DE69838909T2

DE69838909T2 - Bromelainbestandteil

Info

Publication number: DE69838909T2
Application number: DE69838909T
Authority: DE
Inventors: Tracey Mynott; Christian Engwerda; Keith Deeside PEEK
Original assignee: Sarantis Pty Ltd
Current assignee: Sarantis Pty Ltd
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2018-02-26
Also published as: EP1012304A1; ES2297878T3; AU6303798A; ES2377539T3; CN1249002A; ATE533842T1; ES2403433T3; JP4651756B2; EP0996710A1; EP1865055A1; DE69837923D1; JP2010143945A; EP1908823A1; CN1252096A; ES2288762T3; JP2001513635A; CN100400659C; DE69837923T2; JP2002512509A; WO1998038291A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Bestandteil von Bromelain. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung dieses Bestandteils von Bromelain in der Medizin, besonders als ein Antikrebsmittel und ein Immunsuppressivum.
Stammbromelain (Bromelain) ist der Sammelname für die proteolytischen Enzyme, die in Geweben der Pflanze Bromeliaceae gefunden werden. Es ist eine Mischung verschiedener Anteile, die vom Stamm der Ananaspflanze (Ananas comosus) abgeleitet sind. Von Bromelain ist bekannt, dass es wenigstens fünf proteolytische Enzyme enthält, jedoch auch nicht-proteolytische Enzyme, einschließlich einer sauren Phosphatase und einer Peroxidase; es kann auch Amylase- und Cellulaseaktivität enthalten, überdies sind verschiedene andere Bestandteile vorhanden.
Bromelain ist zuvor bei der Behandlung einer Vielzahl von Zuständen einschließlich der Entzündung verwendet worden und ist insbesondere bei der Behandlung von Diarrhoe verwendet worden. Die Verwendung von Bromelain bei der Behandlung der infektiösen Diarrhoe ist in WO-A-9301800 beschrieben, wo angenommen wird, dass Bromelain durch Zerstören intestinaler Rezeptoren für Krankheitskeime durch Proteolyse arbeitet, und in WO-A-8801506 , wo gelehrt wird, dass Bromelain Krankheitskeime von intestinalen Rezeptoren ablöst.
Taussig et al., Planta Medica, 1985, 538–539 und Maurer et al., Planta Medica, 1988, 377–381 nehmen beide an, dass Bromelain zur Verwendung beim Hemmen von Tumorwachstum zweckmäßig sein kann. Die US 5,223,406 , DE-A-4302060 und JP-A-59225122 lehren auch die Verwendung von Bromelain bei der Behandlung von Krebs. Die US 5,223,406 lehrt, dass Bromelain in der Lage ist, den Tumornekrosefaktor (TNF) zu induzieren, während DE-A-4302060 lehrt, dass Bromelain Metastasen durch die strukturelle Modifizierung des Oberflächenproteins CD44 des Tumors verhüten kann.
In der WO-A-9400147 werden verschiedene Experimente beschrieben, die beweisen, dass proteolytische Enzyme und insbesondere Bromelain in der Lage sind, die Sekretion zu hemmen. Die Anmeldung offenbart auch, dass Bromelain die Aktivität der Toxinbindung vermindern kann und die sekretorische Wirkung von Toxinen verhindern kann, so wie von hitzelabilem Toxin (LT) und Choleratoxin (CT) und auch von Toxinen, wie dem hitzestabilen Toxin (ST). Dies trotz der Tatsache, dass ST einen von LT und CT sehr unterschiedlichen Wirkmechanismus hat. Diese Beobachtungen wurden durch die Tatsache erklärt, dass ein Bestandteil der Bromelainmischung, Stamm-Bromelainprotease, in der Lage zu sein scheint, die Stoffwechselwege zyklischer Nukleotide zu modulieren und dies wird weiter in der WO-A-9500169 diskutiert. Überdies wurde für Bromelain auch nachgewiesen, dass es die Sekretion hemmt, die durch den Calcium- abhängigen Stoffwechselweg verursacht wird.
Die vorliegenden Erfinder haben die verschiedenen biologischen Wirkungen von Bromelain untersucht, und insbesondere seine Wirkungen in einem gut dokumentierten Modell der intrazellulären Signaltransduktion, nämlich dem T-Zell-Rezeptor (TCR)/CD3-Signalisieren und der Produktion von IL-2. Der beträchtliche Fortschritt über die letzten Jahre hat zum Verständnis der biochemischen Ereignisse geführt, die im Anschluss an die Wechselwirkung mit TCR auftreten (wiedergegeben von Cantrell, Annu. Rev. Immunol. 14, 259–274 (1996)) und daher bietet das TCR-Signalisierung ein ausgezeichnetes Modell zur Erhellung der Wirkungen der biologisch aktiven Verbindungen. Eine wirksame T-Zell-Aktivierung erfordert zwei Signale. Das erste Signal wird durch den TCR/CD3-Komplex nach Wechselwirkung mit einem Antigenpeptid erzeugt, das vom Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) präsentiert wird, der von antigenpräsentieren Zellen (APC) (Cantrell, 1996) exprimiert wird. Das zweite, co-stimulatorische Signal wird durch Bindung von CD28-Rezeptoren auf T-Zellen mit der B7-Familie von Liganden auf APC erzeugt. Ein Schlüsselelement im Signalisierungs-Stoffwechselweg, das beim Übermitteln rezeptorausgelöster Signale an den Nucleus beteiligt ist, ist die Familie der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPk). Die am besten untersuchten dieser Kinasen sind die extrazelluläre Signal-regulierte Proteinkinasen (ERK)-1 und ERK-2 (auch als p44^MAPk bzw. p42^MAPk in Bezug genommen). ERKs sind Serin/Threonin-Kinasen, die aktiviert sind, wenn sie auf Tyrosin- und Threonin-Resten phosphoryliert sind. In vitro wird diese Aktivierung umgekehrt, wenn eine der Reste dephosphoryliert wird. Ein verhältnismäßig neu entdecktes Mitglied der MAPk-Familie sind c-Jun NH₂-terminale Kinasen (JNKs), die als 46 kDa und 55 kDa Formen existieren, die zur Aktivierung auch die Phosphorylierung erfordern. Die Aktivierung von ERK ist von p56^Lck und der Kopplung des TCR/CD3-Komplexes an p21^Ras abhängig, mit nachfolgender Aktivierung der Raf-1/MEK1/ERK-Kinasekaskade. Die Aktivierung von JNK erfordert sowohl p21^Ras als auch Signale, die von dem CD28-co-stimulatorischen Rezeptor erzeugt werden, die GTP-(Guanosintriphosphat) bindende Proteine (so wie Rac1 oder Cdc42) aktivieren, die die PAK/MEKK/SEK/JNK-Kinasekaskade induzieren. Aktivierte ERK phosphoryliert Elk-1, welches wiederum die Induktion der c-fos-Aktivität im Anschluss an die Phosphorylierung von c-jun durch JNK vermittelt. Aktiviertes c-fos und c-jun vereinigen sich, um das AP-1-Protein zu bilden, das für die Synthese von IL-2 erforderlich ist. Die obigen Ereignisse sind in 1 zusammengefasst. Alle der vorgenannten Ereignisse der Signalisierung erfordern die Phosphorylierung von Tyrosin, weil Inhibitoren der Protein-Tyrosinkinasen (PTKs) viele Ereignisse hemmen, die mit der TCR-Stimulierung in Beziehung stehen, einschließlich der Aktivierung von T-Zellen und der Erzeugung von IL-2.
In WO-A-9600082 haben wir gezeigt, dass Bromelain die Phosphorylierung von Tyrosin und die Aktivierung von ERK-2, die in T-Zellen über den TCR stimuliert wurden, hemmen konnte, oder mit kombiniertem Phorbolester plus Calcium-Ionophor. Wir haben nun gefunden, dass in Verbindung mit einer verminderten ERK-Aktivität, Bromelain die Anhäufung von IL-2-, IL-4- und IFN-γ-mRNA in T-Zellen verminderte, die mit Phorbolester und Ionophor stimuliert waren, jedoch nicht die Anhäufung von Zytokin-mRNA in Zellen beeinflusste, die über den TCR stimuliert waren. Diese Daten legen die Existenz eines TCR-aktivierten, ERK-unabhängigen Stoffwechselwegs nahe, der an der Zytokinproduktion in T-Zellen beteiligt ist.
Aus dem Stand der Technik wird klar, dass Bromelain eine Mischung ist, die eine Vielzahl verschiedener physiologischer Wirkungen hat. Es sind nicht alle Bestandteile der Bromelain-Mischung charakterisiert worden und daher ist mit Ausnahme der Stammbromelain-Protease, deren Aktivität wir beschrieben haben, nicht klar, welcher der Bestandteile für welche der vielzähligen verschiedenen Wirkungen von Bromelain verantwortlich ist. Dies ist natürlich ein großer Nachteil, falls die Bromelain-Mischung als ein Pharmazeutikum zu verabreichen ist, weil dabei gut unerwünschte Nebenwirkungen auftreten können, die sich aus der Tätigkeit irgendeines anderen Bestandteils der Bromelainmischung ergeben können, während ein Bestandteil von Bromelain die erwünschte Wirkung ergeben könnte.
Es wäre daher zuträglich, wenn einzelne Bestandteile von Bromelain, die besondere medizinische Aktivitäten hervorrufen, isoliert und separat verabreicht werden könnten, um so die Wahrscheinlichkeit von Nebenwirkungen zu vermindern. Wir haben nun eine aktive Fraktion rohen Bromelain identifiziert, die für seine Fähigkeit verantwortlich ist, die ERK-Aktivierung zu hemmen, und daher den MAP-Kinase-Stoffwechselweg zu blockieren. Auch wenn es nicht ein einzelnes Protein ist, besteht diese Fraktion aus nur einigen wenigen Bestandteilen und so ist die Wahrscheinlichkeit von Nebenwirkungen, wenn es Patienten verabreicht wird, im Vergleich mit rohem Bromelain beträchtlich vermindert.
Die Fraktion, die die Erfinder CCS genannt haben, kann mit herkömmlichen Verfahren aus der Bromelainmischung isoliert werden, z. B. durch Chromatographie. Hochdurchsatz-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist für diesen Zweck geeignet und eine besonders gute Trennung von Bromelainproteinen kann durch schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC^TM) erreicht werden, unter Verwendung eines Säulenpackungsmaterials, so wie S-Sepharose. Wie in größeren Einzelheiten in den Beispielen beschrieben werden wird, wird bei der Chromatographie auf S-Sepharose ein linearer Gradient von 0 bis 0,8 M Natriumchlorid in Acetatpuffer über 300 ml verwendet, wobei das Protein der vorliegenden Erfindung der letzte doppelte Spitzenwert aus der Säule war.
Die CCS-Fraktion enthält Proteine mit Molekulargewichten von etwa 15,07 kDa, 25,85 kDa und 27,45 kDa, wie durch SDS-PAGE bestimmt, hat isoelektrische Punkte von 10,4 und 10,45 und ist durch das folgende Verfahren erhältlich:

