CN1798565A - 创伤愈合促进材料 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供用于短时间内有效地浓缩对创伤愈合有效的细胞，使之作为创伤愈合促进材料来应用的装置。本发明提供了由表面上至少存在有白细胞和/或血小板的片状多孔材料所组成的创伤愈合促进材料、其制造方法、其制备装置、和利用上述材料、方法、装置的创伤部位的治疗方法。

Description

创伤愈合促进材料

技术领域

本发明涉及用于促进创伤愈合的创伤愈合促进材料、其制造方法、制备装置和利用上述材料、方法、装置促进创伤部位再生的方法。

背景技术

近年，相继阐明有关创伤愈合的机理，作为其中之一，已知如白细胞、血小板这种血液中的细胞所产生的多种生长因子对组织再生起重要作用。

这里提到的生长因子是指基于复杂的细胞间的网络关系，直接或间接干预从血液凝固、炎症细胞游走直至成纤维细胞增殖、细胞外间质的合成、血管新生和它们的再修复等诸多创伤愈合现象的物质。例如，正在阐明作为衍生于血小板的生长因子之一而被发现的PDGF(血小板衍生生长因子，plate-derived growth factor)对成纤维细胞或平滑肌细胞的游走、促进增殖、单核-中性粒细胞的强效趋化作用、以及其作为成纤维细胞的胶原蛋白、胶原蛋白酶合成促进因子的作用。对此，Pierce等人的小组在兔耳朵上制造深达软骨的创伤并给与PDGF-BB时发现其损伤修复比不给与PDGF-BB的损伤要快的多(J.cellBiochem.1991 45：319-326)。顾名思义在血小板中含有大量的PDGF，此外巨噬细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞等细胞也产生PDGF。作为与创伤愈合有关的生长因子，除PDGF-BB外，还阐明了FGF(成纤维细胞生长因子，fibroblast growth factor)、VEGF(血管内皮细胞生长因子，vascular endothelial growth factor)、TGF-β(转化生长因子，transforming growth factor)、EGF(表皮生长因子，epidermal growth factor)等生长因子，其中的一部分已逐渐应用于临床。

作为创伤愈合的另一种机理，还可以从与血细胞自身的创伤愈合相关这一角度得到几点结论。例如，Kalka等把外周血中的单核细胞在体外进行培养后，将其移植到进行过血管狭窄处理的裸鼠的缺血部位，结果显示细胞移植成功，并重新生成血管，愈合了缺血部位。除了从产生上述生长因子的方面考虑，从其与血管新生直接相关的方面考虑，也让人们期待来自外周血的白细胞的创伤愈合效果(PNAS.200097：3422-3427)。此外，Zhao等人揭示了利用多种生长因子，在体外培养人外周血中的单核细胞组分，使之分化成上皮细胞、血管内皮细胞、肝细胞、以及神经细胞等细胞的方法，这也让人们期待细胞和生长因子的组合将显示更多的创伤愈合效果(PNAS.2003 100：2426-2431)。

创伤愈合时，要给与患者特定的生长因子或细胞，其方法主要分全身给药或局部给药两种。不过全身给药，尤其是给与生长因子时，不同生长因子会在给药量过量的情况下表现出各自的危险性，例如：VEGF导致低血压、bFGF导致肾毒性，所以需要极其慎重地决定给与量。另一方面，人们认为生长因子或细胞的任何一种均适合局部给药，不过在一定时间内于局部保持生长因子浓度很困难。另外，因为在创伤愈合中，细胞间的信息传递属于受到上面例举的多种因子作用的复杂体系，故多数情况下单独使用生长因子的治疗效果不理想，因此认为有必要给与与创伤愈合有关的多种生长因子。此外，作为另一种实现局部给药的方法，可以考虑基因治疗，不过目前尚不能充分地确基因治疗的其安全性。

在这一点上讲，与生长因子相比，特定细胞的局部给药有效性高，所以为此进行各种各样的技术探讨。例如，一种方法用离心分离法从血中浓缩产生生长因子的血小板、向其中加入纤维蛋白原和凝血酶，制造血小板糊，涂抹在创伤部位(Int.J.Artif.Or gans.2002 25(4)：334-8)。不过用该方法制造时存在费时间费工夫，以及糊的机械强度低的问题。在特开2001-204807号公报上，公开了用于增强含有细胞的凝胶的机械强度的、由高分子材料成型物组成的、在骨架内部形成含成纤维细胞等细胞凝胶的医疗器材。不过这是以人工皮肤为主要用途的材料，而白细胞、血小板等不含在该凝胶里，故无法期待其创伤愈合促进效果。此外，凝胶中的细胞是被固定在凝胶内的，所以即使细胞产生某些因子，还存在这些因子要达到创伤部位还需要时间的问题。此外在美国专利第6049026号说明书中，提出了将骨髓中的结缔组织前体细胞付着在基质(substrate)表面作为移植片的试剂盒，其中还记载了为了促进移植片的成长，再向上面付着血小板。不过这些主要是与骨移植片有关的发明，其不是以促进创伤愈合、即不是以促进机体创伤部位的细胞成长为其目的。因此，完全未见到公开有将白细胞附着在移植片的内容。

如上所述，在创伤愈合领域里，人们对有效地利用具有创伤愈合效果的血细胞的创伤愈合促进材料没有认识，期待着这样的技术革新。

发明内容

本发明以上述以往技术存在的问题作为必须解决的课题。即，本发明要解决的课题是提供能短时间内有效地浓缩对创伤愈合有效的细胞，使之作为创伤愈合的促进材料而加以运用的装置。

本发明人等为了解决上述课题刻苦研究，结果发现表面上存有白细胞和/或血小板的片状多孔材料可通过提高成纤维细胞的增殖，使之产生创伤愈合有关的生长因子而促进创伤愈合，最终完成本发明。

即，本发明涉及以下内容。

(1)至少是由表面上存在白细胞和/或血小板的片状多孔材料构成的创伤愈合促进材料。

(2)一种含有片状多孔材料的创伤愈合促进材料，且该材料具有细胞增殖功能。

(3)具有成纤维细胞的增殖功能的(2)中记载的创伤愈合材料。

(4)(3)中记载的创伤愈合促进材料，其中细胞增殖功能来源于片状多孔材料表面上存在的白细胞和/或血小板。

(5)一种含有片状多孔材料的创伤愈合促进材料，且该材料具有生长因子产生的功能。

(6)相对于对照血浆，其中，生长因子产生的功能满足以下任何一项的(5)中记载的创伤愈合材料：其功能为血管内皮生长因子(VEGF)的5倍以上、血小板衍生生长因子-AB(PDGF-AB)的2倍以上、转化生长因子(TGF-β1)的2倍以上。

