CN1539019A - 制造1,4-二羟基-2萘甲酸的方法 - Google Patents

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Abstract

通过使用丙酸杆菌属细菌在胞内和胞外制造1，4－二羟基－2－萘甲酸并收集它以获得含高浓度1，4－二羟基－2萘甲酸的组合物。所述组合物有助于改进肠道菌群、缓解与摄入牛奶相关的腹部不适并防止代谢性骨疾病。

Description

制造1，4-二羟基-2萘甲酸的方法
技术领域
本发明涉及1，4-二羟基-2-萘甲酸(或1，4-二羟基-2-萘羧酸)(下文中也简称为“DHNA”)的工业制造方法；含该化合物的药物；含该化合物的食物和饮料并因而有助于改进肠内菌群、缓解乳糖不耐性引起的腹部不适、防止或治疗代谢性骨疾病。
背景领域
对母乳喂养婴儿和牛乳喂养婴儿中发现的肠内菌群的对比研究表明双歧杆菌有助于改善人体健康。如所证实的，体内双歧杆菌的量由于胃肠道疾病或类似疾病、或老化而显著减少，促进肠内双歧杆菌增殖对防止癌发生、肠腐败、传染病有效。因此，认为肠内双歧杆菌的选择性增殖对维持健康和防止及治疗多种疾病包括生活方式-相关疾病非常重要。
通常，一些能促进有益双歧杆菌增殖的物质-这种物质称为“双歧因子”-被研究和报导。这些物质的例子包括母奶中发现的N-乙酰氨基葡萄糖(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，90，219(1995))；肽-相关物质(Am.J.Clin.Nutr.，32，1428(1974)和Agric.Biol.Chem.，48，2159(1984))；胡萝卜提取物(日本生物科学、生物技术和农业化学杂质(Journal of Japan Sciety for Bioscience，Biotechnology，and Agrochemistry)，55，499(1981)和Chem.Pharm.Bull.，(东京)14，1191(1966))；糖-相关物质(Proceedings of Tohoku Fukushi University，10，313(1986))。
然而，制备任何这些能促进双歧杆菌增殖的物质需要复杂的方法，这种物质在仅选择性增殖双歧杆菌上的效果需要改进。
考虑到前述内容，本发明者对能选择性促进双歧杆菌增殖的化合物进行了广泛的研究，结果发现某些种类的萘醌衍生物和萘衍生物在促进不同双歧杆菌增殖上表现出强活性(如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(B.breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、两杈乳杆菌(B.bifidum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、动物双歧杆菌(B.animalis)和假长双歧杆菌假长亚种(B.pseudolongum)。同样，除了这些已知化合物，本发明者描述了一种高活性的双歧杆菌增殖促进物质且证实此物质是2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌，它是常规上未知(换句话说是新的)物质且通过属于丙酸杆菌属的细菌在胞内和胞外生成(日本专利申请公开(kokai)号8-98677)。此外，发明者发现2-氨基-3-羧基-1，4-萘醌可有效作为防止或治疗代谢性骨疾病如骨质疏松症的药物(WO 01/28547)。
同时，已知DHNA可用作工业物质如染料、颜料或感光物质且发展了多种DHNA的有机化学合成方法(如日本专利申请公开(kokai)号57-128655、59-186942和60-104037)。然而，这种常规合成方法需要有机溶剂中的高温、高压反应，或使用如非食用药剂作为催化剂等。此外，通过这种方法从产生的DHNA中完全去除用于生产它的溶剂或药剂有困难。因此，不认为通过这种常规生产方法产生的DHNA在食物和饮料或药物中是有用的。
发明的描述
本发明者对多种化合物作了进一步的研究，这些化合物具体对双歧杆菌表现出增殖促进效果，结果发现通过属于丙酸杆菌属的细菌在胞内和胞外生成大量1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)，含收集自所得培养物肉汤的1，4-二羟基-2-萘甲酸的组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐表现出缓解牛奶不耐性引起的腹部不适的效果，可用于防止或治疗代谢性骨疾病，这是因为此化合物促进造骨细胞分化和造骨细胞功能的表达、抑制造骨细胞形成。本发明在这些发现的基础上完成。1，4-二羟基-2-萘甲酸盐的例子包括药学或营养学上可接受盐类。这些盐的典型例子包括乙酸盐、苯磺酸盐、安息香酸盐、碳酸氢盐、乳酸盐和柠檬酸盐，它们不应理解为限制本发明。