i. Auflösen von Bromelain in Acetatpuffer bei pH 5,0;
ii. Auftrennen der Bestandteile von Bromelain durch Schnelldurchlauf-Hochdurchsatz-Flüssigkeitschromatographie auf S-Sepharose mit Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,8 M Natriumchlorid in Acetatpuffer über 300 ml;
iii. Sammeln der Fraktion, die dem letzten doppelten Spitzenwert aus der Säule entspricht; und
iv. Isolieren des Proteins aus der in (iii) gesammelten Fraktion.

Für diese CCS genannte Fraktion ist gefunden worden, dass sie eine Anzahl möglicherweise brauchbarer Aktivitäten hat. Erstens haben wir gefunden, dass es die ERK-2- Phosphorylierung blockiert, und daher die MAP-Kinasekaskade. Überdies blockierte es die Produktion von IL-2 und die Proliferation von CD4⁺ T-Zellen. CCS beeinflusste jedoch nicht die Proliferation von Milzzellen, was nahelegt, dass es eine selektive Wirkungsweise hat. CCS blockierte auch das Wachstum menschlicher Tumorzelllinien verschieden, einschließlich Eierstock-, Lungen-, Darm-, Melanom- und Brusttumoren. Die unterschiedliche Aktivität von CCS gegen die verschiedenen Zelllinien legt weiterhin nahe, dass CCS eine selektive Wirkungsweise hat und dass es auch als ein Antikrebsmittel wirken kann. Die inhibitorische Wirkung von CCS auf ERK-2 hängt von seiner proteolytischen Aktivität ab, da E-64, ein selektiver Cysteinprotease-Inhibitor die Wirkung vom CCS außer Kraft setzen konnte.
Obwohl wir in WO-A-9724138 behauptet haben, dass Proteasen im Allgemeinen in der Lage sind, die Aktivierung von MAP-Kinase zu verringern, haben wir nun gefunden, dass dies nicht der Fall ist, da Trypsin die T-Zell-Signalisierung nicht außer Kraft setzt und in der Tat ist in anderen Untersuchungen gezeigt worden, dass es die MAPk-Aktivierung erhöht (Belham et al., 1996, Biochem. J., 320, 939–946). Auch für Thrombin, eine Protease, die in der Blutgerinnungskaskade beteiligt ist, ist gezeigt worden, dass es die Aktivierung der MAP-Kinase verstärkt (Vouret-Craviari et al., 1993, Biochem. J., 289, 209–214). Die Erfinder haben nun auch gezeigt, dass andere Proteasen, die in der rohen Bromelainmischung enthalten sind, nicht die Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs blockieren.
Es ist möglich, dass die Wirkungen von CCS auf den MAP-Kinase-Stoffwechselweg in T-Zellen durch spezifische proteolytische Wirkungen an der Zelloberfläche vermittelt werden. Es ist bekannt, dass Bromelain die CD45 Isoform RA spaltet und selektiv andere Oberflächenmoleküle von menschlichen PBMCs (mononukleäre Blutzellen) entfernt. Bromelain entfernt teilweise auch CD4 von T-Zell-Oberflächen. Da CD45 und CD4 eine obligatorische stimulatorische Rolle bei der TCR-vermittelten T-Zell-Aktivierung spielen, könnte CCS mit der TCR-Signalisierung durch Beeinflussen dieser Moleküle in Wechselwirkung treten. Obwohl die Bedeutung von CD45 und CD4 für die TCR-initiierte Signaltransduktion gut anerkannt ist, ist es möglich, deren Erfordernisse für die T-Zell-Aktivierung durch die Verwendung von Phorbolester und Calcium-Ionophor zu umgehen. Die Verwendung von kombinierten Phorbolestern und Ionophor stellt in T-Zellen die normale Funktion wieder her, die durch die Verwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren gegen die TCR-Stimulierung unempfindlich gemacht worden sind, oder die für CD45 oder p56^Lck defizient sind.
In der vorliegenden Untersuchung haben die Erfinder jedoch gezeigt, dass für die T-Zellen normale Funktion nicht wieder hergestellt wird, die mit CCS vorbehandelt wurden, wenn sie mit PMA plus Ionophor behandelt werden. Für diese inhibitorische Wirkung von CCS auf ERK-2 wird daher nicht angenommen, dass sie über die Wirkungen auf CD45 oder CD4 auf T-Zellen vermittelt wird. Möglicherweise beeinflusst CCS ein bislang nicht identifiziertes Oberflächenmolekül, welches wiederum den MAP-Kinase-Stoffwechselweg beeinflusst. Für die inhibitorische Wirkung von CCS auf die Produktion von Zytokinen wird daher nicht angenommen, dass sie über ihre Wirkungen auf CD45 oder CD4 auf T-Zellen vermittelt werden. Die inhibitorische Wirkung von CCS auf die T-Zell-Signaltransduktion erfolgt nicht wegen der Toxizität der Verbindung, da CCS nicht die Lebensfähigkeit von Milzzellen oder GA15-Zellen beeinträchtigte. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Kultur in Gegenwart von CCS für Zeitdauern von länger als 48 Stunden nicht signifikant beeinträchtigt.
Da wir gezeigt haben, dass die CCS-Fraktion von rohem Bromelain die Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs blockiert und die T-Zell-Aktivierung blockiert, kann CCS bei der Behandlung von T-Zell-vermittelten Krankheiten brauchbar sein.
Zusätzlich zu seiner Bedeutung für die Produktion von IL-2 und die Aktivierung von T-Zellen ist der MAP-Kinase-Stoffwechselweg auch für die Erzeugung von Wachstumsfaktoren, sowie epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), Plättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor (PGDF) und Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (IGF) wichtig. CCS wird daher die Produktion dieser und anderer Wachstumsfaktoren blockieren und die Produktion von anderen Zytokinen, sowie IL-4, IFN-γ, GM-GSF und vielen mehr.
Wie oben kurz erwähnt, ist CCS wahrscheinlich auch bei der Behandlung von Krebs nutzbar.
Daher kann CCS in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhütung von Krankheiten oder Zuständen nutzbar sein, die vermittelt werden durch:

i. Aktivierung von T-Zellen;
ii. Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs; oder
iii. der Produktion von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen; oder in der Behandlung oder Verhütung von Krebs.

Bei weiterer Analyse der CCS-Fraktion von Bromelain haben die vorliegenden Erfinder gefunden, dass es mehr als einen Bestandteil umfasst. Sequenzieren der Proteine in der Fraktion zeigte, dass sie aus den Cystein-Proteasen Ananain und Comosain zusammen mit verschiedenen anderen Komponenten besteht.
Es scheint daher, dass sowohl Ananain als auch Comosain oder eine Mischung der beiden für die Aktivität der CCS-Fraktion von Bromelain verantwortlich sein könnte.
Unter einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung von Ananain oder einer Mischung von Ananain und Comosain zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als ein Immunsuppressivum bereitgestellt.
Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain kann bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung oder Verhütung von Krankheiten oder Zuständen verwendet werden, die vermittelt werden durch:

i. Aktivierung von T-Zellen
ii. Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs; oder
iii. die Produktion von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen.

