CN1196409C - 用于冷水泡制的叶茶 - Google Patents

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Abstract

一种用于冷水泡制的叶茶的制备方法，包括以下步骤：将绿色茶叶揉软，用单宁酶处理揉软的叶子，在足够量使内源过氧化物酶激活的过氧化氢存在时发酵单宁酶-处理过的揉软物，并且将发酵的叶料干燥，得到可冷水泡制的叶茶。最终产品为在热水或冷水中泡制具有良好风味和颜色的红叶茶。

Description

用于冷水泡制的叶茶
本发明涉及一种用于冷水泡制的叶茶的制造方法。该方法包括将单宁酶预处理过的碎茶糊(dhool)(揉软(macetated)的茶叶)在固态条件下于过氧化氢的存在下发酵。将干燥的叶产品泡制在冷水中以获得良好的风味和颜色。
发明背景和现有技术
红叶茶传统上通过将新采摘的绿色茶叶经氧化和干燥来生产。茶饮料在联邦国家中通常是通过将茶叶在沸开的水沏泡几分钟并且加入奶，有时添加少量糖来制备的。然而，在一些国家中，尤其是在美国(或更准确说是美国的部分州)，茶被当作冰镇饮料更会得到大众喜爱。
这种饮料不能通过将传统制造的茶叶泡制在冷水来方便地制备。而是，美国人将叶子泡制在热水中，除去叶子并且将泡制品放入冰箱中直至它准备饮用，或者将茶叶放入冷水中，在太阳光下慢慢泡制数小时的时间。
叶子中很多给饮料带来独特感官特征的化合物仅可少量溶于冷水。在二十世纪七十年代，可利用的更方便的选择是使用可溶于冷水的茶基粉末。
为制造可溶于冷水的茶粉，人们提出了很多方法。
US专利4,051,264(Lipton/Sanderson)公开了一种制造可溶于冷水的叶茶提取物的方法。将茶叶用单宁酶在厌氧条件下预处理，产生具有良好颜色、产量和风味的用于冷水泡制的茶。
US专利3,812,266(Sanderson/Coggon)公开了一种涉及使用单宁酶和天然茶酶将绿茶转变成红茶的方法。该方法还包括单宁酶预处理步骤，但是在浆液体系中，接着通过天然茶酶氧化，将绿茶转变成红茶，并且生产出茶粉，其可溶于热水也可溶于冷水。在一些实施例中，加入了过氧化氢，以便″缩短工艺″。现在知道，所提出的通过单宁酶处理(提高表茶黄素含量)来增强可溶于冷水的颜色产生的机理是不正确的，并且没有提出解释添加过氧化氢的机理。
EP专利申请760,213 A1(Unilever)公开了一种增强茶基食物中颜色的方法。该方法包括使用单宁酶预处理(对叶子或提取物)，接着用外源过氧化物酶和过氧化氢处理，产生可溶于冷水的颜色。
国际专利申请公开WO 97/40699(Unilever)中涉及了用沸石加工茶，来产生颜色。其中有添加沸石、随后用单宁酶处理、产生可溶于冷水的茶的实施例。
US专利4,639,375(P & G，Tsai)公开了用单宁酶与其它细胞壁消化酶一起处理红茶，产生可溶于冷水的速溶茶粉。
可溶于冷水的茶粉是方便的，但对许多消费者来说最终饮料的品质并不等同于热泡制叶子获得的品质。其他消费者不喜欢使用粉末，因为他们感到这些粉末是人造的因而是″非天然的″。
本发明的发明者出人意料地发现了可以制造叶茶，将其泡制在冷水中可以获得具有良好颜色和风味，这些颜色和风味可被消费者接受认为是热泡制红叶茶经冷藏的饮料。此外，本产品可以通过改良传统红茶的制造工艺来制造。
发明内容
广义上说，本发明涉及一种用于冷水泡制的叶茶的制备方法，包括以下步骤：将绿色茶叶揉软，用单宁酶处理揉软的叶子，在足够量使内源过氧化物酶激活的过氧化氢存在时发酵单宁酶-处理过的揉软物，并且将发酵的叶料干燥，得到可冷水泡制的叶茶。
本发明还涉及使可溶于冷水的茶制品产生颜色的方法，包括向绿茶单宁酶处理过的揉软物添加足够量的过氧化氢，以便使内源过氧化物酶来氧化通过单宁酶处理产生的棓酸。
本发明中，″茶″指来自Camellia sinensis var.sinensis或Camelliasinensis var.assamica的叶类物料。还包括得自Aspalathus linearis的rooibos茶，但它是内源发酵酶较差的来源。″茶″还包括这些茶的任何两种或多种的共混产品。
本发明中″叶茶″指含有一种或多种未泡制形式的茶源的茶产品。
本发明中，″可溶于冷水″指在4℃或4℃以上温度短时间内获得良好的颜色、风味和口感，即小于10分钟，但优选小于5分钟。
优选，将揉软的叶子在厌氧条件下用单宁酶处理。倘若使用足够的单宁酶，不用此厌氧条件温育，该过程也是有效的。
优选，将单宁酶处理过的揉软物在标准条件下发酵，以便在添加过氧化氢之前产生高含量的茶黄素和棓酸。