因此，本发明提供了制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，包括培养能制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的微生物，从而使微生物在培养物肉汤中产生1，4-二羟基-2-萘甲酸，收集这样生成的1，4-二羟基-2-萘甲酸。
本发明还提供了含1，4-二羟基-2-萘甲酸的组合物，该组合物通过上述制造方法产生。
本发明还提供了用于缓解腹部不适的食物和饮料、缓解腹部不适的药剂、肠功能调节剂、防止或治疗代谢性骨疾病的食物和饮料、或防止或治疗代谢性骨疾病的药剂，药剂包括含1，4-二羟基-2-萘甲酸的组合物作为活性成分，组合物通过上述制造方法、或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐产生。
本发明还提供了含1，4-二羟基-2-萘甲酸的组合物的使用，组合物通过上述制造方法、或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐产生，用于生成缓解腹部不适的食物和饮料、缓解腹部不适的药剂、肠功能调节剂、防止或治疗代谢性骨疾病的食物和饮料、或防止或治疗代谢性骨疾病的药剂。
本发明还提供了治疗腹部不适的方法、调节肠功能的方法、或治疗代谢性骨疾病的方法，该方法包括施用有效剂量的组合物给需要的受试者，组合物含1，4-二羟基-2-萘甲酸，通过上述制造方法、或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐产生。
附图概述
图1显示摄入乳制饮料后六小时内受试者报告的腹部膨胀强度，乳制饮料结合本发明含高浓度DHNA的组合物。
图2显示摄入乳制饮料后六小时内受试者报告的腹部膨胀频率，乳制饮料结合本发明含高浓度DHNA的组合物。
图3显示摄入乳制饮料后六小时内受试者报告的腹部鼓胀(腹鸣)频率，乳制饮料结合本发明含高浓度DHNA的组合物。
图4显示DHNA促进造骨细胞钙化的效果。
图5显示DHNA抑制骨密度减少的效果。
完成发明的最佳模式
本发明使用能制造1，4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)的细菌。这种细菌所属的种属例子包括丙酸杆菌属(Propionibacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢乳杆菌属(Sporolacbacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。大部分这些微生物常规用于生成食物和饮料和药物，因此优选使用这种细菌生成含DHNA的食物和饮料或含DHNA的药物。丙酸菌的例子包括生成干酪的细菌，如费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、特氏丙酸杆菌(P.thoenii)、产丙酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)和詹氏丙酸杆菌(P.jensenii)；贪婪丙酸杆菌(P.avidum)；疮疱丙酸杆菌(P.acnes)；嗜淋病丙酸杆菌(P.lymphophilum)和颗粒丙酸杆菌(P.granulosam)。属于芽孢杆菌属的细菌例子包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。本发明中所用微生物优选是费氏丙酸杆菌。具体例子包括费氏丙酸杆菌IFO 12424(P.freudenreichii IFO 12424)和费氏丙酸杆菌ATCC 6207(P.freudenreichii ATCC 6207)。
为通过本发明方法生成DHNA，首先能产生DHNA的菌株在含营养物的培养基中有氧或厌氧培养，一般的微生物可生长在此培养基中。营养物可以是常规用于培养微生物的已知营养物。含营养物的培养基具体优选含脱脂奶粉的培养基；含胰胨、植胨、酵母提取物和葡萄糖的培养基；或培养基主要含乳糖酶-处理的乳清矿物质、乳清粉、经蛋白酶处理的的乳清粉、乳清蛋白质浓缩物或处理浓缩物获得的产物。在本发明中，最优选的是经蛋白酶处理的的脱脂奶粉用作培养基中的蛋白质来源。在经蛋白酶处理的的乳清粉用于培养基的情况中，当至少一种酵母提取物和乳糖在培养方法中用作添加剂时，所得培养物肉汤中产生的DHNA量可能增加。在培养方法中，葡萄糖或乳糖酶-处理的乳糖可取代乳糖用作添加剂。然而，当经蛋白酶处理的的脱脂奶粉用作培养基的主要原料，最优选的是乳糖用作培养基中的糖。其次描述的是在经蛋白酶处理的的脱脂奶粉用作培养基原料的情况中的一种示范培养基制备方法。
脱脂奶粉溶解于水中使脱脂奶粉浓度为10％(w/v)，接着用蛋白酶降解蛋白质。待使用的蛋白酶量是全部脱脂奶粉的0.25％(w/v)。蛋白质降解在47℃和pH6.8进行6小时，在蛋白质降解中碳酸钾水溶液用于调节pH。脱脂奶粉浓度(最终培养基浓度)调节到10％(w/v)，最后加入酵母提取物使酵母提取物量为全部脱脂奶粉的1-10％(w/v)，优选为3-7％(w/v)。