In unserer früheren Anmeldung WO-A-9600082 haben wir die Hemmung der MAP-Kinase-Kaskade durch rohes Bromelain diskutiert. Zu der Zeit waren wir jedoch nicht in der Lage zu bestimmen, welcher Bestandteil der rohen Bromelainmischung für diese Aktivität verantwortlich war, obwohl wir spekuliert hatten, dass es die Stammbromelain-Protease sein könnte. Wir haben nun entdeckt, dass zusätzlich zum Blockieren der Stoffwechselwege zyklischer Nukleotide die Stammbromelainprotease etwas Aktivität gegen den MAP-Kinase-Stoffwechselweg hat. Es ist jedoch weit weniger wirksam beim Blockieren der MAP-Kinase-Kaskade als die CCS-Fraktion von Bromelain. In der Tat haben wir nun gefunden, dass die CCS-Fraktion von Bromelain im Bereich von zehn Größenordnungen aktiver als die Stammbromelainprotease beim Blockieren der Aktivierung von MAP-Kinase ist.
Die Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs in T-Zellen, um IL-2 zu produzieren und die klonale Expansion von T-Zellen anzutreiben, ist ein wesentlicher Bestandteil der Immunantwort. Die Abwesenheit dieses Prozesses kann tödliche Konsequenzen haben, wie dies beim Leuten mit Aids oder genetischen Mutationen beobachtet werden kann, die zu T-Zell-Defekten führen. Die Aktivierung von T-Zellen kann jedoch auch zu schädlichen Folgen führen. Zum Beispiel können sich Autoimmunkrankheiten daraus ergeben, wenn autoreaktive T-Zellen aktiviert werden. Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain ist daher wahrscheinlich bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten nutzbar, so wie progredientisch/primärchronischer Polyarthritis, Typ-1 Diabetes Mellitus, Multipler Sklerose, Morbus Chrohn und Lupus.
Die Aktivierung von T-Zellen, die spezifisch für implantiertes Gewebe sind, kann auch zur Abstossung von Implantat oder Transplantat führen und daher kann Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain auch brauchbar sein, dieses zu verhüten.
Die Aktivierung von Allergen-spezifischen T-Zellen kann allergische Reaktionen verursachen. Inflammatorische Zytokine und andere zelluläre Produkte, so wie Histamin, werden von Zellen im Anschluss an die Aussetzung gegenüber Allergenen freigesetzt. Die Freisetzung von Histamin und inflammatorischen Zytokinen beteiligt den MAP-Kinase-Stoffwechselweg und daher wird das Blockieren des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs mit Ananain oder einer Mischung aus Ananain und Comosain wahrscheinlich eine wirksame Behandlung für Allergien seien.
Überdies ist Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain wahrscheinlich bei der Verhütung von toxischem Schock und anderen Krankheiten brauchbar, die von einer Überproduktion bakterieller Endotoxine vermittelt werden. Der toxische Schock wird durch die Produktion von Lipopolysacchariden (LPS) von gram-negativen Bakterien vermittelt. LPS löst die Produktion von TNF-α und Interleukin-1 mittels der Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs in Makrophagen aus. Die Sekretion dieser Zytokine löst eine Kaskade der Zytokinproduktion von anderen Zellen des Immunsystems aus (einschließlich T-Zellen), was zu Leukozytose, Schock, intravaskulären Coagulation und Tod führt.
Eine weitere Verwendung von Ananain oder einer Mischung aus Ananain und Comosain ist die Verhütung des programmierten Zelltods (Apoptose). Dies ist ein besonderes Ereignis, wodurch Zellen dazu stimuliert werden, ihre eigene DNA zu zerstören und zu sterben. Es ist ein wesentliches Ereignis in den meisten Immunantworten (um die Anhäufung von zu vielen Zellen zu verhindern), kann jedoch auch immunsuppressive Folgen in einigen Fällen haben, so wie bei der HIV-Infektion und beim Alter, so dass zu viele Zellen absterben und unzureichend zurückbleiben, um eine Infektion zu bekämpfen (Perandones et al., 1993, J. Immunol. 151, 3521–3529). Da die Auslösung der Apoptose von spezifischen Ereignissen der Zell-Signalisierung abhängig ist, einschließlich der Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs, sind Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain wahrscheinlich dazu wirksam, die Apoptose zu blockieren.
Die fortgesetzte Aktivierung von T-Zellen während einer chronischen Krankheit kann auch zu pathologischen Folgen führen, wie dies in bestimmten chronischen parasitären Infektionen gefunden werden kann, so wie chronische Granulatom-Krankheiten, so wie tuberkuloseartiger Lepra, Bilharziose und visceraler Leishmaniose. Des Weiteren ist die Invasion von Parasiten und Pathogenen und ihr anschließendes Überlebenden in Zellen davon abhängig, dass diese Organismen die zellulären Signalisierungsstoffwechselwege des Wirts benutzen (Bliska et al., 1993, Cell, 903–920). Zum Beispiel ist für Salmonella nachgewiesen worden, dass die MAP-Kinase phosphoryliert wird, was es den Bakterien ermöglicht, von Makrophagen endozytiert zu werden (Galan et al., 1992, Nature, 357, 588–589). Die Bakterien proliferieren dann und zerstören die Zelle. Da für Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain gezeigt worden ist, dass sie die Signalisierungstoffwechselwege des Wirts modifizieren und insbesondere die MAP-Kinase hemmen, könnte eine andere der möglichen Anwendungen sein, die Invasion durch Parasiten und Pathogene und deren Überleben in Zellen zu hemmen.
Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain kann auch brauchbar bei der Behandlung von Krebs sein und in der Tat haben wir gezeigt, dass CCS das Wachstum menschlichen Tumors in vitro blockiert. Es bleibt noch der anti-Tumor-Mechanismus der Wirkung von CCS zu bestimmen, es scheint jedoch wahrscheinlich, dass dies ein Ergebnis des Blockierens der Aktivierung des ERK-2-Stoffwechselwegs ist.
Wie zuvor erwähnt ist die Aktivierung der MAP-Kinase von p21^Ras und Raf-1 abhängig, die wichtige Onkogene sind. Die Proteine p21^Ras und Raf-1 helfen dabei, Signale von Wachstumsfaktor-Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen an MAP-Kinasen zu übertragen, um die Zellproliferation oder -differenzierung zu stimulieren. Onkogene (oder mutierte) p21^Ras- oder Raf-1-Gene erzeugen fehlerhafte Proteine, die eine Unabhängigkeit von extern bereitgestellten Wachstumsfaktoren erworben haben und gleichzeitig möglicherweise nicht länger auf externe wachstumshemmende Signale reagieren. Mutierte p21^Ras- oder Raf-1-Proteine sind daher dauerhaft hyperaktiv und ihre ungezügelte katalytische Aktivität hat eine zerstörerische Wirkung auf die Kontrolle des Zellwachstums. Onkogene p21^Ras- oder Raf-1-Gene werden daher die Bildung von Krebs und Tumoren durch Unterbrechen der normalen Kontrollen auf die Zellproliferation und -differenzierung fördern. Etwa 30% menschlicher Krebsgeschwüre haben Mutationen in einem p21^Ras-Gen.
Unter der Voraussetzung, dass die Signale, die von P21^Ras und Raf-1 vermittelt werden, mittels MAP-Kinase blockiert werden können, würde von Ananain oder einer Mischung aus Ananain und Comosain zu erwarten sein, dass sie das Wachstum von Krebs und Tumor blockieren. Die vorliegend beschriebene Proteinfraktion wäre daher bei der Behandlung vieler verschiedener Krebsarten brauchbar, einschließlich fester Krebsarten, so wie Eierstock-, Darm-, Brust- oder Lungenkrebs und Melanomen, sowie auch nicht-fester Tumoren und Leukämie.
Die Bromelainfraktion wird gewöhnlich vor der Verabreichung an Patienten formuliert werden und daher wird in einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zusammensetzung bereitgestellt, die das Ananain oder eine Mischung aus Ananain und Comosain zusammen mit einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch annehmbaren Vehikulum umfasst.
Das Ananain oder die Mischung aus Ananain und Comosain kann über eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich enteraler, z. B. oraler, buccaler, topischer oder analer Verabreichung, oder parenteraler Verabreichung, z. B. durch intravenöse, subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale Wege.
In vielen Fällen kann der orale Weg bevorzugt sein, da dies oft der Weg ist, den die Patienten am Annehmbarsten finden. Der orale Weg kann besonders nützlich sein, wenn viele Dosen des Proteins erforderlich sind.
Wenn die orale Verabreichung gewählt ist, kann es wünschenswert sein, das Ananain oder die Mischung aus Ananain und Comosain in einer enterisch beschichteten Zubereitung zu formulieren, um sein Überleben durch den Magen zu unterstützen. Auf eine andere Weise kann eine andere oral verabreichungsfähige Dosierungsform gewählt werden, z. B. ein Sirup, Elixier oder eine harte oder weiche Gelatinekapsel, von denen jedes enterisch beschichtet sein kann.
Unter bestimmten Umständen kann es jedoch bequemer sein, einen parenteralen Weg zu verwenden. Zur parenteralen Verabreichung kann das Protein in destilliertem Wasser oder einem anderen pharmazeutisch annehmbaren Lösungsmittel oder Suspensionsmittel formuliert sein.
Eine geeignete Dosis des Ananains oder der Mischung von Ananain und Comosain, die einem Patienten verabreicht werden soll, kann von einem Kliniker bestimmt werden. Als ein Anhaltspunkt kann eine geeignete Dosis jedoch von etwa 0,5 bis 20 mg/kg Körpergewicht sein. Es wird erwartet, dass in den meisten Fällen die Dosis von etwa 1 bis 15 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise von 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht sein wird. Für einen Menschen, der ein Gewicht von etwa 70 kg hat, würde daher eine typische Dosis von etwa 70 bis 700 mg sein.
Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die folgenden Beispiele und auf die Zeichnungen beschrieben werden, in welchen:
1 eine diagrammatische Darstellung der Ereignisse der Signaltransduktion ist, die mit der T-Zellaktivierung in Beziehung stehen, die zur Produktion von IL-2 führen.
2 ein Elutionsprofil im Ultraviolett rohen Bromelains nach Kationenaustausch-Chromatographie auf SP Sepharose Hochdurchsatzmedium ist.
3 ein Graph ist, der die proteolytische Aktivität und den Proteingehalt roher Bromelainfraktionen nach Kationen-Austauschchromatographie auf SP Sepharose-Hochdurchsatzmedien zeigt.
