NO320671B1 - Fremgangsmate for a stimulere vektokning i fisk. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å stimulere vektøkning i fisk. Fremgangsmåten omfatter oral administrering av et for som omfatter et materiale, hvor nevnte materiale omfatter et alginat som har et (1-4)-bundet-p-D-mannuronsyre (M) -innhold på minst 40% og en akseptabel bærer.

Alginater blir isolert fra marine brunalger. Alginat blir også produsert i noen jordbakterier så som Azotobacter vinelandii og Azotobacter crococcum og mange forskjellig Pseudomonas sp. Brunalger er imidlertid generelt kilden for kommersielt tilgjengelige alginater.

Alginater er salter av alginsyre, en lineær, heteropolysakkarid bestående av (1-4)-bundet-p-D-mannuronsyre, betegnet her som M og a-L-guluronsyre, betegnet her som G. Disse to uronsyrene har de følgende formler:

Polymerene eksisterer som homopolymere sekvenser av mannuronsyre, betegnet M-blokker, homopolymere sekvenser av guluronsyre betegnet G-blokker og blandede sekvenser av mannuron- og guluronsyreenheter, betegnet MG-blokker eller alternerende blokker. Det følgende skjema viser en illustrasjon av strukturen til alginater:

Alginater inneholder vanligvis alle tre typer blokker og en blokk består vanligvis av tre til tretti monomerenheter. Fordelingen av blokkene avhenger av typen alger som alginatet blir isolert fra, så vel som alderen og del av planten, for eksempel kan alginat fra stilken ha en annen sekvens og blokk-sammensetning i forhold til alginat isolert fra bladene. Årstiden når algene blir høstet påvirker også blokk-sammensetningen og sekvensen. I henhold til vanlig kunnskap, kan det høyeste G-innholdet finnes i stilken til gammel Lhyperborea. Blad fra samme arter har et noe lavere G-innhold og kortere G-blokker, men innholdet er fortsatt høyere enn for de fleste andre arter. Kommersielt tilgjengelige alginater har vanligvis et G-innhold på 25%-70%.

Det er kjent at alginater er anvendt i matvarer og i farmasøytiske, dentale, kosmetiske og andre industrielle produkter. De vanligste industrielle applikasjoner er basert på deres hydrokolloidale og polyelektrolytiske natur, som danner basis for gel-dannende, fortykkende, stabiliserende, svellende og viskositetsfrembring-ende egenskaper.

Det er også vist at alginater, som er rike i M-innhold, har immunstimulerende aktivitet som gjør dem anvendelige som tilsetningsstoffer i vaksiner og sårhelings-preparater som beskrevet i US-patent 5 169 840. G. Skjåk-Bræk og Terje Espevik, Carbohydrates in Europe, beskriver bruk av alginat i et levende for for å stimulere immunforsvaret i ung piggvar. Det oppnås økt overlevelse i fisken, men kun etter at det mannuronsyre-rike alginatet er fordøyet av den levende organismen Artemia som siden blir fiskefor.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å stimulere vekt-økning hos fisk, kjennetegnet ved at den omfatter oral administrering til nevnte fisk av et for som omfatter et materiale, hvor nevnte materiale omfatter inntil 0,06% av et alginat som har et mannuronsyre (M) -innhold på minst 40% og en akseptabel bærer.

Foreliggende oppfinnelse angår foretrukket en fremgangsmåte hvor nevnte materiale omfatter et alginat med M-innhold som er 50% til 70%, 70% til 80% eller 80% til 99,9%. Alginatet kan være avledet fra Lesso/7/a-tang , Durvillea- tang eller Laminaria- tang, foretrukket er alginatet som anvendes i foreliggende oppfinnelse avledet fra Durvillea- tang.

I en foretrukket utførelsesform anvendes alginat som er avledet fra bakterier eller Du/v///ea-vannekstrakt.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse angår i en foretrukket utførelsesform en fremgangsmåte hvor nevnte materiale er en veterinærmedisinsk fast doseform eller flytende preparat.

I ytterligere en foretrukket utførelse, angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å stimulere vektøkning hos fisk ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den omfatter oral administrering til nevnte fisk av et for som omfatter inntil 0,06% av et alginat som har et M-innhold på minst 80% og en akseptabel bærer, hvor nevnte alginat er fremstilt ved blanding og svell ing av Durvillea- tang i vann, under opprettholdelse av pH høyere enn ca. 2,3 ved en temperatur høyere enn 20 °C i minst 30 minutter, isolering av en solubilisert fraksjon fra blandingen og gjenvinning av nevnte alginat som har et M-innhold på minst 80% fra den solubiliserte fraksjonen ved utfelling med syre, salt eller alkohol.

