CN1278300A - 多价抗原结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
一种多价抗原结合蛋白,包括包含连续地,二个或更多单区结合单元的单个多肽链,其中单区结合单元优选衍生自天然缺乏轻链的免疫球蛋白的重链可变区。公开了其制备及应用方法,尤其公开了用于诊断,免疫测定和纯化的方法。
Description
发明领域
本发明涉及多价和多特异性抗原结合蛋白,其制备方法及其用途。具体地,本发明涉及包含包括两或多个单区结合单元的多肽,其中单区结合单元优选来自天然缺乏轻链的免疫球蛋白的重链可变区。
背景技术
抗体是属于对抗原反应的免疫系统产生的免疫球蛋白群的蛋白分子。多数抗体分子的结构以包括四条肽,两条相同重链和两条相同轻链的单元为基础,此单元通过二硫键共价相连。每条链在不连续区中折叠。重链和轻链的C-末端区序列保守,称为恒定区。重链和轻链的N末端,也称为V区,序列可变且确定了抗体的特异性。在轻链和重链的可变区(各为VL和VH)中负责抗体结合活性的区已知为高变或互补性决定区(CDR)。天然的抗体一般具有至少两个由重链和轻链可变区联合确定的相同抗原结合位点。单独的重链或轻链区具有与文献中描述的抗原结合的能力(Ward等,自然341(1989),544-546),尽管一般大多数天然发生的抗体需要VH和VL形成复杂的抗原结合位点并保持完整的免疫反应性。
稍晚,描述了如上述能够显示四链免疫球蛋白功能特性,但包括两条重多肽链而缺少轻多肽链的免疫球蛋白(见欧洲专利申请EP-A-0584421,Casterman等,1994)。在专利申请WO94/25591(Unilever)中描述了制备这些抗体或其片段的方法,包括用可表达的编码抗体或片段的DNA序列转化霉菌或酵母。
EP-A-0584421中描述的可从骆驼(Camelids)的血清分离的免疫球蛋白,不依赖重链和轻链可变区的线合形成抗原结合位点,而仅由重多肽链天然形成完整抗原结合位点。这些免疫球蛋白,即下文中所指的“重链免疫球蛋白”,与普通(四链)免疫球蛋白降解或直接克隆获得的重链有很大不同,普通重链仅构成部分抗原结合位点,它需要轻链伴侣(partner)以结合抗原从而形成了完整的抗原结合位点。从而形成完整的抗原结合位点。
如EP-A-0584421中所述,从骆驼中分离的重链免疫球蛋白VH区(形成完整抗原结合位点且构成单区结合位点)在许多方面与从常规四链免疫球蛋白衍生的VH区相区别,特别是它们无需特殊特性促进与相应轻链区的相互作用。所以,尽管在普通(四链)免疫球蛋白中参与VH/VL相互作用的位置的氨基酸残基高度保守并一般为非极性亮氨酸,在骆驼衍生的VH区,它被带电的氨基酸取代,一般为精氨酸。带电的氨基酸在此位点的存在被认为对提高骆驼衍生的VH的溶解度有贡献。进一步提到的差异是EP-A-0584421的重链免疫球蛋白的CDRs的一种,CDR3,可能包含一个与可变区另一位的另外一个额外的半胱氨酸残基相连的额外半胱氨酸残基。在CDR3和可变区的保留区之间二硫键的建立在结合抗原中很重要,可能补偿了轻链的缺失。
在寻找多价和多特异性的抗原结合蛋白过程中,注意力主要放在仍能有抗原结合活性的完整抗体的片称或部分的应用上。与完整抗体相比较,较小的抗体片段在用于治疗时更有利,例如,它可能较少免疫原性且更能透过组织。
普通(四-链)抗体的结合片段包括Fab(与重链的VH和VH1区联合的轻链),Fv(由彼此联合的重链和轻链的v区组成)和ScFv(包括与VL区通过可弯曲的肽连接体相连的VH区)片段。这些片段仅有一个抗原结合位点,而完整抗体包括二或更多位点,在解决此问题的尝试中,提出具有二或更多结合位点的重组片段。
大体上,文献中描述的多价和/或多特异性结构包括二或更多多肽链,例如,专利申请WO94/09131(Scotgen Limited)和WO97/14719(Unilever)或基于‘双ScFv’靠近,其中多价发生在两个或更多单价ScFv分子连接在一起时,提供包括至少四个可变区的单链分子,如在WO93/11161(Enzon Inc)和WO94/13806(Dow Chemical co)中所述。在所有案例中,结合位点通过轻链和重链可变区联合形成。在WO93/11161中,提到包括抗体轻(或重)链的结合部分的单链蛋白,但它声明因为这种蛋白包括两个相同的可变区,此蛋白无需任何抗原结合能力。
参照上述说明,EP-A-0584421(Casterman)公开了缺少轻链的免疫球蛋白的重链的片段,包括相应于分离的VH区或通过绞合部二硫键连接的VH二聚体的片段。进一步公开,但未举例的有在每条重多肽链具不同特征的的抗体,它可通过线合两条重链免疫球蛋白或EP-A-0584421的免疫球蛋白的重链到常规四链免疫球蛋白的片段而制备。毫无疑问,多价和/或多特异性结构物可通过连接单独的VH区制备。事实上,当在结合位置缺乏由相应轻链的存在而固有的构像约束时,一般认为此种类型的结构中的结合区彼此阻碍,不适宜地影响结合活性有不利影响。
发明概述
首先,本发明提供多价抗原结合蛋白,包括包含二或更多连续连接的单区结合单元的单个多肽链。
另一方面,本发明提供编码本发明的多价抗原结合蛋白的核苷酸序列及包括该核苷酸序列的表达载体。本发明还进一步提供用包含该核苷酸序列的载体转化的宿主细胞以及通过在此宿主中表达核苷酸序列生产本发明的抗原结合蛋白的方法。
本发明还包括包含本发明的多价抗原结合蛋白的组合物。
进一步的,本发明还提供上述的多价抗原结合蛋白在诊断或治疗中的应用,或在其它方法中应用其抗体或片段,如在免疫测定或纯化方法中。还提供依照本发明的运用多价抗原结合蛋白的治疗方法。
在本发明的具体实施方案中,提供了所述多价抗原结合蛋白在失活(细菌)噬菌体中的应用。
通过本发明的方法,获得了有完整免疫球蛋白的特异性和结合亲合性但还具有较小体积的优点的抗原结合蛋白。更进一步的,因本发明的多价抗原结合蛋白包括具不同抗原特异性的可变区,可获得多特异性结合分子。另一优点是依照本发明的结构物可更便利地在适合工业应用的规模中经济及有效地大量生产。
本发明加上以下的描述以及附图,更容易被完全理解。为方便起见,本发明包括两个单结合单元的抗原结合蛋白在此称为‘双头(bihead)’。
附图简述
图1是骆驼科IgG类型的图解。
图2显示质粒pUR4638的PstI-BstEII插入片段的核苷酸序列,它编码来自美洲驼的抗RR6的抗体(以R7表示)的重链可变区。
图3显示质粒pUR4640的PstI-BstEII的插入片段的核苷酸序列,它编码来自美洲驼的抗RR6抗体(以R9表示)的重链可变区。
图4显示质粒pUR4601的PstI-BstEII的插入片段的核苷酸序列,它编码来自美洲驼的抗hCG抗体(以H14表示)的重链可变区。
图5显示质粒pUR4602的PstI-BstEII的插入片段的核苷酸序列,它编码另一来自美洲驼的抗hCG抗体(以HI-15表示)的重链可变区。
图6显示质粒pUR4603的PstI-BstEII的插入片段的核苷酸序列,它编码来自美洲驼的抗链球菌抗体(以S36表示)的重链可变区。
图7显示质粒pUR4642的PstI-BstEII的插入片段的核苷酸序列,它编码另一个来自美洲驼的抗链球菌抗体(以S120表示)的重链可变区。
图8显示质粒pUR4619的图谱。
图9显示质粒pUR4619中的核苷酸序列,该序列编码抗-hCG-抗-RR6双特异性的双头的抗原结合蛋白(以H14-R9表示),缺失头4个和最后3个氨基酸。
图10显示质粒pUR4620中的核苷酸序列,该序列编码抗-hCG-抗-RR6双特异性的双头的抗原结合蛋白(以HI15-R7表示),缺失头4个和最后3个氨基酸。