生成DHNA的菌株可通过任何已知的多种有氧和厌氧培养方法来培养，但从大规模生成DHNA看，用液体培养基的有氧和厌氧培养方法最优选。培养在下列条件下进行：培养温度：约20到约40℃，培养基pH：中性到微酸(优选5.5到7.5)。在液体培养的情况中，培养开始后约1到约5天，DHNA积聚在培养基和菌株中。通过在培养方法中加入乳糖来增加产生的DHNA量。这样生成的DHNA可在培养完成后立即从所得培养物肉汤中收集。然而，优选的是培养物肉汤被冷却(在3-20℃，约10℃最优选)并保存(优选约2-4周)，从而使DHNA进一步在培养物肉汤中积聚。
接着会描述DHNA收集方法。优选的是，上面获得的培养物肉汤进行吸附层析。可使用的吸附剂例子包括用于反相层析的吸附剂，如活性碳和合成吸附剂(如Diaion HP-20，Mitsubishi化学公司的产品)。首先，柱用吸附剂填充，柱用0.5％(w/v)抗坏血酸钠水溶液洗涤。随后，上面获得的培养物肉汤加入柱(通过柱的流体表示为“通过(pass)”)，用0.5％(w/v)抗坏血酸钠水溶液将水溶性部分从培养物肉汤中去除。其后，所得培养物肉汤用含0.5％(w/v)抗坏血酸钠的乙醇洗脱，浓缩乙醇洗脱的部分，从而产生含高浓度DHNA的组合物。当含DHNA的组合物被进一步纯化时，可生成纯DHAN或其盐。取代乙醇的甲醇可用于从柱中洗脱DHNA。
DHNA盐的例子包括药学或营养学上可接受盐类。这些盐的典型例子包括乙酸盐、苯磺酸盐、安息香酸盐、碳酸氢盐、乳酸盐和柠檬酸盐，它们不应理解为限制本发明。
DHNA包含于DHNA-生成细菌(胞内和/或胞外)的培养物肉汤中。因此，培养物肉汤本身可用例如旋转蒸发器而不是吸附层析浓缩，从而产生含高浓度DHNA的组合物。优选的是，细菌细胞通过一般使用的离心技术从培养物肉汤中分离，浓缩所得上清。这样获得的组合物外形根据其使用而变化；例如，组合物可以液体形式使用或可形成粉状产物。
术语“牛奶不耐性”指腹部不适的情况如摄入牛奶后发生的腹部疼痛、腹鸣和腹泻。大部分这种腹部不适与乳糖不耐性相关，这是由于摄入牛奶等中所含乳糖引起。在许多情况中，乳糖不耐性由于小肠中乳糖酶活性缺乏或降低引起。本发明的组合物或DHNA或其盐(下文中也简称为“组合物等”)表现出摄入牛奶后缓解腹部不适的效果。此外，组合物等表现出促进造骨细胞分化和表达造骨细胞功能的效果以及抑制造骨细胞形成的效果，因此可用于防止或治疗代谢性骨疾病如骨质疏松症。组合物等可采取食物和饮料或药物的形式。例如，通过直接施用药物形式的组合物等，通过直接摄取有具体用途食物(如具体健康用途的食物)或营养物形式的组合物等，或通过摄取多种含组合物等的食物(如牛奶、发酵牛奶和酸奶)，可改进肠内菌群，可缓解例如摄入牛奶产生的腹部不适，可防止或治疗代谢性骨疾病。
在本发明组合物或DHNA或其盐用作药物的情况中，组合物等的外形可根据施用方式来适当选择。外形的例子包括口服形式如片剂、胶囊、颗粒、粉末和糖浆。这种药物产品可通过常规方法制备，使用一般用于药物制备技术领域的已知佐剂作为主要试剂，如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调味剂、除臭剂、溶解促进剂、悬浮剂或涂层剂。
当用于人时，优选的是这种药物产品口头施用。口头施用给待治疗病人的有效剂量DHNA(即活性成分)根据病人的年龄和病理情况变化，但一般人的日服DHNA剂量是每千克体重0.03到3μg，优选是0.1到1μg。
当口头施用时，本发明的组合物或DHNA或其盐达到它预期的目的；即改进肠内菌群、缓解摄入牛奶引起的腹部不适、防止或治疗代谢性骨疾病。因此，组合物等可以食物和饮料形式使用。这种含DHNA的食物和饮料可通过任何多种技术制备；例如含高浓度DHNA的本发明组合物或DHNA或其盐加入到任何多种佐剂或食物和饮料，从而制备不同的食物和饮料(如饮料产品和片剂)；或组合物等直接加入食物和饮料。这样制备的食物和饮料使DHNA能长时间摄取，因此可以一般食物和饮料、具体用途的食物(如具体健康用途的食物)或营养物形式商业提供。
实施例
接着关于试验例和实施例更详细地描述本发明，但本发明不限于这些实施例。
试验例1筛选DHNA的细菌
培养条件
下述各试验细菌接种到含脱脂奶粉的培养基中(描述于下面的实施例1)，细菌用GasPak方法在37℃厌氧培养18到72小时。
(A)费氏丙酸杆菌IFO 12424(培养时间：72小时)
(B)产丙酸丙酸杆菌IFO 12425(72小时)
(C)詹氏丙酸杆菌IFO 12427(72小时)
(D)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)ATCC 10697(24小时)
(E)肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)JCM 9700(24小时)
(F)嗜酸性乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4357(18小时)
(G)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)IFO 12006(18小时)
