CN1204258C - 菠萝蛋白酶成分 - Google Patents

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Abstract

一种新的菠萝蛋白酶成分是免疫刺激剂、抗微生物剂和抗癌剂。它可用于治疗免疫系统受抑制的病症或作为疫苗佐剂或可用于治疗实体瘤或软体瘤或其它肿瘤。

Description

菠萝蛋白酶成分
本发明涉及菠萝蛋白酶成分。具体地，本发明涉及含有新型蛋白并具有免疫调节和抗肿瘤活性的菠萝蛋白酶组分。
茎菠萝蛋白酶(菠萝蛋白酶)是在凤梨科植物组织中发现的蛋白水解酶的统称。它是来自凤梨植物(Ananas comosus)茎的各种成分的混合物。已知菠萝蛋白酶包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶；它也可包含淀粉酶和纤维素酶活性。另外，也存在多种其它成分。
菠萝蛋白酶曾用于治疗多种病症包括炎症，具体地，它已用于治疗腹泻。菠萝蛋白酶在治疗感染性腹泻方面的用途在WO-A-9301800中得到，其中证明菠萝蛋白酶通过蛋白水解作用破坏病原体的肠道受体从而发挥作用，在WO-A-8801506中，认为菠萝蛋白酶使病原体从肠道受体上脱离下来。
Taussig等，Planta Medica，1985，538-539和Maurer等，Planta Medica，1988，377-381都提出菠萝蛋白酶可用于抑制肿瘤生长。US 5,233,406、DE-A-4302060和JP-A-59225122也说明了菠萝蛋白酶在治疗癌症方面的用途。US 5,223,406认为菠萝蛋白酶能够诱导肿瘤坏死因子(TNF)，而DE-A-4302060认为菠萝蛋白酶能够通过肿瘤表面蛋白CD44的结构修饰防止转移。
在WO-A-9400147中描述了各种实验，这些实验证明蛋白水解酶，尤其是菠萝蛋白酶能抑制分泌。此申请也公开了菠萝蛋白酶能降低毒素结合活性并能抑制诸如热不稳定毒素(LT)和霍乱毒素(CT)的毒素及诸如热稳定毒素(ST)的毒素的分泌效应，尽管ST具有与LT和CT非常不同的作用模式。这些观察结果通过菠萝蛋白酶混合物的一个成分茎菠萝蛋白酶看来能调节环核苷酸途径这一事实得到解释，并且这一点在WO-A-9500169中得到进一步讨论。另外，也证明菠萝蛋白酶抑制由钙依赖的途径导致的分泌。
WO-A-9600082也涉及了菠萝蛋白酶并且公开了粗制菠萝蛋白酶能够干涉对生长重要的信号传导途径，尤其是导致生长因子如白细胞介素-2(IL-2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)产生的信号传导途径。此文献认为作为其封闭信号传导途径的能力的结果，菠萝蛋白酶能作用为抗癌剂。另外，依据要处理的细胞类型以及细胞以前是否已活化，菠萝蛋白酶可用作免疫抑制剂或免疫刺激剂。
从现有技术看，菠萝蛋白酶很明显是具有多种不同生理效应的混合物。并不是所有的菠萝蛋白酶组分都已得到鉴定，因此除了我们已描述了其活性的茎菠萝蛋白酶，还不清楚哪一个成分负责菠萝蛋白酶各种不同效应的哪一种。如果菠萝蛋白酶混合物要用作药物，这当然是主要缺点，因为尽管菠萝蛋白酶的一个成分可能产生希望的效果，菠萝蛋白酶混合物的某些其它成分的作用可能产生不利的副作用。
因此，如果产生特定医学活性的菠萝蛋白酶单独成分可以得到分离并且单独施用以便减少副作用的可能性，这将是有益的。
本发明涉及已从菠萝蛋白酶混合物分离的特定组分，该组分看来至少部分地负责免疫调节和抗肿瘤活性。
本发明的组分可以用常规方法，例如层析从菠萝蛋白酶混合物分离。高效液相层析(HPLC)适于此目的，通过快速蛋白液相层析(FPLCTM)，使用装有诸如SP-sepharose的物质的柱子可以得到特别好的菠萝蛋白酶蛋白的分离。正如将在实施例中更详细描述的，在SP-sepharose上使用300ml以上的乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度进行层析，本发明的蛋白是从柱上下来的第三个峰，  出现在第一个主要的茎菠萝蛋白酶峰(从柱下下来的第四个峰)的上升边缘上。
在本发明的第一个方面中，提供了具有由SDS-PAGE测定的约27.45kDa分子量的菠萝蛋白酶组分，它可通过下列方法得到：
i将菠萝蛋白酶溶解于含有0.1mM EDTA钠的pH5.0的20mM乙酸缓冲液中；
ii通过在SP-sepharose HP上快速蛋白液相层析并用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶组分，并且
iii收集对应于从柱下下来的第三个峰的组分，出现在第一个主要的茎菠萝蛋白水解酶峰的上升边缘上。
本发明的菠萝蛋白酶组分，本发明人命名为CCZ，主要负责菠萝蛋白酶的免疫刺激活性，因为已发现其它已知的成分如茎菠萝蛋白酶(SBP)、comosain和ananain几乎不具有免疫刺激活性并且实际上可能作用为免疫抑制剂。本发明人已发现由本发明人命名为CCU的菠萝蛋白酶组分具有F9具有的某些免疫调节活性，F9也包含在菠萝蛋白酶中(Garbin等，国际肿瘤学杂志，(1994)5，197-203)。
同样，因为本发明的菠萝蛋白酶组分含有比粗制菠萝蛋白酶低得多数量的成分，所以它不可能有这么多副作用，并且当用作药剂时其活性可以更清楚地确定。
本发明人已知鉴定并得到了CCZ组分的主要成分的氨基酸序列。认为此蛋白负责CCZ组分的生物学活性。
因此，在本发明的第二方面，提供了作为菠萝蛋白酶组分的蛋白，具有由SDA-PAGE测定的约27.45kDa分子量，具有由等电聚焦测定的等电点9.7，并具有氨基酸序列：
Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp Trp Arg Gln Lys Gly Ala ValThr Glu Val Lys Asn Arg Gly
本发明的CCZ组分能作用为免疫刺激剂和抗癌剂并且认为第二方面的蛋白可能负责这些活性。例如，从WO-A-9301800可知，菠萝蛋白酶混合物是非特异的免疫刺激剂，但是以前已假定一个已知的菠萝蛋白酶成分，可能是茎菠萝蛋白酶负责此活性。现已发现事实并非如此，本发明的蛋白是免疫刺激剂而茎菠萝蛋白酶几乎不具有免疫刺激剂活性。
