CN100400659C - 菠萝蛋白酶成分 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及主要负责菠萝蛋白酶阻断MAP激酶级联反应能力的菠萝蛋白酶成分。成分包含ananain和comosain并在治疗或预防由T细胞活化或MAP激酶通路活化介导的疾病和病症方面有用。

Description

菠萝蛋白酶成分
本发明涉及菠萝蛋白酶成分。具体地，本发明涉及此菠萝蛋白在医学，尤其作为抗癌剂和免疫剂方面的用途。
茎菠萝蛋白酶(菠萝蛋白酶)是在凤梨科植物组织中发现的蛋白水解酶的统称。它是来自凤梨植物(Ananas comosus)茎的各种成分的混合物。已知菠萝蛋白酶包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶；它也可包含淀粉酶和纤维素酶活性。另外，也存在多种其它成分。
菠萝蛋白酶曾用于治疗多种病症包括炎症，具体地，它已用于治疗腹泻。菠萝蛋白酶在治疗感染性腹泻方面的用途在WO-A-9301800中得到，其中证明菠萝蛋白酶通过蛋白水解作用破坏病原体的肠道受体从而发挥作用，在WO-A-8801506中，认为菠萝蛋白酶使病原体从肠道受体上脱离下来。
Taussig等，Planta Medica，1985，538-539和Maurer等，Planta Medica，1988，377-381都提出菠萝蛋白酶可用于抑制肿瘤生长。US 5,233,406、DE-A-4302060和JP-A-59225122也说明了菠萝蛋白酶在治疗癌症方面的用途。US 5,223,406认为菠萝蛋白酶能够诱导肿瘤坏死因子(TNF)，而DE-A-4302060认为菠萝蛋白酶能够通过肿瘤表面蛋白CD44的结构修饰防止转移。
在WO-A-9400147中描述了各种实验，这些实验证明蛋白水解酶，尤其是菠萝蛋白酶能抑制分泌。此申请也公开了菠萝蛋白酶能降低毒素结合活性并能抑制诸如热不稳定毒素(LT)和霍乱毒素(CT)的毒素及诸如热稳定毒素(ST)的毒素的分泌效应，尽管ST具有与LT和CT非常不同的作用模式。这些观察结果通过菠萝蛋白酶混合物的一个成分茎菠萝蛋白酶看来能调节环核苷酸途径这一事实得到解释，并且这一点在WO-A-9500169中得到进一步讨论。另外，也证明菠萝蛋白酶抑制由钙依赖的途径导致的分泌。
本发明已研究了菠萝蛋白酶的各种生物效应，并且具体地其在已得到很好证明的胞内信号转导模型中的效应，即T细胞受体(TCR)/CD3信号转导和IL-2合成。近年来的重要进展已导致对TCR啮合(engagement)后出现的生化事件的理解(Cantrell，Annu.Rev.Immunol.14，259-274，(1996))，因此TCR信号转导提供了阐明生物活性化合物效应的极好模型。有效的T细胞活化需要两个信号。第一个信号由TCR/CD3复合物在与由抗原呈递细胞(APC)上表达的主要组织相容性复合物(MHC)呈递的抗原肽啮合后产生(Cantrell，1996)。另外，共刺激信号通过T细胞上的CD28受体与APC上的B7家族配体连接产生。参与将受体发出的信号转导入细胞核的信号转导途经中主要成分是有丝分裂活化的蛋白激酶(MAPk)家族。这些激酶中得到最好研究的是胞外信号调控蛋白激酶(ERK)-1和ERK-2(也分别称为P44MAPK和P42MAPK)。ERK是丝氨酸/苏氨酸激酶，活化时在酪氨酸和苏氨酸残基磷酸化。MAPk家族相对更新发现的成员是Jun NH2-端激酶(JNK)，它以46kDa和55kDa形式存在，活化时也需要磷酸化作用。ERK活化依赖于P56Lck和TCR/CD3复合物与P21Ras的偶联，随后是Raf1/MEK1/ERK激酶级联反应的活化。JNK活化也需要P21Ras以及由CD28共刺激受体产生的信号，CD28共刺激受体活化GTPC鸟嘌呤核苷三磷酸结合蛋白(如Rac1或Cdc42)，GTP结合蛋白诱导PAK/MEKK/SEK/JNK激酶级联反应。活化的ERK使Etk-1磷酸化，继而介导JNK磷酸化c-Jun后的c-Fos活性的诱导。活化的c-fos和c-jun结合以形成IL-2合成所需的AP-1蛋白。上述事件总结于图1中。所有上述信号转导事件需要酪氨酸磷酸化作用，因为蛋白酪氨酸激酶(PTK)的抑制剂抑制与TCR刺激相关的很多事件，包括T细胞活化和IL-2合成。
在WO-A-9600082中，我们证明菠萝蛋白酶能抑制酪氨酸磷酸化作用和通过ICR或用佛波酯加钙离子载体结合刺激的T细胞中ERK-2的活化。我们现已发现，与ERK活性降低相关，菠萝蛋白酶降低用佛波酯和离子载体刺激的细胞中IL-2、IL-4和IFN-γmRNA的积累，但不影响通过TCR刺激的细胞中细胞因子mRNA的积累。此资料证明参与T细胞中细胞因子合成的TCR活化的、不依赖ERK的通路的存在。
从现有技术看，菠萝蛋白酶很明显是具有多种不同生理效应的混合物。并不是所有的菠萝蛋白酶组分都已得到鉴定，因此除了我们已描述了其活性的茎菠萝蛋白酶，还不清楚哪一个成分负责菠萝蛋白酶各种不同效应的哪一种。如果菠萝蛋白酶混合物要用作药物，这当然是主要缺点，因为尽管菠萝蛋白酶的一个成分可能产生希望的效果，菠萝蛋白酶混合物的某些其它成分的作用可能产生不利的副作用。
因此，如果产生特定医学活性的菠萝蛋白酶单独成分可以得到分离并且单独施用以便减少副作用的可能性，这将是有益的。我们现已鉴定了粗制菠萝蛋白酶负责其抑制ERK活化并因此阻断MAP激酶通路的能力的活性组分。尽管不是单一蛋白，但此组分只由少数成分组成，因此当它施用给病人时副作用的可能性与粗制菠萝蛋白酶相比大大降低。
本发明的组分(本发明人称CCS)可以用常规方法，例如层析从菠萝蛋白酶混合物分离。高效液相层析(HPLC)适于此目的，通过快速蛋白液相层析(FPLCTM)，使用装有诸如S-sepharose的物质的柱子可以得到特别好的菠萝蛋白酶蛋白的分离。正如将在实施例中更详细描述的，在S-sepharose上使用300ml以上的乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度进行层析，本发明的蛋白是从柱上下来的最后双峰。
在本发明的第一方面中，提供了包含具有由SDS-PAGE测定的约15.07kDa、25.85kDa和27.45kDa分子量并具有等电点10.4和10.45的蛋白的菠萝蛋白酶成分，它可通过下列方法得到：
i.将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中；
ii.通过在S-Sepharose上快速高效液相层析，用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分；
iii.收集对应于从柱上下来的最后双峰的组分；并且
iv.从(iii)中收集的组分分离蛋白。
