CN107496902A - 在氨基酸1和3位修改的环孢菌素类似分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在氨基酸1和3位修改的环孢菌素类似分子。本发明公开了根据下式(I)的包含氨基酸1和3位取代基修改的环孢菌素A类似物。所公开的化合物包括对亲环素包括亲环素A具有亲和性的化合物,且所述化合物与环孢菌素A及其仅在1位改性的类似物相比降低了免疫抑制性。

Description

在氨基酸1和3位修改的环孢菌素类似分子
本申请是申请日为2011年12月14日、申请号为201180067449.4、发明名称为“在氨基酸1和3位修改的环孢菌素类似分子”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及属于环孢菌素家族的新类似物的分子,包括环孢菌素A(CsA)的类似物和包括具有降低的或没有免疫抑制活性且结合亲环素(CyP)的类似物。
背景技术
环孢菌素是具有有效免疫抑制剂活性的环状多肽种类的成员。至少部分这类化合物(如环孢菌素A(CsA))是由物种多孢木属真菌(Tolypocladium inflatum)的次级代谢物产生的。CsA为有效的免疫抑制剂,已证明其能抑制体液免疫和细胞介导的免疫反应,诸如同种异体移植物排斥、迟发型超敏反应、实验性变应性脑脊髓炎、弗氏佐剂性关节炎和移植物抗宿主疾病。其被用于在器官移植中预防器官排斥;以及用于治疗类风湿性关节炎和用于治疗银屑病。
尽管环孢菌素家族中许多化合物是已知的,但CsA可能是医学上最广泛应用的化合物。CsA的免疫抑制效应涉及抑制T细胞介导的激活事件。免疫抑制是通过环孢菌素与普遍存在的称为亲环素(cyclophilin)(CyP)的胞内蛋白相结合来实现的。该复合物又抑制钙神经素酶的钙和钙调蛋白-依赖性丝氨酸-苏氨酸磷酸酶的活性。钙神经素的抑制阻止转录因子如 NFATp/c和NF-κB的激活,这对于T细胞激活中细胞因子基因(IL-2、IFN-γ、IL-4和 GM-CSF)的诱导是必需的。
自从最初发现环孢菌素以来,已经分离和鉴定了广泛多样的天然存在的环孢菌素。另外,已经通过部分或完全合成手段和通过应用改良的细胞培养技术制备了许多非天然存在的环孢菌素。因此,包含环孢菌素的物种基本上包括例如天然存在的环孢菌素A~Z;多种非天然存在的环孢菌素衍生物;人工或合成的环孢菌素,包括二氢环孢菌素和异环孢菌素;衍生的环孢菌素(例如MeBmt残基的3’-O-原子可被酰化,或3-位肌氨酰基残基上可引入其它取代基);其中MeBmt残基存在异构形式的环孢菌素(例如其中MeBmt残基位置6’和7’位置上的构型为顺式而非反式);和其中肽序列中特定位置上掺入变体氨基酸的环孢菌素。
在位置1含有改性氨基酸的环孢菌素类似物公开于WO 99/18120和WO 03/033527中,在此将其全文引入作为参考。这些申请描述了称为“ISATX247”或“ISA247”或“ISA”的环孢菌素衍生物。该类似物除了在氨基酸1位残基上的修改外,结构上与环孢菌素A相同。申请人先前发现,ISA247的顺式和反式异构体的一些混合物(包括主要包含反式ISA247的混合物)显示出增强免疫抑制性效力和降低毒性的组合作用,优于天然存在和目前已知的环孢菌素。
已经确定环孢菌素有三个细胞靶标;钙神经素,CyP亚型(包括但不限于CyP-A、CyP-B和CyP-D),和P-糖蛋白(PgP)。环孢菌素与钙神经素的结合导致显著的免疫抑制,且负责与移植和自体免疫迹象的传统联系。
亲环素家族
CyPs(酶学委员会(EC)编号5.1.2.8)属于一类蛋白质,具有肽酰-脯氨酰顺-反式异构酶活性;这种蛋白质统称为亲免素,并包括FK-506-结合蛋白质和小细胞蛋白(parvulins)。CyPs被发现在所研究的所有生物体(原核生物和真核生物)的所有细胞中,且在进化中是结构上保守的。人类有7种主要CyPs,即CyP-A、CyP-B、CyP-C、CyP-D、CyP-E、CyP-40、和CyP-NK(首次从人天然杀伤细胞中鉴定出来),总计16种独特的蛋白质(Galat A. Peptidylprolylcis/trans isomerases (immunophilins): biological diversity - targets -functions. Curr Top Med Chem 2003, 3:1315-1347;Waldmeier PC等.Cyclophilin Das a drug target. Curr Med Chem 2003, 10:1485-1506)。
在哺乳动物中鉴定的第一个CyPs成员是CyP-A。CyP-A是18-kDa的细胞溶质蛋白质,且是CsA结合的最丰富蛋白质。据估计,CyP-A组成0.6%的总细胞溶质蛋白质(Mikol V等.X-ray structure of monmeric cyclophilin A-cycloporin A crystal complex at2.1 A resolution. J. Mol. Biol. 1993, 234:1119-1130;Galat A,Metcalfe SM.Peptidylproline cis/trans isomerases. Prog. Biophys. Mol. Biol. 1995, 63:67-118)。
亲环素的细胞位置
CyPs可发现在大多数组织的大多数细胞腔隙中,且编码独特的功能。在哺乳动物中,CyP-A和CyP-40是细胞溶质的,而CyP-B和CyP-C具有氨基-末端的信号序列,使其靶向于内质网蛋白质分泌途径(综述于Galat, 2003;Dornan J等.Structures of immunophilinsand their ligand complexes. Curr Top Med Chem 2003, 3:1392-1409)。CyP-D具有信号序列,使其指向线粒体(Andreeva L等.Cyclophilins and their possible role inthe stress response. Int J Exp Pathol 1999, 80:305-315;Hamilton GS等.Immunophilins: beyond immunosuppression. J Med Chem 1998, 41:5119-5143);CyP-E 具有氨基-末端的RNA-结合域,且位于胞核(Mi H等.A nuclear RNA-bindingcyclophilin in human T cells. FEBS Lett 1996, 398:201-205),和CyP-40具有TPRs,且位于胞液(Kieffer LJ等.cyclophilin-40, a protein with homology to the P59component of the steroid receptor complex. Cloning of the cDNA and furthercharacterization. J Biol Chem 1993, 268:12303-12310)。人CyP-NK是最大的CyP,具有巨大的亲水性和带正电荷的羧基端,且位于胞液(Anderson SK等.A cyclophilin-relatedprotein involved in the function of natural killer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:542-546;Rinfret A等. The N-terminal cyclophilin-homologousdomain of a 150-kilodalton tumor recognition molecule exhibits bothpeptidylprolyl cis-transisomerase and chaperone activities. Biochemistry1994, 33:1668-1673)。
亲环素的功能与活性
CyPs是在许多细胞过程中涉及的多功能蛋白质。因为CyPs在进化中始终是高度保守的,这表明CyPs有至关重要的作用。最初,人们发现CyPs具有催化肽基-脯氨酰键顺反异构化的特异酶性能(Galat, 1995;Fisher GA等.A phase I study of paclitaxel (taxol)(T) in combination with SDZ valspodar, a potent modulator of multidrugresistance (MDR). Anticancer Drugs. 1994;5(Suppl 1): 43)。因此,CyPs被称为肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPI酶),它可以在新合成的蛋白质固有折叠中充当加速因子,PPI酶也参与修复由于环境应激受损的蛋白质,所述环境应激包括热应激、紫外线照射、细胞环境的pH变化、和用氧化剂的治疗。此功能被称为分子陪伴活性(Yao Q等.Roles ofcyclophilins in Cancers and Other Organs Systems. World J. Surg. 2005, 29:276-280)。
此外,最近显示,CyPs的PPI酶活性涉及不同的细胞过程,包括细胞内蛋白质运输(Andreeva, 1999;Caroni P等.New member of the cyclophilin family associatedwith the secretory pathway. J Biol Chem 1991, 266:10739-42)、线粒体功能(Halestrap AP等.CsA binding to mitochondrial cyclophilin inhibits thepermeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusioninjury. Mol Cell Biochem 1997, 174:167-72;Connern CP, Halestrap AP.Recruitment of mitochondrial cyclophilin to the mitochondrial inner membraneunder conditions of oxidative stress that enhance the opening of a calcium-sensitive non-specific channel. Biochem J 1994, 302:321-4)、mRNA前体加工(Bourquin JP等.A serine/argininerich nuclear matrix cyclophilin interactswith the Cterminal domain of RNA polymerase II. Nucleic Acids Res 1997, 25:2055-61)、和多蛋白复合体稳定性维护(Andreeva, 1999)。
环孢菌素在疏水口袋内经由接触以纳摩尔亲和力结合CyP-A(Colgan J等.Cyclophilin A-Deficient Mice Are Resistant to Immunosuppression byCyclosporine. The Journal of Immunology 2005, 174: 6030-6038, Mikol, 1993),并抑制PPI酶活性。然而,这种效应被认为是与免疫抑制不相关的。更正确地,CsA和CyP-A之间的复合体建立了组合表面,其结合并阻止钙神经素调控细胞因子的基因转录(Friedman J等.Two cytoplasmic candidates for immunophilin action are revealed byaffinity for a new cyclophilin: one in the presence and one in the absence ofCsA. Cell 1991, 66: 799-806;Liu J等.Calcineurin is a common target ofcyclophilin-CsA and FKBP-FK506 complexes. Cell 1991 , 66: 807-815)。
亲环素的同源性
