CN1599564A - 口服免疫刺激哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物的(1－4)连接的β－D－甘露糖醛酸 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种哺乳动物、鸟类、鱼类以及爬行动物的口服免疫刺激材料，所述材料包括免疫刺激量的M含量至少为40％的藻酸盐和可接受的载体。

Description

口服免疫刺激哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物的 (1-4)连接的β-D-甘露糖醛酸
发明领域
本发明涉及一种哺乳动物、鸟类、鱼类以及爬行动物的口服免疫刺激材料，所述材料包括免疫刺激量的(1-4)连接的β-D-甘露糖醛酸含量至少为40％的藻酸盐和如果需要或期望的可接受的载体。本发明还涉及刺激哺乳动物、鸟类、鱼类或爬行动物的免疫系统的方法，所述方法包括给激哺乳动物、鸟类、鱼类或爬行动物口服施用本发明的材料。
发明背景
藻酸盐分离自海洋褐色藻类。藻酸盐还产在某些土壤细菌中，如棕色固氮杆菌(Azotobacter vinelandii)和褐色球形固氮杆菌(Azotobactercrococcum)以及若干不同的假单胞菌种。然而，褐色海藻一般是市售藻酸盐的来源。
藻酸盐是藻酸的盐，为线性杂多糖，由在此命名为M的(1-4)连接的β-D-甘露糖醛酸和在此命名为G的α-L-古洛糖醛酸组成。这两个糖醛酸具有下列结构：
Figure A0282393400061
β-D-吡喃型甘露糖醛酸(M)               α-L-吡喃型古洛糖醛酸(G)
  4C1构象                                1C4构象
聚合物存在的形式有称为M-嵌段的甘露糖醛酸的均聚物序列，称为G-嵌段的古洛糖醛酸的均聚物序列以及命名为MG-嵌段或GM-嵌段的甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元的混合序列。下图代表藻酸盐结构的例子：
MMMMMMMGGGGGGGGMGMGMGMGMGGGGGGGGM
 M-嵌段 G-嵌段   MG-嵌段   G-嵌段
藻酸盐通常含有全部三种嵌段，并且嵌段主要由3-30个单体单元组成。嵌段的分布取决于从中分离藻酸盐的海藻的种类，以及取决于此海藻的年龄和部分，例如来自茎部的藻酸盐与分离自叶部的藻酸盐可能具有不同的序列和嵌段组成。海藻收集时的年份也影响嵌段组成和序列。根据常识，最高的G含量可在老L.hyperborea的茎部发现。同样物种的叶部具有稍低的G含量和略短的G嵌段，但其含量仍高于其他大多数物种。市售的藻酸盐通常具有的G含量为25％-70％。
藻酸盐已知用于食品和医药、牙科用、化妆品及其他工业产品。最常见的工业用途是基于它们的水状胶体和聚合电解质性质，这是胶形成、增稠、稳定、膨胀以及粘度提供性质的基础。
富含M的藻酸盐也显示具有免疫刺激活性，可用作疫苗佐剂和伤口愈合组合物，如在美国专利5,169,840中所描述。
发明概述
本发明涉及一种哺乳动物、鸟类、鱼类以及爬行动物的口服免疫刺激材料，所述材料包括免疫刺激量的M含量至少为40％的藻酸盐和如果需要或期望的可接受的载体。
本发明还涉及刺激哺乳动物、鸟类、鱼类以及爬行动物的免疫系统的方法，所述方法包括给所述哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物口服施用免疫刺激量的免疫刺激可摄取的材料，其中所述材料包括M含量至少为40％的藻酸盐和如果需要或期望的可接受的载体。
附图简述
下列缩写用于附图中；Durvillea水提取物＝DWE，Durvillea标准提取物＝Std.DA，而Lessonia标准提取物＝Std.LN。
图1示出猪在喂食含有本发明的藻酸盐的饲料12周后体重增加。
图2示出在用本发明的藻酸盐测试的猪中与对照猪相比总白血球的血清水平。
图3示出在用本发明的藻酸盐测试的猪中与对照猪相比单核细胞的血清水平。
图4示出在用本发明的藻酸盐测试的猪中与对照猪相比淋巴细胞的血清水平。
图5显示利用喂食Durvillea水提取物的猪的血与对照猪相比所测量的吞噬作用的水平。
图6显示利用喂食Durvillea水提取物的猪的血与对照猪相比所测量的氧化爆发反应。
图7显示喂食Durvillea标准提取物、Durvillea水提取物和Lessonia标准提取物的猪与对照猪相比对注射人血清白蛋白试验疫苗的免疫应答。
图8显示斑点狼鱼用含有Durvillea水提取物的口服饲料喂食60天后的比生长速率(％生长/天)与对照组的比较。
发明详述
M含量至少为40％的藻酸盐在本发明中用作哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物的口服免疫刺激剂。更具体而言，可使用M含量为50％-70％的藻酸盐(诸如来自Lessonia，Durvillea和Laminaria)、70％-80％的藻酸盐(诸如来自Durvillea)和80％-99.9％的藻酸盐(诸如来自细菌和例如根据下列实施例所制备的类似Durvillea的藻酸盐的水提取物)。这些藻酸盐刺激哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物针对通过外源体和细胞的物理损伤由细胞攻击所导致的疾病或创伤的免疫应答。其中，外源体包括微生物，颗粒物质，化学试剂等。物理损伤包括诸如擦伤、裂伤、挫伤、创伤等。
本发明的口服免疫刺激材料和方法利用免疫刺激量的M含量至少为40％的藻酸盐。免疫刺激量可依据摄取免疫刺激材料的对象和所需要的免疫刺激的水平而变化。例如，无需受到限制，对于鱼类生命的前60天，每条鱼口服施用2-20mg藻酸盐。当然，较成熟的鱼需要更大的量。