Foretrukket omfatter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse administrering av et for som omfatter inntil 0,06% av et alginat som har et M-innhold på minst 40%, med det forbehold at nevnte alginat enten er fremstilt syntetisk eller isolert fra tang eller en bakteriell kilde.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 er en kurve som viser vektøkningen til griser som har fått for som inneholder alginater med høyt M-innhold i løpet av en periode på tolv uker. Figur 2 er en kurve som viser serumnivået av det totale antall hvite blodceller i grisene testet med ulike alginater sammenlignet med en kontroll. Figur 3 er en kurve som viser serumnivået av monocytter i grisene testet med ulike alginater sammenlignet med en kontroll. Figur 4 er en kurve som viser serumnivået av lymfocytter i grisene testet med ulike alginater sammenlignet med en kontroll. Figur 5 viser nivået av fagocytose målt ved anvendelse av blod fra griser matet med Durw/fea-vannekstrakt sammenlignet med en kontroll. Figur 6 viser det oksydative utbrudd målt ved anvendelse av blod fra griser matet med DuAV///ea-vannekstraktet sammenlignet med en kontroll. Figur 7 viser immunresponsen på en injisert eksperimentell vaksine som inneholdt humant serum albumin (HSA) hos griser matet med Durvillea-standardekstrakt, Duw/fea-vannekstrakt og Lesson/a-standardekstrakt, sammenlignet med en kontroll. Fig.8 viser den spesifikke veksthastighet (SVH) (% vekst per dag) av flekksteinbit matet oralt med fdr inneholdende Øu/v/tfea-vannekstrakt over en periode på 60 dager, mot den spesifikke veksthastigheten til en kontrollgruppe.

De følgende forkortelser blir anvendt i figurene; DWE = Durvillea-vannekstrakt, Std. DA = Du/v//fea-standardekstrakt og Std.LN = Lessonia-standardekstrakt.

Alginater som har et M-innhold på minst 40% anvendes i foreliggende oppfinnelse. Mer spesifikt kan alginater som har et M-innhold på fra 50% til 70%

(så som avledet fra Lessonia, Durvillea og Laminaria) ; 70% til 80% (så som avledet fra Durvillea) og 80% til 99,9% (så som stammer fra bakterier og vannekstrakter av alginater som Durvillea; som fremstilt, for eksempel i henhold til eksemplene nedenfor) anvendes. Disse alginater stimulerer immunresponsen til pattedyr, fugler, fisk og krypdyr mot sykdom eller traumer forårsaket av cellulært angrep fra fremmedlegemer og fysisk skade på celler. Omfattet blant fremmedlegemer er mikroorganismer, partikulære stoffer, kjemiske midler og lignende. Omfattet av fysiske skader er mekanisk sår så som skrubbsår, flenger, kvestelser, sår og lignende.

Det orale, immunstimulerende materialet anvender en immunstimulerende mengde av alginatet som har et M-innhold på minst 40%. Den immunstimulerende mengde kan variere avhengig av dyret som skal innta det immunstimulerende materialet og nivået på immunstimuleringen som er nødvendig. For eksempel, uten å være begrensende, administreres oralt i de første 60 dagene av en fisk sitt liv, 2-20 mg alginat/fisk. Mer moden fisk, vil selvfølgelig kreve større mengder.

Det orale, immunstimulerende materialet som inneholder alginatet som har et M-innhold på minst 40% kan være faste farmasøytiske, veterinærmedisinske eller nutrasøytiske doseformer så som tabletter, småkapsler, kapsler, etc eller som et pulver eller flytende preparat. Det kan også være en hvilket som helst type fast eller flytende matvare beregnet for inntak av pattedyr, fugler, iktyisk eller krypdyr så som katte- eller hundemat. Det kan også være et fast, halvfast eller flytende kosttilskudd så som matplater, drikke, etc.

Akseptable bærere kan være en hvilket som helst av de konvensjonelt anvendte i flytende eller faste doseformer i farmasi, veterinærmedisin og kosttilskudd, i flytende, fast og halvfast matvare og flytende og faste kosttilskudd.

Det er også funnet, som demonstrert nedenfor i eksemplene, at den immunstimulerende aktiviteten til alginatene som anvendes i foreliggende oppfinnelse stimulerer vektøkning til et pattedyr (som demonstrert nedenfor i griser (se Figur 1)) og fisk (som demonstrert nedenfor i flekksteinbit (se figur 8)) som spiser alginatet sammenlignet med en kontroll. Dette aspektet er spesielt anvendelig og ønskelig når slike alginater gis oralt til unge pattedyr. Foreliggende oppfinnelse er også anvendelig for å stimulere vektøkning hos pattedyr, fugler og krypdyr gjennom immunstimulering som omfatter oral administrering av en immunstimulerende mengde av et immunstimulerende materiale til pattedyret, fuglen, fisken eller krypdyret, der materialet omfatter et alginat som har et M-innhold på minst 40% og, hvis nødvendig eller ønsket, en akseptabel bærer. Mer spesifikt, omfatter denne metoden også administrering av et alginat som har et M-innhold på fra 50% til 70%, 70% til 80% eller 80% til 99,9%. Det immunstimulerende materialet kan være et hvilket som helst av dem angitt ovenfor.

