CN1615149A

CN1615149A - 将多能干细胞从组织中流通到外周血的药物

Info

Publication number: CN1615149A
Application number: CNA028272676A
Authority: CN
Inventors: 佐藤秀尚; 山田阳史; 安藤博司; 横山裕美; 樱田一洋
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2001-11-19
Filing date: 2002-11-19
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2022-11-19
Also published as: AU2002366023B2; KR100704158B1; CN100484569C; AU2002366023A1; CA2467557A1; WO2003043651A1; EP1459759A1; KR20050044444A; JPWO2003043651A1; US20040265971A1; EP1459759A4

Abstract

从组织(骨髓，皮肤，骨骼肌，等等)中流通多能干细胞到外周血的药物；使用从组织(骨髓，皮肤，骨骼肌，等等)中流通多能干细胞到外周血的药物治疗心力衰竭，肝衰竭，肾衰竭，神经变性疾病(帕金森氏病，阿尔茨海默氏病)，心血管疾病，脑血管疾病，脊髓损伤，关节炎，骨质疏松，糖尿病等等的方法。

Description

将多能干细胞从组织中流通到外周血的药物

技术领域

本发明涉及将有能力分化为多种存在于成体组织中的细胞，例如红细胞，白细胞，血小板，纤维母细胞，脂肪细胞，骨骼肌细胞，平滑肌细胞，心肌细胞，神经元，神经胶质，少突胶质细胞，血管内皮细胞，皮肤表皮细胞，皮肤真皮细胞，毛囊细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，软骨细胞，气管上皮细胞，肺泡细胞，胃肠道上皮细胞，口腔上皮细胞，成釉质细胞，成牙本质细胞，肝细胞，肝星形细胞，胆囊上皮细胞，胰脏内分泌细胞，胰脏外分泌细胞，肾管状细胞，肾血管小球细胞，输尿管上皮细胞，泌尿道上皮细胞，垂体内分泌细胞，甲状腺细胞，肾上腺皮质细胞，肾上腺髓质细胞，前列腺细胞，乳腺细胞，视细胞，色素上皮细胞，角膜细胞，泪腺细胞和鼓室细胞的多能干细胞流通到外周血的试剂；通过含有试剂的组织再生而进行治疗的试剂；使用试剂回收多能干细胞的方法；将通过以上方法制备的多能干细胞诱导分化为体细胞的方法。

发明背景

目前，从脑死亡的供体进行器官移植作为心功能不全，肝功能不全，肾功能不全，神经变性疾病(例如帕金森氏病，阿尔茨海默氏病)，心血管疾病，脑血管疾病，脊柱损伤，关节炎，骨质疏松，糖尿病等等的一种激进疗法。然而，由于缺少供体，所以即使在移植治疗发达的美国，希望器官移植的患者中只有大约5％可以获得器官[J.Am.Med.Assoc.， 267，239-246(1992)]。

另外，器官移植伴有免疫排斥，所以，一生都要施用免疫抑制剂，并且有遭受源于供体的感染性疾病的风险。

为了解决供体缺乏，异种移植技术正在发展。

然而，免疫排斥的问题还没有解决，并且与同种异体移植术相比，排斥的程度更为严重。猪被认为是异种移植的有效材料，通过移植还有感染来自于猪的病毒等等的风险。实际上，在马来西亚近1,000,000头猪感染了Hendra病毒，结果，导致多于70人死于感染[Nature， 398，549(1999)]。

为了克服以上提及的关于同种异体移植和异种移植的问题，从干细胞分化和诱导人组织和细胞的技术已经在研究。

干细胞是有着自我复制能力和分化为多种组织的多能能力的细胞。根据它们的收集部位，干细胞可以粗略地分为五种，它们是胚胎干细胞(ES细胞)，胎儿干细胞，成体干细胞，脐带血干细胞和胎盘干细胞。ES细胞(胚胎干细胞)分离于囊胚期称为胚胎内细胞团的位置处，EG细胞(胚胎生殖细胞)收集于具有全能性，可以分化为成体的所有细胞的胚胎生殖系，所以，它们作为组织重建的材料引起广泛注意[Konnnichi no Ishoku，14，542-548(2001)]。另外，从胎儿组织中分离培养组织特异的干细胞，例如中性干细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，14720-14725(2000)]。然而，因为制备这样的衍生于胚胎和胎儿的干细胞，需要破坏胚胎和胎儿，所以有一个伦理问题。而且，干细胞不是患者自身的细胞，在从脑死亡的供体进行器官移植的情况下不易避免免疫排斥。而且，因为胚胎的干细胞和胎儿的干细胞的功能是个体的产生，它们的特性与成体干细胞不同，它们对成体组织的亲和性也不同。实际上，当ES细胞移植到成体组织时，会形成肿瘤。以上表明移植源于胚胎和胎儿的细胞到成体中的治疗方法不容易检验和证明其长期的安全性。

在干细胞是源于成体组织的情况下，使用患者自身的细胞进行治疗是可行的。

干细胞有自我复制的能力，它们可以大量的产生。相应的，可以通过证明体外培养和产生的干细胞与组织中的干细胞相同，保证移植的安全性。用于皮肤和软骨复制的商业产品已经有售[TanpakushitsuKakusan Koso， 45，2342-2347(2000)]。

然而，存在于成体组织中的组织特异性干细胞分裂能力有限，所以有一个不利之处即难以获得足量的细胞。另外，只要是使用组织特异性的干细胞，它们只能用于治疗这种组织，并且不能重复使用。

然而最近表明有能力分化为成体中几乎所有种类细胞的多能干细胞存在于成体组织中(WO 01/11011，WO 01/21767，WO 01/48149)。

因为有自我复制能力的这样的细胞表现为无限生长，所以也可以大量地产生细胞。进一步地，与源于胚胎和的ES细胞不同，那些细胞即使移植到成体细胞，也不形成肿瘤。已经表明出生后这样的多能干细胞可以在从人的皮肤，骨骼肌和骨髓中制备。

另一方面，为了治疗多种疾病已经尝试通过移植造血干细胞进行造血系统重建。造血干细胞从骨髓收集，从骨髓中收集干细胞对患者而言是一个负担。所以，考虑到使收集容易或使移植时间缩短，已经尝试将造血干细胞流通到外周血中，从外周血中收集造血干细胞而不是从骨髓中收集造血干细胞。

作为将造血干细胞流通到外周血的方法，此方法已知使用造血系统生长因子，趋化因子，细胞毒素剂，等等。

G-CSF(粒细胞集落-刺激因子)，GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子)，IL-7，IL-12，flt-3配体，干细胞因子(SCF)，血小板生成素，等等已知作为造血系统的生长因子。IL-8，MIP-2(巨噬细胞炎症蛋白-2)，BB-10010(MIP-1α)等等已知作为趋化因子。环磷酰胺等已知作为细胞毒素剂[Blood， 10，3025-3031(2000)]。

哥伦比亚大学的研究组发现通过G-CSF流通到人外周血的细胞中分离出CD34-阳性细胞，并且移植到心脏梗塞模型中时，血管生成发生，心功能提高[Nature Medicine， 7，430-436(2001)，WO 2001/94420]。

