ES2705750T3 - Moléculas análogas de la ciclosporina modificadas en los aminoácidos 1 y 3 - Google Patents

Moléculas análogas de la ciclosporina modificadas en los aminoácidos 1 y 3 Download PDF

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Abstract

Un compuesto de Fórmula L:**Fórmula** en donde: a. R' es H o acetilo; b. R1 - R2 se selecciona del grupo que consiste en: i.**Fórmula** ii.**Fórmula** iii.**Fórmula** iv.**Fórmula** v.**Fórmula** vi.**Fórmula** vii.**Fórmula** viii.**Fórmula** ix.**Fórmula** y x.**Fórmula** y c. R23 es una cadena de carbono alifática opcionalmente sustituida, de cadena lineal o ramificada saturada o insaturada.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas análogas de la ciclosporina modificadas en los aminoácidos 1 y 3
Campo de la invención
La presente invención se refiere a novedosos análogos de moléculas que pertenecen a la familia de la ciclosporina, incluidos análogos de la ciclosporina A (CsA) y análogos que tienen una actividad inmunosupresora reducida o nula y se unen a ciclofilina (CyP).
Antecedentes de la invención
Las ciclosporinas son miembros de una clase de polipéptidos cíclicos que tienen una potente actividad inmunosupresora. Al menos algunos de estos compuestos, tal como la ciclosporina A (CsA), son producidos por la especie Tolypocladium inflatum como metabolitos secundarios. CsA es un potente agente inmunosupresor que se ha demostrado que suprime la inmunidad humoral y las reacciones inmunitarias mediadas por células, tal como el rechazo de aloinjerto, la hipersensibilidad retardada, la encefalomielitis alérgica experimental, la artritis adyuvante de Freund y la enfermedad de injerto contra huésped. Se utiliza para la profilaxis del rechazo de órganos en trasplantes de órganos; para el tratamiento de la artritis reumatoide; y para el tratamiento de la psoriasis.
Aunque se conoce un número de compuestos en la familia de la ciclosporina, la CsA es quizás la más ampliamente utilizada médicamente. Los efectos inmunosupresores de CsA están relacionados con la inhibición de los eventos de activación mediados por células T. La inmunosupresión se logra mediante la unión de la ciclosporina a una proteína intracelular ubicua llamada ciclofilina (CyP). Este complejo, a su vez, inhibe la actividad de la serina-treonina fosfatasa dependiente del calcio y la calmodulina de la enzima calcineurina. La inhibición de la calcineurina previene la activación de factores de transcripción, tales como NFATp/cy NF-kB, que son necesarios para la inducción de genes de citoquinas (IL-2, IFN-y, IL-4 y GM-CSF) durante la activación de céluas T.
Desde el descubrimiento original de la ciclosporina, se ha aislado e identificado una gran variedad de ciclosporinas de origen natural. Adicionalmente, muchas ciclosporinas que no son de origen natural se han preparado por medios sintéticos parciales o totales y mediante la aplicación de técnicas de cultivo celular modificadas. Por lo tanto, la clase que comprende ciclosporinas es sustancial e incluye, por ejemplo, las ciclosporinas A a la Z de origen natural; diversos derivados de ciclosporina de origen no natural; ciclosporinas artificiales o sintéticas, incluidas las dihidro- e isociclosporinas; ciclosporinas derivadas (por ejemplo, puede acilarse el átomo 3'-O del residuo MeBmt, o puede introducirse un sustituyente adicional en el residuo sarcosilo en la posición 3); ciclosporinas en las que el residuo de MeBmt está presente en forma isomérica (por ejemplo, en donde la configuración en las posiciones 6' y 7' del residuo de MeBmt es cis en lugar de trans); y ciclosporinas en donde se incorporan aminoácidos variantes en posiciones específicas dentro de la secuencia peptídica.
Los análogos de la ciclosporina que contienen aminoácidos modificados en la posición 1 se divulgan en los documentos WO 99/18120 y WO 03/033527. Estas solicitudes describen un derivado de la ciclosporina conocido como "ISAtx247" o "ISA247" o "ISA". Este análogo es estructuralmente idéntico a CsA, excepto por la modificación en el residuo del aminoácido-1. Los solicitantes han descubierto previamente que ciertas mezclas de isómeros cis y trans de ISA247, incluidas las mezclas que están predominantemente compuestas por trans ISA247, mostraron una combinación de potencia inmunosupresora mejorada y toxicidad reducida sobre las ciclosporinas de origen natural y actualmente conocidas.
La ciclosporina tiene tres dianas celulares bien establecidas; calcineurina, las isoformas de CyP (que incluyen pero no se limitan a CyP-A, CyP-B y CyP-D) y P-glicoproteína (PgP). La unión de la ciclosporina a la calcineurina da como resultado una importante inmunosupresión y es responsable de su asociación tradicional con el trasplante y las indicaciones autoinmunes.
La familia de la Ciclofilina
Las CyP (Comisión de Enzimas (EC) número 5.1.2.8) pertenecen a un grupo de proteínas que tienen actividad de peptidil-prolil cis-trans isomerasa; tales proteínas se conocen colectivamente como inmunofilinas y también incluyen las proteínas de unión a FK-506 y las parvulinas. Las CyP se encuentran en todas las células de todos los organismos estudiados, tanto en procariotas como en eucariotas y se conservan estructuralmente a lo largo de la evolución. Hay 7 principales CyPs en humanos, a saber, CyP-A, CyP-B, CyP-C, CyP-D, CyP-E, CyP-40 y CyP-NK (identificadas por primera vez a partir de células asesinas naturales humanas), y un total de 16 proteínas únicas (Galat A. Peptidylprolyl cis/trans isomerases (immunophilins): biological diversity -targets -functions. Curr Top Med Chem 2003, 3:1315-1347; Waldmeier PC et al. Cyclophilin D as a drug target. Curr Med Chem 2003, 10:1485-1506).
El primer miembro de las CyP que se identificó en los mamíferos fue CyP-A. La CyP-A es una proteína citosólica de 18 kDa y es la proteína más abundante para la unión a CsA. Se estima que CyP-A constituye el 0,6% de la proteína citosólica total (Mikol V et al. X-ray structure of monmeric cyclophilin A-cycloporin A crystal complex at 2.1 A resolution. J. Mol.Biol. 1993, 234:1119-1130; GalatA, Metcalfe SM. Peptidylproline cis/trans isomerases. Prog. Biophys. Mol. Biol.
1995, 63:67-118).
Localización celular de Ciclofilinas
Las CyP se pueden encontrar en la mayoría de los compartimentos celulares de la mayoría de los tejidos y codifican funciones únicas. En los mamíferos, CyP-A y CyP-40 son citosólicos, mientras que CyP-B y CyP-C tienen secuencias de señal amino-terminales que los dirigen a la vía secretora de la proteína del retículo endoplásmico (revisado en Galat, 2003; Dornan J et al. Structures of immunophilins and their ligand complexes. Curr Top Med Chem 2003, 3:1392-1409). CyP-D tiene una secuencia de señal que la dirige a las mitocondrias (Andreeva L et al. Cyclophilins and their possible role in the stress response. Int J Exp Pathol 1999, 80:305-315; Hamilton GS et al. Immunophilins: beyond immunosuppression. J Med Chem 1998, 41:5119-5143); CyP-E tiene un dominio de unión a ARN amino terminal y se localiza en el núcleo (Mi H et al. A nuclear RNA-binding cyclophilin in human T cells. FEBS Lett 1996, 398:201-205) y CyP-40 tiene TPRs y se encuentra en el citosol (Kieffer LJ et al. Cyclophilin-40, a protein with homology to the P59 component of the steroid receptor complex. Cloning of the cDNA and further characterization. J Biol Chem 1993, 268:12303-12310). La CyP-NK humana es la CyP más grande, con un terminal carboxilo grande, hidrófilo y con carga positiva, y se encuentra en el citosol (Anderson SK et al. A cyclophilin-related protein involved in the function of natural killer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:542-546; Rinfret A et al. The N-terminal cyclophilin-homologous domain of a 150-kilodalton tumor recognition molecule exhibits both peptidylprolyl cis-transisomerase and chaperone activities. Biochemistry 1994, 33:1668-1673).
Función y actividad de las Ciclofilinas.
Las CyP son proteínas multifuncionales que están involucradas en muchos procesos celulares. Debido a que las CyP estaban altamente conservadas a lo largo de la evolución, esto sugiere un papel esencial para las CyP. Inicialmente, se encontró que las CyP tienen la propiedad enzimática específica de catalizar la transisomerización cis de los enlaces peptidil-prolil (Galat, 1995; Fisher GA et al. A phase I study of paclitaxel (taxol) (T) in combination with SDZ valspodar, a potent modulator of multidrug resistance (MDR). Anticancer Drugs. 1994; 5(Suppl 1): 43). Por lo tanto, las CyP se denominan peptidil-prolil-cis-trans isomerasa (PPIasa), que pueden actuar como un factor de aceleración en el plegamiento adecuado de proteínas recién sintetizadas. Las PPIasas también están involucradas en la reparación de proteínas dañadas debido a las tensiones ambientales que incluyen estrés térmico, irradiación ultravioleta, cambios en el pH del entorno celular y tratamiento con oxidantes. Esta función se conoce como actividad de chaperona molecular. (Yao Q et al. Roles of Cyclophilins in Cancers and Other Organs Systems. World J. Surg. 2005, 29: 276­ 280).
Además, recientemente se ha demostrado que la actividad PPIasa de las CyP está involucrada en diversos procesos celulares, incluido el tráfico intracelular de proteínas (Andreeva, 1999; Caroni P et al. New member of the cyclophilin family associated with the secretory pathway. J Biol Chem 1991,266:10739-42), función mitocondrial (Halestrap AP et al. CsA binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Mol Cell Biochem 1997, 174:167-72; Connern CP, Halestrap AP. Recruitment of mitochondrial cyclophilin to the mitochondrial inner membrane under conditions of oxidative stress that enhance the opening of a calcium-sensitive non-specific channel. Biochem J 1994, 302:321-4), procesamiento de pre-ARNm (Bourquin JP et al. A serine/argininerich nuclear matrix cyclophilin interacts with the Cterminal domain of RNA polymerase II. Nucleic Acids Res 1997, 25:2055-61), y el mantenimiento de la estabilidad del complejo multiproteico (Andreeva, 1999).
La ciclosporina se une con la afinidad nanomolar a CyP-A a través de contactos dentro del bolsillo hidrófobo (Colgan J et al. Cyclophilin A-Deficient Mice Are Resistant to Immunosuppression by Cyclosporine. The Journal of Immunology 2005, 174: 6030-6038, Mikol, 1993) e inhibe la actividad PPIasa. Sin embargo, se cree que este efecto es irrelevante para la inmunosupresión. Más bien, el complejo entre CsA y CyP-A crea una superficie compuesta que se une a y evita que la calcineurina regule la transcripción del gen de la citoquina Friedman J et al. Two cytoplasmic candidates for immunophilin action are revealed by affinity for a new cyclophilin: one in the presence and one in the absence of CsA. Cell 1991, 66: 799-806; Liu J et al. Calcineurin is a common target of cyclophilin-CsA and FKBP-FK506 complexes. Cell 1991, 66: 807-815).
Homología de las Ciclofilinas.
La CyP-A, el miembro prototípico de la familia, es una proteína altamente conservada en células de mamíferos (Handschumacher RE et al. Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for CsA. Science 1984, 226: 544-7). El análisis de homología de secuencia de la CyP-A humana muestra que es altamente homóloga a la CyP-B, CyP-C y CyP-D humana (Harding MW, Handschumacher RE, Speicher DW. Isolation and amino acid sequence of cyclophilin. J Biol Chem 1986, 261:8547-55). El bolsillo de unión a la ciclosporina de todas las CyP está formado por una región altamente conservada de aproximadamente 109 aminoácidos. De las CyP conocidas, CyP-D tiene la mayor homología con CyP-A. De hecho, en esta región la identidad de secuencia es 100% entre CyP-A y CyP-D (Waldmeier 2003; Kristal BS et al. The Mitochondrial Permeability Transition as a Target for Neuroprotection. Journal of Bioenergetics and Biomembranes 2004, 36(4); 309-312). Por lo tanto, la afinidad de CyP-A es un muy buen predictor de la afinidad de CyP-D, y viceversa (Hansson MJ et al. The Nonimmunosuppressive Cyclosporine analogues NIM811 and UNIL025 Display Nanomolar Potencies on Permeability Transition in Brain-Derived Mitochondria. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2004, 36(4): 407-413). Esta relación se ha demostrado repetidamente de forma empírica con los análogos de la Ciclosporina (Hansson, 2004; Ptak Rg et al. Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication in Human Cells by Debio-025, a Novel Cyclophilin Binding Agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2008: 1302-1317; Millay DP et al. Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrial dependent necrosis attenuates muscular dystrophy. Nature Medicine 2008, 14(4): 442-447; Harris R et al. The Discovery of Novel Non-Immunosuppressive Cyclosporine Ethers and Thioethers With Potent HCV Activity. Poster # 1915, 59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD), 2008). La secuencia de homología a través de las CyP sugiere que todas las CyP son dianas potenciales para los análogos de la Ciclosporina. Debido a la multitud de procesos celulares en los que están involucrados las CyP, esto sugiere además que los análogos de CsA que retienen una unión significativa a CyP pueden ser útiles en el tratamiento de muchas indicaciones de enfermedades.