含有M含量至少为40％的藻酸盐的口服免疫刺激材料可以为药用、兽用或类药物营养品(nutraceutical)的固体剂量形式，诸如片剂、囊片、胶囊等，或诸如粉剂或液体制剂。其可以是任何类型的用于哺乳动物、鸟类、鱼类或爬行类动物消费的固体或液体食物，诸如宠物食品。其也可以是固体、半固体或液体营养补剂，诸如块状食品、饮料等。
可接受的载体可以是药用、兽用和类药物营养品的液体或固体剂量形式，液体、固体和半固体食品，以及液体和固体营养补剂中所用的任何常规载体。
业已发现，正如下列实施例所证明的，本发明的藻酸盐的免疫刺激活性刺激摄取藻酸盐的哺乳动物(如下所示的猪(参见图1))和鱼(如下所示的斑点鱼(参见图8))与对照相比体重增加。当这种藻酸盐口服施用于年幼哺乳动物时，这一点是特别有用和期望的。同样，本发明还涉及通过免疫刺激在哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物中刺激体重增加的方法，所述方法包括给哺乳动物、鸟类、鱼类或爬行动物口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少为40％的藻酸盐和如果需要或期望的可接受的载体。更具体而言，该方法还包括施用M含量为50％-70％、70％-80％或80％-99.9％的藻酸盐。免疫刺激材料可以是任何上述的那些材料。
本发明的口服免疫刺激材料可含有M含量至少为40％的藻酸盐，所述藻酸盐是合成衍生的，或分离自产藻酸盐的细菌种类或海草来源。
M含量至少为40％的藻酸盐可通过本领域已知的许多方法获自海草。具有所需M含量的藻酸盐的原料为海藻或海草，特别是褐色海藻，为了固定苯酚和保存海藻，其一般用甲醛处理。此外，海藻可以用酸清洗以除去高度粘性的laminaran和fucoglycans。优选地，它们可以用碱处理以减少热原含量。可以理解的是，海藻可以用任何已知的方式进行预处理。可以使用市售的藻酸盐，最优选的是Durvillea种的干燥和粉碎的海藻，但是新鲜的完整或未粉碎的来自Durvillea，Laminaria，Lessonia，Ecklonia，Macrocystis或Ascophyllum的海藻也适合作为原料。
生产这种藻酸盐的方法阐述在例如Green的美国专利2,036,934和Le Gloahec的美国专利2,128,551中，这些方法在此引作参考。用于本发明的其他获取藻酸盐的方法在下列实施例中提供。例如，本发明的藻酸盐的制备还可以利用水抽提方法，在pH保持约2.3以上的膨胀步骤中，通过使高M含量的藻酸盐来源和水以1∶3-1∶20的比例在温度20℃以上混合至少30分钟，然后经过滤从固体材料中分离溶解的藻酸盐组分。所需M含量的藻酸盐可通过用酸、盐或醇沉淀从溶液中回收。
下述的实施例包括本发明方面的代表性例子。实施例并不意味着限制本发明的范围，而是用作说明目的。除非另有说明，所有的部分和百分比等以重量计。
实施例1
在来自不同Durvillea种D.potatorum(粉碎的)样品1和D.antarctica(未粉碎的)样品2的出发原料中以下表所示的量加入水，并在55℃下手工不时搅拌3.5小时。室温保存过夜后，海藻在55℃下第二次抽提1小时，然后加入2.5ml甲醛，继续抽提1小时。
预抽提步骤
  样品   重量[g]     水[ml]     时间[小时]     温度[℃]     甲醛[ml]   pH
    1   50.0     500     5.5     55     2.5   5.9
    2   40.0     500     5.5     55     2.5   6.9
悬浮液经60目过滤器筛分，并且用过量的水洗涤两次。然后，溶液用助滤剂经真空漏斗过滤，又经玻璃滤器的前滤器过滤。接着，让溶液冷却至10℃，并加入NaCl至0.5％浓度。其后，通过磁力搅拌滴加5.5M稀盐酸至pH1.8。形成白色沉淀。悬浮液在10℃保持30分钟后，经120目过滤布筛分，并通过手工挤压，产生黄色浆状质量，挤压后变成细纤维。在磁力搅拌下用固体碱灰中和至pH7前，所有酸材料转移到250ml容器中，并加入水至200ml。溶液再次经0.8μm硝酸纤维素的滤膜过滤。滤液冷却至10℃，并以比例1∶1用异丙醇沉淀。形成的纤维用70体积％的异丙醇洗涤一次，然后用100体积％的异丙醇第二次洗涤。纤维用铁钳取出，然后冷冻干燥。结果示出于下表中。
表
    样品     海藻     重量[g]     产量[g]   ％藻酸盐(热水抽提)
    1   D.potatorum     50     1.08     2.1
    2   D.antarctica     40     1.59     4.0
产物分析
    样品     海藻     本征粘度dL/g     分子量道尔顿/g ％甘露糖醛酸NIR模型ALGLN2D
    1   D.potatorum     2.7     44 009     82
    2   D.antarctica     7.0     118 892     88
产物经NMR 400Hz测量的嵌段分布
  样品     海藻
    M     G     MM     GG     GM/MG
    1  D.potatorum     85.9     14.1     76.3     4.5     9.6
    2  D.antarctica     90.9     9.1     84.8     3.0     6.1
下表示出根据本实施例的方法从其他海草样品中制备的M的产量
    海藻/海草     形式   干物质     产率   甘露糖醛酸