图11显示质粒pUR4621中的核苷酸序列,该序列编码抗-hCG-抗-RR6双特异性的双头的抗原结合蛋白(以HI15-R9表示),缺失头4个和最后3个氨基酸。
图12显示质粒pUR4622中的核苷酸序列,该序列编码同源二聚体的二价抗-RR6抗原结合蛋白(以R7-R7表示),缺失头4个和最后3个氨基酸。
图13显示质粒pUR4623中的核苷酸序列,该序列编码同源二聚体的二价抗-RR6抗原结合蛋白(以R7-R9表示)。
图14显示hCG/RR-6双特异性结合测定的结果。
图15显示RR6/RR6双功能结合测定的结果。
图16显示表达实施例4的结构物的粗巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)上清的结合活性和SDS-PAGE分析。
图17显示pHP14.3A的质粒图谱。
图18显示表达实施例5的结构物的粗多态汉逊酵母上清的结合活性和SDS-PAGE分析。
图19显示使用本发明的结构物乳酸菌噬菌体的感染性的下降。
图20显示运用双头抗体形成活性结合层图解说明。
图21示抗体吸附和双头抗体片段致敏的RR6-BSA孔时I125标记的hCG的捕获。
图22显示在探测hCG抗原的免疫测定中运用本发明的双特异性双头抗体片段示意性的说明。
图23显示通过单克隆抗体和自组装的双头/RR6-BSA乳胶(latex)的吸附进行的乳胶测定反应。
图24显示在RR6-BSA包被的葡聚糖表面双头抗体片段的装配。
图25显示通过乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亚料(Lactococcus lactissubsp.cremoris)LM0230加或不加噬菌体P2和/或双头3850(也指双头3-2)的牛奶酸化作用曲线。
图26显示ELISA中A405信号以确定H14-R9双头A405的双特异性。
图27显示质粒pUR4619中编码抗hcg抗RR6双特异性双头抗原结合蛋白(以H14-R7表示,缺失头4个和后3个氨基酸)的核苷酸序列。
发明详述
本发明基于以下发现:从天然缺失轻链的免疫球蛋白衍生的重链的可变区可彼此结合形成保持亲本完整免疫球蛋白的抗原结合亲和性的多价单多肽链,但此多肽链体积更小,因此较少免疫原性,从而比完整抗体分子,尤其,在例如在诊断,治疗和导向方面有明显优点。因此,本发明如此处所述涉及抗原结合蛋白的多价形式,制备它们的方法及其应用的新的和改进的方法。
如此处所用的,多价抗原结合蛋白是具有超过一个抗原结合位点的蛋白。
其中包括二价,三价,四价等。一方面,二价形式是聚两个抗原结合位点的形式,为优选形式,但更高的多价形式在可用在特定环境下。
单区结合单元意谓天然形成完整抗原结合位点的免疫球蛋白可变区。
本发明应用的单区结合单元优选从任何天然缺失轻链的免疫球蛋白重链可变区,如此则抗原结合位点专门定位在重链可变区。优选地,本发明中运用的重链可变区衍生自天然缺失轻链的免疫球蛋白,如上所述在EP-A-084421中描述的可从骆驼获得。
彼此线合形成本发明的多价抗原结合蛋白的独立的单区结合单元具有相同的抗原特异性时,会产生与一个以上的相同类型的分子结合的结合蛋白。换而言之,能与彼此的不同表位结合的、依照本发明的多价和多特异性结合蛋白可通过将针对不同抗原的单区结合单元装配在一起而获得。具有确定的抗原特异性的、来自天然缺失轻链的免疫球蛋白的重链可变区可便利的通过筛选编码骆驼免疫球蛋白的克隆片段的表达文库而获得,运用常规技术,如所述,例如,在EP-A-0584421和实施例1中。
本发明的多价抗原结合蛋白可通过将单区结合单元顺序相连而形成,如此每个单区结合单元至少与一个其它可变区相连。
独立的单区结合单元可通过肽连接体顺序连接,便利的可弯曲的肽连接体允许各区相对于彼此弯曲,则可同时发生与多抗原决定簇的结合。如此的连接体与独立的单区结合单元的结合,则不影响单区抗原结合位点的结合能力。可适当使用任何容许单区结合单元成分以以下方式连接的肽连接体,使每个可变区保持其衍生自的完整的免疫球蛋白的结合特异性。这些连接体包括,例,衍生自已知蛋白的肽,如葡糖淀粉酶,纤维二糖水解酶,或细胞壁蛋白(CWP),或合理设计的合成肽。连接体可适当包括1到400或更多的氨基酸;便利的,肽连接体包括5到20个氨基酸。通常优选依照本发明在两个单区结合单元之间有如此连接体的抗原结合蛋白群,因其良好的产率。
本发明的另一个优选的实施方案中,单独的单区结合单元可无任何间插连接体直接顺序连接。此种方式中,结合位点在依照本发明的多价结合蛋白中比在免疫球蛋白片段缺失的完整免疫球蛋白中彼此更加紧密。一般认为此种方式会造成不利的空间相互作用升高,但令人吃惊的是,发现仍然保持了完全的结合活性。进一步的,这些含直接连接的单区结合单元的片段表现得更稳定,例,遇到蛋白水解降解时。
在一个可选择的实施方案中,功能基团如酶可与抗原结合蛋白融合。
依照本发明的多价抗原结合蛋白可广泛适用于本领域,使用其抗体,或其片段。这些应用包括诊断,治疗,导向,免疫测定,凝集,凝集分析,纯化过程和去污剂。
为在诊断或治疗导向中的应用,可构建具有针对双靶位点的结合活性的根据本发明的抗原结合蛋白和诊断或治疗剂。具有两个或更多独特的结合特异性的多价结合蛋白有特殊用途,例,将治疗剂导向传递到它们的预定作用位点。依照本发明的结合蛋白在治疗剂和靶位点之间通过自组装建立连接,将治疗剂引导到靶,增加局部效率。细胞毒剂可直接靶向受攻击的肿瘤细胞,例如,依照本发明的双特异性,二价结合蛋白具有对细胞核细胞毒剂的特异性。能在靶位点产生细胞毒素产物的酶,尤其是氧化还原酶如葡糖氧化酶(催化葡萄糖到葡糖酸的氧化作用,从而产生表现细胞毒性的过氧化氢)同样能通过运用根据本发明的具有抗靶和抗酶特异性的结合蛋白,便利地传递到反应的预定位点。
根据本发明的抗原结合蛋白通过本领域常规的方法可便利地与一或更多适当的诊断或治疗的有效试剂或载体接触。诊断或治疗的有效试剂与本发明的小抗原结合蛋白的直接接触具有以下危险,结合位点的空间障碍会反作用于结合活性。因此,在具体实施方案中,抗原结合蛋白具有附加的额外的多肽基团,额外多肽基团对结合特性没有贡献,但为诊断或治疗剂的附着提供方便。
具有附加多肽的的抗原结合蛋白也可特别应用在免疫吸附过程中,特别是要求结合蛋白与其它物质相连的免疫亲合纯化过程,其它物质例如标记物,如酶,或固相,例如,柱中的载体物质。
额外肽基团一般通过肽键附加在抗原结合蛋白的多肽链一端或靠近一端,如此通过形成链的末端部分的额外肽延长该多肽链。额外肽基团将便利地附加在其氨基末端。WO91/08492(Unilever)中描述了合适的额外肽连接基团以及它们的附着方法。它们包括至少5但优选不超过20个氨基酸残基并优选包括至少一个赖氨酸残基,如此可为共价附着到表面或蛋白质示踪物如酶提供便利的位点。尤其适当的额外肽连接基团,特别为将抗原结合蛋白偶联到固体塑料表面的基团,包括“Myc”氨基酸序列:GLU-GLN-LYS-LEU-ILE-SER-GLU-GLU-ASP-LEU-ASN。(见SEQ ID NO:1)
通过便利的化学交联剂可便利地将额外肽偶联到固体表面如乳胶和其它由一般用于免疫测定的塑料物质。额外肽中的化学偶联位点应优选离可变区结合位点足够远,如此则偶联分子不影响结合活性。也可选择治疗剂和示踪物如酶(例辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,葡糖氧化酶)通过赖氨酸的E-氨基(epsilon)基团额外肽共价偶联。