此组分，称为CCS，已发现具有许多潜在有用的活性。首先，我们已发现它阻断ERK-2磷酸化作用并因此阻断MAP激酶级联反应。另外，它阻断IL-2合成和CD4+T细胞增殖。然而，CCS不影响Splenocyte增殖，这说明它具有选择性作用模式。CCS也区分地阻断人肿瘤细胞系包括卵巢瘤、肺癌、结肠癌、黑色素瘤和乳腺癌的生长。CCS针对不同细胞系的不同活性进一步证明CCS有选择性作用模式，并且它也可作用为抗癌剂。CCS对ERK-2的抑制效应依赖于其蛋白水解活性，因为选择性半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64可清除CCS的效应。
尽管在WO-A-9724138中，我们说明了蛋白酶一般能减弱MAP激酶的活化，但是我们现已发现并不是这样，因为胰岛素不消除T细胞信号传导，并且实际上在其它研究中已证明增强MAPk活化(Belham等，1996，生物化学杂志，320，939-946)。凝血酶，参与血凝结级联反应的蛋白酶，也已证明增加MAP激酶活化(Vouret-Craviari等，1993，生物化学杂志，289，209-214)。本发明人现已证明包含在粗制菠萝蛋白酶混合物内的其它蛋白酶不阻断MAP激酶通路的活化。
有可能T细胞中CCS对MAP激酶通路的影响是由细胞表面特异蛋白水解效应介导的。已知菠萝蛋白酶切割CD45RA同工型并选择性地从人PBMC去除其它表面分子。菠萝蛋白酶也从T细胞表面部分地去除CD4。既然CD45和CD4在TCR介导的T细胞活化中起专门刺激作用，那么CCS可以通过影响这些分子干扰TCR信号转导。尽管CD45和CD4对于TCR发出的信号转导的重要性已得到广泛认同，但是可能忽视了它们对于通过使用佛波酯和钙离子载体的活化T细胞的必需性。佛波酯和离子载体的联合使用可恢复已通过使用酪氨酸激酶抑制剂使TCR刺激失去控制或CD45成P45Lck缺陷的T细胞的正常功能。
然而，在目前的研究中，本发明人已证明当用PMA加离子载体处理时，用CCS预处理的T细胞的正常功能不能恢复。因此CCS对ERK-2的抑制效应不认为是通过对T细胞上CD45或CD4的影响介导的。CCS可能影响一个仍未得到鉴定的表面分子，继而影响MAP激酶通路。因此CCS对T细胞信号转导的抑制效应不是因为化合物的毒性，因为CCS不影响splenocyte或GA15细胞生存力。细胞生存力在CCS存在的情况下培养超过48小时的时间不受明显影响。
既然我们已表明来自粗制菠萝蛋白酶的组分CCS阻断MAP激酶通路的活化并阻断T细胞活化，那么CCS可用于治疗T细胞介导的疾病。
除了其对于IL-2合成和T细胞活化的重要性，MAP激酶通对于生长因子如上皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PGDE)和胰岛素样生长因子(IGF)的合成也是重要的。因此CCS将阻断它们和其它生长因子的合成和其它细胞因子如IL-4、IFN-γ、GM-GSF等的合成。
而且，如上所简述的，CCS很有希望具有在治疗癌症方面的用途。
因此，CCS可用于治疗或预防由下列因素介导的疾病或病症：
i.T细胞的活化；
ii.MAP激酶通路的活化；或
iii.生长因子或细胞因子的合成；
或用于治疗或预防癌症。
在本发明的第二方面中，提供了包含具有由SDS-PAGE测定的约15.07kDa、25.85kDa和27.45kDa分子量并具有等电点10.4和10.45的蛋白的菠萝蛋白酶成分，它可通过下列方法得到：
i.将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中；
ii.通过在S-Sepharose上快速高效液相层析，用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分；
iii.收集对应于从柱上下来的最后双峰的组分；并且
iv.从(iii)中收集的组分分离蛋白。
用于医药学，具体地用于治疗或预防由下列因素介导的疾病或病症：
i.T细胞的活化；
ii.MAP激酶通路的活化；或
iii.生长因子或细胞因子的合成；
或用于治疗或预防癌症。
基于对菠萝蛋白酶CCS组分的进一步分析，本发明人已发现，它包含一个以上成分。对组分中蛋白的测序表明它由半胱氨酸蛋白酶ananain和comosain及其它各种成分组成。
因此，看来ananain和comasain或这两种的混合物可能负责菠萝蛋白酶CCS组分的活性。
在本发明的另一方，提供了ananain、comosain、ananain和comosain的混合物或菠萝蛋白酶的CCS组分在制备用于治疗或预防由下列因素介导的疾病或病症的制剂方面或治疗或预防癌症方面的用途：
i.T细胞的活化；
ii.MAP激酶通路的活化；或
iii.生长因子或细胞因子的合成。
在我们先前的申请WO-A-9600082中，我们讨论了粗制菠萝蛋白酶对MAP激酶级联反应的抑制。然而那时我们不能决定粗制菠萝蛋白酶混合物的哪种成分负责此活性，尽管我们推测它可能是茎菠萝蛋白酶。我们现已发现除了阻断环状核苷酸通路，茎菠萝蛋白酶确实具有针对MAP激酶通路的一些活性。然而，它在阻断MAP激酶级联反应方面远远不如本发明的菠萝蛋白酶的CCS组分有效。的确，我们现已发现菠萝蛋白酶的CCS组分在阻断MAP激酶活化方面比茎菠萝蛋白酶活性大十倍数值范围内。
T细胞中MAP激酶通路活化以合成IL-2和推动细胞克隆扩充是免疫反应的必需成分。此过程的缺失会有如能在患有AIDS或导致T细胞缺陷的遗传突变的人们中观察到的致命后果。然而，T细胞的活化也会导致有害后果。例如，如果自身反应(autoreactive)T细胞活化，将产生自身免疫疾病。在此CCS有可能具有在治疗自身免疫疾病如风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化、克罗思氏病和狼疮方面的用途。
而且，T细胞对移植组织特异的活化会导致移植排斥，因此CCS也可能具有防止这种情况的用途。
过敏原特异的T细胞的活化会导致过敏反应。炎性细胞因子和其它细胞产物如组胺在与过敏原接触后从细胞释放。组胺和炎性细胞因子的释放包括MAP激酶通路，因此用CCS阻断MAP激酶通路很可能是对过敏的有效治疗。
另外，CCS很可能具有在防止中毒休克和其它由细菌内毒素的过量表达介导的疾病方面的用途。中毒休克由来自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)的合成介导。LPS通过巨噬细胞中MAP激酶通路的活化激发TNF-α和白细胞介素-1的合成。这些细胞因子的分泌引起免疫系统其它细胞(包括T细胞)中细胞因子的合成，这导致白细胞增多、休克、血管内凝血和死亡。
CCS的进一步用途是防止编程性细胞死亡(细胞程序性死亡)。这是刺激细胞破坏其自身DNA和使其死亡的特殊事件。这在大多数免疫应答中是必需的事件(以防止太多细胞的积累)，但在一些情况下如在HIV感染和老龄时也会有免疫抑制的后果，以致太多细胞死亡，剩下的不足以抵抗感染(Perandones等，1993，免疫学杂志，151，3521-3529)。因为细胞程序性死亡依赖特异细胞信号传导事件包括MAP激酶通路的活化，所以CCS很有希望在阻断细胞程序性死亡方面是有效的。
