JPH0376592A - ２，３―エポキシプロピルエーテルの微生物学的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２．３−エボ卑シグロビルエーテル。

特に、２．５−エボキシグロビルフェニルエーテルの微
生物学的製造に関し且つこの方法で用いられる酵素源で
ある新規な微生物に関「る。

２．３−エボ＋ｆジプロピルフェニルニーテルハ。

ａ薬お工び薬学工業において有用である光学活性化合物
であり８例えば薬剤用田発物質とし″Ｃ重楚である。こ
れらは、アぐン１用いる塩開裂により。

下記の反応 から製造″′ｆるこｔができる。微生物学的な一つの方
法が、欧州特許出願公＠第１６６５２７号明細嶺（但し
、Ａは、芳香族環℃の置換基である）＆Ｃよ−ｚＣアリ
ルオ呼シブロバノールアξンに変換するこεができるの
で、β−遮断莱の合成における中間体εして特に型費で
ある。

２．６．エボ牟ジプロピルエーテルは１例えば過酸化物
を用いる化学的酸化によ一５″Ｃまたは微生物学的酸化
方法により工、相当するアリルエーテルされた微生物の
細胞株馨用いている。しかしながら。このような既知の
方法において、我々は、アリルエーテルの相箋する２、
６−エボキシグロビル２−チルへの酸化を引き起こす酵
素が、アルカン＆Ｃよる成長の際に微生物において誘導
されるこ考えている。我々は、このような酵素が、芳香
族環の置換基に影響することがあり、墓ましくたい副生
物を生ずることを見出だしている。更に、アリルエーテ
ルノ２．３−エポキシプロピルエーテルへの微生物学的
酸化に用いられる反応の生産性は。

増加するものであることが駕ましい。

１Ａ’ｒノによる成長に、Ｊ：、−５″Ｃ誘溝される酵
素アルケンモノオキシゲナーゼを有する微生物の利用カ
、１．２−エポキシプロパンおよヒ１．２−エホキシブ
タンの製造において開示されている。我々は現在、この
ような微生物およびそれらから誘導された酵素が、２．
６−エポ千シグロビルエーテルの製造に用いることがで
きることを見出だしている。

本発明により、我々は、光学活性な２．６−ニポキシグ
ロビルエーテルの製造方法であって、−紋穴 ％式％） （式中Ｘ）２明細書本文中に定義の通りである。）を有
する対応するアリルエーテルを、好気条件下。

アルク／モノオキシゲナーゼ酵素會含む微生物細胞、ま
たはそれから得られた抽出物で処理し、そして生成した
２、３−エポキシプロピルエーテルを単離することから
なり；かつその酵素がアリルエーテルを対応する２、３
−エボ牟シブｐビルエーテルに酸化することが可能であ
り、そしてその＃素がアルケンを含む培地での上記微生
物細胞の増殖によって細胞中に誘導されたものであるこ
とを特徴とする。上記製造方法を提供する。

−紋穴Ｘ−０−ＯＨ−Ｇ）ｌ＝ｃＨ２１１）において。

又は、下記の基の内の１種類を表わ丁。

（ａｌ　　フェニル基および！ｉｌ換フェニル基。

（ｂｌ　　置換および非置換α−ナフデル基およびβ−
ナフチル基、および ［Ｃ１ベンジル基。

Ｘが置換フェニル基である場合、好適な基には。

式 （式中、Ｒｏは下記の基 メチル、エチル、ｎ−プロピル、イングロビル。

ｎ−ブチル、イソブチル、メトキシ、エトキシ。

ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ。

インブトキシ、ｔ−ブトキク、ハロゲン、シアノ。

シクロペンチル、アリル、アリルオキシ、メトキシニブ
ルおよびベンジルオキシ。

の内の１種類以上であり。

ｎは、１〜３の整数であり、基Ｒ□は、ｎが２または３
の場合、同じ℃あるかまたＶ１異なるものである）を有
する基がある。

好適な置換す７テル基には１式 （２） （式中、Ｒ２は、下記の基。

メチル、エチル、ｎ−グロビル、イングロビル。

の内のｉｌｌ類以上であり。

ｎは、１〜４の整数であり、基Ｒ２は、ｎが２〜４であ
る場合、同じであるかまたは異なるものである）を有す
る基がある。

本発明の方法に出発物質として用いるのに好ましいアリ
ルエーテルには、アリルフェニルエーテル、ｔ−す７テ
ルアリルエーテル、２−メチルフェニルアリルエーテル
、４−ｎ−７’ｆｋフエニルアリルエーテル、２．５−
シメデルフェニルアリルエーテル、２．５−ジメテルフ
ェニルアリルエーテＡ／　、　２．６−　シーｔ−フチ
ルー４−メチルフェニルアリルエーテル、２−了りルフ
ェニルアリルエーテル、２−シアノフェニルアリルエー
テル、２−ククロベンテルフエニルアリルエーテル、２
−メトキシフェニルアリルエーテル、２−クロロフェニ
ルアリルエーテル、２−アリルオキシフェニルアリルエ
ーテル、４−β−メトキシエテル７エ二ルアリルエーテ
ル、４−ブトキジフェニルアリルエーテル、３−メチル
フェニルアリルエーテル。