    w/w％     ％
  Ascophyllum nodosum，春天     整体，切块     20     0.035     90
  Durvillea Antarctica，智利，1996年     未粉碎的     85     4     91
  Durvillea Antarctica，智利，1996年     粉碎的     85     6     89
  Durvillea Antarctica，智利，1998年     整体     85     1.3     87
  Durvillea Antarctica，智利，2000年     粉碎的     85     2.5     91
  Durvillea potatorum，塔斯马尼亚，1997年     粉碎的     85     2.1     86
  Lessonia trabeculata，智利，1996年     粉碎的     85     0.125     NA
  Lessonia nigrescens，智利，1995年     粉碎的     85     -     NA
  Laminaria hyperborea，叶子     新鲜的，切块     18     -     NA
  Saragassum，坦桑尼亚，1991年8月     粉碎的     85     -     NA
  Macrocysts pyrifera，智利，1994年     粉碎的     85     -     NA
  Laminaria japonica，日本，1998年     整体，切块     85     0.2     NA
  Fucus spiralis，1994年夏天     整体，切块     15     0.026     91
实施例2
将于1996年8月获自Durvillea antarctica的样品粉碎至大于70目的颗粒用作原料。在容器中称重30g的干海藻。加入100ml 0.2MHCl，用水将此材料稀释至500ml。搅拌数分钟后，pH升高至2.3以上，加入酸，以使pH维持2.3以下(pH1.8)。2分钟后，加入2.5ml 0.2M HCl。当pH在2.3以下恒定维持在1.8时，与用纯水膨胀相比，此材料膨胀很小。膨胀1小时后，此材料经60目滤布筛分，通过手工挤压，并且转移至容器中。其后，所得材料加入500ml水和50ml碱灰/氢氧化钠溶液，并在55℃抽提1小时。此材料很快膨胀，并变成类似浆糊或纸浆状粘稠。室温下保存直至第二天。接着，此材料进一步在55℃下抽提1小时，然后经混合器粉碎。总质量称重至549g。将150g材料用700g水搅拌下稀释。在加入助滤剂后通过水吸真空装置经滤纸过滤溶液。滤液量测量为564g，冷却至10℃。加入NaCl至0.5％，并滴加稀盐酸(1∶1)调节pH至1.6。形成轻质沉淀。然后，此材料经120目滤布筛分，并小心通过手工挤压。接着，将此材料用水悬浮，并在20℃下稀释至体积约200ml。通过磁力搅拌器用固体碱灰粉末使溶液的pH中和至7。通过玻璃棒搅拌，将溶液用等部分的异丙醇溶液沉淀。沉淀的纤维用70体积％的异丙醇溶液洗涤一次。再用纯100体积％的异丙醇洗涤。经120目滤布筛分和挤压后，用铁钳取出纤维，然后用真空冷冻干燥过夜。藻酸盐产物称重至1.04g，对应于3.6重量％的Durvillea Antarctica原料。M含量为70％，以及经NMR测量的藻酸盐的嵌段分布如下。
    分析     M     G   GG   MM    GM/MG
 NIR(algln2d)     77     23   -   -      -
    NMR     78.7     21   10.9   68.3     10.4
实施例3
通过在预抽提步骤中加入盐，有可能进一步增加甘露糖醛酸的含量。在20g于1996年8月从智利获得的Durvillea antarctica(粉碎的粗颗粒＞70目)海藻中加入500ml水和一定量的NaCl，并在搅拌下经Jar测试机以搅拌速度140rpm在20℃温度下抽提2小时。在该溶液中加入盐至如下表所示的浓度。
表
  样品  DurvilleaAntartica[g]     水[ml] NaCl浓度 抽提时间[小时]   备注
    A     20     500     0     2
    B     20     500     0.2％     2
    C     20     500     0.5％     2
    D     20     500     1.0％     2
    E     20     500     2.0％     2
    F     20     500     3.0％     2
    G     20     500     3.4％     2
    H     20     500     2   海草
然后，此材料经400目滤布筛分并通过手工挤压。筛分溶液称重，测量的pH如下表所示。
表
    样品   NaCl浓度   筛分的量[g]     pH     备注
    A     0     377     6.3
    B     0.2％     371     6.0
    C     0.5％     389     6.0
    D     1.0％     397     5.9
    E     2.0％     417     5.8
    F     3.0％     444     5.8
    G     3.4％     455     5.0
    H       -     421     6.4     海草