多价的,根据本发明的多特异性结合蛋白在吸附和纯化技术中因其对两个或更多不同的物质表现特异性而具有特殊的优点。运用本发明的结构物活化的表面可便利地进行配体的检测和纯化。通过例证,合适的包括有载体的分子,根据本发明的结合蛋白具有与之结合的特异性,将其用具适当的结合特异性的双特异性结合蛋白包被,可使之活化或敏化,保留的结合特异性随意与分析物或污染物结合,视目的而定。合适的包括在载体中的分子,无论吸附或共价结合,包括蛋白,肽,糖类,DNA,RNA或其结合。尤其优选可通过此方法检测或纯化的配体,包括人绒毛膜促性腺激素,黄体生成素,雌酮,孕酮或其代谢物。载体可为天然微粒的,平面的或有孔的。适当的载体包括在免疫吸附和纯化技术中常规使用的载体,尤其是乳胶微粒,聚苯乙烯孔和葡聚糖表面。
另一方面,根据本发明的结合蛋白可用作交联试剂。例如,双特异性结合蛋白能将一个噬菌体与另一个相连,从而导致它们的钝化。病毒或微生物的失活可能同样通过凝集作用完成。
本发明的进一步实施方案中,结合蛋白可用在去污剂组合物及其类似物中,用于染色剂的处理,基本上如PCT/EP98/03438中描述。因此,例如,依照本发明的双特异性蛋白特异性具有对染色剂和酶的高结合亲合性。这样的双特异性蛋白通过在冲洗水溶液或染色剂中供应所述蛋白和酶作为先形成的非共价复合物或分别供应二者并允许他们自组装,从而能满足染色中积累的酶的需要。进一步的重要方面是在一类染色物质中运用与几个不同,但结构相关的分子结合的结合蛋白。此举具有如下优点,使单个酶种类结合(并漂白)几种不同染色剂。例如运用与酒,茶,和黑莓中多酚结合的结合蛋白。
可用包括有编码如以上阐明的多肽的基因转化宿主,并在所述宿主中表达所述基因,制备根据本发明的多价抗原结合蛋白。
合适的宿主可选自原核细菌,如革兰氏阴性菌,例如大肠杆菌(E.coli),和革兰氏阳性菌,例如枯草芽杆菌(B.subtilis),或乳酸菌,低等真核生物如酵母,例如糖酵母属(Saccharomyces),克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces),汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia),或霉菌如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)的霉菌。
应用于与本发明有关方面的优选宿主为低等真核生物霉菌和酵母。
合成基因,将它们包括到宿主并在宿主中表达基因的技术为本领域所熟知,技术人员运用普通的知识很容易将本发明附诸实施。
已有文献描述了运用转化的低等真核生物宿主制备从骆驼科重链免疫球蛋白衍生的抗体片段或其功能化的片段的方法,例如在专利申请WO94/25591中,这些技术还可适当用于制备根据本发明的结构物。
可用常规技术如亲合层析,离子交换层析或凝胶过滤层析回收并纯化根据本发明的蛋白。
本领域已知的标准技术如酶联免疫吸附测定(ELISA),放射免疫测定(RIA)或运用生物传感器,可便利地测量依照本发明的多价结合蛋白的活性。
以下实施例仅用于说明。对核酸物质的操作和分析技术出另作说明均如Sambrook等,分子克隆,冷泉港出版社,纽约,第二版,(1989)中所述。
HC-V表示重链可变区。
限制性位点下加下划线。
实施例
实施例1.美洲驼中诱导的体液免疫反应
将雄性美洲驼用油包水乳剂(1∶9 V/V,抗原存在于水中:Specol(Bokout等))皮下和肌内免疫。每个免疫接种位点0.75-1.5毫升油包水乳剂,接种含有:100g抗原。使用的抗原有:hCG(Sigma),与BSA通过反应三嗪基团相连的偶氮染色RR6(ICI)和链球菌突变HG982细胞。根据以下时间表进行免疫接种:第一次免疫接种三周后二次免疫接种。第三次在第二次的两周后进行。抗原特异性的ELISAs跟踪免疫反应。
使用Nunc Covalink板测量抗RR6反应,该板是用偶氮染料染色的。与(稀释的)血清样品温育后,与多克隆兔-抗-美洲驼抗血清(用通过ProtA和ProtG柱纯化的美洲驼免疫球蛋白结合的美洲驼抗体免疫兔子获得;ID-DLO)温育检测检测结合的骆驼抗体,随后与碱性磷酸酶结合的猪-抗-兔免疫球蛋白(Dako)温育。最后,与对硝基苯磷酸温育确定碱性磷酸酶活性,405nm测光密度。基本上用同样方法测抗hCG反应,使用hCG覆盖的Nunc maxi-sorb板。基本上用同样方法测抗链球菌反应,使用链球菌突变株HG982敏化的Nuncmaxi-sorb板。
实施例2美洲驼HC-V片段的克隆,表达和筛选
2.1编码美洲驼HC-V区的基因片段的分离
从免疫接种的美洲驼血样取200毫升,通过Ficoll(Pharmacia)不连续梯度离心获得丰富的淋巴细胞群,酸性硫氰酸胍抽提分离总RNA(例如,通过Chomczynnski和Sacchi,1987的方法)。合成第一链cDNA后(例如,用Amersham第一链cDNA试剂盒),PCR扩增编码HC-V片段的DNA片段和长或短铰链区的部分,使用特殊引物:
PstIVH-2B 5’-AGGTSMAR
CTGCAGSAGTCWGG-3’(见SEQ.ID.NO:2)S=C和G,M=A和C,R=A和G,W=A和T,
Hind IIILam-075’-AACAGTT
AAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3’
(短铰链) (见SEQ.ID.NO:3)
Hind IIILam-08 5’-AACAGTT
AAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3’
(长铰链) (见SEQ.ID.NO:4)
PCR片段用PstI(与HC-V区的密码子4和5一致,编码氨基酸L-Q)和BstEII(定位于HC-V基因片段的3‘端,与氨基酸序列Q-V-T一致)消化,通过凝胶电泳并从琼脂糖凝胶分离纯化长度在300和400bp之间的DNA片段(编码HC-V区,但缺乏前3个和末3个密码子)。
2.2编码美洲驼HC-V区的啤酒糖酵母表达质粒的构建
质粒pUR4547和pUR4548是从pSY1衍生的啤酒糖酵母游离表达质粒(Harmsen等,1993)。PstI部分消化后,移除从PstI位点到定位在GAL7启动子之前的pSY1,剩余部分与克列诺片段和随后的平端连接温育。转化后在对限制图谱分析的基础上选择期望的质粒。然后,将约410bp的AflII/pflMI片段Leu2选择性标记中的BstII位点用BstEII位点经三步骤PCR诱变移除的相应片段置换,使用如下引物:PCR-A:
PflMIBOLI 1 5’-GGGAATT
CCAATAGGTGGTTAGCAATCG(见SEQ.ID.NO:5)
(BstEII)BOLI 4 5’-GACCAACGT
GGTCGCCTGGCAAAACG(见SEQ.ID.NO:6)PCR-B:
(BstEII)BOLI 3 5’-CGTTTTGCCA
GGCGACCACGTTGGTC(见SEQ.ID.NO:7)
AflIIBOLI 2 5’-CCCCAAGCTTACATGGTCTTAAGT
CTTAAGTTGGCGT(见SEQ.ID.NO:8)
PCR-A用引物BOLI 1和BOLI 4执行,生成约130bp片段,其中包括3’末端的PflMI限制性位点和5’末端的钝化BstEII位点。PCR-B用引物BOLI 2和BOLI 3执行,生成AflTI位点在3’末端的约290bp的片段。第三步PCR用从反应A和B获得的片段,及引物BOLI 4和BOLI 2。
最终,使用合成片段置换约1.8kb SacI-HindIII片段,具有如下序列,各自生成质粒Pur4547和pUR4548。
-pUR4547的SacI/HindIII片段 SacIGAGCTCATCACACAAACAAACAAAACAAAATGATGCTTTTGCAAGCCTTCCCTT1 ---------+---------+---------+---------+---------+---- 54CTCGAGTAGTGTGTTTGTTTGTTTTGTTTTACTACGAAAACGTTCGGAAGGGAA
