CN103535461A

CN103535461A - 茶叶的酶法二次加工方法

Info

Publication number: CN103535461A
Application number: CN201310472651.6A
Authority: CN
Inventors: 肖安风; 蔡慧农; 倪辉; 杨远帆; 黄高凌; 朱艳冰; 李利君; 黄玉凤
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2014-01-29

Abstract

本发明公开一种茶叶的酶法二次加工方法，包括如下步骤：1)称取适量干茶叶;2)将浓度为0.3～1.5U/mL为单宁酶溶液均匀喷洒在干茶叶上，单宁酶溶液与茶叶的料液比为1:9～1:1，单宁酶溶液是采用固态发酵法制得；3）揉捻混合，控制温度在30～60oC条件下混合0.5～2h，以使单宁酶充分酶解茶叶；4）采用二次烘干法烘干茶叶。二次烘干法是先控制温度120oC烘干茶叶，再控制温度100oC第二次烘干茶叶。该方法能够显著促进茶叶中有益成分的转化，并保持茶叶的活性物质以保证风味。该方法可以提升低档茶叶的品质和附加价值，对增加茶业经济效益具有重要作用。

Description

茶叶的酶法二次加工方法

技术领域

本发明涉及茶叶加工技术领域，具体涉及一种利用固态发酵得到的单宁酶对茶叶进行二次加工处理的方法。

背景技术

茶在我国的历史悠久，但长期以来，人们只重视茶树芽叶的生产加工，而对茶末、茶叶梗等副产品的关注颇少。在茶生产加工过程中茶叶梗通常作为夹杂物被挑拣出来，年产量约占茶叶毛重的20%，仅福建安溪县一带就达5万吨。目前，大量茶叶梗还没有得到合理利用，大多用于茶园肥料或茶枕制作或置于屋内去除异味等，这造成资源很大浪费。其实茶叶梗与茶叶一样，含有许多对人体有益的成分，茶多酚、儿茶素、生物碱、茶多糖等。目前，市场上出现多种多样的茶饮料和保健茶，很多是从粗老茶、茶末、茶叶梗等副产品中提取营养保健成分，配入特殊药理功效的中草药、代用茶、特定的维生素和人体所需的微量元素等，再经特殊工艺处理制成的。

茶叶品质重滋味和香气，但其化学成分不耐储存，在外界环境因素的作用下，容易发生陈化甚至劣变，导致成茶品质差，降低茶叶档次。时间一久容易造成大量滞销。若能通过添加外源酶的作用，促进茶叶内某些成分的有益转化，可提高低档茶叶的品质以适应市场需求，对增加茶业经济效益具有重要意义。

单宁酰基水解酶（Tannin acyl hydrolase，E.C.3.1.1.20），通常称单宁酶（Tannase），它不仅能催化水解反应，将没食子单宁、复杂单宁和没食子酸酯中的酯键水解生成没食子酸和其他化合物，还能催化酯化反应，可将单宁酸中的酯键转移给醇类直接合成没食子酸酯类。单宁酶的研究开始都是围绕其在茶饮料中的应用而展开。单宁酶即单宁酰基水解酶，它能水解没食子单宁中的酯键和缩酚键，生成没食子酸和其他化合物。利用单宁酶对茶乳酪的转溶作用，在液态茶和速溶茶加工中可以减少或消除茶饮料中沉淀或冷后浑的产生，也可减轻茶叶浓缩液过滤时膜的污染和堵塞。

有鉴于此，本发明旨在提供一种利用固态发酵得到的单宁酶对茶叶进行二次加工处理的方法。

发明内容

本发明提供利用用固态发酵得到的单宁酶对茶叶进行二次加工处理的方法，可最大限度地促进茶叶内有益成分的转化，提高茶叶的品质。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

茶叶的酶法二次加工方法，包括如下步骤：

1)称取适量干茶叶;