Det orale materialet som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde alginat som har et M-innhold på minst 40%, som er syntetisk avledet eller isolert fra enten en alginatproduserende bakteriell art eller fra tangkilder.

Alginater som har et M-innhold på minst 40% kan fremstilles fra tang ved mange kjente prosesser på området. Utgangsmateriatet for alginatet som har det nødvendig M-innhold, er alger eller tang, spesielt brunalger som generelt blir behandlet med formaldehyd for å fiksere fenoler og preservere algene. Deretter blir algene vasket med syre for å fjerne meget viskøse laminaraner og fukoglykaner. Fortrinnsvis kan de også behandles med alkali for å redusere innholdet av pyrogener. Det er underforstått at algene kan være forbehandlet på hvilken som helst kjent måte. Kommersielt tilgjengelige alginater, særlig foretrukket tørkede og oppmalte alger fra artene Durvillea, kan anvendes, men også ferske, hele eller ikke-oppmalte alger fra Durvillea, Laminaria, Lessonia, Ecklonia, Makrocystis eller Ascophyllum er egnet som utgangsmaterialer.

Prosesser for å produsere slike alginater er angitt, for eksempel av Green i US-patent nr. 2 036 934 og Le Gloahec i US-patent nr. 2 128 551 og slike prosesser er inntatt her ved referanse. Andre metoder for å oppnå alginater som er anvendelige i oppfinnelsen er gitt nedenfor i eksemplene. For eksempel kan alginater som anvendes i foreliggende oppfinnelse også fremstilles ved anvendelse av en vandig ekstraksjonsprosess ved samblanding av en alginatkilde som har et høyt M-innhold med vann i et forhold på fra 1:3 til 1:20 i et svelletrinn hvor pH blir holdt over ca. 2,3 ved en temperatur på mer enn 20 °C i minst 30 minutter og isolering av den solubiliserte alginatfraksjonen fra det faste materialet ved filtrering. Et alginat som har det nødvendige M-innhold kan gjenvinnes fra løsningen ved utfelling med syre, salt eller alkohol.

Eksemplene angitt nedenfor omfatter representative eksempler på aspekter ved foreliggende oppfinnelse. Eksemplene tjener et illustrerende formål. Hvis ikke annet er angitt, er alle deler, prosentdeler og liknende etter vekt.

Eksempel 1

Råstoff fra forskjellige Durvillea- arter, D. potatorum (malt), prøve 1, og D. antarctica (ikke malt), prøve 2, ble tilsatt vann i mengdene angitt i tabellen nedenfor og omrørt for hånd fra tid til annen ved en temperatur på 55 °C i 3,5 timer. Etter lagring ved omgivelsestemperatur over natten, ble algene ekstrahert nok en gang ved 55 °C i 1 time, deretter ble 2,5 ml formaldehyd tilsatt og ekstraksjonen fortsatt i 1 time.

Pre-ekstraksjonstrinn

Suspensjonen ble deretter siktet på et 60-mesh filter og vasket 2 ganger med et overskudd av vann. Løsningen ble deretter filtrert med filterhjelpemidler på en vakuumtrakt og deretter på et pre-filter av glassfilter. Løsningen fikk deretter avkjøles til 10 °C og ble deretter tilsatt NaCI inntil en 0,5 % konsentrasjon. Deretter ble det dråpevis tilsatt fortynnet 5,5 M saltsyre under omrøring med magnet til pH 1,8. En hvit utfelling ble dannet. Suspensjonen ble, etter oppbevaring ved 10 °C i 30 minutter, siktet på en 120 mesh filterduk og presset for hånd hvilket resulterer i deigete, gul masse, som ble omdannet til fine fiber etter pressingen. Alt det sure materialet ble overført til et 250 ml kar og tilsatt vann opp til 200 ml, før det ble nøytralisert til pH 7 med fast soda-aske under magnetisk omrøring. Løsningen ble filtrert én gang til på en 0,8 mikron filtermembran av cellulosenitrat. Filtratet ble avkjølt til 10 °C og utfelt med isopropylalkohol i forholdet 1:1. Fibrene dannet ble vasket én gang med 70 volum% isopropylalkohol og deretter en andre gang med 100 volum % isopropylalkohol. Fibrene ble tatt opp med en pinsett og deretter frysetørket. Resultater er gitt i den følgende tabell.

Analyse av produkt Blokk-fordeling i produktet målt med NMR 400 Hz

Den følgende tabell viser utbytte av M fremstilt fra andre tang-prøver på samme måten som fremgangsmåten i dette eksemplet.