在本发明另一方面，提供了具有编码第二方面蛋白的序列或与其互补的序列的核酸。这样的核酸的序列可使用标准方法测定。
在本发明另一方面，提供了用于人或畜医药的本发明第一方面的CCZ组分或根据本发明第二方面所述的蛋白。
本发明的CCZ组分的一个用途是免疫刺激剂，因此，也提供了本发明第一方面的CCZ组分和第二方面的蛋白在制备免疫刺激剂方面的用途。
因此，CCZ组分或作为其主要成分的纯化蛋白可用于治疗其中免疫系统受抑制的病症的方法。此方法包括给病人施用有效量的本发明第一方面的CCZ组分或第二方面的蛋白。
因为其刺激免疫反应的能力，菠萝蛋白酶的CCZ组分具有相当大的用于其中病人无免疫应答的很多临床情况的潜力。初级免疫缺陷是遗传异常的结果，而次级免疫缺陷可由营养不良、感染(例如HIV和疟疾)、肿瘤(例如淋巴瘤、骨髓瘤及其它)、创伤(例如灼伤、击伤和手术)、医学治疗(例如用药如类固醇、环孢菌素和环磷酰胺)、蛋白质丢失(如腹泻和灼伤)、糖尿病和老龄引起。
免疫缺陷导致对病毒、原生动物、细菌及真菌感染的易感性提高，并且它与每年的很多死亡相关，对许多国家中相当一部分健康消费负责。
免疫反应具有两个功能性分类：先天免疫系统和获得性免疫系统。当病原体侵入机体时，获得性免疫反应和先天免疫反应都会活化。先天免疫反应在感染因子和大多数潜在病原体建立感染前提供针对它们的第一道防线。在先天免疫的初始阶段，获得性免疫反应正在发展。如果第一道防御被突破，获得性免疫系统应当充分地发展以产生针对感染因子的特异反应，特异反应在正常情况下清除此因子。
本发明的菠萝蛋白酶组分通过刺激获得性和先天免疫作用为免疫调节剂。
首先，它通过增强T细胞活化和增加B细胞产生的抗体来增强获得性免疫。增强的T细胞活化将导致细胞因子如IL-2、IL-3、IL-4、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-1、IL-5、IL-6、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)和FWF-α的产生增加。另外，此蛋白可在病原体特异的获得性免疫反应发展所需的时间期间促进由巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和嗜中性粒细胞介导的先天免疫反应。
先天免疫反应的刺激使菠萝蛋白酶的CCZ组分可用于T或B细胞反应功能不完全的情况。这可发生在次生免疫缺陷如上述的那些免疫缺陷中以及由遗传异常引起的病症如在缺乏功能性T和/或B细胞的严重复合免疫缺陷病人中存在的病症中。
本发明的菠萝蛋白酶组分也可促进T细胞亚类分化并补偿选择性T细胞亚类缺陷。
T细胞分为两个亚群，促进抗体和细胞介导的免疫反应的CD4+或“辅助”T细胞以及杀细胞的CD8+或“细胞毒性”T细胞。两种T细胞群对于机体抵御多种病原体是必需的，任一T细胞群的减少都将有破坏性效应。这可通过CD4+T细胞数目减少的AIDS病人对机会感染的高易感性而得到证明。
CCZ组分在另一T细胞群缺乏时刺激一个T细胞群的能力意味着它可用于治疗其中一个T细胞亚群减少的病人；例如患有bareIymphocyte syndrome(缺乏功能性CD8+细胞)的病人或患有MHCI类缺陷(缺乏功能性CD4+细胞)或患有诸如AIDS病人中发生的各种次生免疫缺陷的病人。
刺激后，CD4+T细胞可分化成参与细胞介导的免疫反应的Th1细胞和参与体液(抗体)介导的反应产生的Th2细胞。已知本发明的蛋白刺激T细胞并且可选择性地影响Th1和/或Th2细胞的发生。因此它可能刺激由Th 1细胞产生的细胞因子如IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF和GM-CSF介导的反应和/或由Th2细胞产生的细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TFG-β介导的反应。
最后，CCZ组分也有刺激T细胞介导的免疫反应的潜力并因此可作用为疫苗佐剂。
除了其作为免疫刺激剂的用途，本发明人已证明CCZ组分能提高干扰素-γ介导的氧化氮(NO)的产生。因此，菠萝蛋白酶的CCZ组分可用于治疗对增加的NO产生应答的疾病或症状。
NO及其衍生物对包括真菌、细菌和病毒的许多病原体具有强的抗微生物活性。这包括寄生虫如baesia、Brugia、Cryptosporidium、Encephalitoxoon、entamoeba、Leishmania、Naegleria、Ochocerca、Opisthorchis、Plasmldium、Schistosoma、Toxoplasma和Trypanosom。受NO影响的细菌包括芽孢杆菌属、布鲁氏菌属、伯克氏菌属、梭状芽孢杆菌属、埃里希氏体属、弗朗西丝氏菌属、克雷伯氏菌属、军团菌属、利斯特氏小菌属、微球菌属、Pseudomonas Rickettsia、沙门氏菌属、葡萄球菌属、耶尔森氏菌属、衣原体尤其是沙眼衣原体和分枝杆菌属如贪食分枝杆菌、麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌。NO具有抵抗真菌如曲霉属、念珠菌属、隐球酵母属、组织孢浆菌属和酵母属和病毒如柯萨奇病毒、Ectomelia virus、脑心肌炎病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病素(Herpes simplex virus)、人免疫缺陷病毒I型、日本脑炎病毒、小鼠肝炎病毒、细小病毒属、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、猿猴病毒40、牛痘病毒和水疱性口腔炎病毒的活性。
CCZ组分在增加NO产生方面的活性赋予其免疫刺激剂活性并意味着CCZ可用作针对诸如上面所列出的寄生虫、细菌、真菌和病毒的抗微生物剂。
因此，在本发明另一方面，提供了本发明的菠萝蛋白酶的CCZ组分或第二方面的蛋白在制备抗微生物剂方面的用途。