(7)(6)中记载的创伤愈合促进材料，其中，生长因子产生的功能来源于片状多孔材料表面上存在的白细胞和/或血小板。

(8)(1)～(7)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中片状多孔材料的厚度为0.01～3mm。

(9)(1)～(8)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中片状多孔材料可根据创伤部位的形状而变形。

(10)(9)中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料为无纺布。

(11)(10)中记载的创伤愈合促进材料，其中，无纺布的纤维直径为0.3～50μm、松密度是0.05～0.5g/cm³。

(12)(9)中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料为海绵状结构体。

(13)(12)中记载的创伤愈合促进材料，其中，海绵状结构体的平均孔径为1.0～40μm。

(14)(1)～(13)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料的材质是天然高分子或者是合成高分子。

(15)(14)中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料的材质为以疏水性高分子为主要成分的合成高分子。

(16)(13)或(14)中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料的材质为生物可分解材料。

(17)(1)～(16)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中，白细胞和/或血小板是来源于外周血、骨髓液或者是脐带血。

(18)(1)～(16)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中，白细胞和/或血小板为成熟细胞。

(19)(17)或(18)中记载的创伤愈合促进材料，其中，白细胞和/或血小板来源于自体。

(20)(1)～(19)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中，在片状多孔材料上的白细胞密度为6.0×10⁶个/cm³以上和/或血小板密度为2.5×10⁸个/cm³以上。

(21)(1)～(20)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料中整合有成纤维细胞。

(22)(21)中记载的创伤愈合促进材料，其中，成纤维细胞为来自与创伤组织相同组织的成纤维细胞。

(23)(1)～(22)中任一项记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料含有纤维蛋白。

(24)一种创伤愈合促进材料的制造方法，其中，包括在片状多孔材料上至少捕获白细胞和/或血小板的工序。

(25)(24)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料的厚度为0.01～3mm。

(26)(24)或(25)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料为无纺布。

(27)(26)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中无纺布的纤维直径为0.3～50μm、松密度为0.05～0.5g/cm³。

(28)(24)或(25)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料为海绵状结构体。

(29)(28)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，海绵状结构体的平均孔径为1.0～40μm。

(30)(24)～(29)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料具有血液细胞的选择分离性。

(31)(30)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料的表面具有血液细胞的选择分离性。

(32)(31)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对红细胞，片状多孔材料选择性地捕获白细胞和/或血小板。

(33)(32)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料对白细胞的捕获率为50％以上和/或对血小板的捕获率为50％以上。

(34)(24)～(33)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，至少通过过滤含白细胞和/或血小板的细胞悬浮液来向片状多孔材料上捕获白细胞和/或血小板。

(35)(34)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤是经过一次性通过(one through)进行的。

(36)(35)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液的过滤量不足400ml。

(37)(35)～(37)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于片状多孔材料的有效过滤面积，过滤液量的比不足10ml/cm²。

(38)(35)～(37)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，对于片状多孔材料容积过滤液量的比不足100。

(39)(35)～(38)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于片状多孔材料，使细胞悬浮液一次性过滤。

(40)(35)～(40)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于片状多孔材料，细胞悬浮液的过滤方向为单一方向。

(41)(35)～(40)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤时间在20分钟以内。

(42)(34)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，由体外循环进行过滤。

(43)(42)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤流速为20～200ml/min。

(44)(42)或(43)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤时间为10～300分钟。

(45)(24)～(44)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液为新鲜血。

(46)(45)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液为采血后48小时以内的新鲜血。

(47)(24)～(46)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液主要含有成熟细胞。

(48)(24)～(47)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液来源于自身血液。

(49)(24)～(48)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液中含有作为抗凝剂的柠檬酸、肝素类或水解酶抑制剂中的任何一种。

(50)(24)～(49)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，至少还含有培养捕获有白细胞和/或血小板的片状多孔材料的工序。

(51)(50)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，在培养时添加细胞活化材料。

(52)(24)～(51)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，还含有在片状多孔材料中整合成纤维细胞的工序。

(53)(52)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，使成纤维细胞接触片状多孔材料，或将成纤维细胞混合到细胞悬浮液中后通过过滤使之整合。

(54)(53)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，成纤维细胞为来自于与创伤组织相同组织的成纤维细胞。

(55)(24)～(54)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，还包括使片状多孔材料含有纤维蛋白的工序。

(56)(55)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，纤维蛋白来源于制剂。

(57)(56)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，纤维蛋白只通过回收用片状多孔材料过滤细胞悬浮液时排出的液体，对其进行浓缩所获得的。

(58)(24)～(57)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，至少还含有在捕获白细胞和/或血小板后洗涤片状多孔材料的工序。

(59)(24)～(58)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，至少在附有液体入口和出口的可开放液密容器中进行向片状多孔材料上捕获白细胞和/或血小板的工序和/或洗涤该片状多孔材料的工序。

(60)(59)中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，还含有从可开放液密容器中取出片状多孔材料进行保存的工序。

(61)可由(24)～(60)中任何一种记载的创伤愈合促进材料的制造方法获得的创伤愈合促进材料。

(62)一种创伤愈合促进材料的制备装置，其将片状多孔材料安装成一方通向入口侧、另一方通向出口侧，把附有用于液体注入和排出的入口和出口的可开放液密容器内部隔绝成两室。

(63)(62)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为将片状多孔材料夹持在到可挠性树脂板中并溶合或粘合的软质装置，且可剥开可挠性树脂板部来露出或取出内部的片状多孔材料。

(64)(63)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为平板状。

(65)(62)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为配备有固定装置的硬质装置，且可通过解除该固定装置来露出或取出内部的片状多孔材料。

(66)(65)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为圆筒状。

(67)(66)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中装有卷成布匹状收容的片状多孔材料。

(68)(62)～(67)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料的厚度为0.01～3mm。

(69)(62)～(68)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料为无纺布。

(70)(69)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，无纺布的纤维直径为0.3～50μm、松密度为0.05～0.5g/cm³。

(71)(62)～(68)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料为海绵状结构体。

(72)(71)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，海绵状结构体平均孔径为1.0～40μm。

(73)(62)～(72)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料具有血液细胞的选择分离性。

(74)(73)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料的表面具有血液细胞的选择分离性。

(75)(74)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，与红细胞相比，片状多孔材料选择性地捕获白细胞和/或血小板。

(76)(75)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料对白细胞的捕获率为50％以上和/或对血小板的捕获率为50％以上。

(77)(62)～(76)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其配备有能够在容器入口侧和/或出口侧连接袋子的连接部件。

(78)(77)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其在容器的入口侧配备有采血袋和/或出口侧配备有离心袋。