2)将单宁酶溶液均匀喷洒在干茶叶上，单宁酶溶液与茶叶的料液比为1:9～1:1，所述的单宁酶溶液是采用固态发酵法制得；

3）揉捻混合，控制温度在30～60℃条件下混合0.5～2h，以使单宁酶充分酶解茶叶；

4）采用二次烘干法烘干茶叶。

上述步骤1）中，料液比是茶叶质量（g）与单宁酶溶液（mL）的比值。比如：料液比为1:9的比例即1g茶叶与9mL单宁酶溶液混合。

上述步骤2）中，所述固态发酵法是：先用黑曲霉固态发酵茶叶梗制得单宁酶粗液，再经过脱色、除菌、硫酸铵沉淀和透析处理步骤制得单宁酶溶液。

上述步骤2）中，所述单宁酶溶液的浓度为0.3～1.5U/mL。

上述步骤4）中，所述二次烘干法是：先控制温度120℃烘干茶叶，再控制温度100℃第二次烘干茶叶。二次烘干法先控制烘干温度120℃是为了先使单宁酶灭活，再控制烘干温度100℃是第二次烘干茶叶为了在烘干茶叶中水分的同时又能保持活性物质，保证茶叶的风味。

本发明利用固态发酵得到的单宁酶对茶叶进行二次加工处理的方法，可以增加茶叶中的活性物质，以提升茶叶品质。在单宁酶的处理下，茶叶中儿茶素组成和生物活性变化显著。依照本发明方法，低档茶叶经单宁酶加工后，茶水浸提液中儿茶素总量无显著性差异，但儿茶素组成变化很大。通过实验表明：其中，酯型儿茶素总量减少了23.5%，非酯型儿茶素和没食子酸含量分别增加了15.3%和182%；同时，茶水浸提液单宁-蛋白质聚合物和茶乳的形成量明显减少，这些成分变化对改善低档茶滋味和提高茶汤澄清度和稳定性具有非常显著的效果。此外，采用本发明方法，干茶叶经单宁酶加工后抗氧化活性大大增强，表现为酶加工后的茶水浸提液清除OH·和DPPH·自由基的IC₅₀分别仅为对照组的43.3%和86.4%%，即抗氧化活性提高了一倍左右；单宁酶处理前后茶水浸提液均有一定的抑制胰α-淀粉酶和抑制胰脂肪酶活性，而酶作用后抑制率有所下降，这是跟单宁酶喷洒干茶叶后活性物质的存在形式和含量发生变化有关。因此，本发明利用固态发酵得到的单宁酶对茶叶进行二次加工处理的方法，能显著促进茶叶中有益成分的转化，并保持茶叶的活性物质以保证风味。该方法可以提升低档茶叶的品质和附加价值，对增加茶业经济效益具有重要作用。

具体实施方式

1．主要材料

茶叶：低档铁观音茶，购于福建省泉州市安溪县茶园。

单宁酶：1.5U/mL，由黑曲霉JMU-TS528固态发酵茶梗制备得到单宁酶粗酶液，并进行脱色、除菌、硫酸铵沉淀和透析处理得到单宁酶制剂。

2．试剂与药品

甲醇（色谱纯），购于美国Tedia公司；

没食子酸（GA）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酰儿茶素、（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素（GC）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、咖啡因（Caffeine），均购于成都普瑞法科技开发有限公司；

二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），购于美国Sigma公司；

单宁酶：由黑曲霉JMU-TS528固态发酵茶叶梗，柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）提取制得，经活性炭脱色，微孔滤膜过滤除菌，再经过硫酸铵沉淀和透析处理。酶活力为2U/mL，酶活单位定义：30℃条件下每分钟产生1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位。

胰α-淀粉酶：2800U/mg，购于上海国药集团有限公司。酶活力单位定义：37℃，pH7.0条件下每分钟产生1μg麦芽糖所需的酶量定义为一个酶活单位。

胰脂肪酶：100～400U/mg，购于美国Sigma公司。酶活力单位定义：37℃，pH7.7条件下水解甘油三酯每分钟生成1μmol脂肪酸所需的酶量定义为一个酶活单位。