如在某些慢性寄生感染如慢性granulatomas病如结核样麻风、血吸虫病和内脏利什罗病中可以发现的，T细胞在慢性病中的持续活化也会导致病理学后果。而且，寄生物和病原体的侵入和它们随后在细胞中的存活依赖于这些生物利用宿主细胞信号转导通路(Bliska等，1993，细胞，73，903-920)。例如，已证明沙门氏菌使MAP激酶磷酸化，这使得细胞可以通过巨噬细胞内细胞化(endocytosed)(Galan等，1992，自然，357，588-589)。然后细菌增殖并破坏细胞。因为已证明CCS修饰宿主信号转导通路，并且具体地抑制MAP激酶，所以其另一潜在应用将是抑制寄生物和病原体的侵袭和它们在细胞内的存活。
CCS也可能具有用于治疗癌症的用途，的确我们已证明CCS能在体外阻断人肿瘤生长。CCS抗肿瘤作用机理仍有待于确定，但看来很可能是阻断ERK-2通路活化的结果。
如以前所述的，MAP激酶活化依赖于p21Ras和Raf-1，它们是重要的癌基因。p21Ras和Raf-1蛋白有助于延迟信号从细胞表面上的生长因子受体到MAP激酶以刺激细胞增殖或分化。致癌的(或突变的)p21Ras或Raf-1基因产生缺陷型蛋白，它获得了独立于外来提供的生长因子的独立性，并且同时可能不再对外来的生长抑制信号反应。因此突变的p21Ras或Raf-1蛋白是持续功能亢进的，并且它们无法控制的催化活性对控制细胞生长有有害影响。因此致癌的p21Ras或Raf-1基因通过阻断对细胞增殖和分化的正常控制促使癌症和肿瘤的形成。大约30％的人类癌症有P21Ras基因内的突变。
如果由P21Ras或Raf-1传递的信号可以经由MAP激酶受到阻断，那么CCS预期会阻断癌和肿瘤的生长。因此，本发明的组分可用于治疗各种不同类型的癌症包括实体癌如卵巢瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌和黑色素瘤以及非实体瘤和白血病。
本发明的菠萝蛋白酶组分通常在施用给病人之前经过配制，因此在本发明的另一方面，提供包含菠萝蛋白酶的CCS组分及药学上或畜医学上可接受的赋形剂的药物或畜医组合物。
CCS组分可通过多种途径施用包括肠道如口、鼻、颊、局部或肛门施用或非肠道施用通过静脉、皮下、肌内或腹膜内途径。
在许多情况下，口腔途径是优选的，因为这常常是病人发现最可接受的途径。如果需要大剂量的蛋白，口服途径可能是特别有用的。
如果选择口服给药，可以将CCS组分配制成肠溶包衣制剂以帮助其经过胃后仍然有效。选择性地，可选用另一种可口服给药的剂量形式如糖浆、配剂或硬或软的明胶胶囊，它们任何之一都可以是肠溶包衣的。
然而，在某些情况下，用非肠道途径将更为方便。对于非肠道施用，蛋白可在去离子水或另一种药学上可接受的溶剂或悬浮剂中配制。
给病人施用的CCS组分的合适剂量由临床医生决定。然而，作为指导，合适的剂量可以是约0.5-20mg/kg体重。预期在大多数情况下，此剂量将为约1-15mg/kg体重，优选地1-10mg/kg体重。因此对于体重约70kg的人，通常剂量将为约70-700mg。
本发明将参照下列实施例和附图得到进一步描述，其中：
图1是与T细胞活化相关的导致IL-2合成的信号转导事件的图示。
图2是在SP Sepharose高效介质上阳离子交换层析后粗制菠萝蛋白酶的紫外洗脱轮廓。
图3是表示在SP Sepharose高效介质上阳离子交换层析后粗制菠萝蛋白酶组分的蛋白水解活性和蛋白含量的曲线图
图4是SP Sepha rose高效层析汇集的组分在4-20％T梯度胶上电泳的SDS-PAGE，其中1-4泳道和6-9泳道分别包含组分CCT、CCV、CCX和C CZ及CCY、CCW、CCU和CCS，5和10泳道包含分子量标记。
图5表示在pH3-11梯度胶上电泳汇集的组分的等电聚焦，其中1、11和12泳道表示高IEF标记，2和13泳道表示粗制菠萝蛋白酶，3至10泳道分别表示组分CCT、CCV、CCX、CCZ、CCY、CCW、CCU和CCS。
图6是使用抗磷酸酪氨酸的多克隆抗体(mAb)、证明CCS减弱p42kda(ERk-2)蛋白的酪氨酸磷酸化作用的Western印迹。Tho细胞用菠萝蛋白酶组分(50μg/ml)处理30分钟，洗涤，然后用PMA(20ng/ml)和离子载体(1μM)结合刺激5分钟，未刺激的细胞作为对照。然后裂解细胞并且将核后上清用于SDS-PAGE和Western印迹。在此图中，闭合符号(closedsymbols)表示通过PMA加离子载体磷酸化的蛋白。断开符号(Open symbol)表示通过CCS处理减少的ERk-2蛋白。
图7是使用抗磷酸酪氨酸的mAb、证明CCS增强蛋白底物的酪氨酸磷酸化作用的Western印迹。Tho细胞用CCS、粗制菠萝蛋白酶(Brom)、茎菠萝蛋白酸(SBP)或CCT组分(50μg/ml)处理30分钟，洗涤，然后用PMA(20ng/ml)和离子载体(1μM)结合刺激5分钟，未刺激的细胞作为对照。然后裂解细胞并且将核后上清用于SDS-PAGE和Western印迹。在此图中，闭合符号表示通过CCS磷酸化的蛋白。断开符号表示通过活化CCS而不是通过使CCS失活抑制的ERk-2磷酸化作用。
图8是使用抗磷酸酪氨酸的mAb、证明CCS对ERK-2的抑制效应的Western印迹。ThO细胞用CCS(0-25μg/ml)或与所选的蛋白酶抑制剂E-64一起温育的CCS处理30分钟，然后洗涤细胞并用PMA(20ng/ml)和离子载体(1μM)结合刺激5分钟。然后裂解细胞并且将核后上清用于SDS-PAGE和Western印迹。在此图中，闭合符号表示通过CCS磷酸化的蛋白。断开符号表示通过活化CCS而不是通过使CCS失活抑制的ERk-2磷酸化作用。
图9是确定通过CCS抑制的42kDa磷酸化蛋白是ERk-2的免疫印迹。Tho细胞用CCS(50μg/ml)处理30分钟或未处理，洗涤，然而用PMA(20ng/ml)和离子载体(1μM)刺激5分钟。细胞裂解物用抗ERk-2的mAB进行免疫印迹。
图10是使用抗磷酸酪氨酸的mAb、表明交联的抗CD3ε的mAb诱导多个蛋白的酪氨酸磷酸化作用的Western印迹。Tho细胞用交联的抗CD3ε抗体刺激0-20分钟。然后裂解细胞并将核后上清用于SDS-PAGE和Western印迹。闭合符号表示抗CD3ε的mAb诱导的酪氨酸磷酸化的蛋白。
图11是使用抗磷酸酪氨酸的mAb、证明CCS制抑TCR刺激的T细胞中的酪氨酸磷酸化作用的Western印迹。Tho细胞用CCS(0-5μg/ml)处理30分钟，洗涤，然后与抗CD3ε的mAb交联5分钟。然后裂解细胞并将核后上清用于SDS-PAGE和Western印迹。闭合符号表示抗CD3ε的mAb诱导ERk-2的酪氨酸磷酸化由于CCS而减弱。
图12是使用抗Raf-1的mAb、表明CCS抑制Raf-1的迁移率变化的Western印迹。Tho细胞用CCS(0-50μg/ml)处理30分钟，洗涤，然后用(A)PMA加离子载体联合刺激或(B)再与抗CD3ε的mAb交联5分钟。然后裂解细胞并将核后上清用于SDS-PAGE和Western印迹。
图13是表明CCS减弱纯化的CD4+T细胞中IL-2合成和增殖的两个曲线图。T细胞用CCS(50μg/ml)处理，洗涤，然后在培养基中单独培养或与固定的抗CD3ε的mAb和可溶的抗CD28的mAb一起培养。(A)如实施例5中所述通过CTL-L分析法测定IL-2合成。(B)通过3H-胸腺嘧啶核苷的掺入测定增殖。在无mAb(刺激物)的情况下培养的CD4+细胞不合成任何可检测到的IL-2，并且不增殖。