4 ein SDS-PAGE von vereinigten Fraktionen von SP Sepharose Hochdurchsatz-Chromatographie ist, auf 4–20% T-Gradientengelen laufen gelassen, wobei die Spuren 1 bis 4 und 6 bis 9 die Proteine CCT, CCV, CCX und CCZ, bzw. CCV, CCW, CCU und CCS enthalten und Spuren 5 und 10 Molekulargewichtsmarker enthalten.
5 die isoelektrische Fokussierung vereinigter Fraktionen zeigt, die auf pH 3–11 Gradientengelen laufen gelassen wurden, wobei Spuren 1, 11 und 12 Hoch-IEF-Marker zeigen, Spuren 2 und 13 rohes Bromelain zeigen und Spuren 3 bis 10 die Proteine CCT, CCV, CCX, CCZ, CCV, CCW, CCU bzw. CCS zeigen.
6 ein Westernblot unter Verwendung von anti-Phosphotyrosin-mAk ist, der beweist, dass CCS die Tyrosin-Phosphorylierung des p42 kDa (ERK-2) Proteins vermindert. Th0-Zellen wurden mit Bromelainfraktionen (50 μg/mL) für 30 min behandelt, gewaschen und dann mit kombiniertem PMA (20 ng/mL) und Ionophor (1 μM) für 5 min stimuliert. Nicht stimulierte Zellen dienten als Kontrollen. Die Zellen wurden dann lysiert und postnukleäre Überstände wurden SDS-PAGE und Westernblotten unterzogen. In dieser Figur deuten gefüllte Symbole durch kombiniertes PMA plus Ionophor phosphorylierte Proteine an. Leere Symbole zeigen ERK-2 Protein, reduziert durch Behandlung mit CCS.
7 ein Westerblot unter Verwendung von anti-Phosphotyrosin-mAk ist, der beweist, dass CCS die Tyrosin-Phosphorylierung von Proteinsubstraten erhöht. Th0-Zellen wurden mit CCS, rohem Bromelain (Brom), Stamm-Bromelainprotease (SBP) oder Fraktion CCT (50 μg/mL) für 30 min behandelt, gewaschen und dann mit vereinigtem PMA (20 ng/mL) und Ionophor (1 μM) für 5 min stimuliert. Nicht stimulierte Zellen dienten als Kontrollen (Cont). Zellen wurden dann lysiert und postnukleäre Überstände wurden SDS-PAGE und Westernblotten unterzogen. In dieser Figur deuten gefüllte Symbole durch CCS phosphorylierte Proteine an, jedoch nicht durch andere Behandlungen. Leere Symbole zeigen Phosphoproteine Protein, durch Behandlung mit CCS und rohem Bromelain behandelt, an.
8 ein Westernblot unter Verwendung von anti-Phosphotyrosin-mAk ist, der zeigt, dass die inhibitorische Wirkung von CCS auf ERK-2 von seiner proteolytischen Aktivität abhängig ist und in einer dosisabhängigen Art und Weise auftritt. Th0-Zellen wurden mit CCS (0 bis 25 μg/mL) behandelt oder mit CCS, das mit dem ausgewählten Proteaseinhibitor E-64 für 30 min inkubiert war. Zellen wurden dann gewaschen und dann mit vereinigtem PMA (20 ng/mL) und Ionophor (1 μM) für 5 min stimuliert. Die Zellen wurden dann lysiert und postnukleäre Überständen wurden SDS-PAGE wird und Westernblotten unterzogen. In dieser Figur zeigen gefüllte Symbole durch CCS phosphorylierte Proteine an. Leere Symbole zeigen ERK-2 Phosphoprotein an, das durch aktives CCS inhibiert wurde, jedoch nicht durch inaktiviertes CCS.
9 ein Immunblot ist, der bestätigt, dass das 42 kDa Phosphoprotein, das durch CCS inhibiert wurde, ERK-2 ist. Th0-Zellen wurden mit CCS (50 μg/mL) für 30 min behandelt, oder unbehandelt, gewaschen und dann mit vereinigtem PMA (20 ng/mL) und Ionophor (1 μM) für 5 min stimuliert. Die Zellusate wurden mit anti-ERK-2-mAk immungeblottet.
10 ein Westernblot unter Verwendung von anti-Phosphotyrosin-mAk ist, der zeigt, dass vernetzter anti-CD3ε-mAk die Tyrosin-Phosphorylierung multipler Proteine induziert. Th0-Zellen wurden mit vernetztem anti-CD3ε für 0 bis 20 min stimuliert. Die Zellen wurden dann lysiert und postnukleäre Überstände wurden SDS-PAGE und Westernblotten unterzogen. Gefüllte Symbole bezeichnen durch anti-CD3ε-mAk induzierte Tyrosin-phosphorylierte Proteine.
11 ein Westernblot unter Verwendung von anti-Phosphotyrosin-mAk ist, der belegt, dass CCS die Tyrosin-Phosphorylierung in TCR-stimulierten T-Zellen hemmt. T-Zellen wurden mit CCS (0 bis 5 μg/mL) für 30 min behandelt, gewaschen und dann mit anti-CD3ε-mAk für 5 min vernetzt. Die Zellen wurden dann lysiert und postnukleäre Überstände wurden SDS-PAGE und Westernblotten unterzogen. In dieser Figur bezeichnen die Symbole die anti-CD3ε-mAk-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung von ERK-2, die durch CCS vermindert ist.
12 ein Westernblot unter Verwendung von anti-Raf-1-mAk ist, welcher zeigt, dass CCS die Mobilitätsverschiebung von Raf-1 hemmt. Th0-Zellen wurden mit CCS (0 bis 50 μg/mL) für 30 min behandelt, gewaschen, und dann entweder mit (A) vereinigtem PMA plus Ionophor stimuliert oder (B) dann für 5 min mit anti-CD3ε-mAk vernetzt. Die Zellen wurden dann lysiert und postnukleäre Überstände wurden SDS-PAGE und Westernblotten unterzogen.
13 ein Paar von Graphen ist, die zeigen, dass CCS die Produktion von IL-2 und die Proliferation in gereinigten CD4⁺ T-Zellen vermindert. Die T-Zellen wurden mit CCS (50 μg/mL) behandelt, gewaschen, und dann in entweder Medium allein oder mit immobilisiertem anti-CD3ε mAk und löslichem anti-CD28 mAk kultiviert. (A) Die Produktion von IL-2 wurde durch den CTL-L-Test bestimmt, wie in Beispiel 5 beschrieben. (B) Die Proliferation wurde durch Einbau von ³H-Thymidin bestimmt. CD4⁺ T-Zellen, die in Abwesenheit von mAk (Stimulus) kultiviert wurden, erzeugten kein nachweisbares IL-2 und proliferieren nicht.
14 ein Paar von Graphen ist die zeigen, dass CCS die Produktion von IL-2 durch Milzzellen vermindert, jedoch die Proliferation von Milzzellen nicht hemmt. Die Milzzellen wurden mit CCS (50 μg/mL) behandelt, gewaschen und dann in entweder Medium allein oder mit immobilisiertem anti-CD3ε-mAk kultiviert. (A) Die Produktion von IL-2 wurde durch den CTL-L-Test bestimmt, wie in Beispiel 5 beschrieben. (B) Die Proliferation wurde durch den Einbau von ³H-Thymidin bestimmt. Die in Abwesenheit von mAk (Stimulus) kultivierten Milzzellen produzierten kein nachweisbares IL-2 und proliferieren nicht).
15 ein Plot ist, der zeigt, dass CCS das Zellwachstum von Tumoren in vitro hemmt. Krebszelllinien wurden mit CCS (50, 10, 2,5, 1 und 0,25 μg/mL) oder Wasser als eine Kontrolle behandelt. Nach einer Behandlung über 96 h wurde die Wirkung von CCS auf das Wachstum von Tumorzellen bewertet. Die Säulen stellen die 50% inhibitorischen Konzentrationen (IC₅₀ μg/mL) von CCS dar (die Menge an CCS, die erforderlich ist, um das Wachstum von Tumorzellen zu 50% zu hemmen).
Beispiel 1 – Reinigung von Bromelainproteinen
a. Materialien
Reagenzien: Bromelain (E. C 3.4.22.4; proteolytische Aktivität 1,541 nmol/min/mg) wurde von Solvay Inc. (Deutschland) erhalten. Schnelllauf-S-Sepharose, Pharmalyte 3–10^TM, Ampholine 9–11^TM, Ready Mix IEF^TM (Acrylamid, Bisacrylamid) und IEF^TM-Marker wurden von Pharmacia Biotech erhalten. Vorgegossene 4–20% Acrylamidgele und Molekulargewichtsmarker mit breitem Bereich wurden von Bio-Rad Laboratories erhalten. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität und entweder von Sigma Chemical Co. oder British Drug House erhalten.
b. Proteinasetest
Die proteolytische Aktivität von Bromelain wurde durch Verwendung eines hauseigenen Tests auf Mikrotiterplattenbasis bestimmt, unter Verwendung des synthetischen Substrats Z-Arg-Arg-pNA. Dieser Test basierte auf demjenigen, der von Filippova et al. in Anal. Biochem., 143, 293–297 (1984) beschrieben wurde. Das Substrat war Z-Arg-Arg-pNA, wie von Napper et al. in Biochem. J., 301, 727–735 (1994) beschrieben.
c. Proteintest
Protein wurde unter Verwendung eines Testkits, von Bio-Rad geliefert, gemessen, der ein modifiziertes Verfahren nach Lowry et al. (J. Biol. Chem. (1951) 193, 265–275) ist. Die Proben wurden mit Standards von Rinderserumalbumin (0 bis 1,5 mg/mL) verglichen, entweder in 0,9% Salzlösung oder 20 mM Acetatpuffer pH 5,0 hergestellt, wie es angemessen war.
d. Zubereitung von Bromelain
Die nachfolgenden Schritte wurden alle bei Umgebungstemperatur (20 bis 25°C) durchgeführt. Eine Lösung an Bromelain (30 mg/mL) wurde durch Auflösen von 450 mg Puder in 15 mL 20 mM Acetatpuffer (pH 5,0), der 0,1 mM Natrium-EDTA enthielt, hergestellt. Die Lösung wurde in 10 × 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen abgegeben und bei 13.000 × g für 10 min zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Die klaren Überstände wurden vereinigt und für die Chromatographie verwendet.
e. Schnell laufende Hochdurchsatz-Chromatographie auf S-Sepharose
Eine schnell laufende Säule mit S-Sepharose wurde durch Packen von 25 mL Medium in eine XK 16/20^TM-Säule (Pharmacia Biotech) hergestellt und mit 20 mM Acetatpuffer (pH 5,0) equilibriert, der 0,1 mM EDTA enthielt, auf einem FPLC^TM System bei 3 mL/min. 5 mL Bromelainlösung wurden auf die Säule gespritzt. Ungebundenes Protein wurde gesammelt und die Säule wurde mit 100 mL Acetatpuffer gewaschen. An die Säule gebundenes Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,8 M NaCl in Acetatpuffer über 300 mL eluiert. Fraktionen von 5 mL wurden während des Gradienten gesammelt und 2 zeigt ein typisches UV-Chromatogramm rohen Bromelains, das mit diesem Verfahren erhalten wurde.
Die Fraktionen wurden dann auf Protein und proteolytische Aktivität analysiert, wie oben beschrieben, und 3 zeigt die proteolytische Aktivität gegen das synthetische Peptid Z-Arg-Arg-pNA und den Proteingehalt der einzelnen Fraktionen. Das Profil des Proteingehalts spiegelt dasjenige des UV dicht wieder, wie erwartet, jedoch ist die proteolytische Hauptaktivität auf die zwei Hauptspitzenwerte beschränkt, die denjenigen der Bromelainprotease (SBP) entsprechen. Geringe Aktivitäten wurden in anderen Bereichen des Chromatogramms beobachtet, die anderen Proteasen, die sich von SBP unterscheiden, entsprechen können, so wie die erst später eluierende CCS-Fraktion, die Ananain und Comosain enthält.
Die Haupt-Spitzenwerte, die aus dem UV-Profil identifiziert wurden, wurden aus drei aufeinander folgenden Läufen vereinigt und wie in Tabelle 1 angezeigt benannt. Die vereinigten Fraktionen wurden für die physiko-chemische Charakterisierung verwendet. Vereinigte Fraktionen wurden durch Ultrafiltration aufkonzentriert und unter Verwendung von PD10-Säulen in isotonische Salzlösung (0,9% Gew/Vol NaCl) umgepuffert. Der Proteingehalt und die Aktivität gegen Z-Arg-Arg-pNA wurden vor dem biologischen Testen errechnet und sind in Tabelle 2 gezeigt.