本发明人也发现菠萝蛋白酶的CCZ组分具有抗肿瘤活性。多个公开文献也将NO产生与抗肿瘤活性联系起来。例如，Hibbs(1991，免疫学研究142，565-569)已证明在体外，巨噬细胞产生NO时杀死肿瘤细胞。因此，NO的产生增加可能是CCZ组分针对肿瘤作用的机制。然而，CCZ作为抗癌剂的效力不依赖于此理论的正确性。
在另一方面，本发明提供CCZ组分或本发明的第二方面的蛋白在制备抗癌剂方面的用途。
CCZ组分或此蛋白可用于治疗实体瘤或软体瘤或其它肿瘤。可用本发明的蛋白治疗的肿瘤的例子包括卵巢瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、白血病和淋巴瘤。另外，此蛋白可施用于接受癌症化疗的病人以保护免受机会感染。
CCZ组分或此蛋白通常在施用给病人之前经过配制，因此在本发明的另一方面，提供包含本发明第一方面的CCZ组分或本发明第二方面的蛋白及药学上或畜医学上可接受的赋形剂的药物或畜医组合物。
除了其本身作为药剂的用途，CCZ组分或其作为主要成分的蛋白可用作疫苗佐剂，因为在施用疫苗后它刺激免疫系统产生更大量的抗体。
当用作佐剂时，CCZ组分可在疫苗施用之前或之后单独施用。选择性地，它可包含于疫苗组合物中。
因此，在另一方面中，本发明提供包含疫苗、菠萝蛋白酶的CCZ组分或本发明第二方面的蛋白作为佐剂以及药学上或兽医学上可接受的赋形剂或载体的疫苗组合物。
菠萝蛋白酶的CCZ组分可在人或动物疫苗中用作佐剂。此疫苗可以是针对疾病如由病毒、细菌、真菌或原生动物因子引起的疾病或诸如癌症的疾病的疫苗。选择性地，此疫苗可以是设计来为某些其它目的例如在实验动物中产生抗体的制剂。此蛋白也可用于设计为产生针对自身抗原的宿主系统的治疗，例如在自身免疫中。
CCZ组分或此蛋白可通过多种途径施用包括肠道如口、鼻、颊、局部或肛门施用或非肠道施用通过静脉、皮下、肌内或腹膜内途径。
在许多情况下，口腔途径是优选的，因为这是常常病人发现最可接受的途径。如果需要许多剂量的蛋白，例如当CCZ用于治疗其中免疫系统受抑制的病症时，口服途径可能是特别有用的。
如果选择口腔施用，应该将CCZ组分或此蛋白配制成肠衣包的制剂以帮助其经过胃后仍然有效。选择性地，可选用另外一种可口服施用的剂量形式如糖浆、配剂或被肠衣包被的硬或软的明胶胶囊，它们任何之一者可以以肠衣包被。
然而，如果只施用单一剂量，例如当将CCZ组分或蛋白作疫苗佐剂时，用非肠道途径将更为方便。
对非肠道施用，CCZ组分或蛋白可在去离子水或另一种药物上可接受的溶剂或悬浮剂中制成制剂。
由临床医生决定给病人施用的CCZ组分或蛋白的合适剂量。然而，作为指导，合适的剂量为约0.5-20mg/kg体重。期望在大多数情况下，此剂量将为约1-15mg/kg体重，优选地1-10mg/kg体重。对于体重约70kg的人，通常剂量为约70-700mg。
本发明将参照下列实施例和附图得到进一步描述，其中：
图1是在SP Sepharose高效介质中经阳离子交换层析后粗制菠萝蛋白酶的紫外洗脱轮廓；
图2是，表示在SP Sepharose高效介质上经阳离子交换层析后粗制菠萝蛋白酶组分的蛋白水解活性及其蛋白含量的曲线图；
图3是SP Sepharose高效层析汇集的组分在4-20％T梯度胶上的SDS-PAGE，其中1-4泳道和6-9泳道分别包含组分CCT、CCV、CCX和CCZ及CCY、CCW、CCU和CCS，5和10泳道包含分子量标记；
图4表示在pH3-11梯度胶上电泳汇集的组分的等电聚焦，其中1、11和12泳道表示高IEF标记，2和13泳道表示粗制菠萝蛋白酶，3至10泳道分别表示组分CCT、CCV、CCX、CCZ、CCY、CCW、CCU和CCS；并且
图5是表示从粗制菠萝蛋白酶的HPLC得到的组分的比较免疫调节活性的曲线图。CCZ和CCU提高了对T细胞依赖的抗原的B细胞，因此增强了获得性免疫。
图6表示了CCZ提高IFN-γ介导的巨噬细胞产生的亚硝酸盐由此刺激了先天免疫。
图7是一系列曲线，表示了茎菠萝蛋白酶(SBP)和CCZ对肿瘤细胞的体外生长抑制效应。结果通过相当的蛋白数量代表。
图8是与图7中的曲线相似的曲线，但其中的数据被变为代表茎菠萝蛋白酶和CCZ的相当的蛋白水解活性。
图9是茎菠萝蛋白酶和CCZ对CHI卵巢瘤体外生长的生长抑制活性的比较。
实施例1-菠萝蛋白酶蛋白的纯化
a.材料
菠萝蛋白酶来自Solvay Enzymes Inc(德国)。快流速SPSepharose、Pharmalyfe 3-10TM、Ampholine 9-11TM、Ready MixIEFTM(丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺)和IEFTM标记来自pharmaciaBiotech。预灌制的4-20％丙烯酰胺凝胶和大范围分子量标记来自Bio-Rad Laboratories。所有其它试剂是分析级来自SigmaChemical Co.或British Drug House。
b.蛋白酶测定
用合成的底物Z-Arg-Arg-pNA通过使用室内微量滴度板为基础的测定菠萝蛋白酶的水解活性。此测定根据Filippova等在AnalBiochem 143，293-297(1984)描述的为基础进行。底物Z-Arg-Arg-pNA是根据Napper等在生物化学杂志，301，727-735(1994)描述的。
c.蛋白测定
用Bio-Rad提供的试剂盒测定蛋白，它是Lowry等(生物化学杂志(1951)193，265-275)方法的改进。样品与由0.9％盐或20mM乙酸缓冲液pH5.0中的牛血清白蛋白标准(0-1.5mg/ml)进行比较。
d.菠萝蛋白酶的制备
所有的下列步骤在室温(20-25℃)下进行。将450mg粉末溶于15ml含0.1mmEDTA钠的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)中制备菠萝蛋白酶溶液(30mg/ml)。溶液被分散在10个1.5ml微量离心管中于13.000×g离心10分钟以去除不溶物质。汇集澄清的上清用于层析。