(79)(62)～(76)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其在容器的入口侧和出口侧配备有体外循环回路。

(80)(62)～(79)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其用灭菌袋包装进行了灭菌。

(81)(77)中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其使容器的入口出口与外界连通性进行包装、装置整体被包装入灭菌袋进行灭菌。

(82)可用(62)～(81)中任一项记载的创伤愈合促进材料的制备装置获得的创伤愈合促进材料。

(83)一种治疗创伤部位的方法，其在创伤部位贴附(1)～(23)、(61)和(82)中任一项记载的创伤愈合促进材料。

(84)(83)中记载的治疗创伤部位的方法，其中，开放容器，以从容器中露出片状多孔材料一面的状态进行贴附。

(85)(84)中记载的治疗创伤部位的方法，其从容器中取出片状多孔材料进行贴附。

(86)(83)～(85)中任一项记载的创伤部位的治疗方法，其在制备创伤愈合促进材料后30分钟之内贴附到创伤部位。

(87)(83)～(86)中任一项记载的治疗创伤部位的方法，其中，创伤为体表创伤。

(88)(83)～(87)中任一项记载的治疗创伤部位的方法，其中，用保护材料被覆固定所贴附的创伤愈合促进材料。

(89)(88)中记载的治疗创伤部位的方法，其中，保护材料是由不具有透水性的原料构成的片。

(90)(89)中记载的治疗创伤部位的方法，其中，保护材料是由具有气体通透性而且不具有透水性的原料构成的片。

附图说明

图1表示用本发明的创伤愈合促进材料治疗创伤部位的方法。图1A表示以从容器中露出片状多孔材料一面的状态进行贴附的方法，图1B表示从容器中取出片状多孔材料后进行贴附的方法。

具体实施方式

下面，对本发明的实施形式作详细的说明。

用于本发明的片状多孔材料是多边形或盘状的片状材料，该材料是一种通过所具有细小孔隙或者纤维间隙等多孔部可以在多孔部表面通过吸附或过滤来捕获细胞的多孔材料。通常，创伤部位表面不限定为平面，大多伴有凹凸不平的情况，因为为了发挥更高的创伤愈合效果，使片状多孔材料与创伤部位的形状吻合且与之紧密贴附会很有效。因此，该片状多孔材料优选具有可根据创伤部位的形状变形的柔软性，据此比如即使是达数厘米大小的创伤部位也可以无缝隙地用一张片子加以覆盖。

另外，本发明使用的片状多孔材料是可从血液等细胞悬浮液中至少能捕获白细胞和/或血小板等血细胞的材料，优选具有过滤层功能。即，最好具有接触细胞悬浮液或使之通过时，至少捕获白细胞和/或血小板这种血细胞或生长因子、而不捕获液体部分的分离功能。这里不仅包括大小分离还包括基于相对材料表面的细胞亲和性(吸附性等)的分离。

片状多孔材料优选具有能多捕获特定的血细胞的选择分离性。该选择分离性可以通过适当选择多孔材料的原料或形状来实现，如下面所述，也可以通过多孔材料的表面处理来控制更高的选择性。关于本发明的创伤愈合促进材料，比如从生长因子的产生和分泌作用优良的角度出发，特别优选与红细胞相比，可以选择性地捕获白细胞和/或血小板的片状多孔材料。此时，捕获率越高越能从更少量的细胞悬浮液中获得目的物质，因此优选白细胞和/或血小板的捕获率任一项超过50％。

作为片状多孔材料的形态，可列举无纺布、织布、海绵状结构体、塞进粒子片状口袋等。其中，在有目的地把白细胞或血小板作为捕获对象的时候，从去除效率的观点出发，更优选无纺布或海绵状结构体。

本说明书里所说的无纺布是指不对一层以上的纤维块进行编织而做成的布状结构的物品。作为纤维的原料，可采用合成纤维、天然纤维、无机纤维等。其中，以疏水性高分子为主要成分的合成纤维，如聚对苯二甲酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二酯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯腈等纤维，因其对细胞的粘附性高而优选被采用。

片状多孔材料为无纺布时，纤维平均直径优选0.3μm以上，不足50.0μm、更优选0.5μm以上40.0μm以下、进一步优选0.7μm以上35.0μm以下、还优选1.0μm以上20.0μm以下、尤其优选1.0μm以上9.0μm以下。平均直径如果小于0.3μm，则血细胞悬浮液或血液流经无纺布时流动性差，导致装置内的压力损失增高。另外，如果平均直径大于50.0μm，则白细胞和/或血小板的捕获率降低。而白细胞和/或血小板的捕获率一旦降低，会导致捕获到片状多孔材料内的细胞间的间距离变大，所以为了使如前所述的产生的生长因子更有效的发挥功能，纤维平均直径优选为上述范围。

可以通过比如拍取构成无纺布的纤维的扫描电子显微镜照片，测定随机选择的100个以上的纤维直径，将其数学平均的方法获得用于本发明的、构成无纺布的纤维平均直径。

用于本发明的无纺布的松密度，优选从0.05g/cm³到0.5g/cm³、更优选从0.07g/cm³到0.4g/cm³、还优选0.1g/cm³到0.3g/cm³。如果松密度大于0.5g/cm³，血细胞悬浮液或血液流经无纺布时流动性变差而增高压力损失。另外、当松密度小于0.5g/cm³时，细胞的捕获率变差的同时，按照上述的方法捕获的细胞间的距离变大。因此，为了使如前所述的产生的生长因子更有效的发挥功能，纤维松密度优选上述范围。

另外，本发明中提到的海绵状结构体是指具有三维网眼状连续组织的结构体，而其三维网眼状连续组织具有连续开放气孔。对海绵状结构体的材质没有特别的限定，优选使用对细胞的粘附性高的纤维素或其衍生物等天然高分子、或以疏水性高分子为主要成分的聚烯烃、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、聚酯、聚砜、聚丙烯腈、聚醚砜、聚(甲基)丙烯酸酯、丁二烯-丙烯腈共聚物、乙烯-乙烯醇共聚物、聚乙烯醇缩醛或它们的混合物等高分子材料。

海绵状结构体平均孔径优选1.0μm以上40μm以下，更优选2.0μm以上35μm以下，进一步优选3.0μm以上30μm以下。如果平均直径小于1.0μm，则血细胞悬浮液或血液流经海绵状结构体时血液的流动性变差而加大装置内的压力损失。另外，如果平均直径大于40μm，则白细胞捕获率变差。还有，海绵状结构体的平均孔径变大，其结果会导致捕获在过滤层内的细胞间的距离变大，所以为了使如前所述的产生的生长因子更有效的发挥功能，海绵状结构体的平均孔径优选为上述范围。

