JPS6349088A

JPS6349088A - 微生物によるピロガロ−ル、ピロカテコ−ルもしくはそれらの誘導体の製造方法

Info

Publication number: JPS6349088A
Application number: JP19376686A
Authority: JP
Inventors: Etsuko Yamamoto; 山本　英津子; Hiroshi Ueda; 宏植田
Original assignee: TOOA SEIKATSU KAGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: TOOA SEIKATSU KAGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1986-08-19
Filing date: 1986-08-19
Publication date: 1988-03-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は微生物によるピロガロール、ピロカテコールも
しくはそれらの誘導体の製法に係り、さらに詳しくはエ
ンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属す
るピロガロールおよびピロカテコール生産能を有する微
生物、もしくは該微生物の菌体処理物を用いて、ピロガ
ロール、ピロカテコールもしくはそれらの誘導体を工業
的有利に得る製造方法に関するものである。

従来技術ピロガロールは写真の現像薬、染料原料、酸素吸収剤あ
るいは医薬品中間体などに用いられる工業的に重要な化
合物である。現在没食子酸をオートクレープすることに
より製造されているが、副生物が多量に生成する欠点が
あり、このような欠点のないピロガロールの製造法の出
現が期待されている。

微生物によるピロガロールの製造法としては、従来タレ
ブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の細菌（Ａｎ−ｔ
ｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、　３５．
３２５（１９６９））　、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒ）属の細菌（特開昭５７−１３８３９３号
公報）、エルヴイニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属およびエア
ロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の細菌（特開昭６１
−１０８３９３号公報）によるＲ１造法などが知られて
いるにすぎない。

またピロカテコールは重合防止剤原料、分析試薬、写真
の現像薬として広く用いられている化合物で、現在化学
合成法により製造されている。微生物によるピロカテコ
ールの製造法としてはクレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ）属の細菌を用いる方法（Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ
　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、　３５．３２５（１９６９
））や、ベンゼンをシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔａ
ｒｉｕｍ）属の細菌により酸化する方法（Ｊ、　Ｂａｅ
ｔｅｒｉｏｌ、、　８１．４２５（１９６１））等が知
られている。

発明が解決しようとする問題点かかる状況下に於て、ピロガロール、ピロカテコールあ
るいはそれらの誘導体のより容易且つ工業的有利な製造
法が求められており、かかる課題にこたえることが本発
明目的である。

問題点を解決するための手段本発明に従えば、上記目的がエンテロバクタ−（Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｅｔｅｒ）属に属し、ピロガロールおよびピ
ロカテコール生産能を有する微生物もしくは該微生物の
菌体処理物を、加水分解型タンニン、没食子酸もしくは
プロトカテキュ酸に作用させることを特徴とする方法、
就中前記微生物として、エンテロバクター・アグロメラ
ンスＮｏ．５１（微工研菌寄託番号第８８４８号）を使
用する方法により達成せられる。

本発明者らはピロガロール、ピロカテコールを生成しう
る能力をもつ微生物を検索するうち、岐阜県下の畑土壌
から分離したエンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ）属に属する１菌株が加水分解型タンニン又は没食
子酸からピロガロールを、プロトカテキュ酸からピロカ
テコールを効率よく生成することを見出し、本発明を完
成するに至った。

本発明者らにより今回見出された前記の菌株はエンテロ
バクタ−属に属し、エンテロバクター・アグロメランス
Ｎｏ．５１株と命名されたが、その菌学的性質は以下の
通りである。

（ａ）形態　　ブイヨン寒天培地で３０℃、２４時間培
養したちの： ■細胞の大きさ巾０．６〜１．ＯＸ長さ１．２〜３．０ｐｍの短桿菌で
ある。

■細胞の多形性の有無：認められない。

■運動性の有無二周鞭毛を有し、運動性を有する。

■胞子の有無：なし。

■ダラム染色：陰性。

■抗酸性；なし。

（ｂ）各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養速やかに生育し、コロニーは正円形、表面はなめらかで
、半透明、うすいクリーム色、光沢を有する１色素を生
産せず。