纽约州立大学的研究组发现小鼠骨髓的Lin-阴性和c-kit-阳性造血干细胞移植到患有心脏梗塞的小鼠时，心肌和血管再生[Nature，410，701-705(2001)]。同一研究组也发现，当心脏梗塞开始前给小鼠施用G-CSF和SCF，在梗塞位置发生心肌和血管再生，研究组认为通过G-CSF造血干细胞流向外周血，因此梗塞的心肌再生[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，10344-10349(2001)]。

发明公开

多能干细胞可以再生多种组织。从患者的皮肤，骨骼肌和骨髓中收集多能干细胞涉及例如对患者自身造成剧痛，组织破坏等等问题。所以，为了容易地从患者的外周血中进行收集，需要将多能干细胞流通到外周血的试剂。也要求找出没有细胞移植时，使组织破坏和变性的因素，所述因素可以简化从患者中收集细胞，细胞体外培养和细胞移植到患者的使用细胞的再生医药治疗步骤。

为了解决以上提及的问题，已经加强研究以找出多种因素，结果，据信在活化免疫系统中起作用的细胞因子已经发现有把参与多种组织修复的多能干细胞流通到外周血中的作用，因此本发明已经达到。

本发明是关于以下的(1)到(40)。

(1)将多能干细胞从组织中流通到外周血的试剂，其含有作为活性成分的细胞因子，所述细胞因子选自活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子，活化的单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子，和G-CSF受体表达的造血细胞分泌的细胞因子。

(2)以上(1)中提及的试剂，其中细胞因子是选自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8的细胞因子。

(3)以上(1)中提及的试剂，其中活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子选自M-CSF和GM-CSF。

(4)以上(1)中提及的试剂，其中表达G-CSF受体的造血细胞是粒细胞或中性粒细胞。

(5)以上(4)中提及的试剂，其中中性粒细胞分泌的细胞因子是IL-8。

(6)以上的(1)到(5)中任意一项提及的试剂，其中细胞因子是化学修饰过的细胞因子。

(7)以上(6)中提及的试剂，其中细胞因子用聚亚烷基二醇化学修饰的细胞因子。

(8)以上的(1)到(7)中任意一项提及的试剂，其中构成细胞因子的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且细胞因子实质上有相同的活性。

(9)以上(1)中提及的试剂，其中组织是骨髓。

(10)以上(1)中提及的试剂，其中多功能干细胞选自CD45-阴性细胞，血型糖蛋白A-阴性细胞和oct3/4-阳性细胞。

(11)以上(1)中提及的试剂，其中多功能干细胞选自CD45-阴性和血型糖蛋白A-阴性细胞，oct3/4-阳性和CD45-阴性细胞，oct3/4-阳性和血型糖蛋白A-阴性细胞，CD45-阴性，血型糖蛋白A-阴性和oct3/4-阳性细胞和CD45-阴性和CD34-阴性细胞。

(12)以上(1)中提及的试剂，其中多功能干细胞选自CD34-阳性，CD117-阳性和CD140-阳性细胞，CD10-阳性和CD66e-阳性细胞，CD13-阳性和CD49b-阳性细胞和CD45-阴性和CD34-阳性细胞。

(13)一种回收流通为外周血干细胞的多能干细胞的方法，其中使用以上(1)到(12)中任意一项提及的试剂。

(14)一种再生组织的方法，其中使用以上(13)中提及的方法获得多能干细胞。

(15)使用以上(1)到(12)中任意一项提及的试剂诱导流通为外周血干细胞的多能干细胞分化为体细胞的方法。

(16)以上(15)提及的方法，其中体细胞是选自红细胞，白细胞，血小板，纤维母细胞，脂肪细胞，骨骼肌细胞，平滑肌细胞，心肌细胞，神经元，神经胶质，少突胶质细胞，血管内皮细胞，皮肤表皮细胞，皮肤真皮细胞，毛囊细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，软骨细胞，气管上皮细胞，肺泡细胞，胃肠道上皮细胞，口腔上皮细胞，成釉质细胞，成牙本质细胞，肝细胞，肝星形细胞，胆囊上皮细胞，胰脏内分泌细胞，胰脏外分泌细胞，肾管状细胞，肾血管小球细胞，输尿管上皮细胞，泌尿道上皮细胞，垂体内分泌细胞，甲状腺细胞，肾上腺皮质细胞，肾上腺髓质细胞，前列腺细胞，乳腺细胞，视细胞，色素上皮细胞，角膜细胞，泪腺细胞和鼓室细胞的细胞。

(17)一种组织再生治疗试剂，其含有作为活性成分的细胞因子，所述细胞因子选自活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子，活化的单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子，和G-CSF受体表达的造血细胞分泌的细胞因子。

(18)以上(17)中提及的治疗试剂，其中细胞因子选自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8。

(19)以上(17)中提及的治疗试剂，其中活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子选自M-CSF和GM-CSF。

(20)以上(17)中提及的治疗试剂，其中表达G-CSF受体的造血细胞是粒细胞或中性粒细胞。

(21))以上(20)中提及的治疗试剂，其中中性粒细胞分泌的细胞因子是IL-8。

(22)以上(17)到(21)中任意一项提及的治疗试剂，其中细胞因子是化学修饰的细胞因子。

(23)以上(22)中提及的治疗试剂，其中细胞因子是聚亚烷基二醇化学修饰的细胞因子。

(24)以上(17)到(23)中任意一项提及的治疗试剂，其中构成细胞因子的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且细胞因子大体上有相同的活性。

(25)以上(17)到(24)中任意一项提及的治疗试剂，其中组织选自神经组织，皮肤组织，心血管组织，呼吸组织，骨骼组织，结缔组织，血液，免疫组织，肠组织，口腔组织，肝组织，胰腺组织，泌尿组织，内分泌腺和感觉组织。

(26)以上(25)中提及的治疗试剂，其中神经组织选自中枢神经系统和周围神经系统。

(27)以上(25)中提及的治疗试剂，其中皮肤组织选自皮肤表皮，皮肤真皮和皮下组织。

(28)以上(25)中提及的治疗试剂，其中心血管组织选自心脏，动脉血管，静脉血管，毛细血管和淋巴管。

(29)以上(25)中提及的治疗试剂，其中呼吸组织选自鼻粘膜，气管和气囊。

(30)以上(25)中提及的治疗试剂，其中骨骼组织选自骨，软骨，关节，韧带和跟腱。

(31)以上(25)中提及的治疗试剂，其中结缔组织选自脂肪组织和纤维组织。

(32)以上(25)中提及的治疗试剂，其中血液组织选自红细胞，白细胞和血小板。

(33)以上(25)中提及的治疗试剂，其中免疫组织选自淋巴细胞，单核细胞，粒细胞，胸腺，淋巴结和脾。

(34)以上(25)中提及的治疗试剂，其中肠组织选自唾液腺，胃，十二指肠，小肠，大肠，直肠和肛门。

(35)以上(25)中提及的治疗试剂，其中口腔组织选自口腔粘膜，牙和舌。

(36)以上(25)中提及的治疗试剂，其中肝组织选自肝和胆囊。

(37)以上(25)中提及的治疗试剂，其中胰腺组织选自胰腺的外分泌腺和胰腺的内分泌腺。

(38)以上(25)中提及的治疗试剂，其中泌尿组织选自肾单位，肾泌尿小管，肾髓质，输尿管，膀胱和泌尿道。

(39)以上(25)中提及的治疗试剂，其中内分泌腺选自垂体，甲状腺，周围神经。

(40)以上(25)中提及的治疗试剂，其中感觉组织选自味蕾，嗅上皮，视网膜，角膜，晶状体，内耳和周围神经系统。

本发明以下将详细描述。

1.将多能干细胞从组织中流通到外周血的试剂

本发明涉及将多能干细胞从组织中流通到外周血的试剂，所述试剂含有作为活性成分的细胞因子，例如活化粒细胞，单核细胞或巨噬细胞的细胞因子，活化的单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子，和G-CSF受体表达的造血细胞分泌的细胞因子。