然后，筛分溶液用滤纸经漏斗在真空(水吸泵)下过滤。过滤溶液的粘度用玻璃管测定，结果示于下表中。
表
    样品 NaCl浓度   滤液量[g]   测量时间[秒]   计算粘度[cps]
    A     0     277     18.7     11.6
    B     0.2％     286     16.0      9.9
    C     0.5％     319     13.8     8.6
    D     1.0％     330     12.2     7.6
    E     2.0％     408     7.5     4.7
    F     3.0％     438     4.9     3.0
    G     3.4％     445      -     2.6
    H     -     402      -     2.9
滤液冷却至15℃以下，并在磁力搅拌下向各个样品中滴加5.5M盐酸，直到pH达到1.8-2.0。形成纤维状沉淀。然后，经400目滤布筛分沉淀，并通过手工挤压。接着，藻酸用水稀释，并在搅拌下用固体碱灰中和至pH6-7，直至完全溶解。冷却该溶液，并用等部分的异丙醇沉淀。其后，用70体积％的异丙醇洗涤，再反复用纯100体积％的异丙醇洗涤。利用铁钳拉出沉淀的纤维，并转移至容器中，真空下冷冻干燥过夜。结果示于下表中，其中产量的计算是假定藻酸盐没有损失，并且所有的藻酸盐都溶解在加入的水中。
表
    样品 NaCl浓度 沉淀的藻酸盐量[g]   藻酸盐量[g/l]     ％产率100％     ％产率实际   M-嵌段NIR模型ALGLN2D
    A     0     1.26     3.34     8.4     4.6     88％
    B     0.2％     1.03     3.60     9.0     5.1
    C     0.5％     1.1     3.48     8.7     5.6
    D     1.0％     1.14     3.45     8.6     5.7
    E     2.0％     1.20     2.87     7.2     5.9
    F     3.0％     0.80     1.80     4.5     3.9
    G     3.4％     0.54     1.21     3.0     2.7     91.8％
    H     海草     0.53     1.32     3.3     2.7     95.8％
实施例4
甘露糖醛酸在分离组分中的含量通过加入CaCl2而进一步增加。原料为来自智利的D.antarctica，其被粉碎至大于70目的粗颗粒。预抽提步骤的量和条件示于下表中。在约140rpm搅拌下经Jar测试仪进行预抽提。
表
  样品   重量[g]   水[ml]     时间[小时]     温度[℃]     pH     CaCl2[N]
    A   20.0   500     2     25     6.08     0.01
    B   20.0   500     2     25     5.85     0.1
    C   20.0   498     2     25     5.8     0.03
    D   20.0   496     2     25     5.7     0.06
然后，将材料经400目滤器筛分，并通过手工挤压。把溶液加热至约30℃，并用滤纸经真空吸瓶过滤。
表
    样品     CaCl2[N] 筛分溶液400目[g]     滤液[g]
    A     0.01     404     397
    B     0.1     462     457
    C     0.03     423     398
    D     0.06     440     420
使溶液冷却至10℃，加入氯化钠至0.5％。然后，滴加5.5M HCl，小心磁力搅拌直至pH1.8。形成白色沉淀。接着，将材料悬浮液保存30分钟，并经400目滤布筛分后，通过手工小心挤压。材料为浆状黄色质量，挤压后其变成细亮纤维。其后，把该酸材料转移至250ml容器中，加入水至200ml，并在磁力搅拌下用固体碱灰中和至pH7。接着，滤液冷却至10℃，以比例1∶1加入100体积％的异丙醇，经搅拌后沉淀。沉淀出大纤维。纤维用70体积％的异丙醇洗涤两次，最后用100体积％的异丙醇洗涤。然后，用铁钳拉出纤维，并在真空下冷冻干燥过夜。结果示于表9和10中，其表明在预抽提步骤中不加盐的情况下，甘露糖醛酸在藻酸盐中的产量和含量增加，M为80％以上到最大91％，而在加盐的情况下，其最大为95％。
表
    样品     CaCl2[N] 藻酸盐产量[g] 藻酸盐产量[g/l]   100％产率％   实际产率％
    A     0.01     1.29     3.19     8.0     6.5
    B     0.1      -     0     0     0
    C     0.03     0.52     1.31     3.28     2.6
    D     0.06     0.19     0.45     0.33     0.9
表
  样品   CaCl2[N]  ％甘露糖醛酸NIR模型LND2     ％MNMR     ％GNMR     ％MMNMR   ％GM/MGNMR     ％GGNMR
    A   0.01     98.7     89.0     11.0     82.0     8.0     3.0