e.SP-Sepharose高效层析
将25ml介质填充到XK 16/50TM柱中制备了SP-sepharose柱(pharmacia Biotech)并用含0.1mM EDTA的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)在FPLCTM系统上以3ml/min的速度平衡柱子。将5ml的菠萝蛋白酶溶液加到柱上。收集未结合蛋白并用100ml乙酸缓冲液洗柱。用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M NaCl线性梯度洗脱与柱子结合的蛋白。通过整个梯度收集5ml组分，图1表示从此方法得到的粗菠萝蛋白酶的典型的紫外层析谱。
根据上述分析组分的蛋白和蛋白水解活性，图2表示了对合成肽Z-Arg-Arg-pNA的蛋白水解活性及单个组分的蛋白含量。蛋白含量图反映了u.v.图，这与期望的一致，但主要的蛋白水解活性局限于与菠萝蛋白酶(SBP)一致的两个主要峰。在层析谱其它区域中观察到的小活性可能与菠萝蛋白酶明显不同的其它蛋白酶相一致，如后来洗脱的Ananain和Comasain(CCS)。
从紫外模式图确定的主要峰被从三个连续循环中汇集并根据表1所示的命名。汇集的部分用于物理化学定性。汇集的组分通过超滤浓缩，用PD10柱将缓冲液换成等渗盐溶液(0.9％重量/体积NaCl)。在进行生物检测前计算蛋白浓度和Z-Arg-Arg-pNA活性，示于表2。
根据下文所述对汇集组分进行分析。
表1  从SP Sepharose HP分级分离
的菠萝蛋白酶(QC2322)的汇集组分总结
  组分     描述 汇集的组分(包含的)
  CCT     流过的(未结合成分)     未结合柱流过的
  CCV     从柱上下来的第一个峰     8-9
  CCX     从柱上下来的第二个尖峰     13-14
  CCZ 在第三个主要菠萝蛋白酶峰的上升边缘的小峰     19-20
  CCY     第一个主要的菠萝白酶峰     23-24
  CCW     第二个主要的菠萝白酶峰     27-29
  CCU 在第二个主要菠萝蛋白酶峰的下降边缘上的小峰     33-34
  CCS     从柱上下来的最后两个峰     39-44
表2  用于检测生物学活性的汇集的组分的计算蛋白含量和Z-Arg-Arg-pNA活性
 汇集的组分 Z-Arg-Arg-pNA活性(μMoles/min/ml) 蛋白含量(mg/ml)
 CCT  11.30  1.00
 CCV  9.78  1.00
 CCX  71.71  1.00
 CCZ  688.81  1.00
 CCY  1500.0  0.574
 CCW  1500.0  0.543
 CCU  1500.0  0.421
 CCS  379.76  1.00
f汇集组分的加工
测定汇集组分的蛋白水解活性和蛋白含量，用含有最小排阻分子量10kDa的超滤膜的FiltronTM搅拌水室调节浓度至约1.4mg/ml蛋白或105nmoles/min/ml蛋白活性。然后用PD10TM柱(Pharmacia Biotech)将组分缓冲液换成等渗盐(0.9％wv/Nacl)，无菌过滤(0.2μm)，然后调节蛋白含量或蛋白水解活性。将样品冻存于-20℃，并用Jerne Hemolytic Plaque Assay检测免疫调节活性。
g十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)
通过十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)在预制的4-20％T梯度凝胶上分析汇集的FPLCTM样品。将100μl样品与等体积的20％w/v三氯乙酸(TCA)混合通过酸沉淀制备用于电泳的样品。以13,000xg离心10分钟收集沉淀的蛋白，弃去上清。用0.5ml二乙醚洗涤沉淀两次，室温下空气中干燥沉淀。将沉淀溶解于300μl SDS-PAGE样品缓冲液中(62.5mM Tris-HclpH68含10％v/v甘油、2％w/v十二烷基磺酸钠和40mM二硫苏糖醇)并在水浴中于95℃加热。
SDS-PAGE大范围分子量标准以1∶20于SDS-PAGE样品缓冲液中稀释经过相似的处理后与样品同时电泳。根据Bio-Rad’s说明书以240V在微型Protean IITM电泳系统上进行凝胶电泳，直到染色前沿到达凝胶底端(30-45分钟)。
电泳结束后，分离的蛋白在轨道混合器上于含0.075％w/v胶体亮蓝G-250、1.5％v/v磷酸、11.25％w/v硫酸铵和25％v/v甲醇的溶液染色过夜。在含有25％v/v甲醇和10％v/v乙酸的溶液中对凝胶进行脱色以得到清楚的背景。
结果
组分的纯度通过SDS-PAGE示于图3。除了柱流过(CCT)以外的所有汇集的组分表明存在的主要蛋白的分子量约25-28KDa。这与由其他作者从菠萝蛋白酶分离到的半胱氨酸蛋白酶的分子量相一致(Rowan等，酶学方法；(1994)，244，555-568)。组分CCX、CCZ、CCY和CCW的纯度看上去很高。在某些组分中可观察到低分子量的次要组分，特别是CCT、CCV、CCX和CCS中。汇集的CCU和CCS组分中包含25-28KDa的双重线；较高的CCX、CCZ、CCY和CCW的凝胶上样意味着双重线带可能也存在于这些组分中。组分及其由SDS-PAGE测定的汇集组分的计算的分子量的概括示于表3。
汇集的CCX、CCZ、CCY+CCW和CCU组分中的蛋白经SDS-PAGE后被Western印迹转移至硝酸纤维素膜并用针对纯化的茎菠萝蛋白酶蛋白(SBP)的免抗血清进行探测(结果未显示)。汇集的组分中的所有蛋白带都被血清中的抗体识别，表明免疫性相似的蛋白也许属于半胱氨酸蛋白酶家族。
表3存在于SP Sepharose HP汇集的组分中的蛋白根据SDS-PAGE测定的分子量总结
 汇集的组分  主要蛋白条带的分子量(kDa)  次要蛋白条带的分子量(kDa)
