CN102245178A - 莫纳可林j衍生物的生物合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于获得莫纳可林J衍生物(I)的方法，其中R1是COR2，其中R2选自C1-C15烷基、C3-C15环烷基、C2-C15链烯基、C2-C15炔基、芳基和杂环；其包括通过发酵从产生莫纳可林J的微生物制备莫纳可林J；和通过将合适酰化剂添加到发酵培养基中酰化预先获得的莫纳可林J的C8位置存在的羟基来获得所需的莫纳可林J衍生物(I)。

Description

莫纳可林J衍生物的生物合成
技术领域
本发明涉及一种用于获得的莫纳可林J衍生物的方法，所述莫纳可林J衍生物是一种他汀类药物，其是具有降低血胆固醇特性的化合物。 
技术背景
他汀类药物形成一个降低胆固醇试剂的组，所述试剂通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A(HMG-CoA)还原酶来发挥作用，所述还原酶催化细胞胆固醇生物合成的限制性步骤。这些化合物用来减少与低密度脂蛋白(LDL)相关的高胆固醇水平，减少心肌梗死和冠状动脉的死亡的风险。 
天然的他汀类药物(莫纳可林J、洛伐他汀、美伐他汀和普伐他汀)和半合成的他汀类药物(辛伐他汀)具有一个共同的聚酮化合物结构，具有一个六氢萘核心，其在C8(R1)和C6(R2)位置上连接有不同的侧链，和一个内酯环，其取决于条件，呈现以内酯的形式的环化，或者打开成为相应的羟基酸(式A和表1)。 
Figure BDA0000068524220000011
式A 
表1 
Figure BDA0000068524220000021
在土曲霉(Aspergillus terreus)中洛伐他汀和在桔青霉(Penicillium citrinum)中美伐他汀的生物合成途烃都从生化的观点(Moore等.，J Am Chem Soc，1985，107，3694-3701；Endo等，J Antibiot，1985，38，444-448))和在分子水平(Hendrickson等，Chem Biol，1999，6，429-439；Kennedy等，Science，1999，284，1368-1372)进行了描述，并且也涉及两种I类聚酮合酶和一些酶。具体地说，就洛伐他汀来说，LovB基因编码的洛伐他汀九酮合酶(LNS)，烯酰还原酶和细胞色素P450氧合酶产生莫纳可林J(式A，R1＝OH，R2＝CH3)。这些中间产物不累积而是直接地通过LovF基因编码的洛伐他汀二缩酮(diketid)合酶(LDS)和一个乙酰转移酶(LovD)的活性的方式结合一个侧链。 
除了土曲霉和桔青霉之外，已知其它的能够产生他汀类药物(洛伐他汀或者美伐他汀)的微生物如红曲霉属、皮真菌属、正青霉属、裸子囊菌属、菌寄生属、拟青霉属(Paecylmyces)、疱霉属、木霉属、侧耳属中的一些种类和酵母如Pichia labacensis或者Candida cariosilognicola(US 6,943,017)。 
莫纳可林J可以从属于红曲霉属中的产生洛伐他汀类的种类的发酵液中获得(JP 55139396)，或者也通过添加莫纳可林K到属于不同的属的真菌 的菌株中(例如被孢霉属、翘孢霉属、腐质霉属等等)，其水解所述侧链产生这些中间产物(JP 60176595)。另一种方案由克隆和表达一片段所组成，该片段包含对于在非产生洛伐他汀菌株中合成莫纳可林J所必需的土曲霉的基因(US 6,943,017)。然而，在所有这些情况中，莫纳可林J的产量低，因此其生产不具有成本效益。 
辛伐他汀是一个洛伐他汀的半合成的类似物，由于在C8位置(式A，R1)用α-二甲基丁酸盐侧链化学取代α-甲基丁酸盐侧链，其在高胆固醇血症的治疗上更有效。用于进行这些修饰的许多化学方法包含下列步骤：水解、内酯化、通过硅烷化和酰化用α-二甲基丁酰氯保护的莫纳可林J的方式来保护(CA 1,199,322；Hoffman等，J Med Chem，1986，29，849-852)，虽然总产量小于40％，但在专利US 4,444,784、US 5,159,104和US 4,450,171中描述了这个方法的变体。在另一方法中，洛伐他汀是与酰胺反应，并且是用甲基碘和碱保护和酰化产生的酰胺的二醇，产生内酯化的二醇，产出辛伐他汀(US 4,820,850)。在一个该方法的改进变体中，用苯硼酸来保护洛伐他汀的羟基(US 5,393,893)。其它的方法是基于，例如通过洛伐他汀和甲氧基乙胺反应(WO05066150)，通过洛伐他汀和单烷基酰胺或者单环烷基酰胺反应(US 5,763,646)，或者通过进行洛伐他汀的酶水解，它的内酯化和酰化和化学或者酶水解之后的步骤(WO05040107)来获得新的中间物的。 
所有这些化学方法需要多个步骤，并且是费力的；保护步骤具有低产量，并且最终产品具有以非酰化化合物形式存在的杂质。所有这些导致了辛伐他汀的价格超过洛伐他汀的价格的5倍。 
最近已经公开了通过化学的-生物合成方法从洛伐他汀合成辛伐他汀(Xie等.，Chem Biol，2006，13，1161-1169；Xie和Tang，Appl Environ Microbiol，2007，73，2054-2060；WO2007139871)。所述方法开始于化学地获得莫纳可林J和酰化的底物(α-二甲基丁酰基-S-甲基-巯基丙酸盐)，其被添加到能够过量表达编码酰基转移酶的土曲霉的LovD基因的大肠杆菌的静 止细胞，或者培养细胞中。细胞质膜可渗透酰化的底物，从而结合到莫纳可林J产生辛伐他汀。然而，该方法具有限制性，原因在于在所述方法过程中，在用于合成莫纳可林J和α-二甲基丁酰基-S-甲基-巯基丙酸盐的底物以及所述酰化的底物部分降解的步骤中必需的试剂具有高成本。 