■肉汁寒天斜面培養速やかに生育し、表面はなめらかで培地は変化しない。

■肉汁液体培養混濁状によく生育する。

■肉汁ゼラチン穿刺培養穿刺線に沿って生育し、液化されない。

（ｃ）生理学的性質 ■生育の範囲＝ＰＨ４〜７，２０〜３７℃で生育。

至適温度２８℃。

■酸素に対する態度二通性嫌気性 ■硝酸塩還元：＋ ■ＭＲテスト：＋ ■ｖＰテストニー ■インドールの生成ニー ■Ｈ２Ｓの生成ニー ■クエン酸の利用：＋ ■色素の生成ニー［相］蛍光の有無ニー１１ウレアーゼニー１２オキシダーゼニー１３カタラーゼ：＋１４０−Ｆテスト：発酵的、グルコースより酸とガスを
生成。

１５糖類より酸の生成（１）アドニトールニー（２）アラビノース：＋（３）グルコース：＋（４）マニトール：＋（５）イノシトール：十（６）ソルビトールニー（７）ラムノース：＋（８）シュークロース：＋（９）メリビオース：− （１０）アミダリン：＋（１１）乳糖ニー（１２）セロビオース：＋（１３）ラフィノースニー（１４）　トレハロース：＋（ｄ）その他の性質 ■β−ガラクトシダーゼ：＋ ■アルギニンジヒドロラーゼニー ■リジンデカルボキシラーゼ：− ■オルニチンデカルボキシラーゼニー ■トリプトファンデアミナーゼ二− ■ゼラチン分解ニー ■チトクロムオキシダーゼニー ■マロン酸資化：＋本菌の菌学的性質はエルヴイニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗ
ｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）　、エルヴイニア・ウ
レドヴオラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）　
、　−ｒ−）Ｌｔヴイニア０ステワルテイ（Ｅｒｗｉｎ
ｉａ　ｓｔｅｗａｒｔｉ）に類似するが、運動性を有し
、グルコースよりガスを生産すること、ｖＰテストが陰
性であること、黄色色素を生産しないことからこれらの
菌である可能性は排除された。本菌はソルビトール、メ
リビオースより酸を生成しない点は標準画と異なるが、
エンテロバクタ−・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　ａｇ−ｇｌｏｍｅｒａｎｓ）のエアロジェニ
ック・バイオグループ（ａｅｒｏｇｅｎｉｃ　ｂｉｏｇ
ｒｏｕｐ）　Ｇ　２に属する菌株であると英国Ｔｈｅ　
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉ
ｎｄｕｓ−ｔｒｉａｌ　＆　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉａ　Ｌｔｄ、（ＮＣＩＭＢ）により同定された。そ
の菌学的性質はＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
Ｓｙｓｔａｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　
ｖｏｌｕ＋＋ｅ　１．　Ｐ、４６’！（１９８４）に記
載されている。エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏ−ｂａ
ｃｔｅｒ）属に属する微生物がピロガロール、およびピ
ロカテコールを生成することは従来報告がない。なおエ
ンテロバクター・アグロメランスＮｏ．５１は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８８４８号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−８８４８）として寄託されている。

本発明では、このエンテロバクタ−属に肩し。

ピロガロールおよびピロカテコール生成能を有する微生
物、即ちエンテロバクタ−・アグロメランスＮ（１５１
菌株と同じ土壌からの分離菌、あるいは該菌株の紫外線
照射、放射線照射、ニトロソグアニジン処理等によりピ
ロガロール等の生成能を高めた変異株、ならびにこれら
菌体処理物を加水分解型タンニン、没食子酸あるいはプ
ロトカテキュ酸に作用させることを特徴とするピロガロ
ール。

ピロカテコールもしくはそれらの誘導体の製造方法が提
供せられる。かかる微生物あるいは微生物の菌体処理物
を作用させるに当っては通常下記いづれかの方法が採用
せられる。すなわち。