(H)鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)JCM 1136(18小时)
(I)干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469(18小时)
(J)长双歧杆菌ATCC 15707(18小时)
(K)两杈乳杆菌ATCC 11146(18小时)
(L)青春双歧杆菌ATCC 15703(18小时)
(M)短双歧杆菌ATCC 15700(18小时)
DHNA分析条件(HPLC分析)
柱：C18，填充颗粒大小：3μm，内径：4.6mm，长度：150mm(C18：Cadenza CD-C18，Imtakt公司产品)
洗脱液∶乙腈∶甲醇∶水∶乙酸＝10∶20∶200∶0.1(pH7.0(用5％氨水调节))
流速：1.5mL/分钟
进样量：20μl
检测器：UV 254nm
HPLC样品制备方法
抗坏血酸钠(0.1％(w/v))加入上面获得的培养物肉汤(10ml)，所得混合物的pH调节到7.0，水加入混合物使所得混合物的总体积为20ml。其后，混合物的等分样品(3ml)与甲醇混合(3ml)，所得混合物以3,000rpm离心10分钟。这样获得的上清用0.45μm过滤器过滤。
DHNA的定量
上面制备的HPLC样品中所含的DHNA量在下列前面得到的可商业获得DHNA标准的数据基础上计算(Wako Pure Chemical Industries有限公司产品)：保留时间＝约13分钟，HPLC峰面积和DHNA浓度间的关系(校准曲线)。
结果，发现丙酸杆菌(Propionibacteria)(A)到(C)的各培养物肉汤包含3.0μg/ml或更多量的DHNA。尽管在乳球菌属(D)或明串珠菌属(E)的培养物肉汤中发现痕量DHNA，乳杆菌(Lactobacilli)(F)到(I)和双歧杆菌(Bifidobacteria)(J)到(M)的各培养物肉汤中没有检测到DHNA。即发现丙酸杆菌属是本发明中所用的理想DHNA-生成细菌(表1)。同时，枯草芽孢杆菌用与上述类似的培养基有氧培养。结果，发现这样获得的培养物肉汤包含DHNA。
                    表1
    试验细菌   培养时间(小时)   DHNA(μg/ml)
    (A)     72     3.0
    (B)     3.2
    (C)     3.6
    (D)     24     0.1
    (E)     24     0.2
    (F) 18     N.D.
    (G)     N.D.
    (H)     N.D.
    (I)     N.D.
    (J) 18     N.D.
(K) N.D.
    (L)     N.D.
    (M)     N.D.
N.D.：没有检测到
实施例1含DHNA的组合物的制造方法
啤酒酵母提取物(Asahi酿酒有限公司产品)(0.1％(w/v))加入脱脂乳培养基(含10％重量脱脂奶粉的溶液)，该培养基的制备是通过在水中溶解脱脂奶粉使脱脂奶粉浓度为10％(w/v)。所得培养基以分开的方式(50L)置于20个锥形烧瓶中(体积：每个5L)，各烧瓶中的培养基用高压灭菌器在121℃灭菌7分钟。费氏丙酸杆菌IFO12424菌株的活化培养物肉汤(60ml)接种到各所得培养基中，厌氧培养在氮保护气中37℃进行72小时，从而产生含3μg/ml 1，4-二羟基-2-萘甲酸的组合物(50L)。制备上述活化培养物肉汤是通过接种费氏丙酸杆菌(2％(w/v))到TPYG培养基(胰胨(BBL)(8g)、植胨(BBL)(3g)、啤酒酵母提取物(5g)、L-半胱氨酸氢氯化物(0.5g)、葡萄糖(20g)、K2HPO4(2g)、KH2PO4(3g)、MgCl2·6H2O(0.5g)、FeSO4·7H2O(10mg)、H2O(1,000ml)，pH6.5)，接着用GasPak方法在37℃厌氧培养72小时。
实施例2含高浓度DHNA的组合物的制造方法
脱脂奶粉溶解于水中使脱脂奶粉浓度为10到20％(w/w)，蛋白酶[AmanoA](Amano药物有限公司产品)加入所得溶液使蛋白酶量为全部脱脂奶粉的0.25％(w/w)，接着47℃酶降解所得混合物6小时。在酶降解方法中，混合物的pH用碳酸钾水溶液维持在6.8。所得反应混合物在85℃加热5分钟以灭活酶，随后水加入反应混合物使脱脂奶粉浓度为10％(w/w)。啤酒酵母提取物(Asahi酿酒有限公司产品)加入反应混合物后使提取物的量为全部脱脂奶粉的5％(w/w)，混合物(1.5Kg)置于发酵器中(体积：2L)，随后用高压灭菌器在121℃灭菌7分钟。氮气进入发酵器使气体在所得培养基表面上流动，培养基以150rpm搅拌，培养基温度调节到33℃。