为避免疑问，词语″包括″意指包括在内但不一定是“由......组成”或“由......构成”。换句话说，所列举的步骤或选项不必是穷尽的。
本发明特别涉及如下的技术方案：
1、一种用于冷水泡制的叶茶的制备方法，包括以下步骤：将绿色茶叶揉软，用活性为50,000单宁酶活性单位/克的单宁酶以1-100mg/kg揉软的叶子的浓度处理揉软的叶子，将单宁酶-处理过的揉软的叶子发酵足够的时间以产生棓酸和茶黄素，继续在每kg揉软的叶子计100和200ml之间的2.0-2.5％过氧化氢存在下使内源过氧化物酶激活进行发酵，并且将发酵的叶料干燥，得到可冷水泡制的叶茶，其中所述的发酵的时间是30-150分钟。
按照上述方案1的方法，其中将揉软的叶子在厌氧条件下用单宁酶处理。特别是其中活性为50,000单宁酶活性单位/克的单宁酶的添加浓度为10-80mg/kg揉软的叶子。
按照上述方案1的方法，其中用单宁酶真空渗入揉软的茶叶。
按照上述方案1的方法，其中过氧化氢的添加浓度为约160ml2％过氧化氢每kg揉软的叶子。
按照上述方案1的方法，其中绿色茶叶包括成熟茶叶的茶料。
按照上述方案1的方法，其中所说的成熟茶叶料包括30-50天周期采摘的一芽3-5叶的茶部分。
2.一种用于冷水泡制的叶茶，通过以下步骤获得：将绿色茶叶揉软、用活性为50,000单宁酶活性单位/克的单宁酶以1-100mg/kg揉软的叶子的浓度处理揉软的叶子、将单宁酶-处理过的揉软的叶子发酵足够的时间以产生棓酸和茶黄素、继续在每kg揉软的叶子计100和200ml之间的2.0-2.5％过氧化氢存在下使内源过氧化物酶激活进行发酵并且将发酵的叶料干燥得到用于冷水泡制的叶茶，其中所述的发酵时间是30-150分钟。
按照上述方案2，其中绿色茶叶包括成熟茶叶茶料。
按照上述方案2的用于冷水泡制的叶茶制备的用于冷水泡制的茶粉。
发明详述
茶的制造，特别是红茶的制造，传统上包括四个基本步骤：萎凋，揉制，发酵和焙炒。
萎凋是将采摘的茶叶储存一段时间的过程(可能最多24小时)，期间它们经历各种生化和物理变化，这些变化经常包括损失水分。
萎凋步骤之后是揉软，并且传统上将萎凋的叶子选择性地进行揉制，以便破碎和碾碎叶子，即破坏植物组织结构。该过程的效果是从植物细胞和组织内释放可发酵的底物和发酵酶。现代茶品制造中通常包括这个步骤，然而是通过让茶经过揉切机器来破坏植物细胞和组织，所说的茶通常是萎凋的。
下一步是通称为的发酵，但这个叫法不恰当。″发酵″通常在酿酒中使用用来描述外源酶的作用。但在茶领域中，发酵是指当通过撕裂或揉切叶子而使细胞机械分解导致使某些内源酶和底物在一起时茶所经历的氧化过程。
在此过程中，叶子中的无色儿茶素被转化成了黄色和橙色直至黑棕色物质的复合混合物，并且产生大量的芳香挥发化合物。
产色氧化产物包括茶黄素和茶红素。茶黄素包括数种明确的儿茶素缩合产物，其特征在于它们的苯并环庚三烯酚酮环。茶红素是一类不确定的分子，其分子量有很大的不同。它们具有各种各样的颜色，从黄色至深红色和棕色。
将发酵产物焙炒并且干燥，获得红叶茶。焙炒包括将茶加热和干燥，以便破坏发酵酶并由此使发酵停止。该过程使含水量减少至小于5％，还导致进一步化学氧化和茶香味变化。该过程通常来说是将茶与干燥机中的热干空气流接触。
本发明涉及可冷溶的红叶茶的制作方法。本发明的发明者发现本发明的方法可以通过改良上述传统茶制造工艺中的某些步骤来实现。
图1描绘了本发明方法的一个优选实施方案。在该优选的实施方案中，将新采摘的绿色茶叶使用本领域已知的任何技术按正常方式萎凋。萎凋对本发明来说不是必需的，但对增强茶的香味和降低初始含水量(初始含水量是重要的，因为水分随着单宁酶和过氧化物而加入，并且高含水量即大于76％的含水量可以影响干燥效率)可以是一种有用的途径。
将叶子揉软，即意味着可以通过旋转叶片和/或通过一系列CTC(揉切-撕裂-卷曲)机器来粉碎。
与传统红茶制造的第一个不同之处是用单宁酶(黄烷醇棓酸酯酶)处理揉软的叶子，以产生脱棓酸酯的儿茶素和棓酸。随后在发酵过程中导致产生茶黄素和非棓酸酯化的茶红素(其比棓酸酯化的茶红素可溶)。
由单宁酶催化的通用反应是裂解棓酸酯键，不仅针对棓酸酯化的儿茶素还针对叶子中的其它棓酸酯化的化合物。单宁酶还公知可改进茶产品的透明性，这是因为棓酰基在乳状物的形成中起主要作用并且广泛使用单宁酶来脱棓酸酯化和增溶红茶乳。
在浆液发酵之前用单宁酶处理绿色茶是已知的。例如前述的US3,812,266(Sanderson等)公开了使用单宁酶来减少液体溶液中的茶乳量。还注意到通过该过程可产生改进的颜色。