其他药品和试剂均为国产分析纯。

3．溶液及其配制

（1）柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）

称取10.507g一水合柠檬酸，加水溶解并定容至1L，称取14.706g柠檬酸三钠，加水溶解并定容至1L。按82︰118的比例混合并互调pH至5.0。

（2）0.5%乙酸溶液

量取5mL乙酸，加超纯水定容至1000mL，充分混合，过0.22μm微孔滤膜两次，低温存储，备用做高效液相色谱法检测儿茶素的流动相。

（3）DNS显色剂

称取5g3,5-二硝基水杨酸和100g四水合酒石酸钾钠，溶于30mL10%氢氧化钠溶液，再加入溶有1g苯酚和0.25g无水亚硫酸钠的10%氢氧化钠溶液20mL，加水定容至500mL，将固形物全部溶解，溶液配好后需在暗处静置10天后方可使用。

（4）磷酸盐缓冲液（0.02mol/L，pH7.0）

称取二水合磷酸氢二钠3.582g，氯化钠2.922g加适量水溶解，并用浓正磷酸调节pH至6.9，加水定容至500mL。

（5）胰α-淀粉酶溶液（0.05mg/mL）

1mL酶液应至少含3U。称取0.05g胰α-淀粉酶粉，用pH7.0磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL，作为母液，低温保存备用，用缓冲液稀释10倍后即为工作液。

（6）胰α-淀粉酶底物溶液（0.5%）

称取2.5g可溶性淀粉于500mL烧杯中，加入pH7.0磷酸盐缓冲液300mL，通过加热溶解，冷却后定容至500mL。

（7）磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH7.7）

称取十二水合磷酸氢二钠17.908g加水溶解并定容至1000mL，称取二水合磷酸二氢钠3.9g加水溶解并定容至500mL，取这两种溶液混合并互调至pH为7.7。

（8）胰脂肪酶溶液（2mg/mL）

称取1g胰脂肪酶酶粉于烧杯中，加入少量的pH7.7磷酸盐缓冲液调成糊状，再加缓冲溶液定容至500mL，然后冷冻离心取上清，低温保存备用。

（9）醋酸铜显色剂（5%）

称取5g醋酸铜，溶于适量水中，用吡啶调节pH至6.1，加水定容至100mL。

4．试验设备与仪器

SPS401F电子天平，上海精密科学仪器有限公司；

BS124S电子天平，上海精密科学仪器有限公司；

80目国家标准检验筛，浙江上虞市金鼎标准筛具厂；

Five Easy实验室pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；

高速药物粉碎机，山东省青州市精诚机械有限公司；

TDL-40B型台式离心机，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；

Centrifuge5415D小型高速离心机，德国Eppendorf公司；

HH-6数显恒温水浴锅，厦门精艺兴业科技有限公司；

WB-10L1精密恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；

WCJ-802磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；

UV-2600A型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；

AvantiTMJ-25冷冻离心机，美国Beckman公司；

BC/BD-318A海尔冰柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司；

Thermo scientific层析柜，Thermo Fisher Scientific Inc.；

Waters2695/2489高效液相色谱仪，美国Waters公司；

Symmetry C18反相色谱柱（3.0×250mm，5μm），美国Waters公司。

5．实验方法

5.1茶叶酶法二次加工方法

称取10g干茶叶于盘子中，按一定的液料比配制一定浓度的酶液，使用喷壶将酶液均匀喷洒在干茶叶上，适当揉捻，50℃条件下酶作用1h后，立即置于干燥箱中使酶失活及茶叶干燥，采用二次烘干法，第一次的温度为120℃，第二次的温度为100℃。待茶叶完全烘干后，适当研磨，保存备用。

5.2茶汤制备

称取1g磨碎茶样（酶处理与未处理的），至250mL具塞锥形瓶中，加入沸蒸馏水80mL，沸水浴浸提30min（每隔10min摇动一次）。浸提完毕后立刻趁热减压过滤，滤液移入100mL容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤，合并滤液，冷却后定容至100mL，备用。

5.3儿茶素检测方法

取处理后的茶汤1mL，10,000r/min离心10min，经0.22μm微孔滤膜过滤后，备HPLC分析。液相色谱条件：symmetry C18（3.0×250mm，5μm）色谱柱；流动相为0.5%乙酸水溶液（A）和甲醇（B），线性洗脱梯度为88%A（0min）-88%A（5min）-81%A（16min）-76%A（28min）-70%A（32min）-88%A（40min）-88%A（45min）；流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长278nm。

