ME00487B

ME00487B - Smješa analoga ciklosporina i njihova upotreba u svojstvu imunomodulatornih supstanci

Info

Publication number: ME00487B
Application number: MEP-2008-780A
Authority: ME
Inventors: Selvaraj Naicker; Randall W Yatscoff; Robert T Foster
Original assignee: Aurinia Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2011-10-10
Also published as: MXPA04003624A; ECSP045060A; JP2011006417A; BE2022C547I2; PT1436322E; HK1062567A1; PL210697B1; FR22C1051I1; JP5272140B2; NL301200I2; CA2460685C; NZ531945A; HRP20040353A2; KR100992850B1; JP2009197036A; EP1436322A2; AU2002331510B2; DK1436322T3; CY2022030I1; BR0213659A

Abstract

Pronalazak se bavi smešama izomera analoga ciklosporina koji imaju strukturu sličnu ciklosporinu A. Smeše poseduju poboljšanu delotvornost i smanjenu toksičnost u odnosu na pojedinačne izomere, kao i u odnosu na do sada poznate ciklosporine i derivate ciklosporina koji se nalaze u prirodi. Izvodjenja ovog pronalaska se odnose na cis i trans izomere analoga ciklosporina A. pod nazivom ISA TX 247, i derivata ovih jedinjenja. Smeše izomera ISA TX 247 pokazuju kako poboljšano delovanje, tako i smanjenu toksičnost u odnosu na do sada poznate ciklosporine, i one koji su prisutni u prirodi. Izomeri ISA TX 247, zatim alkilovani, arilovani i deuterijumom obeleženi derivati su sintetisani preko stereoselektivnih puteva u kojima odredjeni ušlo vi reakcije odredjuju stepen stereoselektivnosti. U stereoselektivnim putevima sinteze može da se koristi Wittig-ova reakcija, ili organometalni reagens koji sadrži neorganske elemente kao što su bor, silicijum, titanijum i litijum. Odnos izomera u smeši može da varira od približno 10 do 90 masenih procenata izomera (E) do približno 90 do 10 masenih procenata izomera (Z), u odnosu na ukupnu masu smeše.

Description

POZIVANJE NA SRODNE PRIJAVE

Ova prijava poziva se na prava prvenstva od američkih patentnih prijava br. 60/346.201 i 60/370,596 koje su podnete 19. oktobra 2001, odnosno 5. aprila 2002. Prikaz svake od ovih prijava u potpunosti je sadržan u ovom tekstu.

TEHNIČKI DEO

Pronalazak se odnosi na smeše izomera analoga ciklosporina koji su srodni ciklosporinu A. Smatra se da smeše imaju poboljšano delovanje i/ili smanjene toksične efekte u odnosu na pojedinačne izomere i u odnosu na ciklosporine i njihove derivate koji su prisutni u prirodi i druge koji su do danas poznati. Dodatno, ovaj pronalazak se odnosi na puteve sinteze i reakcije preko kojih se dobijaju izomeri analoga ciklosporina A, gde se ovakvi putevi sinteze medjusobno razlikuju po stepenu stereoselektivnosti u zavisnosti od uslova reakcije.

Reference:

Sledeće reference su u vezi sa ili se na njih u ovom tekstu poziva, preko broja patenta ili patentne prijave ili u zagradi po autoru i godini na odredjenim mestima u ovoj specifikaciji:

1. Bennett, W.M., “The nephrotoxicity of new and old immunosuppressive drugs,”

Renal Failure, Vol. 20, pp. 687-90 (1998).

2. J.-F. Biellmann, JT.-B. Ducep in “Allylic and benzylic carbanions substituted by heteroatoms,” OrganicReactions, Vol. 27 (Wiley, New York, 1982), p. 9.

3. H.J. Carlsen et al. in “A Greatly Improveđ Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidations of Organic Compounds,” J Org. Chem., Vol. 46, No. 19, pp 3736-3738 (1981).

4. T. Chang, L.Z. Benet, M.F. Hebert, “The effect of water-soluble vitamin E on cyclosporine pharmacokinetics in healthy volunteers,” Clin. Phannacol. Ther., Vol.

59, pp. 297-303 (1996).

5.

6. E. Ehlinger, P. Magnus in “Silicon in synthesis. 10. The (trimetliylsilyl)allyl anion: A p-acyl anion equivalent for the conversion of aldehydes and ketones into y- lactonesAm. Chem. Soc., Vol. 102, No. 15, pp. 5004-5011 (1980).

7. D.S. Fruman, C.B. Klee, B.E. Bierer, S J. Burakoff, “Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK506 and cyclosporin A,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 3686-90 (1992).

8. Granelli-Pipemo, L. Andrus, R.M. Steinman, “Lymphokine and nonlymphokine mRNA levels in stimulated human cells: kinetics, mitogen requirements, and effects of cyclosporin A,” J. Exp. Med., Vol. 163, p. 922 (1986).

9. J.R. Hanson, “The Protection of Alcohols,” Protecting Groups in Organic Synthesis, CL 2, pp. 24-25 (Sheffield Academic Press, Sheffielđ, England, 1999).

10. M.F. Hebert, J.P. Roberts, T. Prueksaritanont, L.Z. Benet, “Bioavailability of cyclosporin with concomitant rifampin administration is markedly less than predicted by hepatic enzyme induction,” Clin. Phannacol. Ther., Vol. 52, pp. 453-7 (1992).

11. R.W. Hof&nann, H.-J Zei, “Stereoselective synthesis of alcohols. 8. Diastereoselective synthesis of P-methylhomoallyl alcohols via crotylboronates,” J. Org. Chem., Vol. 46, pp. 1309-1314 (1981).

12. P.F. Hurđlik and D. Peterson in “Stereospecific Olefm-Forming Elimination Reactions of p-Hydroxysilanes,” J. Am. Chem. Soc., Vol. 97, No. 6, pp. 1464-1468 (1975).

13. Y. Ikeda, J. Ukai, N. Ikeda, H.Yamamoto, “Stereoselective synthesis of (Z)- and (E)-l,3-alkadienes from aldehydes using organotitanium and lithium reagents,” Tetrahedron, Vol. 43, No. 4, pp. 723-730 (1987).

14. Kobel et al., Europ. J. Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 14, pp. 237-240 (1982).

15. M.T. Reetz in Organotitanium Reagents in Organic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), pp. VH, 148-149, ahđ 164-165.

16. Rich et al., J Med. Chem., Vol. 29, p. 978 (1986).

17. J. McMurry, Organic Chemistry, 5* Ed. (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), pp. 780-783.

18. S.L. Schreiber, G.R. Crabtree, “The mechanism of action of cyclosporin A and FK506,” Immunol. Today, Vol. 13, pp. 136-42 (1992).

19. Sketris, R. YatscofF, P. Keown, D.M. Canafax, M.R. First, D.W. Holt, TJ. Schroeder, M. Wright, “Optimizing the use of cyclosporine in renal transplantation,” Clin. Biochem., Vol. 28, pp. 195-211 (1995).

20. M.B. Smith and J. March, March ’s Advanced Organic Chemistry (Wiley, New York, 2001), pp. 144-147.

21. Streitvrieser, C. H. Heathcock, Iniroduction to Organic Chemistrp, 2nd ed. (Macmillan, New York, 1981), pp. 845-846.

22. JA. Thliveris, R.W. Yatscoff, M.P. Lukowski, K.R. Copeland, J.R. Jeffery, G.F. Murphy, “Chronic ciclosporin nephrotoxicity: A rabbit model,” Nephron. Vol. 57, pp. 470-6 (1991).