基于这些背景文献，认为有必要开发一种方法，从经济的和技术的观点，所述方法通过无需或者最小化使用化学试剂或者溶剂能解决使用涉及更高的价格的原材料的缺点，并且可与环境相兼容。 
发明简述 
本发明的作者已经开发一种用于莫纳可林J衍生物，如辛伐他汀等等的生产的新方法，从方法上看其是简单的，从环境的观点上看，其是经济的和有利的。特别地，所述方法包含通过发酵和通过添加酰化剂到所述发酵培养基酰化存在于莫纳可林J的C8位置的所述羟基获得莫纳可林J，所述酰化剂充当在莫纳可林J衍生物中存在于所述C8位置的侧链的前体。 
因此，在一方面，本发明涉及一种用于获得式(I)的莫纳可林J衍生物[如下限定]的方法，所述方法包含通过从产生莫纳可林J的微生物发酵产生莫纳可林J，继之以通过添加合适的酰化剂到发酵培养基酰化莫纳可林J的存在于C8位置的羟基来获得所需式(I)的莫纳可林J衍生物。 
在另一方面，本发明涉及新萨托菌(Neosartorya)属的微生物，所述微生物能够产生和累积等于或者大于50mg/L浓度的莫纳可林J。在一个特别的实施例中，所述微生物是宽脊新萨托菌(N.stramenia)种微生物。在一个具体的实施例中，所述微生物是保藏在西班牙典型培养物保藏中心(Spanish Type Culture Collection(CECT)，保藏日期为2008年6月2日，保藏单位地址：瓦伦西亚大学研究院巴伦西亚小区46100)登录号CECT20472的宽脊新萨托菌种微生物，其能够产生和累积等于或者大于50mg/L浓度的莫纳可林J，或者一个所述微生物的突变体，其保持了产生和累积等于或者大于50mg/L的浓度莫纳可林J的能力。所述微生物用于产生莫纳可林J和所述式(I)的莫纳可林J衍生物是本发明的另一方面。 
在另一方面，本发明涉及所述微生物的生物学上的纯培养。 
在另一方面，本发明涉及一种用于鉴定产生莫纳可林J的微生物的方法。 
在另一方面，本发明涉及一个多核苷酸选自其中核苷酸序列是如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的多核苷酸。所述多核苷酸作为探针，或者用于构造引物或者探针以鉴别宽脊新萨托菌的菌株或者新萨托菌属的其它的种类的用途是本发明的另一方面。 
发明详述 
定义
本发明涉及如下定义的式(I)的莫纳可林J衍生物的生产。在所述式(I)的化合物中，可以理解下面指明的含义。 
术语“烷基”指的是由碳和氢原子组成直链或者支链烃链的基团，其不是不饱和的并且通过单键结合到分子的剩余部分，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基等等。所述烷基基团可以非必需的被取代。 
术语“环烷基”指的是由碳和氢原子组成稳定的单环的或者二环的基团，其是饱和或者部分地饱和，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、金刚烷基等等。所述环烷基可以非必需的被取代。 
术语“链烯基”指的是具有一个或多个碳-碳双键的直链或者支链烃的非必需的取代基团，其通过单键结合到所述分子的剩余部分，如乙烯基、烯丙基等等。所述链烯基基团可以非必需的被取代。 
术语“炔基”指的是具有一个或多个碳-碳三键的直链或者支链烃链非必需的取代基团，其通过单键结合到分子的剩余部分，如乙炔基、1-丙炔基等等。所述炔基基团可以非必需的被取代。 
术语“芳基”指的是芳香烃的基团，其包含一个或者多个环，所述多个环包括具有独立的或者融合的芳基基团；典型的芳基基团包含1到3个独立环或者稠环，和6到大约18个碳原子，例如苯基、萘基、茚基、菲基、蒽基等等。所述芳基基团可以非必需的被取代。 
术语“杂环”指的是一个具有3到15元环的的稳定的基团，所述元环 包含碳原子和1到5个选自由氮、氧和硫组成的组中的杂原子，优选地具有一个或多个杂原子的4到8元环，更优选地具有一个或多个杂原子的5或者6元环。出于本发明的目的，所述杂环可以是单环的、二环的或者三环系统，其可以包含稠环系，并且在杂环基团中的所述氮、碳或者硫原子可以非必需的被氧化，所述氮原子可以非必需的被季胺化，并且所述杂环基团可以部分地或者完全地饱和或者它可以是芳香族的。上述的杂环基团的非限制性说明的例子包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噻二唑基、恶唑基、咪唑基、吲哚基、异恶唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、异噻唑基、氮杂环己基、喹啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉代、吡咯烷基等等。所述杂环基团可以非必需的被取代。 
如所示，上述的基团可以非必需的用一种或者几种合适的取代基，如OR′、＝O、SR′、SOR′、SO2R′、NO2、NHR′、N(R′)2、＝N-R’、NHCOR′、N(COR′)2、NHSO2R′、CN、卤素、C(＝OR)R′、COOR′、OC(＝O)R′，来独立地在它们的现有的位置一个或几个进行取代。取代或者非取代芳基和取代或者非取代杂环，其中R’独立地选自H、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、C(＝O)H、C(＝O)CH3、COOH，取代或者非取代C1-C12烷基，取代或者非取代C2-C12链烯基，取代或者非取代C2-C12炔基和取代或者非取代芳基。可以存在于式(I)的化合物中的所述卤素取代基包括F、Cl、Br和I。 
