CN103613643A - 一种生物活性小肽、其合成方法及其作为畜禽饲料添加剂的用途 - Google Patents
一种生物活性小肽、其合成方法及其作为畜禽饲料添加剂的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种生物活性小肽、其合成方法及其作为畜禽饲料添加剂的用途,生物活性小肽为线型五肽Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu，是用逐步接链和片段接链结合的方法合成,所得肽纯度高，能在极低添加浓度下即可发挥作用，可调节动物胃肠菌群，促进动物消化功能，预防消化道疾病；刺激动物的免疫功能，增强动物对多种疫病的抗病力，大幅降低发病率和死淘率，降低生产成本，促进生长、增加体重，生产成本低。
Description
发明领域
本发明涉及一种生物活性小肽饲料添加剂，具体地说是涉及生物活性小肽饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
近年来，有些养殖场（户）为了片面追求利润，从促生长、控制疾病和提高瘦肉率等目的出发，滥用饲料添加剂，不仅影响疗效而且会带来一些不良反应：如注射胸腺素制剂、转移因子制剂可致发热和过敏反应；大剂量的脂多糖可引起免疫耐受作用；左旋咪唑可致食欲不振、恶心、呕吐、嗅觉异常、嗜睡乏力、发热、过敏反应、粒细胞减少、肝功能异常等。发达国家“绿色技术壁垒”已严重制约我国动物产品进入国际市场，我国出口欧美的畜禽产品屡屡受阻，同时在国内消费市场上，随着国民经济的发展和人民生活水平的提高，畜禽产品在人们日常膳食结构中的比例愈来愈大，畜禽产品的安全和卫生问题已成为社会共同关注的焦点，必须着眼于提高数量的同时，生产出质量较高的畜禽产品。此外，许多疾病的发生与机体免疫系统功能的缺陷和失调有着密切联系。因此研制出一种既能促进和调节免疫应答功能又能提高抗病能力、减轻应激反应、提高疫苗免疫效果、改善生产性能等作用的饲料添加剂就显得尤为重要。
目前市场上可见到的作为饲料添加剂的生物活性小肽是由动物的小肠和肠粘膜加工而成的肽蛋白或是含有一定量的小肽的肽蛋白饲料，而不是真正意义上的生物活性小肽纯品，虽然也能提高动物的生产性能，降低腹泻率，但是大都存在以下缺陷：（1）产品的添加量较大0.1～1.5%；（2）为多种材料的混合物，产品功能不明确，功效不明显；（3）肽的分子量较大，一般为6000左右，仍然具有抗原性，对动物不利，易引起抗原过敏反应；（4）制备成本高或产品成本高，不适于动物养殖使用。而且这些饲料产品主要用于代替饲料中的部分鱼粉，使用范围并不大。
生物活性小肽饲料添加剂的传统制备方法主要是酶法，如使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶，或是使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，但容易产生令人难以接受的腥味或苦味，且生产成本高；其次是从原料中直接提取法，产率低、成本高；第三是DNA重组技术法，该法因许多消费者反对使用由遗传改性生物所生产的食物产品，并担心有生物安全性和生物污染，而受到限制。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术的不足，提供一种生物活性小肽，添加量低、功能明确，能提高动物对营养素（如蛋白质、矿物质、维生素等）吸收利用率、提高奶、肉、蛋的产量和生产能力，改善肉、蛋、奶的品质和风味，刺激动物免疫器官发育、提高抗病力、减少发病率，并能明显改善水产动物养殖水质，提高水产动物生长速度和存活率，广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品。
本发明的另一目的在于提供生物活性小肽饲料添加剂的合成方法，所得生物活性小肽饲料添加剂为纯品。
本发明的再一目的在于提供所述生物活性小肽饲料添加剂的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
生物活性小肽饲料添加剂的合成方法，包括GE-B5生物活性肽的合成和纯化，其中GE-B5生物活性肽合成路线如下：
试剂说明：(a)DIEA,DCC,HOBt;(b)TFA,CH2Cl2;(c)1NNaOH,CH3OH.