    B   0.1     -     -     -     -     -     -
    C   0.03     101.6     92.0     8.0     86.0     6.0     1.6
    D   0.06     102.5     95.0     5.0     90.0     5.0     0
    E   只有水     88.7     11.3     80.4     8.3     3.0
实施例5
将总共48头平均初始体重为13.07kg(STD 1.98)、来自6窝的35-38天大的断乳杂种[(Norwegian Landrac×Yorkshire)×Norwegian Landrace]仔猪分成4组用于试验喂养研究，并且置于环境受控的养殖场中。开始时，在每个2.5m×2.5m栏中圈养4头猪。饲养6周后，将猪转移到15平米、带有单独饲养畜舍的栏中，每个栏有6头猪。让猪随意取用食物和水。每周，将猪单独称重。使猪有4天的预备期，以适应围栏和标准的市售断奶猪饲料。市售饲料(13％含水量)以对生长必需的维生素和矿物质加强，并具有约18-19％的天然蛋白含量，14-15％的可消化蛋白含量，40-50％的淀粉含量以及约2.6％的天然脂肪含量。
在初始适应市售饲料后，4个组每组12头猪喂给不同的食物10周。研究的最后2周，猪全部喂食市售饲料。对照组中的猪喂食标准市售饲料，同时其他3组中的猪喂食已掺混了1.25％(w/w)藻酸盐的同样市售饲料。测试的3种藻酸盐为：1.Durvillea antarctica水提取物(89％ M)，2.Durvillea antarctica标准提取物(63％ M)，和3.Lessonianigrescen标准提取物(55％ M)。这些藻酸盐粉末的特征本征粘度和1HNMR光谱测定进一步描述如下。
Durvillea antarctica标准提取物的本征粘度为7.0g/dl，这对应于利用Mark Houwink方程式评估的重均分子量210,000道尔顿。Durvilla藻酸盐样品对甘露糖醛酸(M)单元的摩尔组分含量为0.63，而对于古洛糖醛酸(G)单元的摩尔组分含量为0.37。M与M连接F(MM)的组分含量为0.44。G与G连接F(GG)的组分含量为0.18。M与G连接F(MG)的组分含量等于G与M连接F(GM)的组分含量，为0.19。
Durvillea antarctica水提取物或Durvillea水提取物通过选择性沉淀出M含量增加的藻酸盐组分而获得，具有本征粘度4.7g/dl，这对应于利用Mark Houwink方程式评估的重均分子量85,000道尔顿。Durvilla水提取物藻酸盐样品对甘露糖醛酸(M)单元的摩尔组分含量为0.88，而对于古洛糖醛酸(G)单元的摩尔组分含量为0.12。M与M连接F(MM)的组分含量为0.80。G与G连接F(GG)的组分含量为0.04。M与G连接F(MG)的组分含量等于G与M连接F(GM)的组分含量，为0.08。
Lessonia nigrescens标准提取物的本征粘度为13.4g/dl，这对应于利用Mark Houwink方程式评估的重均分子量370,000道尔顿。Lessonia藻酸盐样品对甘露糖醛酸(M)单元的摩尔组分含量为0.55，而对于古洛糖醛酸(G)单元的摩尔组分含量为0.45。M与M连接F(MM)的组分含量为0.35。G与G连接F(GG)的组分含量为0.25。M与G连接F(MG)的组分含量等于G与M连接F(GM)的组分含量，为0.20。
藻酸盐本征粘度的测定利用公开在“作为固定化材料的藻酸盐—一些分子和功能性质的研究”(Martinsen，Anita)论文；NTH-Universityof Trondheim，1990中的方法进行。根据本征粘度数据和Mark Houwink方程式来评估重均分子量。单体组成和序列排列的分析如下列文献所述的通过Brucker 400 WM分光计由1H-NMR光谱法进行：Grasdalen等，“醛酸残基在藻酸盐中的组成和序列的NMR研究”，Carbohydrateresearch 1979；68：23和H.Grasdalen“藻酸盐的高场1H NMR光谱法：序列结构和键构象”，Carbohydrate Research，1983；118：255。
饲养两周后，将猪免疫(在7周龄时)并且在4周后(在11周龄时)给予加强注射。所有猪肌内免疫接种0.5ml的混合物，所述混合物为0.25ml含有马疱疹病毒1(EHV)的Pneumabort K(102BY0002，FortDodge Laboratories)和0.25ml人血清白蛋白(HSA)(200μg/ml)(Sigma)，皮下免疫接种0.5ml含有流感病毒A/Equi 1，A/Equi 2/M，A/Equi2/F(EIV)的Prevacum F(027021E，Hoechst Roussel Vet，Germany)和1.0ml含有白喉毒素(30Lf/ml)和破伤风毒素(7.5Lf/ml)的白喉/破伤风疫苗(DT9169a1，SBL Vaccin AB，Stockholm)。
针对人血清白蛋白(HSA)(Sigma Chemical Industries，USA)和白喉毒素(DIF)(National Institute of Public Health)的特异性抗体通过被动血凝反应测试方法进行测定(Avrameas等1969)。所测试的最低稀释度为1∶8。未显示抑制的血清所给出的滴度为4，用于统计学计算。抗体滴度值被log2转化以使分布标准化。