官能团如羟基或者氨基可以非必需的被保护。有许多用于不同的官能团的保护基，如羟基和氨基，它们是本领域技术人员所熟知的。供参考，参见“Protecting groups”，Kocienski，2004，第三版以及Greene和Wuts“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1999。 
术语“低级醇”指的是包含-OH基团和1到8个碳原子的化合物。 
制备莫纳可林J衍生物
在一个方面，本发明涉及一种用于获得式(I)的莫纳可林J衍生物的方法， 下文为本发明的方法。 
Figure BDA0000068524220000071
其中R1是COR2，其中R2选自C1-C15烷基、C3-C15环烷基、C2-C15链烯基、C2-C15炔基、芳基和杂环； 
其包含下列步骤：a)通过从产生莫纳可林J的微生物的发酵制备莫纳可林J；和b)通过添加适合的酰化剂到发酵培养基来酰化存在于步骤a)中获得的莫纳可林J的C8位置的羟基以获得所需式(I)的莫纳可林J衍生物。 
在第一个步骤[步骤a)]中，本发明的方法包含通过从产生莫纳可林J的微生物的发酵来制备莫纳可林J。虽然实际上任何产生莫纳可林J的微生物根据本发明的方法可用于制备式(I)中的莫纳可林J衍生物，但从它的工业应用观点看，所述用于步骤a)中的产生莫纳可林J的微生物能够产生大量莫纳可林J；除了有利地产生大量莫纳可林J之外，所述产生莫纳可林J的微生物不能产生具有存在于酰化了的C8位置的羟基的莫纳可林J衍生物，例如洛伐他汀等等，或者如果它产生它们，其必须产生非常少的量。在这个意义上讲，如果所述产生莫纳可林J的微生物产生，除了莫纳可林J之外，其它的莫纳可林J衍生物，比如洛伐他汀等等，有利地莫纳可林J的产量必须大于所述莫纳可林J衍生物的产量；举例而言，如果产生莫纳可林J的微生物也产生洛伐他汀，优选地莫纳可林J的产量将至少大于洛伐他汀的产量的10倍。 
在一个特别的实施例中，用于制备根据本发明的方法的式(I)的化合物的 产生莫纳可林J的微生物是能够以等于或者大于50mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的微生物，有利地等于或者大于100mg/L，优选地等于或者大于250mg/L，更优选地等于或者大于500mg/L，再优选地等于或者大于750mg/L，和最优选地等于或者大于1,000mg/L的发酵液。易于使用在本发明的方法的产生莫纳可林J的微生物的非限制性说明的例子包括属于曲霉属、红曲霉属、青霉属和现在的新萨托菌属的菌株。在一个具体的实施例中，用于制备根据本发明的方法的式(I)的莫纳可林J衍生物的产生莫纳可林的微生物是属于新萨托菌属的丝状真菌，如宽脊新萨托菌(N.stramenia)种类的真菌。在一个优选的实施例，用于制备依照本发明的方法的式(I)的莫纳可林J衍生物的产生莫纳可林的微生物是保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)具有登录号CECT 20472的宽脊新萨托菌(Neosartorya stramenia)的菌株，其具有以等于或者大于50mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的能力，或者所述微生物的突变型，其保持了以等于或者大于50mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的能力，其特性将在下面详述，在说明书中有时候定义为“本发明的微生物”。 
通过发酵用于制备莫纳可林J，该产生莫纳可林J的微生物将在合适的条件下培养，所述条件允许莫纳可林J的产生。通常，所述条件，例如培养基、碳源、氮源、温度等等，将依据产生莫纳可林J的微生物的性质而进行选择。 
碳源的非限制性说明的例子包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖醇、甘油、糖蜜、聚乙二醇、淀粉、脂肪酸、油等等。同样地，氮源的非限制说明的例子包括有机氮源例如酵母抽提物、蛋白胨、玉米浆、尿素、凝块乳、谷氨酸钠等等，和无机氮源例如不同的铵盐等等。 
在一个特别的实施例中，产生莫纳可林J的微生物的培养是在一段时间并在一个温度下进行的，所述时间包括在5～15天之间，所述温度包括在20℃～35℃之间，优选地在28℃～32℃之间，这取决于所述微生物，伴随恒 定的搅动，通常在有氧环境下进行。 
通过产生莫纳可林的微生物产生的莫纳可林J可以是以内酯的形式(更稳定)，以羟基酸的形式(更丰富)，或以两种形式作为闭合形式(内酯)和开放形式(羟基酸)存在的混合物。 
然后，一旦达到所需量的莫纳可林J，例如最大量的莫纳可林J，为了酰化存在于莫纳可林J的C8位置的羟基，将合适的酰化剂添加到培养基，并且获得所需式(I)的莫纳可林J衍生物[步骤b)]。 
根据本发明，莫纳可林J的化学酰化作用包括将存在于莫纳可林J的C8位置的羟基转换成酯。通过将合适的酰化剂添加到培养基中来实现这些转换，所述转变导致在莫纳可林J的C8位置的不同的侧链的形成。不希望束缚于任何理论，认为所述酰化作用反应发生在细胞内部，可能具有酶的协作，例如通过lovD基因或其直系同源基因编码的酰基转移酶，因此在一个特别的实施例中，用于制备根据本发明的方法的式(I)的莫纳可林J衍生物的产生莫纳可林J的微生物编码所述酰基转移酶，以天然形式或重组形式存在。 