 CCTCCVCCXCCZCCYCCWCCUCCS  76.0315.07，25.85，28.28，76.0325.0827.4527.4527.4527.45，28.2815.07，25.85，27.45  15.0715.07，76.0313.37，16.49，76.036.5
h等电聚集
汇集的组分(0.5-1.0mg/ml)以1∶3稀释于去离子水中并在pH3-11的梯度凝胶上进行电泳。用Ready Mix IEFTM灌制凝胶产生含有10％v/v甘油、5.0％Phrmalyfe 3-10TMt 2.5％Ampholine 9-11TM的5.5％T、3％C的聚丙稀酰胺凝胶。在700V预聚集后，10μl样品和高pI标记被加到凝胶上。500V电泳10分钟使样品进入，2500V电泳1.5小时进行聚焦，3000V电泳10分钟使条带变细。电泳后，蛋白在含有20％W/V TCA的溶液中固定30分钟，在脱色液中洗30分钟以去除TCA，根据SDS-PAGE部分描述的(见上文)，用亮蓝G-250进行染色。
结果
图4表示除CCX外所有组分包含9.3pI标记之外聚焦的碱性蛋白。与层析介质功能基团的局部电荷相互作用可解释为什么CCX中pI3.8和3.85的蛋白在pH5.0时吸附到阳离子交换树脂上。CCZ在pI9.7处表现出一条单一的带，而汇集的CCY、CCW和CCU组分包含在pH9.5-9.8范围内的多条等电点带。至少这种异源性部分可由共同的茎菠萝蛋白酶主链上碳水化合物部分的差异解释。此值与文献中报道的菠萝蛋白酶的pI9.45-9.55相一致(Rowan等，酶学方法，(1994)，244，555-568)。汇集的CCS组分包含两个pI大于10.25的碱性蛋白。外推估计pI为10.4和10.45。这相当于ananain和comasain，并且与其它的(Rowan等，上述)pI大于10的估计一致。在每一个汇集的组分的蛋白质pI概括于表4。
表4  SP Sepharose HP汇集组分中存在的蛋白的估计等电点总结
 汇集的组分 蛋白的等电点
 CCTCCVCCXCCZCCYCCWCCUCCS 未测定未测定3.8，3.859.79.6，9.79.57，9.6，9.79.57，9.6，9.7510.4，10.45
i Western印迹
根据厂商说明，用TransblotTM仪器(Bi0-Racl)以100V在Towbin缓冲液中转移1小时将按上述SDS-PAGE电泳的样品转移至硝酸纤维素膜上(0.45μm孔径)。蛋白转移后，用蒸馏水洗膜然后在60℃培养箱中干燥过夜。干燥后，膜在含有500mM Nacl(Tris缓冲液)的20mM Tris-HCl(pH7.5)的1％BSA溶液中封闭30分钟，然后用Tris缓冲液将膜洗两次，每次10分钟。然后用含0.05％v/v Tween20TM的Tris缓冲液中含有的以1∶50稀释的抗菠萝蛋白酶抗血清(兔)探测膜2小时。用包含Tween20TM的Tris缓冲液洗膜3次并用抗兔辣根过氧化物酶与膜孵育2小时后对印迹显色。通过与四氯荼酚物温育观察免疫反应条带。
实施例2-CCZ蛋白的N端氨基酸分析
在一个单独的实验中，汇集的CCZ组分进行SDS PAGE电泳，按上述方法转移至PVDF膜上。用0.025％w/v考马斯蓝R-250对膜染色，在40％v/v甲醇中溶解10分钟，然后在50％v/v甲醇中脱色。膜在室温下空气干燥，然后对染色的蛋白进行N-端氨基酸序列测定。简单地，将蛋白带从膜上切下放在测序仪的上半部分用装配有联机乙内酰苯硫脲氨基酸分析仪的气相测序仪(Applided Biosystems)，通过Edman降解进行CCZ蛋白N-端氨基酸分析。
表5  CCZ蛋白与已知的从菠萝蛋白酶分离的蛋白酶N端序列的相似性
蛋白酶 距N端的位置
CCZ V L P D S I D W R Q K G A V T E V K N R G1         5       10      15          20
茎菠萝蛋白酶 A V P Q S I D W R D Y G A V T S V K N Q N1         5       10      15          20
Ananain   V P Q S I D W R D S G A V T S V K N Q G1     4         9       14          19
Comasain   V P Q S I D W R N Y G A V T S V K N Q G1     4         9       14          19
所有蛋白具有序列同源性。与茎菠萝蛋白酶相比，Ananain和Comasain在20个氨基酸中只有2个不同。相反，与茎菠萝蛋白酶相比，CCZ中的21个氨基酸有8个不同。CCZ与ananain和comasain的20个氨基酸中有6个不同。尽管很明显这些蛋白是结构相关的，但是CCZ蛋白是最不同的，表明与从菠萝蛋白酶分离的其它蛋白酶有明显差异。CCZ代表粗制菠萝蛋白酶提取物中以前未知的新型蛋白，看来它是植物半胱氨酸蛋白酶家族的新成员。
实施例3-分析分级分离的蛋白的免疫调节活性a材料
雌性BAL B/A小鼠来自A.Tuck和Son Ltd.(UK)。在所有实施中采用8-10周龄之间的小鼠。Alsevers溶液中的绵羊红血细胞(SRBC)购自TCS Biologicals(Buckingham，UK)。脉鼠补体购自Gibco La boratories。其它试剂均为分析级，购自SigmaChemical Co。
b Jerne溶血板实验
Jerne溶血板实验(Weir，D.M.(编辑)，1986，实验免疫学手册，1-4，第4段，Blackwell Scientific Publications，OxfordUK)用于分析分级分离蛋白的佐剂潜力。实验用两次单独制备的菠萝蛋白酶分级分离样品进行。每一个样品有一个独特的编号(表1)，如果适合，通过超滤(见实施例1(f))将样品渗滤浓缩到等渗盐溶液中。所有的实验以双盲方式进行。