M M L L Q A F L F
|→ SUC2 ss
PstITTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCGCAGGTGCAGCTGCAGG55------+---------+---------+---------+---------+----- 105AAGGAAAACCGACCAAAACGTCGGTTTTATAGACGCGTCCACGTCGACGTCC
L L A G F A A K I S A Q V Q L Q E
|→
BstEII HindIIIAGTCATAATGAGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCATAATGACTTAAGCTT106----+---------+---------+---------+---------+----- 155TCAGTATTACTCCCTGGGTCCAGTGGCAGAGGAGTATTACTGAATTCGAA
E S * * G T Q V T V S S * *
HC-V盒子 ←|
(参见SEQ.ID.NO:9 and NO:10)以及和pUR4548的SacI/Hind III片段SacIGAGCTCATCACACAAACAAACAAAACAAAATGATGCTTTTGCAAGCCTTCCTTT1 ---------+---------+---------+---------+---------+---- 54CTCGAGTAGTGTGTTTGTTTGTTTTGTTTTACTACGAAAACGTTCGGAAGGAAA
M M L L Q A F L F
|→ SUC2 ss
PstITCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCGCAGGTGCAGCTGCAGG55-----+---------+---------+---------+---------+----- 105AGGAAAACCGACCAAAACGTCGGTTTTATAGACGCGTCCACGTCGACGTCC
L L A G F A A K I S A Q V Q L Q E
|→
BstEIIAGTCATAATGAGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACAAAAACTCATC106----+---------+---------+---------+---------+----- 155TCAGTATTACTCCCTGGGTCCAGTGGCAGAGGAGTCTTGTTTTTGAGTAG
S * * G T Q V T V S S E Q K L I
HC-V盒 ←|→ myc 尾
HindIIITCAGAAGAGGATCTGAATTAATGACTTAAGCTT156----+---------+---------+-------- 188AGTCTTCTCCTAGACTTAATTACTGAATTCGAAS E E D L N * *
←|
(见SEQ.ID.NO:11和NO:12)
两质粒都包括GAL7启动子和PGK终止子序列以及转化酶(SUC2)信号序列。两个质粒中的编码SUC2信号序列的DNA序列之后都跟随HC-V区(包括BstII位点)的前5个密码子(编码Q-V-Q-L-Q=SEQ.ID.NO:13),一个填充序列,HC-V区的后6个密码子(编码Q-V-T-V-S-S=SEQ.ID.NO:14)。在Pur4548中,此序列后跟随11个编码myc-标签的密码子,两个终止密码子,一个AflII和HindIII位点。
在真菌菌种保藏中心(Centraal Bureau voorSchimmelcultures),根据布达佩斯条约保藏质粒pUR4547和pUR4548,1997 8月18日,Baarn,保藏分别为:100012和CBS100013。依照EPC规则28(4),或非EPC的合同规定的规定中的相同的协议,在此申请该存放物的样品当要求时仅提交给一位检验人。
通过对pUR4548进行PstI和BstEII消化,分离约6.4kb的载体片段,并将其与PstI-BstEII的约350bp的如上所述获得的片段相连。啤酒糖酵母通过电穿孔转化后,从基本培养基琼脂平板(包括0.7%酵母氮基,2%葡萄糖和2%琼脂,以及必需氨基酸和碱)选择转化体。
2.3抗原特异性HC-V区的筛选
为制备含myc-尾的美洲驼HC-V片段分离的转化体在选择基本培养基(包括0.7%酵母氮基,2%葡萄糖,以及必需氨基酸和碱)中生长过夜,随后在YPGal培养基(包括1%酵母抽提物,2%细菌培养用蛋白胨和5%半乳糖)中稀释十倍。生长24和48小时后,ELISA分析克隆的培养上清,基本依照实施例1中所述方法判断特异性与抗原hCG,RR6或链球菌结合的HC-V片段的存在。在此案例中,用如下方法检测特异性结合的HC-V片段的存在,将特异性结合的HC-V片段与单克隆抗myc抗体温育,随后与多克隆兔-抗-鼠碱性磷酸酶偶联物温育。用此方法分离抗-hCG,抗-链球菌和抗-RR6 HC-V片段,其中:
抗-RR6:
R7 pUR4638(见图2:SEQ.ID.NO:15和NO:16)
R9 pUR4640(见图3:SEQ.ID.NO:17和NO:18)
抗-hCG(α单元):
H14 pUR4601(见图4;SEQ.ID.NO:19和NO:20)
HI15 pUR4602(见图5;SEQ.ID.NO:21和NO:22)
抗-链球菌:
S36 pUR4603(见图6;SEQ.ID.NO:23和NO:24)
S120 pUR4642(见图7;SEQ.ID.NO:25和NO:26)
实施例3通过啤酒糖酵母制备美洲驼HC-V双头
3.1编码抗-hCG/抗-RR6双特异性双头的游离表达质粒的构建
在抗hCG HC-V片段H14和HI15(抗-α-亚基)中,移除PstI位点,通过PCR引入XhoI位点,使用以下引物:℃℃
MPG158WB
XhoI5’-GAATTAAGCGGCCGCCCAGGTGAAACTG
CTCGAGTCWGGGGGA-3’(见SEQ.ID.NO:27)和MPG159WB
BstEII3’-CCCTGGGT
CCAGTGGCAGAGGAGTGGCAGAGGAGTCTTGTTT-5’(见SEQ.ID.NO:28)照此方法序列:
PstICAG GTC CAG
CTG CAG GAG TCT GGGQ V Q L Q E S G (见SEQ.ID.NO:29和NO:30)变为
XhoICAG GTG AAA CTG CTC GAG TCW GGGQ V K L L E S G (见SEQ.ID.NO:31和NO:32)
XhoI和BstEII消化PCR片段,琼脂糖凝胶电泳纯化330bp片段,并从凝胶上分离之。克隆该片段到pUR4421(见WO94/25591中实施例1),pUR4421用同种酶消化,形成pJS2(H14)和pJS53(HI15)。然后,分离pJS2和pJS3的420bp EagI-HindIII片段,并连接其到约6.6kb pSY1的EagI-HindIII载体片段,其中PstI和BstII位点如实施例2.2所述已移除。所得质粒pJS7和pJS8各自用BstEII和HindIII消化,然后纯化的载体片段在具以下序列的合成接头存在时重连接。BstEII PstI HindIII<- MPG 160 WB (49) ->GGTCACCGTCTCCTCACAGGTGCAGCTGCAGGAGTCACTGTAATGACTTAAGCTT---------+---------+---------+---------+---------+----- 55CCAGTGGCAGAGGAGTGTCCACGTCGACGTCCTCAGTGACATTACTGAATTCGAA