Eksempel 2

En prøve fra august 1996 av Durvillea antarctica malt til partikler større enn 70 mesh, ble anvendt som utgangsmaterialet. 30 gram tørkede alger ble veid i et kar. 100 ml 0,2 M HCI ble tilsatt og materialet ble fortynnet med vann til 500 ml. Etter noen få minutters omrøring øket pH til > 2,3 og syre ble tilsatt for å holde pH lavere enn 2,3, (pH 1,8). Etter 2 minutter ble 2,5 ml 0,2 M HCI tilsatt. Materialet svellet svært lite da pH ble holdt konstant lavere enn pH 2,3, ved pH 1,8, sammenlignet med svelling i rent vann. Etter svelling i 1 time, ble materialet siktet på en 60 mesh filterduk, presset for hånd og overført til et kar. Det resulterende materialet ble deretter tilsatt 500 ml vann og 50 ml soda-aske/natriumhydroksyd-løsning og ekstrahert ved 55 °C i 1 time. Materialet svellet meget raskt og var tykt som en deig eller tremasse. Den ble lagret ved omgivelsestemperatur inntil neste dag. Deretter ble materialet ekstrahert ytterligere i 1 time ved 55 °C og deretter malt på en blandeenhet. Total masse ble veiet til 549 gram. 150 gram av materialet ble fortynnet med 700 gram vann under omrøring. Løsningen ble deretter filtrert på filterpapir etter tilsetning av filtrerhjelpemidler ved hjelp av vakuum fra vannsug. Filtratet veide 564 gram og ble avkjølt til 10°C. Det ble tilsatt natriumklorid til 0,5 % og pH ble regulert til 1,6 med dråper fortynnet saltsyre (1:1). En myk utfelling ble dannet. Materialet ble deretter siktet på en 120-mesh filterduk og presset forsiktig for hånd. Materialet ble deretter suspendert med vann og fortynnet til et volum på ca. 200 ml ved en temperatur på 20 °C. pH i løsningen ble nøytralisert til 7 med fast soda-askepulver ved anvendelse av en magnetisk rører. Løsningen ble utfelt med like deler isopropylalkohol-løsning ved omrøring med en glasstav. De utfelte fibre ble vasket én gang med 70 volum% isopropylalkohol-løsning. Deretter ble det vasket igjen med ren 100 volum% isopropylalkohol. Etter sikting og pressing på en 120-mesh filterduk, ble fibrene tatt opp med pinsett og deretter frysetørket natten over i vakuum. Utbyttet ble veiet til 1,04 gram alginat, tilsvarende til 3,6 vekt % fra Durvillea antarctica utgangsmaterialet. Innholdet av M var 70 % og blokkordeling i alginatet målt med NM R som følger.

Eksempel 3

Det er mulig ytterligere å øke innholdet av mannuronsyre ved tilsetning av salt i pre-ekstraksjonstrinnet. 20 gram Durvillea antarctica (grovt oppmalte partikler > 70 mesh) alger fra Chile august 1996 ble tilsatt 500 ml vann og en viss mengde NaCI og ble ekstrahert under omrøring på en Jar-testmaskin, ved en omrøringshastighet på 140 opm i 2 timer ved en temperatur på 20 °C. Saltet ble tilsatt til en konsentrasjon i løsningen som angitt i den følgende tabell.

Materialet ble deretter siktet på en 400 mesh filterduk og presset for hånd. Den siktede løsning ble veiet og pH målt som gitt i den følgende tabell.

Den siktede løsning ble deretter filtrert i vakuum (vannsugpumpe) på en trakt med filterpapir. Viskositeten til den filtrerte løsning ble målt med et glassrør og resultatene er gitt i den følgende tabell.

Filtratet ble avkjølt til under 15°C og hver av prøvene ble tilsatt dråper med 5,5 M saltsyre inntil pH nådde 1,8 - 2,0, under omrøring med en magnetisk rører. En fiberformet utfelling ble dannet. Fellingen ble deretter siktet på en 400-mesh filterduk og presset for hånd. Alginsyren ble deretter fortynnet med vann og nøytralisert med fast soda-aske til pH 6-7 under omrøring inntil oppløsningen var fullført. Løsningen ble deretter avkjølt og utfelt med lik deler med isopropylalkohol. Deretter ble det vasket med 70 volum% isopropylalkohol og gjentatte ganger vasket med ren 100 volum % isopropylalkohol. De utfelte fibrene ble trukket ut med en pinsett og overført til et kar og frysetørket natten over i vakuum. Resultatene er vist i den følgende tabell, hvor mengden av utbytte ble beregnet med den antagelse at intet alginat var mistet og at alt alginat blir løst i det tilsatte vannet.

Eksempel 4

Innholdet av mannuronsyre i den adskilte fraksjon ble ytterligere øket ved tilsetning av CaCfe. Utgangsmaterialet var D. antarctica fra Chile som var malt til grove partikler > 70 mesh. Mengdene og betingelsene for pre-ekstraksjonstrinnet er angitt i den følgende tabell. Pre-ekstraksjonen ble utført under omrøring på en Jar-tester med ca. 140 opm.

Materialet ble deretter siktet på et 400-mesh filter og presset for hånd. Løsningen ble deretter oppvarmet til ca. 30°C og filtrert med papir på en vakuumsugkolbe.