有以上提及的特性的任何细胞因子都可以作为本发明的试剂。

例如，M-CSF，GM-CSF，等等，可以作为活化粒细胞，单核细胞和巨噬细胞的细胞因子的例子；G-CSF，GM-CSF等等可以作为活化的巨噬细胞分泌的细胞因子的例子；IL-8等等可以作为中性粒细胞分泌的细胞因子的例子。

虽然金属蛋白酶明胶酶B(以后缩写为MMP-9)并不是细胞因子，但是它可以作为一种与本发明中以上提及的细胞因子相同的物质，因为它与中性粒细胞分泌的细胞因子有相同的活性。

以上提及的被化学修饰的细胞因子也可以作为本发明的药物使用。化学修饰方法的例子是聚亚烷基二醇修饰(WO98/55500)，白蛋白，纤维素衍生物，明胶，胶原，纤维蛋白，多糖，透明质酸，聚乳酸，乳酸与乙醇酸的共聚物，聚乙烯吡咯烷酮，葡聚糖和聚氨基酸修饰(Bioconjugate Chemistry， 3，349-362，1992)，脂例如卵磷脂修饰(J.Pharm.Exp.Therap.， 271，1672-1677，1994)，苯乙烯与顺丁烯二酸共聚物(SMA)，乙烯醚与顺丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA)和聚乙烯醇(PVA)修饰(Bioconjugate Chemistry 6，332-351，1995)等等，优选的是聚亚烷基二醇修饰。

聚亚烷基二醇修饰细胞因子的具体例子是聚亚烷基二醇修饰的G-CSF和G-CSF衍生的ND28[J.Biochem.，115：814-819，(1994)]。

作为本发明的试剂，也可以使用如以上的大体上相同活性的细胞因子，在此，组成以上提及的细胞因子的氨基酸序列中，一个或几个氨基酸被去除，取代，插入或增加。“去除，取代，插入或增加”的表达意味着，在相同序列的任何位置，有一个或多个氨基酸残基的去除，取代，插入或增加。去除，取代，插入或增加可以同时发生，被去除，取代，插入或增加的氨基酸残基可以是天然类型也可以是非天然类型。天然的氨基酸残基的例子是L-丙氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸和L-半胱氨酸。

可以相互取代的氨基酸残基的例子显示如下。同组的氨基酸残基可以相互取代。组A：亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，戊氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲丝氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，环己基丙氨酸；组B：天冬氨酸，谷氨酸，异天冬氨酸，异谷氨酰胺，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸；组C：天冬酰胺，谷氨酰胺；组D：赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸；组E：脯氨酸，3-羟脯氨酸，3-羟脯氨酸；组F：丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸；组G：苯丙氨酸，酪氨酸。具体的，ND 28(Biochemical and Biophysical Research Communication， 159：103-111，1989)是G-CSF的变体的例子。ND 28是野生型G-CSF的第一个Thr，第三个Leu，第四个Gly，第五个Pro，第17个Cys分别被Ala，Thr，Tyr，Arg和Ser取代的物质。

表达G-CSF受体的造血干细胞的例子是髓样类型前体，淋巴细胞，血管内皮细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，等等，优选的是巨噬细胞和中性粒细胞。

在本发明的试剂中使用的细胞因子可以是单独使用也可以是联合使用。

在以上提及的组织中，骨髓是典型的组织。

以上多能干细胞的例子是CD 45-阴性细胞，血型糖蛋白A-阴性细胞，和oct 3/4-阳性细胞，等等，优选的多能干细胞是CD 45-阴性和血型糖蛋白A-阴性细胞，oct 3/4-阳性和CD 45-阴性细胞，oct3/4-阳性和血型糖蛋白A-阴性细胞，CD 10-阳性和CD 66e-阳性细胞，CD 13-阳性和CD 49b-阳性细胞等等，更优选的多能干细胞是CD 45-阴性，血型糖蛋白A-阴性和oct 3/4-阳性细胞，CD 34-阳性，CD 117-阳性和CD 140-阳性细胞，CD 45-阴性和CD-34阴性细胞，CD 45-阴性和CD-34阳性细胞等等。

具体例子是对CD 10，CD 13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，Flk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a和PDGF-R1b为阳性，对CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型和2-微球蛋白为阴性的多能干细胞；对CD 10和CD 66e为阳性，对CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 13，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CD19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 34，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 56，CD 57，CD 59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 90，CD 95，CD 105，CA 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DRJI，Class-1，FLT 3，FMC-7，annexin和LIN为阴性的多能干细胞；对CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC-I型为阳性的多能干细胞；对CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC-I型为阳性，对CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CA 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 57，CD 59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 66e，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 95，CD 105，CD 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DR-II，FLT 3，FMC-7，annexin和LIN为阴性的多能干细胞；以及对CD 34，CD 117，CD 144，CD 140，CD 29和CD 44为阳性，对CD 14，CD 45，Flk-1，CD 31，CD 105，CD 49b，CD 49d，CD 54，CD 102和CD 106为阴性的多能干细胞。

本发明的试剂没有特殊的限制，只要其含有至少一种选自活化粒细胞，单核细胞和巨噬细胞的因子，活化的单核细胞或巨噬细胞分泌的因子，或表达G-CSF受体，M-CSF，G-CSF，GM-CSF，IL-8和MMP-9的造血细胞分泌的因子中的因子，然而优选的是提供一种通过制药技术领域中已知的任何方法与一种或多种药学可接受载体混合而生产的试剂。

试剂的具体例子是作为遗传修饰的G-CSF制剂的Neu-Up(由Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.生产)，作为遗传修饰的G-CSF制剂的Neutrogin(由Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)，作为遗传修饰的G-CSF制剂的Gran(由Kirin Brewery Co.，Ltd.生产)，和M-CSF制剂的Leukoprol(由Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.生产)。

考虑到施用途径，理想的是使用对治疗最为有效的途径。优选的是口内施用和肠胃外施用例如气管内施用，直肠内施用，皮下施用，肌肉内施用和静脉内施用，最优选的是皮下施用和静脉内施用。

喷雾剂，胶囊，片剂，颗粒剂，糖浆，乳剂，栓剂，注射剂，软膏，粘膏等等是施用形态的例子。

合适于口服的制剂例子是乳剂，糖浆，胶囊，片剂，粉末和颗粒剂。

液体制剂例如乳剂和糖浆可以用水；例如蔗糖，山梨醇和果糖的糖类；例如聚乙二醇和丙二醇的二醇；例如芝麻油，橄榄油和豆油的油剂；例如对羟基苯甲酸的防腐剂；例如草莓味和薄荷味的香料；等等作为添加剂制作。