Enfermedades mediadas por Ciclofilina
Virus de inmunodeficiencia humana (VIH):
El VIH es un lentivirus de la familia de retrovirus y sirve como ejemplo de la participación de CyP en el proceso de infección y replicación de ciertos virus. CyP-A se estableció hace más de una década como un objetivo válido en la quimioterapia contra el VIH (Rosenwirth BA et al. Cyclophilin A as a novel target in anti-HIV-1 chemotherapy. Int. Antivir. News 1995, 3:62-63). CyP-A cumple una función esencial al principio del ciclo de replicación del VIH-1. Se encontró que se unía específicamente a la poliproteína Gag del VIH-1 (Luban JKL et al. Human immunodeficiency virus type 1 Gag protein binds to cyclophilins A and B. Cell 1993, 73: 1067-1078). Se identificó una secuencia de aminoácidos definida alrededor de G89 y P90 de la proteína de la cápside p24 (CA) como el sitio de unión para CyP-A (Bukovsky AAA et al. Transfer of the HIV-1 cyclophilin-binding site to simian immunodeficiency virus from Macaca mulatta can confer both cyclosporine sensitivity and cyclosporine dependence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 10943-10948; Gamble TRF et al. Crystal structure of human cyclophilin A bound to the amino-terminal domain of HIV-1 capsid. Cell 1996, 87: 1285-1294). La afinidad de CyP-A por CA promueve la incorporación de CyP-A en las partículas viriónicas durante el ensamblaje (Thali MA et al. Functional association of cyclophilin A with HIV-1 virions. Nature 1994, 372: 363-365). La evidencia experimental indica que la interacción CyP-A-CA es esencial para la replicación del VIH-1; la inhibición de esta interacción perjudica la replicación del VIH-1 en células humanas (Hatziioannou TD et al. Cyclophilin interactions with incoming human immunodeficiency virus type 1 capsids with opposing effects on infectivity in human cells. J. Virol. 2005, 79: 176-183; SteinkassererAR et al. Mode of action of SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive CsA analog with activity against human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1): interference with early and late events in HIV-1 replication. J. Virol 1995, 69: 814-824). Se demostró que la etapa en el ciclo de replicación viral en donde está involucrado CyP-A es un evento después de la penetración de la partícula del virus y antes de la integración del ADN viral de doble cadena en el genoma celular (Braaten DEK et al. Cyclophilin A is required for an early step in the life cycle of human immunodeficiency virus type 1 before the initiation of reverse transcription. J. Virol 199670: 3551-3560; Mlynar ED et al. The non-immunosuppressive CsA analogue SDZ NIM 811 inhibits cyclophilin A incorporation into virions and virus replication in human immunodeficiency virus type 1-infected primary and growth-arrested T cells. J. Gen. Virol 1996, 78: 825-835; Steinkasserer, 1995). La actividad anti-VIH-1 de CsA se informó por primera vez en 1988 (Wainberg MA et al. The effect of CsA on infection of susceptible cells by human immunodeficiency virus type 1. Blood 1998, 72: 1904-1910). La evaluación de CsA y muchos derivados para la inhibición de la replicación del VIH-1 reveló que los análogos de CsA no inmunosupresores tenían actividades anti-VIH-1 iguales o incluso superiores a las de los análogos inmunosupresores (Bartz SRE et al. Inhibition of human immunodeficiency virus replication by nonimmunosuppressive analogs of CsA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92: 5381-5385; Billich AF et al. Mode of action of SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive CsA analog with activity against human immunodeficiency virus (HIV) type 1: interference with HIV protein-cyclophilin A interactions. J. Virol 1995, 69: 2451-2461; Ptak, 2008).
Inflamación
La inflamación en la enfermedad implica la entrada de leucocitos (glóbulos blancos) en el área de la infección. Los leucocitos son atraídos hacia el área por las quimiocinas, una familia de agentes quimioatrayentes. Los estudios in vitro han demostrado que CyP-A extracelular es un potente quimioatrayente para los leucocitos humanos y las células T (Kamalpreet A et al. Extracellular cyclophilins contribute to the regulation of inflammatory responses Journal of Immunology 2005; 175: 517-522; Yurchenko VG et al. Active-site residues of cyclophilin A are crucial for its signaling activity via CD147. J. Biol. Chem. 2002; 277: 22959-22965; Xu QMC et al. Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin. J. Biol. Chem. 1992; 267: 11968-11971; Allain FC et al. Interaction with glycosaminoglycans is required for cyclophilin B to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytes to extracellular matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 2714-2719). Adicionalmente, CyP-A puede inducir una respuesta inflamatoria rápida, caracterizada por la afluencia de leucocitos, cuando se inyecta in vivo (Sherry BN et al. Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product of lipopolysaccharide-activated macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 3511-3515). CyP-A se distribuye de forma ubicua de manera intracelular, sin embargo, durante el curso de las respuestas inflamatorias, CyP-A se libera en los espacios del tejido extracelular tanto por las células vivas como por las que mueren (Sherry, 1992). De hecho, se han informado niveles elevados de CyP-A en varias enfermedades inflamatorias diferentes, incluida la sepsis, la artritis reumatoide y la enfermedad de las células del músculo liso vascular (Jin ZG et al. Cyclophilin A is a secreted growth factor induced by oxidative stress. Circ. Res. 2000; 87: 789-796; Teger, 1997; Billich, 1997). En el caso de la artritis reumatoide, se informó una correlación directa entre los niveles de CyP-A y el número de neutrófilos en el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Billich, 1997).
Cáncer
Se ha demostrado recientemente que la CyP-A está sobreexpresada en muchos tejidos y líneas celulares de cáncer, incluidos, pero no limitados a cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, vejiga, hepatocelular, pancreático y de mama (Li, 2006; Yang H et al. Cyclophilin A is upregulated in small cell lung cancer and activates ERK1/2 signal. Biochemical and Biophysical Research Communications 2007; 361: 763-767; Campa, 2003). En los casos en que se suministró CyP-A exógeno, se demostró que esto estimula el crecimiento de las células cancerosas (Li, 2006; Yang, 2007), mientras que CsA detuvo el crecimiento (Campa, 2003). Más recientemente, se ha demostrado que CyP (A y B) está intrincadamente involucrada en la ruta bioquímica que permite el crecimiento de células humanas de cáncer de mama y que los experimentos de eliminación de CyP disminuyeron el crecimiento, la proliferación y la motilidad de las células cancerosas (Fang F et al. The expression of Cyclophilin B is Associated with Malignant Progression and Regulation of Genes Implicated in the Pathogenesis of Breast Cancer. The American Journal of Pathology 2009; 174(1): 297-308; Zheng J et al. Prolyl Isomerase Cyclophilin A Regulation of Janus-Activated Kinase 2 and the Progression of Human Breast Cancer. Cancer Research 2008; 68 (19): 7769-7778). Lo más interesante es que el tratamiento con CsA de ratones xenoinjertados con células de cáncer de mama indujo necrosis tumoral e inhibió completamente la metástasis (Zheng, 2008). Los investigadores concluyen que "la acción de la Ciclofilina B puede contribuir significativamente a la patogénesis del cáncer de mama humano" y que la "inhibición de la ciclofilina puede ser una nueva estrategia terapéutica en el tratamiento del cáncer de mama humano" (Fang, 2009; Zheng, 2008).
Hepatitis C
El virus de Hepatitis C (VHC) es la enfermedad hepática más prevalente en el mundo y es considerada por la Organización Mundial de la Salud como una epidemia. Debido a que el VHC puede infectar a un paciente durante décadas antes de ser descubierto, a menudo se le llama epidemia "silenciosa". Los estudios sugieren que más de 200 millones de personas en todo el mundo están infectadas con el VHC, una incidencia global de alrededor del 3,3% de la población mundial. Solo en los EE. UU., Casi 4 millones de personas están o han estado infectadas con el VHC y de éstas; 2.7 millones tienen una infección crónica en curso. Todas las personas infectadas por el VHC están en riesgo de desarrollar enfermedades hepáticas graves que amenazan la vida. La terapia estándar actual para Hepatitis C crónica consiste en la combinación de interferón pegilado en combinación con ribavirina, ambos agentes antivirales generalizados (Craxi A et al. Clinical trial results of peginterferons in combination with ribavirin. Semin Liver Dis 2003; 23(Suppl 1): 35-46). La tasa de fracaso del tratamiento es de aproximadamente el 50% (Molino BF. Strategic Research Institute: 3rd annual viral hepatitis in drug discovery and development world summit 2007. AMRI Technical Reports; 12(1)).
Recientemente se ha demostrado que CyP-B es crítico para la replicación eficiente del genoma del VHC (Watashi K et al. Cyclophilin B Is a Functional Regulator of Hepatitis C Virus RNA Polymerase. Molecular Cell 2005, 19: 111-122). Los virus dependen de factores derivados del huésped tal como CyP-B para su replicación eficiente del genoma. CyP-B interactúa con la ARN polimerasa NS5B del VHC para estimular directamente su actividad de unión al ARN. Tanto la reducción mediada por la interferencia de ARN (ía Rn ) de la expresión endógena de CyP-B como la pérdida inducida de la unión a NS5B a CyP-B disminuyen los niveles de replicación del VHC. Por lo tanto, CyP-B funciona como un regulador estimulante de NS5B en la maquinaria de replicación de HCV. Este mecanismo de regulación para la replicación viral identifica a CyP-B como un objetivo para las estrategias terapéuticas antivirales.
A diferencia de otros tratamientos para el VHC, la inhibición de CyP no se dirige directamente al virus del VHC. Por lo tanto, se piensa que la resistencia a los fármacos de unión a CyP se producirá más lentamente que los fármacos actuales para el tratamiento del VHC ((Manns MP, et al. The way forward in HCV treatment-finding the right path. Nature Reviews Drug Discovery 2007; 6: 991-1000). Además, al interferir en el nivel de interacción huésped-virus, la inhibición de CyP puede abrir el camino para un nuevo enfoque para el tratamiento anti-VHC que podría ser complementario, no solo al tratamiento basado en interferón, sino también a los tratamientos futuros que dirigen directamente enzimas de replicación del VHC, tal como los inhibidores de la proteasa y la polimerasa (Flisiak R, Dumont JM, Crabbé R. Cyclophilin inhibitors in hepatitis C viral infection. Expert Opinion on Investigational Drugs 2007, 16(9): 1345-1354). El desarrollo de nuevos fármacos contra el VHC que efectúan la replicación viral del VHC se ha visto obstaculizado significativamente por la falta de un modelo adecuado de laboratorio para el VHC. Este obstáculo solo se ha superado recientemente mediante el desarrollo de varios modelos de cultivo celular adecuados (Subgenomic HCV Replicon Systems) y un modelo de ratón que contiene células de hígado humano(Goto K, et al. Evaluation of the anti-hepatitis C virus effects of cyclophilin inhibitors, CsA, and NIM811. Biochem Biophys Res Comm 2006; 343: 879-884; Mercer DF, et al. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers. Nat Med 2001; 7: 927-933). La ciclosporina ha demostrado recientemente la actividad anti-VHC en modelos de detección y en ensayos clínicos pequeños (Watashi K, et al. CsA suppresses replication of hepatitis C virus genome in cultured hepatocytes. Hepatology 2003; 38:1282-1288; Inoue K, Yoshiba M. Interferon combined with cyclosporine treatment as an effective countermeasure against hepatitis C virus recurrence in liver transplant patients with end-stage hepatitis C virus related disease. Transplant Proc 2005; 37:1233-1234).
Trastornos degenerativos musculares
CyP-D es una parte integral del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (MTP) en todas las células. La función del poro de la MTP es proporcionar homeostasis de calcio dentro de la célula. En condiciones normales, la apertura y el cierre del poro MTP es reversible. Bajo condiciones patológicas que involucran un flujo excesivo de calcio en la célula, esto sobrecarga las mitocondrias e induce una apertura irreversible del poro de MPT, lo que lleva a la muerte celular o apoptosis. Se ha informado que CsA corrige la disfunción mitocondrial y la apoptosis muscular en pacientes con distrofia muscular congénita de Ullrich y miopatía de Bethlam [(Merlini L et al. CsA corrects mitochondrial dysfunction and muscle apoptosis in patients with collagen VI myopathies. PNAS 2008; 105(13): 5225-5229]. Se ha demostrado que CsA in vitro inhibe de forma dependiente de la dosis la apertura de la MTP en mitocondrias cardíacas aisladas, previniendo así la apoptosis y permitiendo a la célula un tiempo precioso para la reparación(Gomez L et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition improves functional recovery and reduces mortality following acute myocardial infarction in mice Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007, 293: H1654-H1661). Un estudio clínico en 58 pacientes que presentaron infarto agudo de miocardio demostró que la administración de CsA en el momento de la reperfusión se asoció con un infarto más pequeño que la observada con placebo (Piot C et al. Effect of Cyclosporine on Reperfusion Injury in Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine 2008; 395(5): 474-481)).
Enfermedades neurodegenerativas crónicas
CsA puede actuar como un agente neuroprotector en casos de isquemia cerebral aguda y daño como resultado de un traumatismo craneal (Keep M, et al. Intrathecal cyclosporine prolongs survival of late-stage ALS mice. Brain Research 2001; 894: 327-331). Los animales tratados con CsA mostraron una dramática tasa de supervivencia del 80% en relación con solo una tasa de supervivencia del 10% en ausencia de tratamiento. Más tarde se estableció que esto fue en gran parte el resultado de la unión de CsA a CyP-D mitocondrial. Posteriormente, se ha establecido que la utilidad de la CsA se extiende a la neurodegeneración crónica, como se demostró posteriormente en un modelo de rata de la Enfermedad de Lou Gerhig (ALS) (Patente de EE. UU. N° 5.972.924), donde el tratamiento con CsA aumentó en más del doble la vida útil restante. También se ha demostrado recientemente que la inactivación de CyP-D en ratones con eliminación de CyP-D protege los axones en la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple (Forte M et al. Cyclophilin D inactivation protects axons in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of multiple sclerosis. PNAS 2007; 104(18): 7558-7563). En un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer, la deficiencia de CyP-D mejora sustancialmente el aprendizaje, la memoria y la función sináptica ((Du H et al. Cyclophilin D deficiency attenuates mitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning and memory in Alzheimer's disease Nature Medicine 2008, 14(10): 1097-1105). Además, se ha demostrado que CsA es efectivo en un modelo de rata de la enfermedad de Huntington (Leventhal L et al. CsA protects striatal neurons in vitro and in vivo from 3-nitropropionic acid toxicity. Journal of Comparative Neurology 2000, 425(4): 471­ 478), y parcialmente efectivo en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson ((Matsuura K et al. CsA attenuates degeneration of dopaminergic neurons induced by 6-hydroxydopamine in the mouse brain. Brain Research 1996, 733(1): 101-104). Por lo tanto, la necrosis dependiente de la mitocondria representa un mecanismo de enfermedad prominente que sugiere que la inhibición de CyP-D podría proporcionar una nueva estrategia de tratamiento farmacológico para estas enfermedades (Du, 2008).
