサリンの微生物酸化のための方
法であって、前記微生物が、アブシジア（Absidia ）
属、アスペルギラス（Aspergillus ）属、クニングハメ
ラ（Cunninghamella）属、ジプロジア（Diplodia）属、
ペニシリウム（Penicillium ）属、又はプソイドモナス
（Pseudomonas ）属、に属する微生物である、ことを特
徴とする方法。 - 【請求項２】 ２−メチルキノシサリンと微生物とを接
触し、そして得られる混合物を、多量の２−キノキサリ
ンカルボン酸を生成するのに十分な条件下でインキュベ
ートすることを含んで成る、２−キノキサリンカルボン
酸への２−メチルキノキサリンの微生物酸化のための方
法であって、前記微生物が、アブシジア・グラウカ（Ab
sidia glauca）ATCC No.22752,アブシジア・グラウカAT
CC No.74480,アブシジア・プソイドシリンドロスポラ
（Absidia pseudocylindrospora）ATCC No.24169,アブ
シジア・レペンス（Absidia repens）ATTCC No.14849,
アブシジア・レペンスATCC No.74481,アスペルギラス・
タマリ（Aspergillus tamarii ）ATCC No.16865,クニン
グハメラ・エキヌレータ（Cunninghamella echinulata
）ATCC No.8688a,クニングハメラ・エキヌレータ（ATC
C No.8688b,クニングハメラ・エキヌレータATCC No.898
3, クニングハメラ・エクヌレータATCC No.9244, クニ
ングハメラ・イキヌレータATCC No.9245, クニングハメ
ラ・エキヌレータATCC No.10028b, クニングハメラ・エ
キヌレータATCC No.26269,クニングハメラ・エキヌレー
タATCC No.36190,クニングハメラ・エキヌレータATCC N
o.36112,クニングハメラ・ホモタリカ（Cunninghamella
homothallica ）ATCC No.16161,ジプロジア・ゴシピナ
（Diplodia gossypina）ATCC No.20575,ペニシリウム・
クラビホルメ（Penicillium clariforme）ATCC No.1042
6,ペニシリウム・デュクラウキシ（Penicillium duclau
xii ）ATCC No.10440,ペニシリウム・グラブラム（Peni
cillium glabrum ）ATCC No.11080,プソイドモナス・プ
チダ（Pseudomonasputida）ATCC No.33015,及びプソイ
ドモナス・プチダATCC No.202190, ; 並びにそれらの適
切な変異体から成る群から選択され；但し、前記微生物
が前記プソイドモナス・プチダATCC No.33015 又は前記
プソイドモナス・プチダATCC No.202190である場合、前
記プソイドモナス・プチダATCC No.33015 又は前記プソ
シドモナス・プチダATCC No.202190は、前記プソイドモ
ナス・プチダATCC No.33015 又は前記プソイドモアス・
ATCC No.202190と前記２−メチルキノキサリンとの前記
接触の前、インデューサーとの相互作用により誘発され
ることを特徴とする方法。 - 【請求項３】 ２−キノキサリンカルボン酸を単離する
ことをさらに含んで成る請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 前記単離が、有機溶媒による前記混合物
の抽出により実施される請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記有機溶媒が酢酸エチルである請求項
４記載の方法。 - 【請求項６】 前記抽出をクロマトグラフィー処理にゆ
だねることをさらに含んで成る請求項４又は５記載の方
法。 - 【請求項７】 前記単離が、前記混合物からの前記２−
キノキサリンカルボン酸の樹脂上への吸着、及び前記樹
脂からの前記吸着された２−キノキサリンカルボン酸の
有機溶媒による溶出により実施される請求項３記載の方
法。 - 【請求項８】 前記樹脂がポリマー吸着樹脂である請求
項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記有機溶媒が酢酸エチル又はメタノー
ルである請求項７又は８記載の方法。 - 【請求項１０】 前記溶出された２−キノキサリンカル
ボン酸を酢酸エチルから結晶化することをさらに含んで
成る請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 前記溶出された２−キノキサリンカル
ボン酸を酢酸エチル及びメタノールから結晶化すること
をさらに含んで成る請求項７〜９のいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項１２】 前記微生物が損傷を受けていない微生
物である請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項１３】 前記微生物が、前記微生物の洗浄され
た細胞を含んで成る請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 前記洗浄された細胞を固定することを
さらに含んで成る請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 前記洗浄された細胞が水性溶媒に存在
