KR20060028400A - 창상 치유 촉진재 - Google Patents

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KR20060028400A
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porous body
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우시오 이와모또
야스오 도꾸시마
노부야 기따구찌
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아사히 카세이 메디칼 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 목적은, 창상 치유에 효과가 있는 세포를 단시간에 효율적으로 농축하고, 창상 치유의 촉진재로서 활용하기 위한 수단을 제공하는 데 있다. 본 발명에 따르면, 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판이 표면에 존재하는 시트 모양 다공질체를 포함하는 창상 치유 촉진재, 그의 제조 방법, 제조 디바이스, 및 이를 사용한 창상 부위의 치료 방법이 제공된다.
창상, 백혈구, 혈소판, 다공질체

Description

창상 치유 촉진재{MATERIAL PROMOTING WOUND HEALING}
본 발명은, 창상 치유를 촉진하기 위한 창상 치유 촉진재, 그의 제조 방법, 제조 디바이스, 및 이를 사용한 창상 부위의 재생 촉진 방법에 관한 것이다.
최근, 창상의 치유에 관한 메커니즘이 점차 밝혀지고 있고, 그 하나로서, 백혈구, 혈소판이라는 혈액 내의 세포가 생산하는 다양한 성장 인자가 조직의 재생에 중요한 기능을 하는 것이 알려져 있다.
여기서 말하는 성장 인자란, 혈액 응고나 염증 세포의 유주를 비롯하여, 섬유아세포의 증식이나 세포외 매트릭스의 합성, 혈관 신생 및 이들의 재구축에 이르기까지의 창상 치유의 여러 가지 현상을 복잡한 세포간 네트워크 관계를 기초로 직접적 또는 간접적으로 제어하는 것이다. 예를 들면, 혈소판 유래의 성장 인자의 하나로서 발견된 PDGF(혈소판 유래 성장 인자, platelet-derived growth factor)는 섬유아세포나 평활근 세포의 유주, 증식 촉진, 단구·호중구의 강력한 주화성 작용, 나아가 섬유아세포의 콜라겐, 콜라게나제 합성 촉진 인자로서의 작용이 밝혀지고 있다. 이에 대하여 피어스(Pierce) 등의 그룹은, 토끼의 귀에 연골까지 달하는 상처를 내고 PDGF-BB를 투여한 바, PDGF-BB를 투여하지 않는 상처보다 빠르게 손상의 수복이 행해지는 것을 개시하고 있다(J. Cell Biochem. 1991 45:319-326). PDGF는 그 이름이 나타내는 바와 같이 혈소판에 대량으로 포함되지만, 그 이외에 매크로파지나 혈관 내피 세포, 평활근 세포 등의 세포에서도 생산되고 있다. 창상 치유에 관련되는 성장 인자로서는, PDGF-BB 이외에도 FGF(섬유아세포 성장 인자;fibroblast growth factor), VEGF(혈관 내피 증식 인자;vascular endothelial growth factor), TGF-β(형질전환성 성장 인자;transforming growth factor), EGF(상피 성장 인자;epidermal growth factor) 등의 성장 인자가 밝혀져 있고, 그 일부는 임상 응용되게 되었다.
또한, 창상 치유의 다른 메커니즘으로서, 혈액 세포 자신의 창상 치유에의 관여라는 측면에서도 몇가지 지견이 얻어져 있다. 예를 들면 칼카(Kalka) 등은, 인간 말초혈 내의 단핵구세포를 시험관 내에서 배양한 후, 혈관 협착 처치를 행한 누드 래트의 허혈 부위에 그 배양 세포를 이식하면 세포가 생착하여 새롭게 혈관을 생성해 허혈 부위를 치유하는 것을 개시하고 있어, 말초혈 유래의 백혈구는 전술한 성장 인자 생산 이외에도 혈관 신생에 직접 관여한다는 면에서도 창상 치유 효과가 기대되고 있다(PNAS. 2000 97:3422-3427). 또한, 인간 말초혈 내의 단구 분획을 시험관 내에서 여러 가지 성장 인자를 이용하여 배양함으로써 상피 세포, 혈관 내피 세포, 간세포, 그리고 신경 세포라는 세포로 분화하는 방법도 짜오(Zhao) 등에 의해 개시되어 있어, 세포와 성장 인자의 조합이 새로운 창상 치유 효과를 나타내는 것도 기대된다(PNAS. 2003 100:2426-2431).
창상의 치유시에는, 특정한 성장 인자나 세포를 환자에게 투여하는데, 그 방법은 주로 전신 투여 또는 국소 투여의 2가지로 나누어진다. 그러나 전신 투여는, 특히 성장 인자에서는, 투여량이 지나치게 많을 경우에는 예를 들면 VEGF에서는 저혈압을, bFGF에서는 신장 독성을 야기할 위험성이 각각 시사되고 있어, 투여량의 결정에는 매우 신중한 판단이 필요했다. 한편, 국소 투여는 성장 인자나 세포 모두에 적합하다고 생각되지만, 국소에서의 성장 인자 농도를 일정 기간 유지하기는 어렵다. 또한, 창상 치유에서의 세포끼리의 정보 전달은 위에서 예로 든 것 같은 다종의 인자가 작용하는 복잡한 계이기 때문에, 단독의 성장 인자의 투여에서는 치유 효과는 불충분한 경우가 많고, 창상 치유에 관련되는 다종의 성장 인자의 투여가 필요하다고 생각되고 있다. 또한, 국소 투여를 실현하는 다른 방법으로서는 유전자 치료를 생각할 수 있지만, 유전자 치료는 현재 아직 안전성이 충분하게 확립되어 있지 않다.
이러한 점에서, 성장 인자에 비교해서 특정 세포의 국소 투여는 유효성이 높다고 생각되어, 다양한 기술 검토가 이루어지고 있다. 예를 들면, 원심 분리에 의해 성장 인자를 생산하는 혈소판을 혈액으로부터 농축하고, 이것에 피브리노겐과 트롬빈을 첨가해서 혈소판 반죽을 제조하여, 창상 부위에 도포하는 방법이 있다(Int. J. Artif. Organs. 2002 25(4):334-8). 그러나, 이 방법에서는 제조에 시간과 수고가 들고, 또한 반죽의 기계적 강도가 낮다는 문제가 있었다. 일본 특허 공개 2001-204807호에는, 세포를 포함하는 겔의 기계적 강도를 강하게 하기 위해서, 고분자 재료 성형물을 포함하는 골격의 내부에 섬유아세포 등의 세포를 포함하는 겔을 형성시킨 의학용 재료가 개시되어 있다. 그런데, 이 재료는 인공 피부를 주된 용도로 하는 것으로서, 백혈구, 혈소판 등을 이 겔 안에 포함하고 있지 않은 점 에서 창상 치유 촉진의 효과는 기대할 수 없었다. 또한, 겔 안의 세포는, 겔 내에 고정되어 있기 때문에 세포가 어떠한 인자를 생산하였다 해도, 그 인자가 창상 부위에 도달하는 데 시간을 필요로 한다는 문제도 있었다. 또한, 미국 특허 제6049026호 명세서에는, 이식편으로서 골수 내의 결합 조직 전구 세포를 기재(substrate) 표면에 부착시키기 위한 키트가 제안되어 있고, 이식편의 성장을 재촉하기 위하여 혈소판을 더욱 부착시키는 것이 기재되어 있다. 그러나, 이는 주로 뼈의 이식편에 관한 발명으로서, 창상의 치유 촉진, 즉 생체측 창상 부위의 세포의 성장을 촉진하는 것을 목적으로 한 것은 아니었다. 따라서, 백혈구를 이식편에 부착시킨다는 개시는 전혀 되어 있지 않다.
이상 서술한 바와 같이, 창상 치유 분야에서는, 창상 치유 효과가 있는 혈액 세포를 더 효율적으로 이용한 창상 치유 (촉진)재에 대해서는 알려져 있지 않고, 그러한 기술 혁신이 요망되고 있었다.
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해소하는 것을 해결해야 할 과제로 한다. 즉, 본 발명은, 창상 치유에 효과가 있는 세포를 단시간에 효율적으로 농축하고, 창상 치유의 촉진재로서 활용하기 위한 수단을 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 하였다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 표면에 백혈구 및(또는) 혈소판을 존재시킨 시트 모양 다공질 재료가 섬유아세포의 증식을 향상시켜, 창상 치유 관련 성장 인자를 생산함으로써 창상 치유를 촉진하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
(1) 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판이 표면에 존재하는 시트 모양 다공질체를 포함하는 창상 치유 촉진재.
(2) 시트 모양 다공질체를 포함하는 창상 치유 촉진재로서, 세포 증식능을 갖는 창상 치유 촉진재.