图14是表明CCS减弱Splenocyte合成IL-2但不抑制Splenocyte增殖的两个曲线图。Splenocyte用CCS(50μg/ml)处理，洗涤，然后在培养基中单独培养或与固定的抗CD3ε的mAb一起培养。(A)如实施例5中所述通过CTL-L分析法测定IL-2合成。(B)通过3H-胸腺嘧啶核苷的掺入测定增殖。在无mAb(刺激物)的情况下培养的Splenocyte不合成任何可检测到的IL-2，并且不增殖。
图15是表示CCS4抑制体外细胞生长的曲线图。癌细胞系用CCS(50，10，2.5，1和0.25μg/ml)处理或用水处理作为对照。96小时处理后，估评CCS对肿瘤细胞生长的效应。柱表示CCS的50％抑制浓度(IC50μg/ml)(抑制50％的肿瘤细胞生长所需的CCS的量)。
实施例1-菠萝蛋白酶蛋白的纯化
a.材料
试剂菠萝蛋白酶(E.C.3.4.22.4；蛋白水解活性，1,541nmol分钟/mg)来自Solvay Enzymes Inc(德国)。快速S Sepharose、Pharmalyte 3-10TM、Ampholine 9-11TM、Ready Mix IEFTM(丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺)和IEFTM标记来自pharmacia Biotech。预灌制的4-20％丙烯酰胺凝胶和大范围分子量标记来自Bio-Rad Laboratories。所有其它试剂是分析级的并来自SigmaChemical Co.或British Drug House。
b.蛋白酶测定
菠萝蛋白酶的水解活性用合成的底物Z-Arg-Arg-pNA通过使用室内微量滴定板为基础的分析法测定。此分析法根据Filippova等在Anal Biochem 143，293-297(1984)中的描述。底物是根据Napper等在生物化学杂志，301，727-735(1994)中描述的Z-Arg-Arg-pNA。
c.蛋白测定
蛋白用Bio-Rad提供的试剂盒测定，它是Lowry等(生物化学杂志(1951)193，265-275)方法的改进。将样品与在0.9％盐水或20mM乙酸缓冲液pH5.0中制备的牛血清白蛋白标准(0-1.5mg/ml)比较。
d.菠萝蛋白酶的制备
所有的下列步骤在室温(20-25℃)下进行。将450mg粉末溶于15ml含0.1mM EDTA钠的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)中制备菠萝蛋白酶溶液(30mg/ml)。将溶液分装在10个1.5ml微量离心管中并于13,000×g离心10分钟以去除不溶物质。汇集澄清的上清并用于层析。
e.快速S-Sepharose高效层析
快速S-sepharose柱(pharmacia Biotech)通过将25ml介质填充到XK 16/50TM柱中并用含0.1mM EDTA的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)在FPLCTM系统上以3ml/min平衡而得到制备。将5ml的菠萝蛋白酶溶液加到柱上。收集未结合蛋白并用100ml乙酸缓冲液洗柱。与柱子结合的蛋白用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M NaCl线形梯度洗脱。整个梯度收集5ml组分，图1表示从此方法得到的粗制菠萝蛋白酶的典型的紫外层析谱。
根据上述分析组分的蛋白和蛋白水解活性，图2表示针对合成肽Z-Arg-Arg-pNA的蛋白水解活性及单个组分的蛋白含量。正如所预测，的蛋白含量轮廓严密地反映了紫外轮廓，但主要的蛋白水解活性局限于符合茎菠萝蛋白酶(SBP)的两个主要峰。在层析谱其它区域中观察到的小活性可能与SBP明显不同的其它蛋白酶相一致，如后来洗脱的包含Ananain和Comasain的CCS组分。
从紫外模式图确定的主要峰被从三个连续循环中汇集并根据表1所示的命名。汇集的部分用于物理化学定性。汇集的组分通过超滤浓缩，用PD10柱将缓冲液换成等渗盐溶液(0.9％重量/体积NaCl)。在进行生物检测前计算蛋白浓度和Z-Arg-Arg-pNA活性，示于表2。
根据下文所述对汇集组分进行分析。
表1从SP Sepharose HP分级分离的菠萝蛋白酶(QC2322)的汇集组分总结
  组分   描述   汇集的组分(包含的)
  CCT   流过的(未结合成分)   未结合柱流过的
  CCV   从柱上下来的第一个峰   8-9
  CCX   从柱上下来的第二个尖峰   13-14
  CCZ   在第三个主要菠萝蛋白酶峰的上升边缘的小峰   19-20
  CCY   第一个主要的菠萝白酶峰   23-24
  CCW   第二个主要的菠萝白酶峰   27-29
  CCU   在第二个主要菠萝蛋白酶峰的下降边缘上的小峰   33-34
  CCS   从柱上下来的最后两个峰   39-44
表2用于检测生物学活性的汇集的组分的计算蛋白含量和Z-Arg-Arg-pNA活性
  汇集的组分   Z-Arg-Arg-pNA活性(μMoles/min/ml)   蛋白含量(mg/ml)
  CCT   11.30   1.00
  CCV   9.78   1.00
  CCX   71.71   1.00
  CCZ   688.81   1.00
  CCY   1500.0   0.574
  CCW   1500.0   0.543
  CCU   1500.0   0.421
  CCS   379.76   1.00
f汇集组分的加工
测定汇集组分的蛋白水解活性和蛋白含量，用含有最小排阻分子量10kDa的超滤膜的FiltronTM搅拌水室调节浓度至约1.4mg/ml蛋白或105nmoles/min/ml蛋白活性。然后用PD10TM柱(Pha rmacia Biotech)将组分缓冲液换成等渗盐(0.9％wv/Nacl)，无菌过滤(0.2μm)，然后调节蛋白含量或蛋白水解活性。将样品冻存于-80℃，并用于如下的体外研究。
g十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)
通过十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)在预制的4-20％T梯度凝胶上分析汇集的FPLCTM样品。将100μl样品与等体积的20％w/v三氯乙酸(TCA)混合通过酸沉淀制备用于电泳的样品。以13,000xg离心10分钟收集沉淀的蛋白，弃去上清。用0.5ml二乙醚洗涤沉淀两次，室温下空气中干燥沉淀。将沉淀溶解于300μl SDS-PAGE样品缓冲液中(62.5mM Tris-Hcl pH68含10％v/v甘油、2％w/v十二烷基磺酸钠和40mM二硫苏糖醇)并在水浴中于95℃加热。
SDS-PAGE大范围分子量标准以1∶20于SDS-PAGE样品缓冲液中稀释经过相似的处理后与样品同时电泳。根据Bio-Rad’s说明书以240V在微型Protean IITM电泳系统上进行凝胶电泳，直到染色前沿到达凝胶底端(30-45分钟)。