Die vereinigten Fraktionen wurden für die Analyse behandelt, die unten beschrieben ist. Tabelle 1. Zusammenfassung der vereinigten Fraktionen von Bromelain (QC2322), auf SP-Sepharose HP fraktioniert

Bestandteil	Beschreibung	Vereinigte Fraktionen (einschließlich)
CCT	Durchfluss (ungebundene Bestandteile)	Ungebundener Durchfluss durch die Säule
CCV	Erster Spitzenwert aus der Säule	8–9
CCX	Zweiter scharfer Spitzenwert aus der Säule	13–14
CCZ	Kleiner Spitzenwert auf der ansteigenden Kante des dritten Bromelain-Hauptspitzenwerts	19–20
CCV	Erster Bromelain- Hauptspitzenwert	23–24
CCW	Zweiter Bromelain- Hauptspitzenwert	27–29
CCU	Kleiner Spitzenwert auf der absteigenden Kante des zweiten Bromelain-Hauptspitzenwerts	33–34
CCS	Letzter doppelter Spitzenwert aus der Säule	39–44

Tabelle 2. Berechneter Proteingehalt und Aktivität gegen Z-Arg-Arg-pNA vereinigter Fraktionen, die für das Testen der biologischen Aktivität verwendet wurden.

Vereinigte Fraktionen	Z-Arg-Arg-pNA-Aktivität (μMole/min/mL)	Proteingehalt (mg/mL)
CCT	11,30	1,00
CCV	9,78	1,00
CCX	71,71	1,00
CCZ	688,81	1,00
CCV	1500,0	0,574
CCW	1500,0	0,543
CCU	1500,0	0,421
CCS	379,76	1,00

f. Verarbeiten vereinigter Fraktionen
Die proteolytische Aktivität und der Proteingehalt vereinigter Fraktionen wurden bestimmt und die Konzentrationen auf etwa entweder 1,4 mg/mL Protein oder 105 nmol/min/mL Proteinaseaktivität unter Verwendung einer Filtron^TM gerührten Zelle eingestellt, die eine Ultrafiltrationsmembran mit einem nominalen Molekulargewichtsausschluss von 10 kDa enthielt. Die Fraktionen wurden dann unter Verwendung von PD10^TM Säulen (Pharmacia Biotech) in isotonische Salzlösung (0,9% Gew/Vol NaCl) umgepuffert, steril filtriert (0,2 um) und auf den Proteingehalt oder die proteolytische Aktivität eingestellt. Die Proben wurden dann bei –80°C eingefroren und in den in vitro Untersuchungen, die unten beschrieben sind, verwendet.
g. Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Vereinigte FPLC^TM-Proben wurden mittels Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auf vorgegossenen 4 bis 20% T-Gradientengelen analysiert. Die Proben wurden durch Säurefällung für die Elektrophorese vorbereitet, bei der 100 μL mit einem gleichen Volumen an 20 Gew/Vol-% Trichloressigsäure (TCA) gemischt wurden. Gefälltes Protein wurde durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 10 min gesammelt und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde zweimal mit 0,5 mL Diethylether gewaschen und bei Umgebungstemperatur an der Luft trocknen gelassen. Die Pellets wurden dann 300 μL SDS-PAGE-Probenpuffer (62,5 mmol Tris/HCl pH 6,8, mit einem Gehalt an 10 Vol/Vol-% Glycerin, 2 Gew/Vol-% Natriumdodecylsulfat und 40 mM Dithiothreitol) und auf 95°C in einem Wasserbad erwärmt.
Molekulargewichtsstandards mit breitem Bereich für die SDS-PAGE, 1: 20 in SDS-PAGE-Probenpuffer verdünnt, wurden ähnlich behandelt und mit den Proben laufen gelassen. Die Gele wurden in einem Mini-Protean II^TM Elektrophoresesystem entsprechend des Protokolls von Bio-Rad bei 240 V und bis die Farbfront das Ende des Gels erreichte (30 bis 45 min) laufen gelassen.
Nach der Elektrophorese wurden die getrennten Proteine mit umlaufendem Mischen in einer Lösung aus 0,075 Gew/Vol-% kolloidalem Brilliantblau G-250, die 1,5 Vol/Vol-% Phosphorsäure, 11,25 Gew/Vol-% Ammoniumsulfat und 25 Vol/Vol-% Methanol enthielt, gefärbt. Die Gele wurden in einer Lösung aus 25 Vol/Vol-% Methanol und 10 Vol/Vol-% Essigsäure entfärbt, um einen klaren Hintergrund zu erhalten.
Ergebnisse
Die Reinheit der Fraktionen ist mittels SDS-PAGE in 4 gezeigt. Alle der vereinigten Fraktionen außer des Säulendurchlaufs (CCT) zeigten, dass das vorliegende Hauptprotein von einem Molekulargewicht zwischen etwa 25–28 kDa war. Dies entspricht dem Molekulargewicht von Cysteinproteinasen, die von anderen Autoren aus Bromelain isoliert wurden (Rowan et al., Methods in Enzymology, (1994), 244, 555–568). Die Reinheit der Fraktionen CCX, CCZ, CCV und CCW scheint hoch zu sein. Geringe Bestandteile niedrigeren Molekulargewichts können in einigen Fraktionen beobachtet werden, insbesondere CCT, CCV, CCX und CCS. Vereinigte Fraktionen CCU und CCS enthalten eine Dublette zwischen 25–28 kDa; die höheren Beladungen des Gels der Fraktionen CCX, CCZ, CCV und CCW bedeuten, dass auch in diesen Fraktionen Dublett-Banden vorhanden sein können. Eine Zusammenfassung der Bestandteile und ihrer errechneten Molekulargewichte in den vereinigten Fraktionen, wie durch SDS-PAGE bestimmt, ist in Tabelle 3 gezeigt.

Die Proteine in den vereinigten Fraktionen CCX, CCZ, CCV + CCW und CCU wurden nach SDS-PAGE durch Westernblotten auf Nitrocellulose übertragen und mit Kaninchenantiseren sondiert, die gegen gereinigte Stamm-Bromelainprotease (SBP) erzeugt wurden (Ergebnisse nicht gezeigt). Alle Proteinbanden in diesen vereinigten Fraktionen wurden durch Antikörper in den Seren erkannt, was immunologisch ähnliche Proteine anzeigt, die wahrscheinlich zur Familie der Cysteinproteinasen von Enzymen gehören. Tabelle 3. Zusammenfassung der Molekulargewichte von Proteinen, die in vereinigten Fraktionen von SP-Sepharose HP gefunden wurden, wie durch SDS-PAGE bestimmt.