然而，本发明不要求使茶悬浮并且进行浆液发酵。事实上，这样是不利于生产的，因为从叶中获得良好颜色和风味所必需的组分被过早地提取到浆液中。而是，在固态条件下进行茶发酵。这是一个重要的区别。本发明的发明者以前认为使儿茶素提取到浆液溶液中对单宁酶有效发挥作用是必需的。令他们吃惊的是直接给固态的碎茶糊施加单宁酶可有效地(即几乎完全)使儿茶素脱棓酸酯化并且产生高含量的茶黄素。他们对能够将叶产品泡制在冷水中更感惊奇。
单宁酶处理使棓酸酯化的儿茶素ECG和EGCG脱棓酸酯化，产生脱棓酸酯化的儿茶素EC和EGC。在随后的发酵被氧化时，儿茶素EC和EGC反应形成茶黄素。
单宁酶可以通过使用各种本领域已知的技术来施加。本发明的发明者喜欢将单宁酶溶解于水中，将溶液喷洒到碎茶糊上并且让混合物在适宜的温度下反应适宜的时间。在经过初始揉软(例如，第一次CTC揉切)后以细喷的方式将单宁酶施加到碎茶糊上，接着进行进一步揉切(例如，第二次或第三次CTC揉切)，以确保充分混合。优选将碎茶糊温育在真空条件下或厌氧条件下，例如在大气或氮气中。这样可防止发酵发生。优选，在开始发酵之前，便取得了完全的脱棓酸酯化，这样可在随后的发酵中获得最大含量的茶黄素，从而导致产生最佳的颜色。
本发明的发明者假定通过使用真空使外源分子抽到揉软的茶叶中并且与其中的化合物接触，使某些外源化合物可以进入某些固态茶的内源化合物中，从而可以增加效率。真空渗入是已知的，然而它被用来强迫细胞间的物质而不是进入细胞中。而且，那些物质趋向于具有小分子量。
然而，本发明的发明者开发了一种涉及用外源化合物真空渗入揉软的茶叶中使某些外源化合物与茶中发现的内源化合物接触的方法，并且应用它来改良茶和茶饮料的某些性能。该方法允许诸如酶的大分子进入茶内源化合物中并且改良茶某些性能的程度的确出人意料。例如，据发现，泡制单宁酶预处理的茶比对照中的总茶黄素含量多一倍以上并且TF1增加了六倍。
真空渗入是一项在由植物组织制备原生质体中经常使用的技术，尽管是将物质引入到细胞壁之间而不是细胞壁内。将揉切的叶组织在含有单宁酶的溶液中温育。然后，将悬浮液放置在真空条件下并且从叶子颗粒的细胞内空间中提抽空气，酶溶液被抽到其中取代之。本发明的发明者发现真空小于100毫巴适合此目的。
当将此方法运用于茶碎茶糊时，主要困难是达到进入细胞内。另一个主要问题是大体积的水通过减少发酵期间氧的摄取而可能会严重影响茶的品质。实施例中描述的结果说明真空渗入对将酶如单宁酶引入到固态碎茶糊中是有效的工具。当发酵时，单宁酶处理过的碎茶糊产生高含量茶黄素且没有棓酸酯化类物质的红茶。这样能够生产许多的新茶。真空协助的单宁酶处理对去除棓酸酯化类物质和增强附加TF的形成比在常温和常压下的相同处理更有效。真空允许酶渗透到组织中并且在发酵前除去棓酸酯化类物质，与简单地在发酵碎茶糊上施加酶并且用手混合相比，它们的关键特点是单宁酶使茶黄素增进。
如果可能，应当尽可能将条件调整为能够防止在单宁酶处理前或处理期间的任何发酵。此可以通过较强的真空泵来实现，将碎茶糊放置在有N2吹扫的条件下或者缩短单宁酶处理。
可以通过简单给料，给揉软的茶施加单宁酶。然而，优选以细雾的形式喷洒单宁酶，这样可有助于其渗入。
通过实验可以容易地确定适宜的条件。用KIKKOMAN出品的单宁酶(KIKKOMAN是日本东京Kikkoman Corporation，的注册商标)以1-100mg/kg碎茶糊的量可以获得良好效果，优选10-80mg/kg碎茶糊，更优选40-80mg/kg碎茶糊。注意：KIKKOMAN单宁酶具有50,000单宁酶活性单位/克。
发酵优选在4.0-5.5的pH范围下进行。发酵温度优选为15-40℃。发酵优选进行30-150分钟，更优选105-120分钟。然而与传统红茶制造的第二个不同之处是在发酵步骤期间产生足够的棓酸和茶黄素之后添加过氧化氢，以便使内源过氧化物酶激活(或者至少大大增强其活性)。
茶已知含有高含量的天然过氧化物酶。还已知天然过氧化物酶可以通过在浆液体系中添加过氧化氢来激活(或使其活性增强)。《食品农业科学杂志》(J.Sci.Food Agric.)vol.32，p 920-932(Dix.，1981)公开了这样一种体系和方法。该文章提及到过氧化物酶可以氧化茶多酚类，形成茶黄素，以及与在″正常″发酵条件下所生产的相同或不同的茶红素。然而，它没有对工作的化学过程提供任何详细的解释。
本发明的发明者发现内源过氧化物酶具有将儿茶素氧化成茶黄素和茶红素、将茶黄素转化成茶红素的潜力，并且与内源多酚氧化酶不同，容易氧化棓酸。这些组合的反应可产生明显量的可溶于冷水的有色化合物。这里涉及的化学过程示于图2中。