本发明中提到的海绵状结构体的平均孔径是指由水银压入法测得的值。通过由水银压入法(比如：岛津制作所、ポアサイザ9320)的测定，用纵轴表示微孔容量的微分值，横轴表示取孔径绘出的图，取其最峰对应的点(最大值)作为平均孔径。此外，作为由水银压入法测定的值，采用在1～2650psia的压力范围内测定的值。

为提高创伤愈合效果，用于本发明的片状多孔材料的厚度为从0.01mm到3.0mm，优选从0.05mm到2.5mm，更优选从0.1mm到2.0mm。若片状多孔材料的厚度大于3.0mm，则给向创伤部位上的固定带来困难的同时，使白细胞或血小板所产生的生长因子难以到达创伤部位。另外，如果片状多孔材料的厚度小于0.01mm，则机械强度变弱。细胞间的效果在两种情况下得到增强，一种是细胞产生的生长因子作用于其细胞本身(自分泌，autocrine)，再有一种情况是使之更强地发挥作用，与由周边细胞产生并扩散的生长因子一起发挥作用(旁分泌，paracrine)。因此，为了使生长因子更有效的发挥功能，则希望细胞之间的距离尽可能的接近，因此希望过滤层的厚度在上面所述的范围内。还有，可以使用一张具有上述厚度的片状多孔材料，也可以将厚度薄的2张以上重叠使用。

再者，为了使片状多孔材料表面能够仅对捕获靶物质做选择性吸附捕获，也可以在其表面上做特定高分子的包被或者移植处理等。例如，也可以按照包被或固定有聚合体(众所周知的易吸附血细胞而难以吸附血小板的聚合体)的片状多孔材料和易吸附血小板的片状多孔材料的顺序处理血液或血细胞悬浮液，制造更加选择性地吸附血小板的片状多孔材料。作为这样的聚合体的例子，可以参考例如WO87/05812号小册子、WO03/011924号小册子或者是WO03/047655号小册子等。还有，也可以包被或固定能够更加选择性地吸附血细胞或血浆蛋白等特定成份的配体。

在片状多孔材料上也可使用具有生物分解性的原料。作为生物吸收性的原料，可列举聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸和乙醇酸共聚物、聚苹果酸、聚-ε-己内酯等聚酯或纤维素、聚褐藻酸、角素、壳聚糖等多糖类。通过利用这些原料，可以得到生物体适用性更高的创伤愈合促进材料。

对于本发明的创伤愈合促进材料，有必要在上述片状多孔材料表面上至少存在有白细胞和/或血小板。对于血细胞的存在量(密度)没有特别的限定，不过为了进一步提高作为创伤愈合促进材料的效果，优选至少把一定容积的多孔材料中的血细胞密度浓缩至血液中浓度水平以上。还有，上述细胞间相互作用(旁分泌)的角度出发，存在细胞密度过低则生长因子产生低下的担忧，所以有效的方法是提高细胞密度、缩短细胞间距离。根据这些理由，优选在片状多孔材料的表面上存在的白细胞密度为6.0×10⁶个/cm³以上和/或血小板密度为2.5×10⁸个/cm³以上。另一方面，虽然有血细胞密度越高其创伤愈合效果越高的倾向，不过比如仅通过过滤操作调整的时候，存在因堵塞而导致处理时间增加或多孔材料闭塞的担忧，所以优选使白细胞密度的上限为6.0×10⁸个/cm³以下、血小板密度的上限为1.0×10¹⁰个/cm³以下。

存在于上述表面的血细胞为来自外周血、骨髓和脐带血的人血细胞，从免疫排斥或防止感染等原因出发，优选来自接受创伤愈合的患者自身的血液(自体血)或来自人白细胞抗原(HLA)配型相近的血液(同种血)。

用于使这些血细胞捕获到片状多孔材料表面据此制备创伤愈合促进材料的细胞悬浮液，至少是含有白细胞和/或血小板的悬浮液，也可以是原始状态的外周血、骨髓、脐带血，也可以是全血制剂或分离出的成分制剂、或者是预先去除特定细胞组分的细胞悬浮液。这些悬浮液也可以含有常规作为抗凝剂的柠檬酸盐、肝素、低分子肝素、类肝素等肝素类、或者是甲磺酸萘莫司他(FUT)、FOY、Argatroban等水解酶抑制剂。还有，细胞悬浮液优选是新鲜状态的，更优选是从机体中取出后直至用片状多孔材料过滤细胞悬浮液的时间在48小时以内的。

作为使之存在于片状多孔材料表面的血细胞，不仅希望含有干细胞或前体细胞这种未成熟的细胞，还含有很多成熟白细胞或成熟血小板这种成熟的细胞。这是因为血液中或创伤组织中少量含有的干细胞或前体细胞在增殖分化使创伤组织再生的时候，并不是单独进行组织再生，而是在与成熟细胞共存的网络中反复地进行最适于创伤愈合的增殖分化，实现组织再生。

本发明的创伤愈合促进材料中可以整合成纤维细胞。可以将成纤维细胞与血液细胞悬浮液分别通过与片状多孔材料接触的方法整合其中，也可以预先将成纤维细胞与含血细胞的细胞悬浮液混合后，使之与片状多孔材料接触。还有，也可以单独把成纤维细胞先用别的材料(过滤层)吸附后，再与已吸附有血细胞的片状多孔材料组合。整合的成纤维细胞尤其优选与含在创伤部位的成纤维细胞相同者，据此可促进创伤部位的愈合。

本发明的创伤愈合促进材料也可以在其制造过中进行培养。对培养液没有特别的限定，使用常规用于细胞培养的培养基即可。也可以另外添加活化血细胞的因子进行培养。例如，可以通过加入凝血酶等血小板活化剂进行培养，据此可提高局部生长因子的浓度。

本发明的创伤愈合促进材料里也可还含有纤维蛋白。对用于制造纤维蛋白的纤维蛋白原溶液没有特别的限定，可以使用市场上销售的制剂。还有，利用血液作为血细胞悬浮液的时候，也可以从片状多孔材料中回收作为排出液的液体并离心，对此进行浓缩后利用。还有，含有成纤维细胞的时候，细胞既可以是预先包埋在纤维蛋白里的形态，也可以在后来将细胞接种到纤维蛋白上。通过含纤维蛋白不不过使在创伤部位固定创伤愈合促进材料变得容易，而且包括纤维蛋白原在内的其他生长因子可使促进创伤愈合的效果进一步提高。