胶囊，片剂，粉末，颗粒剂等等用例如乳糖，葡萄糖，蔗糖和甘露醇的赋形剂；例如淀粉和海藻酸钠的分裂剂；例如硬脂酸镁和滑石的滑润剂；例如聚乙烯醇，羟丙纤维素和明胶的粘合剂；例如脂肪酸酯的表面活性剂；例如甘油的增塑剂；等等作为添加剂制作。

合适于肠胃外施用的制剂例子是注射剂，栓剂和喷雾剂。

注射剂用盐溶液，葡萄糖溶液，包含两者的混合物的载剂制备。

栓剂用载剂例如可可脂，氢化的脂或羧酸制备。

喷雾剂使用化合物本身或使用不刺激接受者的口腔和气管粘膜的载剂或类似材料而制备，把以上提及的要素分散为细颗粒，使吸收容易。

载剂的具体例子是乳糖和甘油。根据以上提及的要素和使用载剂的特性，试剂可以制备为气雾剂，干粉，等等。在那些肠胃外使用的试剂中，也可以加入作为口服试剂添加剂例子的成分。

虽然本药学组合物的剂量根据患者的年龄，症状等等变化，但是施用于包括人的哺乳动物时，在施用例如是G-CSF制剂的Neu-Up的情况下，剂量是0.1到1,000微克/千克/天。在施用的是M-CSF制剂的Leukoprol的情况下，剂量是100,000-10,000,000单位/天。施用或者是只施用一天的单次施用或者是天天施用。

因为施用本发明的试剂，现在可以流通多能干细胞到外周血中。

2.回收流通为外周血干细胞的多能干细胞的方法

本发明也涉及使用本发明的试剂流通为外周血干细胞的多能干细胞的回收方法。

使用本发明的试剂将流通到外周血中的多能干细胞的回收方法的例子是包括通过白细胞除去法从外周血中选择单核细胞，使用细胞标记识别的方法回收所要的细胞的方法。

白细胞除去法可以使用例如Haemonetics公司的CCS(细胞收集系统)的仪器。

通过使用细胞标记识别而进行所要细胞回收的方法的例子是利用识别细胞标记的抗体的方法，使用微珠和磁体的方法。

所要细胞的例子是有CD 45-阴性和/或血型糖蛋白-A阴性特性的细胞。

使用识别细胞标记抗体的方法的例子是一种包括使用识别CD 45和血型糖蛋白-A的抗体，从通过以上提及方法收集的外周血单核细胞中除去CD 45-阳性细胞和血型糖蛋白-A阳性细胞的方法，等等，所述CD 45是淋巴细胞的共同抗原，血型糖蛋白A是成红血细胞的共同抗原。

使用微珠和磁体的方法的例子是这样一种方法，所述方法包括把血型糖蛋白A和CD 45的微珠(Miltenyi Biotec)与从外周血中制备的单核细胞室温下孵育15分钟，然后使用Super MACS(Miltenyi Biotec)除去CD 45-阳性细胞和血型糖蛋白-A阳性细胞，所述Super MACS是一种磁体。通过本处理获得的细胞大约99.5％是CD 45-阴性和血型糖蛋白-A阴性细胞，并且在所获得的细胞中含有多能干细胞。

3.流通到外周血的多能干细胞的分离和孵育方法

以上2中制备的CD 45-阴性和血型糖蛋白-A阴性细胞中分离和孵育多能干细胞的方法有以下两种。

第一种方法如下。从外周血单核细胞中制备的CD 45-阴性和血型糖蛋白-A阴性细胞用包被5纳克/毫升纤维连接蛋白的培养皿，在培养基(培养基-A)中培养2到3星期，小的粘连细胞形成集落，所述培养基使用低糖DMEM，MCDB-201作为基础培养基，含有10微克/毫升胰岛素，5.5微克/毫升转铁蛋白，5纳克/毫升硒，0.5微克/毫升牛血清白蛋白，0.01微摩尔地塞米松，0.1毫摩尔L-抗坏血酸2-磷酸盐，2％胎牛血清，10纳克/毫升PDGF，10纳克/毫升EGF，10纳克/毫升IGF，1,000国际单位LIF。把细胞用识别细胞表面标记的抗体染色后，制备的细胞的特性可以用荧光活化细胞分离器(FACS)分析。

以上提及的方法制备的多能干细胞，其细胞标记可以用FACS分析鉴定。

可以使用CD 10，CD 13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，Flk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a，PDGF-R1b，CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD 45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型，2-微球蛋白，等等作为多能干细胞的细胞标记。

通过以上提及的方法制备的多能干细胞的例子是对CD 10，CD13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，Flk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a和PDGF-R1b为阳性，对CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD 45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型和2-微球蛋白为阴性的细胞。

制备多能干细胞的第二种方法如下。从外周血单核细胞中制备的CD 45-阴性和血型糖蛋白-A阴性细胞用含有10％马血清的EMEM培养基(培养基-B)培养并生长直到细胞汇合，然后细胞用含有0.05％胰蛋白酶和0.0744％EDTA的PBS溶液回收，冷却，并在含有7.5％DMSO的培养基B中冷冻到-80℃。冷冻细胞37℃复苏，细胞离心回收，在培养基B中再次培养。因为重复冷冻和复苏，所以多能干细胞被浓缩。

在这种方法制备的多能干细胞中，可以使用流式细胞仪分析鉴定细胞标记。

作为通过以上提及方法制备的多能干细胞，要提及的是(1)对CD 10和CD 66e为阳性，对CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 13，CD 14，CD 15，CD 16，CD18，CD 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 34，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 56，CD 57，CD 59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 90，CD 95，CD 105，CA 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DRII，Class-I，FLT 3，FMC-7，annexin和LIN为阴性的细胞；(2)对CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC-I型为阳性，对CD 1a，CD 2，CD3，CD 4，CD 5，CD 7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CA 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 57，CD59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 66e，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 95，CD 105，CD 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白-A，DR-II，FLT 3，FMC-7，annexin和LIN为阴性的细胞；(3)对CD 10，CD 13，CD 49b，CD 49e，CDw 90，Flk1，EGF-R，TGF-R1，TGF-R2，BMP-R1A，PDGF-R1a和PDGF-R1b为阳性，对CD 31，CD 34，CD 36，CD 38，CD 45，CD 50，CD 62E，CD 62P，HLA-DR，Muc 18，STRO-1，c-kit，Tie/Tek，CD 44，HLA-I型和2-微球蛋白为阴性的细胞；(4)对CD 34，CD 117，CD 144，CD 140，CD 29和CD 44为阳性，对CD 14，CD 45，CD 90，Flk-1，CD 31，CD 105，CD 49b，CD 49d，CD 54，CD 102和CD 106为阴性的细胞。

以上提及的细胞具有多潜能性，可以分化为成体中存在的除生殖腺之外的所有组织。另外，对CD 10，CD 13，CD 34，CD 56，CD 90和MHC ClaSS-I为阳性，对CD 1a，CD 2，CD 3，CD 4，CD 5，CD7，CD 8，CD 9，CD 11b，CD 11c，CD 14，CD 15，CD 16，CD 18，CA 19，CD 20，CD 22，CD 23，CD 24，CD 25，CD 31，CD 33，CD 36，CD 38，CD 41，CD 42b，CD 44，CD 45，CD 49d，CD 55，CD 57，CD59，CD 61，CD 62E，CD 65，CD 66e，CD 68，CD 69，CD 71，CD 79，CD 83，CD 95，CD 105，CD 117，CD 123，CD 166，血型糖蛋白A，DR-II，FLT3，FMC-7，annexin和LIN为阴性的细胞对于间质系统有多潜能性。