过氧化氢的添加量应当足以激活内源过氧化物酶和氧化单宁酶处理产生的棓酸。本领域技术人员通过实验可以确定之。然而本发明的发明者喜欢每kg碎茶糊使用100和200ml之间的2.0-2.5％过氧化氢，优选160ml的2.0％过氧化氢/kg碎茶糊。在茶制造的正常情况下，由于过氧化氢的内源含量低而过氧化氢酶的活性高，过氧化物酶大部分被灭活。测定显示在此过程中所有添加的过氧化氢均被消耗，在最终制造的茶中没有任何剩余。与前述US 4,051,264公开的不同，本发明的发明者发现将单宁酶处理和随后的过氧化物激活结合起来是制造具有良好颜色和可接受味道的产品的关键。仅用单宁酶处理的产品具有″酸味″或″金属″味。
不出所料，由本发明用于冷水泡制的叶茶制作的饮料的颜色和味道分布很大程度上取决于原料即茶叶的来源和品质。本发明的发明者发现交付给工厂的标准原料(一芽二叶，每公斤绿色叶茶在超过1100枝范围内)按照本发明的方法加工，可以获得非常良好的颜色和味道。然而，为改进颜色和味道，本发明的发明者作了进一步尝试，吃惊地发现通过使用更成熟的叶子可以明显得到两方面的改进。
茶通常来说是在17天周期时采摘的一芽二叶，以便使品质和产量最佳化。延长周期意味着叶子将更成熟且其化学组成很少不同。人们必需采摘茶树的较大部分来进行额外生长。这种采摘策略可增加每公顷的茶产量并由此提高生产率，但采摘后的植物物料容易具有较长的茎和较大的茎叶比。
由成熟茶叶制造的红茶，与17天周期采摘的两片叶子和一粒芽的茶部分制造的红茶相比，在泡制后容易颜色较浅并且稀薄。然而，本发明的发明者吃惊地发现当在30-50天周期采摘成熟叶茶时，即这时茶叶的组成部分为一芽3-5叶、优选一芽4叶，将其用于本发明中可以明显增加冷水泡制性能，并由此改进颜色和味道。
若不囿于理论，据信成熟叶料(包括叶柄)比标准叶子含有更高含量的过氧化物酶并且这种过氧化物酶在成熟级联中提供重要的角色。这意味着当进行本发明的方法添加过氧化氢时，可以获得更多的过氧化物酶。所以，通过增强的过氧化物/过氧化物酶氧化体系可以产生更多的颜色。
以下将参考实施例和附图对本发明的方法进行描述。
附图中：
图1显示了本发明优选方法的流程。
图2显示了单宁酶和内源过氧化物酶催化获得深色茶红素的化学反应。
图3是单宁酶-过氧化物处理过的部分发酵碎茶糊的形成分布图(实施例1)。
图4是单宁酶-过氧化物处理和未处理茶泡制品颜色特征的直方图对比(实施例3)。
图5和6显示了实施例4a所述实验的发酵分布图。
图7和8显示了使用各种单宁酶量的单宁酶-过氧化物加工红茶的组成
(实施例5)。
图9a至9e是未处理和单宁酶-过氧化物处理过的茶分别在4℃、15℃、25℃、55℃和70℃下的泡制分布图(实施例6)。
实施例1
实验室过程
(a)工艺步骤
将溶于24ml水中的60mg单宁酶喷洒到100g冷冻的碎茶糊上。然后在N2条件下将碎茶糊解冻，并且当其达到20℃时便将它在真空(50毫巴)条件下放置60分钟。然后让碎茶糊在25℃、100％RH下发酵60分钟。发酵之后，用12.5ml约2％的过氧化氢溶液喷洒碎茶糊，在真空条件下放置15分钟，然后通过流化床干燥器(常规FBD)干燥。通过用单宁酶预处理碎茶糊可以增强茶黄素的含量。添加过氧化物可以使茶的内源过氧化物酶激活。这种酶将单宁酶释放的茶黄素和棓酸氧化，得到深色、可溶于冷水的颜料。
发酵分布图显示在图3中。
(b)味道测试
由富经验的茶尝味家对通过刚刚所述过程制备的茶的冷水泡制茶进行味道测试。在15℃下于200ml碳过滤水中泡制5分钟制作泡制茶。经处理过的样品被描述具有″水果味，良好的口感、收敛性，茶体浓厚，芳香味低，良好的颜色，良好的冰茶产品，经得起冰″，而对照，标准红茶被描述为″味淡″。下表1中给出了色度、浊度和固形物分析的结果，其中L*是亮度测定值并且a*是红/绿色度测定值，使用MINOLTA(TM)比色计。
表1：实验室过程的产品
L*  a* 浊度  固形物
对照 54.6  23.6  26.8  0.2
经过处理的茶 29.2  34.6  29.4  0.24
实施例2
与其它产品的颜色比较
根据上述基本实验室过程中的处理过程处理碎茶糊(60mg单宁酶，添加过氧化物后立即干燥)。比较由此过程获得的液体的色度与市售产品(SMOOTHBLEND(TM))和由Kenyan茶叶标准发酵制备的茶样品的色度，所有均为2.27g红茶/200ml凉自来水，泡制5分钟。结果汇总于下表2。注意，这些值来自于自来水，其得到的颜色比在蒸馏水中泡制的颜色更深。
表2：与其它产品的色度比较