在制造本发明的创伤愈合促进材料时，需要使上述的片状多孔材料表面捕获到至少含在细胞悬浮液中的白细胞和/或血小板。在该捕获工序中，例如，扩展开片状多孔材料直接滴下细胞悬浮液进行过滤，将所利用的实验装置固定在适当的过滤固定器上过滤细胞悬浮液(例如：可参照图1B)、或者也可以安装在可开放性液密容器(在后面的系统说明中叙述)上过滤(例如：可参照图1A和1B)。后两种情况，既可以自由落下，也可以利用泵或注射器等强制性地过滤。还有，不单纯是过滤，如果并用使细胞悬浮液接触的状态维持一定时间等操作，也可提高血细胞表面捕获率。

在过滤操作中，尤其是进行多次断续的过滤操作，则过滤的剪切应力使细胞活化，生长因子流失到最终排出的血浆中，这一点让人担忧。因此，优选一次性滤过细胞悬浮液，这样做的优点是准备或操作方便而且处理时间短。还有，细胞悬浮液的过滤方向优选为一个方向。这是因为由于某种原因，片状多孔材料中未能捕获到充足密度的白细胞和/或血小板的时候，会使片状多孔材料的两面的细胞密度不同，且过滤入口侧的细胞密度变高，而在这样的情况下，可以通过把过滤入口侧的一面紧贴在创伤部位能更有效地发挥所捕获细胞的创伤愈合促进效果。或者，可有意识地使密度不均来实现这样的作用。

当一次性滤过时，也可以像在输血中除去白细胞的操作那样处理大量细胞悬浮液(每单位相当于400ml以上)，不过因为进行过滤的量越少越能缩短处理时间，所以例如需要平行于创伤处理进行准备的时候极其有用。因此，优选细胞悬浮液的过滤量不足400ml，还有，使过滤量和对应的片状多孔材料有效过滤面积之比不足10ml/cm²、或者使过滤液量和对应的片状多孔材料容积之比不足100也可缩短过滤时间，因此优选。

另一方面，如果利用可开放液密容器，也易于通过体外循环过滤。这种情况下，虽然处理时间变得比较长，不过它具有连续地循环大量的血液、持续过滤，使片状多孔材料上的血细胞密度变高的优点。还有，如在后面对系统说明中所述，将片状多孔材料卷在布匹上并组装到圆筒状容器中，因为容易确保1～2m²的过滤面积，可由大量血液中获得极其大面积的创伤愈合促进材料。此时，体外循环的过滤速度优选为20～200mL/min、过滤时间优选为10～300分钟。通过体外循环进行过滤的时候，优选过滤流速为20～200mL/分钟。更优选为25～150mL/分钟、还更优选为30～120mL/分钟.如果过滤流速低于此，则根据抗凝剂的类型，在实施体外循环时血液易凝固，且体外循环时间长增加了患者的负担。还有，过滤流速高于此，根据患者血管状态的不同，有时采血困难，而且施加在片状多孔材料的负荷变高，这容易引起促进血液凝固的情况。还有，作为体外循环的过滤时间，优选10分～300分钟，更优选20分钟～250分钟，还更优选式30分钟～200分钟。如体外循环的过滤时间比这短，可能不能捕获充足的细胞，反之体外循环的过滤时间比这长，则增大了带给患者的负担。

根据以上的工序，可获得在片状多孔材料的表面上至少存在有白细胞和/或血小板的本发明的创伤愈合促进材料，在该制造调整方法中还可以包括洗涤工序。可以将生理性水溶液(例如磷酸缓冲液或生理盐水等)实施与细胞悬浮液的过滤操作同样的操作进行洗涤。通过洗涤，可除去创伤愈合中不需要的细胞或残留血液等。关于洗涤后的创伤愈合促进材料，或者以附在固定器(holder)或容器的状态、或者以取出的状态，只要使之不干燥同时无菌地保存即可，对其方法不做任何限定。

本发明还涉及一种装置，该装置用于制造本发明的创伤愈合促进材料。它是一种可开放液密容器且为了液体的注入和排出而装有入口和出口，并把容器内部隔绝成两室、将片状多孔材料配置成一方通向入口侧、另一方通向出口侧的创伤愈合促进材料的制备装置。

在本发明中，装有用于液体的注入和排出的入口和出口的液密容器是指装有注入和排出细胞悬浮液或使之进行体外循环的入口和出口的容器。例如，具有众所周知的平板状白细胞去除过滤装置(可以参照例如WO01/091880号小册)或众所周知的圆筒状白细胞去除模具(可以参照例如WO99/058172号小册)的外形，其内部构造也跟这些相同，用滤材(本发明中所说的片状多孔材料)把容器内部隔成不让过滤前后的液体混合的两室，将滤材配置成一方通向入口侧，另一方通向出口侧。

对用于本发明的装置的容器形状没有特别的限定，只要是易装纳片状多孔材料、液密、细胞悬浮液容易流过片状多孔材料的形状即可。不过，如果要原本不动地装有片状多孔材料，优选平板型，如果做成布匹状装取，则圆筒形容易装纳。而且，也可以将可挠性材料用于平板型容器中，通过把平板型容器整体卷成布匹状，做成更紧密的状态。

所述的可开放指的是可以方便地从上述容器中取出已捕获血细胞的片状多孔材料、或者可以容易地把血细胞捕获面的一部分露出来的容器结构，这是本装置的必要结构。例如，可列举容器本身具有螺式、打包式、磨合式等固定装置的、或者做成可以强制剥开的粘合式的结构。更具体而言，当为平板状容器的情况下，优选熔接或密合了装有液体入口的可挠性树脂片容器和装有液体出口的可挠性树脂片容器的周边部，使之能够夹进片状多孔材料的软质装置。当为圆筒状容器的情况下，优选向筒状躯干部(其装有做成布匹状的片状多孔材料)的两端固定下述两个部分的硬质装置：一是液体入口和附有上述固定装置的头部(header)、二是液体出口和附有固定装置的头部的硬质装置。关于前者，例如：如图1A所显示，露出已捕获血细胞(来自所熔接或密合的板上)的片状多孔材料的一部分，在贴到创伤部位的时候非常方便，而关于后者，虽然作为整体很小型，不过由于可确保大的过滤面积而适合于由体外循环进行制造，所以其适合用于获得大面积或大量的创伤愈合促进材料。

此外，如果能够从上述的容器中方便地取出已捕获了血细胞的片状多孔材料，或可以容易地露出血细胞捕获面的一部分，也可以没有像上述的可开放装置，而容器整体或一部分也可以由可轻易从外侧破坏的材料或结构构成。此外，也可以恰当选择利用市场上销售的平板状或圆筒状的白细胞去除过滤器。