Lesiones celulares, tisulares y orgánicas debido a la pérdida de la homeostasis del ión calcio celular (Ca2+)
Ca2+ está involucrado en un número de procesos fisiológicos a nivel celular, incluida la función mitocondrial saludable. Bajo ciertas condiciones patológicas, tal como infarto de miocardio, apoplejía, hepatotoxicidad aguda, colestasis y lesión por almacenamiento/reperfusión de órganos de trasplante, las mitocondrias pierden la capacidad de regular los niveles de calcio y la acumulación excesiva de calcio en la matriz mitocondrial da como resultado la apertura de grandes poros en la membrana mitocondrial interna. (Rasola A. et al. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis 2007, 12: 815-833.) La conductancia no selectiva de iones y moléculas de hasta 1,5 kilodaltons a través del poro, un proceso denominado la transición de la permeabilidad mitocondrial conduce a la inflamación de las mitocondrias y otros eventos que culminan en la muerte celular, incluida la inducción de la apoptosis. Uno de los componentes de la MTP es CyP-D. CyP-D es una molécula de inmunofilina cuya actividad isomerasa regula la apertura de la MPTP, y la inhibición de la actividad isomerasa por los análogos de CsA o CsA inhibe la creación de la MPTP, y por lo tanto previene la muerte celular.
Inhibidores de la ciclofilina análogos a la ciclosporina no inmunosupresores
A pesar de los efectos ventajosos de la CsA en las indicaciones mencionadas anteriormente, los efectos concomitantes de la inmunosupresión limitan la utilidad de la CsA como inhibidor de la CyP en la práctica clínica. En la actualidad, solo unos pocos análogos de CsA han demostrado tener poca o reducida actividad inmunosupresora (es decir, <10% de la potencia inmunospresiva de CsA) y aún conservan su capacidad para unirse a CyP (es decir,> 10% de capacidad de unión a CyP en comparación con CsA).
NIM 811 (Melle4-ciclosporina)
NIM 811 es un producto de fermentación del hongo Tolypocladium niveum, que se modifica en el aminoácido 4 y no muestra actividad inmunosupresora (debido a la falta de unión a la calcineurina), pero aún así mantiene la afinidad de unión por CyP-A (Rosenwirth BA et al. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive Cyclosporine Analogue. Antimicrob Agents Chemother 1994, 38: 1763-1772).
DEBIO 025 (MeAla3EtVal4-Ciclosporina)
DEBIO 025 es una modificación química dual de CsA en los aminoácidos 3 y 4. DEBIO 025 tampoco muestra actividad inmunosupresora, pero mantiene la afinidad de unión por la actividad de la PPPasa de CyP-A (Kristal, 2004).
SCY-635 (DimetifaminoetiltioSar3-hidroxiLeu4-Cicfosporina)
SCY-635 es una modificación química dual de CsA en los aminoácidos 3 y 4. El SCY-635 tampoco muestra actividad inmunosupresora, pero mantiene la afinidad de unión por la actividad de la PPPasa de CyP-A (publicación PCT No. WO2006/039668).
En general, estos compuestos tienen una modificación en la cara de CsA que es responsable de la unión de la calcineurina, y generalmente requieren la modificación de los aminoácidos 3 y 4. La modificación de los aminoácidos 3 y 4 es laboriosa y compleja, ya que este enfoque generalmente implica abrir el anillo de la ciclosporina, reemplazando y/o modificando esos aminoácidos y luego cerrando el anillo para producir la ciclosporina modificada.
Por el contrario, la modificación de la cadena lateral del aminoácido 1 no requiere la apertura del anillo de la ciclosporina. Sin embargo, el aminoácido 1 está asociado con la unión a CyP (en oposición a la unión a calcineurina) y se ha modificado para aumentar la eficacia inmunosupresora de CsA. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.605.593, divulga una modificación única del aminoácido 1 que da como resultado un análogo de CsA con un aumento de la potencia inmunosupresora.
Por lo tanto, sería deseable tener una molécula análoga de la ciclosporina (una "CAM") que se sintetice fácilmente y sea eficaz en el tratamiento de enfermedades mediadas por CyP. También es deseable proporcionar un análogo de CsA que proporcione al menos parte de la funcionalidad de CsA nativa, pero que posea propiedades, efectos o funciones mejoradas o adicionales en relación con la CsA nativa.
El documento WO-A-2010/012073 divulga moléculas análogas no inmunosupresoras de ciclosporina.
Resumen de la invención
De acuerdo con un aspecto, los compuestos de la presente invención comprenden análogos de la ciclosporina-A que no son inmunosupresores de acuerdo con la definición del presente documento. De acuerdo con otro aspecto, los compuestos tienen afinidad por la ciclofilina, incluida la ciclofilina-A. De acuerdo con otros aspectos, los compuestos de la presente invención comprenden análogos de la ciclosporina-A que son útiles con respecto a una enfermedad o condición mediada por ciclofilina y terapias en desarrollo con respecto a tales enfermedades y condiciones.
De acuerdo con un aspecto, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula L:
Figure imgf000007_0001
en donde
a. R' es H o acetilo;
b. R1 - R2 se selecciona del grupo que consiste en:
i.
Figure imgf000008_0001
ii.
Figure imgf000008_0002
ni.
Figure imgf000008_0003
iv.
Figure imgf000008_0004
v.
Figure imgf000008_0005
vi.
Figure imgf000008_0006
vii.
Figure imgf000008_0007
viii.
Figure imgf000008_0008
ix.
Figure imgf000008_0009
y
x.
Figure imgf000008_0010
y
c. R23 es una cadena de carbono alifática opcionalmente sustituida, de cadena lineal o ramificada saturada o insaturada.
En un aspecto, R1-R2 es
Figure imgf000009_0001
En un aspecto, R' es H.
En un aspecto, R23 se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0003
En un aspecto, R23 es -CH3 o -CH2CH3. En un aspecto, R23 es -CH3.
En un aspecto, R23 comprende un alquilo opcionalmente sustituido, que incluye alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido. Dicho alquilo puede estar sustituido con amino y puede comprender un Ala C1-C3 en donde dicho compuesto comprende el epímero D. En dicha realización, R23 puede ser MeAla.
En un aspecto, en la Fórmula L anterior,
Figure imgf000009_0002
es
Figure imgf000010_0001
En un aspecto, R23 es una cadena de carbono alifática lineal o ramificada de 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 2 carbonos de longitud.
En un aspecto, R', R1-R2 y R23 y El isómero de dicho compuesto se selecciona de los siguientes:
Figure imgf000010_0002
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención y uno o más excipientes farmacéuticos.
En un aspecto, la invención se refiere a un compuesto o composición como se describe en el presente documento para uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o lesión mediada por ciclofilina en un mamífero. Dicha enfermedad o lesión puede estar mediada por la sobreexpresión de ciclofilina o la enfermedad es una sobreexpresión congénita de ciclofilina.
Dicha enfermedad o lesión mediada por ciclofilina puede seleccionarse del grupo que consiste en
a. una infección viral;
b. enfermedad inflamatoria;
c. cáncer;
d. trastorno muscular
e. trastorno neurológico; y
f. lesión asociada con isquemia, reperfusión, pérdida de la homeostasis del calcio celular, pérdida de la homeostasis iónica, aumento de la producción de radicales libres o toxinas que inducen disfunción mitocondrial;
en donde la infección viral es causada opcionalmente por un virus seleccionado del grupo que consiste en Virus de Inmunodeficiencia Humana, Hepatitis A, Hepatitis B, Hhepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, SARS-CoV, hCoV-NL63, hCoV-HKU-1, hCoV -OC43, hCOV-229E, coronavirus, virus de peritonitis infecciosa felina y virus de gastroenteritis transmisible;
en donde la enfermedad inflamatoria se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en asma, enfermedad autoinmune, inflamación crónica, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad de hipersensibilidad, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, enfermedad de las células del músculo liso vascular, aneurismas, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, reumatoide artritis, rechazo de trasplantes y vasculitis;
en donde el cáncer se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, de vejiga, hepatocelular, pancreático, cáncer de mama, glioblastoma, cáncer colorrectal, carcinoma de células escamosas, melanoma y cáncer de próstata;
en donde el trastorno muscular se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en lesión por reperfusión miocárdica, distrofia muscular, miopatías por colágeno VI, síndrome de postparo cardíaco (PCAS), insuficiencia cardíaca, aterosclerosis y aneurisma aórtico abdominal;
en donde el trastorno neurológico se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, atrofia de sistemas múltiples, esclerosis múltiple, parálisis cerebral, epilepsia, apoplejía, neuropatía diabética, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), trastorno bipolar, lesión excitotóxica, encefalopatía hepática, hipoglucemia, toxicidad por manganeso, privación neuronal del objetivo, ácidos grasos tóxicos tal como el ácido araquadónico, lesión mecánica de los nervios, lesión de la médula espinal y lesión cerebral; y
en donde la lesión asociada con la pérdida de la homeostasis del calcio celular se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en infarto de miocardio, apoplejía, hepatotoxicidad aguda, colestasis y lesión por almacenamiento/reperfusión de órganos de trasplante.
En un aspecto, la invención se refiere a un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula L anterior, que comprende las etapas de:
1) hacer reaccionar la ciclosporina A (CsA) Con una alquilamida de litio básica, en presencia de un disolvente adecuado, seguido de reacción con un electrófilo adecuado para generar un compuesto de Fórmula 1:
Figure imgf000011_0001
2) hacer reaccionar el compuesto de Fórmula 1 con AC2O en presencia de un disolvente adecuado para formar un compuesto de Fórmula 2A:
Figure imgf000011_0002
3) Hacer reaccionar el compuesto de fórmula. 2A con un oxidante para formar un compuesto de Fórmula 3A:
Figure imgf000012_0001
4) Hacer reaccionar el compuesto de fórmula. 3A con un electrófilo para formar un compuesto de Fórmula 4A:
Figure imgf000012_0002
5) opcionalmente, desacilar el compuesto de Fórmula. 4A.
En un aspecto, la preparación anterior del compuesto de Fórmula L comprende la adición de un exceso de LiCI en dicho solvente adecuado en la etapa 1) para formar predominantemente el epímero L del compuesto de Fórmula L, o dicha preparación del compuesto de La Fórmula L se lleva a cabo en ausencia de LiCI para formar predominantemente el epímero D del compuesto de Fórmula L. Dicha alquilamida de litio básica puede comprender diisopropilamida de litio.
En un aspecto, dicho electrófilo se selecciona del grupo definido en la siguiente tabla, para generar el R23 correspondiente establecido en dicha tabla.:
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000013_0003
En un aspecto, la invención se refiere a un método para la preparación de un compuesto de Fórmula L como se define en el presente documento que comprende las etapas de:
hacer reaccionar un compuesto de Fórmula 1A con dimetilaminopiridina en presencia de un disolvente adecuado, para formar un compuesto de Fórmula 2:
Figure imgf000013_0001
Opcionalmente seguido de la formación de un aldehído de Fórmula. 3:
Figure imgf000013_0002
Opcionalmente, seguido de una reacción de Wittig para generar el compuesto de Fórmula. L, en donde R23 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000013_0004
Figure imgf000014_0002
En un aspecto, la invención se refiere a la preparación de un compuesto de Fórmula L como se define en el presente documento que comprende las etapas de: hacer reacionar un compuesto de Fórmula 5, con una alquilamida de litio básica, que opcionalmente comprende diisopropilamida de litio, en presencia de un electrófilo adecuado en un solvente apropiado para formar el compuesto de Fórmula L, en donde R1-R2 son como se definen aquí y R23 comprende alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido.
Figure imgf000014_0001
En general, para todas las fórmulas químicas divulgadas en este documento:
"Ácido carboxílico" incluye un grupo en donde la unidad estructural ácido carboxílico está conectada a uno de los siguientes sustituyentes:
1. alquilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquilo de 2 a 15 carbonos);
2. alquenilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquenilo de 2 a 15 carbonos); y
3. alquinilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquinilo de 2 a 15 carbonos);
Los sustituyentes de los descritos anteriormente pueden incluir halógeno (por ejemplo, flúor, cloro, bromo, yodo, etc.), nitro, ciano, hidroxi, tiol que puede estar sustituido (por ejemplo, tiol, alquiltio C1-4, etc.) ), amino que puede estar sustituido (por ejemplo, amino, mono-alquilamino C1-4, di-alquilamino C1-4, amino cíclico de 5 a 6 miembros tal como tetrahidropirrol, piperazina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, pirrol, imidazol) , etc.), alcoxi C1-4 que puede estar halogenado (por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, trifluorometoxi, trifluoroetoxi, etc.), alcoxi C1-4-alcoxi-C1-4 que puede estar halogenado (por ejemplo, metoximetoxi, metoxietoxi, etoxietoxi, trifluorometoxietoxi, trifluoroetoxietoxi, etc.), formilo, alcanoilo C2-4 (por ejemplo, acetilo, propionilo, etc.), alquilsulfonilo C1-4 (por ejemplo, metanosulfonilo, etanosulfonilo, etc.), y similares, y el número de los sustituyentes es preferiblemente de 1 a 3.