L* a* b*
单宁酶/过氧化物 59.43  12.54  57.09
SMOOTHBLEND(TM) 94.22  -2.09  16.22
Kenyan 80.16  3.67  41.14
这些结果说明根据本发明的单宁酶/过氧化物工艺得到液体，其颜色明显比未处理Kenyan茶或SMOOTHBLEND(TM)产品更亮、更红和更黄。
实施例3
标准工艺、仅用单宁酶的工艺、单宁酶-过氧化物(不同添加时间)工艺 的比较
对红茶标准样品、单宁酶处理红茶样品、发酵60分钟后加入过氧化物的单宁酶-过氧化物处理红茶样品和过氧化物于t＝0时添加的单宁酶-过氧化物处理红茶样品进行泡制。每种情况中，将2.27g茶在室温下的200ml HIGHLAND SPRING(TM)不充气泉水中沏泡5分钟。使用MINOLTA传输比色计测定各个样品的颜色特征。结果示于图4中。
结果和产品品尝证实，为最大限度地获得颜色和风味，需要在部分发酵后使单宁酶处理和过氧化氢的添加结合起来。仅用单宁酶的样品据评论具有″酸味″或″金属″味道，据认为是由于高含量棓酸的原因。
重复上述的实验室过程，并且周实验进行进一步的比较，其中不添加单宁酶，而是在添加过氧化氢之前，加入与单宁酶释放的等量的棓酸。使用MINOLTA(TM)比色计测定由处理样品获得的液体的色度。结果见下表3，其中L*是亮度测定值，a*是红/绿色度测定值并且b*是黄/蓝色度测定值。
表3：实验室过程的变化方案
处理 对照/蒸馏水中泡制 60mg单宁酶+真空 棓酸-单宁酶
泡制条件 2.27g/200ml，5min，15℃
L* 90.33  84.65  91.63
a* -1.33  2.27 -4.99
b* 47.36  80.43  52.57
本实验显示单独添加棓酸不足以产生冷-泡制的颜色/风味。
实施例4
使用真空优化单宁酶有效性的研究
使用一些标准化材料和方法进行以下描述的本实验。完整描述如下：
材料
用BBK(Brooke Bond Kenya)clone 35的Kenyan叶进行实验，其在Mabroukie工厂萎凋一整夜并且在干冰上冷冻空运到UK。将该叶在-80℃下储藏直至使用。单宁酶购自日本的Kikkoman′s Co并且″Macer8W″(TM)购自威尔士的Biocatalysts Ltd。
单宁酶处理
由BBK35冷冻叶制备成批的碎茶糊并且在-80℃下储藏。取部分批次分析初始儿茶素组成，其余的用于实验。用8g(用于标准实验)至100g(用于放大规模实验)的不同量碎茶糊进行实验。当使用8g以上的碎茶糊时，单宁酶溶液的体积也按比例地适宜增加。在N2气流条件下将8g碎茶糊解冻至室温。
待单宁酶处理后，将一些样品于TEACRAFT(TM)受控环境室中在25℃、100％RH下发酵最多2小时。将茶在TEACRAFT(TM)流动床干燥器中于120℃空气入口温度下干燥5分钟，然后在90℃下干燥20分钟。在适宜的时间下，取出部分碎茶糊并且立即在液氮中冷冻并且在-80℃下储藏直至分析。
在基于此过程的一个变化方案中，然后将含有大约5mg单宁酶(参见结果)的溶液(1-2ml)移液至碎茶糊上，试图达到均匀散布。将烧瓶与真空管线连接45-60分钟。开始，使用台式上真空抽头(top vaccumtap)但在后面的实验中使用EDWARDS(TM)真空泵，因为它可以提供较强的真空。
多酚类的分析
将1g碎茶糊在40ml70％(v/v)含水甲醇中回流30分钟。冷却之后，通过50mm尼龙网过滤掉提取液中的叶子并且测定其体积。然后将200μl等分液体添加到800μl抗氧化剂溶剂中，之后通过反相HPLC使用二极管阵列检测进行分析。
干重测定
通过在100℃下干燥过夜之后的质量差来测定碎茶糊样品的干重量。结果按干重量为基准来表达，因为水分在N2吹扫过程中有所变化，并且在添加完单宁酶之后，新的重量基准不可靠。
泡制茶的制备
制备1％(w/v)茶固形物的泡制品，泡制5分钟。
实施例4a
单宁酶对固态碎茶糊的有效性
在第一个实验中，于N2条件下解冻后，将8g碎茶糊放置在真空(使用台式上真空带)条件中，并且将1ml单宁酶溶液移液到碎茶糊上(5mg/ml单宁酶，31.25μg(碎茶糊))并且保留60分钟。
在处理之前和处理之后，测定儿茶素组成。结果见下表4：
表4.真空条件下添加单宁酶对BBK 35碎茶糊儿茶素组成的影响
 ％水分                      μmol/g(DW)
棓酸 咖啡因  EGC  EC  EGCG  ECG  TF
 T＝0    70.8  27  150  224  67  153  51  0