电泳结束后，分离的蛋白在轨道混合器上于含0.075％w/v胶体亮蓝G-250、1.5％v/v磷酸、11.25％w/v硫酸铵和25％v/v甲醇的溶液染色过夜。在含有25％v/v甲醇和10％v/v乙酸的溶液中对凝胶进行脱色以得到清楚的背景。
结果
组分的纯度通过SDS-PAGE示于图3。除了柱流过(CCT)以外的所有汇集的组分表明存在的主要蛋白的分子量约25-28KDa。这与由其他作者从菠萝蛋白酶分离到的半胱氨酸蛋白酶的分子量相一致(Rowan等，酶学方法；(1994)，244，555-568)。组分CCX、CCZ、CCY和CCW的纯度看上去很高。在某些组分中可观察到低分子量的次要组分，特别是CCT、CCV、CCX和CCS中。汇集的CCU和CCS组分中包含25-28KDa的双重线；较高的CCX、CCZ、CCY和CCW的凝胶上样意味着双重线带可能也存在于这些组分中。组分及其由SDS-PAGE测定的汇集组分的计算的分子量的概括示于表3。
汇集的CCX、CCZ、CCY+CCW和CCU组分中的蛋白经SDS-PAGE后被Western印迹转移至硝酸纤维素膜并用针对纯化的茎菠萝蛋白酶蛋白(SBP)的免抗血清进行探测(结果未显示)。汇集的组分中的所有蛋白带都被血清中的抗体识别，表明免疫性相似的蛋白也许属于半胱氨酸蛋白酶家族。
表3存在于SP Sepharose HP汇集的组分中的蛋白根据SDS-PAGE测定的分子量总结
  汇集的组分   主要蛋白条带的分子量(kDa)   次要蛋白条带的分子量(kDa)
  CCTCCVCCXCCZCCYCCWCCUCCS   76.0315.07，25.85，28.28，76.0325.0827.4527.4527.4527.45，28.2815.07，25.85，27.45   15.0715.07，76.0313.37，16.49，76.036.5
h等电聚焦
汇集的组分(0.5-1.0mg/ml)以1∶3稀释于去离子水中并在pH3-11的梯度凝胶上进行电泳。用Ready Mix IEFTM灌制凝胶产生含有10％v/v甘油、5.0％Ph rmalyfe 3-10TMt 2.5％Ampholine 9-11TM的5.5％T、3％C的聚丙稀酰胺凝胶。在700V预聚集后，10μl样品和高pI标记被加到凝胶上。500V电泳10分钟使样品进入，2500V电泳1.5小时进行聚焦，3000V电泳10分钟使条带变细。电泳后，蛋白在含有20％W/V TCA的溶液中固定30分钟，在脱色液中洗30分钟以去除TCA，根据SDS-PAGE部分描述的(见上文)，用亮蓝G-250进行染色。
结果
图4表示除CCX外所有组分包含9.3pI标记之外聚焦的碱性蛋白。与层析介质功能基团的局部电荷相互作用可解释为什么CCX中pI3.8和3.85的蛋白在pH5.0时吸附到阳离子交换树脂上。CCZ在pI9.7处表现出一条单一的带，而汇集的CCY、CCW和CCU组分包含在pH9.5-9.8范围内的多条等电点带。至少这种异源性部分可由共同的茎菠萝蛋白酶主链上碳水化合物部分的差异解释。此值与文献中报道的菠萝蛋白酶的pI9.45-9.55相一致(Rowan等，酶学方法，(1994)，244，555-568)。汇集的CCS组分包含两个pI大于10.25的碱性蛋白。外推估计pI为10.4和10.45。这相当于an anain和comasain，并且与其它的(Rowan等，上述)pI大于10的估计一致。在每一个汇集的组分的蛋白质pI概括于表4。
表4 SP Sepharose HP汇集组分中存在的蛋白的估计等电点总结
  汇集的组分   蛋白的等电点
  CCTCCVCCXCCZCCYCCWCCUCCS   未测定未测定3.8，3.859.79.6，9.79.57，9.6，9.79.57，9.6，9.7510.4，10.45
实施例2-CCZ蛋白的N端氨基酸分析
在一个单独的实验中，汇集的CCZ组分进行SDS PAGE电泳，按上述方法转移至PVDF膜上。用0.025％w/v考马斯蓝R-250对膜染色，在40％v/v甲醇中溶解10分钟，然后在50％v/v甲醇中脱色。膜在室温下空气干燥，然后对染色的蛋白进行N-端氨基酸序列测定。简单地，将蛋白带从膜上切下放在测序仪的上半部分用装配有联机乙内酰苯硫脲氨基酸分析仪的气相测序仪(Applided Biosystems)，通过Edman降解进行菠萝蛋白酶N-端氨基酸分析。表5表示CCZ、CCX、茎菠萝蛋白酶、ananain和comosain的头21个NH2-端氨基酸。
表5CCZ蛋白与已知的从菠萝蛋白酶分离的蛋白酶N端序列的相似性
  蛋白酶 距N端的位置
  CCZ V L P D S I D W R Q K G A V T E V K N R G1       5         10        15        20
  CCX V P Q S I D W R D Y G A V N E V K N4         9         14
  茎菠萝蛋白酶 A V P Q S I D W R D Y G A V T S V K N Q N1       5         10        15        20
  Ananain V P Q S I D W R D S G A V T S V K N Q G1     4         9         14        19
  Comosain V P Q S I D W R N Y G A V T S V K N Q G1     4         9         14        19
所有蛋白具有序列同源性。与茎菠萝蛋白酶相比，Ananain和Comasain在20个氨基酸中只有2个不同。与茎菠萝蛋白酶相比，CCZ中的21个氨基酸有8个不同。CCZ与ananain和comasain的20个氨基酸中有6个不同。Comosain与ananain有2个氨基酸不同。尽管很明显这些蛋白是结构相关的，但是它们都是不同的，彼此间表现差异。这些蛋白酶也在它们的蛋白酶底物特异性和生物活性方面不同。
实施例3-组分CCS抑制p42kda磷蛋白的酪氨酸磷酸化
a材料
抗体
抗CD3ε链的mAb(145-2C 11)和抗CD28的mAb(PV-1)购自pharmingen(San Diego，CA)，山羊抗仓鼠IgGAb购自Sigma(Dorset，UK)。小鼠抗磷酸酪氨酸的mAb(4G10)、小鼠抗MAPK R2(ERK-2)mAb和小鼠抗Raf-1的mAb来自UBI(Lake Placid，NY)。与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgGAb来自BioRad(Hemel Hemstead，Hertfordshire，UK)。识别磷酸化的p44和p42MAPS的兔多克降磷酸特异的MAPK IgG来自New England Biolabs(Hitchin，Hertfordshire，UK)。
试剂