23. J.A. Thliveris, R.W. Yatscoff, M.J. Mihatsch, “Chronic cyclosporine-induced nephrotoxicity: A rabbit model,” Transplantation, Vol. 57, pp. 774-6 (1994).

24. S. E. Thomas in Organic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), pp. 84-87.

25. Traber et al., Helv. Chim. Acta, Vol. 60, pp. 1247-1255 (1977).

26. Traber et al., Helv. Chim. Acta, Vol. 65, pp. 1655-1667 (1982).

27. D.S. Tsai, D.S. Matteson, “A stereocontrolled synthesis of (Z) and (E) terminal dienes frompinacol (E)-l-trimethylsilyl-l-propene-3-boronate,” Tetrahedron Letters, Vol. 22, No. 29, p. 2751-2752 (1981).

28. H.A. Valantine, J.S. Schroeder, “Recent advances in cardiac transplantation” [editorial; comment], N. Engl. J. Med., Vol. 333, No. 10, pp. 660-1 (1995).

29. von Wartburg et al., Progress in Allergy, Vol. 38, pp. 28-45 (1986).

30. Wenger, Transpl. Proc., Vol. 15, Suppl. 1, p. 2230 (1983).

31. Wengev,Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 24, p. 77 (1985).

32. Wenger, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Vol. 50, p. 123 (1986).

33. U.S. Pat. No. 4,108,985.

34. U.S. Pat. No. 4,160,452.

35. U.S. Pat. No. 4,210,581.

36. U.S. Pat. No. 4,220,641.

37. U.S. Pat No. 4,256,108.

38. U.S. Pat No. 4,265,874.

39. U.S. Pat. No. 4,288,431.

40. U.S. Pat No. 4,384,996.

41. U.S. Pat. No. 4,396,542.

42. U. S. Pat No. 4, 554, 351.

43. U.S. Pat No. 4,771,122.

44. U.S. Pat No. 5,284,826.

45. U.S. Pat No. 5,525,590.

46. European Patent Publication No. 0 034 567.

47. European Patent Publication No. 0 056 782.

48. Eitemational Patent Publication No. WO 86/02080.

49. International Patent Publication No. WO 99/18120.

Prikaz svakog od gore pomenutih patenata, patentnih prijava i izdanja na koje se ovaj tekst poziva, je ovde naveden kompletnom referencom.

POREKLO OBLASTI PRONALSKA

Derivati ciklosporina čine klasu cikličnih polipeptida, koji imaju po jedanaest aminokiselina, i proizvode ih gljive vrste Tohpocladmm inflatum Gams. kao sekundarne metabolite. Zapaženo je da reversibilno inhibiraju imunokompetentne limfocite, pogotovo T limfocite, Go ili Gj fazi ćelijskog ciklusa. Takodje je primećeno da derivati ciklosporina reversibilno inhibiraju produkciju i oslobadjanje limfokina (Granelli-Pipernc i sar., 1986). lako je broj ciklosporinskih derivata poznat, prevashodno je ciklosporin A u najširoj upotrebi. Supresivni efekti ciklosporina A su povezani sa inhibicijom niza reakcija koje slede nakon aktivacije Tćelija. Ova supresija se postiže vezivanjem ciklosporina za ubikvitarni unutarćelijski protein, ciklofilin. Zauzvrat ovaj kompleks inhibira kalcijum-zavisnu i kalmodulin-zavisnu serin- treonin fosfataznu aktivnost enzima kalcineurina. Inhibicija kalcineurina sprečava aktivaciju transkripcionih faktora kao sto je NFATP/C i NF-kB, a koji su neophodni za indukciju gena za citokine (IL-2, ]FN-y, 1L-4 i GM-CSF) u toku aktivacije T ćelije. Ciklosporin takodje inhibira produkciju limfokina od strane T helper ćelija vitro i zaustavlja sazrevanje CD8 i CD4 T ćelija u timusu (Granelli-Pipemo i sar., 1986). U druge in vitro osobine ciklosporina se ubrajaju i inhibicija T limfocita koji produkuju IL-2 i citotoksičnih T limfocita, inhibicija IL-2 oslobodjenog iz aktiviranih T ćelija, inhibicija mirujućih T limfocita u odgovoru na aloantigen i egzogene limfokine, inhibicija produkcije IL-1, i inhibicija aktivacije T limfocita koji produkuju IL-2, sa mitogenom (Granelli-Piperno i sar., 1986).

Ciklosporin ima snažno imunosupresivno delovanje, za koje je pokazano da suprimira humoralnu imunost i ćelijske imunske reakcije, kao sto je odbacivanje alokalema, kasna preosetljivost, eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, artritis izazvan Frojndovim adjuvansom i bolest kalem protiv domaćina. Korišćen je u profilaksi odbacivanja transplantiranog organa; u lečenju reumatoidnog artritisa; u lečenju psorijaze; i u lečenju drugih autoimunskih oboljenja, kao stoje dijabetes tipa I, Kronova bolest, lupus i tome slično.

Još od prvobitnog otkrića ciklosporina, izolovano je i identifikovano mnoštvo ciklosporina, iz širokog spektra koji su prisutni u prirodi, kao i mnoga druga jedinjenja iz ove klase koja nisu prisutna u prirodi, dobijena su postupcima koji su potpuno ili semi-sintetski, ili primenom tehnike modifikovanih kultura. Klasa jedinjenja koju čine ciklosporini je dakle u današnje vreme pozamašna i uključuje, na primer, ciklosporine A do Z prisutne u prirodi [c.f. Traber i sar., (1977); Traber i sar., (1982); Kobel isar., (1982); i von Warburg i sar., (1986)], kao i različite derivate ciklosporina koji nisu prisutni u prirodi, i veštačke ili sintetske ciklosporine uključujući dihidro- i izo-ciklosporine; derivatizovane ciklosporine (npr., u kojima je 3'-0-atom iMeBmt ostatka acilovan ili je uveden novi supstituent na a-ugljenikovom atomu sarkozil ostatka na poziciji 3); ciklosporini u kojima je -MeBmt- ostatak prisutan u izomernom obliku (npr., u kojima je konfiguracija na pozicijama 6' i 7' -MeBmt-ostatka cis pre nego trans); i ciklosporini u kojima su varijabilne aminokiseline ubačene na specifičnim pozicijama unutar peptidne sekvence, upotrebom npr., u potpunosti sintetskog postupka za dobijanje ciklosporina, koji je razvio R. Wenger - vidi npr.,

Traber i sar., (1977), Traber i sar., (1982) i Kobel i sar., (1982); američki patenti pod brojevima 4,108,985, 4,210,581, 4,220,641,4,288,431, 4,554,351 i 4,396,542; objave evropskih patenata pod brojevima 0 034 567 i 0 056 782; medjunarodne objave patenta br. WO 86/02080; Wenger (1983); i

Wenger (1986). Analozi ciklosporina A koji sadrže modifikovane aminokiseline na poziciji 1 su saopšteni kod Rich i sar., (1986). Analozi ciklosporina A sa imunosupresivnim, anti- inflamatornim i anti-parazitarnim delovanjem su opisani u američkim patentima br. 4,384,996, 4,771,122, 5,284,826; i 5,525,590, svi preneti na Sandoz. Dodatni analozi ciklosporina su navedeni u WO 99/18120, preneti na Isotechnika. Pojmovi Ciclosporin, ciklosporin, cyclosporine i Cyclosporine imaju isto značenje i odnose se na ciklosporin.