 T＝60  77.4 227  137  303  107  5  0  13
 变化+6.6 +200  -13  +79  +40  -148  -51  +13
60分钟后仅剩余5μmol/g(DW)EGCG，脱棓酸酯化差不多全部完成。棓酸的增加(+200μmol/g(DW))准确反映了EGCG和ECG降低(总共-198μmol/g(DW)。然而还有迹象表明在此过程中发生了一些发酵；形成了13μmol/g(DW)的TF并且EGC和EC的增加不如从EGCG的降低中预测的那样高，并且EC不如从EGCG和ECG的降低中预测的那样高。不存在棓酸酯化的茶黄素。TF的增加导致EC/ECG减少但ECG/EGCG不减少，证明还形成了一些茶红素。这些结果说明在单宁酶处理期间发生了一些发酵并且也许形成了少量棓酸酯化的茶黄素然后被脱棓酸酯化。尽管在真空条件下有一定程度的发酵出人意料，但可能是真空不够强来抑制发酵发生或者所用的设备不是绝对气密性的。尽管如此，仍证明了单宁酶的真空渗入对棓酸酯化儿茶素的脱棓酸酯化是非常之有效的。
在下一个实验中，放大该过程，以便样品可以在固态碎茶糊经单宁酶处理后的发酵期间取样(以符合儿茶素氧化的分布图)。将碎茶糊(25g)在N2条件下解冻并且用溶于6ml水的15mg单宁酶处理，然后在真空条件中放置60分钟。处理结束时，将碎茶糊转移至受控环境室中并且在25℃、100％RH(相对湿度)下发酵2小时。以30分钟的间隔取样，以符合发酵分布图。结果见下表5。
表5.发酵前单宁酶处理期间儿茶素的变化
 ％水分                        μmol/g(DW)
棓酸  咖啡因  EGC  EC  EGCG  ECG  TF
 t＝0    75.2  32  195  174  47  217  82  0
 t＝60   78.3  305  178  256  88  9  0  13
 变化    +3.1t60-t0  +273  -17  +82  +41  -206  -82  +13
单宁酶处理60分钟之后剩余9μmol的EGCG，脱棓酸酯化再一次基本上全部完成。
似乎棓酸的增加应当导致EGCG/ECG降低。然而，EGC和EC的增加没有导致EGCG和ECG的增加，说明在单宁酶处理期间又发生了一些发酵并且事实上形成了一些茶黄素。本实验的发酵分布图示于图5(参见附图)。经过90分钟EGC和EC被完全氧化，并且茶黄素的峰值为大于60μmol/g DW(即干重)。
固态碎茶糊经过单宁酶预处理发酵之后，与图6(参见附图)中从相同批次碎茶糊制备的标准茶相比，茶黄素有所增加。
这些实验证明真空渗入可增强单宁酶对儿茶素棓酸酯的脱棓酸酯化的能力并且可提供适合在发酵期间形成高含量茶黄素的原料。然而，在单宁酶处理期间会发生一些发酵。
实施例4b
制备茶黄素含量增加的红茶
在生产完茶黄素含量增加的发酵碎茶糊后，下一步是使用该方法来生产单宁酶处理的红茶，以便可以评价泡制茶的性能。将该过程进一步放大至100g碎茶糊，以便物料在发酵后可以流化床干燥。将碎茶糊(100g)在N2条件下解冻并且添加含60mg单宁酶的24mlH2O。然后将碎茶糊在真空中放置60分钟，使用EDWARDS(TM)真空泵。之后，将碎茶糊放入受控环境室中并且在25℃、100％RH下发酵120分钟。此后将碎茶糊流化床干燥。再制备另一批次的茶，但不添加任何单宁酶。单宁酶处理之前和之后以及发酵后的儿茶素含量见下表6。
表6.单宁酶和对照茶中儿茶素和茶黄素的组成
                                    Mmol/g(DW)
棓酸 咖啡因  EGC  EC  EGCG  ECG  TF  TFMG  TF′MG  TfdiG
 t＝0对照t＝60单宁酶t＝60净变化T60-T0  3237279+246  192190195+3  231194378+147  7270129+57  20519650-155  787518-60  0000  0000  0000  0000
对照发酵(t＝180)单宁酶发酵(t＝180)  23188  189164  00  00  100  80   5.554  20  20  30
可以看出，EGCG的脱棓酸化仅完成75％，但在EGCG和ECG减少与EGC和EC增加之间有良好的对应关系。此外，单宁酶处理期间没有茶黄素形成说明在由泵提供的较强真空条件下不会发生发酵。
经过对发酵碎茶糊的观察(通过溶剂提取法测定)，TF1整体上增加了10倍并且总TF增加了4.3倍。