间质系统包括衍生于中胚层例如骨骼肌，平滑肌，心肌，骨骼，软骨，脂肪，成纤维细胞，血管和血液的细胞。

在FACS中分类的方法有水滴电荷法，细胞捕获法，等等(“FlowCytometer Jiyujizai”14-23页，Shujunsha，1999)。在任何这些方法中，与细胞表面表达的分子结合的抗体发出的荧光强度转化为电信号，由此抗原的表达量可以定量。也可以利用表面抗原，通过与使用的荧光类型结合而分离。荧光的例子是FITC(异硫氰酸荧光素)，PE(藻红蛋白)，APC(别藻蓝蛋白)，TR(Texas红)，Cy3，CyChrome，Red 613，Red 670，PerCP，TRI-Color，Quantum Red，等等(“FlowCytometer Jiyujizai”，3-13页，Sbujunsha，1999)。

4.本发明的再生和治疗组织的试剂

以上1中提及的试剂流通多能干细胞到外周血中，受损组织可以通过流通的多能干细胞再生。因此，以上1中的试剂可以用于再生和治疗组织。

作为使用本发明的再生和治疗组织的试剂治疗疾病的方法，提及的是包括对患者施用该试剂修复受损部位的方法，包括通过以上1的试剂，通过以上2的方法，回收流通到外周血中的多能干细胞，把回收的多能干细胞本身或者体外分化成为所要的细胞或组织后移植到受损部位的方法，等等。

本发明的再生和治疗组织的试剂可以流通多能干细胞到外周血中，然后多能干细胞迁移或分化到受损部位，修复受损组织。

所以，对于组织受损迅速发生的疾病的治疗，优选的是使用包括直接对患者施用根据本发明的再生和治疗组织的试剂的方法。

组织受损迅速发生的疾病的例子是器官或组织不可逆受损例如心功能不全，肝功能不全，肾功能不全，心血管损伤，脑血管损伤，骨髓损伤，由于癌症化疗或癌症免疫疗法的产生的副作用。

也可以通过施用根据本发明的再生和治疗组织的试剂，通过以上提及的方法2回收流通到外周血中的多能干细胞，把回收的多能干细胞本身或者体外分化后成为所要的细胞或组织移植到受损部位，而治疗疾病。

当多能干细胞或分化的细胞用于治疗时，用Haemonetics公司的Hemolite 2 Plus或类似物用生理盐水溶液洗涤细胞。至于仪器，可以处于完全密闭的系统中，可以浓缩，洗涤，和回收培养细胞的仪器作为例子，优选是的可以几乎100％的除去用于培养和分化的物质例如细胞因子的仪器。这样回收的多能干细胞或分化的细胞可以通过通常的灌注输注入静脉或直接输注到患病部位而用于治疗。

这种方法优选用于治疗伴有慢性组织损伤或溃变的疾病。

伴有慢性组织损伤或溃变的疾病的例子是神经变性疾病，关节炎，顽固炎性肠病，骨质疏松，动脉硬化和糖尿病。

根据本发明，不仅仅活化粒细胞，单核细胞和巨噬细胞的因子，而且粒细胞，单核细胞和巨噬细胞也可以直接移植到组织，从而将多能干细胞流通到受损组织。

粒细胞，单核细胞和巨噬细胞可以通过使用一种磁性细胞分类系统(MACS)，从外周血单核细胞中收集CD 14-阳性细胞进行制备。它们也可以通过使用Methoculto H4434V(StemCell Tec)，孵育从骨髓或脐带血液中分离的CD 34-阳性，AC 133-阳性或CD 34-和AC133-双阳性造血干细胞而进行制备。

执行发明的最佳模式

实施例1通过单独施用G-CSF或者联合施用G-CSF和M-CSF，改变外周血中细胞的特性

(1)改变流通到外周血的细胞的数目

研究了通过施用G-CSF或者G-CSF和M-CSF改变流通到外周血的未分化干细胞的数目。

如下所示，准备包含4只小鼠的组A，包含5只小鼠的组B，包含5只小鼠的组C，连续5天施用三种不同的试剂。具体的，在组A的小鼠中，八周龄的四只雄性Balb/c小鼠(Nippon SLC)每只每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生产，商品名：Neu-Up)，连续5天。在组B的小鼠中，八周龄的五只雄性Balb/c小鼠每只每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生产，商品名：Neu-Up)和10⁵单位的M-CSF(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd生产，商品名：Leukoprol)，连续5天。在组C的小鼠中，八周龄的五只雄性Balb/c小鼠每只每天皮下注射200微升的PBS(磷酸盐缓冲盐)(pH7.4)(Life Technologies生产)，连续5天。

最后一次施用试剂的次日，组A，组B和组C每组中的小鼠用乙醚麻醉，从眼动脉收集大约1.2毫升外周血，置于事先有100单位肝素钠(Takeda Chemical industries生产)的管中，然后加入与收集血同样量的用于稀释的0.9％的NaCl，其铺在1.4毫升Nyco Prep 1.077 Animal(Daiichi Kagaku Yakuhin生产)上，室温600×g离心30分钟。收集悬浮于界面的单核细胞层，用1毫升PBS混合，室温400×g离心15分钟。除去上清液，沉淀的单核细胞悬浮于250微升MACS缓冲液[含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的PBS]中，在冰上与70微升小鼠CD 45微珠(Miltenyi Biotec生产)和30微升Ter-119微珠(Miltenyi Biotec生产)反应15分钟。往反应物中加入4毫升MACS缓冲液，混合物300×g离心10分钟，然后除去上清液。沉淀悬浮于400微升MACS缓冲液中。悬浮的细胞通过分离柱MS(Miltenyi Biotec生产)以除去CD45-阳性和Ter 119-阳性细胞，然后浓缩在外周血中含有的CD 45-阴性和Ter 119-阴性细胞。CD 45是白细胞的标记，而Ter 119是小鼠红细胞的标记。通过除去在外周血中含有的成熟细胞例如白细胞和红细胞，制备的CD 45-阴性和Ter 119-阴性细胞的总数，组A(施用G-CSF)分别是2.88×10⁴，2.32×10⁴，4.72×10⁴和2.08×10⁴，组B(施用G-CSF和M-CSF)分别是2.76×10⁴，7.93×10³，3.88×10⁴和4.94×10⁴和3.07×10⁴，组C(施用PBS)分别是5.28×10⁵，5.19×10³，2.60×10³，2.67×10³和2.67×10³。与施用PBS的组相比，单独施用G-CSF或联合施用G-CSF和M-CSF的组的外周血中细胞数增加。

(2)流通到外周血中的细胞的分析

使用FACS Calibur(Becton Dickinson生产)分析流通到外周血的细胞中表达多种细胞表面抗原的细胞的数目。在分析中，使用与在多能干细胞表面表达的五种抗原-CD 34，c-kit，CD 10，Sca-1和CD140a中的每一种抗原反应的抗体。

首先，通过以上方法浓缩的组A到组C的CD 45-阴性和Ter 119-阴性细胞全部回收，每一组的细胞等分3份，用于以下分析(以下称为“分开的细胞”)