Además, los sustituyentes del "amino que puede estar sustituido" anterior pueden unirse entre sí para formar un grupo amino cíclico (por ejemplo, un grupo que se forma restando un átomo de hidrógeno del anillo que constituye el átomo de nitrógeno de un anillo de 5 a 6 miembros tal como tetrahidropirrol, piperazina, piperidina, morfolina, tiomorfolina, pirrol, imidazol, etc., de tal manera que un sustituyente se pueda unir al átomo de nitrógeno, o similares). El grupo amino cíclico puede estar sustituido y los ejemplos del sustituyente incluyen halógeno (por ejemplo, flúor, cloro, bromo, yodo, etc.), nitro, ciano, hidroxi, tiol que puede estar sustituido (por ejemplo, tiol, alquiltio C1-4, etc.), amino que puede estar sustituido (por ejemplo, amino, mono-C.sub alquilamino C1-4, di-alquilamino C1-4, amino cíclico de 5 a 6 miembros tal como tetrahidropirrol, piperazina, piperidina , morfolina, tiomorfolina, pirrol, imidazol, etc.), carboxilo que puede estar esterificado o amidado (por ejemplo, carboxilo, alcoxi-carbonilo C1-4, carbamoilo, mono-alquilo C1-4-carbamoilo, di-alquilo C1-C1-4-carbamoílo, etc.), alcoxi C1-4 que puede estar halogenado (por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, trifluorometoxi, trifluoroetoxi, etc.), alcoxi C1-4-C.sub.alcoxi C1-4 que puede estar halogenado (por ejemplo, metoximetoxi, metoxietoxi, etoxietoxi, trifluorometoxietoxi, trifluoroetoxietoxi, etc.), formilo, alcanoilo C2-4 (por ejemplo, acetilo, propionilo, etc.), alquilsulfonilo C1-4 (por ejemplo, metanosulfonilo, etanosulfonilo), y similares, y el número de los sustituyentes es preferiblemente de 1 a 3.
"Amina" incluye un grupo que puede estar no sustituido o en donde la unidad estructural amina está N-sustituida o N,N disustituida que tiene uno o dos sustituyentes que pueden seleccionarse independientemente de:
1. alquilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquilo de 2 a 15 carbonos);
2. alquenilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquenilo de 2 a 15 carbonos);
3. alquinilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquinilo de 2 a 15 carbonos);
4. formilo o acilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alcanoílo de 2 a 4 carbonos (por ejemplo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, etc.), alquilsulfonilo de 1 a 4 carbonos (por ejemplo, metanosulfonilo, etanosulfonilo, etc.) y similares);
5. Arilo que puede estar sustituido (por ejemplo, fenilo, naftilo, etc.); y similares;
y conectado a un sustituyente seleccionado independientemente de los sustituyentes como se define para el "ácido carboxílico" anterior.
"Amida" incluye un compuesto en donde el grupo carboxílico de la unidad estructural amida está conectado a un sustituyente seleccionado independientemente de los sustituyentes como se define para el "ácido carboxílico" anterior, conectado al grupo amino de la uidad estructural amida es un N-sustituido o N,N disustituido que tiene uno o dos sustituyentes, respectivamente, que pueden seleccionarse independientemente de:
1. alquilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquilo de 2 a 15 carbonos);
2. alquenilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquenilo de 2 a 15 carbonos);
3. alquinilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alquinilo de 2 a 15 carbonos);
4. formilo o acilo que puede estar sustituido (por ejemplo, alcanoílo de 2 a 4 carbonos (por ejemplo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, etc.), alquilsulfonilo de 1 a 4 carbonos (por ejemplo, metanosulfonilo, etanosulfonilo, etc.) y similares);
5. Arilo que puede estar sustituido (por ejemplo, fenilo, naftilo, etc.); y similares
"Arilo" se puede ejemplificar mediante un grupo hidrocarburo aromático policíclico monocíclico o fusionado, y por ejemplo, se prefiere un grupo arilo C6-14 tal como fenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo o acenaftilenilo, y similares, prefiriéndose fenilo. Dicho arilo puede estar sustituido con uno o más sustituyentes, tal como alcoxi inferior (por ejemplo, alcoxi C1-6, tal como metoxi, etoxi o propoxi, etc.), un átomo de halógeno (por ejemplo, flúor, cloro, bromo, yodo, etc.), alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-6 tal como metilo, etilo o propilo, etc.), alquenilo inferior (por ejemplo, alquenilo C2-6 tal como vinilo o alilo, etc.), alquinilo inferior (por ejemplo, alquinilo C.2 -6 tal como etinilo o propargilo, etc.), amino que puede estar sustituido, hidroxilo que puede estar sustituido, ciano, amidino que puede estar sustituido, carboxilo, alcoxicarbonilo inferior (por ejemplo, alcoxicarbonilo C1-6 tal como metoxicarbonilo o etoxicarbonilo, etc.), carbamoilo que puede estar sustituido (por ejemplo, carbamoilo que puede estar sustituido con alquilo C1-6 o acilo (por ejemplo, formilo, alcanoilo C2-6, benzoilo, alcoxicarbonilo C1-6 que puede halogenarse, alquilsulfonilo C1-6 que puede ser halogenado, bencenosulfonilo, etc.) que puede estar sustituido con un grupo heterocíclico monocíclico aromático de 5 a 6 miembros (por ejemplo, piridinilo, etc.), 1 -azetidinilcarbonilo, 1 -pirrolidinilcarbonilo, piperidinocarbonilo, morfolinocarbonilo, tiomorfolinocarbonilo (el átomo de azufre puede estar oxidado), 1-piperazinilcarbonilo, etc.), o similares. Cualquiera de estos sustituyentes puede estar independientemente sustituido en 1 a 3 posiciones sustituibles.
"Cetona" incluye un compuesto en el que el grupo carbonilo de la unidad estructural cetona está conectada a uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente de los sustituyentes como se definió anteriormente para dicho "ácido carboxílico".
"Éster" incluye un éster carboxílico o alcohólico en donde el grupo éster está compuesto por uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente de los sustituyentes como se define para "ácido carboxílico" o "arilo".
"Alquilo", a menos que se defina otra cosa, es preferiblemente un alquilo de 1 a 15 unidades de carbono de longitud.
El "grupo aromático" se puede ejemplificar con arilo como se define anteriormente, o un grupo heterocíclico monocíclico aromático de 5 a 6 miembros, tal como furilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, furazanilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, 1,2,3 -triazolilo, 1,2,4-triazolilo, tetrazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo o similares; y un grupo heterocíclico fusionado aromático de 8 a 16 miembros (preferiblemente de 10 a 12 miembros) "No inmunosupresor" se refiere a la capacidad de un compuesto para exhibir un nivel sustancialmente reducido de supresión del sistema inmunológico en comparación con CsA , según lo medido por la capacidad de los compuestos para inhibir la proliferación de linfocitos humanos en cultivo celular y, preferiblemente, como se mide por el método expuesto en el Ejemplo 19 a continuación.
"Análogo" significa un análogo estructural de CsA que difiere de CsA en uno o más grupos funcionales. Preferiblemente, tales análogos conservan al menos una parte sustancial de la capacidad de CsA para unirse a CyP.
En el presente documento también se describen especies de Fórmula I en las que R' es H, R1 es un alquilo saturado o insaturado de entre 2 y 15 carbonos de longitud y R2 se selecciona de:
1. ácido carboxílico que comprende un grupo carboxilo;
2. N-sustituido de amida N,N-disustituida en donde los sustituyentes se seleccionan independientemente de un H, un alquilo de entre 1 y 7 carbonos de longitud, o dichos sustituyentes forman un anillo heterocíclico del cual el heterociclo se selecciona de O, N o S;
3. un éster de entre 1 y 7 carbonos de longitud;
4. un alquilo monohidroxilado o dihidroxilado de entre 1 y 7 carbonos de longitud;
5. una amina protegida con acilo N-sustituida o no sustituida de entre 1 y 7 carbonos de longitud;
6. un nitrilo;
7. una cetona en donde el grupo carboxílico de la cetona está conectado a R1 y una cadena de alquilo saturada o insaturada de entre 1 y 7 carbonos de longitud;
8. fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de dióxido de nitrógeno, un flúor, una amina, un éster o un grupo carboxilo.
Los compuestos de la presente invención pueden existir en forma de compuestos ópticamente activos. La presente invención contempla todos los enantiómeros de compuestos ópticamente activos dentro del alcance de las fórmulas anteriores, tanto individualmente como en mezclas de racematos. También, la presente invención incluye profármacos de los compuestos definidos en el presente documento.
De acuerdo con otro aspecto, los compuestos de la presente invención pueden ser útiles para tratar, prevenir o estudiar una enfermedad mediada por CyP en un mamífero, preferiblemente un humano. Tal enfermedad usualmente está mediada por la sobreexpresión de CyP, tal como una sobreexpresión congénita de CyP.
Las enfermedades mediadas por CyP que pueden tratarse con compuestos de la presente invención incluyen:
a. una infección viral;
b. enfermedad inflamatoria;
c. cáncer;
d. trastorno degenerativo muscular;
e. trastorno neurodegenerativo; y
f. Lesión asociada a la pérdida de la homeostasis del calcio celular.
Dicha infección viral puede ser causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en el Virus de Inmunodeficiencia Humana, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D y Hepatitis E. Dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma, enfermedad autoinmune, inflamación crónica, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad de hipersensibilidad, enfermedad inflamatoria intestinal, sepsis, enfermedad de células musculares lisas vasculares, aneurismas, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes y vasculitis. Dicho cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, vejiga, hepatocelular, pancreático y de mama. Dicho trastorno degenerativo muscular puede seleccionarse del grupo que consiste en lesión por reperfusión miocárdica, distrofia muscular y miopatías por colágeno VI. Dicho trastorno neurodegenerativo puede seleccionarse del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, atrofia de sistemas múltiples, esclerosis múltiple, parálisis cerebral, apoplejía, neuropatía diabética, esclerosis amiotrófica lateral (enfermedad de Lou Gehrig), lesión de la médula espinal y lesión cerebral. Dicha lesión asociada con la pérdida de la homeostasis del calcio celular se puede seleccionar del grupo que consiste en infarto de miocardio, apoplejía, hepatotoxicidad aguda, colestasis y lesión por almacenamiento/reperfusión de órganos de trasplante.
Descripción detallada
De acuerdo con un aspecto, un compuesto de esta invención puede administrarse puro o con un vehículo farmacéutico a un animal de sangre caliente que lo necesite. El portador farmacéutico puede ser sólido o líquido. El compuesto puede administrarse por vía oral, tópica, parenteral, por inhalación o por vía rectal en formulaciones de dosis unitarias que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales. El término parenteral, como se usa en este documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, inyección intraesternal o técnicas de infusión.
Las composiciones farmacéuticas que contienen la mezcla de la invención pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como tabletas, pastillas, pastillas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas a uso oral pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar una preparación farmacéuticamente atrayente y paladeable. Las tabletas que contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos también pueden fabricarse por métodos conocidos. Los excipientes utilizados pueden ser, por ejemplo, (1) diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; (2) agentes de granulación y desintegración tales como almidón de maíz o ácido algínico; (3) agentes aglutinantes tales como almidón, gelatina o acacia, y (4) agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También pueden recubrirse mediante técnicas descritas en las patentes numero U.S. 4.256.108; 4.160.452; y 4.265.874 para formar tabletas terapéuticas osmóticas para liberación controlada.
En algunos casos, las formulaciones para uso oral pueden estar en forma de cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín. También pueden estar en forma de cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas normalmente contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes pueden incluir: (1) agentes de suspensión tales como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; o (2) agentes dispersantes o humectantes que pueden ser un fosfátido de origen natural tal como la lecitina, un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, por ejemplo, estearato de polioxietileno, un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga , por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol , por ejemplo monooleato de polioxietilen sorbitán.
Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo; uno o más agentes colorantes; uno o más agentes saborizantes; y uno o más agentes edulcorantes tales como sacarosa, aspartamo o sacarina.
La suspensión oleosa se puede formular suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, un aceite de pescado que contiene ácido graso omega 3, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes y agentes saborizantes para proporcionar una preparación oral paladeable. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
Los polvos y gránulos dispersables son adecuados para la preparación de una suspensión acuosa. Proporcionan el ingrediente activo en una mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspensión se ejemplifican por los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, los agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes descritos anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas que contienen la mezcla de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal tal como aceite de oliva o aceites de arachis, o un aceite mineral tal como parafina líquida o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser (1) gomas naturales tales como goma arábiga y goma tragacanto, (2) fosfátidos naturales tales como frijol de soja y lecitina, (3) ésteres o éster parcial 30 derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán, (4) productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y saborizantes. Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, aspartamo o sacarosa. Tales formulaciones también pueden contener agentes demulcentes, conservantes, y saborizantes y colorantes.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con métodos conocidos usando aquellos agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.
El compuesto de la invención también se puede administrar en forma de supositorios para la administración rectal del fármaco. Las composiciones adecuadas se pueden preparar mezclando el compuesto con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles.
Para uso tópico, se pueden emplear cremas, pomadas, jaleas, soluciones o suspensiones adecuadas, etc., que normalmente se usan con ciclosporina.
En una realización particularmente preferida, se usa una solución líquida que contiene un agente tensioactivo, etanol, un disolvente lipófilo y/o anfifílico como ingredientes no activos. Específicamente, se utiliza una fórmula oral de emulsión múltiple que contiene la mezcla análoga isomérica y los siguientes ingredientes no medicinales: succinato de d-alfa tocoferil polietilenglicol 1000 (vitamina E TPGS), aceite de triglicéridos de cadena media (MCT), Tween 40 y etanol. También se puede usar preferiblemente una cápsula de gelatina blanda (que comprende gelatina, glicerina, agua y sorbitol) que contiene el compuesto y los mismos ingredientes no medicinales que la solución oral.
Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administración y la ruta de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos y la naturaleza y gravedad de la enfermedad o condición en particular que se está sometiendo a la terapia.
Metodología
Las reacciones que se exponen a continuación son ejemplos generales de las reacciones químicas capaces de sintetizar los compuestos deseados modificados en el residuo del aminoácido 1 (AA1) y el residuo del aminoácido 3 (AA3) de CsA. Las modificaciones a AA1 se representan como:
Figure imgf000018_0001
y las modificaciones a AA3 se representan como
Figure imgf000018_0002
ambas modificaciones a AA1 y AA3 utilizan reactivos que tienen las propiedades químicas requeridas, y un experto en la técnica entenderá que pueden hacerse sustituciones de ciertos reactivos.
La identidad y la pureza de los compuestos preparados se establecieron generalmente mediante metodologías que incluyen espectrometría de masas, HPLC y espectroscopía de RMN. Los espectros de masas (ESI-MS) se midieron en un sistema Hewlett Packard 1100 MSD. Los espectros de RMN se midieron en un espectrómetro Varian MercuryPlus 400 MHz en disolventes deuterados (DMSO para sales de fosfonio, benceno para todos los demás compuestos). La HPLC analítica y preparativa en fase reversa se llevó a cabo en un sistema Agilent 1100 Series. Síntesis de compuestos de sal de fosfonio
Las sales de fosfonio se preparan mediante la reacción de trifenilfosfina o cualquier otra fosfina adecuada con haluros de alquilo (R-X; X = Cl, Br o I). Los haluros de alquilo adecuados son cualquier haluro alifático primario o secundario de cualquier longitud de cadena o peso molecular. Estos haluros de alquilo pueden ser ramificados o no ramificados, saturados o insaturados.
Si la reacción se lleva a cabo en tolueno (Reacción 1), el producto precipita directamente desde la solución de reacción. Los sustratos no reactivos, sin embargo, requieren un solvente más polar tal como la dimetilformamida (DMF) (Reacción 2) para acortar los tiempos de reacción y lograr rendimientos satisfactorios.
Reacción 1:
Figure imgf000019_0001
Donde X es un haluro (incluyendo pero no limitado a Cl, Br e I), y R10 es una cadena alifática lineal o ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de cetonas, hidroxilos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres y 1,3-dioxolanos; un grupo aromático, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de haluros, ésteres y nitro; o una combinación de la cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada mencionada anteriormente y los grupos aromáticos mencionados anteriormente.
Ejemplo 1.Síntesis de 404-15
Figure imgf000019_0002
Como ejemplo ilustrativo, se disuelve trifenilfosfina (13 mmol) en 50 ml de tolueno y se agrega cloroacetona (10 mmol) para obtener una solución transparente. La reacción se agita bajo reflujo durante la noche. Un sólido incoloro se separa por filtración, se lava con tolueno y hexano y se seca al vacío.
Usando la Reacción 1, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
Figure imgf000019_0003
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0003
Alternativamente, las sales de fosfonio adecuadas pueden sintetizarse a través de la Reacción 2 como se ilustra a continuación:
Reacción 2:
Figure imgf000021_0001
Donde X es un haluro (incluyendo pero no limitado a Cl, Br e I), y R10 es una cadena alifática lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de cetonas, hidroxilos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres y 1,3-dioxolanos; un grupo aromático, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de haluros, ésteres y nitro; o una combinación de la cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada mencionada anteriormente y los grupos aromáticos mencionados anteriormente.
Ejemplo 2: Síntesis de 404-51
Figure imgf000021_0002
Como ejemplo ilustrativo, se disuelve trifenilfosfina (11 mmol) en 10 ml de DMF y se agrega ácido 4-bromobutírico (10 mmol). La reacción se agita durante 7 horas a 110 °C y luego se deja enfriar durante la noche. Se añaden cincuenta ml de tolueno y se recoge por filtración un sólido cristalino e incoloro. El producto se lava con tolueno y hexano y se seca al vacío durante la noche.
Si la cristalización no se establece después del tratamiento con tolueno, el producto se extrae con 20 ml de MeOH/H2O (mezcla 1:1). La fase acuosa se lava con tolueno y hexano y se lleva hasta sequedad. El residuo se agita con 50 ml de acetato de etilo (EtOAc) a temperatura de reflujo durante 20-30 min. Si se obtiene un sólido cristalino, el producto se recoge por filtración, se lava con EtOAc y hexano y se seca. En caso de que el producto se obtenga como un aceite o goma, el EtOAc se decanta y el producto restante se seca al vacío.
Usando la Reacción 2, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
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Reacción de Wittig
La reacción de Wittig es ampliamente aplicable a un amplio rango de sustratos y reactivos. La cadena lateral, que se introduce en el sustrato en la reacción, puede representar cualquier número de compuestos alifáticos ramificados y no ramificados, saturados e insaturados de longitud variable (R') y puede contener un amplio rango de grupos funcionales. En la reacción de Wittig, se utiliza una base, tal como tert-butóxido de potasio (KOtBu), para generar un iluro a partir de una sal de fosfonio. El iluro reacciona con el grupo carbonilo del sustrato, CsA-aldehído, para formar un alqueno. Las sales de fosfonio que contienen una cadena lateral de ácido carboxílico requieren al menos dos equivalentes de base para generar el iluro.
Reacción 3: Síntesis de un intermedio análogo de la ciclosporina acetilada utilizando un compuesto de sal de fosfonio a través de una reacción de Wittig
Figure imgf000026_0001
Donde X es un haluro (incluyendo pero no limitado a Cl, Br e I), y R12 es una cadena alifática lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de cetonas, hidroxilos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres y 1,3-dioxolanos; un grupo aromático, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de haluros, ésteres y nitro; o una combinación de la cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada mencionada anteriormente y los grupos aromáticos mencionados anteriormente.
Ejemplo 3: Síntesis de Compuesto 404-20 utilizando un compuesto de sal de fosfonio a través de una reacción de Wittig:
Figure imgf000026_0002
Como ejemplo ilustrativo, un matraz de 250 ml secado en horno se carga bajo atmósfera de argón con bromuro de trifenilbutilfosfonio (6,0 mmol) y 40 ml de tetrahidrofurano anhidro (THF). La suspensión se enfría hasta 0 °C y se agrega tert-butóxido de potasio (6.0 mmol) para obtener un color naranja. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 1-2 horas, seguido de la adición de aldehído CsA (2,0 mmol, disuelto en 20 ml de THF anhidro). Se continúa agitando durante 3 horas a temperatura ambiente. La reacción se detiene con 10 ml sat. NH4Cl y 20 ml de agua helada. Las capas se separan y la fase acuosa se extrae con EtOAc. Las capas orgánicas se combinan, se lavan con salmuera y se secan sobre Na2SO4. El disolvente se elimina y el producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/acetona 3: 1).
Usando la Reacción 3, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
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Desacetilación
Reacción 4: Desacetilación de los análogos de la ciclosporina acetilada
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Donde R12 es una cadena alifática lineal o ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de cetonas, hidroxilos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, aminas protegidas con acilo y 1,3-dioxolanos; un grupo aromático, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de haluros, ésteres, aminas y nitro; o una combinación de la cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada mencionada anteriormente y los grupos aromáticos mencionados anteriormente.
Ejemplo 4: Síntesis de Compuesto 404-90 a través de Desacetilación
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Como ejemplo ilustrativo, una solución de 404-20 (0.16 mmol) en 10 ml de MeOH se combina con una solución pentahidratado de tetrametilamoniohidróxido (0.47 mmol) en 2 ml de H2O. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 días. La reacción se concentra al vacío y se añaden 5 ml de H2O. La reacción se extrae con EtOAc, el extracto se lava con salmuera, se seca sobre Na2SO4 y se concentra hasta sequedad. El producto crudo se purifica mediante HPLC preparativa en fase reversa.
La purificación de los compuestos desacetilados se lleva a cabo generalmente sobre sílica gel (hexano/acetona 2:1) o por HPLC preparativa. En el caso de los compuestos 404-60, 404-137, 416-08, 420-98 y 420-100 (ácidos carboxílicos), la reacción se acidifica a pH 2-3 con HCl 1 M antes de la extracción.
Usando la Reacción 4, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
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Hidrogenación del doble enlace
El doble enlace se puede hidrogenar bajo presión atmosférica para obtener la cadena lateral saturada. Los grupos funcionales tales como hidroxilo, carbonilo y carboxilo son estables bajo estas condiciones y no requieren protección. R' representa bien sea un grupo acetilo o hidrógeno. En el caso de los compuestos carbonilo a,p-insaturados, el doble enlace debe reducirse antes de la desacetilación para evitar la ciclización a través de una adición nucleófila del grupo hidroxi libre en el doble enlace activado.
Reacción 5:
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Donde R12 es una cadena alifática lineal o ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de cetonas, hidroxilos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, aminas protegidas con acilo y 1,3-dioxolanos; un grupo aromático, que contiene opcionalmente un sustituyente seleccionado del grupo de haluros, ésteres, aminas y nitro; o una combinación de la cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada mencionada anteriormente y los grupos aromáticos mencionados anteriormente, y R’ es bien sea un grupo H o un grupo acetilo.
Ejemplo 5: Síntesis de 404-56:
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelven 404-43 (0,34 mmol) en 40 ml de EtOH anhidro y se agregan 43 mg de Pd/C (10%) y 0,2 ml de ácido acético. La mezcla se agita bajo hidrógeno a presión atmosférica durante 2 días. La reacción se filtra a través de Celite y se concentra al vacío. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Usando la Reacción 5, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
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Reducción del grupo de nitrilo
La reducción del grupo nitrilo a la correspondiente amina primaria se puede lograr con boruro de níquel generado in situ a partir de borohidruro de sodio (NaBH4) y cloruro de níquel (II) (NiCh). La adición de un reactivo de atrapamiento adecuado conduce a aminas primarias protegidas con acilo (carbamatos o amidas, respectivamente) y previene la formación de aminas secundarias como una reacción secundaria no deseada. El doble enlace se reduce parcialmente bajo las condiciones dadas y se obtiene una mezcla de productos. Ambos compuestos de amina protegidos saturados e insaturados se aislaron y se purificaron. Para la reacción 420-123, la mezcla no se separó. En su lugar, la mezcla se sometió a hidrogenación catalítica para producir el compuesto completamente saturado.
Reacción 6 :
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Cuando Acilo es cualquiera de BOC, acetilo o butirilo, el agente acilante es uno de di-tert-butildicarbonato, anhídrido acético y anhídrido butírico y R1 es un grupo alifático de cadena lineal o ramificada saturado o insaturado. Un experto en la técnica entenderá que los agentes de acilación descritos anteriormente pueden reemplazarse con un amplio rango de agentes de acilación para producir de manera similar un amplio rango de aminas protegidas con acilo.
Ejemplo 6 : Síntesis de 420-08
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelve 404-187 (0,257 mmol) en 15 ml de metanol y se enfría hasta 0 °C. Se añade ditert-butildicarbonato (0,514 mmol) y cloruro de níquel (II) (0,025 mmol) para dar una solución transparente. Se agrega borohidruro de sodio (3.85 mmol) en porciones durante 1 hora. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se agrega borohidruro de sodio adicional (1,95 mmol) a 0 °C y se continúa agitando durante 3 horas a temperatura ambiente. La HPLC muestra una mezcla de 420-08-1 (compuesto de carbamato) y 420-08-2 (compuesto de carbamato con doble enlace reducido). La reacción se agita durante 30 minutos con dietilentriamina (0,257 mmol) y luego se concentra al vacío. El residuo se recoge en 75 ml de EtOAc, se lava con 20 ml de solución sat de NaHCO3 y se secó sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina en vacío. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Usando la Reacción 6 , los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
Figure imgf000042_0002
9
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Desprotección de aminas
La amina protegida por BOC (carbamato) se puede convertir en la amina libre mediante hidrólisis ácida usando ácido trifluoroacético (TFA).
Reacción 7:
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Donde R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, y R’ es un grupo H o un grupo acetilo. Ejemplo 7: Síntesis de 420-23
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelven 420-17 (0,026 mmol) en 4 ml de DCM anhidro y se agregan 2 ml de ácido trifluoroacético a 0 °C. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añaden veinte 20 ml de diclorometano. La mezcla de reacción se lava con H2O y solución saturada de NaHCO3 y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina y el producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Usando la Reacción 7, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
Figure imgf000044_0003
Protección del grupo amino
La función amino libre puede protegerse utilizando un amplio rango de grupos protectores utilizando métodos establecidos. Existe una gama más amplia de agentes protectores en comparación con la introducción reductiva a partir del nitrilo. Juntas, las reacciones 7 y 8 ofrecen una ruta alternativa a la reacción 6 para la preparación de 5 compuestos amino protegidos con acilo.
Reacción 8 :
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Cuando Acilo es cualquiera de BOC, acetilo o butirilo, un agente acilante es uno de di-tert-butildicarbonato, anhídrido 0 acético, anhídrido butírico, un experto en la técnica entenderá que un amplio rango de agentes acilantes incluyendo, dicarbonatos, anhídridos y haluros de acilo se pueden emplear para producir un amplio rango de aminas protegidas con acilo, y R1 es un grupo alifático de cadena lineal o ramificada saturado o insaturado.