Brojna su nepovoljna delovanja terapije ciklosporinom A, kao što su nefrotoksičnost, hepatotoksičnost, kataraktogeneza, hirzutizam, parateza i hiperplazija gingiva, pomenuli smo samo neke (Sketris i sar., 1995). Od pomenutih najozbiljniji je nefrotoksični efekat, od dozno zavisnih nepovoljnih efekata koji prate primenu ciklosporina A. Lekovi koji trenutno oslobadjaju ciklosporin A (npr., Neoral® i Sandimmune®) mogu da prouzrokuju nfrotoksične efekte i druge toksične sporedne (prateće) efekte zbog njihovog brzog oslobadjanja i apsorpcije visoke koncentracije leka u krvi. Postulirano je da su maksimalne koncentracije leka povezane sa sporednim efektima (Bennett, 1998). Nije poznat precizan mehanizam po kom ciklosporin A dovodi do oštećenja bubrega; medjutim, ponudjeno je objašnjenje da povećanje nivoa vazokonstriktivnih supstanci u bubregu dovodi do vazokonstrikcije.aferentnih arteriola glomerula. Ovo može da ima za posledicu renalnu ishemiju, smanjenje brzine filtracije u glomerulu i u toku dužeg vremenskog perioda, intersticijalnu fibrozu. Kada se doza smanji ili kada se zameni sa nekim drugim imunosupresivom, bubrežna funkcija se poboljšava (Valantine i Shroeder, 1995).

Prema tome, postoji potreba za lekovima sa imunosupresivnim delovanjem koji su efikasni,a imaju smanjenu toksičnost.

Analozi ciklosporina koji sadrže modifikovane aminokiseline na poziciji 1 su prikazani u WO 99/18120, koji je dodeljen zastupniku ove prijave i ovde je naveden u celini. Takodje je dodeljena sadašnjem nosiocu prava američka patentna prijava br. 60/346,201, u kojoj su prijavioci naveli naročito poželjan analog ciklosporina A, pod nazivom "ISAtx247". Ovaj analog je strukturno identičan ciklosporinu A izuzev modifikacije 1-aminokiselinskog ostatka.

Prijavioci su otkrili da odredjene smeše cis i trans izomera ISATx247 su pokazale kombinaciju pojačanog delovanja, i/ili smanjene toksičnosti u odnosu na poznate ciklosporine koji su prisutni u prirodi. Takodje su opisani odredjeni alkilovani, arilovani i deuterijumom obeleženi derivati ISAtx247.

Karakteristično je da, smeše koje su opisane u američkoj patentnoj prijavi pod brojem 60/346,201 sadrže od približno 10 do 90 masenih procenata trans-izomera i oko 90 do 10 masenih procenata cA-izomera; u drugom izvodjenju, smeša sadrži oko 15 do 85 masenih procenata /ram>-izomera do oko 85 do 15 procenata cis -izomera; u drugom izvodjenju, smeša sadrži oko 25 do 75 masenih procenata trans-izomera do oko 75 do 25 masenih procenata cis- izomera; u drugom izvodjenju, smeša sadrži oko 35 do 65 masenih .procenata trans-izomera i oko 65 do 35 masenih procenata cis-izomera; u drugom izvodjenju, smeša sadrži oko 45 do 55 masenih procenata trans-izomera i oko 55 do 45 masenih procenata cis-izomera; u drugom izvodjenju, smeša izomera je smeša 1SAtx247 koja se sastoji od oko 45 do 50 masenih procenata trans-izomera i oko 50 do 55 masenih procenata cis-izomera. Ovi maseni procenti se odnose na ukupnu masu smeše. Drugim rečima, smeša bi mogla da sadrži 65 masenih procenata (E)- izomera i 35 masenih procenata (Z)-izomera, ili obrnuto. Po alternativnoj nomenklaturi, cis- izomer se takodje može opisati kao (Z)-izomer, a trans-izomer se može obeležavati kao (E)- izomer.

Na osnovu svega iznetog, jasno je da u ovom domenu postoji potreba da se pronadju postupci za dobijanje i pripremanje ciklosporinskih analoga, podrazumevajući izomere 1SAt\'247. Neophodni su sintetski putevi preko kojih je moguće dobiti obogaćene kompozicije pojedinačnih izomera, kao i smeše izomera koje imaju željeni odnos dva izomera. Takodje se traga za postupcima za dobijanje derivata 1SAjx247.

PRIKAZ PRONALASKA

Ciklosporin i ciklosporinski analozi pripadaju klasi cikličnih polipeptida koji imaju snažno imunosupresivno delovanje. Uprlcos prednostima koje ovi lekovi nude, u odnosu na njihovo imunosupresivno, anti-inflamatorno i anti parazitsko delovanje, postoje brojni nepovoljni efekti koji prate terapiju ciklosporinom A, a to su pored ostalog nefrotoksično i hepatotoksično delovanje. Prema tome, postoji potreba da se pronadju nova sredstva sa imunosupresivnim delovanjem koja zadržavaju farmakološku aktivnost kao u prirodi prisutno jedinjenje ciklosporin A, ali bez jednog ili više toksičnih sporednih efekata, koji prate ciklosporinsku terapiju.

U izvodjenjima ovog pronalaska obezbedjen je prikaz odredjenih smeša cis i trans - izomera analoga ciklosporina A, koje su farmakološki delotvorne. Na poželjni analog se u tekstu poziva preko naziva ISAtx247. Smeše ISAtx247 izomera su pokazale kombinaciju poboljšane delotvornosti i smanjenih toksičnih efekata, koji prate terapiju ciklosporinima koji su prisutni u prirodi, a za koje se danas zna.

Ovaj pronalazak se zasniva, delimično, na otriću da odredjene smeše izomera analoga ciklosporina ispoljavaju veće imunosupresivno delovanje, a ne ispoljavaju jedan ili više nepovoljnih efekata koji prate primenu ciklosporina A. A pogotovo, mi smo neočekivano našli da smeše izomera (tj., smeše kako cis, tako i trans-izomera) koje variraju od oko 10:90 do 90:10 (trans- prema cis-) analoga ciklosporina modifikovanih na 1-aminokiselinskom ostatku, obezbedjuju veću efikasnost i bezbednost. Primeri za ovakve analoge su opisani u WO 99/18120 i čine ih deuterijumom obeležena i neobeležena jedinjenja. Pogotovo, za smeše iz opsega od oko 45:50 do oko 50:50 (trans- prema cis-) i iz opsega od približno 50 % do približno 55 % trans- i približno 45 % do približno 50 % cis-, je nadjeno da posebno efikasne. Šta više, pokazano je da ove smeše izomera imaju jače delovanje kombinovano sa smanjenim toksičnim efektima, koji prate terapiju ciklosporinima i derivatima ciklosporina koji su prisutni u prirodi, a za koje se danas zna.