5.4单宁-蛋白质聚合物分析

采用蛋白质沉淀方法分析茶汤中单宁-蛋白质聚合物，从而体现单宁总量。称取牛血清白蛋白（BSA）2g，溶于40mL NaHCO3溶液（1%，pH8.2）中，加入0.15g考马斯亮蓝，室温下搅拌30min，以醋酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH4.8）于4℃透析过夜，期间更换4次缓冲液，配制用于单宁沉淀的染色BSA溶液，再用福林酚法测得蛋白质浓度为54g/L。

取酶解后的茶汤1mL和4mL染色BSA溶液于10mL离心管中，室温下剧烈振荡5min，使完全混合。4000r/min离心20min，弃上清，取1g/100mL SDS-5mL/100mL三乙醇胺-20mL/100mL异丙醇混合溶液3.5mL溶解沉淀，摇匀使BSA-单宁沉淀完全溶解，于590nm处以水为空白调零，测量各样品的吸光度值。

用同样的方法分析未经过单宁酶处理的茶汤单宁-蛋白聚合能力。

5.5茶乳含量测定

取低温或常温储存的茶汤适量，8,000r/min，8℃条件下离心25min，弃上清取沉淀，烘干称重。茶乳含量（g/100mL）以每100mL茶汤中沉淀的重量表示。

5.6茶汤生物活性检测方法

还原力测定：

于10mL具塞试管中分别加入1.5mL磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.6），0.5mL不同浓度的酶解茶汤和1.5mL K3Fe(CN)6溶液（1%，m/v），摇匀，于50℃水浴20min，冰水浴急速冷却后，加入1.5mL三氯乙酸溶液（10%，m/v）并摇匀，3000r/min离心15min。精确量取2.5mL上清于具塞试管中，再加入2.5mL水和0.5mL FeCl3溶液（0.1%，m/v），混匀后，静置10min，于700nm处测定吸光度，以水为空白调零，测定样品的吸光值。

用同样的方法测定未经过单宁酶处理的茶汤的还原力。

对OH·自由基的清除作用：

羟自由基在体内的存活时间较短，却具有很高的活性。产生OH·的体系模型常由Fenton反应（H₂O₂+Fe²⁺→OH·+OH^-+Fe²⁺）来建立，加入水杨酸后，水杨酸的苯环捕捉OH·并产生有色物质2,3-二羟基苯甲酸，该物质在510nm处有最大吸收。当在反应体系中加入具有清除羟自由基能力的物质，与水杨酸竞争羟自由基，会使有色物质的生成量减少，因而可以用分光光度法定量分析。测定方法为：于试管中加入1mL FeSO₄（2.25mmol/L）、1mL水杨酸-乙醇溶液（9mmol/L）、1mL酶解后的茶汤和1mL H₂O₂（8.8mmol/L），在37℃水浴中反应30min，510nm处测其吸光值A₁；用水代替茶汤，测空白A₀；再用2mL的水代替水杨酸-乙醇溶液和H₂O₂溶液，测茶汤本底值A₂。按如下公式计算清除率E并求出IC₅₀（清除50%自由基所需的样品浓度）。

E (%) = \frac{A_{0} - (A_{1} - A_{2})}{A_{0}} \times 100

式中，A₀为未加茶汤的吸光度值；

A₁为加入茶汤后的吸光度值；

A₂为茶汤的本底吸光度值。

用同样的方法求得未经过单宁酶处理的茶汤对OH·自由基的清除能力。

对DPPH·自由基的清除作用：

二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）是一种在有机溶剂中以氮为中心的非常稳定的自由基，它溶于乙醇中呈紫色，在517nm处有最大吸收，其浓度与吸光值呈线性关系。当溶液中加入能与DPPH·结合或反应的物质时，DPPH·数量减少，溶液颜色变浅，吸光值也变小。因此，可以通过在517nm处吸光值的变化检测茶汤对DPPH·的清除能力，反应其抗氧化能力。测定方法为：取2mL DPPH-乙醇溶液（0.2mmol/L），与2mL不同浓度的酶解茶汤混匀，室温下反应30min，以95%乙醇调零，测定5l7nm处的吸光值A₁。以95%乙醇代替茶汤作为空白对照A₀。按如下公式计算清除率E并求出IC₅₀。