12-肉豆蔻13-乙酸佛波醇(PMA)和钙离子载体A23187购自Sigma。菠萝蛋白酶(E.C.3.4.22.4；蛋白水解活性，1,541nmol/分钟/mg)来自Solvay Iny(Germany)。选择性半胱氨酸蛋白酶抑制剂，E-64(L-反式环氧琥珀酰亮氨酰胺基-(4-胍基)丁烷来自Sigma。
细胞
T细胞杂交瘤GA15由B.Fox(ImmuLogic pharmacenticalCorporation，Boston，MA)惠赠。GA15是将胸腺瘤BW5147与与I-Ab相关的KLH特异的Tn2克隆F4融合产生的并按以前描述的(Fox，1993，国际免疫学杂志，5，323-330)维持。由于与抗CD3ε的mAb(Fox，1993)交联后可产生IL-2、IL-4和IFN-γ，所以GA1表现出Th0细胞表型。
b T细胞的刺激
用烯释在盐溶液(0.9％(w/v))中的CCS(1-50μg/ml)于37℃处理悬浮于RPMI 1640中的细胞(2×107)30分钟。用相同体积的盐溶液(稀释剂)处理模拟处理的细胞。如同在以前用粗制菠萝蛋白酶进行的研究中观察到的，在高浓度CCS(50或100μg/ml)时，细胞发生凝集。处理后，洗涤3次温和地分散细胞凝集并把它们重新悬浮于RPMI中。将mAb与TCR(抗-CD3ε)交联通过细胞表面刺激细胞或用PMA(20ng/ml)和离子载体(1μm)联合处理图示和文中所示的时间直接刺激。
通过TCR刺激时，首先将T细胞与抗CD3ε的mAb(20μg/ml)在冰上温育30分钟。4℃洗涤1次去除过多的mAb并于37℃使抗CD3ε的mAb与山羊抗仓鼠IgG(20μg/ml)交联。通过加入冰冷的裂解缓冲液(25mM Tris，pH7.4，75mM NaCl，2mM EDTA 0.5％ Triton X-100、2mM Sodium orthovanadate、10mM氟化钠、10mM焦磷酸钠、74μg/ml亮抑蛋白酶肽、740μMPMSF和74μg/ml抑酶肽)于4℃连续摇动30分钟终止刺激。裂解液得到澄清(14,000xg 10分钟)，然后将等体积的2XSDS-PA GE样品缓冲液(50mMTris，pH7、700mM 2-ME、50％(V/V)甘油、2％(w/v)SDS、0.01％(w/v)溴酚蓝)加到核后上清中。100℃处理蛋白5分钟使其溶解，含相当于1×106细胞的样品进行SDS-PAGE分离。
c免疫印迹
分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上(Bio-Rad)，然后用含5％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma，组分V；BSA)、0.1％NonidetP-40TM的Tris缓冲盐溶液(170mM NaCl和50mM Tris，pH7.4；TBS)封闭此膜。按照图示中所示；用合适的抗体温育免疫印迹。初级抗体用含0.5％(w/v)BSA、0.1％(v/v)Tween-20的TBS的抗体稀释缓冲液于4℃稀释2小时，然后用适合的与辣根过氧化物酶偶联的用抗体稀释缓冲液稀释的二级抗体于4℃检测1小时。每一步温育后，用含0.1％Tween-20的TBS充分洗涤膜。用ECL化学发光检测系统(Amersham Corp，Arlington Heights，IL)鉴定免疫反应。
d CCS蛋白水解活性的抑制
特异的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64用于灭活CCS的蛋白水解活性。稀释于3μm二硫苏糖醇、100μM E-64、60mM乙酸钠(pH5)中的CCS(25μg/ml)于30℃温育10分钟。灭活的CCS于4℃在盐溶液中透析过夜。对于粗制菠萝蛋白酶的早期研究表明这些条件足以使由Z-Arg-Arg-pNA底物分析的99.5％蛋白水解活性丧失(见上文)。用E-64灭活的CCS(25μg/ml)处理的T细胞与未经处理的CCS和用PMA及离子载体刺激的模拟处理细胞进行比较。
结果
a组分CCS抑制p42kda磷蛋白的酪氨酸磷酸化
我们以前已表明菠萝蛋白酶抑制经用PMA和钙离子载体联合刺激T细胞后的ERK-2的酪氨酸磷酸化(WO-A-96/00082)。T细胞的佛波酯和离子载体刺激协同作用产生TCR刺激的许多特征如IL-2分泌、IL-2受体表达和T细胞增殖(Truneh等，1985，自然313，318-320；Rayter等，1992，欧洲分子生物学组织杂志11，4549-4556)。佛波酯通过对PKC和P21ras的直接兴奋剂作用模拟抗原受体激发且规避TCR诱导的蛋白酪氨酸激酶以活化ERK-2。钙离子载体A23187诱导细胞内Ca2+释放提高；由此模拟肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)的作用。然而，佛波酯和离子通道刺激不被TCR控制的PKC通路(Izquierdo等，1992，分子细胞生物学12，3305-3312)提示存在调节T细胞功能的T细胞内独立的细胞内途径。我们因此通过检测菠萝蛋白酶对PMA和离子通道诱导的酪氨酸磷酸化的效应研究了菠萝蛋白酶的哪个组分可通过不依赖TCR的途径抑制T细胞信号通路。
用离子通道和PMA联合刺激T细胞诱导几种蛋白包括大约100kda、85kda、42kda和38kda的酪氨酸磷酸化。CCS(50μg/ml)预处理降低了p42kda蛋白的酪氨酸磷酸化，但不明显抑制，任何其它底物的磷酸化(图6)。在两个实验中，CCS而不是其它组分也提高大约36kda、38kda、85kda、94kda和102kda蛋白的酪氨酸磷酸化(图7和8)。
CCS抑制p42kda磷蛋白酪氨酸磷酸化是剂量依赖性的(图8)并且依赖于其蛋白水解活性，因为E-64完全消除了CCS对p42kda磷酸化的抑制效应(图8)。E-64处理T细胞并不影响PMA和离子载体诱导的细胞信号通路。
CCS抑制ERK-2的酪氨酸磷酸化
我们怀疑由CCS抑制的42kda磷蛋白是MAPK ERK-2，所以我们用只有经Tyr204磷酸化催化活化时才特异地检测ERK-1和ERK-2的特异的抗ERK-2的mAb和抗磷酸MAPK抗体进行免疫印迹分析。对用PMA和离子载体刺激的CCS处理的细胞进行免疫印迹证实了p42kda磷蛋白的确是ERK-2(图9)。
CCS降低TCR诱导的ERK的酪氨酸磷酸化
我们通过评估经抗CD3ε的mAb交联刺激的GA15底物的酪氨酸磷酸化研究了CCS对TCR介导的信号转导的作用。用特异的抗磷酸酪氨酸的mAb对GA15裂解液进行免疫印迹表明包括大约120kda、100kda、85kda、76kda、70kda、42kda、和40kda多种蛋白酪氨酸磷酸化提高，与在其它经TCR连接后中T细胞观察到的磷蛋白一致(June等，1990，免疫学杂志，144，1591-1599和美国国家自然科学院院报，87，7722-7726，由Cantrell综述，1996，Annu.Rev.Immunol，14，259-274)(图10)。刺激后2至5分钟之间很容易检测到酪氨酸磷酸化的蛋白并且保持磷酸化至少10分钟(图10)。GA15细胞用抗CD3的mAb单独或用交联的抗体刺激，不诱导任何细胞底物的酪氨酸磷酸化(数据未显示)。另外，用CCS预处理GA1530分钟导致以剂量依赖形式出现的TCR诱导的ERK-2蛋白酪氨酸磷酸化降低(图11)。CCS不明显地影响其它TCR诱导的磷蛋白的酪氨酸磷酸化，提示CCS有选择性作用模式。