■加水分解型タンニン又は没食子酸又はプロトカテキュ
酸を含有する培地に１本微生物を接種、培養し、培養液
中にピロガロール又はピロカテコールを生成蓄積させる
方法。

■予め培養した本微生物の培養液から分離した菌体又は
菌体処理物を、適当な液体中で加水分解型タンニン又は
没食子酸又はプロトカテキュ酸と接触させる方法。

なお、加水分解型タンニンとしてはガロタンニン、五倍
子タンニン、没食子タンニン、タラタンニン等があげら
れる。前記■の方法による場合。

培地は１通常の炭素源、窒素源、無機塩、ｖＩｉ量栄養
素以外に加水分解型タンニン又は没食子酸又はプロトカ
テキュ酸を含有するものである。炭素源としては、グル
コース、アラビノース、マニトール、シュークロース、
グリセリン等が、窒素源としては、ペプトン、肉エキス
、酵母エキス、コーン・ステイープ・リカー等の天然窒
素源、各種無機塩類が用いられる。微量栄養素として各
種ビタミン類、アミノ酸類、核酸類があげられる。

■の場合添加する加水分解型タンニン又は没食子酸の濃
度は０．２〜１０％（ｗ／ｖ）、培地のＰ）Ｉｉ！４．
０〜７．　Ｏ１好ましくは５．０、培養温度は２０〜３
７℃、好ましくは２８℃付近で好気的に１５〜７２時間
培養する。培養は静置、振とうのいずれでもよい。ピロ
ガロール、ピロカテコールあるいはそれらの誘導体は培
地中に蓄積する。

前記■の方法では、微生物の培養には■と同様の培地が
使用される。■の方法では基質である加水分解型タンニ
ン又は没食子酸又はプロトカテキュ酸は直接培養液に添
加してもよいし、菌体又は菌体処理物を緩衝液に溶解、
懸濁し、基質を添加してもよい、基質の濃度は通常１〜
１０％（Ｗ／Ｖ）であり、反応温度は２０〜４０℃、好
ましくは３０℃、反応ｐＨは４．０〜６．０、好ましく
は４．５で、反応液をゆるく攪拌しつつ１０時間まで反
応させる。

本微生物は■の方法で用いた基質の添加なしでも十分に
生育するが、これら基質の添加によりピロガロール又は
ピロカテコール生成能の増大した菌体を得ることが出来
る。

菌体処理物を得る方法としては超音波処理法、機械的磨
砕法、リゾチーム等の酵素処理法、界面活性剤、有機溶
媒処理したもの、あるいはこれらの処理後、通常の酵素
精製法を用いて精製した没食子酸脱炭酸酵素又はプロト
カテキュ酸脱炭酸酵素を用いてもよい。また菌体又は酵
素を公知の固定化法に従って固定化したものを用いれば
、連続的にピロガロール、ピロカテコールあるいはそれ
らの誘導体を生成させることが可能である。

生成したピロガロール、ピロカテコールあるいはそれら
の誘導体はペーパークロマトグラフィー、薄層クロマト
グラフィーにより定性、硫酸バニリン法、高速液体クロ
マトグラフィーにより定址することが出来る。ピロガロ
ール、ピロカテコールあるいはそれらの誘導体は酸性ジ
エチルエーテル抽出、昇華法等公知の方法により精製、
単離することが出来る。

従来エンテロバクタ−属の細菌が加水分解型タンニン又
は没食子酸よりピロガロール類を、プロトカテキュ酸よ
りピロカテコールを生成することは未公知であり、本発
明はこれら化合物を効率よく生産することが出来、産業
上きわめて有意義である。

以下実施例により本発明を説明する。特にことわりなき
限り１部および％は重量による。

実施例１没食子酸０．２％を含む以下のような組成の液体培地５
　ｍ　Ｑを入れた綿栓付試験管にエンテロバクタ−・ア
グロメランス（Ｅｎｔａｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏ
ｍ−ｅｒａｎｓ）　Ｎａ　５１を１白金耳接種し、２８
℃、２４時時間上う培養した。全体を上記と同一組成の
液体培地２００　ｍ　Ｑを含む５００ｍ１２坂ロフラス
コに移し、２８℃、１８時時間上う培養した。ピロガロ
ールの生成址は８　、８７　μｍｏｌｅｓ／ｍＱ　（１
。