培养基温度稳定到33℃后，将费氏丙酸杆菌ET-3菌株的冷冻浓缩起子(starter)(于2001年8月9日保藏在国际专利生物保藏所，先进工业科学技术国立学院(International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)(中心6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan(邮编：305-8566))，保藏号为FERM BP-8115)接种到培养基中，开始厌氧培养。乳糖(2％(w/w))和乳糖(1.3％(w/w))分别在此培养开始72小时和96小时后加入培养物肉汤。此厌氧培养在氮保护气中33℃进行120小时，培养物肉汤的pH用40％(w/w)碳酸钾水溶液维持在6.45，结果DHNA(30μg/ml)在培养物肉汤中产生。培养120小时后，发现培养物肉汤(1.5kg)中消耗的碱量为131g。抗坏血酸钠加入所得培养物肉汤使抗坏血酸钠的量为全部培养物肉汤的0.5％(w/w)，所得混合物的pH用碳酸钾水溶液调节到8.0，接着冷却到10℃。所得培养物肉汤在10℃保存2周，结果培养物肉汤的DHNA含量增加到40μg/ml。上面使用的冷冻浓缩起子通过下列方法制备：费氏丙酸杆菌ET-3菌株的活化培养物肉汤(通过在培养基中33℃厌氧培养菌株48小时来制备，培养基主要含前述经蛋白酶处理的的脱脂奶粉)(2％(w/w))接种到主要含前述经蛋白酶处理的的脱脂奶粉的培养基中，接着33℃培养72小时；培养完成后，收集培养菌株并随后进行离心，从而使细菌细胞浓度增加约20倍；适当量的所得产物置于灭菌容器，-80℃冷冻或更低，随后-80℃保存。
实施例3用柱层析浓缩实施例1所得组合物
柱用Diaion HP-20填充(4L)，用0.5％(w/v)抗坏血酸钠水溶液洗。随后，实施例1中获得的组合物(40Kg)加入柱。然后，用0.5％(w/v)抗坏血酸钠水溶液(8L)将水溶性部分从组合物中去除。其后，含0.5％(w/v)抗坏血酸钠的乙醇洗脱液(12L)加入柱，从而洗脱DHNA。乙醇洗脱的部分用蒸发器浓缩，从而产生含DHNA(115mg)的本发明组合物。
实施例4用旋转蒸发器浓缩实施例1所得组合物
抗坏血酸钠(0.5％(w/v))加入实施例1中获得的组合物(5Kg)，所得混合物用旋转蒸发器浓缩5倍，从而产生含DHNA(15mg)的本发明组合物(1Kg)。
由于实施例1到3的各组合物用产生干酪的丙酸细菌生成，实施例1到3中获得的发明组合物可用于食物和饮料而没有进行任何处理。
实施例5DHNA的纯化
实施例2中获得的浓缩物(培养物肉汤)溶解于pH调节到4.5的0.5％(w/v)抗坏血酸钠水溶液(1L)，所得溶液用乙酸乙酯(1L)提取三次。这样获得的乙酸乙酯层混合在一起，随后用无水硫酸钠(200g)脱水，接着在低压浓缩。所得浓缩物溶解于甲醇(80mL)，所得溶液的等分样品(4mL)用C18柱纯化。抗坏血酸钠加入所得DHNA洗脱部分(保留时间：21到31分钟)使抗坏血酸钠含量为25％(w/v)，随后所得混合物在低压浓缩。所得浓缩物(800mL)用乙酸乙酯(300mL)提取两次，随后用无水硫酸钠(50g)脱水，接着在低压浓缩。通过500-MHz 1H-NMR光谱的结构分析鉴定最终的纯化产物为DHNA。通过上面的方法，DHNA(115mg)从培养物肉汤(40L)生成。
柱：Capcell Pak C18 SG120，φ50×500mm，批号930210(Shiseido有限公司产品)
流动相：乙腈∶甲醇∶水∶乙酸＝20∶40∶200∶0.1(pH7.0(用5％氨水调节))
温度：室温
流速：100mL/分钟
进样量：4mL
检测器：UV 254nm
<最终纯化产物的NMR数据>
1H-NMR(500MHz，MeOH-d4)：δ8.39(1H，d，J＝8.3Hz)，8.23(1H，d，J＝8.3Hz)，7.69(1H，dd，J＝8.3，6.9Hz)，7.60(1H，dd，J＝8.3，6.9Hz)，7.23(1H，s)
实施例6急性毒性试验
实施例2中所述含DHNA的组合物用五只小鼠进行急性毒性试验(5周龄：商业上可获得的ICR小鼠，适应7天)。组合物连续5天施用给各小鼠(最大的日服剂量：78.3mg/kg(DHNA：0.9(≈115×(78.3/(10×1000)))mg/kg))，观察这样施用的小鼠14天。结果没有小鼠死去，没有小鼠被证实表现出体重、行为和解剖器官上的异常。
实施例7含有本发明含DHNA的组合物的食物的制备方法(片剂制备)
实施例1中获得的组合物(10Kg)在50℃冻干24小时，从而产生冻干的粉末(1Kg)。随后，粉末(40％(w/w))结合到片剂基本物质中，物质含葡萄糖(80％(w/w))、干玉米淀粉(10％(w/w))、palatinit粉末(7％(w/w))和柠檬酸(3％(w/w))，所得物质为各重0.5g的片剂。
实施例8含有本发明含DHNA的组合物的食物的制备方法(乳制饮料制备1)
抗坏血酸钠(15g)和实施例2中获得的DHNA-包含组合物(125mg)加入原料乳，匀浆化所得混合物并随后在130℃杀菌2秒钟。每100ml所得产物装入容器。
实施例9结合本发明DHNA-包含组合物的食物的制备方法(乳制饮料制备2)