首先，每一组中分开的细胞400×g室温离心10分钟，悬浮于20微升含有10％血清的DMEM培养基(Life Technologies生产)，然后加入10微升FITC标记的抗-鼠CD 34抗体(BD PharMingen生产)和10微升PE标记抗-鼠c-kit抗体(BD PharMingen生产)，冰上避光反应30分钟。DMEM培养基洗涤后，使用FACS Calibur(BectonDickinson生产)检测FITC和PE的荧光强度，测定表达抗原的细胞数目。结果，CD 34-阳性细胞的数目在小鼠组A平均为46.7，在小鼠组B平均为35.3，在小鼠组C平均为9.3，而c-kit-阳性细胞的数目在小鼠组A平均为31.3，小鼠组B平均为13.5，在小鼠组C平均为10.7。

然后，每一组的分开的细胞与10微升PE标记的抗鼠Sca-1抗体(BD Pharmingen生产)和10微升兔抗CD 10抗体(Santa CruzBiotechnology生产)冰上反应30分钟，DMEM培养基洗涤，与10微升FITC标记的抗兔Ig抗体(BD PharMingen生产)反应，使用FACS分别通过测定FITC和PE强度分析CD 10-阳性细胞和Sca 1-阳性细胞的数目。结果，CD 10-阳性细胞的数目在小鼠组A中平均为18.7，小鼠组B中平均为9.8，小鼠组C中平均为1.7。

Sca-1-阳性细胞的数目在小鼠组A中平均为18.7，小鼠组B中平均为11.8，小鼠组C中平均为1.7。

进一步的，每一组分开的细胞与10微升鼠抗-CD 140a抗体(BDPharMingen生产)冰上反应30分钟，DMEM培养基洗涤，与10微升FITC标记的抗鼠Ig抗体(BD PharMingen生产)反应，使用FACS通过测定FITC强度分析CD 140a-阳性细胞的数目。结果，CD 140a-阳性细胞的数目在小鼠组A中平均为19.3，小鼠组B中平均为6.3，小鼠组C中平均为4.7。

以上结果表明G-CSF可以流通不仅仅造血干细胞，单核细胞和巨噬细胞，而且流通多能干细胞到外周血。

实施例2.通过施用G-CSF流通到外周血中的CD 45-阴性，Ter119-阴性和CD 13-阳性细胞数目改变

准备包含5只小鼠的组D，包含5只小鼠的组E，与实施例1相似，连续5天施用两种不同试剂。具体的，在组D的小鼠中，八周龄的五只雄性Balb/c小鼠(Nippon SLC)每只每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生产，商品名：Neu-Up)，连续5天。在组E的小鼠中，八周龄的五只雄性Balb/c小鼠每只每天皮下注射200微升的PBS(磷酸盐缓冲盐)(pH7.4)(Life Technologies生产)，连续5天。

最后一次施用试剂的次日，组D和组E的每一只小鼠用乙醚麻醉，从眼动脉收集1.2毫升外周血，置于事先有100单位肝素钠(TakedaChemical industries生产)的管中，然后加入与收集血同样量的用于稀释的0.9％的NaCl，其铺在1.4毫升Nyco Prep 1.077 Animal(DaiichiPure Chemicals Co.，Ltd.生产)上，室温600×g离心30分钟。收集悬浮于界面的单核细胞层，用1毫升PBS混合，室温400×g离心15分钟。除去上清液，沉淀的单核细胞悬浮于250微升MACS缓冲液[含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的PBS]中，在冰上与70微升小鼠CD 45微珠(Miltenyi Biotec生产)和30微升Ter-119微珠(Miltenyi Biotec生产)反应15分钟。往反应溶液中加入4毫升MACS缓冲液，混合物300×g离心10分钟，然后除去上清液，沉淀悬浮于400微升MACS缓冲液中。悬浮的细胞通过分离柱MS(Miltenyi Biotec生产)以除去CD 45-阳性和Ter 119-阳性细胞，然后浓缩在外周血中含有的CD 45-阴性和Ter 119-阴性细胞。

在浓缩的CD 45-阴性和Ter 119-阴性细胞中，使用确定了在多能干细胞表面表达，作为指示物的CD 13，使用FACS Calibur(BetonDickinson)分析CD-13表达的细胞的数目。首先，通过以上方法浓缩的CD 45-阴性和Ter 119-阴性细胞400×g室温离心10分钟，悬浮于20微升含有10％血清的DMEM培养基(Life Technologies生产)中，然后加入10微升PE-标记的抗-鼠CD13抗体(BD PharMingen生产)和10微升Per CP-标记的抗-鼠CD 45抗体(BD PharMingen生产)，反应在冰上避光进行30分钟。DMEM培养基洗涤后，使用FACSCalibur(Becton Dickinson生产)测定荧光强度，分析抗原表达的细胞的数目。结果，CD 45-阴性，Ter 119-阴性和CD 13-阳性单核细胞的数目在小鼠组D中平均为29.5，小鼠组E中平均为11.9。结果表明G-CSF抗原流通不仅仅造血干细胞，单核细胞和巨噬细胞，而且还能流通多能干细胞到外周血。

实施例3.施用G-CSF流通到外周血的细胞的特性

(1)通过施用G-CSF流通到外周血的细胞移植到用X射线照射的小鼠中

通过把细胞移植到小鼠中分析施用G-CSF流通到外周血的细胞的特性。

GFP基因整合于身体所有细胞并且GFP基因表达的十周龄的小鼠(C57BL/6，×129株的F4)分为包含3只小鼠的组F，包含1只小鼠的组G，以下试剂施用于每一只小鼠。具体的，对于组F，每只小鼠每天皮下注射10微克的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd生产，商品名：Neu-Up)，连续5天。对于组G，每只小鼠每天皮下注射200微升PBS(pH7.4)(Life Technologies生产)，连续5天。

最后一次施用试剂的次日，组F和组G的每一只小鼠用乙醚麻醉，从眼静脉收集外周血，置于事先有肝素钠(Takeda Chemical industries生产)的管中，回收的外周血通过一个100-微升的细胞滤器(BectonDickinson生产)。至于组G，切除股骨，附着股骨的肌肉用剪刀截断，这样整个股骨暴露出来，然后用剪刀剪去两端。连着Thermo生产的27G针，并且含有PBS的注射针的前端插入股骨膝关节侧的截断端，通过把PBS吹入试管收集骨髓，将收集的骨髓细胞通过一个100微升的细胞滤器(Becton Dickinson生产)。

如下把收集的外周血或骨髓从尾静脉注入C57BL/6小鼠而进行移植。

首先，准备八周龄的C57BL/6小鼠(Nippon Claire)，从尾静脉注射的前一天，使用X-光照射仪(Hitachi Medico生产)，用剂量为12Gy的X-光照射小鼠。那些小鼠分为组H，组I，组J和组K。组H的每一只小鼠从其尾静脉移植300微升取自组F小鼠的外周血；组I的每一只小鼠从其尾静脉移植300微升取自组G小鼠的外周血；组J的每一只小鼠从其尾静脉移植3×10⁶个取自组G小鼠的骨髓细胞；组K的小鼠不进行移植。

结果，在组I和组K中，所有的小鼠从移植开始7到10天内死亡，然而，组H和组J，小鼠移植后八周仍存活。然而，骨髓移植的组J的一些小鼠，记录到外观和行为异常，例如，毛发出现，皮肤长疮，它们行走时朝头部倾斜，行走不自然。移植施用G-CSF的小鼠的外周血的组H，记录到外观和行为无异常。