する請求項１３の方法。 - 【請求項１６】 前記接触が、前記溶媒に前記２−メチ
ルキノキサリンを添加することによる請求項１５記載の
方法。 - 【請求項１７】 前記微生物が増殖培地に存在する請求
項１２記載の方法。 - 【請求項１８】 前記接触が、前記増殖培地に前記２−
メチルキノキサリンを添加することによる請求項１７記
載の方法。 - 【請求項１９】 前記微生物が、前記アブシジア・グラ
ウカATCC No.22752,アブシジア・グラウカATTCC No.744
80, アブシジア・レペンスATCC No.14849,アブシジア・
レペンスATCC No.74481,アスペルギラス・タマリATCC N
o.16865,クニングハメラ・エキヌレータATCC No.8983及
びジプロジア・ゴシピナATCC No.20575 ；並びにそれら
の前記変異体から成る群から選択される請求項１〜１８
のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２０】 前記微生物が、前記アブシジア・グラ
ウカATCC No.22752,アブシジア・グラウカATCC No.7448
0,アブシジア・レペンスATCC No.14849,アブシジア・レ
ペンスATCC No.74481,及びアスペルギラス・タマリATCC
No.16865 ；並びにそれらの前記変異体から成る群から
選択される請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 前記微生物が、前記アブシジア・グラ
ウカATCC No.22752,アブシジア・グラウカATCC No.7448
0,アブシジア・レペンスATCC No.14849 及びアブシジア
・レペンスATCC No.74481 ；並びにそれらの前記変異体
から成る群から選択される請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 前記微生物が、アブシジア・レペンス
ATCC No.14849 又はアブシジア・レペンスATCC No.7448
1 である請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 ２−メチルキノシサリンと微生物とを
接触し、そして得られる混合物を、多量の２−キノキサ
リンカルボン酸を生成するのに十分な条件下でインキュ
ベートすることを含んで成る、２−キノキサリンカルボ
ン酸への２−メチルキノキサリンの微生物酸化のための
方法であって、前記微生物がアブシジア・レペンスATCC
No.14849 又はアブシジア・レペンスATCC No.74481 ；
並びにそれらの適切な変異体であることを特徴とする方
法。 - 【請求項２４】 前記微生物が増殖培地に存在する請求
項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 前記接触が、前記増殖培地に前記２−
メチルキノキサリンを添加することによる請求項２４記
載の方法。 - 【請求項２６】 前記微生物が、前記プソイドモナス・
プチダATCC No.33015 又は前記プソイドモナス・プチダ
ATCC No.202190である請求項１〜１８のいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項２７】 前記インデューサーがｐ−キシレンで
ある請求項２６記載の方法。 - 【請求項２８】 前記プソイドモナス・プチダATCC No.
33015 又はプソイドモナス・プチダATCC No.202190が増
殖培地に存在する請求項２７記載の方法。 - 【請求項２９】 前記ｐ−キシレンが前記増殖培地に添
加される請求項２８記載の方法。 - 【請求項３０】 前記増殖培地がフラスコに存在する請
求項２９記載の方法。 - 【請求項３１】 前記誘発の完結の後、前記微生物を収
集する段階をさらに含んで成る請求項３０記載の方法。 - 【請求項３２】 前記収集が、前記フラスコ中の内容物
を遠心分離し、液体をデカントし、細胞ペレットを洗浄
し、そして前記ペレットを緩衝液に再懸濁することによ
る請求項３１記載の方法。 - 【請求項３３】 前記接触が、前記再懸濁の後、前記緩
衝液に前記２−メチルキノキサリンを添加することによ
る請求項３２記載の方法。 - 【請求項３４】 前記増殖培地が発酵器に存在する請求
項２９記載の方法。 - 【請求項３５】 前記増殖培地への前記ｐ−キシレンの
添加が、前記誘発の後に中断される請求項３４記載の方
法。 - 【請求項３６】 前記接触が、前記ｐ−キシレンの中断
の後、前記増殖培地に前記２メチルキノキサリンを添加
することによる請求項３５記載の方法。 - 【請求項３７】 ２−メチルキノキサリンと微生物と
を、前記微生物の酵素がインデューサーとの相互作用に
より誘発された後、接触し、そして得られる混合物を、
多量の２−キノキサリンカルボン酸を生成するのに十分
な条件化でインキュベートすることを含んで成る、２−
キノキサリンカルボン酸への２−メチルキノキサリンの
微生物酸化のための方法であって、前期微生物が、プソ
イドモナス・プチダATCC No.33015 及びプソイドモナス
・プチダATCC No.202190；又はそれらの適切な変異体か
ら成る群から選択されることを特徴とする方法。 - 【請求項３８】 前記インデューサーがｐ−キシレン又
はｍ−キシレンである請求項３７記載の方法。
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