以两周间隔采集血样，用于血清学，血液学，以及吞噬细胞和淋巴细胞的功能表征。分离血清并储存在-20℃直至处理。在早晨采集稳定的(肝素化的和EDTA)血样并且立即加以分析。在Norwegian Schoolof Veterinary Science，Oslo的临床中心实验室(Central ClinicalLaboratory)分析血样(Technicon H-1)。总的白血细胞计数(WBC×109/L)，单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜曙红细胞的数目(×109/L)通过电子方法测定，并且对淋巴细胞的数目和淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜曙红细胞的相对数(％)进行了测定。对总红血细胞计数(RBC×1012/L)，平均细胞体积(MCV fL)和血红蛋白(HGB g/L)进行测定，并且对血球密度(HCT L/L)进行评估。
粒细胞在血液中的吞噬活性利用Phagotest(Orpegen Pharma，Heidelberg)，遵照操作手册进行分析。在加入20μl预冷的稳定和调理的FITC-标记的大肠杆菌悬浮液之前，将肝素化(15IU/ml)的全血混合，等分(100μl)在5ml小瓶(Falcon)的底部，并在冰上温育10分钟(测试试剂盒)。振荡所有小瓶，并使测试样品在37℃的水浴中温育10分钟，而对照样品仍放置在冰上。然后，同时将所有样品置于冰上，以终止吞噬作用，并向各样品中加入100μl的冰冷淬灭溶液，在漩涡混合器上混合。接着，样品中加入3ml洗涤液，混合，并将细胞离心(250×g，5分钟，4℃)。在加入200μl的DNA染色液之前，重复该洗涤程序。把样品混合，并在冰上温育10分钟，然后利用兰-绿激发光(488nm)通过流式细胞仪(FACScanTM，LYSISTM软件)分析细胞。将具有预先形成的吞噬作用的细胞的百分比进行分析。
氧化爆发活性的评价利用Phagoburst(Orpegen Pharma，Heidelberg)遵照操作手册通过流式细胞仪进行。在加入20μl预冷的稳定和调理的大肠杆菌悬浮液之前，将肝素化(15IU/ml)的全血混合，等分(100μl)在5ml小瓶(Falcon)的底部，并在冰上温育10分钟(测试试剂盒)。每条测试动物中包括3个对照瓶，其中一个瓶中加入20μl的洗涤液(阴性对照)，另一个瓶中加入20μl的趋化肽fMLP工作液(“低对照”)以及最后一个瓶中加入20μl的佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(PMA)工作液(“高对照”)。将所有小瓶混合，并使测试样品在37℃的水浴中温育10分钟。然后，在所有样品中加入20μl的底物溶液，充分混合后在37℃的水浴中继续温育10分钟。接着，同时从水浴中取出全部样品，裂解全血，并用2ml预温热的裂解液固定，混合后室温下温育20分钟。样品离心(250×g，5分钟，4℃)后，加入3ml洗涤液洗涤一次(250×g，5分钟，4℃)。倾倒上清液，加入200μl的DNA染色液，把样品混合，并在冰上温育10分钟(避光)。利用兰-绿激发光(488nm)通过流式细胞仪(FACScanTM，LYSISTM软件)分析细胞。分析已经产生活性氧代谢物的细胞的百分比及其平均荧光强度。
图1以饲养时间为函数显示4组猪的平均重量。在Durvillea水提取物组和Lessonia组中的猪与对照组相比时发现有显著的重量增加。3周后，重量差异在统计学上被视为是显著性的，但是，图1显示重量增加的趋势，这与1周后Durvillea水提取物组和Lessonia组较对照组的体重增加更快相一致。虽然Durvillea水提取物组和对照组之间实际重量差异不如对Durvillea水提取物组和Lessonia组所见的那么显著，但应该注意的是，Durvillea组的平均重量始终高于对照组。对照组中单个猪在重量上与3组喂食含藻酸盐的饲料的猪个体比较具有较高的变异性，这提示对照组中的一些个体具有的免疫反应减少，因为它们处理创伤和/或应激的能力较小。为了让动物处理疾病应激，猪中的激素氢化可的松使得营养物远离肌肉和脂肪组织。
图2-4显示通过分析血液中的总白血球，单核细胞和淋巴细胞而获得的数据。虽然在统计学上是不显著的，但图2显示Durvillea水提取物组的总自细胞数高于对照组。Durvillea水提取物组与对照组比较，Durvillea水提取物组中观察到的白血球数增加是由于分别在6周和10周后单核细胞(图3)和淋巴细胞(图4)的显著增加。与Durvillea水提取物组比较，Lessonia组中的淋巴细胞显示增加延迟(第10周)。对采集自Durvillea水提取物组(和对照组)的血中的吞噬活性也进行分析，测定结果显示，Durvillea水提取物组较对照组在第4周时有显著增加，如图5所示。图6所示的氧化爆发反应数据进一步支持了在第4周和第8周，以Durvillea水提取物喂食的猪较对照具有更高水平的吞噬反应。在第4周和第8周时Durvillea水提取物组较对照组的持续的氧化爆发反应增加是显著的，因为与呼吸爆发相关的主要化学过程对杀死一些类型的细菌是必要的，并且显示吞噬作用的效果提高。
图7显示对免疫接种的免疫反应。对注射人血清白蛋白试验疫苗的免疫反应(图7)显示在第8周时Durvillea水提取物组和Lessonia组较对照组的免疫反应有显著提高。
实施例6
把Durvillea水提取物藻酸盐(如实施例5所述)溶于水中，经过短暂超声处理后，将含有溶解的藻酸盐、其浓度为4.2g/升的溶液喷洒到市售的饲料颗粒(Skretting/Nutreco，Dirdal，Norge)上从而得到0.02％和0.06％藻酸盐(重量百分比)的饲料。饲料颗粒经空气干燥2天后，再口服施用给新孵化的斑点狼鱼(Anarhichas minor)鱼苗。Durvilleaantarctica水提取物的本征粘度为8.3dl/g，这对应于利用Mark Houwink方程式评估的重均分子量160,000道尔顿。Durvillea水提取物藻酸盐样品对甘露糖醛酸(M)单元的摩尔组分含量为0.89，而对于古洛糖醛酸(G)单元的摩尔组分含量为0.11。M与M连接F(MM)的组分含量为0.81。G与G连接F(GG)的组分含量为0.03。M与G连接F(MG)的组分含量等于G与M连接F(GM)的组分含量，为0.09。