(3) 섬유아세포의 증식능을 갖는 (2)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(4) 세포 증식능이 시트 모양 다공질체 표면에 존재하는 백혈구 및(또는) 혈소판에서 유래하는 (3)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(5) 시트 모양 다공질체를 포함하는 창상 치유 촉진재로서, 성장 인자 생산능을 갖는 창상 치유 촉진재.
(6) 대조 혈장에 대한 성장 인자의 생산능이, 혈관 내피 증식 인자(VEGF)의 경우에는 5배 이상, 혈소판 유래 증식 인자-AB(PDGF-AB)의 경우에는 2배 이상, 형질전환성 성장 인자(TGF-β1)의 경우에는 2배 이상 중 어느 하나를 만족하는 (5)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(7) 성장 인자의 생산능이, 시트 모양 다공질체 표면에 존재하는 백혈구 및(또는) 혈소판에서 유래하는 (6)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(8) 시트 모양 다공질체의 두께가 0.01∼3㎜인 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(9) 시트 모양 다공질체가 창상 부위의 형상에 맞춰서 변형 가능한 (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(10) 시트 모양 다공질체가 부직포인 (9)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(11) 부직포의 섬유 직경이 0.3∼50㎛, 부피 밀도가 0.05∼0.5g/㎤인 (10)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(12) 시트 모양 다공질체가 스펀지 모양 구조체인 (9)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(13) 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이 1.0∼40㎛인 (12)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(14) 시트 모양 다공질체의 재질이 천연 고분자 또는 합성 고분자인 (1)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(15) 시트 모양 다공질체의 재질이 소수성 고분자를 주요 성분으로 하는 합성 고분자인 (14)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(16) 시트 모양 다공질체의 재질이 생분해성 소재인 (13) 또는 (14)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(17) 백혈구 및(또는) 혈소판이 말초혈, 골수액 또는 제대혈 유래인 (1)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(18) 백혈구 및(또는) 혈소판이 성숙 세포인 (1)∼(16) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(19) 백혈구 및(또는) 혈소판이 자기 유래인 (17) 또는 (18)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(20) 시트 모양 다공질체에서의 백혈구 밀도가 6.0×106개/㎤ 이상이고(이거나) 혈소판 밀도가 2.5×108개/㎤ 이상인 (1)∼(19) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(21) 시트 모양 다공질체에 섬유아세포를 넣은 (1)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(22) 섬유아세포가 창상 조직과 동일한 조직 유래의 섬유아세포인 (21)에 기재된 창상 치유 촉진재.
(23) 시트 모양 다공질체가 피브린을 포함하는 (1)∼(22) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재.
(24) 시트 모양 다공질체에 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포착하는 공정을 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(25) 시트 모양 다공질체의 두께가 0.01∼3㎜인 (24)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(26) 시트 모양 다공질체가 부직포인 (24) 또는 (25) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(27) 부직포의 섬유 직경이 0.3∼50㎛, 부피 밀도가 0.05∼0.5g/㎤인 (26)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(28) 시트 모양 다공질체가 스펀지 모양 구조체인 (24) 또는 (25)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(29) 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이 1.0∼40㎛인 (28)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(30) 시트 모양 다공질체가 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 (24)∼(29) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(31) 시트 모양 다공질체의 표면이 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 (30)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(32) 시트 모양 다공질체가 적혈구에 비해 백혈구 및(또는) 혈소판을 선택적으로 포착하는 것인 (31)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(33) 시트 모양 다공질체의 백혈구 포착률이 50％ 이상이고(이거나) 혈소판 포착률이 50％ 이상인 (32)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(34) 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포함하는 세포 부유액을 여과에 의해 시트 모양 다공질체에 포착하는 (24)∼(33) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(35) 여과가 한번에 행해지는 (34)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(36) 세포 부유액의 여과 액량이 400㎖ 미만인 (35)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(37) 시트 모양 다공질체의 유효 여과 면적에 대한 여과 액량의 비가 10㎖/㎠ 미만인 (35)∼(37) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(38) 시트 모양 다공질체의 용적에 대한 여과 액량의 비가 100 미만인 (35)∼(37) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(39) 시트 모양 다공질체에 대하여 세포 부유액을 일회 여과시키는 (35)∼(38) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(40) 시트 모양 다공질체에 대한 세포 부유액의 여과 방향이 일방향인 (35)∼(40) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(41) 여과 시간이 20분 이내인 (35)∼(40) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(42) 여과가 체외 순환에 의해 행해지는 (34)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(43) 여과 유속이 20∼200㎖/min인 (42)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(44) 여과 시간이 10∼300분인 (42) 또는 (43)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(45) 세포 부유액이 신선한 혈액인 (24)∼(44) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(46) 세포 부유액이 채혈후 48시간 이내의 신선한 혈액인 (45)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(47) 세포 부유액이 성숙 세포를 주로 포함하는 (24)∼(46) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(48) 세포 부유액이 자기혈 유래인 (24)∼(47) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(49) 세포 부유액이 시트르산염, 헤파린류 또는 가수분해 효소 저해제 중 어느 하나를 항응고제로서 포함하는 (24)∼(48) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(50) 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포착한 시트 모양 다공질체를 배양하는 공정을 추가로 포함하는 (24)∼(49) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(51) 배양시에 세포 활성화제를 첨가하는 (50)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(52) 시트 모양 다공질체에 섬유아세포를 넣는 공정을 추가로 포함하는 (24)∼(51) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(53) 섬유아세포를 시트 모양 다공질체에 접촉시키거나 또는 섬유아세포를 세포 부유액에 혼합해서 여과함으로써 넣는 (52)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(54) 섬유아세포가 창상 조직과 동일한 조직 유래의 섬유아세포인 (53)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(55) 시트 모양 다공질체에 피브린을 포함시키는 공정을 추가로 포함하는 (24)∼(54) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(56) 피브린이 제제 유래인 (55)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(57) 피브린이 세포 부유액을 시트 모양 다공질체에 여과했을 때의 여과액을 회수해 농축해서 얻은 것인 (56)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(58) 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포착한 후에 시트 모양 다공질체를 세정하는 공정을 추가로 포함하는 (24)∼(57) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(59) 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 시트 모양 다공질체에 포착하는 공정 및(또는) 상기 시트 모양 다공질체를 세정하는 공정이, 액체의 입구와 출구가 붙은 개방 가능한 액밀 용기 내에서 행해지는 (24)∼(58) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(60) 개방 가능한 액밀 용기로부터 시트 모양 다공질체를 꺼내고, 보존하는 공정을 추가로 포함하는 (59)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
(61) (24)∼(60) 중 어느 하나의 창상 치유 촉진재의 제조 방법에 의해 수득되는 창상 치유 촉진재.
(62) 액체의 주입과 배출을 위한 입구와 출구가 붙은 개방 가능한 액밀 용기의 내부에서, 용기 내부를 2실로 나누고, 한쪽을 입구측에 다른 쪽을 출구측에 통하도록 시트 모양 다공질체를 배치한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(63) 가요성 수지 시트에 시트 모양 다공질체를 끼워서 용착 또는 접착한 연질 디바이스로서, 가요성 수지 시트부를 벗김으로써 내부의 시트 모양 다공질체를 노출 또는 취출 가능하게 한 (62)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(64) 평판 모양인 (63)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(65) 체결 수단을 구비한 경질 디바이스로서, 상기 체결 수단을 해제함으로써 내부의 시트 모양 다공질체를 노출 또는 취출 가능하게 한 (62)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(66) 원통 모양인 (65)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(67) 시트 모양 다공질체가 피륙 모양으로 감겨서 수용되어 있는 (66)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(68) 시트 모양 다공질체의 두께가 0.01∼3㎜인 (62)∼(67) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(69) 시트 모양 다공질체가 부직포인 (62)∼(68) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(70) 부직포의 섬유 직경이 0.3∼50㎛, 부피 밀도가 0.05∼0.5g/㎤인 (69)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(71) 시트 모양 다공질체가 스펀지 모양 구조체인 (62)∼(68) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(72) 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이 1.0∼40㎛인 (71)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(73) 시트 모양 다공질체가 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 (62)∼(72) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(74) 시트 모양 다공질체의 표면이 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 (73)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(75) 시트 모양 다공질체가 적혈구에 비해 백혈구 및(또는) 혈소판을 선택적으로 포착하는 것인 (74)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(76) 시트 모양 다공질체의 백혈구 포착률이 50％ 이상이고(이거나) 혈소판 포착률이 50％ 이상인 (75)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(77) 용기의 입구측 및(또는) 출구측에 백을 접속할 수 있는 접속 부품을 구비한 (62)∼(76) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(78) 용기의 입구측에 채혈 백 및(또는) 출구측에 원심 백을 구비한 (77)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(79) 용기의 입구측 및 출구측에 체외 순환 회로를 구비한 (62)∼(76) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(80) 멸균 자루에 포장되어 멸균된 (62)∼(79) 중 어느 하나에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(81) 용기의 입구 출구가 외부에 연통해서 포장되고, 장치 전체가 멸균 자루에 포장되어 멸균된 (77)에 기재된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
(82) (62)∼(81) 중 어느 하나의 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스를 이용하여 수득되는 창상 치유 촉진재.