以上合成路线的具体说明如下：
在冰浴条件下，以DIEA为缚酸剂，DCC与HOBt为混合缩合剂，二氯甲烷为溶剂,亮氨酸甲酯盐酸盐（化合物2）与Boc-色氨酸（化合物1）反应得到纯Boc-Trp-Leu-OMe（化合物3），然后同样在0℃下将所得的Boc-Trp-Leu-OMe与三氟醋酸反应，得到Trp-Leu-OMe三氟醋酸盐（化合物4）；
按照合成化合物3的同样方法，以Boc-Tyr-OH（化合物5）和Gly-Gly-OMe盐酸盐（化合物6）为原料，合成Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe（化合物7），然后在冰浴条件下，在化合物7中加入NaOH和甲醇使其皂化，然后用HCl酸化得到Boc-Tyr-Gly-Gly-OH（化合物8）。
同理，按照合成化合物3的方法以化合物4和化合物8为原料合成Boc-Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OMe（化合物9），然后用NaOH将其水解，最后用三氟醋酸（TFA）处理脱去Boc保护基，得到Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OH（化合物10）。
以下将具体说明所获得的活性小肽昨晚畜禽饲料添加剂的用途
该活性肽饲料添加剂的使用方法为：
（1）与饲料混合或拌料（含活性肽有效成分克/吨饲料），仔猪、肉仔鸡，80～120克；母猪、育肥猪，60～80克；产蛋鸡、肉鸭，60～80克；（2）也可直接口服或加入水中饮用。
（1）猪饲养中的应用
为检验本发明产品的功效和在养猪业上的应用效果。试验选取体重接近健康的30日龄断奶仔猪（公母各半）180头分为5个处理，每个处理（组）36头，每个处理6个重复，每个重复6头猪，均为3公3母，试验期8周（2个月），实验设计见表1，试验结果列于表2。
表1.仔猪试验设计
表2.在养猪生产中的使用效果
| 组别 | 30～90日龄平均日增重 | 30～90日龄料重比 |
| 试验1组 | 0.306±0.01 | 1.82±0.07 |
| 试验2组 | 0.368±0.03* | 1.58±0.05* |
| 试验3组 | 0.325±0.02 | 1.69±0.08 |
| 试验4组 | 0.318±0.01 | 1.74±0.06 |
| 对照组 | 0.260±0.03 | 2.24±0.08 |
注：*，p<0.05
从表1中可以看出，添加了活性肽饲料添加剂的4个活性肽组的平均日增重和饲料转化效率均好于空白对照组，可明显提高猪的生产性能，即日增重和饲料转化效率。其中试验2组（成品添加量160mg/Kg饲料）的平均日增重和饲料转化率显著好于空白对照。
(2)在蛋鸡饲养中的应用
为检验生物活性小肽在蛋鸡上的使用效果和在畜牧业上的应用前景，试验选用褐壳蛋鸡3000羽，分5组，每组600只蛋鸡，分3个重复，每个重复200只鸡，喂以5种不同的日粮，对照组为基础蛋鸡日粮，试验1～4组分别在蛋鸡基础日龄中添加活性肽0.1‰、0.2‰、0.4‰和0.8‰。试验期为2个月，结果列于表3。检测指标为破蛋率（%）、产蛋率（%）、蛋重（克/个蛋）、死淘率（%）、饲料转化效率（耗料g/Kg蛋）。
表3：生物活性小肽饲料添加剂在蛋鸡上的应用
从表3中可以看出，随着活性肽饲料添加剂的添加量的增加，产蛋率明显增加，其中试验2组（成品添加量160mg/Kg饲料）产蛋率显著提高了5.2%（P<0.05）；在饲料转化效率（料/蛋比）方面，添加生物活性肽能显著降低料蛋比，即明显提高了饲料转化效率，其中以试验2、3和4组差异显著（P<0.05）。总之，试验表明，在蛋鸡饲料中添加该活性肽能显著提高蛋禽产蛋率，增加蛋重，降低料蛋比、破蛋率，降低死淘率，提高饲料利用率、生产性能和降低生产成本。
（3）对肉仔鸡生产性能（增重速度和耗料）影响
为检测本发明的活性肽对肉鸡生产性能的影响，将肉仔鸡分为6组，每个组分成3个重复，每个重复10只鸡，试验期7周。试验设计见表4，基础日粮配比及营养水平见表5。在7日龄试验开始时、28和42日龄分别以重复为单位称重，并统计耗料量，计算7～28日龄和28～42日龄的死亡只数、增重、采食量以及料肉比，实验结果见表6。