Ejemplo 8 : Síntesis de 420-27
5
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Como ejemplo ilustrativo, 420-25 (0.039 mmol) se disuelve en 3 mL de piridina anhidra bajo nitrógeno. La reacción se enfría hasta 0 °C y se agrega anhídrido acético (0.59 mmol). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se elimina al vacío y el residuo se recoge en 25 ml de EtOAc. La reacción se lava con 2 x 10 ml de HCl 1 M, 2 x 10 ml de solución saturada de NaHCO3 y 10 ml de salmuera y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente 0 se elimina al vacío para dar el producto como un sólido incoloro.
Desprotección del aldehído
La unidad estructural 1,3-dioxolano se convierte en una función aldehído a través de la hidrólisis ácida.
Reacción 9 y Ejemplo 9: Síntesis de 404-47
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5
Como ejemplo ilustrativo, una solución de 404-33 (0.246 mmol) en 20 ml de ácido fórmico se agita a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se agregan lentamente cien ml de agua helada y 200 ml de solución saturada de NaHCO3 a la reacción (espumación fuerte). La reacción se extrae con 2 x 150 ml de EtOAc. Los extractos combinados se lavan con solución saturada de NaHCO3, agua y salmuera y se secan sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina y el 0 producto se seca al vacío.
Reducción del grupo nitro.
El compuesto nitro aromático se reduce a la anilina a través de hidrogenación catalítica. La reacción conduce a la reducción del doble enlace.
Reacción 10 y Ejemplo 10: Síntesis de 404-120
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Como ejemplo ilustrativo, 404-89 (0.13 mmol) se disuelve en 2 mL de etanol y Níquel Raney (0.18 g, 50% en H2O, se lava 3 veces con etanol, luego se suspende en 2 mL de etanol) y se agrega 0.1 mL de ácido acético. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 días. La reacción se filtra a través de Celite y la torta del filtro se lava con metanol. El filtrado se lleva hasta sequedad. El residuo se recoge en EtOAc, se lava con solución de NaHCO3 y salmuera y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina en vacío. El producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/acetona 2 : 1 ).
Síntesis de amida
Las amidas se preparan a partir de ácidos carboxílicos por reacción de una amina con el correspondiente cloruro de ácido (Reacción 11). La síntesis también puede proceder directamente del ácido mediante el uso de reactivos de acoplamiento apropiados, tales como DCC y HOBt (Reacción 12).
Reacción 11:
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Cuando R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, R15 y R16 son independientemente hidrógeno o una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, o donde NR15R16 juntos forman una unidad estgructural morfolinilo.
Ejemplo 11: Síntesis de 404-85
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Como ejemplo ilustrativo, 365-73 (0.04 mmol) y cloruro de tionilo ( 6 8 mmol) se combinan bajo atmósfera de nitrógeno y se calientan hasta reflujo durante 2 horas. La reacción se deja enfriar y se concentra hasta sequedad. Se agregan veinte ml de tolueno y la reacción se concentra hasta sequedad nuevamente (2 veces). El residuo se recoge en 5 ml de tolueno anhidro y se agrega dietilamina (0,48 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se agregan cinco ml de H2 O y la mezcla se extrae con 20 ml de EtOAc. El extracto se lava con salmuera y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina al vacío y el producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/acetona 3: 1).
Usando la Reacción 11, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
Figure imgf000047_0002
Reacción 12:
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Cuando R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, R15 y R16 son independientemente hidrógeno o una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, o donde NR15R16 juntos forman una unidad estgructural morfolinilo.
Ejemplo 12: Síntesis de 420-104
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Como ejemplo ilustrativo, 420-98 (0.078 mmol) se disuelve en 10 ml de DCM anhidro bajo atmósfera de nitrógeno. Se añaden diciclohexilcarbodiimida (DCC, 0.117 mmol) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 0.078 mmol) a 0 °C y la mezcla se agita durante 15 minutos. Se agrega dimetilamina (0.78 mmol) para dar una solución transparente e incolora. El baño de enfriamiento se retira después de 15 minutos y la agitación se continúa a temperatura ambiente durante 5 días. La reacción se transfiere a un embudo de decantación y se agregan 20 ml de DCM y 10 ml de HCl 0,5 M. La capa orgánica se retira, se seca sobre Na2 SO4 y se concentra hasta sequedad. El residuo se recoge en 10 ml de acetonitrilo. El sólido no disuelto se separa por filtración y el filtrado se concentra al vacío. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Usando la Reacción 12, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
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Esterificacion
Los ésteres de ácido carboxílico se preparan a partir de los ácidos carboxílicos correspondientes y un alcohol utilizando catálisis ácida (Reacción 13) o reactivos de acoplamiento (DCC y DMAP, Reacción 14).
Reacción 13:
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Donde R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, y R17 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, que contiene opcionalmente un sustituyente halógeno o hidroxilo.
Ejemplo 13: Síntesis de 404-171
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Como ejemplo ilustrativo, una mezcla de 404-60 (0.059 mmol), 4 ml de EtOH y 2 ^l de H2 SO4 conentrado se calienta hasta reflujo durante 4 horas. El disolvente se evapora y el residuo se recoge en acetonitrilo. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Usando la Reacción 13, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
Figure imgf000050_0003
Compuesto Material de partida MS (Na+) Reactivo
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13 horas a 90 °C; producto extraído con EtOAc
Reacción 14:
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Donde R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, y R17 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, que contiene opcionalmente un sustituyente halógeno o hidroxilo.
Ejemplo 14: 420-24
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelve 404-60 (0,053 mmol) en 4 ml de DCM anhidro y se enfría hasta 0 °C bajo atmósfera de nitrógeno. Se añadieron dimetilaminopiridina (DMAP, 0,005 mmol), 2-fluoropropanol (0,27 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (DCC, 0,058 mmol) y la reacción se agitó durante 15 minutos a 0 °C. Se retira el baño de enfriamiento y se continúa la agitación durante la noche a temperatura ambiente. Se agregan 20 ml de DCM, luego la reacción se lava con H2O y se evapora hasta sequedad. El residuo se recoge en 10 ml de acetonitrilo y se filtra. El filtrado se concentra al vacío. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Alcoholes
Además de la síntesis directa en la reacción de Wittig, los alcoholes se obtienen a través de varias reacciones. La reducción de un grupo carbonilo con borohidruro de sodio conduce a alcoholes primarios (a partir de aldehído) o secundarios (a partir de cetona), respectivamente.
La oxidación de un doble enlace a través del método de hidroboración puede conducir a una mezcla de isómeros. La reacción procede predominantemente en orientación anti-Markovnikov. En el caso de una olefina terminal, el alcohol prmario es el producto principal.
Una olefina se puede convertir en un diol mediante oxidación con peróxido de hidrógeno. La reacción de un compuesto carbonilo con un reactivo de Grignard conduce a alcoholes secundarios (a partir de aldehído) y terciarios (a partir de cetona). Este método permite una extensión de la cadena de carbono.
Reacción 15:
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Cuando R’ es un H o acetilo, R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, y R20 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada.
Ejemplo 15: Síntesis de 404-98
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelve 404-61 (0.0365 mmol) en 4.5 mL de EtOH anhidro bajo atmósfera de nitrógeno. Se agrega borohidruro de sodio (0.15 mmol, suspendido en 0.5 mL de EtOH anhidro) a 0 °C y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se agrega borohidruro de sodio adicional (0.08 mmol) y la agitación se continúa durante la noche. La reacción se detiene con 5 ml de HCl 1 M bajo enfriamiento con baño de hielo y se extrae con EtOAc. El extracto se lava con salmuera, se seca sobre Na2 SO4 y se concentra hasta sequedad. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Usando la Reacción 15, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que pueden sintetizarse.
Figure imgf000052_0003
Figure imgf000053_0004
Reacción 16:
Figure imgf000053_0001
Donde R1 es una cadena alifática lineal o ramificada, saturada o insaturada.
Ejemplo 16: Síntesis de 420-28-1
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelve 404-16 (0.081 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno en 4 ml de THF anhidro. La reacción se enfría hasta 0 °C y se agrega BH3 THF (solución 1 M en THF, 0,06 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. La HPLC muestra que la reacción es incompleta. Se agrega BH3 THF adicional (0.5 mmol) y se continúa agitando durante 4 horas a temperatura ambiente. La reacción se enfría hasta 0 °C y se añaden 1,0 ml de NaOH 1 M y 0,30 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 30%. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se extrae con 25 ml de EtOAc. El extracto se lava con salmuera, se seca sobre Na2 SO4 y se concentra hasta sequedad. El producto se purifica por HPLC preparativa.
Reacción 17:
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Cuando R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, R’ es un grupo H o un grupo acetilo. Ejemplo 17: Síntesis de 420-49
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelven 420-49 (0,037 mmol) bajo atmósfera de argón en 5 ml de THF anhidro. La reacción se enfría hasta -70 °C y se agrega cloruro de alilmagnesio (solución 1 M en THF, 0,22 mmol). La reacción se agita durante 15 minutos a -70 °C y luego se deja que alcance la temperatura ambiente. Después de 90 minutos, la reacción se detiene con una solución saturada de NH4 Cl. La reacción se extrae con 25 ml de EtOAc. El extracto se lava con salmuera, se seca sobre Na2 SO4 y se concentra hasta sequedad. El producto se purifica por HPLC preparativa. Se obtiene una mezcla de compuesto acetilado y desacetilado.
Reacción 18:
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Donde R1 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada, y R23 es una cadena alifática lineal o ramificada saturada o insaturada.
Ejemplo 18: Síntesis de 404-126
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Como ejemplo ilustrativo, se disuelve 404-16 (0.054 mmol) en 1 ml de ácido fórmico y se agrega peróxido de hidrógeno (solución acuosa al 30%, 0.52 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche y luego se concentra hasta sequedad. El residuo se disuelve en 25 ml de EtOAc, se lava con una solución sat. De NaHCO3 y se secó sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina en vacío. La reacción se recoge en 9 ml de THF y 3 ml de NaOH 1 M, y se agita durante 4 horas a temperatura ambiente. El disolvente se elimina y el residuo se somete a partición entre 25 ml de EtOAc y 5 ml de H2O. La capa orgánica se lava con salmuera y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente se evapora y el producto crudo se purifica mediante HPLC preparativa.
Ejemplo 19: Modificación del Aminoácido 3
CsA sufre una sustitución en AA3 como se describe a continuación. La reacción con el exceso de LDA (diisopropilamida de litio) conduce a un derivado de hexalitio que contiene cuatro unidades de azaenolato de litio, así como una unidad de alcóxido de litio en la cadena lateral del aminoácido 1 y una unidad de enolato de litio en AA3, respectivamente. La reacción subsecuente con un electrófilo adecuado genera productos de sustitución en el residuo AA3 (sarcosina). Los electrófilos adecuados son, por ejemplo haluros de alquilo, aldehidos, dióxido de carbono y disulfuros de alquilo (Tabla 1). Se pueden obtener ambos epímeros D y L, con las relaciones relativas dependiendo de las condiciones de reacción. La ruta A (véase más abajo) conduce predominantemente al producto D, mientras que la ruta B (adición de LiCI en exceso) proporciona mezclas de ambos epímeros.
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Ejemplo 19: reacción de sustitución en AA3 de Ciclosporina A. Se obtienen estereoisómeros D y L
Ruta A: [D-MeSar] 3-CsA
Un matraz secado en horno se carga bajo atmósfera de argón con 160 ml de THF anhidro y diisopropilamina (2,07 ml, 14,8 mmol). La solución se enfría hasta -78 °C y se agrega n-butil litio (2.5 M en hexano, 5.4 mL, 13.5 mmol). Después de agitar durante 30 minutos, se agrega CsA (2,40 g, 2,0 mmol, disuelto en 40 ml de THF anhidro). La reacción se agita durante 1 hora a -78 °C. Se agrega n-butil litio adicional (3.2 mL, 8.0 mmol), seguido por la adición de yoduro de metilo (1.25 mL, 20.0 mmol). La agitación se continúa a -78 °C durante 1,5 horas, y luego la reacción se deja calentar a temperatura ambiente durante 1,5 horas adicionales. Se añaden 20 ml de H2 O y el THF se elimina al vacío. Se agregan 50 ml adicionales de H2 O y se realiza una extracción con 150 ml de EtOAc. El extracto se lava con salmuera y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina al vacío y el producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/acetona 3: 1). Rendimiento: 0,74 g (0,61 mmol, 30%).
Ruta B: [MeSar]3-CsA
Se carga un matraz seco de 100 ml bajo atmósfera de argón con 7,5 ml de THF anhidro y diisopropilamina (0,46 ml, 3,3 mmol). La solución se enfría hasta 0 °C y se agrega n-butil litio (1.32 ml, solución 2.5 M en hexano, 3.3 mmol). La reacción se agita durante 20 minutos a 0 °C y luego se enfría hasta -78 °C. Se prepara una solución de CsA (601 mg, 0,5 mmol) y cloruro de litio (636 mg, 15 mmol) en 12 ml de THF anhidro y se enfría hasta -78 °C bajo atmósfera de argón. La solución LDA se transfiere entonces a esta mezcla a través de una cánula. La reacción se agita a -78 °C durante 2 horas. Se añade n-butil litio adicional (1,20 ml, 3,0 mmol), seguido de yoduro de metilo (0,62 ml, 10 mmol). La mezcla se deja calentar hasta -20 °C y se agita a esta temperatura durante 3 horas. La reacción se deja calentar a temperatura ambiente, se inactivó con una solución saturada de NH4 Cl, se extrajo con EtOAc (2 x 20 ml), se lavó con salmuera y se secó sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina al vacío y el producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/acetona 3: 1). Rendimiento: [L-MeAla3 ]-CsA: 302 mg (0,25 mmol, 50%). [D-MeAla3] -CsA: 76 mg (0,06 mmol, 1 2 %).
Tabla 1: Ejemplos de posibles electrófilos utilizados para la alquilación de la posición 3 de la ciclosporina.