(83) (1)∼(23), (61) 및 (82) 중 어느 하나의 창상 치유 촉진재를 창상 부위에 붙이는 창상 부위의 치료 방법.
(84) 용기를 개방하고, 시트 모양 다공질체의 일면을 용기로부터 노출시킨 상태에서 붙이는 (83)에 기재된 창상 부위의 치료 방법.
(85) 용기로부터 시트 모양 다공질체를 꺼내서 붙이는 (84)에 기재된 창상 부위의 치료 방법.
(86) 창상 치유 촉진재를 제조후 30분 이내에 창상 부위에 붙이는 (83)∼(85) 중 어느 하나에 기재된 창상 부위의 치료 방법.
(87) 창상이 체표면인 (83)∼(86) 중 어느 하나에 기재된 창상 부위의 치료 방법.
(88) 붙인 창상 치유 촉진재를 보호재에 의해 피복 고정하는 (83)∼(87) 중 어느 하나에 기재된 창상 부위의 치료 방법.
(89) 보호재가 투수성을 갖지 않는 소재를 포함하는 시트인 (88)에 기재된 창상 부위의 치료 방법.
(90) 보호재가 기체 투과성을 갖고 또한 투수성을 갖지 않는 소재를 포함하는 시트인 (89)에 기재된 창상 부위의 치료 방법.
도 1은, 본 발명의 창상 치유 촉진재에 의한 창상 부위의 치료 방법을 도시한다. 도 1a는, 시트 모양 다공질체의 일면을 용기로부터 노출시킨 상태에서 붙이는 방법을 도시하고, 도 1b는, 용기로부터 시트 모양 다공질체를 꺼내서 붙이는 방법을 도시한다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용하는 시트 모양 다공질체란, 각형 혹은 디스크형의 시트 재료로서, 세공 혹은 섬유 틈 등의 다공부를 가짐으로써, 다공부의 표면에서 흡착이나 여과에 의해 세포를 포착할 수 있는 다공질 재료이다. 일반적으로, 창상 부위 표면은 평면에 한하지 않고 요철을 수반하는 경우가 많기 때문에, 더 높은 창상 치유 효과를 발현하기 위해서는, 창상 부위의 형상에 맞춰 시트 모양 다공질체가 밀착되어 있는 것이 효과적이다. 따라서, 본 시트 모양 다공질체는 창상 부위의 형상에 맞춰 변형 가능한 유연성을 갖는 것이 바람직하고, 이에 따라, 예를 들면 사방 수㎝에 미치는 큰 창상 부위이어도, 1장의 시트로 빈 틈 없이 피복할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 시트 모양 다공질체는, 혈액 등의 세포 부유액으로부터 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판 등의 혈구 세포를 포착할 수 있는 재료이지만, 필터층으로서의 기능을 갖는 것이 바람직하다. 즉, 세포 부유액을 접촉 혹은 통과시켰을 때에, 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판이라는 혈구 세포나 성장 인자 등을 포착하고, 액체 부분을 포착하지 않는다는 분리 기능을 갖고 있으면 되고, 거기에는, 사이즈 분리 뿐만 아니라 재료 표면에 대한 세포 친화성(흡착성 등)에 근거하는 분리도 포함된다.
시트 모양 다공질체는, 특정한 혈구 세포를 많이 포착할 수 있다는 선택 분리성을 갖는 것이 바람직하다. 이 선택 분리성은, 다공질 재료의 소재나 형상을 적당하게 선택함으로써 달성 가능하지만, 후술하는 바와 같이, 다공질 재료의 표면처리에 의해서 더 고 선택적으로 제어할 수도 있다. 본 발명의 창상 치유 촉진재에서는, 예를 들면 성장 인자의 생산이나 분비 작용이 우수하다는 점에서, 적혈구에 비해서 백혈구 및(또는) 혈소판을 선택적으로 포착할 수 있는 시트 모양 다공질체가 특히 바람직하다. 이 때, 포착률이 높을수록 더 소량의 세포 부유액으로부터 목적물을 얻을 수 있으므로, 백혈구 및(또는) 혈소판의 포착률은 모두 50％ 이상이 면 바람직하다.
시트 모양 다공질 재료의 형태로서는, 부직포, 직포, 스펀지 모양 구조체, 입자를 시트 모양의 자루에 채운 것 등을 예시할 수 있다. 그 중에서도, 포착 대상물로서 백혈구나 혈소판을 의도할 경우에는, 제거 효율이라는 관점에서, 부직포나 스펀지 모양 구조체가 더 바람직하다.
본 명세서에서 말하는 부직포란, 1층 이상의 섬유의 덩어리를 제편직하지 않고 천 모양 구조로 한 것을 말한다. 섬유의 소재로서는, 합성 섬유, 천연 섬유, 무기 섬유 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 소수성 고분자를 주요 성분으로 하는 합성 섬유, 예를 들면 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리아크릴로니트릴 등의 섬유는, 세포의 접착성이 높으므로 바람직하게 사용된다.
시트 모양 다공질 재료가 부직포인 경우의 섬유의 평균 직경은, 바람직하게는 0.3㎛ 이상 50.0㎛ 미만이고, 더 바람직하게는 0.5㎛ 이상 40.0㎛ 이하이고, 더 바람직하게는 0.7㎛ 이상 35.0㎛ 이하이고, 더욱 바람직하게는 1.0㎛ 이상 20.0㎛ 이하이고, 특히 바람직하게는 1.0㎛ 이상 9.0㎛ 이하이다. 평균 직경이 0.3㎛보다 작아지면 혈액 세포 부유액이나 혈액을 부직포에 흐르게 할 때에 유동성이 나빠져서 장치 내의 압력 손실이 높아진다. 또한, 평균 직경이 50.0㎛보다 크면 백혈구 및(또는) 혈소판의 포착률이 나빠진다. 또한, 백혈구 및(또는) 혈소판의 포착률이 나빠지면, 결과적으로 시트 모양 다공질 재료 내에 포착된 세포간의 거리가 커지기 때문에, 전술한 바와 같이 생산된 성장 인자가 더 효과적으로 기능하기 위해서도 섬유의 평균 직경은 상기한 범위가 바람직하다.
본 발명에서 사용하는 부직포를 구성하는 섬유의 평균 직경은, 예를 들면 부직포를 구성하고 있는 섬유의 주사형 전자현미경 사진을 찍고, 무작위로 선택한 100개 이상의 섬유의 직경을 측정하고, 이들을 수평균하는 방법으로 구해진다.
본 발명에서 사용하는 부직포의 부피 밀도는, 바람직하게는 0.05g/㎤ 내지 0.5g/㎤, 더 바람직하게는 0.07g/㎤ 내지 0.4g/㎤, 더욱 바람직하게는 0.1g/㎤ 내지 0.3g/㎤가 좋다. 부피 밀도가 0.5g/㎤보다 커지면 세포 부유액이나 혈액을 부직포에 흐르게 할 때에 유동성이 나빠져서 압력 손실이 높아진다. 또한 부피 밀도가 0.05g/㎤보다 작으면 세포 포착률이 나빠짐과 아울러, 전술한 바와 같이 포착된 세포간의 거리가 커지기 때문에, 전술한 바와 같이 생산된 성장 인자가 더 효과적으로 기능하기 위해서도 섬유의 부피 밀도는 상기한 범위가 바람직하다.
또한, 본 발명에서 말하는 스펀지 모양 구조체란, 연속 개방 기공을 갖는 삼차원 메쉬 모양 연속 조직을 갖는 구조체를 말한다. 스펀지 모양 구조체의 재질은 특별히 한정되지 않고, 셀룰로오스나 그 유도체 등의 천연 고분자, 혹은 소수성 고분자를 주요 성분으로 하는 폴리올레핀, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리술폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에테르술폰, 폴리(메트)아크릴레이트, 부타디엔ㆍ아크릴로니트릴 공중합체, 에틸렌ㆍ비닐알코올 공중합체, 폴리비닐아세탈 혹은 이들의 혼합물 등의 고분자 재료는 세포의 접착성이 높으므로 바람직하게 사용된다.