Naročito poželjan analog (na koji se u ovom tekstu poziva preko " ISAtx247") je strukturno sličan ciklosporinu A izuzev modifikovane funkcionalne grupe na periferiji molekula, na mestu 1-aminokiselinskog ostatka. Struktura upravo ovog izomernog analoga u poredjenju sa strukturom ciklosporina A je:

Smeše izomera mogu da se koriste, pored ostalog, za imunosupresiju i zbrinjavanje različitih imunoloških poremećaja, oboljenja i stanja, kao i za prevenciju, kontrolu, ublažavanje i lečenje istih.

Prema izvodjenjima ovog pronalaska, ISATx247 izomeri (i od njih izvedeni derivati) su dobijeni preko stereoselektivnih puteva sinteze koji mogu da se razlikuju u stepenu stereoselektivnosti. Preko stereoselektivnih puteva dobijaju se kompozicije koje su obogaćene bilo (E)- bilo (Z)-izomerima, i ove kompozicije mogu da se kombinuju tako da na taj način nastala smeša ima željeni odnos dva izomera. S druge strane, uslovi reakcije koja se odvija preko stereoselektivnog puta se mogu skrojiti tako da proizvedu željeni odnos direktno u dobijenoj smeši. Procenat zastupljenosti jednog izomera ili drugog u smeši se može proveriti spektroskopijom smeše nuklearnom magnetnom rezonancijom (NMR) ili drugim tehnikama koje su poznate u ovom domenu.

Svaki od puteva preko kojih se vrši sinteza, započinje uvodjenjem grupe za zaštitu na osetljivu alkoholnu funkcionalnu grupu. U jednom izvodjenju alkohol je zaštićen u obliku acetata; u drugim izvodjenjima grupe za zaštitu su estri benzoata ili silil etri. Iako se acetatane grupe uobičajeno upotrebljavaju za zaštitu, važno je napomenuti da u mnogim izvodjenjima koja su navedena kao primeri, a ovde su opisana, dešavaju se odredjene neželjene sporedne reakcije u kojima učestvuje acetatna grupa za zašttitu, a koje se mogu izbeći korišćenjem nekih drugih grupa za zaštitu kao što su estri benzoata ili silil etri.

Zaštićeno jedinjenje može onda da posluži kao prekursor velikog broja različitih stereoselektivnih puteva sinteze uključujući neke koji sadrže realctante koji imaju fosfor u Wittig-ovoj reakciji i neorganske elemente kao organometalna jedinjenja. Drugi pomenuti tip može da se vrši preko prelaznog stanja šestočlanog prstena, gde prostorna smetnja odredjuje ishodnu konfiguraci ju. Mnoga organometalna jedinjenja su dostupna, uključujući i ona ko jasadrže neorganske elemente poput bora. silicijuma, titanijuma. litijuma i sumpora. Pojedinačni izomeri se mogu dobiti od jednog polaznog ili više polaznih jedinjenja.

Odnos izomera (E) prema (Z) u ma kojoj smeši, bilo da je nastala stereoselektivnim ili nestereoselektivnim putem može da ima širok opseg vrednosti. Na primer. smeša može da se sastoji od približno 10 do 90 procenata izomera (E) do približno 90 do 10 procenata izomera (Z). U drugim izvodjenjima. smeša može a sadrži od oko 1 5 do 85 masenih procenata izomera (E) i približno 85 do 15 procenata izomera (Z); u drugom izvodjenju, smeša sadrži oko 25 do 75 masenih procenata izomera (E) i oko 75 do 25 masenih procenata izomera (Z); u drugom izvodjenju, smeša sadrži oko 35 do 65 masenih procenata izomera (E) i oko 65 do 35 masenih procenata izomera (Z); u drugom izvodjenju, smeša sadrži oko 45 do 55 masenih procenata izomera (E) i oko 55 do 45 masenih procenata izomera (Z). U drugom izvodjenju, smeša izomera je smeša 1SATX247 koja se sastoji od približno 45 do 50 masenih procenata izomera (E) i približno 50 do 55 masenih procenata izomera (Z). Ovi maseni procenti se izračunavaju u odnosu na ukupnu masu kompozicije i podrazumevaće se da je suma masenih procenata izomera (E) i izomera (Z) je 100 masenih procenata. Drugim rečima, smeša bi mogla da sadrži 65 masenih procenata izomera (E) i 35 masenih procenata izomera (Z), ili obrnuto.

Sa jednog gledišta, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja se sastoji od smeše izomera analoga ciklosporina modifikovanog na 1-aminokiselinskom ostatku gde se opseg sastava smeše izomera kreće od oko 10:90 do oko 90:10 (trans- prema cis-). Poželjna kompozicija (na koju se ovde poziva kao na "ISAtx247") se sastoji od smeše izomera E i Z:

Propisno, smeša izomera se sastoji od oko 10 % do oko 90 % izomera E i od oko 90 % do oko 10 % izomera Z; poželjno je da, smeša sadrži oko 15 % do oko 85 % izomera E i oko 85 % do oko 15 % izomera Z; poželjnije je da smeša sadrži oko 25 % do oko 75 % izomera E i oko 75 % do oko 25 %5 izomera Z; još poželjnije je da, smeša sadrži oko 35 % do oko 65 % izomera E i

oko 65 % do oko 35 % izomera Z; opet, još poželjnije je da, smeša sadrži oko 45 % do oko55 %izomera E i oko 55 % do oko 45 % izomera Z. U najpoželjnijim izvodjenjima, smeša izomera može da predstavlja smeše ISAtx247 koje sadrže: oko 45 do oko 50 % izomera E i oko 55 do 50 % izomera Z; oko 55 do oko 65 % izomera E i oko 35 do 45 % izomera Z; oko 65 % do oko 75 % izomera E i oko 25% do 35 % izomera Z; oko 75 % do oko 85 % izomera E i oko 15% do 25 % izomera Z; oko 85 % do oko 90 % izomera E i oko 10 % do 15 % izomera Z. Još su poželjne smeše izuomera koje se sastoje od oko 75 % do oko 65 % izomera Z i oko 25 % do oko35 % izomera E, i oko 65 % do 55 % izomera Z i oko 35 % do oko 25 % izomera E. (Procenti izražavaju maseni udeo).

Sa drugog stanovišta, pronalazak se bavi farmaceutskim kompozicijama koje sadrže smešu izomera analoga ciklosporina kao stoje to gore opisano i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Poželjno je daje smeša izomera analoga, smeša ISAjx247 izomera.

Još jedan aspekt pronalaska je postupak kako se proizvodi imunosupresivni efekat, koji se sastoji od primene efektivne količine smeše izomera analoga ciklosporina kako je gore opisano, ili kompozicije koja sadrži smešu izomera analoga, na životinju kod koje postoji potreba za terapijom. U poželjnom izvodjenju, smešu predstavlja smeša ISAtx247 izomera. Postupak može da se koristi za lečenje ili ublažavanje odbacivanja transplantata, autoimunske bolesti ili stanja, ili inflamatornog oboljenja ili stanja.

Opet, još jedan aspekt pronalaska jeste daje on usmeren na postupak za smanjivanje toksičnog delovanja imunosupresivnog analoga ciklosporina pripremanjem smeše izomera analoga koja ima da se koristi kao imunosupresivno sredstvo. U poželjnom izvodjenju, smešu predstavlja smeša ISAtx247 izomera.