Vereinigte Fraktionen	Molekulargewicht (kDa) von Hauptproteinbanden	Molekulargewicht (kDa) von kleinen Proteinbanden
CCT	76,03	15,07
CCV	15,07, 25,85, 28,28, 76,06
CCX	25,08	15,07, 76,03
CCZ	27,45	13,37, 16,49, 76,03
CCV	27,45	6,5
CCW	27,45
CCU	27,45 28,28
CCS	15,07, 25,85, 27,45

h. Isoelektrisches Fokussieren
Vereinigte Fraktionen (0,5 bis 1,0 mg/mL) wurden 1: 3 mit entionisiertem Wasser verdünnt und auf Gradientengelen von pH 3 bis 11 laufen gelassen. Die Gele wurden unter Verwendung von Readymix IEF^TM gegossen, um ein 5,5% T, 3% C-Polyacrylamidgel herzustellen, dass 10 Vol/Vol-% Glycerin, 5,0% Pharmalyte 3–10^TM und 2,5% Ampholine 9–11^TM enthielt. In Kürze wurden 10 μL Probe und Marker für hohen pI nach Vorfokussieren bei 700 V auf das Gel geladen. Der Probeneintrag war für 10 min bei 500 V, Fokussieren war bei 2.500 V für 1,5 h und das Schärfen der Banden bei 3.000 V für 10 min. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in einer Lösung aus 20 Gew/Vol-% TCA für 30 min fixiert, für 30 min in Entfärber gewaschen, um TCA zu entfernen, und mit Brilliantblau G-250 gefärbt, wie für die SDS-PAGE beschrieben (siehe oben).
Ergebnisse
Die 5 zeigt, dass alle Fraktionen außer CCX basische Proteine enthielten, die jenseits das pI-Markers 9,3 fokussierten. Örtliche Ladungswechselwirkungen mit den funktionellen Gruppen des chromatographischen Mediums könnten erklären, weshalb Proteine von pI 3,8 und 3,85 in CCX auf ein Kationenaustauschharz bei pH 5,0 adsorbierten. CCZ war als eine einzelne Bande bei pI 9,7 vorhanden, während vereinigte Fraktionen CCV, CCW und CCU mehrfache Banden isoelektrischer Punkte im Bereich von pH 9,5–9,8 enthielten. Wenigstens ein Teil dieser Heterogenität kann durch Abweichungen im Kohlenhydratrest eines gemeinsamen Rückgrats des Stamm-Bromelainproteins erklärt werden. Diese Werte sind in Übereinstimmung mit denjenigen, die in der Literatur mit pI 9,45–9,55 für Bromelain angegeben werden (Rowan et al., Methods in Enzymology, (1994), 244, 555–568). Die vereinigte Fraktion CCS enthält zwei basische Proteine mit einem pI größer als 10,25.

Schätzungen durch Extrapolation geben pIs von 10,4 und 10,45. Diese entsprechen Ananain und Comosain und sind in Übereinstimmung mit anderen Schätzungen (Rowan et al., wie oben) von pIs größer als 10. Die pIs von Proteinen in jeder der vereinigten Fraktionen sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4. Zusammenfassung der geschätzten isoelektrischen Punkte von Proteinen, die in vereinigten Fraktionen aus SP-Sepharose HP gefunden wurden.

Vereinigte Fraktionen	Isoelektrische Punkte von Proteinen
CCT	nicht nachgewiesen
CCV	nicht nachgewiesen
CCX	3,8 3,85
CCZ	9,7
CCV	9,6 9,7
CCW	9,57, 9,6, 9,7
CCU	9,57, 9,6, 9,75
CCS	10,4, 10,45