结果表明，通过施用G-CSF，有能力分化成组织例如皮肤的干细胞流通到小鼠的外周血中。

(2)解剖细胞移植的小鼠

将(1)中获得的组H小鼠解剖并且灌注和固定，每个器官都切除。

具体的，小鼠通过腹膜内注射Nembutal(DainipponPharmaceutical Co.，Ltd.生产)进行麻醉，整个身体用70％乙醇润湿，提起股皮肤，从膝到大腿根的皮肤用剪子切开并打开，暴露出股动脉和静脉。用丝制的缝线(Natsume Seisakusho Co.，Ltd生产)结扎股动脉和静脉，从结扎端切断大腿。从此处切去胫骨，用剪子除去连着胫骨的肌肉，暴露出整个胫骨，用剪子剪去两端。连着Thermo生产的23G针，并且含有PBS的注射针的前端插入胫骨膝关节侧的截断端，通过把PBS吹入试管收集骨髓。

另一方面，小鼠经剖腹和胸廓切开，暴露出心脏，带翼的Thermo生产的25G静脉注射针插入左心室，切掉右心耳，流入20毫升PBS，灌注整个身体。收集从心脏溢出的血液作为外周血装在装有100单位肝素钠(Takeda Chemical industries Inc.生产)的管中。

所有PBS流出后，通过同样操作流入20毫升固定溶液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]进行固定。

然后，切除肺和气管，20毫升的装有连着由Thermo生产的surflow内针(20G)的导管，含有用PBS稀释2倍的OCT(最适割开温度)化合物(Miles生产)的注射器插入气管，导管前端和气管用丝制的缝线(Natsume Seisakusho Co.，Ltd.生产)连接，用PBS稀释两倍的10毫升OCT溶液通过气管注入肺。注入后，肺切成几平方毫米的块，用OCT化合物包被，将其用干冰冷冻的异戊烷冷冻。

别的器官也从小鼠切除，浸入固定溶液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中，4℃，2小时，用PBS漂洗，浸入高蔗糖溶液[20％蔗糖，PBS]中，4℃过夜，第二天切成几平方毫米的块，用OCT化合物包被，将其用干冰冷冻的异戊烷冷冻。

使用恒冷切片机把冷冻的组织切成10微米厚的片，贴附于包被有APS(Matsunami生产)的载玻片，干燥以制备冷冻切片。

在以上提及的操作中制备的外周血用相同量的0.9％NaCl稀释，铺在1.4毫升Nyco Prep 1.077Animal(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd生产)上，室温600×g离心30分钟。收集悬浮于界面的单核细胞层，用1毫升PBS混合，室温400×g离心15分钟。除去上清液，沉淀的单核细胞悬浮于0.5毫升PBS，使用FACS Calibur(Becton Dickinson生产)测定在外周单核细胞中GFP-阳性细胞数目的比率。结果，GFP-阳性细胞数目的比率是90.3％。

至于骨髓细胞，也用同样方式，使用FACS Calibur测定GFP-阳性细胞数目的比率，GFP-阳性细胞占87.3％。

切除的每个器官制备成的冷冻切片在Zeiss生产的荧光显微镜Axiophot 2下观察，证实在身体几乎所有的器官，例如肺，心脏，肝，脑，胃，皮肤，小肠，大肠，骨骼肌，胰脏，脾，肾，气管中都存在GFP-阳性细胞，特别是在脑中，例如嗅球，脉络丛区域观察到GFP-阳性细胞。结果表明小鼠的通过施用G-CSF动员到外周血的干细胞功能是修复身体的多种组织。

(3)通过免疫染色鉴定GFP-阳性细胞的特性

如下将(2)中制备的冷冻切片用多种抗体染色，观察GFP-阳性细胞的特性

首先，多种器官的组织切片用抗细胞角蛋白抗体免疫染色。细胞角蛋白是上皮细胞的标记。

皮肤切除制备成的冷冻切片置于载玻片上，载玻片浸于PBS中5分钟，重复3次。载玻片洗涤后，浸于用PBS稀释，终浓度为10毫克/毫升的蛋白酶K(Gibco BRL生产)中15分钟。PBS洗涤一次后，与固定溶液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]室温反应15分钟。PBS洗涤2次后，浸于封闭溶液[10％猪血清(Dako生产)，PBS]中室温1小时，与用PBS稀释50倍，含有1.5％猪血清的一抗溶液[单克隆鼠抗-人细胞角蛋白，Clones AE1/AE3]室温反应一小时。PBS洗涤4次后，与用PBS稀释800倍，含有1.5％猪血清的二抗溶液[Cy3-结合的Affini纯的羊抗-鼠IgG(H+L)](Seikagaku公司生产)室温反应1小时。PBS再洗涤4次后，含有DAPI的Vectashield封固剂(Vector Laboratories生产)滴入切片，用盖玻片封闭，在Zeiss生产的荧光显微镜Axiophot2下观察。因为观察到GFP-阳性和细胞角蛋白-阳性细胞，表明用于移植的通过G-CSF流通的外周血细胞中含有能够趋向皮肤和分化为上皮细胞的干细胞。

大肠的冷冻切片相似地使用抗-细胞角蛋白抗体染色，在荧光显微镜下观察，结果观察到GFP-阳性和细胞角蛋白-阳性细胞。结果表明，用于移植的通过G-CSF动员的外周血细胞中含有趋向大肠和分化为上皮细胞能力的干细胞。

小肠的冷冻切片相似地使用抗-细胞角蛋白抗体和CD 45抗体染色，CD 45是血细胞的标记。在荧光显微镜下观察，观察到细胞角蛋白-阳性和CD 45-阴性细胞。结果表明，用于移植的通过G-CSF动员的外周血细胞中含有趋向小肠和分化为除血细胞之外细胞能力的干细胞。

然后，使用抗-CD 45抗体，多种器官经免疫染色。

肺切除制备的冷冻切片置于载玻片上，浸于PBS中洗涤5分钟，重复3次。载玻片浸于Dako Biotin封闭系统(1)溶液(Dako生产)中室温10分钟，用PBS洗涤2次，浸于Dako Biotin封闭系统(2)溶液(Dako生产)中室温10分钟，用PBS再洗涤2次。

然后，载玻片浸于封闭溶液[10％猪血清(Dako生产)，PBS]中室温1小时，与用PBS稀释100倍，含有1.5％猪血清的一抗溶液[Biotin抗—鼠CD 45(LCA，Ly 5)](BD Pharmingen生产)室温反应1小时。PBS洗涤4次后，与用PBS稀释到终浓度为5微克/毫升，含有1.5％猪血清的二抗溶液(streptavidin，Alexa Fluor 594 conjugate)(MolecularProbe生产)室温反应1小时。PBS再洗涤4次后，含有DMPI的Vectashield封固剂(Vector Laboratories生产)滴入切片，用盖玻片封闭，在荧光显微镜下观察。结果观察到GFP-阳性和CD 45-阴性细胞。结果表明，在用于移植的通过G-CSF动员的外周血细胞中含有趋向肺和分化为除血细胞之外细胞能力的干细胞。