U jednom od mnogih aspekata, pronalazak je usmeren na dobijanje postupka kojim bi se povećala delotvornost imunosupresivnog analoga ciklosporina pripremanjem smeše izomera analoga koja treba da se koristi kao imunosupresivno sredstvo. U poželjnom izvodjenju, smešu predstavlja smeša ISAtx247 izomera.

Još jedan aspekt pronalaska su i postupci za sintezu smeša izomea analoga.

KRATAK OPIS SLIKA

Na SL. 1A prikazana je struktura ciklosporina A, na kojoj se vidi 11 aminokiselinskih ostataka koji ulaze u sastav prstena cikličnog peptida molekula, kao i struktura bočnog lanca 1- aminokiselinskog ostatka;

Na SL. 1B vidi se još jedan prikaz struktureciklosporina A sa posebno naglašenom definicijom pojma "CsA" koji se koristi u ovom opisu;

Na SL. 2 A prikazana je struktura izomera E (ili trans-izomera) analoga ciklosporina A pod nazivom ISAtx247;

Na SL. 2B prikazana je struktura izomera Z (ili m-izomera) analoga ciklosporina A 1SAtx247;

SL. 3 prikazuje pregled modela puteva sinteze preko kojih je moguće dobijanje analoga ciklosporina koji su navedeni u ovom pronalasku, gde su stereoselektivni putevi grupisani prema uslovima reakcije;

Na SL. 4 prikazanje put sinteze preko kojeg se dobija smeša izomera (E) i (Z) ISAtX247 od bromiranog prekursora;

Na SL. 5 prikazanje put sinteze preko kojeg se dobija smeša izomera (E) i (Z) ISATX247 od prekursora koji je aldehid;

Na SL. 6 prikazanje model šeme stereoselektivne reakcije koja može da se koristi za dobijanje kompozicije obogaćene sa bilo (E), bilo (Z) izomerom ISATX247, pri čemu je oba izomera moguće dobiti od istog prekursora koji je alkohol;

Na SL. 7 je prikazana alternativna šema reakcije stereoselektivne sinteze kompozicije obogaćene ISA-rX247 izomerom (Z);

Na SL. 8 je prikazana alternativna šema reakcije stereoselektivne sinteze kompozicije obogaćene ISATX247 izomerom (E);

Na SL. 9A prikazanje model puteva sinteze za dobijanje smeše ISAtx247 izomera (E) i (Z), pri čemu se prvo dobijaju kompozicije obogaćene jednim od dva izomera, a zatim se mešaju prema odgovarajućem prethodno utvrdjenom odnosu, da bi postigli željeni odnos izomera u sastavu smeše;

Na SL. 10 prikazanje model stereoselektivnih puteva za dobijanje smeše ISATX247 izomera (E) i (Z), pri čemu se prvo dobijaju kompozicije obogaćene jednim od dva izomera, a zatim se mešaju prema odgovarajućem prethodno utvrdjenom odnosu, da bi postigli željeni odnos izomera u sastavu smeše;

SL. 11 prikazuje rezultate ispitivanja, kojim se odredjuje inhibicija fosfatazne aktivnosti kalcineurina, iz kojih se vidi daje delovanje ISATX247 (45-50 % izomera E i 50-55 % izomera Z) i do 3 puta snažnije (odredjeno kao IC50) u odnosu na ciklosporin A;

SL. 12 nudi strukturu i kompoziciju izomera nekih deuterijumom obeleženih i neobeleženih smeša izomera analoga;

Na SL. 13 prikazani su rezultati ispitivanja u kojem je odredjivana inhibicija fosfatazne aktivnosti kalcineurina, iz kojih se vidi daje inhibicija pod uticajem različitih deuterijumom obeleženih i neobeleženih smeša izomera analoga bar jednako snažna (odredjeno kao IC50) u odnosu na ciklosporin A.

MOGUĆNOSTI ZA IZVODJENJE PRONALASKA

Sinteza

Ciklosporin i njegovi analozi pripadaju klasi cikličnih peptida koji imaju snažno imunosupresivno delovanje. Uprkos brojnim prednostima koje ovaj lek nudi, tu se pre svega misli na njegovo imunosupresivno, anti-inflamatorno i anti-parazitsko delovanje, zna se za mnoge nepovoljne efekte koji prate terapiju ciklosporinom A, medju kojima su nefrotoksični i hepatotoksični efekti. Prema tome, postoji potreba za novim sredstvima sa imunosupresinim delovanjem koji bi bili u najmanju ruku jednako farmakološki aktivni koliko i ciklosporin A, supstanca koja je prisutna u prirodi, ali bez sporednih toksičnih efekata.

Apikanti su prethodno prikazali i objasnili analog ciklosporina A, koji nosi naziv "ISAtx247". Ovaj analog je strukturno sličan ciklosporinu A izuzev modifikacije na 1- aminokiselinskom ostatku. Prijavioci

su otkrili da su odredjene smeše cis- i trans-izomera ISATx247 pokazale novu karakteristiku u odnosu na ciklosporine prisutne u prirodi i one koji su do danas poznati, a loje kombinacija pojačane delotvornosti i umanjenih toksičnih delovanja.

Prema izvodjenjima ovog pronalaska, izomeri ISATx247 (i od njih izvedeni derivati) su sintetisani preko stereoselektivnih puteva, i stepen stereoselektivnosti se može menjati i podešavati. Reakcijama preko stereoselektivnih puteva moguće je proizvesti kompozicije koje su obogaćene sa bilo (E), bilo (Z)-izomerima, a ove kompozicije je moguće kombinovati tako da finalna smeša sadrži izomere u željenom odnosu. Ili, druga mogućnost je, da se uslovi reakcije koja se odvija preko stereoselektivnog puta podešavaju tako da se direktno dobijaju smeše sa željenim udelom izomera u sastavu.

Jedan analog ciklosporina sa imunosupresivnim delovanjem koji je naveden u ovom pronalasku, nazvan ISATx247, nosi hemijski naziv ciklo{{(E,Z)-(2S,3R,4R)-3-hidroksi-4-metil- 2-(metilamino)-6,8-nonadienoil}-l-2-aminobutiril-N-metil-glicil-N-metil-L-leucil-L-valil-N- metil-L-leucil-L-alanil-D-alanil-N-metil-L-leucil-N-metil-L-leucil-N-metil-L-valil}. Njegova empirijska formula galsi C63EI11 lNnCfi? i ima molekulsku masu od 1214,85. Izraz " ISATx247" je komercijalna oznaka koja je dodeljena ovom farmakološki aktivnom jedinjenju.

Struktura ISAtx247 je potvrdjena prvobitno spektroskpski nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR). Spektri kako 'H, tako i bC su odredjeni u dve serije eksperimenata, sa jednodimenzionalnom i sa dvodimanzionalnom NMR, i poredjenjem sa poznatim NMR spektrima ciklosporina. Apsolutni položaj siganala ISAtx247 izomera (E) i (Z) je potvrdjen eksperimentima uz pomoć nuklearnog Overhauser efekta (NOE). Dodatne analize koje su potvrdile strukture ovih jedinjenja su masena spektroskopija, koja je potvrdila molekulsku masu, i infracrvena spektroskopija, stoje potvrdilo daje struktura ovih jedinjenja veoma slična strukturi ciklosporina A. Drugi rezultat je bio očekivan, kada se uzme u obzir sličnost izmedju dva jedinjenja.