２−クロロ−５−メチルフェニルアリルエーテルおよび
ベンジルアリルエーテルがある。特に好ましい出発物質
は、アリルフェニルエーテルである。

一般的には、アリルエーテルは１本発明の方法において
出発物質として個別に用いるものであるが。

アリルエーテルの混合物を用いてもよい。

本発明の方法に用いるのに特嗅有月な微生物は。

新規な細胞株ＮＣＩＭＢ　４０１５５およびＮＣＩＭＢ
４０１５６（それぞれ細胞株Ｍ２６およびＭ１５６とし
ても知られている）である。これらの細胞株の培養は１
％許手跣き上の微生物の国際承認に関丁ルフタヘスト条
約の条件で、ナシ画ナル・コレクシ冒ンＸＯ−オブーイ
ンダストリアル・アンド１１″ｌＦリーンΦバクテリア
ーりくテヴド（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎ
ｅＢａａ　ｔｅｒｊａ　Ｌ　ｔｄ。）　（ＮＧＩＭＢ）
私書箱３１．１３５アビー＠ロード、アバディーン、Ａ
Ｂ９８ＤＧ、スコツトランドに、１９８９年６月２１日
に寄託されている。これらの新規な微生物は、エアンお
よびグロベン雰囲気中で緩衝沿、中に懸濁し℃いる土壌
試料から新規に誘導された。この処理の５日ａｔｔＣ。

土壌ケ分離し、生じる培養物音、エテンおよびプロペ／
下で継代塘養を（６〜４回）繰り返した。

標準分離法豪、生物学的に純粋に培養物Ｖ製造するのに
用いた。

本発明の方法において５本明細誉前記に定義の式ｔｌｌ
’に有するアリルエーテルを、酵素アルケン七ノオキシ
グナーゼであり℃、酵素がドウ・ボンｅジェイ０エイ−
ｘ　Ａ　（ｄａ　５ｏｎｔ　Ｊ、Ａ、Ｍ、　）らによル
、（１９７９）　、　ＦＥＭＳ　ＭｉＣｒＯｂｉＯＩ　
Ｌｅｔｔ、、　３巻、８９〜９３頁に記載され℃いるも
の℃処理する。酵素は１例えば細胞株ＮＧＩＭＢ　４０
１５５またはＮＧＩＭＢ　　４０１５６．属（コバクテ
リクム株の微生物細飽中またはそれらから誘導された粗
または＠製抽出物中に存在するこεができる。酵素は、
アルカンによる成長が重司能℃ある細胞中に、このよう
な細胞がアルケンを含む場地上で成長する場合にｖＳ擲
されたものが好ましい。細胞の成長および酵素の誘導に
好ましいアルケンは、エアンおよびプロペンである６酵
素が誘導される場合、細馳株は。最初に、非酵素誘導性
のグルコース、酢＠塩および乳酸塩などの別の炭素源で
成長させた後、アルケンで２時間〜２日間の間成長させ
ゐことが℃きるｔｈ静素を有するように細胞を族長き破
る別の方法は、グルコース、酢酸塩または乳酸塩なとの
炭素源に加えてエアンまたはプロペ／以外の好適な酵素
誘導物質豪雨いることである。

本発明の方法の生成物は、−紋穴 ％式％ を有し且つ牟うル中心が￥にある２、６−エポキシプロ
ピルエーテルである。この方法により℃製造することが
でき、中間体として極め℃有用であるエボキシグロビル
エーテルにおいて、Ｘは、下記の構造 を有するものである。一般的に６本発ＦＪＪ′Ｊｃｙ）
方法によって製造される鏡像異性体は。Ｓ−蜆像異性体
である。更にｍａ造される鋭＠異性体は１通常。

８０％を上回る鏡像異性体過剰量そ製造される。

生成物が中間体℃ある場合１次に、１回のまたは一連の
反応を行なりて新型の最終生成物を製造する。任意の続
いて行なった反応で製造された生成物が結晶性籾導体℃
ある場合、これは、鏡像異性本過剰量を１００％に更に
近い値まで高くするのに用いることができる。