在本发明的创伤愈合促进材料的制备装置上，为了使细胞悬浮液无菌地流过，可以在容器入口侧连接附有穿刺针的管，该用于连接采血袋。也可以单取出管用无菌连接器进行连接。还有，为了使利用排出液制造血浆或血清的工作变得容易，可在容器出口侧连接用于离心的袋子。而且，可以连接血液泵或者具备导血部和反血部等的通常的体外循环回路。

在用灭菌袋包装本发明的创伤愈合促进材料的制备装置的时候，将装片状多孔材料的容器包装到灭菌袋中，再把装置整体用别的灭菌袋包装也可以。通过这么做，可以保持容器和多孔材料在流过细胞悬浮液后到把多孔材料实际贴在创伤部位期间无菌，显著提高取用性。

而且本发明还涉及向创伤部位贴附本发明的创伤愈合促进材料的治疗创伤部位的方法。

采用本发明的创伤愈合促进材料的治疗创伤部位的方法可列举：从容器中取出片状多孔材料并贴附的方法(图1B)，或使容器中露出片状多孔材料的一面的状态贴附的方法(图1A)。关于前者，因露出面的反面被容器所覆盖，所以片状多孔材料的无菌性更优异，而且也可以防止多孔材料的干燥。鉴于这些理由，前者尤其在向体表面上的适用性方面很优异。

还有，关于本发明的治疗方法，也可以用保护材料覆盖固定贴附于创伤部位的创伤愈合促进材料的表面。此时，治疗部位，尤其是为了防止创伤愈合促进材料表面干燥，优选用不具有透水性的原材料构成的保护材料。还有，如果是具有气体通透性而不具有透湿性的原料，则因对血细胞的氧气供应变得容易，更长时间维持血细胞的活性而尤其优选。可利用通常用在创伤治疗愈合中的保护材料作为这些保护材料。

以下用实施例更具体地对该发明进行说明，不过本发明不仅限于

实施例。

实施例

[实施例1]：创伤愈合促进材料的制备(人血液)

用以下方法制造了在表面含有血细胞的片状多孔材料。把CPD(citrate-phosphate-dextrose)作为抗凝剂从健康志愿者中，采取外周血(血液∶CPD＝400∶56、白细胞数：5100个/μL、血小板数：14.4×10⁴个/μL)。在由聚乙二醇对苯二甲酸酯制成的无纺布(旭化成株式会社、平均纤维直径2.6μm、厚度0.38mm、松密度0.27g/cm³)上打取直径25mm的布片，并把布片2张重叠，固定在柱子(Advantech公司、型号PP-25)上、再向柱子流过5ml外周血。紧接着血液流过后，向柱子流过10mL磷酸缓冲液进行洗涤，得到了含有片状多孔材料(表面附有血细胞)的创伤愈合促进材料。

分别施行2次上述操作，不过处理所需时间每次均在10分钟以内。

用血细胞计数板测定处理前后的血液中含有的白细胞、血小板。

无纺布过滤层的白细胞和血小板的捕获率如表1所示。

[表1]

	白细胞捕获率	血小板捕获率
			第一次	74.5％	83.3％
第二次	68.6％	67.4％

[实施例2]：创伤愈合促进材料的制备(人血液)

用以下方法制造表面含有血细胞的片状多孔材料。把肝素作为抗凝剂，从健康志愿者中采取了外周血(血液∶肝素＝100∶1、白细胞数：3800个/μL、血小板数：22.5×10⁴个/μL)。在由聚乙二醇对苯二甲酸酯制成的无纺布(旭化成株式会社、平均纤维直径1.1μm、厚度0.24mm、松密度0.17g/cm³)上打取直径25mm的片，并将其2张重叠，固定在柱子(Advantech公司、型号PP-25)上、再向柱子流过5mL外周血。紧接着血液流过后，向柱子流过10mL磷酸缓冲液进行洗涤，得到由表面附有血细胞的片状多孔材料所构成的创伤愈合促进材料。

分别施行上述操作2次，不过处理所需时间每次均在10分钟以内。

用血细胞计数板测定处理前后的血液中含有的白细胞、血小板。无纺布过滤层的白细胞和血小板的捕获率如表2所示。

[表2]

	白细胞捕获率	血小板捕获率
			第一次	74.7％	72.8％
第二次	81.8％	54.7％

[实施例3]：创伤愈合促进材料的制备(小鼠血液)

用以下方法制造表面含有血细胞的片状多孔材料。

把肝素作为抗凝剂，从2型糖尿病模型小鼠(C57BL/KsJ-db/db Jct，日本クレア(株))中采取外周血(白细胞数：5200个/μL、血液∶肝素＝100∶1)。在由聚乳酸制成的无纺布(旭化成株式会社、平均纤维直径1.14μm、厚度0.20mm、松密度0.20g/cm³)上打取直径13mm的片，并将其3张重叠，固定在5ml注射器(Terumo公司制造)上，再向其流过200uL小鼠外周血。紧接着血液流过后，流过200ul磷酸缓冲液进行洗涤，得到了由表面附有血细胞的片状多孔材料所构成的创伤愈合促进材料。

分别施行上述操作2次，不过处理所需时间每次均在2分钟以内。

用血细胞计数板测定处理前后的血液中含有的白细胞。

无纺布过滤层的白细胞的捕获率如表3所示。

[表3]

	白细胞捕获率
		第一次	68.9％
第二次	66.3％
		第三次	57.5％

[试验例1]：成纤维细胞增值率的测定

将实施例1中制造的表面附有血细胞的无纺布创伤愈合促进材料与成纤维细胞共同培养，对成纤维细胞的增殖率进行研究。

作为培养容器，采用了具有被内置的3μm孔径的膜分隔的多孔培养板(コ-ニング社、Transwell 3452)。

在被内置膜分隔的上侧，装入2张在实施例1中制备的经过血液处理的无纺布(即表面上附有血细胞的本发明的创伤愈合促进材料)，下侧接种来自人胎儿肺的正常二倍体成纤维细胞株(HEL、humanembryonic lung fibroblast)，使细胞的接种密度为1×10⁵/孔。

向Basal Medium Eagle(Sigma社、B1522)中按制造商所指示的那样，添加丙酮酸钠(ICN社)使之达1mM、添加100倍浓缩的非必需氨基酸(ICN社、Cat.#1681049)至使之稀释100倍、还添加谷氨酰胺使之达2mM。向其中再添加胎牛血清(FCS、StemCell Technologies社)使之终浓度达10％，作为抗生素添加青霉素和链霉素，制备培养液。使培养液容量为4ml/孔。

还有，作为对照，进行了未作血液处理的无纺布和HEL的共同培养。

将上述的培养物在5％CO₂、37℃的培养箱中培养4天后，测定成纤维细胞的数量。结果如表4所示。用0.25％Trypsin/EDTA液(Gibco公司)回收成纤维细胞。