<- MPG 161 WB (48) ->V T V S S Q V Q L Q E S L * * L K LMPG 160 WB(49) (see SEQ.ID.NO:33)MPG 161 WB(48) (see SEQ.ID.NO:34)
获得质粒pJS9和pJS10。最终,用PstI和HindIII消化,然后将纯化的约7.0kb的载体片段与约350bp的pUR4638和pUR4640,的PstI-HindIII片段连接,各自编码抗-RR6 HC-V片段R7和R9,其后跟随myc尾。得到的啤酒糖酵母游离表达质粒pUR4618,pUR4619,pUR4620,和pUR4621编码抗hCG抗RR6双特异性双头,其前部是SUC2信号序列以及后部是myc尾。PUR4618:SUC2-H14-R7-myc(见图27;SEQ.ID.NO:35和NO:36)PUR4619:SUC2-H14-R9-myc(见图8-9;SEQ.ID.NO:37和NO:38)PUR4620:SUC2-HI15-R7-myc(见图10;SEQ.ID.NO:39和NO:40)PUR4621:SUC2-HI15-R9-myc(见图11;SEQ.ID.NO:41和NO:42)
XhoI消化这些质粒,部分用BstEII消化,可分离约0.7kb的XhoI-BstEII片段,然后将其克隆至pUR4547的载体片段(用同种酶消化)。照此方法,可获得无myc尾的双头。
推荐在不同启动子系统中构建表达载体,例,组成型GAPDH启动子或不同的信号序列,例使用交配因子前原序列。
3.2编码抗RR6二价双头的游离型表达质粒的构建
BstEII(部分)和HindIII消化质粒pUR4618和pUR4619,各自纯化约440bp和400bp的DNA片段。该片段随后与pUR4623的BstEII-HindIII载体片段(-6.7kb)连接,得到PuR4622和PuR4623(见图12-13;各自为SEQ.ID.NOS:43/44和45/46),各自编码同源二聚化的二价和异源二聚化的二价双头。
PUR4622:SUC2-R7-R7-myc
PUR4623:SUC2-R7-R9-myc
3.3 HC-V双头的制备和分析
通过pUR4623将表达质粒pUR4618经由电穿孔引入啤酒糖酵母,如实施例2.3所述从基本培养基琼脂平板上选择转化体。为制备双头,转化体在选择基本培养基中生长过夜,然后在YPGal培养基中稀释10倍。生长24和48小时后,对样品进行Western印迹分析。通过Western印迹分析对制备的双头免疫检测,使用单克隆抗myc抗体,随后与多克隆兔抗鼠碱性磷酸酶偶联物温育。
照以下方法检测双特异性双头的双功能性
hCG覆盖的PINs与(稀释的)培养基样品温育。然后,PINs与RR6-碱性磷酸酶偶联物温育,其中偶氮染色RR6通过其反应三嗪基团伴随碱性磷酸酶。最终PINs与对硝基苯磷酸温育,405nm测光密度,确定碱性磷酸酶酶活性(见图14)。
依照以下方法检测单特异性,二价双头的双功能性
Nunc Covalink板,RR6覆盖,与(稀释的)培养基样品温育。然后,与RR6碱性磷酸酶偶联物温育,其中偶氮染色RR6通过其反应三嗪基团伴随碱性磷酸酶。最终,与对硝基苯磷酸温育,405nm测光密度,确定碱性磷酸酶酶活性(见图15)。
实施例4.通过巴斯德毕赤酵母制备HC-V双头
4.1用于抗-hCG/抗-RR6双特异性双头的表达的整合载体的构建
为在巴斯德毕赤酵母中美洲驼双头结构物的表达和分泌,融合编码双特异性结构物的基因到可从商业渠道获得的巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9(Invitrogen)α交配因子前导序列。最后表达载体的构建包括几个克隆步骤。
步骤1:双特异性HCV表达载体的构建需要两个穿梭载体,pPIC9N和pUC.HCVx2,的构建。构建pUC.HCVx2,用合成的HindIII/EcoRI片段置换pUC19的HindIII/EcoRI多接头,破坏原始HindIII位点,在pPIC9N中引入允许直接与α交配因子前导序列融合的NheI位点,并引入XhoI和HindIII HCVx2插入位点。
pUC.HCVx2的合成插入片段:----A S Q V K L L E-----AAGCT
GCTAGCCAGGTGAAACTG
CTCGAGCCCGGG
AAGCTTGAATTC
NheI XhoI HindIII
(见SEQ.ID.NO:47和NO:48)
合成的寡核苷酸PCR.650和PCR.651退火构建合成接头。PCR.650:5′-AGCTGCTAGCCAGGTGAAACTGCTCGAGCCCGGGAAGCTTG-3′(见SEQ.ID.NO:49)PCR.651:5′-AATTCAAGCTTCCCGGGCTCGAGCAGTTTCACCTGGCTAGC-3′(见SEQ.ID.NO:50)
从PuR4619和PuR4621切除编码双特异性HCV片段的XhoI/HindIII的基因片段(见实例3.1)并将其插入XhoI/HindIII开放的pUC.HCVx2穿梭载体,从而产生中间结构物pUC.HCV19和pUC.HCV21。构建pPIC9N,用合成的XhoI/EcoRI片段置换pPIC9(Invitrogen)的XhoI/EcoRI多接头,在α交配因子前导序列直接下游引入NheI限制性位点。
合成的pPIC9N的插入片段:L E K R A S-----CTCGAGAAAAGA
GCTAGCCCCGGG
GAATTCXhoI NheI EcoRI (见SEQ.ID.NO:51和NO:52)
合成的寡核苷酸PCR.648和PCR.649退火构建新插入片段。PCR.648:5′-TCGAGAAAAGAGCTAGCCCCGGGG-3′(见SEQ.ID.NO:53)PCR.649:5′-AATTCCCCGGGGCTAGCTCTTTTC-3′(见SEQ.ID.NO:54)
步骤2:通过三点连接构建最终表达载体。将包括α交配因子编码序列的pPIC9N的BamHI/NheI片段和来自pUC.HCV21和pUC.HCV19的NheI/EcoRI HCVx2插入片段一起克隆到BamHI/EcoRI开放的pPIC9载体。从而各自分离巴斯德毕赤酵母转化和表达载体pPIC.HCV19和pPIC.HCV21。
4.2HC-V双头的制备和分析
步骤1:转化的巴斯德毕赤酵母细胞的转化和选择:
巴斯德毕赤酵母细胞基本如Faber等所述转化。简单的:巴斯德毕赤酵母GS115细胞在500毫升YPD培养基(1%酵母抽提物,2%蛋白胨,1%葡萄糖)30EC生长过夜,OD600=1.4。细胞离心,无菌蒸馏水冲洗沉淀,而后在100毫升KDTT缓冲液(50mM磷酸钾pH7.5,25mMDTT)中重悬。37EC温育15分钟,沉淀细胞(3000rpm 3分钟),在100毫升冰冷的STM缓冲液(92.4g葡萄糖/升,10mM Tris.HClpH7.5,1mM MgCl2)中重悬。缓冲液5次冲洗后,细胞沉淀重悬在终体积为0.5毫升STM缓冲液中。2微升水中近似2-5微克DNA(BglII消化的pPIC结构物:酚/氯仿抽提和沉淀纯化DNA)与70微升新鲜耐久的巴斯德毕赤酵母细胞(冰上)混合。在0.2cm小池中电穿孔,BioRadGene-Pulser 1.5kv,400,25μF.。向细胞中加入YPD培养基。30EC恢复1小时,沉淀细胞,在200微升1M山梨醇中重悬并转入MD平板(1.34%YNB,4×10-5%生物素,1%葡萄糖,0.15%琼脂)。转化细胞(His)的克隆形成在30EC培养48小时之内可见。转化的巴斯德毕赤酵母细胞GS115基本上如Invitrogen巴斯德毕赤酵母表达手册推荐的进行选择。筛选包含His+转化体的平板寻找Mut1和Muts表型:使用无菌牙签,克隆印在MM平板(1.34%YNB,4×10-5%生物素,0.5%MeOH,0.15%琼脂)和MD平板上,通常先印MM平板。从每个结构物中挑约100转化体。平板在30EC培养2-3天,平板上划线。正常在MD平板上生长但在MM平板上级少或不生长的克隆定为Muts克隆。