E (%) = \frac{A_{0} - (A_{1} - A_{2})}{A_{0}} \times 100

式中，A₀为不加茶汤的吸光度值；

A₁为加入茶汤的吸光度值。

用同样的方法求得未经过单宁酶处理的茶汤对DPPH·自由基的清除能力。

对胰α-淀粉酶的抑制作用：

取0.25mL胰α-淀粉酶液（0.05mg/mL）于测试管中（对照管加已失活的同样浓度的胰α-淀粉酶液），分别加入0.25mL不同浓度的酶解茶汤，混合均匀，置于37℃水浴中保温10min后，加入0.5mL0.5%的淀粉溶液（预热至同样温度）。反应30min后立即加1mL DNS显色剂，置于沸水浴中8min，冷却后加水定容至10mL，以水为空白调零，540nm处测定吸光值。根据测试管和对照管中胰α-淀粉酶活力的变化求出抑制活性，绘制抑制率E-茶汤浓度曲线。

E (%) = \frac{T_{1} - T_{2}}{T_{1}} \times 100

式中，T₁为测试管的胰α-淀粉酶活力；

T₂为对照管的胰α-淀粉酶活力。

用同样的方法求得未经过单宁酶处理的茶汤对胰α-淀粉酶活力的抑制活性。

对胰脂肪酶的抑制作用：

取不同浓度的茶汤l mL与l mL胰脂肪酶溶液（2mg/mL）于测试管中，摇匀，对照管加已失活的同样浓度的胰脂肪酶溶液，于37℃中预热5min，然后加入已预热至同样温度的底物（4mL缓冲液和2mL橄榄油的混合物），37℃下，磁力搅拌反应30min，立即加入10mL二甲苯，继续搅拌5min，终止反应，同时萃取脂肪酸。将溶液转至离心管中，4000r/min离心10min，此时，有机相和水相分层澄清。取上层有机相4mL于小锥形瓶中，加入1mL醋酸铜显色液，振荡5min，再转入10mL离心管中，4000r/min离心10min后，用枪吸取1mL上层有机相于微量比色皿中，以水为空白调零，在710nm处测吸光度值。根据测试管和对照管中胰脂肪酶活力的变化求出抑制活性，绘制抑制率-茶汤浓度曲线。计算公式同胰α-淀粉酶测定。

用同样的方法求得未经过单宁酶处理的茶汤对胰脂肪酶活力的抑制活性。

5.7统计方法

实验结果均以4次平行测定的均值表示，数据使用SPSS17.0进行方差分析，差异性分析采用邓肯多范围检测法，相同字母表示差异不显著，不同字母表明差异显著（P<0.05）。

依据上述实验方法结合具体实施例中的实验条件变化对本发明作进一步的说明。

实施例1

本实施例测试不同料液比对本方法效果的影响。

按照上述5.1和5.2方法分别制备茶叶和茶汤，并控制单宁酶溶液体积（mL）与茶叶（g）的比例（即液料比）为9:1～1:1。经检测得到表1实验数据。由表1可知，随着单宁酶添加量的增加，儿茶素总量变化不大，但酯型儿茶素EGCG、GCG、ECG的含量明显减少，非酯型儿茶素EGC、EC的含量有所增加，没食子酸（GA）含量也显著增加。由此可见，液料比的增大意味着单宁酶总量的增加，茶叶表面单位面积接触的酶量增大，酶解作用增强，在单宁酶的作用下，酯型儿茶素被分解为非酯型儿茶素和没食子酸。