CyP-A,典型的家族成员,是哺乳动物细胞中高度保守的蛋白质(Handschumacher RE等.Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for CsA. Science 1984,226: 544-7)。人CyP-A的序列同源性分析显示,其与人CyP-B、CyP-C、和CyP-D是高度同源的(Harding MW, Handschumacher RE, Speicher DW. Isolation and amino acidsequence of cyclophilin. J Biol Chem 1986, 261:8547-55)。通过高度保守区域的约109个氨基酸,形成了所有CyPs的环孢菌素结合口袋。已知的CyPs中,CyP-D具有与CyP-A的最高同源性。事实上,CyP-A和CyP-D之间在这一区域的序列同一性是100%(Waldmeier2003;Kristal BS等.The Mitochondrial Permeability Transition as a Target forNeuroprotection. Journal of Bioenergetics and Biomembranes 2004, 36( 4);309-312)。因此,CyP-A亲和性是CyP-D亲和性非常好的预言者,反之亦然(Hansson MJ等.TheNonimmunosuppressive Cyclosporine analogues NIM811 and UNIL025 DisplayNanomolar Potencies on Permeability Transition in Brain-Derived Mitochondria.Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2004,36(4): 407-413)。这种关系已经反复得到环孢菌素类似物的经验性证明(Hansson, 2004;Ptak Rg等.Inhibition ofHuman Immunodeficiency Virus Type 1 Replication in Human Cells by Debio-025,a Novel Cyclophilin Binding Agent.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2008:1302-1317;Millay DP等.Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrialdependent necrosis attenuates muscular dystrophy. Nature Medicine 2008, 14(4): 442-447;Harris R等.The Discovery of Novel Non-ImmunosuppressiveCyclosporine Ethers and Thioethers With Potent HCV Activity. Poster # 1915,59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases(AASLD), 2008)。CyPs的序列同源性提议,所有CyPs是环孢菌素类似物的潜在靶标。因为CyPs涉及的众多细胞过程,这进一步提议,保持显著结合CyP的CsA类似物可用于治疗许多疾病的适应证。
亲环素介导的疾病
人免疫缺陷病毒(HIV):
HIV是逆转录病毒家族的慢病毒属,并在某些病毒感染和复制过程中充当CyP参与的实例。CyP-A在十年前就已被确定为抗HIV化疗中有效的靶标(Rosenwirth BA等.CyclophilinA as a novel target in anti-HIV-1 chemotherapy. Int. Antivir. News 1995, 3:62-63)。CyP-A在HIV-1复制周期中满足早期的基本功能。它被发现特异性结合HIV-1 Gag多聚蛋白(Luban JKL等.Human immunodeficiency virus type 1 Gag protein binds tocyclophilins A and B. Cell 1993, 73: 1067-1078)。衣壳蛋白p24(CA)的G89和P90周围确定的氨基酸序列被鉴定为CyP-A的结合位点(Bukovsky AAA等.Transfer of the HIV-1cyclophilin-binding site to simian immunodeficiency virus from Macaca mulattacan confer both cyclosporine sensitivity and cyclosporine dependence. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1997, 94: 10943-10948;Gamble TRF等.Crystal structure ofhuman cyclophilin A bound to the amino-terminal domain of HIV-1 capsid. Cell1996, 87: 1285-1294)。CyP-A对CA的亲和力促进CyP-A在组装中掺入病毒体颗粒(ThaliMA等.Functional association of cyclophilin A with HIV-1 virions. Nature 1994,372: 363-365)。实验证据表明,CyP-A-CA的相互作用是HIV-1复制必不可少的;抑制这种相互作用会损害人类细胞中HIV-1的复制(Hatziioannou TD等.Cyclophilin interactionswith incoming human immunodeficiency virus type 1 capsids with opposingeffects on infectivity in human cells. J. Virol. 2005, 79: 176-183;Steinkasserer AR等.Mode of action of SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive CsAanalog with activity against human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1):interference with early and late events in HIV-1 replication. J. Virol 1995,69: 814-824)。在CyP-A涉及的病毒复制周期中的步骤被证明是在病毒颗粒渗透后和双链病毒DNA整合到细胞基因组前的事件(Braaten DEK等.Cyclophilin A is required foran early step in the life cycle of human immunodeficiency virus type 1 beforethe initiation of reverse transcription. J. Virol 1996 70: 3551-3560;MlynarED等.The non-immunosuppressive CsA analogue SDZ NIM 811 inhibits cyclophilinA incorporation into virions and virus replication in human immunodeficiencyvirus type 1-infected primary and growth-arrested T cells. J. Gen. Virol 1996, 78: 825-835;Steinkasserer, 1995)。CsA抗HIV-1的活性首先报道于1988年(Wainberg MA等.The effect of CsA on infection of susceptible cells by humanimmunodeficiency virus type 1. Blood 1998, 72: 1904-1910)。对CsA和许多衍生物抑制HIV-1复制的评价揭示了非免疫抑制的CsA类似物具有抗HIV-1的活性,其相当于或者甚至优于那些免疫抑制的类似物(Bartz SRE等.Inhibition of human immunodeficiencyvirus replication by nonimmunosuppressive analogs of CsA. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1995, 92: 5381-5385, Billich AF等.Mode of action of SDZ NIM 811, anonimmunosuppressive CsA analog with activity against human immunodeficiencyvirus (HIV) type 1: interference with HIV protein-cyclophilin A interactions.J. Virol 1995, 69: 2451-2461 ;Ptak, 2008)。
炎症
疾病中的炎症涉及白细胞(白血细胞)流入感染区域。白细胞被趋化因子(化学吸引剂家族)吸引到该区域。体外研究表明,细胞外的CyP-A是人白细胞和T细胞的有效化学吸引剂(Kamalpreet A等.Extracellular cyclophilins contribute to the regulation ofinflammatory responses Journal of Immunology 2005;175: 517-522;Yurchenko VG等.Active-site residues of cyclophilin A are crucial for its signalingactivity via CD147. J. Biol. Chem. 2002;277: 22959-22965;Xu QMC等.Leukocytechemotactic activity of cyclophilin. J. Biol. Chem. 1992;267: 11968-11971;Allain FC等.Interaction with glycosaminoglycans is required for cyclophilin Bto trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytes toextracellular matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002;99: 2714-2719)。此外,当体内注入时,CyP-A可诱导迅速的其特征在于白细胞流入的炎症应答(Sherry BN等.Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product oflipopolysaccharide-activated macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992;89:3511-3515)。CyP-A普遍分布在细胞内,然而在炎症应答过程中,CyP-A通过活的和濒死的细胞释放到细胞外组织间隙(Sherry, 1992)。事实上,在几种不同的炎症性疾病(包括败血症、类风湿关节炎)和血管平滑肌细胞疾病中,已经报告了升高水平的CyP-A(Jin ZG等.Cyclophilin A is a secreted growth factor induced by oxidative stress. Circ. Res. 2000;87: 789-796;Teger, 1997;Billich, 1997)。在类风湿关节炎的情形中,报道了类风湿关节炎患者滑液中的CyP-A水平和嗜中性粒细胞数量之间的正相关性(Billich,1997)。
癌症
最近在许多癌症组织和细胞系中,包括但不限于在小和非小细胞肺癌、膀胱癌、肝细胞癌、胰腺癌和乳腺癌中,CyP-A显示出过度表达(Li, 2006;Yang H等.Cyclophilin A isupregulated in small cell lung cancer and activates ERK1/2 signal.Biochemical and Biophysical Research Communications 2007;361:763-767;Campa,2003)。在提供外源性CyP-A的情况下,显示出刺激癌细胞的生长(Li,2006;Yang, 2007),而CsA阻止该生长(Campa, 2003)。最近,已经证明了CyP(A和B)错综复杂地参与允许人乳腺癌细胞生长的生化途径,和CyP敲除实验降低了癌细胞的生长、增殖和运动(Fang F等.Theexpression of Cyclophilin B is Associated with Malignant Progression andRegulation of Genes Implicated in the Pathogenesis of Breast Cancer. The American Journal of Pathology 2009;174(1): 297-308;Zheng J等.Prolyl IsomeraseCyclophilin A Regulation of Janus-Activated Kinase 2 and the Progression ofHuman Breast Cancer. Cancer Research 2008;68 (19): 7769-7778)。最有趣地,CsA治疗异种移植乳腺癌细胞的小鼠,诱发了肿瘤坏死和完全地抑制转移(Zheng, 2008)。研究人员得出“亲环素B的作用可显著地促成人乳腺癌的发病机制”和“亲环素的抑制可能是一种人乳腺癌治疗的新治疗策略”(Fang, 2009;Zheng, 2008)。