Løsningen ble deretter avkjølt til 10°C og tilsatt natriumklorid til 0,5 %. Deretter ble dråper av 5,5 M HCI tilsatt under forsiktig magnetisk omrøring inntil pH 1,8. En hvit utfelling ble dannet. Substans-suspensjonen ble deretter lagret i 30 minutter og siktet på en 400-mesh filterduk og presset forsiktig for hånd. Materialet var en deigete gul masse, som forvandlet seg til fine skinnende fibre etter pressing. Det sure materialet ble deretter overført til et 250 ml kar og tilsatt vann opp til 200 ml og deretter nøytralisert til pH 7 med fast soda-aske under magnetisk omrøring. Filtratet ble deretter avkjølt til 10 °C og utfelt under omrøring med 100 volum % isopropylalkohol i et forhold på 1:1. Store fibre ble utfelt. Fibrene ble vasket to ganger med 70 volum% isopropylalkohol og til slutt med 100 volum% isopropylalkohol. Fibrene ble deretter trukket ut med en pinsett og deretter frysetørket natten over under vakuum. Resultatene er gitt i tabeller 9 og 10 som viser utbyttene og økningen i innhold mannuronsyre i alginat med mer enn 80% M fra maksimum 91% når salt ikke ble tilsatt, til et maksimum på 95% når salt ble tilsatt til pre-ekstraksjonstrinnet.

Eksempel 5

Et totalt antall på førtiåtte kryssavlede [(Norsk landrase x Yorkshire) x Norsk landrase] 35 til 38 dager gamle avvente griser fra seks kull med en gjennomsnittlig innledende vekt på 13,07 kg (STD 1,98), ble delt i fire grupper i en eksperimentell forstudie og plassert i en miljømessig kontrollert pleiestasjon. Initielt var det huset fire griser pr. bås på 2,5 m ganger 2,5 m. Etter seks uker med foring, ble grisene overført til båser på 15 kvadratmeter med individuelle forstaller med seks griser pr. bås. Grisene fikk fri tilgang til for og vann. Grisene ble individuelt veiet en gang ukentlig. Grisene fikk et 4 dagers innledende tidsrom for tilvenning til båsene og standard kommersielt awenningsgrisefor. Det kommersielle foret (13% fuktighets-innhold) ble forsterket med vitaminer og mineraler som er nødvendige for vekst og hadde et rå proteininnhold på ca. 18-19%, et fordøyelige proteininnhold på 14-15%, et stivelsesinnhold på 40-50% og et råinnhold av fett på ca. 2,6%.

Etter de innledende tilpasninger til kommersielt for, ble de fire gruppene hver på tolv griser gitt forskjellig diett i ti uker. De siste to ukene av undersøkelsen fikk alle grisene det kommersielle foret. Grisene i kontrollgruppen ble foret med standard kommersielt for mens grisene i de tre andre gruppene ble foret med samme kommersielle for som ble blandet med 1,25% (vekt/vekt) alginat. De tre alginatene som ble testet var 1. Durvillea anfarcf/ca-vannekstrakt (89% M), 2. Durvillea a/ifarcf/ca-standardekstrakt (63% M) og 3. Lessonia nigrescens-standardekstrakt ( 55% M). Disse alginatpulvere som blir karakterisert ved egenviskositet og ^H NMR spektroskopimålinger er ytterligere beskrevet som følger: Durvillea anfarcf/ca-standardekstrakt hadde en egenviskositet på 7,0 g/dl som tilsvarer en beregnet gjennomsnittlig molekylvekt på 210,000 Dalton ved anvendelse av Mark Houwink-ligningen. Denne Durv///a-alginatprøven hadde et molfraksjonsinnhold for mannuronat-(M)-enheter på 0,63 og for guluronat-(G)-enheter på 0,37. Fraksjonsinnholdet av M- til M-bindinger, F(MM), var 0,44. Fraksjonsinnholdet av G- til G-bindinger, F(GG), var 0,18. Fraksjonsinnholdet av M- til G-bindinger, F(MG), som tilsvarer fraksjonsinnholdet av G- til M-bindinger F(GM), var 0,19.

Durvillea a/?farcf/ca-vannekstrakt eller Du/v///ea-vannekstrakt, fremstilt ved selektiv utfelling av en alginatfraksjon som har et forøket M-innhold, hadde en egenviskositet på 4,7 g/dl som tilsvarer en beregnet vektgjennomsnittlig molekylvekt på 85,000 Dalton ved anvendelse av Mark Houwink-ligningen. Denne alginatprøven av Durv»7/ea-vannekstrakt hadde et molfraksjonsinnhold for mannuronat-(M)-enheter på 0,88 og for guluronat-(G)-enheter på 0,12. Fraksjonsinnholdet for M- til M-bindinger, F(MM), var 0,80. Fraksjonsinnholdet for G- til G-bindinger, F(GG), var 0,04. Fraksjonsinnholdet av M- til G-bindinger, F(MG), som tilsvarer fraksjonsinnholdet av G- til M-bindinger F(GM), var 0,08.