스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경은 바람직하게는 1.0㎛ 이상 40㎛ 이하 이고, 더 바람직하게는 2.0㎛ 이상 35㎛ 이하이고, 더 바람직하게는 3.0㎛ 이상 30㎛ 이하이다. 평균 직경이 1.0㎛보다 작아지면 세포 부유액이나 혈액을 스펀지 모양 구조체에 흐르게 할 때에 혈액의 유동성이 나빠지고, 장치 내의 압력 손실이 높아진다. 또한, 평균 직경이 40㎛보다 크면 백혈구 포착률이 나빠진다. 또한, 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이 커지면, 결과적으로 필터층 내에 포착된 세포간의 거리가 커지기 때문에, 전술한 바와 같이 생산된 성장 인자가 더 효과적으로 기능하기 위해서도 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경은 상기한 범위가 바람직하다.
본 발명에서 말하는 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이란, 수은 압입법으로 측정해서 얻어진 값이다. 수은 압입법(예를 들면 시마즈세이사꾸쇼, 포어사이저 9320)에 의한 측정에 의해, 세로축에 세공의 용량의 미분 값을 나타내고, 가로축에 구멍 직경을 나타내어 그래프를 그리고, 그 피크에 해당하는 점(최빈값)을 평균 구멍 직경으로 한다. 또한, 수은 압입법에 의한 측정값으로서는 1∼2650psia의 압력 범위에서 측정한 값을 사용한다.
본 발명에서 사용하는 시트 모양 다공질 재료의 두께는, 창상 치유 효과를 높이기 위해서 0.01㎜ 내지 3.0㎜이고, 바람직하게는 0.05㎜ 내지 2.5㎜, 더 바람직하게는 0.1㎜ 내지 2.0㎜이다. 시트 모양 다공질 재료의 두께가 3.0㎜보다 커지면, 창상 부위에의 고정이 어려워짐과 아울러, 백혈구나 혈소판으로부터의 성장 인자가 창상 부위에 닿기 어려워진다. 또한, 시트 모양 다공질 재료의 두께가 0.01㎜보다 작으면 기계적 강도가 약해진다. 세포로부터 생산되는 성장 인자는 그 세 포 스스로에게 작용(자기 분비, autocrine)하여, 더욱 강하게 작용하는 경우와, 주변의 세포로부터 생산되어 확산한 성장 인자가 서로 작용(방분비, paracrine)함으로써, 세포간에서 효과가 증강되는 경우가 있다. 따라서, 성장 인자를 더 효과적으로 기능시키기 위해서는 세포끼리의 거리가 가능한 한 가까운 것이 바람직하기 때문에, 필터층의 두께는 상기한 범위 내인 것이 바람직하다. 또한, 시트 모양 다공질 재료는 1장으로 상기한 두께를 갖는 것을 사용해도 되고, 두께가 작은 것을 2장 이상 포개서 사용할 수도 있다.
또한, 시트 모양 다공질 재료의 표면에는, 포착 대상 물질만을 선택적으로 흡착 포착할 수 있게 하기 위해서 특정한 고분자를 코팅 또는 그래프트 처리 등을 할 수도 있다. 예를 들면, 혈구는 흡착하기 쉽지만 혈소판은 흡착하기 어려운 공지의 폴리머를 코팅 또는 고정화한 시트 모양 다공질 재료와, 혈소판을 흡착하기 쉬운 시트 모양 다공질 재료에 이 순서로 혈액이나 세포 부유액을 처리함으로써, 혈소판을 더 선택적으로 접착하는 시트 모양 다공질 재료를 제조할 수도 있다. 이러한 폴리머의 예로서는, 예를 들면 WO87/05812호 팸플릿, WO03/011924호 팸플릿 혹은 WO03/047655호 팸플릿 등을 참조할 수 있다. 또한, 혈구 혹은 혈장 단백질 등의 특정 성분을 더 선택적으로 흡착할 수 있는 리간드를 코팅 또는 고정화해도 된다.
시트 모양 다공질 재료에는, 생분해성인 소재를 사용할 수도 있다. 생체 흡수성의 소재로서는, 예를 들면 폴리락트산, 폴리글리콜산, 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리말산, 폴리-ε-카프로락톤 등의 폴리에스테르 또는 셀룰로오스, 폴리 알긴산, 키틴, 키토산 등의 다당류 등을 들 수 있다. 이들 소재를 사용함으로써 더 생체 적합성이 높은 창상 치유 촉진재로 할 수 있다.
본 발명의 창상 치유 촉진재는, 상기한 시트 모양 다공질체의 표면에 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판이 존재할 필요가 있다. 혈구 세포의 존재량(밀도)에 관해서는 특별히 한정하지 않지만, 창상 치유 촉진재로서의 효과를 더 높이기 위해서는, 일정 용적의 다공질체 내의 혈구 밀도가 적어도 혈액 내의 농도 레벨 이상으로 농축되어 있는 것이 바람직하다. 또한 전술한 세포간 상호 작용(파라크린)의 점에서도, 세포 밀도가 지나치게 낮으면 성장 인자 생산이 저하할 우려가 있기 때문에, 세포 밀도를 높여서 세포간 거리를 짧게 하는 것이 효과적이다. 이들 이유로부터, 시트 모양 다공질체의 표면에 존재하는 백혈구 밀도가 6.0×106개/㎤ 이상이고(이거나) 혈소판 밀도가 2.5×108개/㎤ 이상인 것이 바람직하다. 한편, 혈구 밀도가 높을수록 창상 치유 효과는 높아지는 경향이 있지만, 예를 들면 여과 조작에 의해서만 조정할 때에는, 막힘에 의해 처리 시간이 증대하거나 혹은 다공질체가 폐쇄될 우려가 있기 때문에, 백혈구 밀도의 상한을 6.0×108개/㎤ 이하, 혈소판 밀도의 상한을 1.0×1010개/㎤ 이하로 하는 것이 바람직하다.
상기 표면에 존재하는 혈구 세포는, 말초혈, 골수 및 제대혈에서 유래하는 인간의 혈구 세포이고, 면역적인 거절이나 감염 방제 등의 이유에서 창상의 치유를 받는 환자 자신의 혈액에서 유래하는 것(자기혈)이나 인간 백혈구 항원(HLA)의 형 이 가까운 것(동종혈)의 혈액에서 유래하는 것이 바람직하다.
시트 모양 다공질체의 표면에 이들 혈구 세포를 포착시켜, 창상 치유 촉진재를 제조하기 위한 세포 부유액은, 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포함하는 부유 액이고, 말초혈, 골수, 제대혈 그대로여도 되고, 전혈 제제나 분리된 성분 제제, 또는 미리 특정한 세포 분획을 제거한 세포 부유액어어도 된다. 이들 세포 부유액은, 항응고제로서 일반적인 시트르산염, 헤파린, 저분자 헤파린, 헤파리노이드 등의 헤파린류, 또는 후탄(FUT), FOY, 아르가트로반 등의 가수분해 효소 저해제를 포함하고 있어도 된다. 또한, 세포 부유액은 신선한 상태인 것이 바람직하고, 생체로부터 추출한 후 세포 부유액을 시트 모양 다공질체에 의해 여과할 때까지의 시간이 48시간 이내인 것이 더 바람직하다.
시트 모양 다공질체의 표면에 존재시키는 혈액 세포로서는, 줄기 세포 혹은 전구 세포라는 미숙한 세포 뿐만 아니라, 성숙 백혈구나 성숙 혈소판이라는 성숙 세포를 많게 포함하는 것이 바람직하다. 혈액 내나 창상 조직 내에 소량 포함되는 줄기 세포 혹은 전구 세포가 증식, 분화하여 창상 조직의 재생을 행할 때에는, 단독으로 조직 재생을 하는 것이 아니라 성숙 세포와의 네트워크 안에서 창상 치유에 가장 적합한 증식, 분화를 반복해서 조직 재생을 실현하기 때문이다.
본 발명의 창상 치유 촉진재에는 섬유아세포를 넣을 수도 있다. 섬유아세포는 혈액 세포 부유액과는 별도로, 시트 모양 다공질 재료와 접촉시킴으로써 넣을 수도 있지만, 미리 혈액 세포를 포함하는 세포 부유액에 혼합시키고 나서, 시트 모양 다공질 재료와 접촉시켜도 된다. 또한, 섬유아세포만을 추가로 별도의 재료(필 터층)에 부착시킨 후, 혈액 세포를 부착시킨 시트 모양 다공질 재료와 조합할 수도 있다. 섬유아세포는 특히 창상 부위에 포함되는 것과 동일한 섬유아세포를 넣는 것이 바람직하고, 이에 따라 창상 부위의 치유를 촉진할 수 있다.
본 발명의 창상 치유 촉진재는, 그 제조 과정에서 배양할 수도 있다. 배양액은 특별히 한정되지 않고, 보통 세포 배양에서 사용할 수 있는 것이면 된다. 추가로, 혈액 세포를 활성화하는 인자를 첨가해서 배양할 수도 있다. 예를 들면 트롬빈 등의 혈소판 활성화제를 넣고 나서 배양함으로써 국소적인 성장 인자의 농도를 높일 수 있다.