表1不同液料比方法获得的茶叶儿茶素含量

注：酶浓度为1.5U/mL，酶作用温度为50℃，酶作用时间为60min。

实施例2

本实施例测试不同单宁酶浓度对本方法效果的影响。

按照上述5.1和5.2方法分别制备茶叶和茶汤，控制料液比为1:3，并控制单宁酶浓度为0～1.5U/mL。经检测得到表2实验数据。单宁酶溶液处理茶叶，作用60min后其茶水浸提液中儿茶素含量变化如表2所示。从表中可以看出，干茶叶经不同量的单宁酶处理后，其水浸提液中儿茶素的总量和组成均变化较显著，整体呈现酯型儿茶素的含量明显减少，简单儿茶素和没食子酸的含量不断增加的趋势，这是因为酶浓度不断增大，茶叶表面单位面积接触的酶量增多，酶解作用增强的原因。当酶浓度为1.5U/mL时，儿茶素组分变化最明显。

表2不同单宁酶浓度对茶儿茶素的影响

注：料液比为1:3，酶作用温度为50℃，酶作用时间为60min。

实施例3

本实施例测试不同酶解温度对本方法效果的影响。

按照上述5.1和5.2方法分别制备茶叶和茶汤。温度是茶叶加工工序中的一重要工艺参数，对茶叶的外形和内质有着重要的影响。苏祝成等研究利用外源单宁酶改善夏茶滋味品质，该研究的酶作用条件是在室温下进行的，而肖世青等是在45～50℃条件下对暑季采摘的安溪铁观音喷洒复合酶液进行处理，这些研究均是对刚采摘不久的茶青叶进行作用，茶叶本身具有一定的多酚氧化酶、过氧化物酶等酶活性，再添加一些对茶叶内质形成有益的外源酶进行加工处理，对多酚类物质的氧化变化、茶叶品质的形成起着极重要的作用。

表3显示的是在不同温度（30°～60C）条件下，对干茶叶喷洒单宁酶溶液，酶作用一定时间后茶叶儿茶素组分的变化。由表3可看出，外界温度的适当升高，单宁酶对干茶叶儿茶素的酶解作用有所增强。当温度为60℃时，茶水浸提液中酯型儿茶素总量明显减少，非酯型儿茶素增加到最大，没食子酸的含量也最多。

表3不同酶解温度对茶儿茶素的影响

注：料液比为1:3，酶浓度为1.5U/mL，酶作用时间为60min。

实施例4

本实施例测试不同酶解时间对本方法效果的影响。

按照上述5.1和5.2方法分别制备茶叶和茶汤，并控制浸提时间为0～2小时。试验考察了茶儿茶素组分随单宁酶作用时间的动态变化情况，结果如表4所示。从表中同样可看出，随着酶作用时间的延长，

酯型儿茶素的总量减少，非酯型儿茶素和没食子酸的总量增加。当酶在茶叶表面上作用一段时间（1.5h）之后，酯型儿茶素的分解程度降低，酶解作用减弱，这种情况以儿茶素含量最多的EGCG浓度变化最明显，这是因为时间长了部分酶活性降低或已失活。

表4不同酶解时间对茶儿茶素的影响

注：料液比为1:3，酶浓度为1.5U/mL，酶作用温度为60℃。

可以理解，很多细节的变化是可能的，但这并不因此违背本发明的范围和精神，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化，皆应视为不脱离本发明专利的范畴。

Claims

1.茶叶的酶法二次加工方法，其特征在于包括如下步骤：

1) 称取适量干茶叶；

2) 将单宁酶溶液均匀喷洒在干茶叶上，单宁酶溶液与茶叶的料液比为1: 9～1:1，所述单宁酶溶液是采用固态发酵法制得；

3）揉捻混合，控制温度在30～60oC条件下混合0.5～2 h；

4）采用二次烘干法烘干茶叶。

2.根据权利要求1所述的茶叶的酶法二次加工方法，其特征在于：步骤2）中，所述固态发酵法是：先用黑曲霉固态发酵茶叶梗制得单宁酶粗液，再经过脱色、除菌、硫酸铵沉淀和透析处理步骤制得单宁酶溶液。

3.根据权利要求1或2所述的茶叶的酶法二次加工方法，其特征在于：步骤2）中，所述单宁酶溶液的浓度为0.3～1.5 U/mL。

4.根据权利要求1所述的茶叶的酶法二次加工方法，其特征在于：步骤4）中，所述二次烘干法是：先控制温度100oC烘干茶叶，再控制温度120oC第二次烘干茶叶。