相似地肝的冷冻切片使用抗-CD 45抗体染色，在荧光显微镜下观察，观察到GFP-阳性和CD 45-阴性细胞。结果表明，用于移植的通过G-CSF动员的外周血细胞中含有趋向肝和分化为除血细胞之外细胞能力的干细胞。

心脏，脑，胃，皮肤，小肠，大肠，骨骼肌和胰腺的冷冻切片相似地使用抗-CD 45抗体染色，在荧光显微镜下观察，在每个组织中都观察到GFP-阳性和CD 45-阴性细胞。结果表明，用于移植的通过G-CSF动员的外周血细胞中含有趋向心脏，脑，胃，皮肤，小肠，大肠，骨骼肌和胰腺和分化为除血细胞之外细胞能力的干细胞。

工业实用性

本发明涉及流通能够分化为多种组织的多能干细胞到外周血的试剂，通过含有该试剂的组织再生进行治疗的试剂，使用试剂进行多能干细胞回收的方法，和诱导以上方法制备的多能干细胞分化为体细胞的方法。

Claims

1.一种将多能干细胞从组织流通到外周血的试剂，其含有作为活性成分的的细胞因子，所述的细胞因子选自活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子，活化的单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子和表达G-CSF受体的造血细胞分泌的细胞因子。

2.如权利要求1所述的试剂，其中细胞因子是选自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8的细胞因子。

3.如权利要求1所述的试剂，其中活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子选自M-CSF和GM-CSF。

4.如权利要求1所述的试剂，其中表达G-CSF受体的造血细胞是粒细胞或中性粒细胞。

5.如权利要求4所述的试剂，其中中性粒细胞分泌的细胞因子是IL-8。

6.如权利要求1到5中任意一项所述的试剂，其中细胞因子是化学修饰的细胞因子。

7.如权利要求6所述的试剂，其中细胞因子由聚亚烷基二醇化学修饰。

8.如权利要求1到7中任意一项所述的试剂，其中组成细胞因子的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且细胞因子有大体上相同的活性。

9.如权利要求1所述的试剂，其中组织是骨髓。

10.如权利要求1所述的试剂，其中多能干细胞选自CD45-阴性细胞，血型糖蛋白A-阴性细胞和oct3/4-阳性细胞。

11.如权利要求1所述的试剂，其中多能干细胞选自CD45-阴性和血型糖蛋白A-阴性细胞，oct3/4-阳性和CD45-阴性细胞，oct3/4-阳性和血型糖蛋白A-阴性细胞，CD45-阴性和血型糖蛋白A-阴性和oct3/4-阳性细胞与CD45-阴性和CD34-阴性细胞。

12.如权利要求1所述的试剂，其中多能干细胞选自CD34-阳性，CD117-阳性和CD140-阳性细胞，CD10-阳性和CD66e-阳性细胞，CD13-阳性和CD49b-阳性细胞与CD45-阳性和CD34-阳性细胞。

13.一种回收流通为外周血干细胞的多能干细胞的方法，其中使用如权利要求1到12中任意一项所述的试剂。

14.一种组织再生的方法，其中使用如权利要求13中所述的方法获得的多能干细胞。

15.使用如权利要求1到12中任意一项所述的试剂把流通为外周血干细胞的的多能干细胞分化为体细胞的方法。

16.如权利要求15所述的方法，其中体细胞是选自红细胞，白细胞，血小板，纤维母细胞，脂肪细胞，骨骼肌细胞，平滑肌细胞，心肌细胞，神经元，神经胶质，少突胶质细胞，血管内皮细胞，皮肤表皮细胞，皮肤真皮细胞，毛囊细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，软骨细胞，气管上皮细胞，肺泡细胞，胃肠道上皮细胞，口腔上皮细胞，成釉质细胞，成牙本质细胞，肝细胞，肝星形细胞，胆囊上皮细胞，胰脏内分泌细胞，胰脏外分泌细胞，肾管状细胞，肾血管小球细胞，输尿管上皮细胞，泌尿道上皮细胞，垂体内分泌细胞，甲状腺细胞，肾上腺皮质细胞，肾上腺髓质细胞，前列腺细胞，乳腺细胞，视细胞，色素上皮细胞，角膜细胞，泪腺细胞和鼓室细胞的细胞。

17.一种组织再生治疗试剂，其含有作为活性成分的的细胞因子，所述的细胞因子选自活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子，活化的单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子和表达G-CSF受体的造血细胞分泌的细胞因子。

18.如权利要求17所述的方法，其中细胞因子选自G-CSF，M-CSF，GM-CSF和IL-8。

19.如权利要求17所述的治疗试剂，其中活化单核细胞或巨噬细胞的细胞因子选自M-CSF和GM-CSF。

20.如权利要求17所述的治疗试剂，其中表达G-CSF受体的造血细胞是粒细胞或中性粒细胞。

21.如权利要求20所述的治疗试剂，其中中性粒细胞分泌的细胞因子是IL-8。

22.如权利要求17到21中任意一项所述的治疗试剂，其中细胞因子是化学修饰的细胞因子。

23.如权利要求22所述的治疗试剂，其中细胞因子由聚亚烷基二醇化学修饰。

24.如权利要求17到23中任意一项所述的治疗试剂，其中组成细胞因子的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸被去除，取代，插入或增加，并且细胞因子有大体上相同的活性。

25.如权利要求17到24所述的治疗试剂，其中组织选自神经组织，皮肤组织，心血管组织，呼吸组织，骨骼组织，结缔组织，血液，免疫组织，肠组织，口腔组织，肝组织，胰腺组织，泌尿组织，内分泌腺和感觉组织。

26.如权利要求25所述的治疗试剂，其中神经组织选自中枢神经系统和周围神经系统。

27.如权利要求25所述的治疗试剂，其中皮肤组织选自皮肤表皮，皮肤真皮，皮下组织。

28.如权利要求25所述的治疗试剂，其中心血管组织选自心脏，动脉血管，静脉血管，毛细血管和淋巴管。

29.如权利要求25所述的治疗试剂，其中呼吸组织选自鼻粘膜，气管和气囊。

30.如权利要求25所述的治疗试剂，其中骨骼组织选自骨，软骨，关节，韧带，跟腱。

31.如权利要求25所述的治疗试剂，其中结缔组织选自脂肪组织和纤维组织。

32.如权利要求25所述的治疗试剂，其中血组织选自红细胞，白细胞和血小板。

33.如权利要求25所述的治疗试剂，其中免疫组织选自淋巴细胞，单核细胞，粒细胞，胸腺，淋巴结和脾。

34.如权利要求25所述的治疗试剂，其中肠组织选自唾液腺，胃，十二指肠，小肠，大肠，直肠和肛门。

35.如权利要求25所述的治疗试剂，其中口腔组织选自口腔粘膜，牙和舌。

36.如权利要求25所述的治疗试剂，其中肝脏组织选自肝和胆囊。

37.如权利要求25所述的治疗试剂，其中胰腺组织选自胰腺的外分泌腺和胰腺的内分泌腺。

38.如权利要求25所述的治疗试剂，其中泌尿组织选自肾单位，肾泌尿小管，肾髓质，输尿管，膀胱和泌尿道。

39.如权利要求25所述的治疗试剂，其中内分泌腺选自垂体，甲状腺，周围神经。

40.如权利要求25所述的治疗试剂，其中感觉系统选自味蕾，嗅上皮，视网膜，角膜，晶状体，内耳和周围神经系统。