Struktura ciklosporina je prikazana na slici 1 A. Struktura pođrazumeva identifikaciju 11 aminokiselinskih ostataka koji grade prsten cikličnog peptidnog molekula. Ovih 11 aminokiselinskih ostataka su obeleženi brojevima tako da brojevi rastu u smeru kretanja kazaljke na satu, počinjući od aminokiseline centralno na vrhu prstena (i identifikovana sa oznakom preko koje se na nju poziva u tekstu "1-aminokiselina"). Prva aminokiselina je prikazana uokvirena sa isprekidanom linijom radi lakšeg razumevanja. Bočni lanac 1-aminokiselinskog ostatka je izvučen hemijski, budući da se na ovoj poziciji odvijaju pomenute reakcije na putu sinteze krajjeg produkta.

Po konvenciji, ugljenik koji je vezan za peptidnu karbonil grupu je obeležen kao a-ugljenik, sa susednim ugljenicima koji su obeleženi ostalim slovima grčkog alfabeta u smeru niz lanac, a udaljavajući se od peptidnog prstena. U slučaju cilosporina A, kao stoje to prikazano na SL. 1 A. (3-ugljenik u bočnom lancu je vezan za karboksilnu grupu i tu postoji dvostruka veza sa cis- orijentacijom izmedju e i g-ugljenika u bočnom lancu.

Još jedan prikaz strukture ciklosporina A je dat na SL. 1B, na kojoj se vidi drugi deo molekula u isprekidanom linijom uokvirenom polju. Ova slika odredjuje nomenklautrukoja će se koristiti u ovom opisu, i gde se oznaka "CsA" odnosi na deo molekula ciklosporina A koji je uokviren. Ova nomenklatura obezbedjuje skraćenice, simbole koji predstavljlaju region u kom se vrše ovde pomenute reakcije sinteze (tj., bočni lanac 1-aminokiselinskog ostatka, koji je prikazan van uokvirenog polja na SL. 1B), bez potrebe da se ponovo prikazuje ostatak molekula, svaki put kada učestvuje u reakciji. Za one koji su u struci biće očigledno daje veza izmedju a i p~ ugljenika u bočnom lancu normalne dužine i predimenzionirana je samo na ovoj slici, da bi pratila defmicju oznake "CsA".

Kao što je gore opisano, posebno poželjan analog ciklosporina A nosi naziv ISAtx247 i njegova dva stereoizomera E (ili trans) i Z (ili cis) su prikazani na odgovarajućim slikama SL. 2A, odnosno 2B. Cis i trans priroda ovih stereo izomera se odnosi na kongiguraciju dvostruke veze izmedju e i č-ugljenika u bočnom lancu; tj., dvostruka veza koja je bliža peptidnom , prstenu, nasuprot dvostrukoj vezi koja je na kraju lanca.

Nekoliko reči povodom stereohemijske nomenklature. U ovom opisu izrazi cis i (Z) se koriste tako da na svakom mestu u tekstu mogu da zamene jedan drugog, isto važi i za izraze trans i E. Korišćenje pojmova "eritro" i "treo" će biti svedeno na najmanju moguću meru, zbog očigledne konfuzije oko njihovog značenja. Vidi kod R.W. Hoffmann i H.-j Zei u "Stereoselective Synthesis of Alcohols 8. Diastereoselective Synthesis of P-Methylhomoallyl Alcohols via Crotvlboronates", J.Org.Chem., Vol. 46, pp. 1309-1314 (1981); A. Stzrreitvvieser i C.H. Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 2ncl ed. (Macrriillan, New York, 1981), pp.845-846; i M.B. Smith ii J. March, March's Advanced Organic Chemistry (Wiley, Nevv York,2001), pp. 144-147. U par slučajeva u ovom tekstu gde je korišćena treo/eritro terminologija poštovana je konvencija Streitwieser-a i Heathcock-a, po kojoj "eritro" izomeri odgovaraju (R,S9 i (S,R) konfiguracijama, a "treo" izomeri odgovaraju (R;R) i (S;S) konfiguracijama.

I poslednji komentar na temu nomenklature se odnosi na terminalnu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu koja je prikazana na slikama 2A i 2B. Po alternativnoj šemi brojanja, ugljenici u bočnom lancu 1-aminokiselinskog ostatka mogu da se broje počevši od terminalnog (9) ugljenika, pa nazad opet prema peptidnom prstenu. Po ovom sistemu ISAt.\247 izomeri se mogu smatrati 1,3-dienima prema konvencionalnoj nomenklaturi u organskoj hemij, gde je svaka dvostruka veza odredjena svojim ugljenikom sa nanjnižim brojem.

Sada ćemo diskutovati o putevima sinteze koji su prikazani na slikama 3-8. Prema izvodjenjima ovog pronalaska, smeše izomera je moguće dobiti direktno, ali se uslovi reakcije odredjenog puta sinteze moraju prilagodjavati tako da se postigne sastav smeše sa željenim odnosom izomera. Druga mogućnost je da se proizvedu kompozicije koje su obogaćene jednim od dva geometrijska izomera analoga ciklosporina A, te da se nakon toga dobijene kompozicije mešaju u odnosu koji je prethdno odredjen kako bi se dobila željena smeša.

Pregled puteva sinteze prema izvodjenjima ovog pronalaska je prikazan na SL. 3, gde je naročita pažnja posvećena grupisanju reakcija na osnovu tipa hemijskih reakcija i stereoselektivnosti. Pozivajući se na SL. 3, putevi sinteze koji idu preko Wittig-ovih reakcija su smešteni na desnoj strani dijagrama na šta ukazuje broj 31, dok putevi 32 i 33 koji podrazumevaju reakcije sa organomealnim reagensima za koje se smatra da u prelaznom stanju grade šestočlani prsten, nalaze se na sredini i sa leve strane dijagrama. Preko svakog od puteva sinteze moguće je dobiti smeše izomera, ili kompozicije obogaćene jednim od dva izomera.

U izvodjenjima ovog pronalaska opisano je mnoštvo različitih načina da se dodje do smeše izomera željenog sastava. Fleksibilnost i svestranost strategija za sintezu koje su ovde opisane se delimično odražavaju na simetričnost ili asimetričnost šeme na SL. 3. Reakcija koja je zajednička za sve puteve sinteze je zaštita, odnosno blokiranje funkcionalne grupe u ciklosporinu A 34; u ovom navedenom izvodjenju reakcija je prevodjenje ciklosporina A 34 u acetilciklosporin A 35. Asimetrija na SL. 3 je posledica toga daje nastali acetil siklosporin A aldehid 51 je prekursor za sve puteve u kojima reaguju organometalni reagensi sa titanijumom i litijumom, a samo za neke od puteva koji idu preko Wittig-ove reakcije, u kojima je reagens fosfor.

Dakle, sintetski putevi na SL. 3 u kojima se uslovi mogu menjati tako da se dobije smeša koja ima željeni odnos izomera, obuhvataju Wittig-ovu reakciju i reagense koji sadrže fosfor. Drugi stereoselektivni putevi koriste takodje i neorganske elemente, uglavnom u sastavu organometalnih reagenasa koji grade šestočlani prsten u prelaznom stanju gde sterna smetnja odredjujekonfiguraciju nastalog proizvoda reakcije. Postojanje velikog broja organometalnih reagenasa koji sadrže neorganske elemente kao što su bor, silicijum, titanijum, litijum i sumpor, korisno je za dati pronalazak.