丙型肝炎
丙型肝炎病毒(HCV)是世界上最普遍的肝脏疾病,被世界卫生组织视为流行病。因为HCV可以在被发现之前感染患者数十年,它通常被称为“静息的”流行病。研究表明,全世界超过2亿人感染了HCV,世界人口约3.3%的总发病率。仅在美国,近4百万人感染或已经感染HCV;其中270万人经历慢性感染。所有HCV感染个体处于正发展为严重威胁生命的肝脏疾病的风险中。慢性丙型肝炎的当前标准治疗为两种广义抗病毒剂聚乙二醇干扰素与利巴韦林组合的联用(Craxi A等.Clinical trial results of peginterferons in combinationwith ribavirin. Semin Liver Dis 2003;23(Suppl 1): 35-46)。这种治疗的失败率约为50%(Molino BF. Strategic Research Institute: 3rd annual viral hepatitis indrug discovery and development world summit 2007. AMRI Technical Reports;12(1))。
最近已证实,CyP-B是HCV基因组有效复制的关键(Watashi K等.Cyclophilin BIs a Functional Regulator of Hepatitis C Virus RNA Polymerase.Molecular Cell2005, 19: 111-122)。对于其有效的基因组复制,病毒依赖于宿主衍生的因子诸如CyP-B。CyP-B与HCV RNA聚合酶NS5B相互作用,以直接刺激其RNA结合活性。RNA干扰(RNAi)介导的内源性CyP-B表达的减少和NS5B结合CyP-B引起的损失均降低了HCV的复制水平。因此,CyP-B充当HCV复制机构中NS5B的刺激调节剂。这种对病毒复制的调节机制可鉴别CyP-B为抗病毒治疗策略的靶标。
不像HCV的其他治疗,CyP抑制不直接靶向于HCV病毒。因此认为,对CyP结合药物的耐受将比目前HCV治疗药物出现得更慢(Manns MP等. The way forward in HCVtreatment-finding the right path. Nature Reviews Drug Discovery 2007;6: 991-1000)。此外,通过在宿主-病毒相互作用水平的干扰,CyP抑制可能会打开抗HCV治疗的新途径,它不仅对干扰素为基础的治疗,而且对直接靶向HCV复制酶如蛋白酶和聚合酶抑制剂的未来治疗均可为互补的(Flisiak R, Dumont JM, Crabbé R. Cyclophilin inhibitorsin hepatitis C viral infection. Expert Opinion on Investigational Drugs 2007,16(9): 1345-1354)。影响HCV病毒复制的新型抗HCV药物的开发已显著受碍于缺乏合适的实验室HCV模型。这一障碍最近通过开发几种合适的细胞培养模型(Subgenomic HCVReplicon Systems)和含有人肝细胞的小鼠模型(Goto K等. Evaluation of the anti-hepatitis C virus effects of cyclophilin inhibitors, CsA, and NIM811. Biochem Biophys Res Comm 2006;343: 879-884;Mercer DF等. Hepatitis C virus replicationin mice with chimeric human livers. Nat Med 2001;7: 927-933)才得到克服。环孢菌素最近在筛选模型和小型临床试验中被证实了抗HCV活性(Watashi K等. CsA suppressesreplication of hepatitis C virus genome in cultured hepatocytes. Hepatology 2003;38:1282-1288;Inoue K, Yoshiba M. Interferon combined with cyclosporinetreatment as an effective countermeasure against hepatitis C virus recurrencein liver transplant patients with end-stage hepatitis C virus relateddisease. Transplant Proc 2005;37:1233-1234)。
肌肉退行性障碍
CyP-D是所有细胞中线粒体通透性转换孔(MTP)的组成部分。MTP孔的功能是提供细胞内钙稳态。在正常条件下,MTP孔的开放和关闭是可逆的。在涉及过量钙流入细胞内的病理条件下,这使线粒体超负荷且诱导MPT孔的不可逆开放,导致细胞死亡或凋亡。据报道,CsA在乌尔里希(Ullrich)先天性肌营养不良症和Bethlam肌病的患者中纠正了其线粒体的功能障碍和肌细胞凋亡[(Merlini L等. CsA corrects mitochondrial dysfunction andmuscle apoptosis in patients with collagen VI myopathies. PNAS 2008;105(13):5225-5229]。CsA已在体外证实了其剂量依赖性地抑制离体心肌线粒体的MTP开放,从而阻止细胞凋亡和允许细胞有宝贵的修复时间(Gomez L等. Inhibition of mitochondrialpermeability transition improves functional recovery and reduces mortalityfollowing acute myocardial infarction in mice Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007, 293: H1654-H1661)。在58例存在急性心肌梗死患者的临床研究中,与安慰剂所观察的结果相比,证实了在再灌注时间施用CsA与较少的梗死相关(Piot C等. Effect ofCyclosporin on Reperfusion Injury in Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine 2008;395(5): 474-481))。
慢性神经退行性疾病
CsA可用作由于头部外伤的急性脑缺血和损坏情况中的神经保护剂(Keep M等.Intrathecal cyclosporine prolongs survival of late-stage ALS mice. Brain Research 2001;894: 327-331)。相对在缺乏治疗时只有10%存活率,经CsA治疗的动物显示出引人注目的80%的存活率。经后来确定,这主要是CsA结合线粒体CyP-D的结果。经随后确定,CsA的效用延伸到慢性神经退行性变,如同后来被卢伽雷(Lou Gerhig)氏病(ALS)的大鼠模型所证实(美国专利号5,972,924),其中CsA治疗增加了一倍以上的剩余寿命。最近还表明,在CyP-D敲除小鼠中CyP-D失活保护了实验性自身免疫性脑脊髓炎(多发性硬化症的动物模型)的轴突(Forte M等. Cyclophilin D inactivation protects axons inexperimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of multiplesclerosis. PNAS 2007;104(18): 7558-7563)。在阿尔茨海默氏病小鼠模型中,CyP-D缺乏基本上提高了学习、记忆和突触的功能(Du H等. Cyclophilin D deficiency attenuatesmitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning and memoryin Alzheimer's disease Nature Medicine 2008, 14(10): 1097-1105)。此外,CsA在亨廷顿病大鼠模型中被证明是有效的(Leventhal L等. CsA protects striatal neuronsin vitro and in vivo from 3-nitropropionic acid toxicity. Journal of Comparative Neurology 2000, 425(4): 471-478),和在帕金森病小鼠模型是部分有效的(Matsuura K等. CsA attenuates degeneration of dopaminergic neurons induced by6-hydroxydopamine in the mouse brain. Brain Research 1996, 733(1): 101-104)。因此,线粒体依赖性坏死代表突出的发病机制,提议抑制CyP-D可以提供这些疾病的新药理学治疗策略(Du, 2008)。
由于细胞钙离子(Ca 2+ )稳态丧失的细胞、组织和器官的损伤
Ca2+在细胞水平上参与许多生理进程,包括健康的线粒体功能。在某些病理条件如心肌梗死、中风、急性肝毒性、胆汁淤积、和移植器官的存储/再灌注损伤中,线粒体丧失调节钙水平的能力,过多钙累积在线粒体基质中,导致线粒体内膜大量的孔开放(Rasola A等.The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in celldeath and in disease pathogenesis. Apoptosis 2007, 12: 815-833)。通过孔的高达1.5千道尔顿的离子和分子的非选择性传导,被称为线粒体通透性转变的过程,导致线粒体膨胀和达到细胞死亡包括诱导细胞凋亡的其他事件。MTP的成分之一是CyP-D。CyP-D是亲免素分子,其异构酶活性调节MPTP的开放,通过CsA或CsA类似物抑制异构酶活性可抑制MPTP产生,从而防止细胞死亡。
非免疫抑制的环孢菌素类似物亲环素抑制剂
尽管CsA在上述适应证中的有利效应,但免疫抑制伴发的效应限制了CsA作为CyP抑制剂在临床实践中的实用性。目前,只有少数CsA类似物已被证明有很少或降低的免疫抑制活性(即<10%的CsA免疫抑制效能),并仍然保留其结合CyP的能力(即与CsA相比>10%的结合能力)。
NIM 811(Melle 4 -环孢菌素)
NIM 811是真菌雪白弯颈霉(Tolypocladium niveum)的发酵产物,其在氨基酸4位上被修改并显示无免疫抑制活性(由于缺乏钙神经素结合),但保留对CyP-A的结合亲和力(Rosenwirth BA等. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1replication by SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive Cyclosporine Analogue.Antimicrob Agents Chemother 1994, 38: 1763-1772)。
DEBIO 025 (MeAla 3 EtVal 4 -环孢菌素)
DEBIO 025是在氨基酸3和4位上双元化学改性的CsA。DEBIO 025也显示没有免疫抑制活性,仍还保留对CyP-A PPI酶活性的结合亲和力(Kristal, 2004)。
SCY-635 (二甲氨基乙基硫代Sar 3 -羟基Leu 4 -环孢菌素)
SCY-635在氨基酸3和4位上双元化学改性的CsA。SCY-635也显示没有免疫抑制活性,仍还保留对CyP-A PPI酶活性的结合亲和力(PCT公布号WO2006/039668)。
一般来说,这些化合物具有对负责结合钙神经素的CsA方面的修改,且一般需要修改氨基酸3和4位。氨基酸3和4位的修改是艰苦和复杂的,因为这一做法通常涉及开放环孢菌素的环、取代和/或修改这些氨基酸、然后闭合环以产生修改的环孢菌素。
与此相反,侧链氨基酸1位的改性不需要打开环孢菌素的环。然而,氨基酸1位与CyP结合(而不是结合钙神经素)相关,且修改增加了CsA的免疫抑制效果。例如美国专利号6,605,593公开了氨基酸1位的单一修改,其导致CsA类似物具有增加的免疫抑制效能。
因此,容易合成的且在治疗CyP介导的疾病中有效的环孢菌素类似分子(“CAM”)应是令人想要拥有的。还令人想要地提供CsA类似物,该类似物提供至少一些CsA的原来功能,但它相对于原来的CsA具有改善的或额外的性质、效果和功能。