虽然大多数常见的酰化剂是羧酸类及其衍生物，例如卤化物(特别是氯化物)、酯、酰胺、酐及其盐，任何合适的能够酰化存在于莫纳可林J的C8位置的羟基，并且在莫纳可林J的C8位置形成一个的酯的化合物可以在本发明中用作酰化剂以获得所需式(I)的莫纳可林J衍生物。所述酰化剂可以被本领域技术人员容易地确定。然而，在一个特别的实施例中，所述酰化剂是式(II)的化合物。 
R2COOH            (II) 
其中R2具有先前关于式(I)表示的含义；或选自卤化物、酯、酰胺、酐或所述式(II)的羧酸的盐的衍生物。 
式(II)的化合物，例如丙酸、2，2-二甲基丙酸、2-甲基丁酸、2，2-二甲基丁酸等等，是已知的化合物或可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法获得。 
式(II)的羧酸的卤化物可以通过常规方法获得，例如通过所述羧酸与SOCl2、PCl5、PBr3、C1COCOCl等等反应。式(II)的羧酸的酯可以容易地通过常规方法获得，例如通过所述羧酸或酐或其氯化物与相应醇反应，或通过所述羧酸(II)的钠盐与烷基卤化物反应等等。式(II)的羧酸的酰胺还可以通过常规方法容易地获得，例如通过所述羧酸的酯、酐或卤化物与氨或与胺反应，或通过水解相应硝基等等。式(II)的羧酸的酐可以通过常规方法容易地获得，例如通过所述羧酸的卤化物与羧化物反应等等。式(II)的羧酸的盐包括金属盐例如钠盐、钾盐、铵盐等等，其可以通过常规方法容易地获得，例如通过所述羧酸与合适的碱反应。 
所述酰化剂的非限制性说明的例子包括醋酸盐、丙酸盐，例如丙酸钠、2，2-二甲基丙酸钠等等，丁酸盐例如2-甲基丁酸盐、2，2-二甲基丁酸盐等等。如果存在手性中心，所述酰化剂将优选地是以所需的不对称形式存在，例如(S)-2-甲基丁酸钠等。 
根据本发明的方法获得的式(I)中的莫纳可林J衍生物的非限制性说明的例子包括式(I)的那些化合物，其中R1选自丙酰基、2，2-二甲基丙酰基、2-甲基丁酰基(洛伐他汀)和2，2-二甲基丁酰基(辛伐他汀)。 
在一个特别的实施例中，随着搅拌进行所述酰化反应24～72小时，在20℃～40℃的温度下进行，优选地温度在25～30℃之间。 
获得的式(I)的莫纳可林J衍生物，如果需要，可以用常规方法进行分离和纯化。为此，所述式(I)的化合物可以从发酵液中提取，并且如果需要，浓缩并且进行非必需的结晶。 
提取获得的式(I)的所述化合物的目的在于将它与存在于发酵液中(发酵培养基)中的其余的化合物分离开。可以通过常规方法从培养基中提取所述式(I)的化合物，例如通过在酸性介质中使用合适的溶剂提取。为此，所述包含式(I)的化合物的发酵液基通过使用合适的有机或无机酸来酸化，代表性地为无机酸。在一个特别的实施例中，所述培养基被酸化到pH值2.5～5，优 选3～4。可以用于酸化所述培养基的所述酸类的非限制性说明的例子包括任何能够酸化所述培养基达到合适的pH值，例如2.5～5的酸，例如盐酸、硫酸、磷酸等等。 
在一个特别的实施例中，可以使用合适溶剂进行所述提取，例如有机溶剂如酯，例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等等。添加的溶剂的量可以在一个较宽的范围内变化；然而，在一个特别的实施例中，添加的溶剂的量为0.5～2倍的培养基体积。进行所述提取，如果需要，以可控速度搅拌1～2小时。随后可以通过常规的方法分离产生的相，例如通过倾析或离心。 
一旦分离，所述式(I)的分离化合物可以以闭合形式(内酯)，开放形式(羟基酸)或以混合形式存在，即所述闭合和开放形式的混合物，如果需要所述化合物可以通过常规方法浓缩，例如通过真空下羟基酸形式的同步内酯化和随后的结晶化，例如通过在-20～-30℃的温度下冷却。如果需要，为了增加其纯度，所述式(I)的化合物可以额外地进行重结晶步骤。在一个特别的实施例中，所述先前获得的式(I)的化合物的晶体在真空下以40～60℃的温度进行过滤和干燥，优选地在45～50℃之间。通过加入合适溶剂所述晶体可以溶解，所述溶剂例如酯，例如低级醇醋酸酯，例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丁酯，和通过在20～30℃之间的温度冷却进行结晶，如前所述。 
本发明的微生物
在一个方面，本发明涉及一种新萨托菌属的微生物，在下文为本发明的微生物，其能够产生和累积等于或大于50mg/L的浓度的莫纳可林J。在一个特别的实施例中，所述的微生物是一个宽脊新萨托菌(N.stramenia)种的微生物，在一个具体的实施例中，所述本发明的微生物是宽脊新萨托菌(Neosartorya stramenia)种的保藏在CECT登录号为CECT 20472的微生物，所述微生物能够产生和累积等于或大于50mg/L的浓度的莫纳可林J，或所述的微生物的突变株，其保持能够产生和累积等于或大于50mg/L的浓度的 莫纳可林J的能力。如在本文中使用的，“能够产生和累积等于或大于50mg/L的浓度的莫纳可林J”的表述应用于一种微生物，意思指在合适的条件下，所述微生物能够产生莫纳可林J达到大于每升(L)发酵液中50毫克(mg)的莫纳可林J的浓度。所述合适条件包括在一个合适培养基和在一个合适温度下培养。在一个特别的实施例中，所述本发明的微生物能够产生和累积等于或大于50mg/L的浓度的莫纳可林J，有利地等于或大于100mg/L，优选地等于或大于250mg/L，更优选地等于或大于500mg/L，再优选地等于或大于750mg/L，和最优选地等于或大于1,000mg/L。 
可以通过任何常规方法确定用于产生和累积莫纳可林J(例如以等于或大于50mg/L的浓度)的微生物的能力，例如通过将所述微生物的培养物接种到一个合适培养基中，在合适的条件下培养并测量产生莫纳可林J的量，如描述的，例如在包括在本说明书中的实施例1。在一个特别的实施例中，所述本发明的微生物是宽脊新萨托菌(N.stramenia)CECT 20472株。 