[表4]

	经血液处理过的无纺布	单纯无纺布
			细胞数	5.0×105个/孔	2.0×105个/孔

如表4所示，证实了与使用未进行血液处理的无纺布的情况相比，通过使用实施例1中制备的经血液处理的无纺布所制成的本发明的创伤愈合促进材料使成纤维细胞增值率变高。

[试验例2]：从创伤愈合促进材料产生生长因子

用培养液培养由实施例2中制作表面有血细胞的无纺布创伤愈合促进材料，研究由附着的细胞产生的各种生长因子的浓度。

采用直径为35mm的培养皿作为培养容器(旭化成株式会社)。

加入2张在实施例2中经血液处理的无纺布(即表面上附有血细胞的本发明的创伤愈合促进材料)。

向市场上销售的培养液Dulbecco’s Modified Eagle Medium(D-MEM、Gibco公司)中添加胎牛血清(FCS、Gibco公司)使之终浓度达2％，作为抗生素添加庆大霉素，制备培养基。培养液容量为2mL。

将上述的培养物在5％CO₂、37℃的培养箱中培养48小时之后，回收培养上清，并测定作为创伤愈合有关的生长因子VEGF、PDGF-AB、以及TGF-β1的浓度。浓度测定采用了市场上销售的ELISA试剂盒(R&DSystem社)。

作为比较对照，采用了对培养前的培养液和离心经无纺布过滤后回收的血液制备得到的血浆。结果如表5所示。

[表5]

	VEGFpg/ml	PDGF-ABpg/ml	TGF-β1pg/ml
				第一次	635	15.1	24.5
第二次	452	10.6	23.7
				培养前的培养液	0	0	0.7
血浆(第一次)	22	0.3	6.3
				血浆(第二次)	30	0.2	6.4

如表5所示，可知与培养前的培养液和血浆相比，将表面上有血细胞的无纺布培养72小时后的培养液上清中，产生了很多生长因子。

[试验例3]：使用动物模型，如下进行创伤愈合效果的确认。

在全身麻醉下，剃掉2型糖尿病模型鼠(C57BL/KsJ-db/db Jct，日本クレア(株))的背部的毛后，利用活体组织检查用6mmΦ的凿孔器(カイインダストリ-ズ社、BP-60F)进行全皮层缺损处理。每个实验鼠做3个全皮层缺损处理。

接着，在3个全皮层缺损部位分别做如下处理：其中一个贴附实施例3中经血液处理的由聚乳酸制成的无纺布(即表面上吸附血细胞的本发明的创伤愈合促进材料)，另一个贴附未作血液处理的由聚乳酸制成的无纺布，第三个作为比较对照，未作任何贴附。并且再用由聚氨酯制成的创伤被覆材料(テガダ-ム、3M社)对其进行固定。在比较对照部位上，只贴附了由聚氨酯制成的创伤被覆材料。

2周后，剥开聚氨酯板和创伤愈合促进材料，并测定伤口的大小。

用数码相机同时测定创伤部位和尺寸，通过把得到的图像用图像分析软件ImageJ(the National Institutes of Health)进行分析，算出了伤口面积。表6中，把刚做全皮层缺损处理后的创伤部位面积定为100，算出2周后的面积，比较其愈合程度。

[表6]

	小鼠1	小鼠2	小鼠3	平均
					经血液处理的无纺布	22％	3％	0％	8.5％
无纺布	63％	132％	294％	162.9％
					未处理	92％	38％	52％	60.6％

如表6所示，贴附了经血液处理的无纺布的部位的愈合率有意义地比其他愈合程度高。贴附了由聚乳酸制成的无纺布的部位发现炎症，创伤反而比刚进行处理之后有扩大的倾向。

产业上的可利用性

根据本发明，可通过简便的操作在短时间内制造浓缩了血细胞的创伤愈合促进材料。由于本发明的创伤愈合促进材料具有促进细胞增殖的效果，所以通过利用本发明的创伤愈合促进材料可以促进创伤的愈合。

Claims (90)

1、一种创伤愈合促进材料，其由至少在表面上存在有白细胞和/或血小板的片状多孔材料所构成。

2、一种创伤愈合促进材料，其为含有片状多孔材料的创伤愈合促进材料，且具有细胞增殖功能。

3、权利要求2中记载的创伤愈合促进材料，其具有成纤维细胞的增殖功能。

4、权利要求3中记载的创伤愈合促进材料，其细胞增殖功能来源于片状多孔材料表面上存在的白细胞和/或血小板。

5、创伤愈合促进材料，其为含有片状多孔材料的创伤愈合促进材料，且具有生长因子产生功能。

6、权利要求5中记载的创伤愈合促进材料，其中，相对对照血浆，生长因子的产生功能满足以下任何一项：血管内皮生长因子(VEGF)的情况为5倍以上、血小板衍生生长因子-AB(PDGF-AB)的情况为2倍以上、转化生长因子(TGF-β1)的情况为2倍以上。

7、权利要求6中记载的创伤愈合促进材料，其中，生长因子的产生功能来源于片状多孔材料表面上存在的白细胞和/或血小板。

8、权利要求1～7任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料的厚度为0.01～3mm。

9、权利要求1～8任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料可根据创伤部位的形状而变形。

10、权利要求9中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料为无纺布。

11、权利要求10中记载的创伤愈合促进材料，其中，无纺布的纤维直径为0.3～50μm、松密度是0.05～0.5g/cm³。

12、权利要求9中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料为海绵状结构体。

13、权利要求12中记载的创伤愈合促进材料，其中，海绵状结构体的平均孔径为1.0～40μm。

14、权利要求1～13任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料的材质是天然高分子或者是合成高分子。

15、权利要求14中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料的材质为以疏水性高分子为主要成分的合成高分子。

16、权利要求13或14中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料的材质为生物分解性材料。

17、权利要求1～16任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，白细胞和/或血小板是来源于外周血、骨髓液或者脐带血。

18、权利要求1～16任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，白细胞和/或血小板为成熟细胞。

19、权利要求17或18中记载的创伤愈合促进材料，其中，白细胞和/或血小板来源于自体。

20、权利要求1～19任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，在片状多孔材料上的白细胞密度为6.0×10⁶个/cm³以上和/或血小板密度为2.5×10⁸个/cm³以上。