表4肉鸡试验设计
表5试验基础日粮组成及营养水平
注：*每千克日粮添加量，铜8mg，铁80mg，锰100mg，碘0.35mg，硒0.25mg，钴0.4mg，维生素A8800U，维生素D33000U，维生素E30mg，维生素K31.6mg，硫胺素6.6mg，核黄素6.6mg，吡哆醇4.4mg，维生素B120.02mg，泛酸11mg，烟酸66mg，叶酸1mg，生物素0.2mg；**计算值。
表6：42日龄添加活性肽对肉仔鸡生产性能的影响
| 组别 | 增重 | 料肉比 |
| 试验1组 | 1.635±0.009 | 2.25±0.011 |
| 试验2组 | 1.847±0.021** | 2.03±0.029* |
| 试验3组 | 1.720±0.023* | 2.19±0.024 |
| 试验4组 | 1.762±0.019* | 2.14±0.015 |
| 对照组 | 1.511±0.013 | 2.31±0.031 |
由表3可知，试验结束时0.1‰，0.2‰、0.4‰和0.8‰肉鸡体增重分别比对照组肉鸡体增重高8.2%，22.2%、13.8%和16.6%，除试验1组外，其余各试验组差异均达显著水平（P＜0.05），同时各试验组之间肉鸡体增重差异也达到显著水平（P＜0.05）。其中以0.2‰添加量效果最显著（P＜0.01）。0.1‰，0.2‰、0.4‰和0.8‰添加剂量组饲料转化率分别比对照组降低了2.7%，13.8%、5.5%和7.9%，0.2%剂量组差异显著（P＜0.05），其余两试验组差异不显著（P＞0.05）。由此得出，添加适量的本发明的生物活性小肽可以提高肉仔鸡的体增重，降低饲料转化率，节约饲料开支，提高经济效益。且添加量中以0.2%剂量效果最好。
（4）对鸡外周血PBMC细胞增殖活力的影响
为检测本发明的活性肽对鸡外周血T-淋巴细胞增殖活力的影响，即检测本发明产品对肉仔鸡细胞免疫力的作用效果或影响程度。进行了微量法淋巴细胞转化试验，即在肉仔鸡淋巴细胞培养液中加入不同剂量的无菌活性肽液，观察活性肽对肉仔鸡血液中淋巴细胞增殖活力的影响，具体方法如下：
（1）外周血淋巴细胞的制备：无菌取5mL鸡外周血小心沿侧壁加入到10mL玻璃离心管中4mL的淋巴细胞分离液之液面上，以2000rpm离心15min；收集上层与淋巴细胞分离液两相界面上的细胞（白色云雾层），放入新的10mL玻璃离心管，以2000rpm离心10min；吸去上清液，沉淀经PBS反复洗涤2次，即得所需的淋巴细胞；细胞计数后，用RPMI-1640完全培养基调节细胞密度至5×106个/mL；将细胞悬液加到96孔细胞板中，100μL/孔。
（2）淋巴细胞增殖试验：淋巴细胞增殖试验参照文献的方法稍作修改。将纯化NDV抗原用RPMI-1640完全培养基调节至20μg/mL作为刺激抗原，每孔加入100μL，对照孔加入100μLRPMI-1640完全培养基，各作3个重复孔。37℃下培养66h，然后每孔加入40μLMTT（5mg/mL），37℃下继续培养72h。吸弃培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡融解结晶，测定OD570nm的值，计算刺激指数（SI），SI＝刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值。结果见图1，由图1中可以看出，本发明所得活性小肽具有刺激动物免疫功能，增强动物T细胞活力的功能，T细胞室畜禽动物体内参与非特异性免疫（如抗肿瘤、抗病毒）和细胞免疫的主力军，其活力的增强说明可提高动物的抗病力。
（5）对鸡IBV抗体效价的影响
为检测本发明的活性肽对肉鸡对IBV特异性抗体效价的影响，将肉仔鸡分为6组，每个组分成3个重复，每个重复10只鸡，试验期7周。试验设计见表7，分别于7日龄和14日龄给肉鸡滴鼻、滴眼IBVH120疫苗0.5ml。
表7肉鸡试验设计
分别于7、28、35和42日龄每组取8只鸡翅静脉采血，然后4000rpm离心10min分离血清，于-20℃冰箱冷冻保存，用HA和HI试验检测IBV抗体效价，结果以Log2的对数值表示，见表8。