由50条鱼苗组成的3个复制组用于每种情形下的60天连续给食鱼的饲养研究中。饲养研究开始时，每条鱼的平均重量约为0.4g。在研究过程中，鱼苗每10天称重(湿重)一次。测试条件包括3种不同的饲料：对照(0％藻酸盐)，0.02％藻酸盐和0.06％藻酸盐。另一组鱼喂食对照饲料，在60天的饲养周期中，通过把鱼转移到每升海水含有0.1g藻酸盐的浴中浴处理两次，在饲养研究中每次处理周期为12-24小时。
如图8所示，在60天的生长周期内，用含有藻酸盐的饲料喂食的鱼与没有加入藻酸盐的对照饲料喂食的鱼(4.857％生长/天)比较显示了更高的比生长速率，对0.02％藻酸盐的组而言为5.197％，而对于0.06％藻酸盐的组而言为5.247％。在60天研究过程中，与对照组比较，经间歇浴处理的鱼在比生长速率方面显示了不显著的差异(分别为4.745％生长/天对4.857％生长/天)。图8所示的比生长速率根据下列公式计算成每天生长百分比：100％×[ln(研究结束的重量)-ln(研究第0天的重量)]÷研究天数(注：ln为自然对数)。
实施例7
把Durvillea水提取物藻酸盐(如实施例5所述)溶于水中，得到的藻酸盐浓度为3％。Durvillea antarctica水提取物的本征粘度为4.7dl/g，这对应于利用Mark Houwink方程式评估的重均分子量85,000道尔顿。Durvillea水提取物藻酸盐样品对甘露糖醛酸(M)单元的摩尔组分含量为0.88，而对于古洛糖醛酸(G)单元的摩尔组分含量为0.12。M与M连接F(MM)的组分含量为0.80。G与G连接F(GG)的组分含量为0.04。M与G连接F(MG)的组分含量等于G与M连接F(GM)的组分含量，为0.08。
将约1200g市售饲料(Biomar Ecoweaner EMB 16244)部分以下列条件在台式流化床反应器(bench top fluidized bed reactor)中喷涂不同量的藻酸盐溶液：气流足以流化颗粒，40-50℃，以及每小时流动60ml藻酸盐溶液。以不同浓度的藻酸盐(0.01％，0.06％和0.10％)回收干饲料颗粒，如基于藻酸盐浓度和每重量原始装入的干粉所喷涂的藻酸盐溶液的量进行计算。对于最低浓度而言，利用稀释至0.5％的藻酸盐溶液。对照样品的使用无需进一步处理。粒度为0.6mm和1.0mm的饲料分别用于早期饲养和晚期饲养。喷涂和未喷涂的饲料颗粒在显微镜下目测，未发现在外观或粒度上有任何差异。喷涂颗粒中加工后即时的干物质含量(95％)稍高于未喷涂颗粒(90％)。
为了测定饲料颗粒中藻酸盐的损失，Durvillea antarctica水提取物藻酸盐用同位素标记，随后测定从海水喷涂颗粒中释放出的藻酸盐。100mg藻酸盐溶解于50ml的0.05M、pH8.0的硼酸缓冲液中。加入100mg的对羟基甲基benzimidate(MPHBIM)，溶液在37℃下振荡24小时。将此溶液对含有1％叠氮钠的蒸馏水透析2天。进一步对分子量为6000的聚乙二醇透析3天以使藻酸盐溶液更浓。所有透析液每天交换两次。在另标记125碘(125I)之前，将标记的藻酸盐溶液经0.45μm滤器过滤。将50μl的iodogen(1，3，4，6-四氯-3α，6α-二苯基甘脲)加入到Ellermann管中。当溶液从管中蒸发后，用水冲洗5次，并用压缩空气干燥。在试管中加入50μl的磷酸盐缓冲液，4μl的125I2以及2ml的MPHBIM标记的藻酸盐溶液。1小时后加入100μl的0.1M亚硫酸氢钠以终止反应。利用Sephadex G-25经凝胶层析除去非反应的同位素化合物。非反应化合物和标记的藻酸盐采用γ计数器加以鉴定。如实施例6中所述，饲料颗粒包被以I25I2MPHBIM标记的藻酸盐。饲料颗粒在海水中振荡5分钟，并在沉降后，用γ计数器采集水样用于分析。分析6个平行样，并测定藻酸盐的损失，结果显示从5.2％到8.0％。饲料试验中的损失被认为是很低的，因为幼体通常以秒吃完饲料。
将新孵化的斑点狼鱼幼体(约0.3g)置于12个容器中，每个容器中约80条。容器的尺度为40×20cm，并在一端单独装有连续流水，以便获得连续的水流通过容器。在试验全过程中，水温为8℃。非消耗饲料和粪便被连续去除。3个平行容器喂食具有各个浓度的饲料，而3个平行容器喂食对照饲料。在白天，喂食饲料若干次(约每小时喂食一次)，以确保饲料不是一个限定因素。每10天测量30条幼体的重量。试验历时60天。标记有“*”的棒表示有显著的差异性(p＜0.05)。比生长速率的结果示于图9中。
实施例8
把Durvillea水提取物藻酸盐(如实施例5所述)溶于水中，并在台式流化床反应器上将市售饲料(Biomar Ecoweaner EMB 16244)部分喷涂以不同量的藻酸盐溶液。如实施例7所示，用不同浓度的藻酸盐(0.01％，0.06％和0.10％)回收干饲料颗粒。
在开始试验前，使鳕鱼幼体总共适应10天。在此10天期间，幼体全部喂食对照饲料，并达到体重为0.5-1.0g。在开始试验前3天，把幼体划分到12个30升的圆容器(直径40cm和高度60cm)中，每个容器中含有约70条幼体。每个容器在其底部装有塑料筛。水体积在试验过程中的变化介于15和20升之间。在同样期间，水温跟随自然海水温度，并增加8-12℃。容器的单个供水量约为1.5升/分钟，并且光照恒定。去除非消耗饲料，并且如果需要清洁容器。当测定幼体重量时，清空容器并彻底清洁。每个容器中30条幼体的基重在测试饲料开始前加以测定。3个平行容器喂食具有各个藻酸盐浓度的饲料，而3个平行容器喂食对照饲料。在白天，喂食饲料若干次(约每小时喂食一次)，以确保饲料不是一个限定因素。