发明概述
根据一方面,本发明的化合物包括根据本文定义的非免疫抑制的环孢菌素A类似物。根据另一方面,本发明化合物对亲环素包括亲环素A具有亲和性。根据其它方面,本发明的化合物包括环孢菌素A类似物,其对亲环素介导的疾病或病症是有用的,并发展了这些疾病或病症的疗法。
根据一个方面,本发明涉及式L的化合物:
其中
a. R'为H或乙酰基;
b. R1为2到15个碳原子长度的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族碳链;
c. R2选自:
i.H;
ii. 未取代的、N-取代的、或N,N-二取代的酰胺;
iii.N-取代的或未取代的酰基保护的胺;
iv.羧酸;
v.N-取代的或未取代的胺;
vi.腈;
vii.酯;
viii.酮;
ix.羟基、二羟基、三羟基、或多羟基的烷基;和
x.取代的或未取代的芳基;
xi.饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链,其任选包含选自氢、酮、羟基、腈、羧酸、酯、1,3-二氧戊烷、卤素和氧代的取代基;
xii. 芳香族基团,其包含选自卤化物、酯和硝基的取代基;和
xiii. 饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链(xi)和芳香族基团(xii)的组合;和
d. R23为饱和或不饱和的直链或支链的任选取代的脂肪族碳链。
在一个方面,取代基R1-R2选自:
在一个方面,R2选自:
其中
i.R5为1到10个碳长度的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族碳链;和
ii.R6为单羟基化、二羟基化、三羟基化或多羟基化的1到10个碳长度的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族碳链。
在一个方面,取代基R1-R2包含2到5个碳的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链,其任选被选自氢、酮、羟基、腈、卤素、氧代、羧酸、酯、和1,3-二氧戊烷的取代基取代;
在一个方面,R3选自:
在一方面, R23包含任选取代的烷基,包括任选取代的C1-C3烷基。所述烷基可以被氨基取代,并且可以包含C1-C3-Ala,其中所述化合物包含D-差向异构体。在所述的实施方案中,R23可以为MeAla。
在一方面,上述的式L
选自下列:
在一方面,R23是1~6个、1~5个、1~4个、1~3个或2个碳长度的直链或支链的脂肪族碳链。
在一方面,本发明涉及治疗或预防哺乳动物中亲环素介导的疾病的方法,包括在治疗亲环素介导的疾病或损伤的条件下给哺乳动物施用本文所述的化合物,或所述化合物或组合物治疗所述疾病或损伤的用途,或所述化合物在制备用于所述用途或治疗的药物中的用途。所述疾病或损伤可以是由亲环素过表达介导的,或该疾病是亲环素先天性过表达的。所述亲环素介导的疾病或损伤可以选自:
a. 病毒感染;
b. 炎症性疾病;
c. 癌症;
d. 肌肉障碍(muscular disorder);
e. 神经障碍;和
f.与缺血、再灌注、细胞钙稳态丧失、离子稳态丧失、自由基生产增加、或诱导线粒体功能障碍的毒素相关的损伤;
其中所述病毒感染任选是由选自以下的病毒引起的:人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV、hCoV-NL63、hCoV-HKU-1、hCoV-OC43、hCOV-229E、冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、和传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis virus);
其中所述炎症性疾病任选地选自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、过敏性疾病、炎性肠病、败血症、血管平滑肌细胞疾病、动脉瘤、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥、和脉管炎;
其中所述癌症任选地选自小和非小细胞肺癌、膀胱癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、和前列腺癌;
其中所述肌肉障碍任选地选自心肌再灌注损伤、肌营养不良症、胶原VI肌病(collagenVI myopathies)、心脏骤停后综合征(PCAS)、心力衰竭、动脉粥样硬化、和腹主动脉瘤;
其中所述神经障碍任选地选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统萎缩、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、中风、糖尿病神经病变、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷氏病)、双相障碍、兴奋毒性损伤(excitotoxic injury)、肝性脑病、低血糖、锰中毒(manganesetoxicity)、神经元靶标剥夺(neuronal target deprivation)、毒性脂肪酸如花生四烯酸、机械性神经损伤、脊髓损伤、和脑损伤;和
其中所述与细胞钙稳态丧失相关的损伤任选地选自心肌梗死、中风、急性肝毒性、胆汁淤积、和移植器官的存储/再灌注损伤。
在一方面,本发明涉及制备上述式L化合物的方法,其包括以下步骤:
1) 将环孢菌素A(CsA)与碱性烷基氨基锂(lithium alkylamide)在合适的溶剂存在下进行反应,随后与合适的亲电试剂反应以生成式1化合物:
2)将式1化合物与AC2O在合适的溶剂存在下进行反应,以形成式2A的化合物:
3)将式2A的化合物与氧化剂进行反应,以形成式3A的化合物:
4)将式3A的化合物与亲电试剂进行反应,以形成式4A的化合物:
5)任选地将式4A的化合物进行脱乙酰化。
在一方面,上述式L的制备包括在所述溶剂中加入过量的LiCl以主要形成式L的L-差向异构体,或所述式L的制备在LiCl缺失下进行,以主要形成式L的D-差向异构体。所述碱性烷基氨基锂可包括二异丙基氨基锂。
在一方面,所述亲电试剂选自下表中定义的组,以生成表中提出的相应R23:
在一方面,本发明涉及制备本文所定义式L的方法,其包括以下步骤:
1) 将式1A的化合物与二甲氨基吡啶在适当的溶剂的存在下进行反应,以形成式2化合物:
任选随后形成式3的醛:
任选随后通过维蒂希反应以生成式L的化合物,其中R23选自:
在一方面,本发明涉及本文所定义式L的制备,其包括以下步骤:将式5的化合物与碱性烷基氨基锂,任选地包括二异丙基氨基锂,在合适的亲电试剂存在下,在适当的溶剂中进行反应,以形成式L的化合物,其中R23包括任选取代的C1-C3烷基。
一般地,对于本文件公开的所有化学式而言:
“羧酸”包括其中羧酸部分连接在以下取代基之一的基团:
1. 可被取代的烷基(例如2至15个碳的烷基);
2. 可被取代的烯基(例如2至15个碳的烯基);和
3. 可被取代的炔基(例如2至15个碳的炔基);
上述取代可包括卤素(例如氟、氯、溴、碘等)、硝基、氰基、羟基、可被取代的硫氢基(例如硫氢基(thiol)、C1-4烷基硫基(alkylthio)等)、可被取代的氨基(例如氨基、单-C1-4烷基氨基、二-C1-4烷基氨基、5-至6-元的环氨基如四氢吡咯、哌嗪、哌啶、吗啉、硫代吗啉、吡咯、咪唑等)、可被卤代的C1-4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基等)、可被卤代的C1-4烷氧基-C1-4烷氧基(例如甲氧基甲氧基、甲氧基乙氧基、乙氧基乙氧基、三氟甲氧基乙氧基、三氟乙氧基乙氧基等)、甲酰基、C2-4烷酰基(例如乙酰基、丙酰基等)、和C1-4烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基等)等,且取代的数目优选是1至3。
此外,上述“可被取代的氨基”的取代可相互结合以形成环氨基(例如,基团是从5-至6-元环的含氮原子环如四氢吡咯、哌嗪、哌啶、吗啉、硫代吗啉、吡咯、咪唑等上除去氢原子,以使取代可连接到氮原子等上所形成的)。环氨基基团是可被取代的,且取代的实例包括卤素(例如氟、氯、溴、碘等)、硝基、氰基、羟基、可被取代的硫氢基(例如硫氢基、C1-4烷基硫基等)、可被取代的氨基(例如氨基、单-C1-4烷基氨基、二-C1-4烷基氨基、5-至6-元的环氨基如四氢吡咯、哌嗪、哌啶、吗啉、硫代吗啉、吡咯、咪唑等)、可被酯化或酰胺化的羧基(例如羧基、C1-4烷氧基-羰基、氨基甲酰基、单-C1-4烷基-氨基甲酰基、二-C1-4烷基-氨基甲酰基等)、可被卤代的C1-4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基等)、可被卤代的C1-4烷氧基-C1-4烷氧基(例如甲氧基甲氧基、甲氧基乙氧基、乙氧基乙氧基、三氟甲氧基乙氧基、三氟乙氧基乙氧基等)、甲酰基、C2-4烷酰基(例如乙酰基、丙酰基等)、C1-4烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基)等,且取代的数目优选是1至3。
“胺”包括基团,其是未取代的或其中胺部分是N-取代的或N,N二取代的,且具有一个或两个可独立选自以下的取代基:
1. 可被取代的烷基(例如2至15个碳的烷基);
2. 可被取代的烯基(例如2至15个碳的烯基);
3. 可被取代的炔基(例如2至15个碳的炔基);
4. 可被取代的甲酰基或酰基(例如2至4个碳的烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等)、和1至4个碳的烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基等)等);
5. 可被取代的芳基(例如苯基、萘基等);等等;
并连接到取代基上,所述取代基独立选自如上“羧酸”所定义的取代基。
“酰胺”包括化合物,其中酰胺部分的羧基基团连接到独立选自如上“羧酸”所定义取代基的取代基上,连接酰胺部分的氨基基团为N-取代的或N,N二取代的,且分别具有一个或两个可独立选自以下的取代基:
1. 可被取代的烷基(例如2至15个碳的烷基);
2. 可被取代的烯基(例如2至15个碳的烯基);
3. 可被取代的炔基(例如2至15个碳的炔基);
4. 可被取代的甲酰基或酰基(例如2至4个碳的烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等)、和1至4个碳的烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基等)等);
5. 可被取代的芳基(例如苯基、萘基等);等等
“芳基”可由单环或稠合多环的芳烃基团举例说明,例如优选C6-14芳基基团如苯基、萘基、蒽基、菲基或苊基(acenaphthylenyl)等,优选苯基。所述芳基可被一个或多个取代基取代,所述取代基如低级烷氧基(例如C1-6烷氧基如甲氧基、乙氧基或丙氧基等)、卤素原子(例如氟、氯、溴、碘等)、低级烷基(例如C1-6烷基如甲基、乙基或丙基等)、低级链烯基(例如C2-6链烯基如乙烯基或烯丙基等)、低级炔基(例如C.2-6炔基如乙炔基或炔丙基等)、可被取代的氨基、可被取代的羟基、氰基、可被取代的脒基、羧基、低级烷氧基羰基(例如C1-6烷氧基羰基如甲氧基羰基或乙氧基羰基等)、可被取代的氨基甲酰基(例如可被C1-6烷基或酰基(例如甲酰基、 C2-6烷酰基(alkanoyl)、苯甲酰基、可被卤代的C1-6烷氧基羰基、可被卤代的C1-6烷基磺酰基、苯磺酰基等)取代的氨基甲酰基,所述烷基或酰基可被5-至6-元的芳族单环杂环基团(例如吡啶基等)、1-氮杂环丁基羰基、1-吡咯烷基羰基、哌啶子基羰基、吗啉代羰基、硫代吗啉代羰基(硫原子可被氧化)、1-哌嗪基羰基等取代)、等等。任何这些取代基可在1至3个可替代的位置被独立地取代。
“酮”包括其中酮部分的羰基基团连接到一个或两个取代基上的化合物,所述取代基独立选自如上述“羧酸”所定义的取代基。
“酯”包括羧酸酯或醇酯,其中酯基团包括一个或两个取代基,所述取代基独立选自“羧酸”或“芳基”所定义的取代基。
“烷基”除非另有定义,优选为1至15个碳单位长度的烷基。
“芳香族基团”可举例说明为如上定义的芳基,或5-至6-元的芳族单环杂环基团,如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、呋吖基(furazanyl)、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、四唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等;和8-至16-元的(优选10-至12-元的)芳族稠合的杂环基团。