费氏丙酸杆菌ET-3菌株(FERM P-18454)的活化培养物肉汤(60ml)接种到主要含经蛋白酶处理的的乳清粉的培养基中(培养基通过下列方法制备：啤酒酵母提取物(Asahi酿酒有限公司产品)(0.1％(w/v))加入用蛋白酶(Amano A，Amano药物有限公司产品)2小时蛋白降解(50℃，pH7.0)含10％重量乳清粉的溶液所得的溶液，所得混合物(50L)置于发酵缸中并随后在121℃灭菌7分钟)，接着在35℃ pH6.0厌氧培养90小时，抗坏血酸钠(0.5％(w/v))加入所得培养物肉汤，从而产生本发明的组合物。这样获得的组合物(177.5ml)加入原料乳(9822.5ml)，匀浆化所得混合物并随后在130℃杀菌2秒钟。每100ml的所得产物装入容器(DHNA含量：11μg/100ml)。
上述活化的培养物肉汤用与实施例1中所述相同的方法制备，除了培养温度变为35℃。
实施例10本发明组合物对摄入乳制饮料1引起的腹部不适的效果
实施例8中制备的乳制饮料用作测试饮料，用非发酵培养基以类似于实施例8的方法制备乳制饮料，此乳制饮料用作对照饮料。测试的受试者选择在摄入牛奶后测量呼吸氢浓度时表现出小肠中低β-半乳糖苷酶活性的人，因而被认为患乳糖不耐性。具体的是，受试者是15人(7名男性和8名女性，平均年龄：28.07±3.41)，他们用对照饮料(400ml)进行乳糖负荷测试，饮料摄取后6小时内表现出呼吸氢浓度增加约20ppm或更多。
指示受试者从测试前一天22:00到测试当天17:00避免摄取任何食物或饮料(除了水)。在测试当天10:00，对照饮料(400ml)口头施用给各受试者。到当天17:00，腹部情况的调查表由受试者填写(每30分钟)，呼吸从受试者中取样(每小时)。一周后，测试饮料以类似于对照饮料施用的方式施用给各受试者。前面没有通知受试者这些饮料的种类。
各受试者的呼吸用有旋塞的Tedlar袋取样(体积：1L)(GL Sciences公司)，用气相色谱仪(GC-8A，Shimadzu公司)在下列分析条件下进行氢气分析：柱：分子筛5A(3mm×2m)，烤箱温度：40℃，运载气体：氩，探测器：TCD(导热性探测器)。
腹部情况的调查表分发给各受试者，受试者每30分钟填写。腹部膨胀根据下列标准用数字分级：
4：与摄取后随即的状态相比显著的腹部肠胃气胀
3：与摄取后随即的状态相比适度的腹部肠胃气胀
2：与摄取后随即的状态相比轻微的腹部肠胃气胀
1：与摄取后随即的状态相比没有可察觉的变化。积累摄取后以30分钟间隔(从30分钟到6小时)获得的这些数字分级。任何其它腹部情况包括腹泻、腹部疼痛和腹部鼓胀也描述于调查表中。
摄取乳制饮料后随即到摄取后6小时关于腹部情况的评估结果如下。在摄取对照饮料的情况中，发现腹部膨胀值的累积值为17.93±4.83。相反，在摄取试验饮料的情况中，发现累积值为15.83±3.65，显著低于对照饮料情况中获得的值(Wilcoxon试验，p＜0.05)(图1)。在摄取对照饮料的情况中，发现摄取后6小时内受试者报告的腹部膨胀频率为3.47±3.11。相反，在摄取试验饮料的情况中，发现腹部膨胀频率为2.47±2.90，低于摄取对照饮料情况中获得的腹部膨胀频率(p＝0.108)(图2)。在摄取对照饮料的情况中，发现摄取后6小时内受试者报告的腹部鼓胀(腹鸣)频率为2.87±2.75。相反，在摄取试验饮料的情况中，发现腹部鼓胀频率为1.47±2.10，显著低于摄取对照饮料情况中获得的腹部鼓胀频率(p＜0.05)(图3)。同时，在摄取对照饮料的情况中，两个受试者抱怨腹泻，但摄取试验饮料的情况中，没有受试者抱怨腹泻。在摄取对照饮料的情况中，未患腹部不适的受试者数量为两个，但在摄取试验饮料的情况中，这类受试者的数量增加到六个(表2)。
在摄取对照饮料的情况中，发现呼吸氢浓度的最大增加平均值是42.9±13.7ppm。相反，在摄取试验饮料的情况中，发现呼吸氢浓度的最大增加平均值是34.7±17.6ppm，低于摄取对照饮料情况中获得的平均值(Wilcoxon试验，p＜0.051)(表2)。
表2
摄取结合DHNA-包含组合物的乳制饮料对腹部不适和呼吸氢浓度的效果
    受试者             摄取对照饮料           摄取试验饮料
号  年龄  性别 呼吸氢浓度* 腹部情况§ 呼吸氢浓度* 腹部情况§
1    27    女      30.2        B，C         21.8          B
2    25    女      50.0        N            33.9          N
3    28    女      19.2        B，C         6.7           C
4    24    女      32.1        B，C         13.6          B
5    26    男      N.T.        C            N.T.          C
6    32    男      N.T.        C            N.T.          N