表8：肉鸡血清中IBVHI抗体滴度(log2)
| dpi | 0 | 21 | 28 | 35 |
| 组别 | ||||
| 组1(10mg/L) | 0.2±0.2 | 6.5±0.3 | 7.1±0.3 | 5.3±0.1 |
| 组2(20mg/L) | 0.5±0.3 | 7.9±0.6* | 9.3±0.6* | 8.4±0.3* |
| 组3(40mg/L) | 0.3±0.1 | 6.5±0.4 | 7.3±0.4 | 6.2±0.4 |
| 组4(80mg/L) | 0.4±0.2 | 7.5±0.7* | 7.9±0.3 | 6.8±0.3 |
| 组5(空白对照) | 0.5±0.2 | 5.1±0.3 | 6.3±0.1 | 4.7±0.2 |
从表8中可看出，添加活性肽组的肉仔鸡的IBV抗体效价明显高于空白对照组，特别是试验2和4组更为显著。说明活性肽饲料添加剂可显著提高肉仔鸡的抗体效价，抗体效价是衡量机体抵抗病原能力的重要指标，抗体效价高即表明机体的抗病力强。
本发明提供的活性肽饲料是一种绿色饲料添加剂，与已有技术相比具有如下优越性：
（1）在饲料中的添加量低，每吨饲料仅添加100克左右，是目前肽蛋白饲料的1/10；
（2）该活性肽饲料添加剂的功能明确，具有如下的功能：①可提高动物对营养素，如蛋白质、矿物质、维生素等重要营养素的吸收利用率，提高饲料利用率。②可提高肉、蛋产量和生产能力，改善肉、蛋的品质和风味；③本发明产品具有刺激动物免疫器官发育和提高抗病力和减少发病率等功能，明显提高畜禽成活率，降低死淘率，可作为抗生素的替代品，降低药物残留。
（3）该活性肽饲料添加剂的分子量较小；
（4）本发明产品成本低，易于在薄利的养殖行业推广。
附图说明
图1是活性肽饲料添加剂对鸡外周血PBMC细胞增殖活力影响柱状图；
图2为所得产品的质谱图；
图3为所得产品高效液相色谱图。
具体实施方式
生物活性小肽饲料添加剂的合成方法，步骤如下：
1）Boc-Trp-Leu-OMe（化合物3）的合成
在0℃下，将二异丙基乙胺（试剂a：DIEA）21mmol缓慢滴加到亮氨酸甲酯盐酸盐（化合物2，7mmol）的30ml二氯甲烷中，用DIEA调节pH=7-8，然后再加入Boc-色氨酸（化合物1，7mmol）与1-羟基苯并三唑0.92g（HOBt，7mmol），在0℃下再反应15min，然后再加入N,N'-二环己基碳二亚胺1.54g（DCC，7.49mmol），室温下反应12h（TLC跟踪反应），停止反应后，过滤，减压蒸去溶剂，再用乙酸乙酯溶解，依次用柠檬酸，NaHCO3和NaCl溶液萃取，合并有机相，在Na2SO4中干燥2h，过滤，减压蒸去溶剂，300-400目硅胶柱层析进行纯化，从而得到纯产物Boc-Trp-Leu-OMe（化合物3）2.74g，产物为纯白色固体，收率91.2%。
2）Trp-Leu-OMe三氟醋酸盐（化合物4）的合成
准确称取步骤1）获得的Boc-Trp-Leu-OMe（2.5mmol）溶解于25ml的圆底烧瓶中，用12ml二氯甲烷溶解，并冷却到0℃，然后加入3ml三氟醋酸，在0℃反应4h，反应结束后，在压下旋去二氯甲烷与未反应的三氟醋酸，得到白色固体Trp-Leu-OMe三氟醋酸盐（化合物4），其不需提纯可以直接用于第5）步合成。
3）Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe（化合物7）的合成
在0℃下，将二异丙基乙胺（DIEA）21mmol缓慢滴加到Gly-Gly-OMe盐酸盐（化合物6，6.91mmol的30ml二氯甲烷中，搅拌10min，然后再加入Boc-Tyr-OH（化合物5，7mol）与1-羟基苯并三唑0.92g（HOBt，7mmol），在0℃下再反应15min，然后再加入DCCl.54g（7.49mmol），然后升到室温反应12h（TLC跟踪反应），停止反应后，过滤，减压蒸去溶剂，再用乙酸乙酯溶解，依次用柠檬酸，NaHCO3和NaCl溶液萃取，合并有机相，在Na2SO4中干燥2h，过滤，减压蒸去溶剂，用300-400目硅胶柱层析进行纯化，从而得到较纯产物2.5g，产物为白色固体Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe（化合物7），收率81%。