步骤2:双特异性HC-V双头的制备和评估
转化并选择过的巴斯德毕赤酵母克隆经诱导表达双特异性抗体,使用以下列出的方法:
1)运用来自MD平板的单克隆,接种到50毫升Falcon管中10毫升BMGY(1%酵母抽提物,2%蛋白胨,100mM磷酸钾pH6.0,1.34YNB,4×10-5%生物素,1%甘油)。
2)30EC下摇床(250rpm)振荡培养到培养基OD600=2-8。
3)2000g自旋5分钟,在2毫升BMMY培养基中重悬细胞(1%酵母抽提物,2%蛋白胨,100Mm磷酸钾Ph6.0,1.34%YNB,4×10-5%生物素,0.5%甘油)。
4)培养物放回摇床。
5)继续培养24小时后,向培养物中加20μl MeOH。
6)48小时候离心除细胞收集上清。
检测粗制的上清中HC-V双头片段的存在,运用Bio-Rad mini-Protean II System对12%丙烯酰胺凝胶进行分析(图16)。ELISA显示双头结合活性:
1)96孔ELISA板(Greiner HC板)加200微升/孔PBS中的BSA-RR6偶联物(见实例1)37EC活化过夜。
2)PBST洗一次,37EC,每孔加200微升封闭缓冲液,温育1小时。封闭缓冲液:PBS-T中1%BSA。
3)待测样品的连续稀度(100微升)与等体积封闭缓冲液混合,加入敏化的ELISA孔。37EC温育1-2小时。
4)向每孔加入200微升封闭缓冲液中的hCG-AP偶联物,其中hCG通过戊二醛偶联伴随碱性磷酸酶。
5)PBST洗一次,加100微升/孔Pnpp底物(1M二乙醇胺/1mMMgCl2中1毫克/毫升pNPP捕获的hCG-AP)。
实施例5通过多态汉逊酵母(H.polymorpha)制备HC-V双头
5.1表达抗-hCG/抗RR6双特异性双头的整合载体的构建
为允许骆驼双头结构物在多态汉逊酵母(H.polymorpha)菌株A16(Leu-)中的表达和分泌(Hodgkins等),将双头HC-V基因结构物与α交配因子前导序列融合,克隆在多态汉逊酵母(H.polymorpha)转化和表达载体Php14.3的MOX启动子的下游(见图17)。包含质粒pHP14.3的大肠杆菌培养物按布达佩斯条约在伦敦(联合王国)的国立典型培养物保藏中心(Nation collection of Type Cultures)(中央公共健康实验室)保藏号,保藏号NCTC13048。最后的表达载体的构建包括几个克隆步骤。
步骤1:pUC19基础的穿梭载体pHP.1的构建,其中用合成HindIII/EcoRI片段置换HindIII/EcoRI多接头,破坏原始EcoRI位点并引入BamHI,MunI和BglII位点:
合成的pHP.1插入片段:AAGCTTAGATCTGGATCCCGGGCAATTGAGATCTAATTC(见SEQ.ID.NO:55)HindIII BglII BamHI MunI BglII
合成的寡核苷酸PCR.448和PCR.449退火构建新的插入片段。PCR.448:5′-AGCTTAGATCTGGATCCCGGGCAATTGAGATCT-3′(见SEQ.ID.NO:56)PCR.449:5′-AATTAGATCTCAATTGCCCGGGATCCAGATCTA-3′(见SEQ.ID.NO:57)
步骤2:BamHI-EcoRI切除来自pPIC9-HCV19和pPIC9-HCV21的α交配因子前导-双特异性HC-V基因,将其插入BamHI/MunI开放穿梭载体pHP.1,各生成pHP.HCV19和pHP.HCV21。
步骤3:最后的克隆步骤中,将来自中间结构物的NheI/BglII插入片段pHP.HCV19和pHP.HCV21插入NheI/BglII开放多态汉逊酵母转化载体pHP14.3,生成pHP14.HCV19和pHP14.HCV21。
5.2 HC-V双头的制备和分析
步骤1:转化的多态汉逊酵母细胞的转化和选择:
多态汉逊酵母细胞(菌株A16)基本上依照4.2所述进行转化,除所有培养在37EC进行,且Php结构物在转化前用SfiI/NotI消化。如4.2所述使用包括Leu+转化体的平板筛选Mut+和Mut-表型。
步骤2:双特异性HC-V双头的制备和评价
诱导经转化和选择的多态汉逊酵母克隆表达双特异性抗体,运用与在巴斯德毕赤酵母中表达HC-V双头的相同方法,如4.2所述。检测粗制的上清中HC-V双头片段的存在,使用Bio-Rad mini-ProteanII System对12%丙烯酰胺凝胶进行分析(图18)。ELISA显示双头结合活性(见4.2)。
实施例6 通过啤酒糖酵母制备美洲驼HC-V三头
用BstEII和HindIII消化pUR4603和pUR4642,分离约6.8kb的载体片段,在寡核苷酸MPG160WB和MPG161WB存在下重连接(见实施例3.1)。从得到的质粒分离约0.4kb的PstI片段,编码抗链球菌HC-V片段,它在N端缺失前5个氨基酸,而将此5个氨基酸融合在C端。用PstI消化质粒pUR4618或pUR4621,顺序将载体与如上所述获得的约0.4kb的PstI片段重连接,获得一组新的酵母表达质粒。新获得的酵母表达质粒中约0.4kb的PstI片段的定位通过BstEII消化确定。正确的定位导致生成两个约0.4kb的片段。错误的定位导致生成一个约0.75kb的片段和一个0.05kb的片段。PstI片段正确定位的质粒编码三头,包括与HCG结合的HC-V片段,及紧随其后的与链霉素结合的HC-V片段,和紧随其后的与RR6结合的HC-V片段和最后的myc尾。
应该认识到,本领域技术人员可设计改变的构建路线。
实施例7通过运用美洲驼HC-V双头减少乳酸菌噬菌体的感染性
7.1 RR6染色分子与噬菌体的偶联
将噬菌体用RR6分子包被,10微升P2噬菌体储存液(~1012噬菌体/毫升)+890微升偶联缓冲液(0.1m四硼酸钠,0.15M氯化钠,pH8.5)+100微升偶联缓冲液中的RR6溶液,混合,37EC温育1小时(5×104RR6分子配1个噬菌体)。加入5微升封闭缓冲液(1.0M Tris封闭液pH9,和过剩的基本氨基基团)使RR6的非反应的氯原子失活,在37EC温育30分钟。
7.2双头对RR6包被的噬菌体的作用
检测通过包括质粒pUR4623的啤酒糖酵母制备的抗-RR6双头的抑制作用,将该双头(范围在0-300ng)与5.5*105噬菌体在200微升总体积中混合,37EC温育0.5小时。从此混合物中,取100微升加到乳酸乳球菌乳脂亚种LM0230的过夜培养物中,在M17(1*109cfu/ml)生长,在包含0.5%葡萄糖和10mM CaCl2的M17的平板上铺板。30EC平板温育过夜。图9显示14ng二价抗体片段使感染降低90%。
实施例8通过使用美洲驼HC-V双头降低乳酸菌(LAB)噬菌体的感染性
8.1抗LAB噬菌体P2的重链抗体的产生并获得抗原特异性的HC-V片段