Beispiel 2 – NH₂-terminale Aminosäureanalyse von Bestandteilen von Bromelain
In einem getrennten Experiment wurden vereinigte Fraktionen von Bromelain auf SDS-PAGE laufen gelassen und wie oben auf PVDF-Membran geblottet. Die Membran wurde mit 0,025 Gew/Vol-%, Coomassie-Blau R-250 für 10 min gefärbt, das in 40 Vol/Vol-% Methanol gelöst war, gefolgt von Entfärben in 50 Vol/Vol-% Methanol. Die Membran wurde an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet und das NH₂-terminale Aminosäuresequenzieren der gefärbten Proteine wurde durchgeführt. In Kürze wurde die Proteinbande aus der Membran ausgeschnitten und in die obere Patrone des Sequenzierers platziert. Die NH₂-terminale Aminosäureanalyse von Bestandteilen von Bromelain wurde durch den Abbau nach Edman unter Verwendung eines Gasphasen-Sequenzierers (Applied Biosystems) bestimmt, der mit einem verbundenen Phenylthiohydantoin-Aminosäureanalysator ausgerüstet war. Tabelle 5 zeigt die ersten 21 NH₂-terminalen Aminosauren von CCZ, CCX, Stamm-Bromelainprotease, Ananain und Comosain. Tabelle 5. NH₂-terminale Sequenzähnlichkeiten von CCZ-Protein und denjenigen bekannter Proteinasen, die aus Bromelain isoliert sind.
Alle Proteine teilen sich Sequenzhomologien. Ananain und Comosain unterscheiden sich in 2 von 20 Aminosäuren, wenn sie mit der Stammbromelainprotease verglichen werden. CCZ unterscheidet sich in 8 von 21 Aminosäuren im Vergleich zu Stamm-Bromelainprotease. CCZ unterscheidet sich von Ananain und Comosain in 6 von 20 Aminosäuren. Comosain unterscheidet sich in 2 Aminosäuren von Ananain. Während es klar ist, dass diese Proteine strukturell verwandt sind, sind sie alle unterschiedlich und zeigen eine Divergenz voneinander. Diese Proteinasen unterscheiden sich auch in ihrer Substratspezifität der Proteinase und in ihrer biologischen Aktivität.
Beispiel 3 – die Fraktion CCS hemmt die Tyrosinphosphorylierung von p42 kDa Phosphoprotein.
a. Materialien
Antikörper: anti-CD3ε-Ketten-mAk (145-2C11) und anti-CD28-mAk (PV-1) wurden von Pharmingen (San Diego, CA) erworben, und anti-Hamster IgG Ak der Ziege stammte von Sigma (Dorset, Vereinigtes Königreich). Anti-Phosphotyrosin-mAk der Maus (4G10), anti-MAPk R2 (ERK-2)-mAk der Maus und anti-Raf-1-mAk der Maus stammten von UBI (Lake Placid, NY). Anti-Maus der Ziege und anti-Kaninchen IgG der Ziege, an Meerettichperoxidase (MPO) konjugiert, stammten von Bio-Rad (Hemel Hemstead, Hertforshire, V. K.). Polyklonaler phosphospezifischer MAPk IgG des Kaninchens, der Tyrosin-phosphorylierte p44 und p42 MAPks erkennt, stammten von New England BioLabs (Hitchin, Hertforshire, V. K.).
Reagenzien: Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und Calciumionophor A23187 wurden von Sigma gekauft. Bromelain (E. C 3.4.22.4; proteolytische Aktivität 1,541 nmol/min/mg) wurden von Solvay Inc. (Deutschland) erhalten. E-64 (L-Transepoxysuccinylleucylamido-(4-guanidino)-butan, ein selektiver Cysteinproteinase-Inhibitor, stammte von Sigma.
Zellen: Das T-Zell Hybrodom GA15 war ein großzügiges Geschenk von B. Fox (ImmuLogic Pharmaceutical Corporation, Boston, MA). GA15 wurde erzeugt durch Verschmelzen des Thymoms BW5147 mit dem T_h2-Klon F4, spezifisch für KLH in Assoziierung mit I-A^b, und wurde wie zuvor beschrieben erhalten (Fox, 1993, Int. Immunol., 5, 323–330). GA15 weist einen Th0-Zell-Phänotyp auf, da IL-2, IL-4 und IFN-γ im Anschluss an die Stimulierung mit vernetztem anti-CD3ε-mAk produziert wird (Fox, 1993).
b. Stimulierung von T-Zellen.
Die in RPMI 1640 suspendierten Zellen (2 × 10⁷) wurden mit CCS (1 bis 50 μg/mL) in Salzlösung (0,9 Gew/Vol-%) verdünnt, für 30 min bei 37°C behandelt. Scheinbehandelte Zellen wurden mit einem gleichen Volumen Salzlösung (Verdünner) behandelt. Bei hohen Konzentrationen von CCS (50 oder 100 μg/mL) trat die Aggregation von Zellen auf, wie zuvor in Untersuchungen mit rohem Bromelain festgestellt. Im Anschluss an Behandlung wurden Zellaggregate durch 3-faches Waschen der Zellen und dann Resuspendieren in frischem RPMI sanft dispergiert. Die Zellen wurden über die Zelloberfläche mit vernetztem mAk gegen TCR (anti-CD3ε), oder direkt unter Verwendung von vereinigtem PMA (20 ng/mL) und Ionophor (1 μM) für die in den Figurenunterschriften und im Text angegebenen Zeiten stimuliert.
Die Stimulierung über den TCR wurde durch zuerst Inkubieren der T-Zellen auf Eis für 30 min mit anti-CD3ε-mAk (20 μg/mL) durchgeführt. Überschüssige mAk wurde dann durch Waschen einmal bei 4°C entfernt und anti-CD3ε-mAk wurde mit anti-Hamster IgG der Ziege (20 μg/mL) bei 37°C vernetzt. Die Stimulierung wurde durch Zugabe von eiskaltem Lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 75 mM NaCl, 2mM EDTA, 0,5% Triton X-100, 2mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumfluorid, 10 mM Natriumpyrophosphat, 74 μg/mL Leupeptin, 740 μM PMSF und 74 μg/mL Aprotinin) für 30 min mit kontinuierlicher Drehung bei 4°C beendet. Die Lysate wurden geklärt (14.000 × g für 10 min) und ein gleiches Volumen 2 × Probenpuffer für die SDS-PAGE (50 mM Tris, pH 7, 700 mM 2-ME, 50 Vol/Vol-% Glycerin, 2 Gew/Vol-% SDS, 0,01 Gew/Vol-% Bromphenol-Blau) wurde den postnukleären Überständen zugegeben. Die Proteine wurden bei 100°C für 5 min solubilisiert und Proben, die 1 × 10⁶ Zellequivalente enthielten, wurden durch SDS-PAGE aufgelöst.
c. Immunblotten.
Aufgetrennte Proteine wurden auf Membranen aus Nitrocellulose (Bio-Rad) übertragen, die dann mit 5 Gew/Vol-% Rinderserumalbumin (Sigma, Fraktion V, RSA), 0,1%, Nonidet P-40^TM in Tris-gepufferter Salzlösung (170 mM NaCl und 50 mM Tris, pH 7,4; TBS) geblockt. Immunblots wurden mit den passenden Antikörpern inkubiert, wie in den Unterschriften der Figuren angezeigt ist. Primäre Antikörper wurden in Verdünnungspuffer für Antikörper bei 4°C für 2 h verdünnt, der aus 0,5 Gew/Vol-% RSA, 0,1 Vol/Vol-% Tween-20 in TBS bestand, gefolgt von Detektion mit dem passenden sekundären Antikörper, der an Meerettichperoxidase gekoppelt war, und in Verdünnungspuffer für Antikörper verdünnt war, bei 4°C für 1 h. Im Anschluss an jeden Inkubationsschritt wurden die Membranen ausführlich mit 0,1% Tween-20 in TBS gewaschen. Die Immunreaktivität wurde unter Verwendung des Chemilumineszenz-Nachweissystems ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) bestimmt.
d. Hemmung der proteolytischen Aktivität von CCS.
Ein spezifischer Inhibitor für Cysteinproteasen, E-64, wurde verwendet, um die proteolytische Aktivität von CCS zu inaktivieren. CCS (25 μg/mL), in 3 μM Dithiotreitol, 100 μM E-64, 60 mM Natriumacetat (pH 5) verdünnt, wurde für 10 min bei 30°C inkubiert. Das inaktivierte CCS wurde dann über Nacht in Salzlösung bei 4°C dialysiert. Frühere Untersuchungen mit rohem Bromelain haben gezeigt, dass diese Bedingungen ausreichend sind, um eine Inaktivierung von 99,5% der proteolytischen Aktivität auszulösen, wie mit dem Substrat Z-Arg-Arg-pNA getestet wird (siehe oben). T-Zellen wurden mit E-64 inaktiviertem CCS (25 μg/mL) behandelt und mit unbehandelten CCS und scheinbehandeltem T-Zellen, die mit PMA plus Ionophor stimuliert waren, verglichen.
Ergebnisse
a. Die Fraktion CCS hemmt die Tyrosinphosphorylierung von p42 kDa
Phosphoprotein. Wir haben zuvor gezeigt, dass Bromelain die Tyrosinphosphorylierung von ERK-2 im Anschluss an die Stimulierung von T-Zellen mit kombiniertem PMA plus Calciumionophor blockiert ( WO-A-96/00082 ). Die Stimulation von T-Zellen mit Phorbolester und Ionophor wirkt synergistisch, um viele Eigenschaften der TCR-Stimulierung zu reproduzieren, so wie die Sekretion von IL-2, die Expression des IL-2-Rezeptors und die Proliferation von T-Zellen (Truneh et al., 1985, Nature, 313, 318–320; Rayter et al., 1992 EMBO 11, 4549–4556). Phorbolester können das Auslösen des Antigenrezeptors nachahmen und die durch TCR induzierten Proteintyrosinkinasen umgehen, um ERK-2 durch eine direkte Agonistenwirkung auf PKC und p21^Ras zu aktivieren. Der Calciumionophor A23187 induziert eine erhöhte intrazelluläre Freisetzung von Ca¹⁺ und ahmt daher die Wirkung von Inositol-1, 4,5-triphosphat (IP₃) nach. Jedoch stimulieren Phorbolester und Ionophor die PKC-Stoffwechselwege, die nicht durch TCR kontrolliert werden (Izquierdo et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12, 3305–3312), was getrennte intrazelluläre Stoffwechselwege innerhalb der T-Zellen nahelegt, die die Funktion der T-Zellen regulieren. Wir haben daher durch Untersuchen seiner Wirkung auf PMA und die durch Ionophor induzierte Tyrosinphosphorylierung untersucht, welche Fraktion von Bromelain die Signalisierung von T-Zellen über den TCR-unabhängigen Stoffwechselweg blockieren könnte.
Die Stimulierung von T-Zellen mit vereinigtem Ionophor und PMA induziert die Tyrosinphosphorylierung mehrerer Proteine einschließlich derjenigen von etwa 100 kDa, 85 kDa, 42 kDa und 38 kDa. Die Vorbehandlung mit CCS (50 μg/mL) reduzierte die Tyrosinphosphorylierung des p42 kDa Proteins und hemmte die Phosphorylierung eines anderen Substrats (6) nicht signifikant. In zwei Experimenten erhöhte CCS, jedoch keine andere Fraktion, auch die Tyrosinphosphorylierung mit Proteinen von ca. 36 kDa, 38 kDa, 85 kDa, 94 kDa und 102 kDa (7 und 8).
Die Fähigkeit von CCS, die Tyrosinphosphorylierung des 42 kDa Phosphoproteins zu blockieren, war dosisabhängig (8) und von seiner proteolytischen Aktivität abhängig, da E-64 die hemmende Wirkung von CCS auf die p42 kDa Phosphorylierung vollständig außer Kraft setzte (8). Die Behandlung von T-Zellen mit E-64 beeinflusste nicht die durch PMA und Ionophor induzierte T-Zell-Signalisierung.
CCS inhibiert die ERK-2 Tyrosinphosphorylierung. Wir nahmen an, dass das 42 kDa Phosphoprotein, das durch CCS inhibiert wurde, die MAPk ERK-2 war, sodass wir Immunblot-Analysen mit spezifischen anti-ERK-2-mAks und anti-Phospho MAPk-Antikörpern durchführten, welcher spezifisch ERK-1 und ERK-2 nur detektiert, wenn sie katalytisch durch Phosphorylierung an Tyr204 aktiviert sind. Immunblotten von mit CCS behandelten Zellen, die mit PMA plus Ionophor stimuliert worden waren, bestätigte, dass das p42 kDa Phosphoprotein in der Tat ERK-2 war (9).