Lessonia n/grescens-standardekstrakt hadde en egenviskositet på 13,4 g/dl som svarer til en beregnet vektgjennomsnittlig molekylvekt på 370,000 Dalton ved anvendelse av Mark Houwink-ligningen. Denne Lessonia -alginatprøveen hadde et mol fraksjonsinnhold for mannuronat-(M)-enheter på 0,55 og for guluronat-(G)-enheter på 0,45. Fraksjonsinnholdet av M- til M-bindinger, F(MM), var 0,35. Fraksjonsinnholdet for G- til G-bindinger, F(GG), var 0,25. Fraksjonsinnholdet av M- til G-bindinger, F(MG), som er lik fraksjonsinnholdet av G- til M-bindinger F(GM), var 0,20.

Alginatets egenviskositet ble bestemt ved anvendelse av metoden beskrevet i Alginates as immobilization materials - A study of some molecular and functional properties (Martinsen, Anita) hovedfagsoppgave; NTH - Universitetet i Trondheim, 1990. Vektgjennomsnittlig molekylvekt ble beregnet basert på data for egenviskositet og Mark Howink-ligningen. Monomersammensetning og sekvensielt arrangement ble analysert ved ^H-NMR-spektroskopi på et Brucker 400 WM spektrometer som beskrevet av Grasdalen et al, "A NMR study of composition and sequence of uronate residues in alginates", i Carbohydrate Research 1979; 68:23 og H. Grasdalen "High Field ^H NMR spectroscopy of alginate: sequential structure and linkage conformation" i Carbohydrate Research, 1983 ; 118 : 255.

Etter to ukers foring, ble grisene immunisert (ved 7 ukers alder) og de ble gitt en booster-injeksjon fire uker senere (ved 11 ukers alder). Alle grisene ble immunisert intramuskulært med 0,5 ml en blanding av 0,25 ml Pneumabort K<®>

(102BY0002, Fort Dodge Laboratories) inneholdende heste-herpesvirus 1 (EHV) og 0,25 ml Humant serum albumin (HSA)(200 ug/ml) (Sigma), subkutant med 0,5 ml Prevacun F<®> (027021E, Hoechst Roussel Vet, Tyskland) inneholdende influensa virus A/Eki 1, A/Eki 2/M, A/Eki 2/F (EIV) og 1,0 ml Difteri/Tetanus vaksine<®> (DT9169a1, SBL Vaccin AB, Stockholm) inneholdende tetanustoksoid (30 Lf/ml) og tetanustoksoid (7,5 Lf/ml).

Spesifikke antistoffer mot humant serum albumin (HSA) (Sigma Chemical Industries, USA) og difteritoksoid (DIF) (Statens Institutt for Folkehelsen) ble målt med en passiv hemagglutinasjonstest (Avrameas et al 1969). Den laveste fortynning testet var 1:8. Sera som viste ingen hemning ble gitt en titer på 4 for anvendelse i de statistiske beregninger. Titerverdier for antistoffet ble log2-transformert for å normalisere fordeling.

Blodprøver ble oppsamlet i to ukers intervaller for serologi, hematologi og for funksjonell karakterisering av fagocytter og lymfocytter. Serum ble isolert og lagret ved -20°C inntil prosessering. Stabilisert (heparinisert og EDTA) blodprøver ble tatt om morgenen og analysert umiddelbart. Blodprøvene ble analysert (Technicon H-1) på Klinisk sentrallaboratorium ved Norges Veterinærhøgskole, Oslo. Totalt leukocyttall (WBC x 10<9>/L), antall (x 10<9>/L) monocytter, nøytrofiler og eosinofiler ble målt elektronisk og antallet lymfocytter og det relative antall (%) lymfocytter, monocytter, nøytrofiler og eosinofiler ble beregnet. Totalt erythrocyttall (RBC x 10<12>/L), gjennomsnittlig cellevolum (MCV fL) og hemoglobin (HGB g/L) ble målt og hematokrit (HCT L/L) ble beregnet.

Den fagocyttiske aktiviteten til granulocyter i blodet ble undersøkt ved anvendelse av Phagotest<®> (Orpegen Pharma, Heidelberg) ved å følge bruksanvisningen. Heparinisert (15 I U/ml) helblod ble blandet og porsjonert ut (100 lii) og tilsatt til bunnen av et 5 ml medisinglass (Falcon) og inkubert 10 minutter på is før tilsetning av 20 \ i\ forhåndsavkjølt, stabilisert og opsonisert FITC-merket E. coli suspensjon (testsett). Alle medisinglass ble ristet og testprøver ble inkubert i