实施例5
工艺优化
(a) 单宁酶使用量的优化
改变单宁酶使用量。在5至320mg单宁酶/kg之间增加单宁酶使用量，制备一系列样品。结果见下表7，其中L*，a*和b*如前。
表7：单宁酶/过氧化物加工的红茶色度分析
 单宁酶  L*  a*  b*  ％可溶性固形物
 5mg/kg  87.27  0.77  60.9  0.215
 10mg/kg  86.62  1.42  62.9  0.205
 20mg/kg  86.54  0.56  64.7  0.210
 40mg/kg  86.3  1.6  68.1  0.225
 80mg/kg  82.3  5.62  77.5  0.230
 160mg/kg  81.8  6.4  82.9  0.245
 320mg/kg  81.7  6.5  83.7  0.260
 对照  90.6  0.37  42.8  0.185
结果显示随着单宁酶使用量增加，茶颜色变深(L-值较低)并且色度(a*和b*)增加。本发明的发明者注意到使用40和80mg单宁酶之间色度有一个步阶的变化，a*变化了4个单位，而b*变化了5个单位。可溶性固形物随单宁酶使用量而增加，最大量的单宁酶比对照的可溶性固形物多40％。
通过使用各种单宁酶量获得的单宁酶-过氧化物加工的红茶的组成示于图7和8中。
从这些结果看出棓酸，茶黄素和表茶黄素随单宁酶使用量而增加，而剩余儿茶素和棓酸酯化的茶黄素下降。
(b)进一步强化
改变过氧化物使用量
如上经60分钟发酵后，添加水和不同量过氧化氢，在它们之间进行比较。向1kg碎茶糊中添加存在于100ml水中的80mg单宁酶，并且在经过60分钟发酵后，加入160ml水或过氧化氢溶液(28-112ml的30％w/w溶液，补充至160ml)。对产品进行色度测定并且结果示于下表8。
表8：过氧化物的使用量
样品  L*  a*  b*  固形物
水  87.39  1.61  78.53  0.26
HP1  83.08  6.22  88.38  0.27
HP2  82.57  5.85  86.39  0.22
HP3  81.87  5.79  80.38  0.22
HP1-28ml过氧化物+132ml水；
HP2-56ml过氧化物+104ml水；
HP3-112ml过氧化物+48ml水
不同过氧化氢使用量之间的色度的差别很小，但所提取的固形物的含量随过氧化氢使用量的增加而降低。
改变添加过氧化物之后的发酵时间
将添加过氧化物之后的发酵时间长度从0分钟至60分钟之间变化。经观察15-60分钟之间几乎没有差别，但添加并且立即焙炒会造成泡制颜色略微降低。
施用过氧化物后经CTC与不经CTC的影响
在标准条件下制备样品。对产品进行色度测定并且结果见下表9。
表9
样品  L*  a*  b*  固形物
CTC  80.42  7.70  86.41  0.27
不经CTC  1.65  7.42  87.81  0.26
说明在过氧化物添加后取消CTC会有轻微不利的影响。
单宁酶施用期间水体积的影响
将80mg单宁酶溶于60至160ml水/kg碎茶糊中，依次改变水的体积。对产品进行色度测定并且结果见下表10。
表10
 样品  L*  a*  b*  固形物
 60ml  83.25  3.90  81.49  0.24
 80ml  82.15  5.64  83.67  0.24
 100ml  81.98  5.68  85.75  0.25
 120ml  82.00  8.19  87.57  0.27
 140ml  82.21  5.53  80.97  0.22
 160ml  83.59  3.85  78.74  0.20
从结果看出，对泡制性能来说最佳的用量是100-120ml.选择下限100ml，以便使添加的水分保持最少。
增加发酵时间的影响
将施用单宁酶之后的发酵时间从105分钟(标准)增加至120，135，150分钟。添加过氧化物之后的发酵时间保持15分钟。温度保持恒定在22°F。对产品进行色度测定并且结果见下表11。
表11
样品  L*  a*  b*  固形物
标准  84.12  4.24  86.10  0.22
120  83.25  5.18  90.03  0.20
 135   83.22   5.08   89.21   0.21
 150   81.64   6.93   92.60   0.22
结果说明随发酵时间增加，泡制性能也增加。
增加发酵温度的影响