CCS vermindert die durch TCR induzierte Tyrosinphosphorylierung von ERK. Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von CCS auf die TCR-vermittelte Signaltransduktion durch Einschätzen der Tyrosinsubstratphosphorylierung von mit vernetztem anti-CD3ε-mAk stimulierten GA15. Die Immunblots von Lysaten von GA15 unter Verwendung spezifischer anti-Phosphotyrosin-mAk zeigten eine erhöhte Tyrosinphosphorylierung mehrfacher Proteine auf, einschließlich derjenigen von etwa 120 kDa, 100 kDa, 85 kDa, 76 kDa, 70 kDa, 42 kDa und 40 kDa, was in Übereinstimmung mit den Phosphoproteinen steht, die in anderen T-Zell-Linien im Anschluss an die TCR-Ligation beobachtet wurden (June et al. 1990, J. Immunol., 144, 1591–1599 und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 7722–7726, rezensiert von Cantrell, 1996, Annu. Rev. Immunol., 14, 259–274) (10). Tyrosinphosphorylierte Proteine wurden leicht zwischen 2 und 5 min im Anschluss an die Stimulierung nachgewiesen und blieben für wenigstens 10 min phosphoryliert (10). Die GA15-Zellen, mit anti-CD3ε-mAk allein oder vernetzendem Antikörper stimuliert, induzierten nicht die Tyrosinphosphorylierung eines zellulären Substrats (Daten nicht gezeigt). Die Vorbehandlung von GA15 mit CCS für 30 min bewirkte wiederum eine Verminderung der TCR-induzierten Proteintyrosinphosphorylierung von ERK-2 in einer dosisabhängigen Art und Weise (11). CCS beeinträchtigte die Tyrosinphosphorylierung anderer TCR-induzierter Phosphoproteine nicht wesentlich, was nahelegt, dass CCS eine selektive Wirkungsweise hat.
Beispiel 4 – CCS verzögert die Verschiebung der Mobilität von Raf-1
Raf-1 ist ein unmittelbar stromaufwärts gelegener Aktivator von MEK-1, der ERK-2 aktiviert. Die Aktivierung von Raf-1 erfordert die Phosphorylierung von spezifischen Serin- und Threoninresten (Avruch et al., 1994, TIBS, 19, 279–283). Um zu untersuchen, ob CCS andere Substrate stromaufwärts von ERK-2 in der MAP-Kinasekaskade beeinflusst, haben wir die Wirkung von CCS auf Raf-1 untersucht. T-Zellen wurden mit CCS (0 bis 50 μg/mL) behandelt und dann mit entweder anti-CD3ε-mAk oder kombiniertem PMA plus Ionophor wie zuvor beschrieben stimuliert. Die Ergebnisse zeigen, dass CCS die Verschiebung der Mobilität von Raf-1 blockiert, was anzeigt, dass es die Proteinphosphorylierung und daher die Aktivierung blockiert. Diese Werte bestätigen, dass CCS eine Wirkung auf die MAP-Kinasekaskade (12) hat und dass die Wirkung von CCS nicht direkt auf ERK-2 sein könnte, sondern auf Substrate stromaufwärts in der MAPk-Kaskade.
Beispiel 5 – Wirkung von CCS auf die Produktion von IL-2 und Proliferation von T-Zellen
a. Materialien
Zellen: Milzzellen wurden von weiblichen BALG/c-Mäusen (6–8 Wochen alt) isoliert, wie zuvor beschrieben in WO-A-96/00082 . Hoch aufgereinigte der CD4⁺ T-Zellen wurden aus Milzzellen unter Anwendung des magnetisch aktivierten Zellsortierens (MACS) isoliert.
b. Produktion von Interleukin 2.
In RPMI verdünnte T-Zellen wurden mit CCS (50 μg/mL) oder Salzlösung bei 37°C für 30 min behandelt, in frischem RPMI gewaschen und dann in Kulturmedium resuspendiert. Die T-Zellen wurden durch immobilisiertes anti-CD3ε (4 μg/mL) und lösliches anti-CD28 (10 μg/mL) stimuliert, um Zytokin-mRNA zu erzeugen. In PBS verdünnter anti-CD3ε-mAk wurde auf 24-Napf-Mikrokultivierungsplatten mit flachem Boden (Corning, Corning, NY) durch Inkubation für 16 h bei 4°C immobilisiert. Vor der Zugabe von Dreifachkulturen von entweder Milzzellen oder gereinigten CD4⁺ T-Zellen (2,5–5 × 10⁶ Zellen pro Napf), die bei 37°C in befeuchtetem 5% CO₂ für 24 h inkubiert wurden, wurden die Näpfe dann dreimal in PBS gewaschen. Die Spiegel von IL-2 im Kulturüberstand wurden unter Verwendung des CTL-L-Biotests gemessen (Gillis et al., 1978, J. Immunol., 120, 2027–2032).
c. Proliferation von T-Zellen.
Die Zellen wurden mit CCS (50 μg/mL) für 30 min behandelt, in RPMI gewaschen und dann mit immobilisiertem anti-CD3ε-mAk allein oder mit kombiniertem anti-CD3ε-mAk plus anti-CD28-mAk stimuliert. Die Zellen wurden dann in 96-Napf-Platten mit Flachboden (Nunc) zu 10⁵ Zellen pro Napf für 36 h kultiviert. Die Kulturen wurden mit 0,5 μCi [³H]TdR 12 h vor dem Abernten auf Glasfaserfiltern gepulst.
Ergebnisse
a. CCS hemmt die Produktion von IL-2 und die Proliferation von CD4⁺ T-Zellen.
Die Aktivierung von p21^Ras ^, Raf-1, MEK-1 und ERKs sind für die Induktion der Transkription von IL-2 in T-Zellen wesentlich (Izquierdo et al., 1993 J. Exp. Med., 178, 1199). IL-2 ist der hauptsächliche autokrine Wachstumsfaktor von T-Zellen, der die Proliferation von T-Zellen induziert. Von dem Defekt in der ERK-Aktivierung, der hier nachgewiesen ist, könnte daher erwartet werden, dass er die Produktion von IL-2 und die Proliferation von T-Zellen hemmt. Wir haben daher untersucht, ob CCS ein funktionelles Ergebnis der Signalisierung von T-Zellen beeinflussen könnte, nämlich die Produktion von IL-2 und die Proliferation von Milzzellen der Maus und hoch aufgereinigten CD4⁺ T-Zellen. Die Behandlung gereinigter CD4⁺ T-Zellen mit CCS (50 μg/mL) verminderte sowohl die Produktion von IL-2 als auch die Proliferation, wenn der ERK-Stoffwechselweg mit anti-CD3ε-mAk (13a und 13b) stimuliert war. CCS blockierte auch die Produktion von IL-2 durch Milzzellen, beeinflusste jedoch nicht die Proliferation von Milzzellen (14a und 14b), was nahelegt, dass ein noch nicht identifizierter Bestandteil in CCS auf akzessorische Zellpopulationen in Kulturen von Milzzellen wirkt, so wie B-Zellen oder Makrophagen. Bromelain kann co-stimulatorische Signale auf T-Zellen über eine Wirkung auf B-Zellen erhöhen. Unabhängig von der mutmaßlichen Wirkung von CCS auf akzessorische Zellen deuten die Werte deutlich daraufhin, dass CCS die Produktion von IL-2 und die Proliferation gereinigter CD4⁺ T-Zellen blockiert, was nahelegt, dass CCS die Aktivierung von T-Zellen blockiert. Die Produktion von IL-2 und die Proliferation waren von der Zellstimulierung mit anti-TCR-Antikörpern abhängig, da kein Zytokin in Zellen nachgewiesen wurde, die allein in Gewebskulturmedium kultiviert wurden (13 und 14).
Beispiel 6 – Wirkung von CCS auf das Zellwachstum menschlichen Tumors in vitro
a. Materialien
Zellen: Tumorzelllinien wurden von L. Kelland (Institute of Cancer Research, Sutton, V. K.) bereitgestellt und waren folgendermaßen: Eierstock (SKOV-3, CH-1, A2780), Darm (HT29, BE, LOVO), Brust (MCF-7, MDA231, MDA361), Lunge (A549, CORL23, MOR) und Melanom (G361, BOO8, SKMe124).
b. Wachstumshemmung menschlicher Tumorzelllinien.
Die Untersuchungen wurden von L. Kelland (Institute of Cancer Research, Sutton, V. K.) durchgeführt. Die Zelllinien wurden trypsinisiert und einzelne lebende Zellen wurden in 96-Napf-Mikrotiterplatten zu einer Dichte von 4 × 10³ Zellen pro Napf in 160 μL Wachstumsmedium ausgesät. Nach dem Anheftenlassen über Nacht wurde dann CCS zu vierfachen Näpfen in 40 μL Wachstumsmedium zugegeben, um einen Bereich der Endkonzentrationen in den Näpfen von 50, 10, 2,5, 1 und 0,25 μg/mL zu ergeben. Acht Näpfe dienten als Kontroll-, unbehandelte Näpfe. CCS wurde unmittelbar vor der Zugabe zu den Zellen in sterilem Wasser verdünnt. Die Aussetzung von CCS auf Zellen erfolgte für 96 h, woraufhin die Zellzahl in jedem Napf durch Färbung mit 0,4% Sulforhodamin B in 1% Essigsäure bestimmt wurde, wie zuvor beschrieben (Kelland et al., 1993, Cancer Res., 53, 2581–2586). Die 50% inhibitorischen Konzentrationen (IC₅₀-Werte in μg/mL) wurden dann aus Graphen der Absorbanz (bei 540_nm abgelesen) von Konzentration gegenüber Kontrolle (%) berechnet.
Ergebnisse
a. CCS hemmt menschliches Tumorwachstum in vitro.
p21^Ras und Raf-1 sind wichtige Onkogene, die, wenn sie mutiert sind, unkontrolliertes Zellwachstum und die Proliferation verursachen, was zu Krebs führt. Da wir gezeigt haben, dass CCS die Wirkungen der p21^Ras/Raf-1/MEK1/ERK-Kinasesignalisierungskaskade blockieren kann, haben wir untersucht, ob CCS das Tumorwachstum blockieren könnte. Die CCS-Behandlung menschlicher Tumorzellen ergab eine Verminderung des Wachstums mehrerer verschiedener Eierstock-, Lungen-, Darm-, Brust- und Melanom- Tumorzelllinien in vitro (15). CCS beeinflusste nicht alle Zelllinien gleich, was nahelegt, dass CCS eine selektive Wirkung hat. SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung von Ananain oder einer Mischung aus Ananain und Comosain zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als ein Immunsuppressivum.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der das Medikament zur Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (a) einer Krankheit oder einem Zustand, der durch die Aktivierung von T-Zellen vermittelt ist; (b) einer Krankheit oder einem Zustand, der durch die Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs vermittelt ist; (c) einer Krankheit oder einem Zustand, der durch die Produktion von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen vermittelt ist; (d) einer Autoimmunkrankheit; (e) der Abstoßung verpflanzten Gewebes oder eines Transplantats durch einen Wirt; (f) einer allergischen Reaktion; (g) toxischem Schock; (h) Apoptose; und (i) einer parasitischen oder pathogenen Infektion.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der das Medikament für zumindest eines der nachfolgenden wirksam ist: (i) Modulieren des Zellwachstums und der Proliferation; (ii) Hemmen der Produktion von Wachstumsfaktoren oder Zytokinen durch Zellen; (iii) Hemmen der Aktivierung des MAP-Kinase-Stoffwechselwegs; und (iv) Hemmen der Aktivierung von T-Zellen.
Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche, bei der das Arzneimittel in einer Form ist, die zur enteralen, oralen, nasalen, buccalen, topischen oder analen Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das Arzneimittel in einer Form ist, die für die parenterale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 5, bei der die parenterale Verabreichung ausgewählt ist unter der intravenösen, subkutanen, intramuskulären oder intraperitonialen Verabreichung.
Verwendung nach Anspruch 4, bei der das Arzneimittel in einer zur oralen Verabreichung geeigneten Form vorliegt und eine enterische Beschichtung aufweist.