4)Boc-Tyr-Gly-Gly-OH（化合物8）合成
冰浴条件下，在Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe（化合物7，1mmol）中加入1NNaOH4mL和甲醇4mL，5min后让其在室温下皂化2小时，点板至原料点消失，加HCl调pH=7-8，停止反应旋去甲醇，在冰浴下加HCl调pH=2-3，有大量的白色沉淀析出，用无水乙醚萃取一次，水相用28乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用饱和NaCl洗3-4次，乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥2小时，过滤浓缩，得到Boc-Tyr-Gly-Gly-OH（化合物8）。
5)Boc-Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OMe（化合物9）的合成
合成方法同步骤（1）
6）Boc-Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OH的合成
合成方法同步骤（4）
7)Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OH（化合物10）的合成
合成方法同步骤（2），反应完后减压旋去二氯甲烷与未反应的三氟醋酸,然后用离子交换树脂去除三氟醋酸，冷冻干燥得到五肽粗品。随后用300-400目硅胶柱层析进行纯化,纯化步骤是：将得到的粗肽加入去离子水，温度保持在20～40℃，用超声波振荡10～30分钟进行溶解；如有不溶物，以1∶100加入三氯乙酸帮助溶解。溶解后，用0.45μm的膜过滤，得到澄清溶液。将得到的粗肽溶液进行离子交换色谱分离模块与低压有机色谱分离模块的分离纯化，即离子交换柱和低压有机色谱柱，醋酸盐缓冲系统和醋酸/乙醇缓冲系统，进行色谱柱的平衡、进样、吸附、洗脱等工艺，获得高纯度的多肽产品，实现化学合成多肽从小试至中试的规模化制备。
Claims (5)
1.生物活性小肽，其特征在于为线型五肽Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu。
2.权利要求1所述的生物活性小肽的合成路线如下：
试剂说明如下：(a)DIEA,DCC,HOBt;(b)TFA,CH2Cl2;(c)1NNaOH,CH3OH。
3.权利要求2所述的生物活性小肽的合成方法，步骤如下：
在冰浴条件下，以DIEA为缚酸剂，DCC与HOBt为混合缩合剂，二氯甲烷为溶剂,亮氨酸甲酯盐酸盐与Boc-色氨酸反应得到纯Boc-Trp-Leu-OMe，然后同样在0℃下将所得的Boc-Trp-Leu-OMe与三氟醋酸反应，得到Trp-Leu-OMe三氟醋酸盐；
按照合成Boc-Trp-Leu-OMe的方法，以Boc-Tyr-OH和Gly-Gly-OMe盐酸盐为原料，合成Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe，然后在冰浴条件下，在Boc-Tyr-Gly-Gly-OMe中加入NaOH和甲醇使其皂化，然后用HCl酸化得到Boc-Tyr-Gly-Gly-OH；
同理，按照合成Boc-Trp-Leu-OMe的方法以Trp-Leu-OMe三氟醋酸盐和Boc-Tyr-Gly-Gly-OH为原料合成Boc-Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OMe，然后用NaOH将其水解，最后用三氟醋酸处理脱去Boc保护基，得到Tyr-Gly-Gly-Trp-Leu-OH。
4.权利要求1所述的生物活性小肽作为畜禽饲料添加剂的用途。
5.权利要求1所述的生物活性小肽作为畜禽饲料添加剂的用途，其特征在于所述的畜禽为猪、鸡，鸭。
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