Kompozicije obogaćene jednim ili drugim od para izomera moguće je dobiti od jednog istog prekursora.; druga mogućnost je da se proizvedu dve kompozicije od različitih polaznih reaktanata, U jednom od stereoselektivnih puteva SL. 3 (put 32), od jednog prekursora dobijajau se oba od dva izomera ISArx247, u zavisnosti od uslova reakcije koje smo primenili. U jednom drugom stereoselektivnom putu (put33) potrebna su dva različita prekursora da bi se dobila svaka od obogaćenih kompozicija.

Sada će detaljnije biti razmotrene reakcije prikazane na SL. 3. Reakcija koja je zajednička svakom od puteva sinteze je zaštita alkohola na p-poziciji bočnog lanca 1- aminokiselinskog ostatka. Ovakva šema za zaštitu se suočava sa problemom koji se često sreće kod organskih sinteza, gde je prva funkcionalna grupa modifikovana u reakciji kojom se želelo uticati na drugu (sličnu i/ili identičnu) funkcionalnu grupu koja se nalazi na drugom delu molekula. Da bi uspešno izvršili željenu modifikaciju, prva funkcionalna grupa reaguje sa grupom za zaštitu, željena reakcija se vrši na drugoj funkcionalnoj grupi, a zatim se uklanja grupa za zaštitu sa pve funkcionalne grupe.

Grupe za zaštitu su dobro poznate u oranskoj sintezi, i o njima je diskutovano kod J.R. Hanson u poglavlju 2, "The Protection of Alcohols", u okviru publikacije Protecting Groups in Organic Synthesis (Sheffield Academic Press, Sheffield, Englan, 1999), pp. 24-25. Hanson objašnjava kako da se zaštite hidroksilne grupe njihovim prevodjenjem u bilo estre, bilo etre. Acetatni estri su možda najčešće korišćeni za zaštitu hidroksilnih grupa. Postoji širok opseg uslova koje je moguće koristiti za uvodjenje acetatne grupe. Ovi reagensi i rastvarači obuhvataju acetatni anhidrid i piridin; acetatni anhidrid, piridin i dimetilaminopiridin (DMAP); acetatni anhidrid i natrijum acetat; acetatni anhidrid i toluen-p-sulfonska kiselinu, acetilhlorid, piridin i DMAP; i keten. DMAP je koristan katalizator reakcije acilovanja jer gradi veoma reaktivnu N- acilpiridinijum so od anhidrida.

U jednom izvodjenju ovog pronalaska, p-alkoholna grupa ciklosporina A 34 je zaštićena tako što je prevedena u acetat reakcijom 34 sa acetilhloridom, etilacetatom, ili njihovom kombinacijom, pri tom gradeći jedinjenje acetil ciklosporin A 35. U drugom izvodjenju (3- alkoholna grupa podleže nukleofilnoj adiciji sa acetatnim anhidridom, gradeći pri tom acetil ciklosporin A 35 i sirćetnu kislinu.Ove reakcije se mogu izvoditi u prisustvu dimetilaminopiridina (DMAP) gde višak acetatnog anhidrida deluje kao rastvarač. U ovim slučajevima prefiks "acetil" može da se koristi u nomenklaturi na čitavom putu sinteze, ili sve dok se acetil grupa ne ukloni. Na primer, poslednji intermedijer u jednom putu koji ima acetil grupu na [3-ugljeniku je nazvan "acetil-(E)-l,3-dien".

Iako je dobijanje acetil ciklosporina A detaljno opisano u literaturi, oni koji su stručni u ovom domenu će proceniti da se mogu koristiti i duge grupe za zaštitu (3-alkohola u 1 - aminokiselinskom ostatku ciklosporina A 34 pored acetatnih estara'. Medju ove zaštitne grupe se ubrajaju estri benzoata, supstituisani estri benzoata, etri i silil etri. Pod odredjenim uslovima reakcije, acetatna zaštitna grupa je sklona da podlegne neželjenim sporednim reakcijama kao što je eliminacija i hidroliza. Kako su estri benzoata, etri i silil etri često otporniji na takve sporedne reakcije pod tim istim uslovima reakcije, često je bolje primenjivati takve zaštitne grupe umesto acetata. Ciklosporin ili derivati ciklosporina koji su modifikovani acetil zaštitnom grupom ili bilo kojom drugom grupom za zaštitu se pominju kao "zaštićeni-ciklospprin A". Isto tako, krajnji intermedijer u putu koji je gore naveden kao primer bi bio nazvan "zaštićeni-(E)-l,3-dien" umesto "acetil-(E)-l,3-dien". Priroda odabrane zaštitne grupe bi mogla da ima uticaj na željeni redosled koraka reakcije koji slede.

Pozivajući se na SL. 3, acetil ciklosporin A 35 ima u ovom putu koji je naveden kao primer, zaštićeni (3—alkohol, a ovo jedinjenje služi kao prekursor u sintezi izomera ISATx247 u nekoliko puteva sinteze. Prvo će biti diskutovano o putevima koji idu preko Wittig-ove reakcije. Sinteza smeša ISAtx247 izomera (E) i (Z) Wittig-ovom reakcijom

Putevi koji sadrže Wittig-ovu reakcijuovde navedi za primer su identifikovani brojem 31 preko koje g se na ovu reakciju poziva u tekstu, na SL. 3. Postupak 1 uključuje bromni intermedijer acetil-r]-bromociklosporin 41, dok se u postupku 2 acetil ciklosporin A aldehid 51 kao polazna tačka.Dole opisani postupci navedeni za primer koriste Wittig-ovu reakciju za uvodjenje jedne alkenske funkcionalnosti sa smešom stereohemijskih konfiguracija.

Wittig-ova reakcija koja je koričćena u izvodjenjima ovde navedenim za primer, da bi sintetisali smeše ISAtx247 izomera E i Z se može takodje izvršiti i u prisustvu litijumhalida. Dobro je poznato da prisustvo litijum halida u Wittig-ovoj reakciji utiče na odnos geometrijskih izomera koji se dobijaju, te dodavanje takvog jedinjenja može da pomogne u dobijanju željenog sastava smeše ISAtx247 izomera (E) i (Z).

Postupak 1

U jednom izvodjenju ovog pronalska, smeša ISAtx247 izomera (E) i (Z) se dobija na način kako prikazjue SL. 4. Upotreba predstavljanja sa talasastom linijom na SL. 4 (naročito pogledaj jedinjenja 43 i 44) treba da označava reakcionu sekvencu koja je navedena za primer, a proizvodi smešu izomera (E) i (Z). U jednom izvodjenju procentni odnos dobijenih izomera (E) i (Z) varira od oko 10 do 90 procenata izomera (E) do oko 90 do 10 procenata izomera (Z), ali ovi opsezi su navedeni samo kao primer i moguće je proizvesti smeše sa mnogo drugih opsega. Na primer, smeša može da sadrži od oko 15 do 85 masenih procenata izomera (E) i oko 85 do 15 procenata izomera (Z). U drugim izvodjenjima, smeša sadrži oko 25 do 75 masenih proenata izomera (E) i oko 75 do 25 masenih procenata izomera (Z); oko 35 do 65 masenih procenata izomera (E) i oko 65 do 35 masenih procenata izomera (Z); i oko 45 do 55 masenih procenata izomera (E) i oko 55 do 45 procenata izomera (Z). U drugom izvodjenju, smeša izomera je ISAtx247 smeša koja se sastoji od 45 do 50 masenih procenata izomera (E) i oko 50 do 55 masenih procenata izomera (Z). Ovi maseni procenti su izraženi na ukupnu masu kompozicije, i podrazumevaće se da suma masenih procenata izomera (E) i (Z) iznosi 100 masenih procenata. Drugim rečima, smeša može da sadrži 65 masenih procenata izomera (E) i 35 masenih procenata izomera (Z), ili obrnuto.