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Los ejemplos 20 y 21, que se exponen a continuación, son ejemplos generales de las reacciones químicas capaces de sintetizar los compuestos deseados modificados en los aminoácidos 1 y 3 de CsA usando reactivos que tienen las propiedades químicas requeridas, y un experto en la técnica entendería que pueden hacerse sustituciones de ciertos reactivos.
Ejemplo 20: Modificación AA1 de CsA alquilado
El Ejemplo 20 proporciona una ruta sintética para la introducción de sustituyentes en la posición 3 de CsA antes de la modificación de la cadena lateral AA1. Después de la 3-alquilación, un procedimiento de 2 etapas conduce al aldehído acetilado (compuesto 3 en el siguiente ejemplo), que es un sustrato adecuado para la modificación de la posición 1 mediante la reacción de Wittig. Este método permite la introducción de residuos en la cadena lateral AA1 que tienen una estabilidad limitada bajo las condiciones de reacción utilizadas en las etapas 1-3, tal como la base fuerte y los agentes oxidantes.
Ejemplos adicionales de compuestos preparados usando esta secuencia se resumen en la Tabla 2.
Etapa 1: Alquilación de la cadena lateral AA3
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La síntesis se lleva a cabo de acuerdo con la Ruta A o B, respectivamente, como se describe anteriormente.
Etapa 2: Acetilación del grupo hidroxi en la cadena lateral AA1
Figure imgf000057_0004
Un matraz secado en horno se carga bajo nitrógeno con [D-MeSar]3-CsA (1.84 g, 1.51 mmol), N,N-dimetilaminopiridina (19 mg, 0.15 mmol) y 20 ml de piridina anhidra, seguido de anhídrido acético (10 ml , 0,1 mol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se vierte en 100 ml de agua helada y se agita hasta que todo el hielo se haya derretido. Un sólido se recoge por filtración y se seca al aire. El sólido se disuelve en 50 ml de EtOAc y se lava con HCl 1 M (2x), solución saturada de NaHCO3 y salmuera. La fase orgánica se seca sobre Na2 SO4 y se evapora. El producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/EtOAc/MeOH 10: 10: 0.5).
Etapa 3: Formación de aldehídos.
Figure imgf000057_0001
A un matraz que contiene el compuesto 2 (800 mg, 0,636 mmol) se agregan 10 ml de dioxano y 10 ml de H2 O. Se agregan NalO4 (544 mg, 2.54 mmol) y OsO4 (solución 7.9 mM en agua/dioxano 1: 1,4.05 mL, 32 mmol) y la reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. Se agregan 75 ml de H2O y la reacción se extrae con 3 x 25 ml de EtOAc. Los extractos se lavan con agua, solución saturada de NaHCO3, agua y salmuera (25 ml cada una) y se secan sobre MgSO4. El disolvente se elimina al vacío y el producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/EtOAc 3: 1 ). Etapa 4: Reacción de Wittig
Figure imgf000057_0002
Un matraz secado en horno se carga bajo atmósfera de argón con bromuro de fosfonio de ácido trifenil-6 -hexanoico (90 mg, 0,195 mmol) y 5 ml de THF anhidro. Se agrega t-butóxido de potasio (solución 1 M en THF, 0,39 ml, 0,39 mmol) a 0 °C y la solución se agita durante 30 minutos para dar un color naranja brillante. El Compuesto 3 (81 mg, 0.065 mmol, disuelto en 1 ml de THF anhidro) se agrega gota a gota a la reacción y la agitación se continúa a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se detiene con una solución saturada de NH4Cl y se extrae con EtOAc. El extracto se lava con salmuera y se seca sobre Na2SO4. El disolvente se elimina al vacío y el producto crudo se purifica sobre sílica gel (tolueno/acetona 3: 1).
Etapa 5: Desacetilación
Figure imgf000058_0001
El Compuesto 4 (30 mg, 0.022 mmol) se disuelve en 2 mL de metanol y se agregan 0.5 mL de agua y pentahidratado de hidróxido de tetrametilamonio (12 mg, 0.066 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante varios días hasta que la HPLC confirma que la desprotección se ha completado. La reacción se acidifica hasta pH 2 con HCl 1 M y se concentra al vacío. El residuo se recoge en EtOAc, se lava con agua y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente se evapora y el producto crudo se purifica mediante HPLC preparativa.
Figure imgf000058_0002
Representación esquemática de derivados de ciclosporina modificados en 1,3.
Usando el método del Ejemplo 20, los siguientes compuestos son ejemplos adicionales de los compuestos que se pueden sintetizar (X y R23 en referencia a la representación esquemática anterior; y la referencia de R en X es indicar la unión de la estructura a AA1 de CsA).
Figure imgf000058_0003
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0002
Alquilación de compuestos modificados AA1
La Reacción 21 introduce sustituyentes al residuo AA3 de compuestos previamente modificados en la cadena lateral AA1. Además de los grupos disponibles a través de la Reacción 19, esta ruta permite la introducción de sustituyentes en AA3 que son inestables bajo las condiciones de reacción utilizadas en la Reacción 2 0 , por ejemplo un residuo de tiometilo podría sufrir oxidación durante la formación del aldehído en la etapa 3 de este método.
Ejemplo 21
Figure imgf000060_0001
Se carga un matraz seco de 25 ml bajo atmósfera de argón con 1,5 ml de THF anhidro y diisopropilamina (87 pl, 0,62 mmol). La solución se enfría hasta 0 °C y se agrega n-butil litio (2.5 M en hexano, 0.25 mL, 0.62 mmol). La mezcla se agita durante 20 minutos a 0 °C y luego se enfría hasta -70 °C. La solución clara de LDA se transfiere a una solución de 404-76 (118 mg, 0.095 mmol) y cloruro de litio (120 mg, 2.84 mmol) en 1.5 mL de THF anhidro a -70 °C. La agitación se continúa durante 2 horas a -70 °C. Se agrega n-butil litio adicional (0.23 mL, 0.58 mmol), seguido por yoduro de metilo (118 pl, 1.89 mmol). La reacción se deja calentar hasta -20 °C y se mantiene a esta temperatura durante la noche. La reacción se apaga con una solución saturada de NH4Cl y se extrae con EtOAc. El extracto se lava con salmuera, se seca sobre Na2 SO4 y se evapora hasta sequedad. El producto crudo se purifica sobre sílica gel (hexano/acetona 3: 1 ^ 2: 1).
Tabla 3: Ejemplos de compuestos preparados por el Método 21 (X y R23 de acuerdo con la representación esquemática anterior; y la referencia de R en X es para indicar la unión de la estructura a AA1 de CsA).
Figure imgf000060_0003
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0004
Se pueden realizar modificaciones adicionales a los grupos funcionales en el residuo AA1 (o AA3, respectivamente) para obtener diversos compuestos derivados, tales como ésteres, amidas, alcoholes, etc. Se pueden obtener compuestos saturados reduciendo el doble enlace creado en la reacción de Wittig.
Ejemplo 22: Formación de amidas a partir de ácido carboxílico - Síntesis de 440-08
Figure imgf000062_0001
Se disuelve 440-02 (48 mg, 0.037 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno en 5 ml de DCM anhidro y se enfría hasta 0 °C. Se agregan diciclohexilcarbodiimida (DCC, 1l.6 mg, 0.056 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 5.0 mg, 0.037 mmol) y la mezcla se agita durante 15 minutos a 0 °C. Se agrega dimetilamina (solución 2 M en THF, 0.19 mL, 0.38 mmol) y se continúa agitando a temperatura ambiente durante 3 días. La reacción se diluye con 20 ml de DCM y se lava con 15 ml de HCl 0,5 M. La fase orgánica se seca sobre Na2 SO4 y luego se lleva hasta sequedad. La mezcla cruda se purifica por HPLC preparativa.
Ejemplo 23: Formación de ésteres - Síntesis de 440-31
Figure imgf000062_0002
Se disuelve 440-20 (30 mg, 0.022 mmol) en 4 ml de EtOH anhidro y 2 pl de H2 SO4.concentrado La reacción se calienta hasta reflujo durante 3 horas y luego se deja enfriar hasta temperatura ambiente. La reacción se lleva hasta sequedad. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Ejemplo 24: Formación de amida a partir de compuesto de nitrilo (amida invertida) - Síntesis de 440-15
Figure imgf000062_0003
Se carga un matraz de 50 ml bajo nitrógeno con 440-09 (80 mg, 0.061 mmol) y 5 ml de MeOH. La reacción se enfría hasta 0 °C y se añaden Ni (II)Cl2 -6 H2O (1,4 mg, 0,006 mmol) y anhídrido acético (19 pl, 0,20 mmol). Se agrega borohidruro de sodio (104 mg, 2.75 mmol) en 2 lotes con 2 horas de diferencia. A continuación, la reacción se deja calentar hasta temperatura ambiente y se agita durante la noche. Después de que se completa la reacción, se agregan 7 ml de HCl 1 M. La solución se concentra al vacío a aproximadamente la mitad de su volumen original. La mezcla resultante se extrae con EtOAc, el extracto se lava con solución saturada de NaHCO3 y salmuera y se seca sobre Na2 SO4. El disolvente se elimina en vacío. El producto, que contiene algún compuesto saturado, se usa en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Ejemplo 25: Síntesis de 440-25
Figure imgf000063_0001
Se disuelve 440-15 (83 mg, 0.061 mmol) en 10 ml de EtOH anhidro. Se añaden paladio (10% en peso sobre carbono, 8 mg) y 3-4 gotas de ácido acético. La reacción se hidrogena bajo presión atmosférica a temperatura ambiente durante varios días hasta que se completa por HPLC. La reacción se filtra a través de Celite y el filtrado se evapora hasta sequedad. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa y luego se somete a la etapa de desacetilación. Ejemplo 26: Síntesis de 440-32
Figure imgf000063_0002
Se disuelve 440-25 (41 mg, 0.03 mmol) en 4 mL de MeOH y se agrega pentahidrato de hidróxido de tetrametilamonio (16 mg, 0.09 mmol, disuelto en 1 mL de H2O). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 días. La reacción se concentra al vacío. Se agregan 5 ml de H2O y el producto se extrae con EtOAc. El extracto se lava con salmuera, se seca sobre Na2 SO4 y se evapora hasta sequedad. El producto crudo se purifica por HPLC preparativa.
Tabla 4: Ejemplos de derivados de compuestos de ciclosporina modificados en 1,3 obtenidos mediante la reducción del doble enlace creado en la reacción de Wittig (X y R23 de acuerdo con la representación esquemática anterior; y la referencia de R en X es indicar la unión de la estructura a AA1 de CsA).
Figure imgf000063_0003
Figure imgf000064_0001
Ensayo de inhibición de la isomerasa de la Ciclofilina A
Se usó un ensayo enzimático para medir la inhibición de la actividad de CyP-A por los análogos de 1,3 CsA de la presente invención, de acuerdo con un protocolo descrito en la literatura científica con modificaciones menores. El ensayo se basa en la capacidad de CyP-A para catalizar un cambio conformacional en péptidos que contienen prolina a partir de conformaciones isoméricas cis a trans. En resumen, se suministró un sustrato peptídico que incluye una unidad estructural de nitroanilida a una mezcla de reacción que contiene CyP-A, compuesto de prueba (análogo de CsA, CsA o vehículo de dimetilsulfóxido), y una segunda enzima, la alfa-quimotripsina. Cada compuesto de prueba se probó a 10 concentraciones por triplicado o cuadruplicado. El péptido se convirtió a partir de la conformación cis a la conformación trans, tanto por procesos no catalíticos como por procesos catalíticos CyP. El isómero trans del péptido, pero no el isómero cis, es un sustrato para la alfa-quimotripsina. La alfa-quimotripsina escindió inmediatamente la nitroanilida del resto del péptido, y la nitroanilida libre se acumuló a una tasa proporcional a la isomerización cis-trans. Dado que la nitroanilida libre es un producto coloreado, su acumulación se cuantificó midiendo su absorbancia con un espectrofotómetro. La acumulación de nitroanilida se midió durante 6 minutos, y las constantes de la tasa de primer orden para cada reacción se calcularon utilizando el software Graphpad Prism. La constante de la tasa catalítica de CyP-A de cada reacción se determinó restando la constante de la tasa no catalítica (derivada de la reacción sin CyP-A) de la constante de la tasa de reacción total. Los gráficos de las constantes de la tasa catalítica en función de las concentraciones de inhibidor demostraron las potencias de los compuestos, definidas por sus valores de IC50.
Protocolo detallado
A. Péptido
El péptido de ensayo fue N-succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilida. Se disolvió a una concentración de 3 mM en una solución de trifluoroetanolamina y cloruro de litio (TFE/LiCI). TFE/LiCl se preparó fresco cada día disolviendo cloruro de litio en trifluoroetanolamina a una concentración de 17 mg/ml. Después de la disolución de LiCI, el contenido de agua de la solución de TFE/LiCl se redujo agregando tamices moleculares secados al calor y mezclando suavemente la solución durante al menos 30 minutos. El péptido se disolvió luego en TFE/LiCl, y la solución se enfrió hasta 4 °C - 8 °C antes de los ensayos. La disolución del péptido en TFE/LiCl seco promovió que existiera más péptido en la conformación cis al comienzo de cada reacción de ensayo. El análisis de los datos mostró que aproximadamente el 60% del péptido en estos ensayos comenzó como un isómero cis que es consistente con los datos informados en la literatura científica. En las reacciones enzimáticas, el péptido se diluyó 20 veces hasta una concentración de ensayo final de 150 pM.