每10天测量30条幼体的重量。试验历时60天。如实施例5所示，计算比生长速率。图10中给出比生长速率。标记有“*”的棒表示有显著的差异性(p＜0.05)。
实施例9
记录实施例7中斑点狼鱼幼体的生长研究中的死亡率，并且示于图11中。测定到任何组之间没有显著差异性(p＜0.05)。
实施例10
记录实施例8中鳕鱼幼体的生长研究中的死亡率，并且示于图12中。测定到任何组之间没有显著差异性(p＜0.05)。

Claims (41)

1.一种鱼的口服免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的甘露糖醛酸(M)含量至少为40％的藻酸盐和可接受的载体。
2.权利要求1的材料，其中所述M含量为50％-70％。
3.权利要求1的材料，其中所述M含量为70％-80％。
4.权利要求1的材料，其中所述M含量为80％-99.9％。
5.权利要求2的材料，其中所述藻酸盐来自Lessonia海草，Durvillea海草或Laminaria海草。
6.权利要求3的材料，其中所述藻酸盐来自Durvillea海草。
7.权利要求4的材料，其中所述藻酸盐来自细菌或Durvillea水提取物。
8.权利要求1的材料，其中所述材料为：(i)药用，兽用或类药物营养品固体剂量形式或液体制剂，(ii)固体，半固体或液体食物，或(iii)固体或液体营养补剂。
9.一种刺激鱼的免疫系统的方法，其包括给所述鱼口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少为40％的藻酸盐和可接受的载体。
10.权利要求9的方法，其中所述M含量为50％-70％。
11.权利要求9的方法，其中所述M含量为70％-80％。
12.权利要求9的方法，其中所述M含量为80％-99.9％。
13.权利要求9的方法，其中所述可摄取材料为：(i)药用，兽用或类药物营养品固体剂量形式或液体制剂，(ii)固体或液体食物，或(iii)固体或液体营养补剂。
14.一种鱼的口服免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的M含量至少为80％的藻酸盐和可接受的载体，其中所述藻酸盐的制备方法为：将Durvillea海草混合并膨胀在水中，在20℃以上的温度维持pH约2.3以上至少30分钟，从混合物中分离溶解的组分，以及通过用酸，盐或醇沉淀从溶解的组分中回收M含量至少为80％的所述藻酸盐。
15.权利要求14的材料，其中所述材料为：(i)药用，兽用或类药物营养品固体剂量形式或液体制剂，(ii)固体或液体食物，或(iii)固体或液体营养补剂。
16.一种刺激鱼的免疫系统的方法，其包括给所述哺乳动物，鸟类和爬行动物口服施用免疫刺激量的权利要求14的免疫刺激材料。
17.一种通过免疫刺激来刺激鱼体重增加的方法，其包括给所述鱼口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少为40％的藻酸盐和可接受的载体。
18.权利要求17的方法，其中所述M含量为50％-70％。
19.权利要求17的方法，其中所述M含量为70％-80％。
20.权利要求17的方法，其中所述M含量为80％-99.9％。
21.一种鱼的口服免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的M含量至少为40％的藻酸盐。
22.权利要求21的材料，其中所述M含量为50％6-70％。
23.权利要求21的材料，其中所述M含量为70％-80％。
24.权利要求21的材料，其中所述M含量为80％-99.9％。
25.一种刺激鱼的免疫系统的方法，其包括给所述鱼口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少为40％的藻酸盐。
26.权利要求25的方法，其中所述M含量为50％-70％。
27.权利要求25的方法，其中所述M含量为70％-80％。
28.权利要求25的方法，其中所述M含量为80％-99.9％。
29.一种鱼的免疫刺激材料，其包括免疫刺激量的M含量至少为40％的藻酸盐，前提条件是所述藻酸盐或是合成制备的或是分离自海草或细菌来源。
30.权利要求29的材料，其中所述M含量为50％-70％。
31.权利要求29的材料，其中所述M含量为70％-80％。
32.权利要求29的材料，其中所述M含量为80％-99.9％。
33.权利要求29的材料，其进一步包括可接受的载体。
34.权利要求29的材料，其中所述材料为：(i)药用，兽用或类药物营养品固体剂量形式或液体制剂，(ii)固体，半固体或液体食物，或(iii)固体或液体营养补剂。
35.一种刺激鱼的免疫系统的方法，其包括给所述鱼口服施用免疫刺激量的免疫刺激材料，其中所述材料包括M含量至少为40％的藻酸盐，前提条件是所述藻酸盐或是合成制备的或是分离自海草或细菌来源。
36.权利要求35的方法，其中所述材料进一步包括可接受的载体。
37.权利要求35的方法，其中所述M含量为50％-70％。
38.权利要求35的方法，其中所述M含量为70％-80％。
39.权利要求35的方法，其中所述M含量为80％-99.9％。
40.权利要求35的方法，其进一步包括可接受的载体。
41.权利要求35的方法，其中所述材料为：(i)药用，兽用或类药物营养品固体剂量形式或液体制剂，(ii)固体，半固体或液体食物，或(iii)固体或液体营养补剂。
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