１１■／ＩＩＩＱ）で、転換率は８３．４％であった。

培地組成没食子酸　　　　　　　　０．２％　　　Ｐ）１５．０
グルコース　　　　　　　　Ｏ，１％Ｎａ２ＨＰＯ，”１２Ｈ，ｏ　　１．８％ＫＨ２ＰＯ，
０，１％ＮＨ４Ｃｌ　　　　　　　　　０．１％ＭｇＳＯ４・７
Ｈ，００，０２％酵母エキス　　　　　　　０．０５％実施例２実施例１の方法で培地中の没食子酸を０．２％プロトカ
テキュ酸に置き換えて２８℃、１８時時間上う培養を行
なった。ピロカテコールの生成址は９　、３４　μｍｏ
ｌｅｓ／ｍＱ（１、０２ｍｇ／ｍｕ　）、転換率は７２
％であった。

実施例３実施例１で得た培養液５本分、１，０００ｍｆｌを１２
．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄液を得た。

ＰＨをｌＮＨＣｌで２．０に合わせ、次いで等量のジエ
チルエーテルで２回抽呂、エーテル層を蒸発乾固した。

残渣をデシケータ−中で乾燥し、減圧フラスコ中７５℃
で昇華して結晶６９７．８１１Ｉｇを得た。本結晶は融
点１３５℃、薄層クロマトグラフィーのＲｆ値（展開溶
媒、ベンゼン、ジオキサン、酢酸、９０　：　２０　：
　４　（ｖ／ｖ／ｙ））、赤外吸収スペクトルはピロガ
ロールのそれと完全に一致したため、ピロガロールと同
定した。収率は５２．０％であった。

実施例４実施例２で得た培養液５本分１．ＯＯＯｍＱを実施例３
と同様の方法で酸性エーテル抽出、昇華を行ない、結晶
４３９■を得た。本結晶は融点１０５℃、薄層クロマト
グラフィーのＲｆ値（展開溶媒、ベンゼン、ジオキサン
、酢酸、９０　：　２０　：４　（Ｖ／Ｖ／Ｖ））　、
赤外吸収スペクトルからピロカテコールと同定した。収
率は２２．０％であった。

実施例５実施例１の方法で培地中の没食子酸を１％タラタンニン
で置き換えて２８℃、７２時間まで培養を行なった結果
を下に示した。

ピロガロール（ａｇ／ｍＱ）　　　　（μｍｏｌｅｓ／ｍＱ）２４時
間　　　　１．６８　　　　　１３．４４８時間　　　
　１．９６　　　　　１５．６７２時間　　　　２．２
３　　　　　１７．７実施例６エンテロバクター・アグロメランスＮｏ．５１を没食子
酸０．２％を含む実施例１の液体培地１．ＯＯＯｍＱ中
で２８℃、１８時間振どう培養した後、１２．０ＯＯｒ
ρｍで２０分間遠心分離して得た菌体を、没食子酸２％
を含む酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）１．
ＯＯＯｍＱにＩ＠濁し、３０℃で１０時間ゆっくりと攪
拌、反応液中の生成ピロガロールを定量した。生成量は
６５μｍｏｌｅｓ／＊Ｑ　（８，１９■／ｌＱ）、転換
率は６０．４％であった。

特許出願代理人

Claims

【特許請求の範囲】

（１）エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）
属に属し、ピロガロールおよびピロカテコール生産能を
有する微生物もしくは該微生物の菌体処理物を、加水分
解型タンニン、没食子酸もしくはプロトカテキュ酸に作
用させることを特徴とするピロガロール、ピロカテコー
ルもしくはそれらの誘導体の製造法。
（２）前記微生物がエンテロバクター・アグロメランス
Ｎｏ．５１（微工研菌寄託番号第８８４８号）である特
許請求の範囲第１項記載の方法。