在另一个特别的实施例中，本发明的微生物是所述宽脊新萨托菌(N.stramenia)CECT 20472菌株的突变体，其保持产生和累积等于或大于50mg/L浓度的莫纳可林J的能力。如在本文中使用的那样，术语“突变体”包括任何源自在有机体的基因中的DNA的突变或改变导致的一种在野生型中未发现的特性(表现型)的任意个体或有机体，和任何源自不产生可检测的表型效应(沉默突变)有机体的基因中的DNA的突变的个体或有机体；所述在DNA中的突变或改变的非限制性说明的例子包括核苷酸的插入或删除，以及用其它的核苷酸替换一些核苷酸；在一个具体的实施例中，所述突变体是一个宽脊新萨托菌(N.stramenia)CECT 20472的突变体，其实质上保持与亲代菌株相同的特性[N.stramenia CECT 20472]，并且进一步具有不产生或产生非常微量的洛伐他汀的能力。可以通过本领域技术人员熟知的常规技术获得所述突变体，例如经典或定向诱变、遗传操纵、重组等等。 
本发明的微生物可以用于通过微生物学的方法(发酵)产生莫纳可林J 和从所述化合物产生式(I)的莫纳可林J衍生物，例如辛伐他汀、洛伐他汀等等。从本发明的方法的工业应用的观点，所述产生莫纳可林J的微生物优选地是能够产生大量莫纳可林J，并且不产生或产生少量的其它的莫纳可林J衍生物，例如洛伐他汀。在一个优选的实施例，本发明的微生物能够产生莫纳可林J的产量将至少大于洛伐他汀的产量的10倍(如果产生了所述化合物)。 
本发明的微生物已经从对于产生莫纳可林J的微生物的筛选中分离出来。所以简要地，提取在平皿中生长的不同的微生物的培养块，并且保藏在其它的预先接种白色念球菌(Candida albicans)的培养物的平皿中，并且在培育后，通过白色念球菌(C.albicans)生长抑制晕形成的方式来测定杀菌活性的存在状态，在显示杀菌活性的菌株中选择显示出白色念球菌(C.albicans)生长抑制晕小于通过作为对照的土曲霉(Aspergillus terreus)ATCC 20542株产生的尺寸的菌株。随后，提取所述莫纳可林衍生物并且通过UPLC-PDA-MS/MS相对于纯模式的洛伐他汀、美伐他汀和莫纳可林J进行分析，如在实施例1中所示。按照这个方法，分离主要产生莫纳可林J和少量洛伐他汀的菌株，通过核糖体DNA(rDNA)的28S亚基的D1/D2区域(SEQ ID NO：1)和位于18S和28S亚基之间完全的ITS(内部转录间隔区)区域的片段(SEQ ID NO：2)的测序确定所述株为宽脊新萨托菌(Neosartorya stramenia)，并保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，登录号为CECT 20742。 
所述多核苷酸可以用作探针或用于设计引物或探针用于确定其它的宽脊新萨托菌(N.stramenia)的其它菌株或新萨托菌属的其它种类，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；因此所述多核苷酸和它们的应用是本发明的附加的方面。 
宽脊新萨托菌(N.stramenia)CECT 20742的所述rDNA的28S亚基的D1/D2区域(SEQ ID NO：1)可以使用核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ  ID NO：4所示的通用的真菌的低聚核苷酸引物通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。设置在18S和28S亚基之间的完全ITS区域(SEQ ID NO：2)还可以使用核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的通用的真菌的低聚核苷酸引物通过PCR进行扩增。 
本发明的微生物的生物学上的纯培养是本发明的一个附加的方面。 
如上所述，本发明的微生物可以用于通过微生物学的方法(发酵)来产生莫纳可林J和从所述化合物产生式(I)的莫纳可林J衍生物，例如辛伐他汀、洛伐他汀等等。因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的微生物用于产生莫纳可林J或式(I)的莫纳可林J衍生物的用途。在一个特别的实施例中，本发明的微生物是宽脊新萨托菌(N.stramenia)种类的真菌；在一个具体的实施例中，本发明的所述微生物是宽脊新萨托菌(N.stramenia)CECT 20472菌株。 
用于鉴定产生莫纳可林J的微生物的方法
在另一个方面，本发明涉及用于鉴定产生莫纳可林J的微生物(作为生物合成的产品)的方法，其包括： 
a)在允许所述菌株和白色念球菌(C.albicans)生长的条件下，在一个接种白色念球菌(Candida albicans)的培养物的平皿中培养微生物的培养物。 
b)分析所述微生物相关的抗真菌性的存在性； 
c)如果所述微生物不显示抗真菌活性或显示低的抗真菌活性，从所述微生物的培养物中收集一个样品，并且分析它来检测和/或定量在所述样品中的莫纳可林J；和 
d)如果所述分析显示莫纳可林J的存在，鉴定所述微生物作为一个产生莫纳可林J的微生物。 