本発明の方法紮微先物細胞中の酵素を用いて行なう場合
、下記が基本的な代わりの方法である多くの択一方法で
行なうこεができる。

ｌａＪ　　酵素およびアリルエーテル出発物ｇＬヲ有す
る細胞の戒長用炭素源鮎含む培地を初めから用いる方法
を行なうこ、！：、。

（ｂｌ　　同一の装置で２段階の方法１行なうこと。

この方法におい℃、微生物は、最初に成長用炭素源を含
む培地″ｅ取長させ、好適な開胸の後、第二段階の開始
時に、酸化されるアリルエーテル馨加えるこε。

＋Ｃ１異なる装置て：２段階の方法を行うこと。この変
法におい℃５微生物は、成長用炭素源Ｖ含む培地の最初
の装置″′ｅ最初＆Ｃ成長させる。第２段階の開始時に
、微生物細胞Ｖ成長培地かｈ分組し。

好適な緩衝培地中で酸化されるアリルエーテル４含んで
いる第二の装置へ移丁。この培地に、別の酸化可能基質
を加えてこの方法に対する性能紮低下させることもある
。この変法におい″Ｃ，アリルエーテルは、水不混和性
溶媒中に存在するこ辷もある。

微生物の成長は、好気的におよび好適な無機栄ＩＩ素と
、酵母抽出物、トウモロコシ８！漬液などの微生物の成
長に必焚な任意の他の物質とを含む培地の存在下で行な
う。

本発明の方法の利用１工、光学活性な２．６−エボ呼ジ
プロピルエーテルχ、高度な立体特異性に対する高い生
成炭で且つ低い副生物発生率で製造することを可能にす
る。

本発明ケ、下記の実Ｍ例によって例示し、その結果を図
面の第１図および第２図に示す。

実施ガ　１ への変換 微生物Ｍ２６　（ＮＧＩＭＢ　４０１５５）％：１表−
１に示されている組成物である無機塩類培地４００−カ
人っている２リツトルのエレンマイヤーフラスコで種部
させた。炭素源は、シリンジで良髪通して注入したエテ
ノ５％Ｖ／’Ｖであった。培養接種材料（４％Ｖ／Ｖ　
）は、エテノでの成長に予め適合させた細胞を用いた。

培養物％：６０℃で７２時間インキエベートした後、細
胞を遠心分離によって採取し、ｐＨ７での冷リン酸緩衝
液２５ｍＭで洗浄した。細胞を再＠濁させて、６００ｎ
ｍで測定したところ１０〜１５単位の光学密度【得た。

スクリエー式栓付きコニカルフラスコ１００−に。

洗浄した細胞懸濁液１２ｄを入れた。懸淘液浅６０℃で
５分間予めインキュベートした後、生物変換反応を、了
りルフェニルエーテルを最終濃度２ｍＭまで加えるとと
Ｋよって開始させた。試料（５８μｔ）を間隔をおいて
取りだし、内部標準として１−ヘプタデカンを含む同量
の水冷エーテルで抽出を行なった。混合物を、遠心分離
によって分離し。

エーテル層からの試料を、１０％カルボヮクス（Ｃａｒ
ｂｏｗａｘ）　２０　Ｍまりｔｔクロモソーブ（ｃｈｒ
ｏｍｏ−ｓｏｒｂ）　ＷＨＰ（１，８ｍＸ内径４　ｍ　
）の、１９０”Ｃで窒素キャリヤーガスＩｋ４０ａｕ／
分で用いるガスクロマトグラフィーによって分析した。

１２時間の生物変換反応の結果を第１図に示す。得られ
た１、２−エポ牟シー３−７エノキシプロパンの最終濃
度は、収率８０％（生成物？／加えた了りルエーテル？
）を示した。

生成物の鏡像異性体組成物の分析用に、前記の方法’ｒ
２８倍に拡大した。アリルフェニルエーテルとの１０時
間のインキュページ＊ｙｃｏａ、ａａ培地全体を、同量
の（内部標準を含まない）冷エーテルで２回抽出を行た
った。合わせたエーテル層をリン酸緩衝液（ｐ）（８）
で１回洗浄し。

Ｎａ２５ｏ４上で乾燥させた後、ロータリーエバポレー
ターで濃縮した。

濃縮した抽出物を、−？ラル高速液体クロマトグラフィ
ーによってａｍ異性体組成物についての試験を行なった
。カラムは、キラセル（Ｏｈ　ｉ　ｒａｃｅｌ　）ＯＤ
２５０１１Ｘ内径０．４ｃｙａ；溶出液は、イソプロピ
ルアルコール／ヘキサン５０１５０（ｖハリ；流速は。