“非免疫抑制”是指在细胞培养中测量化合物抑制人淋巴细胞增殖的能力且优选由以下实施例19中提出的方法测量时,该化合物与CsA相比显示基本上降低抑制免疫系统水平的能力。
“类似物”是指CsA的结构类似物,其在一个或多个官能团不同于CsA。优选地,这样的类似物至少保留CsA结合CyP能力的重要部份。
式I的优选种类为:其中R'是H,R1是2到15个碳长度的饱和或不饱和的烷基,且R2选自:
1. 包含羧基的羧酸;
2. N-取代的N,N-二取代的酰胺,其中取代基独立地选自H、1到7个碳长度的烷基,或者所述取代基形成杂环,其中杂环选自O、N或S;
3. 1到7个碳长度的酯;
4. 1到7个碳长度的单羟基化、或二羟基化的烷基;
5. N-取代的或未取代的酰基保护的1到7个碳长度的胺;
6. 腈;
7. 酮,其中酮的羧基连接到R1,且饱和或不饱和的烷基链的长度为1到7个碳;
8. 任选被一个或多个取代基取代的苯基,所述取代基独立选自二氧化氮、氟、胺、酯或羧基。
本发明的化合物可以以光学活性化合物的形式存在。本发明包括上式范围内光学活性化合物的所有对映体,各个体对映体以及消旋混合物。同样,本发明包括本文所定义化合物的前体药物。
根据另一方面,本发明化合物可用于治疗或预防或研究哺乳动物优选人的CyP介导的疾病。这种疾病通常是由CyP过表达介导的,如CyP先天性过表达介导的。
可通过本发明化合物治疗的CyP介导的疾病包括:
a. 病毒感染;
b. 炎症性疾病;
c. 癌症;
d. 肌肉退行性障碍(muscular degenerative disorder);
e. 神经退行性障碍(neurodegenerative disorder);和
f. 与细胞钙稳态丧失相关的损伤。
所述病毒感染可能是由选自人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、和戊型肝炎的病毒引起的。所述炎症性疾病选自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、过敏性疾病、炎性肠病、败血症、血管平滑肌细胞疾病、动脉瘤、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥、和脉管炎。所述癌症可选自小和非小细胞肺癌、膀胱癌、肝细胞癌、胰腺癌和乳腺癌。所述肌肉退行性障碍可选自心肌再灌注损伤、肌营养不良症和胶原VI肌病。所述神经退行性障碍可选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统萎缩、多发性硬化、大脑性麻痹、中风、糖尿病神经病变、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷病)、脊髓损伤、和脑损伤。所述与细胞钙稳态丧失相关的损伤可选自心肌梗死、中风、急性肝毒性、胆汁淤积、和移植器官的存储/再灌注损伤。
附图说明
图1A-1C显示了在位置1和根据本发明在位置1和3修改的CsA类似物的亲环素A抑制和免疫抑制。
详细的描述
根据一方面,本发明的化合物可单纯地或与药学载体一起给有需要的温血动物施用。药学载体可是固体或液体。化合物可以以含有常规无毒性药学上可接受的载体、佐剂、和赋形剂的单位剂量的制剂,经口服、局部应用、胃肠外、吸入喷雾或经直肠地施用。本文所用术语“胃肠外”包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或灌注技术。
含有本发明混合物的药物组合物可以是适合口服应用的形式,例如片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。旨在口服应用的组合物可按照本领域已知的制备药物组合物的方法制备,且这样的组合物可含有一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的药剂,以提供药学上优雅和可口的制剂。含有与无毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂,也可通过已知的方法制备。所用的赋形剂可例如是:(1)惰性稀释剂,如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;(2)制粒和崩解剂,如玉米淀粉、或海藻酸;(3)粘合剂,如淀粉、明胶或阿拉伯胶;和(4)润滑剂,如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的或它们可以用已知的技术包衣,以便延缓胃肠道内崩解和吸收,从而在较长的时期内提供持续的作用。例如,可以应用时间延迟材料如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。它们也可用美国专利号4,256,108;4,160,452;和4,265,874中所述的技术包衣,以形成控制释放的渗透性治疗片剂。
在一些情况下,用于口服的制剂可以是硬明胶胶囊形式,其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合。它们也可以是软明胶胶囊形式,其中活性成分与水或油性介质例如花生油、液体石蜡、或橄榄油混合。
水性悬浮液通常含有与适合制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性成分。这样的赋形剂可包括:(1)悬浮剂,如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶;或(2)分散剂或润湿剂,其可以是天然存在的磷脂如卵磷脂、烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、环氧乙烷与偏酯(衍生自脂肪酸和己糖醇)的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、或环氧乙烷与偏酯(衍生自脂肪酸和己糖醇酐)的缩合产物如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。
水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂,例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯;一种或多种着色剂;一种或多种矫味剂;和一种或多种甜味剂,如蔗糖、阿司帕坦或糖精。
油性悬浮液可通过将活性成分悬浮于植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)、含ω3脂肪酸的鱼油、或矿物油(如液体石蜡)中按配方制得。油性悬浮液可含有增稠剂,例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。也可加入甜味剂和矫味剂,以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
可分散的粉剂和颗粒剂适合用于制备水性悬浮液。它们提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂已由上述那些举例说明。也可存在其它的赋形剂,例如,上述的那些甜味剂、矫味剂和着色剂。
含本发明混合物的药物组合物还可以是水包油的乳剂形式。油相可以是植物油(如橄榄油或花生油)、或矿物油(如液体石蜡)、或它们的混合物。合适的乳化剂可以是(1)天然存在的树胶,如阿拉伯胶和黄蓍胶;(2)天然存在的磷脂如大豆和卵磷脂;(3)衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯30,如失水山梨糖醇单油酸酯;(4)所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物,如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳剂也可含甜味剂和矫味剂。
糖浆剂和酏剂可用甜味剂(如甘油、丙二醇、山梨醇、阿司帕坦或蔗糖)一起配制。这样的制剂还可含缓和剂(demulcent)、防腐剂、和矫味剂及着色剂。
药物组合物可以是灭菌可注射的水性或油性悬浮液的形式。该悬浮液可按照已知方法应用上面已提及的那些适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。灭菌可注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或混悬液,例如1,3-丁二醇中的溶液。其中可用的可接受溶媒和溶剂是水、林格氏溶液、和等渗氯化钠溶液。此外,灭菌的不挥发性油被常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的,可以应用任何温和的不挥发性油,包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外,脂肪酸如油酸可在注射制剂制备中应用。
本发明化合物也可以以栓剂形式给药,用于该药物的直肠给药。合适的组合物可通过将该化合物与在常温下为固体但在直肠温度下为液体的适当无刺激性赋形剂混合而制得,并因此会在直肠中融化以释放药物。这样的材料为可可豆脂和聚乙二醇。
对于局部应用,可使用适当的通常与环孢菌素一起应用的霜剂、软膏、凝胶、溶液、或悬浮液等。
在特别优选的实施方案中,应用含有表面活性剂、乙醇、亲脂和/或两性溶剂作为非活性成分的液体溶液。特别地,应用含此异构体类似物混合物和以下非药物成分的口服多重乳液配方:d-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)、中链甘油三酯(MCT)油、Tween 40、和乙醇。也可优选应用含该化合物和与口服溶液相同的非药物成分的软明胶胶囊(包含明胶、甘油、水和山梨糖醇)。
但是,应该明白,对于任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素,包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度、药物配伍以及正治疗的特定疾病或病症的性质和严重性。
方法学
以下提出的反应是能够合成CsA的氨基酸1位残基(AA1)和氨基酸3位残基(AA3)上修改的所需化合物的化学反应的一般实例。AA1的修改描述如下:
和AA3的修改描述如下:
AA1和AA3修改均应用具有必需化学性质的试剂,且本领域技术人员应理解可作出某些反应物的替换。
所制备化合物的鉴定和纯度通常通过包括质谱法、HPLC和NMR光谱的方法学得到确定。质谱(ESI-MS)在Hewlett Packard 1100 MSD系统上进行了测定。NMR光谱在VarianMercuryPlus 400 MHz光谱仪上在氘代溶剂(鏻盐为DMSO,所有其他化合物为苯)中进行了测定。分析和制备的反相HPLC在Agilent 1100系列系统上进行。
盐化合物的合成
鏻盐通过三苯基膦或任何其他合适的膦与烷基卤化物(R-X;X = Cl、Br、或I)反应制得。合适的烷基卤化物为任何链长度或分子量的任何伯或任何仲的脂肪族卤化物。这些烷基卤化物可为分支的或未分支的、饱和或不饱和的烷基卤化物。
如果反应在甲苯中进行(反应1),则产物直接从反应溶液中沉淀析出。然而,非活性的底物要求更多极性溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)(反应2),以缩短反应时间并达到满意的产率。
反应1:
其中X为卤化物(包括但不限于Cl、Br、和I),和R10为饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链,其任选包含选自酮、羟基、腈、羧酸、酯和1,3-二氧戊烷的取代基;芳香族基团,其任选包含选自卤化物、酯和硝基的取代基;或上述饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链和上述芳香族基团的组合。
实施例1. 404-15的合成
作为用作说明的实例,将三苯基膦(13 mmol)溶于50mL甲苯中,加入氯丙酮(10 mmol)以得到澄明溶液。将反应在回流下搅拌过夜。将无色固体滤出,用甲苯和己烷洗涤,真空干燥。
使用反应1,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
替代选择地,适当的鏻盐可通过如下所示的反应2来合成:
反应2:
其中X为卤化物(包括但不限于Cl、Br、和I),和R10为饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链,其任选包含选自酮、羟基、腈、羧酸、酯和1,3-二氧戊烷的取代基;芳香族基团,其任选包含选自卤化物、酯和硝基的取代基;或上述饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链和上述芳香族基团的组合。
实施例2. 404-51的合成
作为用作说明的实例,将三苯基膦(11 mmol)溶于10 mL DMF中,加入4-溴丁酸(10mmol)。将反应在110℃搅拌7小时,然后让其冷却过夜。加入50mL甲苯,通过过滤收集结晶的无色固体。将该产品用甲苯和己烷洗涤,真空干燥过夜。