所述方法包括用保藏在允许所述菌株和白色念球菌(C.albicans)生长的条件下的平皿上的白色念球菌(C.albicans)的培养物与微生物的培养物相接触。所述条件为本领域技术人员所熟知；然而，在一个特别的实施例中， 进行试验的所述微生物的培养物是保藏在具有预先用白色念球菌(C.albicans)(例如C.albicans CECT 1002)的培养物接种的培养基的平皿中，所述培养基包含麦芽膏、葡萄糖、mycopeptone和琼脂；然后将所述平皿保持在4℃下1个小时，并且接着在28℃下培养过夜。 
然后为了选择没有或者具有低的抗真菌活性的微生物，通过任何合适常规方法分析所述微生物有关的抗真菌活性的存在性；然而，在一个特别的实施例中，通过白色念球菌(C.albicans)生长抑制环的形成来分析所述微生物有关的抗真菌活性的存在性。为了评估一个微生物是否不显示抗真菌活性或者显示低的抗真菌活性，可适当的比较所述最后的抗真菌活性与阳性对照的抗真菌活性，并且选择相对于对照显示较低的抗真菌活性的那些微生物或那些不显示抗真菌活性的微生物。因此，在一个特别的实施例中，使用用于抗真菌活性的阳性对照，所述对照是接种在接种有C.albicans在允许所述对照的微生物以及C.albicans均生长的情况下的平皿中；虽然实际上可以使用任何产生抗真菌化合物的微生物，在实践中有兴趣使用产生他汀类(例如洛伐他汀)的微生物，因为洛伐他汀的β-羟基酸形式具有抗真菌的性能，并选取显示的抑制环比所述对照组产生抑制环的尺寸小的微生物；在一个具体的实施例中，将土曲霉(Aspergillus terreus)ATCC 20542(实施例1)的菌株用作对照。 
如果所讨论的微生物实际上显示无抗真菌活性或者低抗真菌活性，从所述微生物的培养物中收集一个样品，并且分析来检测和/或来定量所述样品中的莫纳可林J。实际上任何用于检测或者定量莫纳可林J的合适的分析都可以使用；然而，在一个特定实施例中，所述莫纳可林J的检测和定量是通过超高效液相色谱-质谱/质谱联用法(UPLC-PDA-MS/MS)相对于纯模式的莫纳可林J来进行的。其它的相关化合物，例如洛伐他汀或者美伐他汀(实施例1)，可以进行其他的或者非必需的分析。因此，首先通过常规方法提取莫纳可林J，例如，在如实施例1所述的酸性介质(例如盐酸等)中 通过合适溶剂(例如酯，如乙酸乙酯等)提取。 
在一个特定实施例中，所述产生莫纳可林J的微生物是一种微生物，其能够以等于或者大于50mg/L浓度产生并累积莫纳可林J，有利地等于或大于100mg/L，优选地等于或大于250mg/L，更优选地等于或大于500mg/L，再优选地等于或大于750mg/L，和最优选地等于或大于1,000mg/L。 
如果所述分析示出了存在莫纳可林J，则将所述微生物鉴定为一种产生莫纳可林J的微生物。如有必要，所述产生莫纳可林J的微生物的特征通过取决于其性质的合适方法描述，例如通过经典的微生物测定法，分析其属、种或菌株的基因组的特定区域(例如所述核糖体DNA的28S亚基的特定区域，特定的ITS区域等)，通过使用常规的技术，例如聚合酶链式反应(PCR)扩增等。 
根据本发明提供的方法鉴定的产生莫纳可林J的微生物的非限制性说明的例子包括属于曲霉菌属、红曲霉属、青霉菌属和新萨托菌属的菌株。在一个特定实施例中，根据所述方法鉴定的产生莫纳可林J的微生物是宽脊新萨托菌(N.stramenia)CECT 20472菌株，其具有以等于或者大于50mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的能力。 
以下实施例用于说明本发明，但并不认为局限于此。 
实施例1 
能够产生并累积莫纳可林J的微生物的选择
从生长在M2培养基(每公升包含：45g的葡萄糖，2.5g的聚乙二醇P2000，24g的凝块乳和2.5g的酵母抽提物)的平皿中的土壤样品中分离的不同真菌的培养物中提取直径为0.6厘米的块，并且保藏在预先接种白色念珠菌CECT 1002培养物的MA培养基中(每公升包含：20g的麦芽膏，20g的葡萄糖，1g的mycopeptone和10g的琼脂)。将所述平皿在4℃下培养1小时，接着在28℃下过夜培养。通过白色念珠菌生长抑环的形成来测定抗真菌活性的存在。从显示杀菌活性的菌株中选择比对照组Aspergillus terreus  ATCC 20542(产生洛伐他汀的菌株)产生的抑制环小的菌株。 
从已选菌株的平皿中提取直径为0.6厘米的块，将其放入到2mL的埃彭道夫管(Eppendorf tube)中；然后添加1mL酸化的乙酸乙酯(用HCl酸化)，并将该管放置在超声波浴中10分钟。然后12,000rpm离心3分钟，并将上层清液分离到新管中，且在氮气流下干燥。将沉淀物在1mL甲醇中再悬浮，过滤并通过UPLC-PDA-MS/MS相对纯的洛伐他汀、美伐他汀和莫纳可林J的图谱分析。 
通过这些方法，分离到能产生具有杀菌活性的化合物的不同微生物的197个菌株，其中186个菌株示出的抑制环的尺寸小于菌株A.terreus ATCC 20542(对照)。UPLC-PDA-MS/MS分析允许鉴别3种产生洛伐他汀的菌株，2种产生美伐他汀的菌株和1种主要产生莫纳可林J和少量洛伐他汀的菌株。后者通过核糖体DNA(rDNA)的28S亚基的D1/D2区域和位于18S和28S亚基之间的完全ITS(内部转录间隔区)的片段的测序被鉴定为宽脊新萨托菌(Neosartorya stramenia)，其没有任何的类似于保藏在现存数据库中的这些种类的序列。菌株Neosartorya stramenia已经在2008年1月16日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，布尔哈所特，巴伦西亚(西班牙)，登录号为CECT 20742。 