根据表6所示，用粗制菠萝蛋白酶、分级分离的蛋白或盐溶液静脉注射小鼠一次。粗制菠萝蛋白酶(200μg；1500μmoles/min/ml)被悬浮于0.9％(200μl)盐溶液中并在施用前立即过滤除菌。分级分离样品(200μl)同样地过滤除菌。用灭菌盐溶液处理的小鼠用作对照。1500μmoles/min/ml粗制菠萝蛋白酶的剂量速度相当于Sigma Aldrich Ltd的Materials Safety Datasheet所给出的菠萝蛋白酶LD50的约三分之一。在施用粗制菠萝蛋白酶、分级分离蛋白或盐溶液后，通过腹膜内注射绵羊红血细胞(SRBC)(100μl；107细胞)免疫小鼠。用盐溶液(100μl)单独处理的小鼠作为阴性对照。免疫后3天处死小鼠，在这个时候取出脾并通过尼龙网滤器过滤分离脾细胞。用Jerne溶血板实验测定产生针对SRBC抗原抗体的B细胞的数目(即每106脾细胞的蚀斑形成细胞(PFC)。
c数据分析
以平均数±标准差表示数值。用独立t-检验(斯氏t检验；2-向)检验PFC平均数之间的差异。当一个以上的处理的平均数与对照相比时，采用方差分析(ANOVA)。
d结果
Jerne溶血板实验结果示于图5和表6。
表6 PFC形成(分泌针对SRBC抗体的B细胞数目)
组     处理 动物号  平均PFC/106脾细胞  中间值(范围) 标准差
F  茎菠萝蛋白酶+SRBC     8     68   65(1-147) 47
L  盐溶液+SRBC     8     29   28(21-40) 7
S  CCS+SRBC     6     50   47(13-90) 28
T  CCT+SRBC     3     42   26(13-86) 32
U  CCU+SRBC     6     86   94(25-123) 35
V  CCV+SRBC     6     44   35(3-90) 34
W/Y  SBP+SRBC     9     46   37(4-112) 29
X  CCX+SRBC     6     49   39(8-98) 33
Z  CCZ+SRBC     6     102   95(68-106) 31
与盐溶液对照相比，粗制菠萝蛋白酶(QC2322)的施用导致了PFC的明显增加(菠萝蛋白酶PFC/106脾细胞，68±47；盐溶液对照，29±7；P＜0.05)。分级分离的蛋白CCZ和CCU也诱导比盐溶液对照明显高的PFC(分别为102±31和86±31PFC/106脾细胞；P＜0.002)，比粗制菠萝蛋白酶提取物产生的PFC多。CCZ和CCU成分与描述详尽的茎菠萝蛋白酶、comosain、ananain和F9酶从FPLCTM柱的洗脱不同，表明CCZ和CCU是不同的分子。当检测纯化的茎菠萝蛋白酶(CCW和CCY成分的联合)的佐剂效应时，结果显示很小的PFC增加(46±29PFC/106脾细胞)表明茎菠萝蛋白酶不是负责菠萝蛋白酶佐剂活性的成分。相似地，ananain和comosain(CCS)也具有很小的免疫调节活性。所以，粗菠萝蛋白具有很小的佐剂效应并不归因于原来认为具有免疫用的粗制混合物的成分。某些检验的成分有比对照高的PFC(与茎菠萝蛋白酶相似)，但这些值没有明显的不同。这些成分及茎菠萝蛋白酶中观察到的PFC的轻微升高与以前将胰蛋白酶施用于小鼠时观察到的相似，反应或许应归功于非特异的蛋白水解效应。
实施例4-CCZ提高巨噬细胞产生硝酸盐，所以能刺激先天免疫 反应
实施例3表明CCZ通过增强对T细胞依赖抗原的B细胞反应提高获得性免疫反应。我们下一步通过探讨其对参与先天免疫的主要细胞群，巨噬细胞的效应探讨CCZ是否能增强先天免疫。
对细胞内寄生虫的主要的宿主防御机制是巨噬细胞产生氧化氮(NO)。所以，我们探讨了是否CCZ能够影响NO产生。
a材料
用重组IFN-γ(100u/ml)刺激培养的鼠巨噬细胞系RAW264。用Greiss实验(Roach等(1991)，感染与免疫，59，3935-3944)测定培养上清中的硝酸盐水平。
b方法
用CCZ(50μg/ml)、粗制菠萝蛋白酶(50μg/ml)或茎菠萝蛋白酶(50μg/ml)处理或以盐溶液模拟处理RAW264巨噬细胞。然后洗细胞三次去除处理剂并用IFN-γ刺激细胞。
c结果
粗制菠萝蛋白酶和CCZ，而不是茎菠萝蛋白酶显著提高IFN-γ介导的硝酸盐产生(图6)。在CCZ处理的细胞中，IFN-γ硝酸盐产生增加比盐溶液处理细胞明显高，表明CCZ与IFN-γ协同作用提高NO产生。当用CCZ或菠萝蛋白酶单独刺激巨噬细胞时，几乎不产生硝酸盐，提示CCZ和茎菠萝蛋白酶都不能刺激硝酸盐产生。为了保证已经存在于CCZ混合物中的可能污染的内毒素负责NO的提高，实验中包含了多粘菌素B(内毒素的强有力的抑制剂)。多粘菌素B的包含并不影响IFN-γ诱导的CCZ处理细胞中NO的产生，暗示可能污染的内毒素不负责观察到的效应(数据未显示)。
考虑到氧化氮产生对于宿主对细胞内病原体抵御的重要性，CCZ刺激巨噬细胞特定产生这种代谢物的能力暗示它可控制多种细胞内感染。
实施例5-菠萝蛋白酶片段对一系列人肿瘤细胞系的体外生长抑 制。
除了在宿主对感染防御中的关键作用外，NO也表明是强有力的杀肿瘤细胞剂。Hibbs(1991，免疫学研究，142，565-569)已表明当巨噬细胞产生NO时，它们在体外杀死肿瘤细胞。因此氧化氮在肿瘤治疗中可能有用(Sagar等，(1995)，肿瘤治疗综述，21，159-181)。因此，我们研究(CCZ是否能够在体外阻断几种不同人肿瘤细胞系的生长并因此作用为抗癌剂。测定了CCZ蛋白和茎菠萝蛋白酶对代表五种最常见人实体瘤十五种人肿瘤细胞系的比较生长抑制特性：卵巢瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。
消化细胞系并将单个活细胞以每孔4×103的密度用160∶1生长培养基接种于96孔微量滴定板上。贴壁培养过夜后，将CCZ、SBP或菠萝蛋白酶加到四个孔的生长培养基中，得到孔中的终浓度范围为50、10、2.5、1和0.25g/ml。8个孔作为未处理细胞对照。在加到孔中之前立即用无菌水稀释提取物。根据以前描述的(Kelland等于，癌症研究，53，2581-2586(1993))，抽提物暴露96小时后，用溶于1％乙酸中的0.4％硫氰酸盐染色以测定每个孔中的细胞数目。从浓度比％对照吸光度(在540nm处读)曲线上计算50％抑制浓度(IC50以g/ml)。