본 발명의 창상 치유 촉진재는 추가로 피브린을 포함하고 있어도 된다. 피브린을 제조하기 위한 피브리노겐 용액으로서는 특별히 특정되지 않지만, 제제로서 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 또한, 혈액 세포 부유액으로서 혈액을 사용했을 때에 시트 모양 다공질 재료로부터 여과액으로서 회수되는 액을 원심하고, 이것을 농축해서 사용할 수도 있다. 또한, 섬유아세포를 포함하는 경우에는, 세포는 미리 피브린에 파묻힌 형태여도 되고, 나중에 피프린에 세포만을 파종해도 된다. 피브린을 포함함으로써 창상 부위에의 창상 치유 촉진재의 고정화가 용이해짐과 아울러, 피브린 겔 내에 포함되는 것 외의 성장 인자에 의해 창상의 치유 촉진 효과를 더욱 상승시킬 수 있다.
본 발명의 창상 치유 촉진재를 제조하기 위해서는, 세포 부유액에 포함되는 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 상기 시트 모양 다공질체의 표면에 포착시키는 것이 필요하다. 이 포착 공정에서는, 예를 들면 시트 모양 다공질체를 펴서 세포 부유액을 직접 적하해 여과하거나, 실험실 장치로 사용되는 적당한 여과 홀더로 붙잡아서 세포 부유액을 여과하거나(예를 들면 도 1b를 참조할 수 있다), 혹은 시스템의 설명에서 후술하는 개방 가능한 액밀 용기에 셋팅해서 여과하면 된다(예를 들면 도 1a 및 도 1b를 참조할 수 있다). 후자의 두가지 경우에는, 자유 낙하이어도 되고, 펌프나 시린지 등을 이용하여 강제적으로 여과해도 된다. 또한, 단지 여과할 뿐만 아니라, 세포 부유액이 접촉한 상태에서 일정 시간 유지하는 등의 조작을 병용하면, 혈구 세포의 표면 포착률을 높일 수도 있다.
여과 조작에서는, 특히 단속적인 여과 조작을 여러 번 행하면 여과의 셰어 스트레스로 세포가 활성화되어, 여과액의 혈장 내에 성장 인자를 방출하는 것이 걱정된다. 따라서, 세포 부유액을 한번에 여과하는 것이 바람직하고, 준비나 조작이 간편하고 또한 처리 시간이 짧다는 이점도 얻을 수 있다. 또한, 세포 부유액을 여과하는 방향은 일방향인 것이 바람직하다. 예를 들면 어떠한 원인에 의해, 시트 모양 다공질체 내에 충분한 밀도의 백혈구 및(또는) 혈소판을 포착할 수 없는 경우에는, 시트 모양 다공질체의 양면에서 세포 밀도가 다르고, 여과 입구측의 세포 밀도가 높아지는 경우가 있다. 그러한 경우에는, 여과 입구측의 면을 창상 부위에 밀착함으로써 포착 세포의 창상 치유 촉진 효과를 더 효율적으로 발현시킬 수 있기 때문이다. 또는, 의도적으로 밀도를 편재시켜서 이러한 작용을 노릴 수도 있다.
이와 같이 한번에 여과를 행하는 경우에는, 수혈에서의 백혈구 제거 조작과 같이 대량의 세포 부유액(1단위인 400㎖ 이상)을 처리하는 것도 가능하기는 하지만, 소량으로 여과를 행할수록 처리 시간이 단축되기 때문에, 예를 들면 창상의 처 치에 병행하여 준비가 필요한 경우에는 매우 유용하게 된다. 따라서, 세포 부유액의 여과 액량을 400㎖ 미만으로 하는 것이 바람직하고, 또한 시트 모양 다공질체의 유효 여과 면적에 대한 여과 액량의 비를 10㎖/㎠ 미만으로 하거나 혹은 시트 모양 다공질체의 용적에 대한 여과 액량의 비를 100 미만으로 하여도 여과 시간이 짧아지므로 바람직하다.
한편, 개방 가능한 액밀 용기를 사용하면, 체외 순환에 의해 여과하는 것도 용이하다. 이 경우에는, 처리 시간은 비교적 길어지지만, 대량의 혈액을 연속적으로 순환하고 계속해서 여과함으로써, 시트 모양 다공질체에서의 혈구 밀도가 높아진다는 이점이 있다. 또한, 시스템의 설명에서 후술하는 바와 같이, 시트 모양 다공질체를 피륙 모양으로 감아서 원통 모양의 용기에 넣으면, 1∼2㎡의 여과 면적을 용이하게 확보할 수 있기 때문에, 대량의 혈액으로부터 매우 대면적의 창상 치유 촉진재를 얻을 수 있다. 이 때, 체외 순환에서의 여과 유속은 20∼200㎖/min, 여과 시간은 10∼300분이면 바람직하다. 체외 순환에 의해 여과를 행할 경우에는 여과 유속은 20∼200㎖/min이 바람직하다. 더 바람직하게는 25∼150㎖/min, 더욱 바람직하게는 30∼120㎖/min이다. 여과 유속이 이보다 낮으면 항응고제의 종류에 따라서는 체외 순환 시행중에 혈액이 응고하기 쉬워지고, 체외 순환 시간이 길어져서 환자에게 부담이 가해진다. 또한, 여과 유속이 이보다 높으면, 환자의 혈관 상태에 따라서는 혈액 채취가 어려워지는 경우가 있고, 또한 시트 모양 다공질체에 가해지는 부하가 높아져서 혈액 응고를 촉진하는 경우가 발생할 수 있다. 또한, 체외 순환의 여과 시간으로서는 10분∼300분이 바람직하다. 더 바람직하게는 20분∼ 250분, 더욱 바람직하게는 30분∼200분이다. 체외 순환의 여과 시간이 이보다 짧아지면 충분한 세포를 포착할 수 없는 우려가 있고, 반대로 이보다 체외 순환의 여과 시간이 길어지면 환자에게 주는 부담이 커진다.
이상의 공정에 의해, 시트 모양 다공질체의 표면에 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판이 존재하는 본 발명의 창상 치유 촉진재를 얻을 수 있는데, 이 제조 조정 방법에서는, 추가로 세정 공정을 포함해도 된다. 세정은, 예를 들면 인산완충액이나 생리식염수 등의 생리적 수용액을, 세포 부유액의 여과 조작과 마찬가지로 실시하면 된다. 세정함으로써, 창상 치유에 불필요한 세포나 잔류 혈액 등을 제거할 수 있다. 세정후의 창상 치유 촉진재에 대해서는, 홀더나 용기에 장착한 상태 또는 꺼낸 상태에서, 건조하지 않도록 또한 무균적으로 보존하면 되고, 그 방법은 전혀 한정하지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 창상 치유 촉진재를 제조하기 위한 디바이스로서, 액체의 주입과 배출을 위한 입구와 출구가 붙은 개방 가능한 액밀 용기의 내부에서, 용기 내부를 2실로 나누고, 한쪽을 입구측에 다른 쪽을 출구측에 통하도록 시트 모양 다공질체를 배치한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스에 관한 것이기도 하다.
본 발명에서, 액체의 주입과 배출을 위한 입구와 출구가 붙은 액밀 용기란, 세포 부유액의 주입과 배출(여과) 또는 체외 순환이 가능한 입구와 출구가 붙은 용기이다. 예를 들면, 공지되어 있는 평판 모양의 백혈구 제거 필터 디바이스(예를 들면 WO01/091880호 팸플릿을 참조할 수 있다)나 공지되어 있는 원통 모양의 백혈 구 제거 모듈(예를 들면 WO99/058172호 팸플릿을 참조할 수 있다)과 같은 외부 형상을 갖고 있고, 내부 구조도 이들과 마찬가지로, 여과재(본 발명에서 말하는 시트 모양 다공질체)가 용기 내부를 여과 전후의 액체가 혼합되지 않도록 2실로 나누고, 한쪽이 입구측에, 다른 쪽이 출구측에 통하도록 배치되어 있다.
본 발명의 장치에 사용되는 용기의 형상은 특별히 한정되지 않고, 시트 모양 다공질 재료를 수납하기 쉽고, 액체가 새지 않게 되어 있고, 세포 부유액이 시트 모양 다공질 재료를 흐르기 쉬운 형상이면 된다. 단, 시트 모양의 다공질 재료를 그대로 수용하는 것이라면 평판형이 바람직하고, 피륙 모양으로 해서 수용하는 것이라면 원통형이 수납하기 쉽다. 또한, 평판형 용기에 가요성 재료를 사용하여, 평판형 용기 전체를 피륙 모양으로 감음으로써 콤팩트한 상태로 할 수도 있다.