如果在用甲苯处理后没有开始结晶,则将产品用20 mL MeOH/H2O (1 :1的混合物)萃取。水相用甲苯和己烷洗涤,并干燥。将残留物与50 mL乙酸乙酯(EtOAc)一起在回流温度下搅拌20-30分钟。如果获得结晶固体,则将产品通过过滤收集,用EtOAc和己烷洗涤,干燥。在获得产品为油或胶质的情况下,倾析EtOAc,将其余产品在真空干燥。
使用反应2,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
Wittig反应
维蒂希(Wittig)反应广泛适用于宽范围的底物和反应物。反应中引入至底物的侧链,可代表任何数目的分支和未分支的、饱和与未饱和的可变长度的脂肪族化合物(R'),且可包含宽范围的官能团。
在维蒂希反应中,碱如叔丁醇钾(KOtBu)用于由鏻盐产生内鎓盐。内鎓盐与底物的羰基(CsA-醛)反应,以生成烯烃。含有羧酸侧链的鏻盐需要至少两当量的碱以产生内鎓盐。
反应3:乙酰化环孢菌素类似物中间体通过Wittig反应使用鏻盐化合物的合成
其中X为卤化物(包括但不限于Cl、Br、和I),和R12为饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链,其任选包含选自酮、羟基、腈、羧酸、酯和1,3-二氧戊烷的取代基;芳香族基团,其任选包含选自卤化物、酯和硝基的取代基;或上述饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链和上述芳香族基团的组合。
实施例3. 化合物404-20通过Wittig反应使用鏻盐化合物的合成:
作为用作说明的实例,在氩气气氛下将烘干的250 mL烧瓶装入丁基三苯基溴化鏻(6.0mmol)和40 mL无水四氢呋喃(THF)。将混悬液冷却到0℃,加入叔丁醇钾(6.0 mmol),以获得橙色。将反应在环境温度搅拌1-2小时,随后加入CsA-醛(2.0 mmol,溶于20 mL无水THF)。继续在室温搅拌3小时。反应用10 mL饱和NH4Cl和20 mL冰水淬火。分离各层,水相用EtOAc萃取。将有机层合并,用盐水洗涤,经Na2SO4干燥。除去溶剂,并将粗产品经硅胶(己烷/丙酮3:1)纯化。
使用反应3,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
脱乙酰化
反应4:乙酰化环孢菌素类似物的脱乙酰化
其中R12为饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链,其任选包含选自酮、羟基、腈、羧酸、酯、酰胺、酰基保护的胺和1,3-二氧戊烷的取代基;芳香族基团,其任选包含选自卤化物、酯、胺和硝基的取代基;或上述饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链和上述芳香族基团的组合。
实施例4:化合物404-90经脱乙酰化的合成
作为用作说明的实例,将404-20(0.16 mmol)于10 mL MeOH中的溶液与四甲基氢氧化铵五水合物(0.47 mmol)于2 mL H2O中的溶液合并。将混合物在室温搅拌2天。在真空浓缩反应,加入5 mL H2O水。用EtOAc萃取反应,萃取物用盐水洗涤,经Na2SO4干燥,浓缩至干。粗产品经反相制备的HPLC纯化。
脱乙酰化合物的纯化一般通过硅胶(己烷/丙酮2:1)或通过制备的HPLC进行。在化合物404-60、404-137、416-08、420-98和420-100(羧酸)的情况下,在萃取前将反应用1 MHCl酸化至pH值为2-3。
使用反应4,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
双键的氢化
双键可在大气压下氢化,以获得饱和的侧链。官能团如羟基、羰基和羧基在这些条件下是稳定的,并不要求保护。R'代表乙酰基或氢。在α,β-不饱和羰基化合物的情形下,在脱乙酰作用前必须将双键还原,以避免自由羟基对活性双键亲核加成的环化。
反应5:
其中R12为饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族链,其任选包含选自酮、羟基、腈、羧酸、酯、酰胺、酰基保护的胺和1,3-二氧戊烷的取代基;芳香族基团,其任选包含选自卤化物、酯、胺和硝基的取代基;或上述饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链和上述芳香族基团的组合,且R'为H或乙酰基。
实施例5:404-56的合成
作为用作说明的实例,将404-43(0.34 mmol)溶于40 mL无水EtOH,加入43 mg Pd/C(10 %)和0.2 mL乙酸。在氢气大气压力下将混合物搅拌2天。反应通过硅藻土过滤,真空浓缩。粗产品经制备的HPLC纯化。
使用反应5,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
腈基的还原
腈基还原为相应的伯胺可由硼氢化钠(NaBH4)和氯化镍(II)(NiCl2)在原位生成的硼化镍来完成。加入合适的捕集试剂,形成酰基保护的伯胺(分别为氨基甲酸酯或酰胺),并防止形成作为不希望副反应的仲胺。双键在指定的条件下部分还原,并获得产品混合物。饱和与不饱和的受保护的胺类化合物均被分离和纯化。对于反应420-123,没有分开混合物。相反地,将混合物经催化氢化,以产生完全饱和的化合物。
反应6:
其中酰基是BOC、乙酰基、或丁酰基中的任何一种,酰化剂是二碳酸二叔丁酯、醋酸酐和丁酸酐的任何一种,和R1为饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族基团。本领域技术人员应当理解,上述的酰化剂可被广泛范围的酰化剂替代,以产生同样广泛范围的酰基保护的胺。
实施例6:420-08的合成
作为用作说明的实例,将404-187(0.257 mmol)溶于15 mL甲醇,并冷却至0℃。加入二碳酸二叔丁酯(0.514 mmol)和氯化镍(II)(0.025 mmol),以得到澄明溶液。经1小时分部份加入硼氢化钠(3.85 mmol)。将由此产生的混合物在环境温度下搅拌过夜。在0℃加入另外的硼氢化钠(1.95 mmol),并在室温继续搅拌3小时。HPLC显示为420-08-1(氨基甲酸酯类化合物)和420-08-2(双键被还原的氨基甲酸酯类化合物)的混合物。将该反应与二乙烯三胺(0.257 mmol)一起搅拌30分钟,然后在真空浓缩。残留物用75 mL EtOAc吸收,用20 mL饱和NaHCO3溶液洗涤,并经Na2SO4干燥。在真空中除去溶剂。粗产品经制备的HPLC纯化。
使用反应6,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
胺的脱保护
BOC保护的胺(氨基甲酸酯类)可使用三氟乙酸(TFA)经酸性水解转化为游离的胺。
反应7:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,且R'为H或乙酰基。
实施例7:420-23的合成
作为用作说明的实例,将420-17(0.026 mmol)溶于4 mL无水DCM,并在0℃加入2 mL三氟乙酸。将反应在室温搅拌3小时。加入二十20 mL二氯甲烷。反应混合物用H2O和饱和NaHCO3溶液洗涤,经Na2SO4干燥。除去溶剂,粗产品经制备的HPLC纯化。
使用反应7,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
氨基基团的保护
游离氨基官能团可使用广泛范围的保护基团应用已建立的方法进行保护。与从腈开始的还原引入相比,更广泛范围的保护剂是可用的。总之,反应7和8提供了反应6的替代路线,用于制备酰基保护的氨基化合物。
反应8:
其中酰基是BOC、乙酰基、或丁酰基中的任何一种,酰化剂是二碳酸二叔丁酯、醋酸酐和丁酸酐的任何一种,本领域技术人员应当理解,包括二碳酸酯、酐和酰卤的广泛范围的酰化剂可用于产生广泛范围的酰基保护的胺,和R1为饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族基团。
实施例8:420-27的合成
作为用作说明的实例,将420-25(0.039 mmol)在氮气下溶于3 mL无水吡啶。将反应冷却到0℃,加入醋酸酐(0.59 mmol)。混合物在环境温度下搅拌过夜。在真空除去溶剂,残留物用25 mL EtOAc吸收。反应用2 x 10 mL 1 M HCl、2 x 10 mL饱和NaHCO3溶液和10 mL盐水洗涤,并经Na2SO4干燥。在真空中除去溶剂,得到无色固体的产品。
醛的脱保护
1,3-二氧戊烷部分通过酸性水解转化为醛官能团。
反应9和实施例9:404-47的合成
作为用作说明的实例,将404-33(0.246 mmol)于20 mL甲酸中的溶液在室温搅拌45分钟。向反应中缓慢加入100mL冰水和200 mL饱和NaHCO3溶液(强发泡)。反应用2 x 150 mLEtOAc萃取。将合并后的提取物用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤,并经Na2SO4干燥。在真空中除去溶剂并干燥。
硝基基团的还原
芳族硝基化合物通过催化氢化还原为苯胺。该反应导致双键的还原。
反应10和实施例10:404-120的合成
作为用作说明的实例,将404-89(0.13 mmol)溶于2 mL乙醇中,加入兰尼(Raney)镍(0.18 g,于50% H2O中,用乙醇洗涤3次,然后混悬于2 mL乙醇中)和0.1 mL乙酸。在室温搅拌反应2天。反应通过硅藻土过滤,滤饼用甲醇洗涤。将滤液干燥。残留物用EtOAc吸收,用NaHCO3溶液和盐水洗涤,经Na2SO4干燥。真空中除去溶剂。粗产品经硅胶(己烷/丙酮2:1)纯化。
酰胺的合成
酰胺通过胺与相应的酰基氯的反应由羧酸制得(反应11)。该合成也可以通过应用适当的偶合试剂如DCC和HOBt由酸直接进行(反应12)。
反应11:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,R15和R16独立为氢或饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,或其中NR15R16一起形成吗啉基部分。
实施例11:404-85的合成
作为用作说明的实例,将365-73(0.04 mmol)和亚硫酰氯(68 mmol)在氮气气氛下合并,并加热回流2小时。让反应冷却,并浓缩至干。加入20mL甲苯,将反应反复浓缩至干(2次)。残留物用5 mL无水甲苯吸收,加入二乙胺(0.48 mmol)。反应在室温搅拌过夜。加入5mLH2O,用20 mL EtOAc萃取混合物。将提取物用盐水洗涤,经Na2SO4干燥。真空中除去溶剂,粗产品经硅胶(己烷/丙酮3:1)纯化。
使用反应11,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
反应12:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,R15和R16独立为氢或饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,或其中NR15R16一起形成吗啉基部分。
实施例12:420-104的合成
作为用作说明的实例,将420-98(0.078 mmol)在氮气气氛下溶于10 mL无水DCM。在0℃加入二环己基碳二亚胺(DCC, 0.117 mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(HOBt, 0.078mmol),将混合物搅拌15分钟。加入二甲胺(0.78 mmol),得到澄明无色的溶液。15分钟后除去冷却浴,在环境温度下继续搅拌5天。将反应转移到分液漏斗中,加入20 mL DCM和10 mL0.5 M HCl。将有机层移出,经Na2SO4干燥,浓缩至干。残留物用10 mL乙腈吸收。将不溶的固体滤出,在真空中浓缩滤液。粗产品经制备的HPLC纯化。
使用反应12,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
酯化
应用酸性催化(反应13)或偶合试剂(DCC和DMAP,反应14)由相应的羧酸和醇制备羧酸酯。
反应13:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,和R17为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,任选包含卤素或羟基的取代基。
实施例13:404-171的合成
作为用作说明的实例,将404-60(0.059 mmol)、4 mL EtOH和2 μL浓H2SO4的混合物加热回流4小时。蒸发溶剂,残留物用乙腈吸收。粗产品经制备的HPLC纯化。
使用反应13,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