10 minutter ved 37°C i et vannbad, mens kontrollprøvene forble på is. Alle prøver ble deretter plassert samtidig på is for å stoppe fagocytose og 100 jai iskald "Quenche"-løsning ble tilsatt til hver prøve og blandet på en vortex-blander. Prøvene ble deretter tilsatt 3 ml vaskeløsning, blandet og cellene ble spunnet ned (250 x g, 5 min, 4°C). Vaskeprosedyren ble deretter gjentatt før tilsetning av 200 |J DNA-holdig løsning. Prøvene ble blandet og inkubert i 10 minutter på is og cellene ble analysert ved strømningscytometri (FACScan™, LYSIS™ programvare) ved anvendelse av blå-grønt eksitasjonslys (488 nm). Prosentdelen av celler som har forut formet fagocytose ble analysert. Evalueringen av oksydativ utbruddsaktivitet ble utført ved strømnings-cytometri ved anvendelse av Phagoburst<®> (Orpegen Pharma, Heidelberg) ved å følge bruksanvisningen. Heparinisert (15 IU/ml) helblod ble blandet og porsjonert (100 |il) ut i bunnen av et 5 ml medisinglass (Falcon) og inkubert 10 minutter på is før tilsetning av 20 (il forhåndsavkjølt, stabilisert og opsonisert E. co//-suspensjon (testsett). Tre kontroll-medisinglass ble inkludert for hvert dyr testet; ett rør ble tilsatt 20 |il vaskeløsning (negativ kontroll), ett rør ble tilsatt 20 ^l kjemotaktisk peptidholdig fMLP-arbeidsløsning ("lav kontroll") og ett rør ble tilsatt 20 \ i\ forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) arbeidsløsning ("høy kontroll"). Alle medisinglass ble blandet og testprøvene ble inkubert i 10 minutter ved 37°C i et vannbad. Alle prøver ble deretter tilsatt 20 |il substratløsning, blandet grundig og inkubert i ytterligere 10 minutter ved 37°C i et vannbad. Alle prøver ble deretter tatt ut av vannbadet samtidig og helblod ble lysert og fiksert med 2 ml forvarmet lyserings-løsning, blandet og inkubert i 20 min ved romtemperatur. Prøvene ble spunnet ned (250 x g, 5 min, 4°C) og vasket én gang ved tilsetning av 3 ml vaskeløsning (250 x g, 5 min, 4°C). Supernatanten ble dekantert og 200 ul DNA-fargeløsning ble tilsatt, prøvene ble blandet og inkubert i 10 minutter på is (lysbeskyttet). Cellene ble analysert ved strømningscytometri (FACScan™, LYSIS™-programvare) ved anvendelse av blå-grønt eksitasjonslys (488 nm). Prosentdelen av celler som har produsert reaktive oksygenmetabolitter ble analysert så vel som deres gjennomsnittlige fluorescensintensitet. Figur 1 viser gjennomsnittsvekt for fire grupper av griser som en funksjon av foringstiden. En betydelig vektøkning ble funnet for griser i Du/v///ea-vannekstraktgruppen og /.esson/a-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Vektforskjellen ble ansett som statistisk signifikant etter uke 3, imidlertid viser Figur 1 en trend til vektøkning i Durvillea vannekstraktgruppen og Lesson/a-gruppen i overens-stemmelse med at disse gruppene økte raskere i vekt enn kontrollgruppen etter uke 1. Mens den aktuelle vektforskjell mellom Di//v///ea-gruppen og kontrollgruppen ikke er så dramatisk som den som sees for Du/v///ea-vannekstraktgruppen og Lesson/a-gruppen, skal det bemerkes at gjennomsnittsvekt i Du/v//fea-gruppen var konsistent høyere enn kontrollgruppen. De individuelle griser i kontrollgruppen hadde en høyere variasjon i vekt sammenlignet med individer i de tre gruppene som fikk alginatholdig for, noe som indikerer at noen individer i kontrollgruppen hadde en nedsatt immunrespons ettersom de var mindre i stand til å håndtere traumer og/eller stress. Hormonet kortisol i griser fordeler næringsstoffer bort fra muskel- og fettvev for å gjøre dyr i stand til å håndtere sykdomsstress. Figurene 2 til 4 viser data oppnådd ved analysering av blodet med hensyn til totale hvite blodceller, monocytter og lymfocytter. Selv om det ikke er statistisk signifikant, indikerer Figur 2 at totale hvite blodceller for Du/v/V/ea-vannekstraktgruppen er høyere enn i kontrollgruppen. Økningen hvite blodcelletall, som observeres for Durv///ea-vannekstraktgruppen, er et resultat av betydelige økninger i både monocytter (Figur 3) og lymfocytter (Figur 4) etter henholdsvis 6 og 10 uker for Dw/v///ea-vannekstraktgruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Lymfocytter i Lesson/a-gruppen viser en forsinket økning (uke 10) sammenlignet med Du/v///ea-vannekstraktgruppen. Blodet tatt fra Duw/fea-vannekstraktgruppen (og kontrollgruppen) ble også undersøkt for fagocyttisk aktivitet og betydelige økninger ble målt for Du/v/7/ea-vannekstraktgruppen sammenlignet med kontrollgruppen i uke 4 som fremgår av Figur 5. Oksydative utbruddsdata vist i Figur 6 underbygger ytterligere det høyere nivå for fagocyttisk respons i griser matet med Du/v///ea-vannekstrakt sammenlignet med kontroll både i uke 4 og uke 8. Det forlengede, økede oksydative utbrudd i uke 4 og uke 8 for Durvillea-vannekstraktgruppen sammenlignet med kontrollgruppen er vesentlig siden underliggende kjemiske prosesser forbundet med respiratorisk utbrudd er nødvendige for å drepe noen typer bakterier og indikerer en forbedret effektivitet i fagocytose. Figur 7 indikerer immunresponsen på vaksineringen. Immunoresponsen på injeksjon med eksperimentell vaksine inneholdende humant serum albumin (Figur 7) viser en betydelig økning i uke 8 for Durw7/ea-vannekstraktgruppen og Lesson/a-gruppen, noe som indikerer en forbedret immunrespons sammenlignet med kontrollen.