여기서 말하는 개방 가능이란, 혈구가 포착된 시트 모양 다공질 재료를 상기 용기로부터 간편하게 꺼낼 수 있거나, 혹은 혈구 포착면의 일부를 용이하게 노출할 수 있는 용기 구조를 의미하고, 본 디바이스에서 필요한 구조이다. 예를 들면 용기 본체가 나사식, 패킹식, 마찰식 등의 체결 수단을 갖는 것, 또는 잡아 뗄 수 있는 부착식으로 되어 있는 구조를 예시할 수 있다. 더 구체적으로는, 평판 모양 용기의 경우에는, 액체 입구가 붙은 가요성 수지 시트 용기와 액체 출구가 붙은 가요성 수지 시트 용기를, 시트 모양 다공질체를 끼워 넣도록 그들의 주변부에서 용착 또는 접착한 연질 디바이스가 바람직하고, 원통 모양 용기의 경우에는, 액체 입구와 상기한 체결 수단이 붙은 헤더부와, 액체 출구와 체결 수단이 붙은 헤더부를, 피륙 모양으로 한 시트 모양 다공질체를 수용한 통 모양 몸통부의 양단에 체결한 경질 디바이스가 바람직하다. 전자에서는, 예를 들면 도 1a에 도시한 바와 같이 용착 또는 접착한 시트에 혈구가 포착된 시트 모양 다공질체의 일부를 노출해서 창상 부위에 붙일 때에 매우 편리하고, 후자에서는, 전체적으로는 소형이어도 큰 여과 면적을 확보할 수 있기 때문에 체외 순환에 의해 제조하기에 적합하고, 그 결과, 대면적 혹은 대량의 창상 치유 촉진재를 얻기에 적합하다.
또한, 혈구가 포착된 시트 모양 다공질 재료를 상기 용기로부터 간편하게 꺼내거나, 혹은 혈구 포착면의 일부를 용이하게 노출하는 것이 가능하다면, 상기한 바와 같은 개방 가능한 수단이 없어도 되고, 용기의 전체 혹은 일부가 외측으로부터 용이하게 파괴 가능한 재료나 구조로 되어 있어도 된다. 나아가, 시판되고 있는 평판 모양 또는 원통 모양의 백혈구 제거 필터를 적당하게 선택해서 이용할 수도 있다.
본 발명의 창상 치유 촉진재 제조 디바이스에는, 세포 부유액을 무균적으로 흐르게 하기 위해서 용기 입구측에 채혈 백과 접속하기 위한 스파이크 침이 부착된 튜브를 접속할 수도 있다. 단지 튜브만을 장착해 두고, 무균 접속기로 접속해도 된다. 또한, 여과액을 이용하여 혈장 또는 혈청을 제조하는 것을 쉽게 하기 위해서 용기의 출구측에 원심용 백을 접속할 수도 있다. 또한, 혈액 펌프나 도혈부 및 반혈부 등을 구비한 일반적인 체외 순환 회로를 접속할 수도 있다.
본 발명의 창상 치유 촉진재 제조 디바이스를 멸균 자루에 포장하는 경우, 시트 모양 다공성 재료를 수용하는 용기를 멸균 자루에 포장하고, 추가로 장치 전체를 별도의 멸균 자루로 포장해도 된다. 이렇게 함에 따라, 세포 부유액을 흐르 게 한 후에 다공질 재료를 실제로 창상 부위에 붙일 때까지 동안 용기 및 다공질 재료를 무균적으로 유지 가능하게 되어, 취급성이 현저하게 향상된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 창상 치유 촉진재를 창상 부위에 붙이는 창상 부위의 치료 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 창상 치유 촉진재에 의한 창상 부위의 치료 방법에는, 용기로부터 시트 모양 다공질체를 꺼내서 붙이는 방법(도 1b)이나, 시트 모양 다공질체의 일면을 용기로부터 노출시킨 상태에서 붙이는 방법(도 1a)을 예시할 수 있다. 전자에서는, 노출면의 반대측이 용기로 덮여 있기 때문에 시트 모양 다공질체의 무균성이 더 뛰어나고, 또한 다공질체의 건조를 방지할 수도 있다. 이와 같은 이유로 인해, 전자에서는 특히 체표면에의 적용성이 우수하다.
또한 본 발명의 치료 방법에서는, 창상 부위에 붙인 창상 치유 촉진재의 표면을 보호재에 의해 피복 고정해도 된다. 이 때, 치료 부위, 특히 창상 치유 촉진재 표면의 건조를 막기 위해서, 투수성을 갖지 않는 소재를 포함하는 보호재를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 기체 투과성을 가지면서 투습성을 갖지 않는 소재라면, 혈구 세포에의 산소 공급이 용이하게 되어, 세포 활성이 더 장기간 유지되기 때문에 특히 바람직하다. 이들 보호재는, 창상 치료 치유에서 통상 사용되는 것을 이용하면 된다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]:창상 치유 촉진재의 제조(인간 혈액)
혈액 세포를 표면에 갖는 시트 모양 다공질체를 이하의 방법으로 제조했다. 건강한 보통 사람인 지원자로부터, 항응고제로서 CPD(citrate-phosphate-dextrose)를 이용하여 말초혈을 채취했다(혈액:CPD=400:56, 백혈구 수:5,100개/㎕, 혈소판 수:14.4×104개/㎕). 폴리에틸렌테레프탈레이트제의 부직포(아사히가세이 주식회사, 평균 섬유 직경 2.6㎛, 두께 0.38㎜, 부피 밀도 0.27g/㎤)를 25㎜ 직경으로 펀칭하고, 이것을 2장 겹쳐서 칼럼(아도반테크사, 모델 넘버 PP-25)으로 유지하고, 칼럼에 말초혈 5㎖를 흐르게 했다. 혈액을 흐르게 한 후에 연속해서, 칼럼에 인산완충액 10㎖을 흐르게 하여 세정하고, 혈액 세포를 표면에 부착시킨 시트 모양 다공질체를 포함하는 창상 치유 촉진재를 얻었다.
상기 조작을 각각 2회 시행했지만, 처리에 필요한 시간은 모두 10분 이내였다.
처리 전후의 혈액 내에 포함되는 백혈구, 혈소판 수를 혈구 계산판에 의해 측정했다. 부직포 필터층에 의한 백혈구 및 혈소판의 포착률은 이하의 표 1과 같다.
백혈구 포착률 혈소판 포착률
1회째 74.5％ 83.3％
2회째 68.6％ 67.4％
[실시예 2]:창상 치유 촉진재의 조제(인간 혈액)
혈액 세포를 표면에 갖는 시트 모양 다공질체를 이하의 방법으로 조제했다. 건강한 보통 사람인 지원자로부터, 항응고제로서 헤파린을 이용하여 말초혈을 채취했다(혈액:헤파린=100:1, 백혈구 수:3,800개/㎕, 혈소판 수:22.5×104개/㎕). 폴리에틸렌테레프탈레이트제의 부직포(아사히가세이 주식회사, 평균 섬유 직경 1.1㎛, 두께 0.24㎜, 부피 밀도 0.17g/㎤)를 25㎜ 직경으로 펀칭하고, 이것을 2장 겹쳐서 칼럼(아도반테크사, 모델 넘버 PP-25)으로 유지하고, 칼럼에 말초혈 5㎖를 흐르게 했다. 혈액을 흐르게 한 후에 연속해서, 칼럼에 인산완충액 10㎖를 흐르게 하여 세정하고, 혈액 세포를 표면에 부착시킨 시트 모양 다공질체로 이루어진 창상 치유 촉진재를 얻었다.
상기 조작을 각각 2회 시행했지만, 처리에 필요한 시간은 모두 10분 이내였다.
처리 전후의 혈액 내에 포함되는 백혈구, 혈소판 수를 혈구 계산판에 의해 측정했다. 부직포 필터층에 의한 백혈구 및 혈소판의 포착률은 이하의 표 2와 같다.
백혈구 포착률 혈소판 포착률
1회째 74.7％ 72.8％
2회째 81.8％ 54.7％
[실시예 3]:창상 치유 촉진재의 조제(마우스 혈액)
혈액 세포를 표면에 갖는 시트 모양 다공질체를 이하의 방법으로 조제했다. 2형 당뇨병 모델 마우스(C57BL/KsJ-db/db Jct, 닛폰쿠레아(주))로부터, 항응고제로서 헤파린을 이용하여 말초혈을 채취했다(백혈구 수:5,200개/㎕, 혈액:헤파린=100:1). 폴리락트산제의 부직포(아사히가세이 주식회사, 평균 섬유 직경 1.14㎛, 두께 0.20㎜, 부피 밀도 0.20g/㎤)를 13㎜ 직경으로 펀칭하고, 이것을 3장 겹쳐서 5㎖ 시린지(데루모사)로 유지하고, 여기에 마우스 말초혈 200㎕를 흐르게 했다. 혈액을 흐르게 한 후에 연속해서, 인산완충액 200㎕를 흐르게 하여 세정하고, 혈액 세포를 표면에 부착시킨 시트 모양 다공질체로 이루어진 창상 치유 촉진재를 얻었다.