B. Compuestos de prueba
Los compuestos de prueba consistían en CsA, análogos de CsA o dimetilsulfóxido (DMSO). Se prepararon soluciones madre de análogos de CsA y CsA mediante disolución en DMSO a una concentración de 10 mg/ml en tubos de microcentrífuga estériles. Las soluciones madre se almacenaron a -20 °C cuando no estaban en uso. Se realizaron diluciones adicionales de los compuestos de prueba cada día de los ensayos. DMSO y CsA se probaron en cada experimento para servir como control de vehículo y compuesto de referencia, respectivamente.
Las soluciones madre de 10 mg/ml de análogos de CsA y CsA se diluyeron con DMSO a 50 pM en tubos de microcentrífuga, en base a los pesos moleculares de los compuestos. Luego se realizaron nueve diluciones en serie de 3 veces de cada compuesto en DMSO en una placa de poliestireno de 96 pozos. Una parte alícuota de solución DMSO o vehículo DMSO solo se diluyó 50 veces en regulador de reacción (consulte la receta a continuación) para obtener concentraciones finales de análogos de CsA o CSA de 1000, 333, 111, 37, 12, 4.1, 1.4, 0.460.15, y 0.05 nM. Las soluciones de regulador de reacción se almacenaron a 4 °C - 8 °C durante al menos una hora antes de los ensayos.
C. Regulador de reacción
La solución de partida (regulador salino) para el regulador de reacción consistió en Hepes 50 mM, cloruro de sodio 100 mM y albúmina de suero humano 1 mg/ml, ajustado a pH 8.0 con hidróxido de sodio. El regulador salino se almacenó a 4 °C cuando no estaba en uso. En cada día de ensayo, se disolvió alfa-quimotripsina bovina en un volumen de regulador salino hasta una concentración de 1 mg/ml. Se retiró una alícuota de la solución de alfa-quimotripsina para servir como el regulador de reacción de control no catalítico. Se añadió CyP-A humano recombinante al resto de la solución de quimotripsina a una concentración de 5 nM. La solución que contenía alfa-quimotripsina y CyP-A se designó como regulador de reacción y se usó para la preparación de las soluciones de reacción.
D. Protocolo de reacción
Todas las reacciones de ensayo se realizaron en un cuarto frío dentro de un rango de temperatura de 4 °C a 8 °C. Todas las soluciones y el equipo se almacenaron en el cuarto frío durante al menos 1 hora antes de los ensayos. La baja temperatura fue necesaria para que las reacciones procedieran a una tasa suficientemente lenta para medir con el equipo disponible. El dispositivo de medición fue un lector de microplacas BMG Polarstar configurado para lecturas de absorbancia a OD 405 nm. Las reacciones se realizaron en placas de ensayo de poliestireno de fondo plano de 96 pozos. Cada ejecución de ensayo consistió en 12 reacciones separadas en una fila de la placa. El péptido se dividió en partes alícuotas a 5 pl por pozo con una pipeta de un solo canal en una fila de la placa, luego la placa se colocó en el soporte de la placa del lector de microplacas. Las reacciones se iniciaron dispensando 95 pl de regulador de reacción en cada pozo que contenía péptidos utilizando un pipeteador de 12 canales y mezclando cada reacción a fondo transfiriendo con pipeta repetidamente para asegurar una disolución uniforme del péptido. Las 12 reacciones en cada ensayo fueron representadas por lo siguiente:
a) 10 reacciones, que representan una réplica para cada una de las 10 concentraciones de un compuesto de prueba (CyP-A en el regulador de reacción)
b) 1 reacción con 5 pl de vehículo DMSO (CyP-A en regulador de reacción)
c) 1 reacción con 5 pl de vehículo DMSO (CyP-A A ausente del regulador de reacción)
Las grabaciones de absorbancia se iniciaron inmediatamente después de la mezcla. Transcurrieron aproximadamente 15 segundos desde la adición del regulador de reacción hasta la primera grabación OD405 debido al tiempo de mezcla y la configuración del instrumento. Las lecturas subsiguientes se realizaron a intervalos de 6 segundos para un total de 60 lecturas en 360 segundos. Se realizaron tres o cuatro ciclos de reacción para que cada compuesto de prueba proporcione réplicas de datos.
E. Análisis de datos
Los datos sin procesar consistieron en un aumento dependiente del tiempo en OD405. En presencia de CyP-A y en ausencia de inhibidor, el péptido se convirtió completamente en el isómero trans en aproximadamente 150 segundos, como lo demuestra una meseta en el OD405. Los datos de OD405 vs. tiempo se trazaron con el software Graphpad Prism y se ajustaron con una ecuación exponencial monofásica para obtener una constante de la tasa de primer orden K para cada reacción. En las reacciones sin CyP-A, la constante de la tasa representó por completo la cis-atransisomerización térmica, no catalítica, espontánea del péptido y se definió como la constante de la tasa no catalítica K0. En reacciones que contienen CyP-A, la isomerización se produjo a través de procesos no catalíticos y catalizados por enzimas. Por lo tanto, la constante de la tasa K en las reacciones que contienen CyP-A representó la suma de la constante de la tasa no catalítica K0 y la constante de la tasa catalítica Kcat. Kcat se calculó restando K0 (obtenido de la reacción sin CyP-A) de la constante de la tasa K. Kcat típicamente fue 3 veces mayor que K0 en reacciones con CyP-A 5 nM, sustrato peptídico 150 pM y ningún inhibidor.
Las gráficas de Kcat frente a la concentración de inhibidor se ajustaron con regresiones no lineales de dosis-respuesta sigmoidales para demostrar las potencias de los inhibidores. Los valores de EC50 calculados por software representaron las concentraciones del compuesto de prueba que inhibieron Kcat en un 50%. Para normalizar la variabilidad entre los experimentos en condiciones de ensayo, se ejecutó CsA en cada experimento como un compuesto de referencia, y la potencia del análogo de CsA se expresó como una potencia de plegado en relación con CsA en función de los valores de CE50. Por ejemplo, un EC50 análogo de CsA que era la mitad de CsA representaba una potencia de 2 veces en comparación con CsA, mientras que un IC50 análogo de CSA que era 5 veces más alto que CsA representaba una potencia de 0.2 veces en comparación con CsA.
La Tabla 5, que se muestra en la Figura adjunta, muestra la inhibición de la ciclofilina A y la inmunosupresión de los análogos de CsA modificados en la posición 1 y en las posiciones 1 y 3 de acuerdo con la presente invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de Fórmula L:
Figure imgf000067_0001
en donde:
a. R' es H o acetilo;
b. R1 - R2 se selecciona del grupo que consiste en:
i.
Figure imgf000067_0002
ii.
Figure imgf000067_0003
iii.
Figure imgf000067_0004
iv.
Figure imgf000067_0005
v.
Figure imgf000067_0006
vi.
Figure imgf000067_0007
vil.
Figure imgf000068_0001
viii.
Figure imgf000068_0002
ix.
Figure imgf000068_0003
y
x.
Figure imgf000068_0004
y
c. R23 es una cadena de carbono alifática opcionalmente sustituida, de cadena lineal o ramificada saturada o insaturada.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R1-R2 es
Figure imgf000068_0005
3. El compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde R' es H.
4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones1-3, en donde R23 se selecciona del grupo que consiste en: i. -CHa,
ii. -CH2 CH3 ,
iii. -CH2 CHCH2 ,
iv. -CH2 CH2 CH2 I,
v. -(CH2)aCH2 l,
vi. -(CH2)aN+(CHa)a,
vii. -CH2 CCH,
viii. -CH2CO2(t-Bu),
ix. -CH2 Ph,
x. -CH2OH,
xi. -CH(OH)CHa,
xii. -CH(OH)(t-Bu),
xiii. -CH(OH)Ph,
xiv. -COOH,
xv. -SCHa, y
xvi. -S(p-Tol).
5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde R23 es -CH3 o -CH2CH3.
6 . El compuesto de la reivindicación 5, en donde R23 es -CH3.
7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones1-4, en donde R23
(a) comprende un alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido;
(b) está sustituido con un amino;
(c) es un C1-C3-Ala y dicho compuesto comprende el epímero D;
(d) es MeAla; y/o
(e) es una cadena de carbono alifática lineal o ramificada de 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 2 carbonos de longitud.
8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones1-7, en donde
Figure imgf000069_0001
en la Fórmula L es
Figure imgf000069_0002
9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde R’, R1-R2 y R23 y el isómero de dicho compuesto se seleccionan de entre los siguientes:
Figure imgf000069_0003
10. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y uno o más excipientes farmacéuticos.
11. Un proceso para la preparación de un compuesto de Fórmula L como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende las etapas de:
1) hacer reaccionar la ciclosporina A (CsA) Con una alquilamida de litio básica, en presencia de un disolvente adecuado, seguido de reacción con un electrófilo adecuado para generar un compuesto de Fórmula 1:
Figure imgf000070_0001
2) hacer reaccionar el compuesto de Fórmula 1 con AC2O en presencia de un disolvente adecuado para formar un compuesto de Fórmula 2A:
Figure imgf000070_0002
3) hacer reaccionar el compuesto de Fórmula 2A con un oxidante para formar un compuesto de Fórmula 3A:
Figure imgf000070_0003
4) hacer reaccionar el compuesto de Fórmula 3A con un electrófilo para formar un compuesto de Fórmula 4A:
Figure imgf000070_0004
5) opcionalmente, desacilar el compuesto de Fórmula. 4A.
12. El proceso de la reivindicación 11, en donde dicha preparación del compuesto de Fórmula L comprende la adición de un exceso de LiCI en dicho solvente adecuado en la etapa 1) para formar predominantemente el epímero L del compuesto de Fórmula L, o dicha preparación del compuesto de Fórmula L se lleva a cabo en ausencia de LiCI para formar predominantemente el epímero D del compuesto de Fórmula L.
13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en donde dicha alquilamida de litio básica es diisopropilamida de litio.
14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde dicho electrófilo se selecciona del grupo definido en la siguiente tabla, para generar el R23 correspondiente establecido en dicha tabla:
Figure imgf000071_0002
15. Un proceso para la preparación de un compuesto de Fórmula L como se define en la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
Hacer reaccionar un compuesto de Fórmula 1A con dimetilaminopiridina en presencia de un disolvente adecuado, para formar un compuesto de Fórmula 2:
Figure imgf000071_0001
opcionalmente seguido de la formación de un aldehido de Fórmula 3:
Figure imgf000072_0001
opcionalmente seguido por una reacción de Wittig para generar el compuesto de Fórmula L, en donde R23 se selecciona del grupo que consiste en
i. -CH3 ;
ii. -CH2 CH3 ;
iii. -CH2 CHCH2 ;
iv. -CH2 CH2 CH2 I;
v. -(CH2)3CH2I;
vi. -(CH2)3N+(CH3)3;
vii. -CH2 CCH;
viii. -CH2 CO2 (t-Bu)
ix. -CH2 Ph2;
x. -CH2OH;
xi. -CH(OH)CH3 ;
xii. -CH(OH)(t-Bu)3;
xiii. -CH(OH)Ph;
xiv. -COOH;
xv. -SCH3 ; y
xvi. -S(p-Tol).
16. Un proceso para la preparación de un compuesto de Fórmula L como se define en la reivindicación 1, que comprende las etapas de: hacer reaccionar un compuesto de Fórmula 5, en donde R1-R2 son como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9, con un alquilamida de litio básica, en presencia de un electrófilo adecuado en un disolvente apropiado para formar el compuesto de Fórmula L, en donde R23 comprende alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido.
Figure imgf000073_0001
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en donde dicha alquilamida de litio básica es diisopropilamida de litio.
18. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composición de la reivindicación 10 para uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o lesión mediada por ciclofilina en un mamífero.
19. El compuesto o composición de la reivindicación 18 para uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o lesión mediada por ciclofilina, en donde dicha enfermedad o lesión mediada por ciclofilina se selecciona del grupo que consiste en
a. una infección viral;
b. enfermedad inflamatoria;
c. cáncer;
d. trastorno muscular
e. trastorno neurológico; y
f. lesión asociada con isquemia, reperfusión, pérdida de la homeostasis del calcio celular, pérdida de la homeostasis iónica, aumento de la producción de radicales libres o toxinas que inducen disfunción mitocondrial;
en donde la infección viral es causada opcionalmente por un virus seleccionado del grupo que consiste en Virus de Inmunodeficiencia Humana, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, SARS-CoV, hCoV-NL63, hCoV-HKU-1, hCoV -OC43, hCOV-229E, coronavirus, virus de peritonitis infecciosa felina y virus de gastroenteritis transmisible;
en donde la enfermedad inflamatoria se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en asma, enfermedad autoinmune, inflamación crónica, prostatitis crónica, glomerulonefritis, enfermedad de hipersensibilidad, enfermedad inflamatoria del intestino, sepsis, enfermedad de las células del músculo liso vascular, aneurismas, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes y vasculitis;
en donde el cáncer se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, de vejiga, hepatocelular, pancreático, cáncer de mama, glioblastoma, cáncer colorrectal, carcinoma de células escamosas, melanoma y cáncer de próstata;
en donde el trastorno muscular se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en lesión por reperfusión del miocardio, distrofia muscular, miopatías por colágeno VI, síndrome de postparo cardíaco (PCAS), insuficiencia cardíaca, aterosclerosis y aneurismas aórticos abdominales;
en donde el trastorno neurológico se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, atrofia de sistemas múltiples, esclerosis múltiple, parálisis cerebral, epilepsia, apoplejía, neuropatía diabética, esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig), trastorno bipolar, lesión excitotóxica, encefalopatía hepática, hipoglucemia, toxicidad por manganeso, privación neuronal del objetivo, ácidos grasos tóxicos tales como el ácido araquadónico, lesión mecánica de los nervios, lesión de la médula espinal y lesión cerebral; y
en donde la lesión asociada con la pérdida de la homeostasis del calcio celular se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en infarto de miocardio, apoplejía, hepatotoxicidad aguda, colestasis y lesión por almacenamiento/reperfusión de órganos de trasplante.
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