所述微生物的rDNA的28S亚基的D1/D2区域的扩增是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的，使用低聚核苷酸引物，分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。进行PCR的条件如下：(i)96℃ 5分钟；(ii)30次循环(94℃，30秒；60℃，40秒；72℃，1分钟)；最后，(iii)延伸循环72℃10分钟。位于18S和28S亚基之间的完全ITS区域也通过PCR方式扩增，使用低聚核苷酸引物，分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。进行PCR的条件是与所述D1/D2区域的扩增的条件相同。 
实施例2 
通过发酵制备莫纳可林J
使用N.stramenia CECT 20742的孢子悬浮液接种具有动力(Power)培养基的平皿(每公升包含：15g的蔗糖2.5g的细菌蛋白胨，2.5g的乳糖，0.5g的玉米浆，2g的NaCl，1g的NaNO3，26.1g的KCl，0.25g的K2HPO4，0.25g的MgSO4·7H2O，0.03g的KH2PO4，0.005g的FeSO4·7H2O，0.0015g的FeCl3·6H2O和0.0005g的CuSO4·5H2O)，并且在28℃下培养5天。将每个平皿的孢子收集在5mL的20％甘油中，并将其用于接种含有30mL的M2培养基(实施例1)的烧瓶。将烧瓶在28℃下，200rpm搅拌下培养48小时。 
将这些培养物用于接种含有M2培养基的烧瓶，并且在28℃下，200rpm培养2-5天。然后混合液体培养基，获得浓度为70mg/L的含量为310mg的莫纳可林J，通过UPLC-PDA测定，其如下所述进行纯化。将液体培养基在5,000rpm离心10分钟并从液体培养基和菌丝体中分离上层清液。将后者在150mL的水中再悬浮，并进行剧烈搅拌1小时。所述过程重复两次。将滤液和液体培养基的上层清液混合，并且用稀硫酸调节pH至3.5。每次用3x 300毫升的乙酸乙酯在恒定的搅拌下30分钟进行提取。合并的乙酸乙酯提取物用无水硫酸钠干燥并在真空中浓缩直到获得100mL的体积为止。然后通过在室温下和恒定的搅拌下添加三氟乙酸进行内酯化。通过UPLC-MS/MS确定内酯的形成。在完全形成内酯之后，用2x 20mL的5％碳酸氢钠水溶液冲洗，然后用20mL水冲洗，用无水硫酸钠干燥并在真空中蒸发。然后将获得的残留物在40mL的乙酸乙酯和正己烷(20∶80)中再悬浮，并通过直径为1.2厘米和床层高度为20厘米的硅胶柱。通过乙酸乙酯和正己烷的混合物进行洗脱，乙酸乙酯的浓度逐渐增加。将含有莫纳可林J的内酯的馏分从色谱柱洗脱到45％乙酸乙酯和55％正己烷的混合物中。所述馏分被合并并且在真空中蒸发。将获得的残留物溶于10ml的丙酮中并在4℃下保存一夜。将沉淀物过滤，用2mL的丙酮和2mL的正己烷冲洗，在室温下真空中干燥。将获得的莫纳可林J在20mL的甲醇中再悬浮，通过添加10g的 活性碳漂白，并与乙醇-乙酸乙酯的混合物在-20℃结晶。最后，在室温下真空中干燥晶体。 
实施例3 
制备辛伐他汀
将如实施例2中所述制备的N.stramenia CECT 20742的孢子悬浮液用于接种含有25mL的MEB培养基(每公升包含：15g的麦芽膏，1g的细菌蛋白胨和20g的葡萄糖)的烧瓶。将烧瓶在28℃下，250rpm搅拌下培养48小时。将这些培养物用于接种(10％v/v)含有50mL的M2培养基(实施例1)的烧瓶，并且在28℃下，250rpm培养48小时。在这之后，将2，2-二甲基丁酸钠(0.1％)(w/v)添加到保持相同的培养条件的培养物中。所述培养物再生长72-96小时。 
通过从液体培养基中采样的方式检查在发酵液中的辛伐他汀的存在性，所述采样是用乙酸乙酯提取，在真空中浓缩并在通过UPLC.分析前在甲醇中再悬浮。最后，所述发酵液经历实施例2所示的冲洗、提取和纯化的过程。 
实施例4 
制备化学式(I)的化合物，其中R 1 是丙酰基
用生长在实施例3所示的MEB培养基中的接种物接种含有50mL的M2培养基的烧瓶(10％v/v)，并且在28℃下，250rpm培养48小时。此后，将丙酸钠(0.1％)(w/v)添加到保持相同的培养条件的培养物中。所述培养物再生长72-96小时。 
式(I)的化合物的存在，其中R1是丙酰基，在发酵液中的[(1S，3R，7R，8S，8aR)-8-[2-[(2R，4R)-4-羟基-6-氧代-噁(oxan)-2基]乙基]-3，7-二甲基-1，2，3，7，8，8a-六氢萘-1-基]丙酸酯通过从液体培养基采样的方式进行核查，其用乙酸乙酯提取，在真空中浓缩并且在其通过UPLC分析之前在甲醇中再悬浮。最后，所述发酵液经历如实施例2所示的清洗、提取和纯化的过程。 
实施例5 
制备式(I)的化合物，其中R 1 是2，2-二甲基丙酰基
用生长在如实施例3所示的MEB培养基中的接种物接种包含50mL的M2培养基的烧瓶(10％v/v)，并且在28℃下，250rpm培养48小时。此后，将2，2-二甲基丙酸钠(0.1％)(w/v)添加到培养物中，在保持如实施例3所示的相同的培养条件下再培养72-96小时。 
式(I)的化合物的存在，其中R1是2，2-二甲基丙酰基，在发酵液中的[(1S，3R，7R，8S，8aR)-8-[2-[(2R，4R)-4-羟基-6-氧代-噁(oxan)-2基]乙基]-3，7-二甲基-1，2，3，7，8，8a-六氢萘-1-基]-2，2-二甲基丙酸酯通过从液体培养基采样的方式进行核查，其用乙酸乙酯提取，在真空中浓缩并且在其通过UPLC分析之前在甲醇中再悬浮。最后，所述发酵液经历如实施例2所示的清洗、提取和纯化的过程。 
序列表
 