将发酵温度增加至22℃，25℃，30℃，35℃，40℃。使用以上的最长发酵时间(150分钟+15分钟)。对产品进行色度测定并且结果见下表12。
表12
 样品 L*  a*  b*  固形物
 22℃ 81.64  6.93  92.60  0.22
 25℃ 83.52  5.93  89.24  0.22
 30℃ 81.59  6.33  80.89  0.22
 35℃ 76.54  9.64  85.13  0.23
 40℃ 79.20  7.09  82.95  0.22
从结果看出，随着温度升高性能增加，选择最高至30-35℃作为最佳温度，因为这个温度是工厂发酵期间可始终能够实现的最高温度。
多次施用过氧化物(延长发酵时间和升高温度)的影响
标准过氧化物(56ml过氧化物+104ml水)，添加之后发酵15分钟。2次半份过氧化物(28ml过氧化物+52ml水)，每次添加之后发酵10分钟。2次标准过氧化物(56ml过氧化物+24ml水)，每次添加之后发酵10分钟。对产品进行色度测定并且结果见下表13。
表13
 样品  L*  a*  b*  固形物
 标准  80.33  5.29  83.77  0.24
 21/2  83.46  3.10  79.54  0.21
 2标准  76.98  8.51  81.74  0.23
结果说明双倍使用过氧化物得到益处，但将标准用量分成两次施用似乎会降低泡制性能。
实施例6
泡制速率的比较
通过以各种时间间隔测定在445nm下的吸光度，来测定1.0g未处理茶和单宁酶过氧化物处理茶在300ml中的泡制速率。试验分别在4℃，15℃，25℃，55℃和70℃下进行。结果示于图7a至7e中(注意图中的C.I.表示″冷泡制″即单宁酶-过氧化物处理过的茶)。从中看出，单宁酶过氧化物处理过的泡制茶在所有温度下泡制更快并且泡制的程度更大。
实施例7
成熟叶茶的加工
使用成熟叶茶(35天周期时采摘的茶叶，组成部分为四片叶子和一粒芽)作为实施例1所述实验室工厂的原料。如前使用MINOLTA(TM)比色计测定所得用于冷水泡制的叶的泡制性能。结果见下表14。
表14-由成熟茶叶原料制造的产品的泡制性能
 L*  a*  B*
试验1  71.4  13.4  85.5
试验2  72.1  12.1  84.2
试验3  78.2  5.7  75.7
试验4  75.7  7.9  73.9
试验5  74.2  6.8  78.4
标准叶  81.8  3.2  74.5
当与由标准叶制造的产品的典型泡制性能相比，可以看到色度降低了约10个L-单位，某些情况中降低了3个L-单位。所有情况中，使用成熟茶叶制造的样品的味道分布优于对照。

Claims (10)

1、一种用于冷水泡制的叶茶的制备方法，包括以下步骤：将绿色茶叶揉软，用活性为50,000单宁酶活性单位/克的单宁酶以1-100mg/kg揉软的叶子的浓度处理揉软的叶子，将单宁酶-处理过的揉软的叶子发酵足够的时间以产生棓酸和茶黄素，继续在每kg揉软的叶子计100和200ml之间的2.0-2.5％过氧化氢存在下使内源过氧化物酶激活进行发酵，并且将发酵的叶料干燥，得到可冷水泡制的叶茶，其中所述的发酵的时间是30-150分钟。
2.权利要求1的方法，其中将揉软的叶子在厌氧条件下用单宁酶处理。
3.权利要求2的方法，其中活性为50,000单宁酶活性单位/克的单宁酶的添加浓度为10-80mg/kg揉软的叶子。
4.权利要求1的方法，其中用单宁酶真空渗入揉软的茶叶。
5.权利要求1的方法，其中过氧化氢的添加浓度为约160ml 2％过氧化氢每kg揉软的叶子。
6.权利要求1的方法，其中绿色茶叶包括成熟茶叶的茶料。
7.权利要求1的方法，其中所说的成熟茶叶料包括30-50天周期采摘的一芽3-5叶的茶部分。
8.一种用于冷水泡制的叶茶，通过以下步骤获得：将绿色茶叶揉软、用活性为50,000单宁酶活性单位/克的单宁酶以1-100mg/kg揉软的叶子的浓度处理揉软的叶子、将单宁酶-处理过的揉软的叶子发酵足够的时间以产生棓酸和茶黄素、继续在每kg揉软的叶子计100和200ml之间的2.0-2.5％过氧化氢存在下使内源过氧化物酶激活进行发酵并且将发酵的叶料干燥得到用于冷水泡制的叶茶，其中所述的发酵时间是30-150分钟。
9.权利要求8的用于冷水泡制的叶茶，其中绿色茶叶包括成熟茶叶茶料。
10.由权利要求8的用于冷水泡制的叶茶制备的用于冷水泡制的茶粉。
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