7    28    男      N.T.        C            N.T.          C
8    27    女      54.8        A，B，C      46.6          B，C
9    27    男      51.0        C            44.2          N
10   32    男      41.2        N            21.5          N
11   25    女      42.2        B            38.1          B，C
12   23    女      30.8        B            59.1          N
13   34    女      N.T.        A，C         N.T.          N
14   33    男      63.2        C            60.0          C
15   30    男      57.7        C            35.7          C
平均值±标准偏差     42.9±13.7                 34.7±17.6
*：呼吸氢浓度(ppm)的最大增加
§：A：腹泻，B：腹部疼痛，C：腹部鼓胀，N：没有直观症状
N.T.：未测试
实施例11本发明组合物对摄入乳制饮料2引起的腹部不适的效果
培养费氏丙酸杆菌IFO 12424菌株以类似于实施例9的方式进行。这样获得的培养物肉汤(5Kg)用蒸发器浓缩5倍，从而产生含DHNA(45mg)的组合物(1Kg)。乳制饮料制备自这样获得的组合物(35.5g)、原料乳(10kg)和抗坏血酸钠(15g)，所得乳制饮料以类似于实施例10的方式测试。在摄取含本发明组合物的乳制饮料的情况中，得到了与实施例10所获非常相似的效果，发现乳制饮料摄取引起的腹部不适被缓解。
实施例12DHNA对促进造骨细胞钙化的效果
使用收集自20岁男性长骨膜的人造骨细胞(SaM-1)，骨膜在骨折手术中获得。SaM-1细胞表现出造骨细胞的所有特征(Koshihara，Y.等：In Vitro Cell.Dev.Biol.，25：37-43，1989)。已知SaM-1在存在2mM α-甘油磷酸时以1α、25(OH)2D3浓度-依赖方式促进钙化(Koshihara，Y.等：Biochem.Biophys.Res.commun.，145：651-657，1987)。
上面获得的18PDL的SaM-1细胞(群体两倍水平)被接种到12孔板，并培养细胞直到细胞达到铺满状态。随后，α-甘油磷酸加入所得培养物肉汤使α-甘油磷酸含量为2mM，它是一种钙化促进剂。DHNA(10-7M到10-5M)加入培养物肉汤，接着培养32天。对于对照，DMSO(一种溶剂)加入培养物肉汤使DMSO含量为0.1％。试验培养物肉汤和对照培养物肉汤的培养基每第二天分别与含DHNA和含DMSO的培养基交换。钙化的程度由钙的量表示，钙组成羟磷灰石。
胞外基质的钙含量用试剂盒(钙C Test Wako)在o-甲酚酞氨羧络合剂方法(OCPC方法)基础上定量(Gitleman，H.J.：Anal.Biochem.，18：520-531，1967)。
完成培养后，所得细胞用Hank溶液洗。冷的5％高氯酸(0.5ml/孔)加入细胞，接着在4℃振荡提取15分钟。所得提取物(25μl)与缓冲液混合(2.5mL)，随后染色溶液(含OCPC(0.4mg/mL)和8-羟基喹啉)(250μl)加入所得混合物，然后搅拌5分钟。其后，所得反应混合物用吸收仪(570nm)(图4)测量。如图4所示，DHNA以浓度-依赖方式促进钙化。
实施例13DHNA对FK-506诱导的骨质疏松症动物模型的效果
如已知的，将认为是免疫抑制剂的FK-506施用给动物诱导骨质疏松症-类似情况(J.Hard Tissue Biology，103-107，10(2)，2001)。如所表明的，通过RNAKL(造骨细胞分化因子)高表达形成造骨细胞，RNAKL表达在造骨细胞上，且骨熔蚀超过骨形成，导致这种骨质疏松症-类似情况。FK-506(1mg/kg)连续10周腹膜内施用给ICR雄性小鼠(8周大)。在10周FK-506施用中，饲料(CRF-1，Oriental Yeast有限公司产品)任意地为小鼠摄取，悬浮于1％DMSO(二甲基亚砜)水溶液的DHNA(75μg/kg)每天口头施用给各小鼠。结果，发现DHNA施用组中的小鼠骨密度显著高于对照组的小鼠(FK 506(+))，发现FK 506施用引起的骨密度降低通过DHNA抑制。
工业应用性
通过本发明DHNA的工业生产方法产生含DHNA的组合物，该组合物获得自微生物，因此它表现出极好的安全性。当口头施用时，含高浓度DHNA的组合物改进肠内菌群。此外，组合物可用于缓解牛奶摄取引起的腹部不适、防止或治疗代谢性骨疾病。由于它的无毒性，组合物可长时间摄取。

Claims (22)