상기 조작을 각각 2회 시행했지만, 처리에 필요한 시간은 모두 2분 이내였다.
처리 전후의 혈액 내에 포함되는 백혈구를 혈구 계산판에 의해 측정했다. 부직포 필터층에 의한 백혈구의 포착률은 이하의 표 3과 같다.
백혈구 포착률
1회째 68.9％
2회째 66.3％
3회째 57.5％
[시험예 1]:섬유아세포의 증식율의 측정
실시예 1에서 조제한 혈액 세포를 표면에 부착한 부직포 창상 치유 촉진재와, 섬유아세포를 공배양하여, 섬유아세포의 증식률을 검토했다.
배양 용기로서는, 3㎛의 포어 사이즈의 막으로 나누어진 인서트를 갖는 멀티플 웰 배양용 플레이트(코닝사, 트랜스 웰 3452)를 사용했다.
인서트의 막으로 나누어진 위측에 실시예 1에서 혈액 처리를 행한 부직포(즉, 혈액 세포를 표면에 부착한 본 발명의 창상 치유 촉진재) 2장을 넣고, 아래측에 인간 태아 폐 유래의 정상 2배체 섬유아세포주(HEL, human embryonic lung fibroblast)를 파종했다. 세포의 파종 밀도는, 각 1×105개/웰로 하였다.
베이즐 배지 이글(Basal Medium Eagle)(시그마사, B1522)에서 제조사가 지정한 대로, 피루브산나트륨(ICN사)을 1mM, 100배 농축 비필수 아미노산(ICN사, Cat.#1681049)을 100배 희석되도록, 그리고 글루타민을 2mM로 되도록 첨가했다. 이것에 추가로, 최종 농도가 10％로 되도록 소 태아 혈청(FCS, 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)사)과, 항생 물질로서 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하여, 배양액을 제작했다. 배양액의 용량은 4㎖/웰로 했다.
또한, 컨트롤로서는, 혈액으로 처리하지 않는 부직포와 HEL의 공배양을 행했다.
상기한 배양물을, 5％ CO2, 37℃의 인큐베이터에서 4일간 배양후, 섬유아세포의 수를 측정했다. 결과를 표 4에 나타낸다. 섬유아세포의 회수에는 0.25％ 트립신/EDTA액(기부코사)을 사용했다.
혈액을 처리한 부직포 부직포만
세포수 5.0×105개/웰 2.0×105개/웰
표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 혈액 처리를 행한 부직포를 포함하는 본 발명의 창상 치유 촉진재를 이용하여 배양함으로써, 혈액 처리를 행하지 않은 부직포를 사용한 경우와 비교하여, 섬유아세포의 증식능이 높아지는 것이 실증되었다.
[시험예 2]:창상 치유 촉진재로부터의 성장 인자 생산
실시예 2에서 조제한 혈액 세포를 표면으로 한 부직포 창상 치유 촉진재를 배양액으로 배양하여 부착한 세포로부터 생산되는 각종 증식 인자의 농도를 검토했다.
배양 용기로서는, 직경 35㎜의 배양 접시(아사히테크노글라스사)를 사용했다.
실시예 2에서 혈액 처리를 행한 부직포(즉, 혈액 세포를 표면에 부착한 본 발명의 창상 치유 촉진재) 2장을 넣었다.
시판의 배양액 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(D-MEM, 기부코사)에 최종 농도가 2％로 되도록 소 태아 혈청(FBS, 기부코사)과, 항생 물질로서 겐타마이신을 첨가하여, 배양액을 제작했다. 배양액의 용량은 2㎖로 하였다.
상기한 배양물을, 5％ CO2, 37℃의 인큐베이터에서 48시간 배양후, 배양 상청을 회수하여 창상 치유 관련의 성장 인자로서 VEGF, PDGF-AB, 그리고 TGF-β1의 농도 측정을 행했다. 농도 측정은 시판의 ELISA 키트(R&D 시스템즈사)를 사용했다. 비교 대조로서는, 배양 전의 배양액 및 부직포 여과후에 회수된 혈액을 원심하여 조제한 혈장을 사용했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
VEGF pg/㎖ PDGF-AB ng/㎖ TGF-β1 ng/㎖
1회째 635 15.1 24.5
2회째 452 10.6 23.7
배양전의 배양액 0 0 0.7
혈장(1회째) 22 0.3 6.3
혈장(2회째) 30 0.2 6.4
표 5에 나타낸 바와 같이, 배양 전의 배양액 내 및 혈장 내와 비교하여, 혈액 세포를 표면에 갖는 부직포를 72시간 배양한 후의 배양 상청 내에는 성장 인자가 많이 생산되어 있음을 알 수 있었다.
[시험예 3]:동물 모델을 이용하여 창상 치유 효과를 다음과 같이 확인했다.
2형 당뇨병 모델 마우스(C57BL/KsJ-db/db Jct, 닛폰쿠레아(주))의 등 부위를 전신 마취 하에 털을 깎은 후, 생검용 6㎜Φ 펀치(카이인더스트리사, BP-60F)를 이용하여 피부 전층 결손 처치를 행했다. 마우스당 3개의 전층 결손 처치를 행했다.
다음에 3개의 전층 결손 부위에 각각 실시예 3에서 혈액 처리를 행한 폴리락트산제 부직포(즉, 혈액 세포를 표면에 갖는 본 발명의 창상 치유 촉진재), 혈액 처리를 행하지 않은 폴리락트산제 부직포, 그리고 비교 대조로서 아무것도 붙이지 않는 처치를 행하고, 추가로 이들을 폴리우레탄제의 창상 피복재(『데가담』, 3M사)로 고정했다. 비교 대조 부위에는 우레탄제 창상 피복재만을 붙였다.
2주일 후에 우레탄 시트 및 창상 치유 촉진재를 벗겨서 상처의 크기를 측정했다.
창상 부위 및 척도(scale)를 디지털 카메라로 동시에 측정하고, 수득된 화상으로부터 화상 해석 소프트 이미지(Image)J(the National Institutes of Health)로 해석함으로써 상처의 면적을 산출했다. 표 6에 전층 결손 처치 직후의 창상 부위 면적을 100이라 했을 때의 2주일후의 면적을 산출해 그 치유 정도를 비교했다.
마우스1 마우스2 마우스3 평균
혈액을 처리한 부직포 22％ 3％ 0％ 8.5％
부직포 63％ 132％ 294％ 162.9％
미처치 92％ 38％ 52％ 60.6％
표 6에 나타낸 바와 같이, 혈액을 처리한 부직포를 붙인 부위의 치유율은 유의하게 다른 것보다 치유 정도가 높았다. 폴리락트산제 부직포를 첨부한 부위에는 염증이 보이고, 처치 직후보다 오히려 상처가 확대되는 경향이 있었다.
본 발명에 의하면, 간편한 조작으로 단시간 내에 혈액 세포를 농축한 창상 치유 촉진재를 제조할 수 있다. 본 발명의 창상 치유 촉진재는 세포의 증식을 촉진하는 효과를 갖는다는 점에서, 본 발명의 창상 치유 촉진재를 사용함으로써 창상의 치유를 촉진할 수 있다.

Claims (90)

  1. 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판이 표면에 존재하는 시트 모양 다공질체를 포함하는 창상 치유 촉진재.
  2. 시트 모양 다공질체를 포함하며 세포 증식능을 갖는 창상 치유 촉진재.
  3. 제2항에 있어서, 섬유아세포의 증식능을 갖는 창상 치유 촉진재.
  4. 제3항에 있어서, 세포 증식능이 시트 모양 다공질체 표면에 존재하는 백혈구 및(또는) 혈소판에서 유래하는 창상 치유 촉진재.
  5. 시트 모양 다공질체를 포함하며 성장 인자 생산능을 갖는 창상 치유 촉진재.
  6. 제5항에 있어서, 대조 혈장에 대한 성장 인자의 생산능이, 혈관 내피 증식 인자(VEGF)의 경우에는 5배 이상, 혈소판 유래 증식 인자-AB(PDGF-AB)의 경우에는 2배 이상, 형질 전환성 성장 인자(TGF-β1)의 경우에는 2배 이상 중 어느 하나를 만족하는 창상 치유 촉진재.