诱导直接抗LAB P2噬菌体的免疫反应,基本依照实施例1中描述的相同方法。向美洲驼若干次注射约0.2mg噬菌体蛋白。从免疫接种的美洲驼收获富集的淋巴细胞群,然后如实施例2.1中所述获得HC-V基因片段。酵母HC-V文库的构建和筛选基本如实施例2.2和2.3中所述进行。
用此方法获得大量抗-LAB-噬菌体片段。以下为3个此种片段的序列:pUR3823QVQLQESGGG LVQTGGSLRL SCAASGRTSS DYSVGWFRQA PGKEREFLAVMMLSGTGTYY ADSVKGRAAI SRDLAKNTVY LEMNSLKPED TAVYYCALDRAGWLRTEENV YDYWGQGTQV TVSS(见SEQ.ID.NO:58)pUR3824QVQLQESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGAPFR ESTMAWYRQT PGKERETVAFITSGGSKTYG VSVQGRFTIS RDSDRRTVLL QMNNLQPEDT AVYYCHRALSNTWGQGIQVT VSS(见SEQ.ID.NO:59)pUR3825QVQLQESGGG LVQPGGSLRL SCVVSGEGFS NYPMGWYRQA PGKQRELVAAMSEGGDRTNY ADAVKGRFTI SRDNAKKTVY LQMSSLKPED TAVYYCNAARWDLGPAPFGS WGQGTQVTVS S(见SEQ.ID.NO:60)
8.2编码抗-LAB-噬菌体二价双头的游离表达质粒的构建
编码抗-LAB-噬菌体二价双头的游离表达质粒基本如实施例3.1和3.2中所述构建,使用以上提及的片段作为起始物质。用此种及其它方法,构建编码双头位于SUC2分泌信号之前的的质粒pUR3843和pUR3850。
pUR3843:SUC2-3823-3825
pUR3850:SUC2-3825-3824
通过基本依照实施例3.3中所述获得的酵母转化体制备HC-V双头3843和3850。
8.3双头对LAB-噬菌体的感染性的作用
检测用包括质粒pUR3843或pUR3850的啤酒糖酵母制备的抗-LAB-噬菌体双头的抑制作用,将双头(45微克3843和24微克3850)与103,106或108噬菌体在200微升总体积中混合。37EC温育0.5小时,将100微升生长在M17(1*106 cfu/ml)中的乳酸乳球菌乳脂亚种LM0230加入混合物中。然后将混合物在包含0.5%葡萄糖和10mMCaCl2的M17平板上铺板。平板在30EC温育过夜,计算pfu’s数。
表1
噬斑形成单位数
双头(μg) | 103噬菌体 | 100噬菌体 | 108噬菌体 |
3843 (45)3850 (24) | 00 | <1030 | 汇合<103 |
8.4双头对牛奶酸化的作用
在随后的实验中,乳酸菌在30℃接种,牛奶酸化,同时用HP-3852A数据采集记录仪对pH计数。为此,100ml XVM葡萄糖培养基(=包括0.35%酵母抽提物,0.35%蛋白胨和1%葡萄糖的脱脂乳)中接种100μl的XVM葡萄糖中生长过夜的乳酸乳球菌乳脂亚种LM0230培养物(109cfu/ml),加入240μg双头3850后,30℃温育17小时。4小时内培养物使XVM酸化(图25,图表1),双头的存在对结果无影响。在平行实验中,103pfu/Ml P2噬菌体加入LM0230培养物中,整个17小时过程中不发生酸化(图25,图表2)。当加入103,106,或108pfu/ml P2噬菌体,以及240μg双头3850,培养物造成的酸化可完全(103 cfu/ml噬菌体)或部分恢复(图25,图表3,4,5)。
实施例9使用HC-V双头通过自组装活化表面,对分析元素的检测并纯化
9.1使用双特异性的HC-V双头在聚苯乙烯孔通过自组装到预吸附分子形成活性结合层
总的说来,本实施例显示双头抗体片段如何用于在聚苯乙烯孔通过自组装到预吸附分子形成活性结合层。图20显示图表说明。表示吸附的抗体表面(A),或者是双头抗体片段敏化的表面(B)或是通过双头抗体片段自组装到预吸附的RR6-BSA表面形成的(C)。这些双表面而后能结合hCG(D)。
活性红6牛血清白蛋白偶联物的制备
活性红6牛血清白蛋白偶联物通过如下方法制备,用1ml BSA(磷酸盐缓冲液中10mg/ml)与200μl RR6(蒸馏水中10mg/ml)室温下持续混合培养3小时。加入200μl乙醇胺溶液(蒸馏水中1M),所得溶液室温下持续混合培养15分钟。从游离RR6分离BSA-RR6偶联物,用如下方法,向PD10柱(Pharmacia)加0.75ml,含0.1%叠氮钠的磷酸缓冲盐洗脱柱。1ml每分收集洗脱液。部分4和5为红色,收集(RR6-BSA偶联物在非反应或游离RR6前洗脱)。部分10之后的也为红色,但这些部分包括未结合的RR6,予以丢弃。
RR6-BSA吸附的聚苯乙烯孔的制备
从96孔板锯割分离Greiner高结合板的单独的孔。向这些孔中加入100μl每分10μg/ml RR6-BSA或识别hCG的单克隆抗体,室温下温育3小时。PBSTA洗3次抗体吸附和RR6-BSA吸附的孔。
双头抗体片段向RR6-BSA孔的自组装
PBSTA洗RR6-BSA孔后,向每孔中加入100μl以20μg/ml溶于PBSTA中的亲合纯化的双头抗体片段(HI15-R9:pPIC.HCV21)。一小时后,PBSTA冲洗RR6-BSA孔3次。
抗体吸附和双头抗体片段致敏的RR6-BSA孔时I125标记的hCG的捕获
向hCG(2500IU/ml溶于PBSTA)中掺加10μCiI125 hCG(Amersham),用PBSTA稀释为500,100,20和4IU/ml hCG。每分(100μl)稀释液室温下在孔中温育1小时,随后PBSTA用充分冲洗。γ计数器对孔计数。图21显示单克隆抗体吸附的孔(A)和双头抗体片段敏化的孔(B)在一定hCG浓度范围内捕获的dpm数。
双头抗体片段敏化的孔(HI15-R9:pPIC.HCV21)在饱和的hCG浓度时比吸附的抗体孔结合超过2倍的hCG。这说明双头抗体片段敏化孔比吸附抗体孔拥有更高密度的活性hCG结合位点。
9.2运用双特异性HC-V双头自组装到乳胶颗粒中检测人体绒毛膜促性腺激素(hCG)
RR6-BSA乳胶的制备
向950μl 10mM硼酸盐缓冲液中加入0.01%硫柳汞,pH8.5 50μl每份Duke兰乳胶(10%固体),颠倒混合。稀释的乳胶室温下离心8,000g 10分钟,去上清,旋涡振荡细胞沉淀。细胞沉淀在900∶1的硼酸盐缓冲液(如上)和100μl先前制备的RR6-BSA偶联物溶液中重悬。包括乳胶的溶液在室温混合30分钟。随后,如前所述沉淀乳胶并在1ml硼酸盐缓冲液中重悬。
双头抗体片段向RR6-BSA乳胶的自组装
双头抗体片段(HI15-R9:pPIC.HCV21)因其特异性自组装到RR6-BSA乳胶的表面。采用如下方法:将5∶1的RR6-BSA乳胶与3∶1的表达双头HI15-R99(pPIC.HCV21)的巴斯德毕赤酵母上清与包含0.1%叠氮钠和0.1%Tween-20(PBSTA)的磷酸盐缓冲液混成40μl,室温下15分钟。
评价在hCG测定中应用自组装的双头
向自组装的双头RR6-BSA乳胶中加hCG(10μl不同浓度),室温温育15分钟。混合物随后向上流向硝酸纤维素带。该硝酸纤维素带具有一列抗体,识别的hCG的不同抗原决定簇而非双头抗体片段(图22显示此原理的示意说明)。在此抗体列上乳胶结合量通过用自动读取其扫描此列的光密度确定。结果示于图23。通过比较,通过hCG特异性的单克隆抗体吸附制备乳胶,运用与RR6-BSA相同的方法学。该乳胶与hCG(10μl不同浓度)温育,也置于相同的硝酸纤维素带的测定中(结果显示于图23)。