结果
提取物被成功地溶解，IC值示于图7。
从图7中看出，CCZ蛋白在体外表现出对所有细胞系的能力与QC2322(粗制菠萝蛋白酶)和茎菠萝蛋白酶的相当。CCZ对所有15个系表现的平均IC50为11.9μg/ml，对SKOV-3(卵巢瘤)、LOVO(结肠癌)、MDA231(乳腺癌)、MDA361(乳腺癌)和MOR(肺癌)的活性普遍较低。
在此实施例中所用的方法依赖于检测吸附于微量板孔上的细胞。用菠萝蛋白酶组分处理后对细胞染色测定生长抑制活性。死的或将要死的细胞从孔上脱离下来从而不被染色。用高浓度的酶如胰蛋白酶处理也能使细胞从孔上下来；一种被称为“胰酶消化”的方法。因此，CCZ和菠萝蛋白酶的生长抑制活性由于蛋白水解活性使细胞从孔上非特异的移下来导致的而不是这些组分的特异的“抗肿瘤”效应。
鉴于此，图7中给出的结果调整每一组分的蛋白水解活性。调整的结果示于图8。
用这种解释，从图8看出得到了有些不同的结果分析。一旦考虑到每一组分的蛋白水解活性，可以看出CCZ比粗制菠萝蛋白酶或茎菠萝蛋白酶明显更高的抗癌活性。
为了证实CCZ的确具有生长抑制活性，粗制菠萝蛋白酶、茎菠萝蛋白酶和CCZ被稀释成包含有相当量的蛋白水解活性(5.7μmoles/min/nl)并检测其阻止CH1卵巢瘤生长的能力。图9证实CCZ的确比粗菠萝蛋白酶或茎菠萝蛋白酶更强有力的生长抑制活性。
                            序列表
(1)基本信息
  (i)申请人：
    (A)名称：CORTECS(UK)LIMITED
    (B)街道：FIRST FLOOR，OSPREY HOUSE
    (C)城市：LOWER SQUARE
    (D)州名：ISLEWORTH，MIDDLESEX
    (E)国家：LONDON，ENGLAND
    (F)邮政编号：TW7 6BN
    (A)名称：MYNOTT，Tracey，Lehanne
    (B)街道：IMPERIAL COLLEGE OF SCIENCE
             TECHNOLOGY&MEDICINE
    (C)城市：DEPT OF BIOCHEMISTRY
    (D)州名：EXHIBITION RD，
    (E)国家：LONDON，UNITED KINGDOM
    (F)邮政编号：SW7 2AZ
    (A)名称：ENGWERDA，Christian
    (B)街道：LONDON SCHOOL OF HYGIENE &
             TROPICAL MEDICINE
    (C)城市：DEPT OF MEDICAL PARASITOLOGY
    (D)州名：KEPPEL STREET，
    (E)国家：LONDON，UNITED KINGDOM
    (F)邮政编号：WC1E 7HT
    (A)名称：PEEK，Keith
    (B)街道：CORTECS(UK)LIMITED
      (C)城市：RESEARCH&DEVELOPMENTDIV
      (D)州名：NEWTECHSQUARE，
      (E)国家：DEESIDEINDPARK，UK
      (F)邮政编号：CH52NT
  (ii)发明名称：菠萝蛋白酶成分
  (iii)序列数：4
  (iv)计算机可读形式：
      (A)介质类型：软盘
      (B)计算机：IBM PC兼容机
      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
      (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)
  (v)目前申请资料：
      (A)申请号：WO PCT/GB98/00591
(2)关于SEQ ID NO：1的信息：
  (i)序列特征
      (A)长度：21个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
  (ii)分子类型：肽
  (iii)假设：否
  (v)片段类型：N末端
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp Trp Arg Gln Lys Gly Ala Val Thr Glu
1               5                   10                  15
Val Lys Asn Arg Gly
            20
(2)关于SEQ ID NO：2的信息：
  (i)序列特征
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：否
(v)片段类型：N末端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Ala Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Thr Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asn Gln Asn
            20
(2)关于SEQ ID NO：3的信息：
  (i)序列特征
    (A)长度：20个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
  (ii)分子类型：肽
  (iii)假设：否
  (v)片段类型：N末端
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Ser Gly Ala Val Thr Ser Val
1               5                   10                  15
Lys Asn Gln Gly