实施例4-CCS阻滞了Raf-1的迁移率变动
Raf-1是活化ERK-2的MEK-1的立即上游激活剂。Raf-1的活化需要特定丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化(Avruch等，1994，TIBS，19，279-283)。为了研究CCS是否影响MAP激酶级联反应中ERK-2的其它上游底物，我们研究了CCS对Raf-1的效应。用CCS(0-50μg/ml)处理T细胞然后用抗CD3εmAb或如前所述用PMA和离子载体联合刺激它。结果表明CCS抑制Raf-1的迁移率变动，暗示它抑制了其蛋白磷酸化及其活化。此数据证实了CCS对MAP激酶级联反应有影响并且CCS的影响不是直接在ERK-2上而是在MAPK级联反应的上游底物上。
实施例5CCS对IL-2合成和T细胞增殖的影响
a材料
细胞
根据WO-A-96/00082所述，从雌性BALB/C小鼠(6-8周龄)分离脾细胞。用磁法活化细胞分拣(MACS)从脾细胞中分离高度纯化的CD4+T细胞。
b白细胞介素2的合成
用CCS(50μg/ml)或盐溶液于37℃处理稀释在RPMI中的T细胞30分钟，用新鲜的RPMI洗涤T细胞并将它们重新悬浮在培养基中。用固定化的抗CD3ε抗体(4μg/ml)和可溶性的抗CD28抗体(10μg/ml)刺激T细胞以产生细胞因子mRNA。通过于4℃温育16小时将用PBS稀释的抗CD3ε的mAb固定在24孔、平底、微培养板上(Corning，Corning，NY)。在加入于37℃湿度为5％CO2下培养24小时的脾细胞或纯化的CD4+T细胞(2.5-5×106细胞/孔)的一式三份培养物前用PBS洗孔三次。用CTL-L生物测定(Gillis等，1978，免疫学杂志，120，2027-2032)。测量培养物上清中的IL-2水平。
c T细胞增殖
用CCS(50μg/ml)处理T细胞30分钟，用RPMI洗涤然后用固定化的抗CD3ε的mAb单独或用抗CD3ε的mAb与抗CD28的mAb联合刺激T细胞。然后在96孔平底培养板中(Nunc)以105细胞/孔培养细胞36小时。用0.5μCi[3H]TdR脉冲处理细胞后12小时将细胞收获得到玻璃纤维滤膜上。
结果
a CCS抑制IL-2产生和CD4+T细胞增殖
P21Ras、Raf-1、MEK-1和ERKs的活化对于诱导IL-2在T细胞中的转录是必需的(Izquierdo等，1993，实验医学杂志，178，1199)。IL-2是诱导T细胞增殖的主要的自分泌T细胞生长因子。ERK活化的缺陷此外表明可期望抑制IL-2产生和T细胞增殖。我们因此研究了CCS是否能影响T细胞信号通路的功能结果，即IL-2产生和鼠脾细胞及高度纯化的CD4+T细胞的增殖。当用抗CD3ε的mAb刺激ERK通路时，CCS(50μg/ml)处理纯化的CD4+T细胞降低了IL-2产生和增殖(图13a和13b)。CCS也抑制脾细胞产生IL-2，然而它不影响脾细胞增殖(图14a和14b)，提示有未确定的CCS中的成分对脾细胞中的佐细胞群体起作用，如B细胞或巨噬细胞。菠萝蛋白酶通过对B细胞的作用提高对T细胞的共同刺激信号。不管推断的CCS对佐细胞的作用，数据清楚地暗示CCS抑制IL-2产生和纯CD4+T细胞增殖，提示CCS抑制T细胞活化。IL-2产生和增殖依赖于抗TCR抗体刺激细胞因为在单独组织培养基中培养的细胞中检测不到细胞因子(图13和14)。
实施例6CCS对人肿瘤细胞生长的体外影响
a材料
细胞
肿瘤细胞系由L.kelland(Institute of Cancer Research，Suttbn，UK)提供，如下：卵巢(SKOV-3、CH-1、A2780)，结肠(HT29、BE、LOVO)、乳腺(MCF-7、MDA231、MDA361)、肺(A549、CORL23、MOR)和黑色素瘤(G361、B008、SKMel24)。
b人肿瘤细胞系的生长抑制
研究由L.Kelland(Institute of Cancer Research，Sutton，UK)进行。胰酶消化细胞并将单个细胞以4×103细胞/孔浓度接种在含160μl生长培养基的96孔微量滴定板上。贴壁过夜后，将40μl培养基中的CCS一式四份加到孔中使孔中的终浓度为50、10、2.5、1和0.25μg/ml。8个孔是未处理的孔作为对照。在加在孔中之前现用无菌水稀释CCS。CCS曝露给细胞是96小时而每个孔中的细胞数目通过用含0.4％sulforhodamine B的1％乙酸根据以前所述(kelland等，1993，癌症研究，53，2581-2586)确定。从浓度比对照(％)吸收值(在540nm处读取)曲线上计算50％抑制浓度(IC50值为μg/ml)
结果
a CCS体外抑制人肿瘤生长
P21Ras和Raf-1是重要的癌基因，当其突变时引起失控的细胞生长和增殖，导致肿瘤。因为我们已表明CCS抑制P21Ras/Raf-1/MEK1/ERK激酶信号通路级联反应的效应，我们研究了CCS是否能抑制肿瘤生长。CCS处理人肿瘤细胞导致了几种不同的卵巢、肺、结肠、乳腺和黑色素瘤细胞系体外生长降低(图15)。CCS并不是相同地影响所有细胞系，提示CCS有选择性作用。
序列表
(1)基本信息
(i)申请人：
(A)名称：CORTECS(UK)LIMITED
(B)街道：FIRST FLOOR，OSPREY HOUSE
(C)城市：LOWER SQUARE，ISLEWORTH
(D)州名：MIDDLESEX
(E)国家：ENGLAND
(F)邮政编号(ZIP)：TW7 6BN
(A)名称：MYNOTT，Tracey，Lehanne
(B)街道：IMPERIAL COLLEGE OF SCIENCE，
TECHNOLOGY & MEDICINE
(C)城市：Dept of Biochemistry，Exhibition Road，
(D)州名：LONDON
(E)国家：UNITED KINDOM
(F)邮政编号：SW7 2AZ
(ii)发明名称：菠萝蛋白酶成分
(iii)序列数：5
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)
(v)目前申请资料：
(A)申请号：WO PCT/GB98/00590
(2)关于SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(v)片段类型：N端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Val Leu Pro Asp Ser Ile Asp Trp Arg Gln Lys Gly Ala Val Thr Glu
1               5                   10                  15
Val Lys Asn Arg Gly