０．５ｄ／分；検出器は、２８０１ｍ；狂人容量は、２
０μｔで行なった。＆＠異性体過剰量は、９６％であり
、主としてＳ−＊像Ｓ性体であった。

表−１：微生物Ｍ２６の培養に用いられた培地の組成 実施９’ｌＪ　　２ への変換 微生物Ｍ１５６幣、尭施例ｉｉｃ記載のように増殖させ
た。炭素原は、１０％（Ｖ／Ｖ　）プロペン℃あった。

他の条件および操作はいずれも、実施例１に記載の通り
であった。１１１３定しｔこ生成物の娩１象異性本通！
ｌ！１１ｉｔ１工。９６％であり、主とｔ、”Ｃ８−鏡
像異性体であった。

【図面の簡単な説明】

図面におい℃、 第１図は．アリルフスニルエーテル（。Ｓ）の。 実施例１の倣生物凰２６による１．２−エボキシ−６−
７エノ牟シプロパンｃ．ｐ）への変換をボテ時間ｔａ＋
Ｔｌｃたい丁る濃度（ｍＭ）のグラフであり。 第２図は．アリル７ｘ．ニル２−チル（躯．Ｓ）の。 実施例２の微生物Ｍ１５６による１．２−エボキシ−６
−７エノ欅シグロパ７　（＠．１：１）への変換浅ボテ
時間１ｂ＋に対重る濃度（ＩＩＩＭ）のグラフ″′Ｃ：
ある。 （外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、光学活性な２，３−エポキシプロピルエーテルの製
   造方法であつて、一般式 Ｘ−Ｏ−ＣＨ＿２−ＣＨ＝ＣＨ＿２（ I ） （式中Ｘは明細書本文中に定義の通りである。）を有す
   る対応するアリルエーテルを、好気条件下、アルケンモ
   ノオキシゲナーゼ酵素を含む微生物細胞、またはそれか
   ら得られた抽出物で処理し、そして生成した２，３−エ
   ポキシプロピルエーテルを単離することからなり；かつ
   その酵素がアリルエーテルを対応する２，３−エポキシ
   プロピルエーテルに酸化することが可能であり、そして
   その酵素がアルケンを含む培地での上記微生物細胞の増
   殖によつて細胞中に誘導されたものであることを特徴と
   する、上記製造方法。 ２、アリルエーテルが、Ｘがフェニル基または置換フェ
   ニル基である一般式を有し、前記の置換フェニル基が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１は下記の基、 メチル、エテル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブ
   チル、イソブチル、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキ
   シ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔ
   −ブトキシ、ハロゲン、シアノ、シクロペンチル、アル
   リ、アリルオキシ、メトキシエチルおよびベンジルオキ
   シの内１種類以上であり、 ｎは、１〜３の整数であり、基Ｒ＿１は、ｎが２または
   ３の場合、同じであるかまたは異なるものである）を有
   する、請求項１に記載の方法。 ３、アリルエーテルが、Ｘが置換または非置換α−ナフ
   チル基またはβ−ナフチル基である一般式を有し、前記
   の置換ナフチル基が、一般式▲数式、化学式、表等があ
   ります▼ （式中、Ｒ＿２は、下記の基、 メチル、エテル、ｎ−プロピルおよびイソプロピルの内
   １種類以上であり。 ｎは、１〜４の整数であり、基Ｒ＿２は、ｎが２〜４で
   ある場合、同じであるかまたは異なるものである）を有
   する、請求項１に記載の方法。 ４、微生物細胞が、細胞株Ｍ２６（ＮＣＩＭＢ４０１５
   ５）またはＭ１５６（ＮＣＩＭＢ４０１５６）に属する
   、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５、酵素が、アルカンによって成長不能である細胞中に
   、このような細胞がアルケンを含む培地によつて成長す
   る場合に誘導されたものである、請求項１〜４のいずれ
   か１項に記載の方法。 ６、酵素が、エテンまたはプロペンを含む培地上での細
   胞の成長によつて細胞中に誘導された、請求項１〜５の
   いずれか１項に記載の方法。 ７、この処理を、酵素およびアリルエーテル出発物質を
   有する細胞の成長用炭素源を含む培地で開始する、請求
   項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８、微生物が成長用炭素源を含む培地で成長する第一の
   段階と、間隔をおいた後、酸化するアリルエーテルを加
   える第二の段階とから成る、請求項１〜６のいずれか１
   項に記載の方法。 ９、第一の段階を第一の容器で行ない、第一および第二
   の段階の間に微生物細胞を成長培地から分離し、第二の
   段階を行なう容器に移し変える、請求項８に記載の方法
   。 １０、第二の段階において、アリルエーテルが、水不混
   和性溶媒中に存在する、請求項９に記載の方法。