反应14:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,和R17为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,任选包含卤素或羟基的取代基。
实施例14: 420-24
作为用作说明的实例,在氮气气氛下将404-60(0.053 mmol)溶于4 mL无水DCM中,并冷却至0℃。加入二甲氨基吡啶(DMAP, 0.005 mmol)、2-氟丙醇(0.27 mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC, 0.058 mmol),并在0℃将反应搅拌15分钟。除去冷却浴,在环境温度下继续搅拌过夜。加入20 mL DCM,然后将反应用H2O洗涤,蒸发至干。残留物用10 mL乙腈吸收,过滤。在真空浓缩滤液。粗产品经制备的HPLC纯化。
除了在Wittig反应中直接合成之外,醇可通过许多反应得到。羰基用硼氢化钠还原,分别形成伯醇(由醛开始)或仲醇(从酮开始)。
通过硼氢化反应的方法,双键的氧化可形成同分异构体的混合物。反应主要以反马氏(anti-Markovnikov)方向进行。在端烯烃的情况下,伯醇为主要产品。
烯烃通过过氧化氢的氧化可转换成二元醇。羰基化合物与格氏试剂反应,形成仲醇(由醛开始)和叔醇(由酮开始)。这种方法允许碳链延长。
反应15:
其中R'为H或乙酰基,R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,和R20为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链。
实施例15:404-98的合成
作为用作说明的实例,在氮气气氛下将404-61(0.0365 mmol)溶于4.5 mL无水EtOH。在0℃加入硼氢化钠(0.15 mmol, 悬浮于0.5 mL无水EtOH中),将由此产生的混合物在环境温度下搅拌过夜。加入另外的硼氢化钠(0.08 mmol),并继续搅拌过夜。该反应在冰浴冷却下用5 mL 1M HCl淬火,用EtOAc萃取。该提取物用盐水洗涤,经Na2SO4干燥,并浓缩至干。该粗产品经制备的HPLC纯化。
使用反应15,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物。
反应16:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链。
实施例16: 420-28-1的合成
作为用作说明的实例,在氮气气氛下将404-16(0.081 mmol)溶于4 mL无水THF。将反应冷却到0℃,加入BH3·THF(1M的THF溶液,0.06 mmol)。该反应在室温搅拌过夜。HPLC表明反应不完整。加入另外的BH3·THF(0.5 mmol),继续在室温搅拌4小时。将反应冷却到0℃,加入1.0 mL 1M NaOH和0.30 mL 30 %过氧化氢溶液。该混合物在室温搅拌过夜。用25 mLEtOAc提取该反应。该提取物用盐水洗涤,经Na2SO4干燥,并浓缩至干。该产品经制备的HPLC纯化。
反应17:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,R'为H或乙酰基基团。
实施例17:420-49的合成
作为用作说明的实例,在氩气气氛下将420-49(0.037 mmol)溶于5 mL无水THF。将反应冷却到-70℃,加入烯丙基氯化镁(1 M的THF溶液,0.22 mmol)。反应在-70℃搅拌15分钟,然后让其恢复到室温。90分钟后,该反应用饱和NH4Cl溶液淬火。用25 mL EtOAc提取该反应。提取物用盐水洗涤,经Na2SO4干燥,并浓缩至干。产品经制备的HPLC纯化。得到乙酰化和脱乙酰化的化合物的混合物。
反应18:
其中R1为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链,和R23为饱和或不饱和的、直链或支链的脂肪族链。
实施例18: 404-126的合成
作为用作说明的实例,将404-16(0.054 mmol)溶于1 mL甲酸,加入过氧化氢(30 %水溶液,0.52 mmol)。该反应在室温搅拌过夜,然后浓缩至干。将残留物溶于25mL EtOAc,用饱和NaHCO3溶液洗涤,经Na2SO4干燥。在真空中除去溶剂。反应用9 mL THF和3 mL 1M NaOH吸收,在室温搅拌4小时。除去溶剂,让残留物在25 mL EtOAc 和5 mL H2O之间分配。有机层用盐水洗涤,经Na2SO4干燥。蒸发溶剂,粗产品经制备的HPLC纯化。
实施例19: 氨基酸3位的修改
CsA经历如下概述的AA3上的取代。与过量的LDA(二异丙基氨基锂)反应,导致分别在氨基酸1位侧链上包含四个氮杂烯醇锂(lithium azaenolate)单​​位以及醇锂(lithiumalkoxide)单​​位和在AA3上(lithium enolate)烯醇锂单​​位的六锂化衍生物(hexalithio derivative)。与合适亲电试剂的后续反应生成AA3(肌氨酸)残基上的取代产物。合适的亲电试剂是例如烷基卤、醛、二氧化碳和烷基二硫化物(表1)。取决于反应条件,可以得到相对比例的D和L两种差向​​异构体。途径A(见下文)主要导致D产品,而途径B(添加过量的LiCl)得到两种差向​​异构体的混合物。
实施例19: 环孢菌素A的AA3上的取代反应。得到D和L立体异构体。
途径A:[D-MeSar]3-CsA
在氩气气氛下,将烘干烧瓶中加入160 mL无水THF和二异丙胺(2.07 mL, 14.8 mmol)。将溶液冷却至-78℃,加入正丁基锂(2.5 M己烷溶液,5.4 mL,13.5 mmol)。搅拌30分钟后,加入CsA (2.40 g, 2.0 mmol,溶于40 mL无水THF)。反应在-78℃搅拌1小时。加入另外的正丁基锂(3.2 mL, 8.0 mmol),接着加入甲基碘(1.25 mL, 20.0 mmol)。在-78℃继续搅拌1.5小时,然后让反应经另外的1.5小时升至室温。加入20 mL H20,在真空中除去THF。加入另外的50 mL H20,用150 mL EtOAc萃取。将萃取液用盐水洗涤,经Na2SO4干燥。在真空中除去溶剂,粗产物经硅胶(己烷/丙酮3:1)纯化。产量:0.74 g (0.61 mmol, 30 %)。
途径B:[MeSar]3-CsA
在氩气气氛下,将100 mL干烧瓶中加入7.5 mL无水THF和二异丙胺(0.46 mL, 3.3mmol)。将溶液冷却至0℃,加入正丁基锂(1.32 mL, 2.5 M的己烷溶液,3.3 mmol)。反应在0℃搅拌20分钟,然后冷却至-78℃。在氩气氛下制备CsA (601 mg, 0.5 mmol)和氯化锂(636mg, 15 mmol)在12 mL无水THF中的溶液并冷却至-78℃。然后通过套管将LDA溶液转移到该混合物中。反应在-78℃搅拌2小时。加入另外的正丁基锂(1.20 mL, 3.0 mmol),接着加入甲基碘(0.62 mL, 10 mmol)。将混合物升至-20℃,并在此温度下搅拌3小时。让反应升至室温,用饱和NH4Cl溶液淬火,用EtOAc(2 x 20 mL)萃取,用盐水洗涤,经Na2SO4干燥。在真空中除去溶剂,粗产物经硅胶(己烷/丙酮3:1)纯化。产量:[L-MeAla3]-CsA: 302 mg (0.25mmol, 50 %)。[D-MeAla3]-CsA: 76 mg (0.06 mmol, 12 %)。
表1:环孢菌素3-位上烷基化可用的亲电试剂的实施例。
以下列出的实施例20和21是化学反应的一般实例,所述化学反应能使用具备必要化学性质的试剂合成CsA的氨基酸1和3位修改的所需化合物,且本领域技术人员应理解,可以进行某些反应物的置换。
实施例20:烷基化CsA的AA1修改
实施例20提供了在AA1侧链修改前在CsA的3-位引入取代基的合成路线。在3-位烷基化后,2步骤的程序形成乙酰化的醛(在以下实施例中的化合物3),其为经由维蒂希反应1-位修改的合适底物。该方法允许引入残基至AA1侧链,AA1侧链在步骤1~3所用的如强碱和氧化剂的反应条件下具有有限的稳定性。
使用该顺序制备的化合物的更多实例总结于表2中。
步骤1:AA3侧链的烷基化
如上所述,分别根据途径A或B进行合成。
步骤2:AA1侧链上的羟基乙酰化
在氮气下将烘干的烧瓶中加入[D-MeSar]3-CsA (1.84 g, 1.51 mmol)、N,N-二甲基氨基吡啶(19 mg, 0.15 mmol)和20 mL无水吡啶,然后加入乙酸酐(10 mL, 0.1 mol)。反应在环境温度下搅拌过夜。将混合物倾入100 mL冰水中,搅拌直到所有的冰融化。固体通过过滤收集,在空气中干燥。将该固体溶于50 mL EtOAc,用1M HCl(2x)、饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥,蒸发。粗产物经硅胶(己烷/EtOAc/MeOH 10:10:0.5)纯化。
步骤3:醛的形成
向含有化合物2(800 mg, 0.636 mmol)的烧瓶中加入10 mL二噁烷和10 mL H20。加入Nal04 (544 mg, 2.54 mmol)和Os04 (7.9 mM溶液,在1:1水/二噁烷中, 4.05 mL, 32mmol),在室温搅拌反应过夜。加入75 mL H20,用3 x 25 mL EtOAc萃取反应。萃取液用水、饱和NaHCO3溶液、水和盐水(各25 mL)洗涤,经MgSO4干燥。在真空中除去溶剂,粗产物经硅胶(己烷/EtOAc 3: 1 )纯化。
步骤4:维蒂希反应
在氩气氛下将烘干的烧瓶中加入三苯基-6-己酸溴化鏻(90 mg, 0.195 mmol)和5 mL无水THF。在0℃加入叔丁醇钾(1M的THF溶液, 0.39 mL, 0.39 mmol),将溶液搅拌30分钟,得到明亮的橙色。向反应中逐滴加入化合物3(81 mg, 0.065 mmol, 溶于1 mL无水THF),继续在室温下搅拌过夜。用饱和NH4Cl溶液淬灭反应,用EtOAc萃取。将萃取液用盐水洗涤,经Na2S04干燥。在真空除去溶剂,粗产物经硅胶(甲苯/丙酮3:1)纯化。
步骤5:脱乙酰化
将化合物4(30 mg, 0.022 mmol)溶于2 mL甲醇和0.5 mL水,加入氢氧化四甲铵五水合物(12 mg, 0.066 mmol)。在室温搅拌反应数天,直至HPLC证实脱保护完成。反应用1M HCl酸化至pH为2,在真空中浓缩。将剩余物溶于EtOAc中,用水洗涤,经Na2S04干燥。蒸去溶剂,粗产物用制备的HPLC纯化。
1,3-修改的环孢素衍生物的示意图。
使用实施例20的方法,下列化合物是可合成的更多实施例的化合物(X和Y参考上述图示;X中提及的R表示与CsA的AA1的连接结构)。
AA1改性化合物的烷基化
反应21在先前AA1侧链改性化合物的AA3残基上引入取代基。除了反应19可用的基团外,该途径允许在AA3引入取代基,所述取代基在反应20中所用的反应条件下是不稳定的,例如硫代甲基(thiomethyl)残基在该方法步骤3中的醛形成过程中,可能经历氧化。
实施例21
在氩气气氛下,将25 mL干烧瓶中加入1.5 mL无水THF和二异丙胺(87 μL, 0.62mmol)。将溶液冷却至0℃,加入正丁基锂(2.5 M,在己烷中, 0.25 mL, 0.62 mmol)。混合物在0℃搅拌20分钟,然后冷却至-70℃。在-70℃将澄明的LDA溶液转移到404-76(118 mg,0.095 mmol)和氯化锂(120 mg, 2.84 mmol)于1.5 mL无水THF的溶液中。在-70℃继续搅拌2小时。加入另外的正丁基锂(0.23 mL, 0.58 mmol),接着加入甲基碘(118 μL, 1.89mmol)。让反应升温至-20℃,并在此温度下保持过夜。用饱和NH4Cl溶液淬灭反应,用EtOAc萃取。萃取液用盐水洗涤,经Na2S04干燥,并蒸发至干。粗产物经硅胶(己烷/丙酮3: 1→ 2:1 )纯化。
表3:由方法21制备的化合物的实施例(X根据[0152]段中的1,3-修改的环孢素衍生物的示意图;X中提及的R表示与CsA的AA1的连接结构)。
1异构体未分离;2 m+信号。
可以进行AA1(或AA3,分别)残基官能团的另外修改,以得到多种衍生化合物,如酯、酰胺、醇等。通过将维蒂希反应中建立的双键还原,可以获得饱和化合物。
实施例22:羧酸的酰胺形成-440-08的合成
在氮气气氛下,将440-02 (48 mg, 0.037 mmol)溶于5 mL无水DCM,并冷却至0℃。加入二环己基碳二亚胺(DCC, 1 1.6 mg, 0.056 mmol)和1-羟基苯并三唑(HOBt, 5.0 mg,0.037 mmol),将混合物在0℃搅拌15分钟。加入二甲胺(2 M的THF溶液, 0.19 mL, 0.38mmol),并在室温继续搅拌3天。反应用20 mL DCM稀释,用15mL 0.5 M HCl洗涤。将有机相经Na2S04干燥,然后干燥至干。粗混合物经制备的HPLC纯化。