  7. 제6항에 있어서, 성장 인자의 생산능이, 시트 모양 다공질체 표면에 존재하 는 백혈구 및(또는) 혈소판에서 유래하는 창상 치유 촉진재.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 두께가 0.01∼3㎜인 창상 치유 촉진재.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 창상 부위의 형상에 맞춰서 변형 가능한 창상 치유 촉진재.
  10. 제9항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 부직포인 창상 치유 촉진재.
  11. 제10항에 있어서, 부직포의 섬유 직경이 0.3∼50㎛, 부피 밀도가 0.05∼0.5g/㎤인 창상 치유 촉진재.
  12. 제9항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 스펀지 모양 구조체인 창상 치유 촉진재.
  13. 제12항에 있어서, 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이 1.0∼40㎛인 창상 치유 촉진재.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 재질이 천연 고분자 또는 합성 고분자인 창상 치유 촉진재.
  15. 제14항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 재질이 소수성 고분자를 주요 성분으로 하는 합성 고분자인 창상 치유 촉진재.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 재질이 생분해성 소재인 창상 치유 촉진재.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 백혈구 및(또는) 혈소판이 말초혈, 골수액 또는 제대혈 유래인 창상 치유 촉진재.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 백혈구 및(또는) 혈소판이 성숙 세포인 창상 치유 촉진재.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 백혈구 및(또는) 혈소판이 자기 유래인 창상 치유 촉진재.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체에서의 백혈구 밀도가 6.0×106개/㎤ 이상이고(이거나) 혈소판 밀도가 2.5×108개/㎤ 이상인 창 상 치유 촉진재.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체에 섬유아세포를 넣은 창상 치유 촉진재.
  22. 제21항에 있어서, 섬유아세포가 창상 조직과 동일한 조직 유래의 섬유아세포인 창상 치유 촉진재.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 피브린을 포함하는 창상 치유 촉진재.
  24. 시트 모양 다공질체에 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포착하는 공정을 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 두께가 0.01∼3㎜인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 부직포인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 부직포의 섬유 직경이 0.3∼50㎛, 부피 밀도가 0.05∼0.5g/㎤인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 스펀지 모양 구조체인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이 1.0∼40㎛인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 표면이 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  32. 제31항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 적혈구에 비해 백혈구 및(또는) 혈소판을 선택적으로 포착하는 것인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  33. 제32항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 백혈구 포착률이 50％ 이상이고(이거나) 혈소판 포착률이 50％ 이상인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포함하는 세포 부유액을 여과에 의해 시트 모양 다공질체에 포착하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  35. 제34항에 있어서, 여과가 한번에 행해지는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  36. 제35항에 있어서, 세포 부유액의 여과 액량이 400㎖ 미만인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  37. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 유효 여과 면적에 대한 여과 액량의 비가 10㎖/㎠ 미만인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 용적에 대한 여과 액량의 비가 100 미만인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체에 대하여 세포 부유액을 일회 여과시키는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  40. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체에 대한 세 포 부유액의 여과 방향이 일방향인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 시간이 20분 이내인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  42. 제34항에 있어서, 여과가 체외 순환에 의해 행해지는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서, 여과 유속이 20∼200㎖/min인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 여과 시간이 10∼300분인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  45. 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 부유액이 신선한 혈액인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  46. 제45항에 있어서, 세포 부유액이 채혈후 48시간 이내의 신선한 혈액인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  47. 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 부유액이 성숙 세포를 주로 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  48. 제24항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 부유액이 자기혈 유래인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  49. 제24항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 부유액이 시트르산염, 헤파린류 또는 가수분해 효소 저해제 중 어느 하나를 항응고제로서 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  50. 제24항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포착한 시트 모양 다공질체를 배양하는 공정을 추가로 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  51. 제50항에 있어서, 배양시에 세포 활성화제를 첨가하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  52. 제24항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체에 섬유아세포를 넣는 공정을 추가로 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  53. 제52항에 있어서, 섬유아세포를 시트 모양 다공질체에 접촉시키거나 또는 섬유아세포를 세포 부유액에 혼합해서 여과함으로써 넣는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  54. 제53항에 있어서, 섬유아세포가 창상 조직과 동일한 조직 유래의 섬유아세포인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  55. 제24항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체에 피브린을 포함시키는 공정을 추가로 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  56. 제55항에 있어서, 피브린이 제제 유래인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  57. 제56항에 있어서, 피브린이 세포 부유액을 시트 모양 다공질체에 여과했을 때의 여과액을 회수해 농축해서 얻은 것인 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  58. 제24항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 백혈구 및(또는) 혈소판을 포착한 후에 시트 모양 다공질체를 세정하는 공정을 추가로 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  59. 제24항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 백혈구 및(또는) 혈소 판을 시트 모양 다공질체에 포착하는 공정 및(또는) 상기 시트 모양 다공질체를 세정하는 공정이, 액체의 입구와 출구가 붙은 개방 가능한 액밀 용기 내에서 행해지는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  60. 제59항에 있어서, 개방 가능한 액밀 용기로부터 시트 모양 다공질체를 꺼내고, 보존하는 공정을 추가로 포함하는 창상 치유 촉진재의 제조 방법.
  61. 제24항 내지 제60항 중 어느 한 항의 창상 치유 촉진재의 제조 방법에 의해 수득되는 창상 치유 촉진재.
  62. 액체의 주입과 배출을 위한 입구와 출구가 붙은 개방 가능한 액밀 용기의 내부에서, 용기 내부를 2실로 나누고, 한쪽을 입구측에 다른 쪽을 출구측에 통하도록 시트 모양 다공질체를 배치한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  63. 제62항에 있어서, 가요성 수지 시트에 시트 모양 다공질체를 끼워서 용착 또는 접착한 연질 디바이스로서, 가요성 수지 시트부를 벗김으로써 내부의 시트 모양 다공질체를 노출 또는 취출 가능하게 한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  64. 제63항에 있어서, 평판 모양인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  65. 제62항에 있어서, 체결 수단을 구비한 경질 디바이스로서, 상기 체결 수단을 해제함으로써 내부의 시트 모양 다공질체를 노출 또는 취출 가능하게 한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  66. 제65항에 있어서, 원통 모양인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  67. 제66항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 피륙 모양으로 감겨서 수용되어 있는 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 두께가 0.01∼3㎜인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  69. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 부직포인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  70. 제69항에 있어서, 부직포의 섬유 직경이 0.3∼50㎛, 부피 밀도가 0.05∼0.5g/㎤인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  71. 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 스펀지 모양 구조체인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  72. 제71항에 있어서, 스펀지 모양 구조체의 평균 구멍 직경이 1.0∼40㎛인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  73. 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  74. 제73항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 표면이 혈액 세포의 선택 분리성을 갖는 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  75. 제74항에 있어서, 시트 모양 다공질체가 적혈구에 비해 백혈구 및(또는) 혈소판을 선택적으로 포착하는 것인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  76. 제75항에 있어서, 시트 모양 다공질체의 백혈구 포착률이 50％ 이상이고(이거나) 혈소판 포착률이 50％ 이상인 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  77. 제62항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 용기의 입구측 및(또는) 출구측에 백을 접속할 수 있는 접속 부품을 구비한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  78. 제77항에 있어서, 용기의 입구측에 채혈 백 및(또는) 출구측에 원심 백을 구 비한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  79. 제62항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 용기의 입구측 및 출구측에 체외 순환 회로를 구비한 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  80. 제62항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 자루에 포장되어 멸균된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  81. 제77항에 있어서, 용기의 입구 출구가 외부에 연통해서 포장되고, 장치 전체가 멸균 자루에 포장되어 멸균된 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스.
  82. 제62항 내지 제81항 중 어느 한 항의 창상 치유 촉진재의 제조 디바이스를 이용하여 수득되는 창상 치유 촉진재.
  83. 제1항 내지 제23항, 제61항 및 제82항 중 어느 한 항의 창상 치유 촉진재를 창상 부위에 붙이는 창상 부위의 치료 방법.
  84. 제83항에 있어서, 용기를 개방하고, 시트 모양 다공질체의 일면을 용기로부터 노출시킨 상태에서 붙이는 창상 부위의 치료 방법.
  85. 제84항에 있어서, 용기로부터 시트 모양 다공질체를 꺼내서 붙이는 창상 부위의 치료 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 창상 치유 촉진재를 제조후 30분 이내에 창상 부위에 붙이는 창상 부위의 치료 방법.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 창상이 체표면인 창상 부위의 치료 방법.
  88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 붙인 창상 치유 촉진재를 보호재에 의해 피복 고정하는 창상 부위의 치료 방법.
  89. 제88항에 있어서, 보호재가 투수성을 갖지 않는 소재를 포함하는 시트인 창상 부위의 치료 방법.
  90. 제89항에 있어서, 보호재가 기체 투과성을 갖고 또한 투수성을 갖지 않는 소재를 포함하는 시트인 창상 부위의 치료 방법.
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