1.制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，所述方法包括培养能产生1，4-二羟基-2-萘甲酸的微生物，从而使微生物在培养物肉汤中制造1，4-二羟基-2-萘甲酸并收集这样产生的1，4-二羟基-2-萘甲酸。
2.如权利要求1所述的制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，培养用主要含经蛋白酶处理的脱脂奶粉的培养基或主要含经蛋白酶处理的乳清粉的培养基来进行。
3.如权利要求1或2所述的制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，酵母提取物和乳糖中至少一种被用作培养过程的添加剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，完成培养后培养物肉汤被冷却至3-20℃并保存。
5.如权利要求1所述的制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，将含有1，4-二羟基-2-萘甲酸的培养物肉汤进行吸附层系，接着吸附和洗脱1，4-二羟基-2-萘甲酸以收集1，4-二羟基-2-萘甲酸。
6.如权利要求5所述的制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，浓缩这样洗脱的溶液。
7.如权利要求1-6中任一项所述的制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，所述能制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的的微生物选自丙酸杆菌属、肠杆菌属、芽孢乳杆菌属和芽孢杆菌属。
8.如权利要求7所述的制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于，能制造1，4-二羟基-2-萘甲酸的的微生物是费氏丙酸杆菌。
9.一种含1，4-二羟基-2-萘甲酸的组合物，其特征在于，所述组合物通过权利要求1-8中任一项所述的制造方法来产生。
10.用于缓解腹部不适的食物和饮料，其特征在于，所述食物和饮料包括作为活性成分的权利要求9所述的组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐。
11.一种缓解腹部不适的药剂，其特征在于，所述药剂包括权利要求9所述的组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐作为活性成分。
12.一种肠功能调节剂，其特征在于，所述药剂包括权利要求9所述的组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐作为活性成分。
13.用于防止或治疗代谢性骨疾病的食物和饮料，其特征在于，所述食物和饮料包括权利要求9所述的组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐作为活性成分。
14.一种防止或治疗代谢性骨疾病的药剂，其特征在于，所述药剂包括权利要求9所述的组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐作为活性成分。
15.如权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐在制造用于缓解腹部不适的食物和饮料中的应用。
16.如权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐在制造用于缓解腹部不适的药物中的应用。
17.如权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐在制造肠功能调节剂中的应用。
18.如权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐在制造用于防止或治疗代谢性骨疾病的食物和饮料中的应用。
19.如权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐在制造用于防止或治疗代谢性骨疾病的药剂中的应用。
20.一种治疗腹部不适的方法，其特征在于，所述方法包括对由此需要的受试者施用有效剂量的权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐。
21.一种调节肠功能的方法，其特征在于，所述方法包括对由此需要的受试者施用有效剂量的权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐。
22.一种治疗代谢性骨疾病的方法，其特征在于，所述方法包括对由此需要的受试者施用有效剂量的权利要求9所述组合物或1，4-二羟基-2-萘甲酸或其盐。
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