21、权利要求1～20任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料中整合有成纤维细胞。

22、权利要求21中记载的创伤愈合促进材料，其中，成纤维细胞为来自与创伤组织相同组织的成纤维细胞。

23、权利要求1～22任一项中记载的创伤愈合促进材料，其中，片状多孔材料含有纤维蛋白。

24、创伤愈合促进材料的制造方法，其中包括在片状多孔材料上至少捕获白细胞和/或血小板的工序。

25、权利要求24中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料的厚度为0.01～3mm。

26、权利要求24或25任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料为无纺布。

27、权利要求26中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，无纺布的纤维直径为0.3～50μm、松密度为0.05～0.5g/cm³。

28、权利要求24或25中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料为海绵状结构体。

29、权利要求28中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，海绵状结构体的平均孔径为1.0～40μm。

30、权利要求24～29任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料具有血液细胞的选择分离性。

31、权利要求30中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料的表面具有血液细胞的选择分离性。

32、权利要求31中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于红细胞，片状多孔材料选择性地捕获白细胞和/或血小板。

33、权利要求32中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，片状多孔材料对白细胞的捕获率为50％以上和/或对血小板的捕获率为50％以上。

34、权利要求24～33任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，通过过滤至少含白细胞和/或血小板的细胞悬浮液，在片状多孔材料上进行捕获。

35、权利要求34中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤是经过一次性通过进行的。

36、权利要求35中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液的过滤液量不足400ml。

37、权利要求35～37任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于片状多孔材料的有效过滤面积的过滤液量的比不足10ml/cm²。

38、权利要求35～37任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于片状多孔材料容积的过滤液量的比不足100。

39、权利要求35～38任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于片状多孔材料，使细胞悬浮液一次过滤。

40、权利要求35～40任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，相对于片状多孔材料，细胞悬浮液过滤方向为单一方向。

41、权利要求35～40任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤时间为20分钟以内。

42、权利要求34中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤是由体外循环进行。

43、权利要求42中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤流速为20～200ml/min。

44、权利要求42或43中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，过滤时间为10～300分钟。

45、权利要求24～44任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液为新鲜血。

46、权利要求45中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液为采血后48小时以内的新鲜血。

47、权利要求24～46任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液主要含有成熟细胞。

48、权利要求24～47任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液来源为自体血。

49、权利要求24～48任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，细胞悬浮液含有作为抗凝剂的柠檬酸、肝素类或水解酶抑制剂中的任一种。

50、权利要求24～49任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中包括培养至少捕获有白细胞和/或血小板的片状多孔材料的工序。

51、权利要求50中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，在培养时添加细胞活性化材料。

52、权利要求24～51任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中还包括在片状多孔材料中整合成纤维细胞的工序。

53、权利要求52中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，使成纤维细胞接触片状多孔材料、或将成纤维细胞混合到细胞悬浮液后进行过滤使之整合。

54、权利要求53中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，成纤维细胞为来自与创伤组织相同组织的成纤维细胞。

55、权利要求24～54任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中还包括使片状多孔材料含有纤维蛋白的工序。

56、权利要求55中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，纤维蛋白为来自于制剂。

57、权利要求56中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，纤维蛋白为回收用片状多孔材料过滤细胞悬浮液时排出的液体，经浓缩得到的。

58、权利要求24～57任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中还包括至少在捕获白细胞和/或血小板后洗涤片状多孔材料的工序。

59、权利要求24～58任一项中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中，在片状多孔材料上至少捕获白细胞和/或血小板的工序和/或洗涤该片状多孔材料的工序是在附有液体入口和出口的可开放液密容器中进行的。

60、权利要求59中记载的创伤愈合促进材料的制造方法，其中还包括从可开放液密容器中取出片状多孔材料进行保存的工序。

61、由权利要求24～60中任一种记载的创伤愈合促进材料的制造方法获得的创伤愈合促进材料。

62、一种创伤愈合促进材料的制备装置，其将片状多孔材料配置成一方通向入口侧、另一方通向出口侧，把附有用于液体注入和排出的入口和出口的可开放液密容器内部隔绝成两室。

63、权利要求62中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其将片状多孔材料夹持在可挠性树脂板中并溶合或粘合的软质装置，且可剥开可挠性树脂板的部分来露出或取出内部的片状多孔材料。

64、权利要求63中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为平板状。

65、权利要求62中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为配备有固定装置的硬质装置，且可通过解除该固定装置来露出或取出内部的片状多孔材料。

66、权利要求65中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为圆筒状。

67、权利要求66中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中装有卷成布匹状收容的片状多孔材料。

68、权利要求62～67任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料的厚度为0.01～3mm。

69、权利要求62～68任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料为无纺布。

70、权利要求69中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，无纺布的纤维直径为0.3～50μm、松密度为0.05～0.5g/cm³。

71、权利要求62～68任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料为海绵状结构体。

72、权利要求71中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，海绵状结构体平均孔径为1.0～40μm。

73、权利要求62～72任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料具有血液细胞的选择分离性。

74、权利要求73中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料的表面具有血液细胞的选择分离性。

75、权利要求74中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，与红细胞相比，片状多孔材料选择性地捕获白细胞和/或血小板。

76、权利要求75中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，片状多孔材料对白细胞的捕获率为50％以上和/或对血小板的捕获率为50％以上。

77、权利要求62～76任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其配备有能够在容器入口侧和/或出口侧连接袋子的连接部件。

78、权利要求77中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其中，在容器的入口侧备有采血袋和/或出口侧备有离心袋。

79、权利要求62～76任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其在容器的入口侧和出口侧备有体外循环回路。

80、权利要求62～79任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其用灭菌袋包装进行了灭菌。

81、权利要求77中记载的创伤愈合促进材料的制备装置，其为使容器的入口出口与外界连通进行包装、装置整体被灭菌袋包装而灭菌。

82、利用权利要求62～81任一项中记载的创伤愈合促进材料的制备装置获得的创伤愈合促进材料。

83、一种治疗创伤部位的方法，是将权利要求1～23、61和82任一项中记载的创伤愈合促进材料贴附在创伤部位。

84、权利要求83中记载的治疗创伤部位的方法，其中，开放容器，以从容器中露出片状多孔材料一面的状态进行贴附。

85、权利要求84中记载的治疗创伤部位的方法，其为从容器中取出片状多孔材料进行贴附。

86、权利要求83～85任一项中记载的创伤部位的治疗方法，其为在制备创伤愈合促进材料后的30分钟内将其贴附到创伤部位。

87、权利要求83～86任一项中记载的治疗创伤部位的方法，其中，创伤为体表创伤。

88、权利要求83～87任一项中记载的治疗创伤部位的方法，其中，用保护材料被覆固定所贴附的创伤愈合促进材料。

89、权利要求88中记载的治疗创伤部位的方法，其中，保护材料为由不具有透水性的原料构成的片。

90、权利要求89中记载的治疗创伤部位的方法，其中，保护材料是由具有气体通透性同时不具有透水性的原料构成的片。