图23显示自组装的乳胶与吸附的抗体乳胶孔的比较。实际上,在高hCG浓度时吸附的乳胶(图23中标记的A)的钩效果在对hCG检测的较高范围进行测定的自组装的乳胶(图23中标记的B)中较弱。对此最可能的解释是在自组装的乳胶上hCG结合位点比吸附的乳胶数量多。
9.3双特异性HC-V抗体片段与伴随有RR6-BSA偶联物的葡聚糖表面的装配
与RR6-BSA偶联的Bialite芯片的制备
将新的CM5生物传感器芯片(Biacore AB)加入Biolite生物传感器(Biacore AB)。HEPES缓冲盐(HBS)的流速调到10μl/分钟。RR6-BSA偶联物与CM5芯片胺偶联,根据生产商指导运用胺偶联试剂盒。主要是,进行2次40μl MHS/EDC注入,活化生物传感器芯片表面。活化后,进行2次40μl RR6-BSA(1∶10在10mM醋酸钠中稀释,pH4.0)注入。然后通过2次40μl乙醇胺(1M)注入封闭生物传感器芯片表面。
通过双头抗体片段的自组装制备结合表面及随后对hCG的检测
通过注入20μl纯化的双头抗体片段(HI15-R9:pPIC.HCV21,100μg/ml溶于PBS中)将双头抗体片段(HI15-R9:pPIC.HCV21)装配到RR6-BSA偶联的葡聚糖表面。此举在图24标记的A所示的Bialite sensorgram表现为反应单元(RU)的增加。而后可注入hCG(20μl 10IU/ml HBS溶液)。HCG的检测表现为RU的增加(图24,标记的B)。
实施例10包括接头肽的抗-hCG/抗-RR6双特异性双头
10.1编码包括接头肽的抗-hCG/抗-RR6双特异性双头的啤酒糖酵母游离表达质粒的构建
在H14和R9之间,引入编码DNA片段合成接头,编码不同接头肽。在末端约50bp长的pJS7的BstEII-HindIII片段(见实施例3.1)置换为约50bp长的具以下序列的BstEII-HindII I片段
MVaJA
BstEII XbaI DraIII PstI HindIII
5′GTCACCGTCTCTAGATGGCCACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAACTTA 3′
(见SEQ.ID.NO:61)
MVbJA
3′GCAGAGATCTACCGGTGGTCCACGTCGAGCTCCTCAGTTGAATTCGA 5′
(见SEQ.ID.NO:62)
所得为pSJ7a。此质粒中,约20bp的PstI-HindIII片段置换为约370 bp的编码抗-RR6 HC-V片段R9的PstI-HindIII片段,约20bp的PstI-HindIII片段置换为pUR4640(见实施例3.1)的myc尾,则得到pSJ7b。
XbaI和DraIII消化质粒pSJ7b,将约7kb载体片段与如下的5个合成寡核苷酸接头连接:
MV01JA 5′CTAGTGGTACTTCCGGTTCCCAG 3′
(见SEQ.ID.NO:63)
MV02JA 3′ ACCATGAAGGCCAAGG 5′
(见SEQ.ID.NO:64)
S G T S G S Q
(见SEQ.ID.NO:65)
MV03JA 5′CTAGTTCTTCATCTGCTTCTGCCTCTTCAGCCCAG 3′
(见SEQ.ID.NO:66)
MV04JA 3′ AAGAAGTAGACGAAGACGGAGAAGTCGG 5′
(见SEQ.ID.NO:67)
S S S S A S A S S A Q
(见SEQ.ID.NO:68)
MV05JA 5′CTAGTGGTTCTCCAGGTTCACCAGGTCAG 3′
(见SEQ.ID.NO:69)
MV06JA 3′ ACCAAGAGGTCCAAGTGGTCCA 5′
(见SEQ.ID.NO:70)
S G S P G S P G Q
(见SEQ.ID.NO:71)
MV07JA 5′CTAGTGCTACTACAACTGGTTCTTCACCAGGTCCAACTCAG 3′
(见SEQ.ID.NO:72)
MV08JA 3′ ACGATGATGTTGACCAAGAAGTGGTCCAGGTTGA 5′
(see SEQ.ID.NO:73)
S A T T T G S S P G P T Q
(见SEQ.ID.NO:74)
MV09JA 5′CTAGTGCTAATCATTCTGGTAATGCTTCTCAG 3′
(see SEQ.ID.NO:75)
MV10JA 3′ ACGATTAGTAAGACCATTACGAAGA 5′
(见SEQ.ID.NO:76)
S A N H S G N A S Q
(见SEQ.ID.NO:77)
寡核苷酸接头片段编码N端HC-V片段的最后一个氨基酸(S)和C端HC-V片段的第一个氨基酸,有连接的接头肽分割。分别生成质粒pUR5330到pUR5334。
用这些质粒对啤酒糖酵母进行转化后,通过Western印迹分析和使用抗myc mAb的抗-hCG的ELISA确定双头的制备水平,检测结合双头(见实例2.3)。制备水平显示在表2:
表2
质粒 | 接头 | 制备水平(mg/l) |
pUR4619pUR5330pUR5331pUR5332pUR5333pUR5334 | NoneS-G-T-S-G-S-QS-S-S-S-A-S-A-S-S-A-QS-G-S-P-G-S-P-G-QS-A-T-T-T-G-S-S-P-G-P-T-QS-A-N-H-S-G-N-A-S-Q | 113649335651 |
两个HC-V区被接头肽(由6-11氨基酸组成)分离的双头的制备水平比两个HC-V区片段无接头肽相连的双头高出3-5倍。
因此认为其它接头肽,例,中联抗体中发现的短铰链区也适合甚至有更好的产量。
最后,使用如实施例3.3中描述的ELISA证明双头的双特异性,结果示于图26。
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Claims (16)
1.多价抗原结合蛋白,包括单个多肽链,此单个多肽链包括连续两个和或更多单区结合单元。
2.权利要求1的蛋白,其中单区结合单元是从天然缺失轻链的免疫球蛋白衍生而来的重链可变区。
3.权利要求1或2的蛋白,其中单区结合单元是从骆驼免疫球蛋白衍生而来的重链可变区。
4.权利要求1-3中任一项的蛋白,包括二价抗原结合蛋白。
5.权利要求1-4中任何一项的蛋白,其中单区结合单元直接顺序相连。
6.权利要求1-4中任一项的蛋白,其中单区结合单元通过肽接头顺序相连。
7.权利要求1-6中任一项的蛋白,其中蛋白具有附加于其上的其它肽。
8.权利要求1-7中任一项的蛋白,其中蛋白具有与其融合的酶。
9.权利要求1-8中任一项的蛋白,其中单区结合单元具有彼此不同的抗原特异性。
10.权利要求1-8中任一项的蛋白,其中单区结合单元具有彼此相同的抗原特异性。
11.编码前述的权利要求中任一项的多价抗原结合蛋白的肽的核苷酸序列。
12.一种表达载体,包括根据权利要求11的核苷酸序列。
13.一种用权利要求12的载体转化并能表达核苷酸序列,产生多价抗原结合蛋白的多肽的宿主细胞。
14.一种制备权利要求1-10中任一项的多价抗原结合蛋白的方法,包括通过将编码所述多肽的基因掺入到宿主中以转化宿主并在宿主中表达所述基因。
15.权利要求1-10中任一项的多价抗原蛋白的在诊断,治疗,定向,免疫测定,交联方法中的应用,包括凝集反应;或在纯化中的应用。
16.权利要求1-10中任一项的多价抗原蛋白在(细菌)噬菌体或病毒的钝化中的应用。
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