            20
(2)关于SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(v)片段类型：N端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val
1               5                   10                  15
Lys Asn
(2)关于SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Ala Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Thr Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asn Gln Asn
            20
(2)关于SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(v)片段类型：N端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Ser Gly Ala Val Thr Ser Val
1               5                   10                  15
Lys Asn Gln Gly
            20
(2)关于SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(v)片段类型：N端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asn Tyr Gly Ala Val Thr Ser Val
1               5                   10                  15
Lys Asn Gln Gly
            20

Claims (9)

1.菠萝蛋白酶成分在制备用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途，其中该菠萝蛋白酶成分选自：
(a)菠萝蛋白酶成分，包含具有由SDS-PAGE测定的约15.07kDa、25.85kDa和27.45kDa分子量并具有等电点10.4和10.45的蛋白，所述菠萝蛋白酶成分可通过下列方法得到：
(i)将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中；
(ii)通过在S-Sepharose上快速高效液相层析，用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分；
(iii)收集对应于从柱上下来的最后双峰的组分；
(b)ananain；和
(c)ananain和comosain的混合物；
其中，所述疾病或病症对抑制MAP激酶通路有反应并且选自：
(a)T细胞活化介导的疾病或病症；
(b)生长因子或细胞因子的产生介导的疾病或病症；
(c)癌症；
(d)自身免疫疾病；
(e)宿主对移植排斥；
(f)过敏反应；
(g)中毒性休克；
(h)细胞程序性死亡；和
(i)寄生物或病原体侵染。
2.权利要求1的用途，其中菠萝蛋白酶成分用于制备免疫抑制剂。
3.菠萝蛋白酶成分在以下至少一个方面的用途：
(i)调节控制细胞生长和增殖；
(ii)抑制细胞产生生长因子或细胞因子；
(iii)抑制MAP激酶通路的活化；和
(iv)抑制T细胞活化；
其中，所述菠萝蛋白酶成分选自：
(a)菠萝蛋白酶成分，包含具有由SDS-PAGE测定的约15.07kDa、25.85kDa和27.45kDa分子量并具有等电点10.4和10.45的蛋白，所述菠萝蛋白酶成分可通过下列方法得到：
(i)将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中；
(ii)通过在S-Sepharose上快速高效液相层析，用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分；
(iii)收集对应于从柱上下来的最后双峰的组分；
(b)ananain；和
(c)ananain和comosain的混合物。
4.一种用于预防或治疗疾病或病症的药物或兽医组合物，包含菠萝蛋白酶成分及药学上或兽医上可接受的赋形剂，其中所述菠萝蛋白酶选自：
(a)菠萝蛋白酶成分，包含具有由SDS-PAGE测定的约15.07kDa、25.85kDa和27.45kDa分子量并具有等电点10.4和10.45的蛋白，所述菠萝蛋白酶成分可通过下列方法得到：
(i)将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中；
(ii)通过在S-Sepharose上快速高效液相层析，用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分；
(iii)收集对应于从柱上下来的最后双峰的组分；
(b)ananain；和
(c)ananain和comosain的混合物；
其中，所述疾病或病症对抑制MAP激酶通路有反应并且选自：
(a)T细胞活化介导的疾病或病症；
(b)生长因子或细胞因子的产生介导的疾病或病症；
(c)癌症；
(d)自身免疫疾病；
(e)宿主对移植排斥；
(f)过敏反应；
(g)中毒性休克；
(h)细胞程序性死亡；和
(i)寄生物或病原体侵染。
5.包含菠萝蛋白酶成分及药学上或兽医上可接受的赋形剂的药物或兽医组合物，其用于以下至少一个用途：
(i)调节控制细胞生长和增殖；
(ii)抑制细胞产生生长因子或细胞因子；
(iii)抑制MAP激酶通路的活化；和
(iv)抑制T细胞活化；
其中，所述菠萝蛋白酶成分选自：
(a)菠萝蛋白酶成分，包含具有由SDS-PAGE测定的约15.07kDa、25.85kDa和27.45kDa分子量并具有等电点10.4和10.45的蛋白，所述菠萝蛋白酶成分可通过下列方法得到：
(i)将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中；
(ii)通过在S-Sepharose上快速高效液相层析，用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分；
(iii)收集对应于从柱上下来的最后双峰的组分；
(b)ananain；和
(c)ananain和comosain的混合物。
6.权利要求4或5的药物或兽医组合物，其配制成适于肠道、口、鼻、颊、局部或肛门施用的形式。
7.权利要求5的药物或兽医组合物，其配制成适于非肠道施用的形式。
8.权利要求7的药物或兽医组合物，其中非肠道施用选自静脉内、皮下、肌内或腹膜内施用。
9.权利要求6中所述的药物或兽医组合物，其配制成适于口服施用的形式并且是肠溶包衣制剂。
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