<110>  神经元生物制药股份公司
 
<120> 莫纳可林J衍生物的生物合成
 
<130>  FP11ES1236
 
<150>  ES P200802971
<151>  2008-10-15
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  583
<212>  DNA
<213>  Neosartorya stramenia
 
<400>  1
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gacgctggcc cgcccacggg gaagtacacc ggcacgaatg ccggctgaac cccgcgggcg      180
 
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<210>  2
<211>  595
<212>  DNA
<213>  Neosartorya stramenia
 
<400>  2
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<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  Oligonucleotide primer to amplify the D1/D2 region of
       28S subunit of the rDNA of Neosartorya stramenia
 
<400>  3
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<210>  4
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  Oligonucleotide primer to amplify the D1/D2 region of
       28S subunit of the rDNA of Neosartorya stramenia
 
<400>  4
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<210>  5
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  Oligonucleotide primer to amplify the entire ITS region
       located between the 18S and 28S subunits of Neosartorya stramenia
 
<400>  5
tccgtaggtg aacctgcgg                                                    19
 
 
<210>  6
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<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
 
<220>
<223>  Oligonucleotide primer to amplify the entire ITS region
       located between the 18S and 28S subunits of Neosartorya stramenia
 
<400>  6
tcctccgctt attgatatgc                                                   20

Claims (18)

1.一种获得式(I)的莫纳可林J衍生物的方法
Figure 2009801504347100001DEST_PATH_IMAGE002
(I)
其中 R1是COR2, 其中 R2 选自C1-C15 烷基、C3-C15 环烷基、C2-C15 链烯基、C2-C15 炔基、芳基和杂环；
其包括下列步骤：
a) 通过发酵从一种产生莫纳可林J的微生物制备莫纳可林J；和
b）通过将适合的酰化剂添加到发酵培养基中来酰化存在于步骤a）中获得的莫纳可林J的C8位置的羟基来获得所需式(I)的莫纳可林J衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述产生莫纳可林J的微生物是一种能够产生和累积等于或者大于50mg/L浓度的莫纳可林J的微生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述产生莫纳可林J的微生物是一种属于选自曲霉属、红曲霉属、青霉属和新萨托菌属的微生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述产生莫纳可林J的微生物是N. stramenia。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述产生莫纳可林J的微生物是Neosartorya stramenia CECT 20472的菌株或者所述保持以等于或者大于50mg/L的浓度产生和累积莫纳可林J的能力的微生物的突变体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述酰化试剂是式(II)的化合物
R2COOH         (II)
其中 R2具有预先关于式(I)指明的含义；或者一种它的衍生物选自所述式(II)的羧酸的卤化物、酯、酰胺、酸酐或者盐。
7.根据权利要求1的所述方法，其中所述酰化剂选自丙酸钠、2,2-二甲基丙酸钠、2,2-二甲基丁酸钠和2 -甲基丁酸钠。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述式(I)的莫纳可林J衍生物是式(I)的化合物，其中R1选自丙酰基、2,2-二甲基丙酰基、2-甲基丁酰基（洛伐他汀）和2,2-二甲基丁酰基（辛伐他汀）。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括分离和非必需的纯化获得的式（I）的莫纳可林J衍生物。
10.一种新萨托菌属的微生物，所述微生物具有以等于或者大于50 mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的能力。
11.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于它是一种Neosartorya stramenia种类的微生物，保藏在西班牙典型培养物保藏中心（CECT），具有登录号为CECT 20472，所述微生物具有以等于或者大于50mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的能力，或者一个所述微生物的突变体，其保持了以等于或者大于50mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的能力。
12.根据权利要求10或11所述的微生物的一个生物学上的纯培养物。
13.根据权利要求10或11中任一项所述的微生物来制备根据权利要求1的莫纳可林J或者式(I)的莫纳可林J衍生物的用途。
14.一种用于鉴定产生莫纳可林J的微生物的方法，所述方法包括：
a) 在提供所述菌株和白色念球菌的生长的条件下在接种白色念球菌的培养物的平皿上培养一种微生物的培养物；
b) 分析所述微生物相关的抗真菌活性的存在性；
c) 如果所述微生物不显示抗真菌活性或者显示低的抗真菌活性，从所述的微生物的培养物中采样，并且分析它来检测和/或定量所述样品中的莫纳可林J；并且 
d) 如果所述分析显示存在莫纳可林J，则鉴定所述微生物为一种产生莫纳可林J的微生物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中与所述微生物相关的杀菌活性的存在性通过白色念球菌生长抑制环的形成来进行分析。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其进一步包含使用阳性对照用于抗真菌活性。
17.根据权利要求16所述的方法，其包含选取显示出白色念球菌生长抑制环的尺寸小于所述对照所产生的尺寸的微生物。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所鉴定的产生莫纳可林J的微生物是一种能够以等于或者大于50 mg/L浓度产生和累积莫纳可林J的微生物。
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