            20
(2)关于SEQ ID NO：4的信息：
  (i)序列特征
    (A)长度：20个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：否
(v)片段类型：N末端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asn Tyr Gly Ala Val Thr Ser Val
1               5                   10                  15
Lys Asn Gln Gly
            20

Claims (15)

1.一种分离的蛋白，由SDS-PAGE测定其分子量为27.45KDa，由等电聚焦测定其等电点为9.7，并具有氨基端序列：
Val-Leu-Pro-Asp-Ser-Ile-Asp-Trp-Arg-Gln-Lys-Gly-Ala-Val-Thr-Glu-Val-Lys-Asn-Arg-Gly；
该分离蛋白是可通过下列方法得到的菠萝蛋白酶组分：
i.将菠萝蛋白酶溶解于含有0.1mM EDTA钠的pH5.0的20mM乙酸缓冲液中；
ii.通过在SP-Sepharose HP上快速蛋白液相层析，用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶成分；并且
iii.收集对应于从柱上下来的第三个峰的组分，其出现在第一个主要的茎菠萝蛋白水解酶峰的上升边缘。
2.编码如权利要求1中所述的分离蛋白的分离核酸。
3.一种分离的核酸，其与权利要求2所述的分离核酸互补。
4.如权利要求1所述的分离蛋白在制备用于人或兽医药的药物中的用途。
5.如权利要求1所述的分离蛋白在制备免疫刺激剂中的用途。
6.如权利要求5中所述的用途，其中的免疫刺激剂用于治疗初级免疫缺陷或者由营养不良、感染、肿瘤、创伤、利用药物进行的医学治疗、蛋白丢失、糖尿病或老龄导致的次级免疫缺陷。
7.如权利要求6中所述的用途，其中的免疫刺激剂是疫苗佐剂。
8.如权利要求1所述的分离蛋白在制备抗微生物剂方面的用途。
9.如权利要求1所述的分离蛋白在制备抗癌剂方面的用途。
10.如权利要求9中所述的用途，其中抗癌剂用于治疗卵巢瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、白血病或淋巴瘤。
11.一种兽医组合物，其中包含权利要求1的分离蛋白及兽医上可接受的赋形剂或载体。
12.一种疫苗组合物，其中包含疫苗、含有权利要求1的分离蛋白的佐剂及药学上或兽医上可接受的赋形剂或载体。
13.如权利要求12所述的疫苗组合物，其被配制成用于肠道、鼻、颊或肛门施用。
14.如权利要求12所述的疫苗组合物，其被配制成用于非肠道施用。
15.如权利要求14所述的疫苗组合物，其被配制成经静脉内、皮下、肌内或腹膜内途径给药。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6303898A (en) 1997-02-25 1998-09-18 Cortecs (Uk) Limited Component of bromelain
US20020102253A1 (en) 1997-02-25 2002-08-01 Mynott Tracey Lehanne Component of bromelain
DK1096951T3 (da) * 1998-07-15 2002-10-21 Ursapharm Arzneimittel Gmbh Anvendelse af bromelainproteaser til inhiberingen af blodkoaguleringen
AU2845400A (en) * 1998-12-24 2000-07-31 Phairson Medical Inc. Treatment and prevention of immune rejection reactions
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US20040185055A1 (en) * 2001-03-19 2004-09-23 Glenn Gregory M Transcutaneous immunostimulation
CN108472341A (zh) * 2015-08-20 2018-08-31 安纳塔拉生命科学有限公司 具有抗炎活性的酶级分
JP2023522297A (ja) * 2020-03-20 2023-05-30 ノーベル コンセプツ メディカル リミテッド コロナウイルス感染症を処置及び予防するための組成物及び方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8724728D0 (en) * 1987-10-22 1987-11-25 Genzyme Corp Cysteine proteinase
IL105699A0 (en) * 1992-06-26 1993-09-22 Genzyme Corp Hydrophilic creams for delivery of therapeutic agents
JPH08503691A (ja) * 1992-06-30 1996-04-23 コーテックス リミテッド 下痢の治療における酵素、特にブロメラインの使用
US5387517A (en) * 1994-03-23 1995-02-07 Ethicon, Inc. Thiol activated protease from stem bromelain for treating devitalized tissue
GB9412711D0 (en) * 1994-06-24 1994-08-17 Cortecs Ltd Medical use of bromelain

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