实施例23:酯形成-440-31的合成
将440-20 (30 mg, 0.022 mmol)溶于4 mL无水EtOH和2 μL浓H2S04。将反应加热回流3小时,然后让其冷却至室温。干燥反应至干。粗产物经制备的HPLC纯化。
实施例24:腈化合物的酰胺形成(反酰胺)-440-15的合成
在氮气下,将50 mL的烧瓶中加入440-09 (80 mg, 0.061 mmol)和5 mL MeOH。反应冷却至0℃,加入Ni(II)Cl2-6H20 (1.4 mg, 0.006 mmol)和乙酸酐(19 μL, 0.20 mmol)。分2批2小时间隔加入硼氢化钠(104 mg, 2.75 mmol)。然后让反应升至室温并搅拌过夜。反应完成后,加入7 mL 1 M HCl。在真空中浓缩溶液至其原体积的大约一半。将所得混合物用EtOAc萃取,萃取液用饱和NaHCO3溶液和盐水洗涤,经Na2S04干燥。在真空中除去溶剂。该产物,其包含一些饱和化合物,未进一步纯化用于以下步骤中。
实施例25:440-25的合成
将440-15 (83 mg, 0.061 mmol)溶于10 mL无水EtOH。加入钯(10 wt %,碳上, 8 mg)和3-4滴乙酸。反应在室温和大气压下进行氢化数天,直到通过HPLC证实反应完全。通过硅藻土过滤反应,将滤液蒸发至干。粗产物通过制备的HPLC纯化,然后进行脱乙酰化步骤。
实施例26:440-32的合成
将440-25 (41 mg, 0.03 mmol)溶于4mL MeOH,加入氢氧化四甲铵五水合物(16 mg,0.09 mmol, 溶于1 mL H20)。反应在室温搅拌2天。在真空中浓缩反应。加入5 mL H20,用EtOAc萃取产物。将萃取物用盐水洗涤,经Na2S04干燥,并蒸发至干。粗产物用制备的HPLC纯化。
表4:通过将维蒂希反应中建立的双键还原所获得的1,3-改性的环孢菌素化合物的衍生物实施例(X根据[0152]段中的1,3-修改的环孢素衍生物的示意图;和X中提及的R表示与CsA的AA1的连接结构)。
亲环素A异构酶的抑制测定
通过本发明的1,3 CsA类似物,根据科学文献所述方案并稍加修改,酶测定用来测量CyP-A活性的抑制。该测定基于CyP-A催化含脯氨酸的肽从顺式至反式异构体构象的构象改变的能力。简单地说,将将包括硝基苯胺部分的肽底物供给反应混合物,所述反应混合物含有CYP-A、测试化合物(CsA类似物、CsA、或二甲亚砜溶媒)、以及第二酶α-糜蛋白酶。每个测试化合物在10个浓度以一式三份或一式四份进行测试。通过非催化和CYP催化方法,该肽从顺式构象转化成反式构象。肽的反式异构体,不是其顺式异构体,为α-糜蛋白酶的底物。α-糜蛋白酶立即从其余的肽裂解硝基苯胺,游离的硝基苯胺以顺-反异构化的比率成比例积累。由于游离的硝基苯胺是有色的产品,其积累通过分光光度计测量其吸收度得到定量。对硝基苯胺的积累测量了6分钟,使用Graphpad Prism软件计算了各反应的一级速率常数。CyP-A催化的各反应的速率常数通过从总反应速率常数中减去非催化速率常数(来自没有CyP-A的反应)得到确定。催化速率常数作为抑制剂浓度函数的曲线证明了由其IC50值定义的化合物效力。
详细的方案
A.肽
测定用肽是N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺。将其以3 mM的浓度溶于三氟乙醇胺和氯化锂(TFE/LiCl)的溶液中。通过以17 mg/ml的浓度将氯化锂溶于三氟乙醇胺,每天制得新鲜的TFE/LiCl。LiCl溶解后,通过加入热干燥的分子筛并轻轻混合溶液至少30分钟,减少了TFE/LiCl溶液中的水含量。然后将肽溶于TFE/LiCl,测定前冷却溶液至4℃~8℃。在各测定反应开始时,无水TFE/LiCl的肽溶出促进了更多肽存在顺式构象。数据分析表明,在我们的测定中约60%的肽开始为顺式异构体,这与科学文献报告的数据是一致的。在酶反应中,肽被稀释20倍至最终测定浓度为150μΜ。
B.测试化合物
测试化合物为CsA、CsA类似物、或二甲基亚砜(DMSO)。通过在无菌微量离心管中,在DMSO中溶解至浓度为10 mg/ml,制得CsA和CsA类似物的储备液。储备液在不使用时保存在-20℃下。在测定的每天,制得进一步稀释的测试化合物。在每一实验中,分别作为溶媒对照和参照化合物,测试了DMSO和CsA。在微量离心管中,基于化合物的分子量将CsA和CsA类似物的10 mg/ml储备液用DMSO稀释至50μΜ。然后在96-孔聚苯乙烯板中,制得DMSO中各化合物的九种3倍的系列稀释。将等分部分DMSO-溶液或单独的DMSO溶媒在反应缓冲液(见下文配方)中稀释50倍,以制得CsA或CSA类似物的终浓度为1000、333、111、37、12、4.1、1.4、0.46、0.15、和0.05 nM。测定前,反应缓冲液的溶液保存在4℃~8℃至少一小时。
C.反应缓冲液
反应缓冲液的起始溶液(盐缓冲液)包括Hepes 50 mM、氯化钠100 mM、和人血清白蛋白1 mg/ml,用氢氧化钠调整pH值至8.0。盐缓冲液在不使用时贮存于4℃。在测定各天,将牛α-糜蛋白酶溶于一定体积的盐缓冲液中,使其浓度为1 mg/ml。将等分部分的α-糜蛋白酶溶液移出,用作非催化对照的反应缓冲液。向其余部分的α-糜蛋白酶溶液中,加入人重组CYP-A至浓度为5 nM。含有α-糜蛋白酶和CYP-A的溶液被指定为反应缓冲液,并用于制备反应液。
D. 反应方案
所有测定反应在温度4℃~8℃的冷室内进行。在测定前,所有溶液和设备在冷室中存储至少1小时。为了以足够慢的速度进行可用设备的测量,低温度是反应必需的。测量装置是配有OD 405 nm吸收度读数的BMG Polarstar酶标仪。反应在96-孔平底聚苯乙烯测定板中进行。各测定运行由在板一排中12个独立的反应组成。在板一排中将肽用单通道移液器每孔5 μl等分,然后将板置于酶标仪板支持器下。通过使用12通道移液器将95 μl反应缓冲液分配到各个含肽孔,并通过反复移液以确保肽均匀溶解而彻底混合各反应,开始反应。各测定运行中的12个反应表示如下:
a) 代表一种测试化合物10种浓度各自重复的10个反应(反应缓冲液含CyP-A)
b) 5μl DMSO溶媒的1个反应(反应缓冲液含CyP-A)
c) 5μl DMSO溶媒的1个反应(反应缓冲液不含CyP-A)
吸收度记录在混合后立即开始。由于混合时间和设置仪器,从加入反应缓冲液至OD405首先记录经过约15秒。后续读数以6秒为间隔经360秒进行了总共60个读数。每个测试化合物进行了三或四个反应运行,以提供平行测定的数据。
E. 数据分析
原始数据包括在OD405的时间依赖性增加。在CYP-A存在与抑制剂缺失下,由OD405的平稳状态证明,肽在约150秒内被完全转换为反式异构体。使用Graphpad Prism软件,将OD405对时间数据进行标绘,并用单相指数方程拟合以推导出各反应的一级速率常数K。在没有CyP-A的反应中,速率常数完全代表肽的自发性非催化的、热的顺式-至-反式的异构化,将其定义为非催化速率常数K0。在含有CYP-A的反应中,异构化通过非催化和酶催化过程发生。因此,在含有CYP-A反应的速率常数K表示非催化速率常数K0和催化速率常数Kcat的总和。通过从总速率常数K减去K0(由不含CyP-A的反应获得)计算出Kcat。在5 nM CyP-A、150 μΜ肽底物和无抑制剂反应中,Kcat通常3倍高于K0
将Kcat对抑制剂浓度绘图用S形剂量响应非线性回归拟合,以证明抑制剂效力。软件计算的EC50值代表测试化合物抑制50%Kcat的浓度。为了将测定条件下实验间的变异性进行标准化,CsA在每一实验中作为参考化合物运行,CsA类似物效力基于EC50值表示为相对CsA的效力倍数。例如,CsA类似物EC50是CsA的1/2,表示与CsA相比2倍的效力,而CSA类似物IC50是5倍高于CsA,表示与CsA相比0.2倍的效力。
附图1A-1C中所示的表5中,显示了在位置1和根据本发明在位置1和3修改的CsA类似物的亲环素A抑制和免疫抑制。

Claims (21)

1.式L的化合物在制备用于治疗或预防哺乳动物中亲环素介导的疾病或损伤的药物中的用途,
其中
a. R'为H或乙酰基;
b. R1为2到15个碳原子长度的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族碳链;
c. R2选自:
i. 未取代的、N-取代的、或N,N-二取代的酰胺;
ii.N-取代的或未取代的酰基保护的胺;
iii. 羧酸;和
iv.腈;和
d. R23为甲基或乙基,
其中所述化合物是D-差向异构体,其中所述D-差向异构体的手性中心是与R23连接的碳。
2.权利要求1的用途,其中R1-R2选自:
i.
ii.
iii.
iv.
v.
vi.
vii.
viii.
ix.
x.
xi.
xii.
xiii.
xiv.
xv.
xvi.
xvii.
xviii.
xix.
xx.
xxi.
xxii.
xxiii.
xxiv.
xxv.
xxvi.
xxvii.
xxviii.
xxix.
xxx.
xxxi.
xxxii.
xxxiii.
xxxiv.
xxxv. ;和
xxxvi.
3.权利要求1的用途,其中R2选自:
a.
b.
c.
d. ;和
e.
其中R5为1到10个碳长度的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族碳链。
4.权利要求1的用途,其中R1-R2包含2到5个碳的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族碳链,其被选自腈、N-取代的或未取代的酰基保护的胺和羧酸的取代基取代。
5.权利要求1-4任一项的用途,其中
选自下列:
;和
6.权利要求1或权利要求5的用途,其中R23是乙基。
7.权利要求1或权利要求5的用途,其中R23是甲基。
8.权利要求7的用途,其中R1是不饱和的C4-C15直链脂肪族碳链和R2是COOH。
9.权利要求8的用途,其中R1是不饱和的C6-C15直链脂肪族碳链。
10.以下通式的化合物在制备用于治疗或预防哺乳动物中亲环素介导的疾病或损伤的药物中的用途,
其中:
R'是H或乙酰基;
R1-R2是;和
R23是乙基或甲基,且
其中所述化合物为D-差向异构体,其中所述D-差向异构体的手性中心是与R23连接的碳。
11.权利要求10的用途,其中R23是甲基。
12.以下通式的化合物在制备用于治疗或预防哺乳动物中亲环素介导的疾病或损伤的药物中的用途,
其中:
R'是H或乙酰基;
R1-R2是;和
R23是甲基,且
其中所述化合物为D-差向异构体,其中所述D-差向异构体的手性中心是与R23连接的碳。
13.权利要求1-12任何一项的用途,其中R'为H。
14.权利要求1-13任何一项的用途,其中所述疾病或损伤是由亲环素过表达介导的,或该疾病是亲环素先天性过表达的。
15.权利要求1-13任何一项的用途,其中所述亲环素介导的疾病或损伤选自:病毒感染;炎症性疾病;癌症;肌肉障碍;神经障碍;和与缺血、再灌注、细胞钙稳态丧失、离子稳态丧失、自由基生产增加或诱导线粒体功能障碍的毒素相关的损伤。
16.权利要求15的用途,其中所述病毒感染是由选自以下的病毒引起的:人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV、hCoV-NL63、hCoV-HKU-1、hCoV-OC43、hCOV-229E、冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒和传染性胃肠炎病毒。
17.权利要求15的用途,其中所述炎症性疾病选自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎症、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、过敏性疾病、炎性肠病、败血症、血管平滑肌细胞疾病、动脉瘤、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥和脉管炎。
18.权利要求15的用途,其中所述癌症选自小和非小细胞肺癌、膀胱癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤和前列腺癌。
19.权利要求15的用途,其中所述肌肉障碍选自心肌再灌注损伤、肌营养不良症、胶原VI肌病、心脏骤停后综合征(PCAS)、心力衰竭、动脉粥样硬化和腹主动脉瘤。
20.权利要求15的用途,其中所述神经障碍选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统萎缩、多发性硬化、大脑性麻痹、癫痫、中风、糖尿病神经病变、肌萎缩侧索硬化(卢伽雷氏病)、双相障碍、兴奋毒性损伤、肝性脑病、低血糖、锰中毒、神经元靶标剥夺、脂肪酸中毒、机械性神经损伤、脊髓损伤和脑损伤。
21.权利要求15的用途,其中所述与细胞钙稳态丧失相关的损伤选自心肌梗死、中风、急性肝毒性、胆汁淤积和移植器官的存储/再灌注损伤。
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