Eksempel 6

Durv///ea-vannekstraktalginat (som beskrevet i eksempel 5) ble løst i vann, og etter en kort ultralydbehandling ble løsningen som inneholdt det oppløste alginatet i en konsentrasjon på 4,2 gram alginat per liter, sprayet på kommersielle forpartikler (Skretting(Nutreco, Dirdal, Norge) for å gi 0,02% og 0,06% alginat (vekt%) av foret. Forpartiklene ble lufttørket i to dager før oral administrasjon til nylig klekket flekksteinbit (Ararhichas minor) fiskeyngel.

Tre replikagrupper bestående av 50 yngel ble anvendt for hver betingelse i en 60-dagers for-studie med kontinuerlig foring av fisken. Gjennomsnittsvekt per fisk var omtrent 0,4 gram ved starten av for-studien. Yngelen ble veid hver 10. dag (våtvekt) under studiet. Testbetingelsene inkluderte tre ulike for; kontroll (0% alginat), 0,02% alginat og 0,06% alginat. En tilleggsgruppe av fisk som spiste kontrollfdret ble badet to ganger i løpet av den 60 dagers for -perioden ved å overføre fisken til et bad inneholdende 0,1 gram alginat per liter sjøvann med en behandling i 12-24t per behandlingssyklus, så i for-studien.

Som vist i figur 8, viste fisken som ble foret med alginatinneholdende for en høyere spesifikk veksthastighet på 5,197% vekst per dag (for 0,02% alginat) og 5,247% vekst per dag (for 0,06% alginat) sammenlignet med fisk som ble foret med kontrollfor uten tilsatt alginat (4,875% vekst per dag) over 60 dagers vekstperioden. Fisken som ble periodisk bad-behandlet i løpet av den 60 dager lange studien viste ingen signifikant forskjell i sin spesifikke veksthastighet sammenlignet med kontrollgruppen (henholdsvis 4,745% vekst per dag mot 4,857% vekst per dag). Den spesifikke veksthastigheten i figur 8 ble beregnet som prosent daglig vekst i henhold til den følgende formelen : 100%ganger {ln(vekt ved dag 0 i studien) minus In (vekt ved slutten av studien)} dividert med antall dager i studien (bemerk at In er den naturlige logaritme).

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for å stimulere vektøkning hos fisk, karakterisert v e d at den omfatter oral administrering til nevnte fisk av et for som omfatter et materiale, hvor nevnte materiale omfatter inntil 0,06% av et alginat som har et mannuronsyre (M) -innhold på minst 40% og en akseptabel bærer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte M-innhold er 50% til 70%, 70% til 80% eller 80% til 99,9%.

3. Fremgangsmåte for å stimulere vektøkning hos fisk ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte alginat er avledet fra Lessonia- tang , Durvillea- tang eller Laminaria- tang.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte alginat er avledet fra Durvillea- tang.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte alginat er avledet fra bakterier eller Dt/n/7//ea-vannekstrakt.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte materiale er en veterinærmedisinsk fast doseform eller flytende preparat.

7. Fremgangsmåte for å stimulere vektøkning hos fisk ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter oral administrering til nevnte fisk av et for som omfatter inntil 0,06% av et alginat som har et M-innhold på minst 80% og en akseptabel bærer, hvor nevnte alginat er fremstilt ved blanding og svelling av Durvillea- tang i vann, under opprettholdelse av pH høyere enn ca. 2,3 ved en temperatur høyere enn 20 °C i minst 30 minutter, isolering av en solubilisert fraksjon fra blandingen og gjenvinning av nevnte alginat som har et M-innhold på minst 80% fra den solubiliserte fraksjonen ved utfelling med syre, salt eller alkohol.

8. Fremgangsmåte for å stimulere vektøkning hos fisk ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter administrering av et f6r som omfatter inntil 0,06% av et alginat som har et M-innhold på minst 40%, med det forbehold at nevnte alginat enten er fremstilt syntetisk eller isolert fra tang eller en bakteriell kilde.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en akseptabel bærer.