Prema SL. 4, terminalni r|-ugljenik bočnog lanca 1-aminokiselinskog ostatka acetil ciklosporina A reaguje sa bromom u sledećem koraku reakcije refluktovanjem acetil ciklosprina A 35 sa N-bromosukcinimidom i azo-bis-azobutironitrilom u rastvaraču kao što je ugljenik tetrahlorid, proizvodeći intermedijerni acetil-r]-bromociklosporin A 41. N-bromosukcinimid je reagens koji se često koristi da bi zamenili ali Ine vodonike sa bromom, i smatra se da se ova reakcija dešava po mehanizmu slobodnih radikala. Dobijanje intermedijera 41 je u osnovi opisano kod iM.K.Eberle i F. Nuninger u "Synthesis of the Main Metabolite (OL-17) of Cyclosporin A" J. Org.Chem., vol.57, pp. 2689-2691 (1992).

Novi intermedijer trifenilfosfonijum bromid acetil ciklosporina A 42 moguće je dobiti od acetil-r|-bromociklosporina A 41 zagrevanjem druge nabrojane supstance sa trifenilfosfmom u rastvaraču kao što je toluen.

Novonastali intrmadijer 42, kao i drugi poput njega, se smatra daje ključni intermedijer u sintezi mnoštva analoga ciklosporina A koj sadrži konjugovani sistem diena u 1- aminokiseliinskom ostatku. Na primer, pored trifenilfosfina, jedinjenja kao što su triarilfosflni, trialkilfosflni, arilalkilfosfini, i triarilarsini mogu da reaguju sa acetil-^-bromociklosporinom A 41 i daju proizvod reakcije druga aktivirana jedinjenja kao što je 42.

Prema SL. 4, smeša izomera (E) i (Z) acetil-1,3-diena 43 se može dobiti mešanjem trifenilfosfonijum bromida acetil ciklosporina A 42 sa viškom formaldehida u toluenu na sobnoj temperaturi. Nakon dodavanja formaldehida dodaje se kap po kap baza poput natrijum hidroksida, a dobijena smeša izomera diena je ekstrahova sa etil acetatom.

Wittigova reakcija je opisana u mnogim udžbenicima. Jedan opis se nalazi kod J.Mcmurrv, Organic Chemistry, 5th Ed. (Brooks/Cole, Pacific Grove, 2000), pp.780-783. Wittig- ova reakcija se može izkoristiti za prevodjenje ketona ili aldehida u alken. U ovakvom procesu, fosforni ilid, koji se još naziva fosforan, može da u reakciji sa aldehidom ili ketonom da dipolarni intermedijer koji se naziva betain. Uglavnom se intermedijer betain ne izoluje iz rekacione smeše; nego se spontano razgradjuje preko četvoročlanog prstena da bi se dobio alken i trifenilfosfm oksid. Neto rezultat je zamena karbonilnog atoma kiseonika sa R2C= grupom koja je prvobitno bila vezana za fosfor.

Stručnjaci iz ovog domena će proceniti da brojni reagensi mogu da se zamene, u odnosu na gore pomenute, koji su reaktanti u Wittig-ovoj reakciji. Na primer, brojna jedinjenja alkil, aril, aldehidi i lcetoni mogu da zamene formaldehid da bi se dobio veliki broj derivata ciklosporina. Prijavioci su izvršili gore pomenutu sintezu sa formaldehidom i umesto formaldehida, jedinjenja kao što su acetaldehid, deuterisani formaldehid, deuterisani acetaldehid, 2-hlorobenzaldehid, benzaldehid i butiraldehid. Ove Wittig-ove reakcije je moguće izvesti i sa nekim drugim jedinjenjima u odnosu na trifenilfosfonijum derivate, kao što su triarilfosfmi, trialkilfosfmi, arilallđlfosfini triarilarsini. Umesto natrijum hidroksida mogu se koristiti i druge baze kao što su natrij um karbonat, butillitijum, heksillitijum, natrijum amid, kao i voluminozne baze sa litijumom kao što su litijum diizopropilamid i alkoksidi alkalnih metala. Osim variranja ovih reagenasa, reakcija se može izvršiti u različitim organskim rastvaračima ili u smešama organskih rastvarača i vode, u prisustvu različitih soli, naročito litijum halida, i na različitim temperaturama. Svi gore nabrojani faktori se mogu smišljeno odabrati da bi imali željeni efekat na stereohemiju formirane dvostruke veze; tjželjeni efekat na odnos cis- i trans-izomera.

U krajnjem koraku ovog puta sinteze, grupa za zaštitu na (3-ugljeniku, uklanja se po sledećoj proceduri. Smeša acetil-(E)-1,3-diena i acetil-(Z)-l,3-diena 43 je rastvorean u metanolu, a zatim je dodata voda. Dodataje baza, kao što je kalij um karbonat i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi. Pored kalijum karbonata moguće koristiti i druge baze kao što su natrijum hidroksid, natrijum karbonat, natzrijum alkoksid i kalijum alkoksid. Onda je za ekstrakciju finalnog proizvoda, smeše ISAtx247 izomera (E) i (Z), korišćen etil acetat 44.

Postupak 2

U alternativnom putu sinteze smeše ISAjx247 izomera (E) i (Z) po principu \Vittig-ove reakcije, moguće je koristiti put sinteze koji se sastoji iz četiri koraka i to su: 1) zaštita (3- alkohola, kao po postupku 1,2) oksidacija acetil-ciklosporina A koji se dobija u prvom koraku da bi dobili aldehid; 3) Wittig-ova reakcija ; i 4) de-acetilovanje proizvoda Wittig-ove reakcije ili ekvivalentno tome, hidroliza acetatnog estra kako bi ga ponovo preveli u alkohol. Ove rakcije su prikazane na SL. 5.

Ovaj sintetski put započinje na način koji je sličan putu sinteze preko V/ittigove reakcije sa SL. 4 utoliko da se u prvom koraku vrši zaštita p-alkohola sa acetatnom estarskom grupom. Odavde se dva puta razlikuju, medjutim, u tome da sledeći korak u postupku 2 prevodi acetil- ciklosporin a 35 u aldehid, acetil ciklosporin A aldehid 51. U ovoj reakciji se koristi oksidaciono sredstvo koje je dovoljno jako da raskine dvostruku C=C vezu i tako se dobijaju dva fragmenta. Raskidanje veze u alkenu je poznato u oblasti. Najčešće korišćeni reagens za raskidanje dvostruke veze u alkenimaje ozon, ali i druga oksidaciona sredstva kao što je kalijum permanganat (KMnO^ ili osmijum tetroksid modu da izazovu raskidanje dvostruke veze.

Korišćenje oksidacionih sredstava na bazi rutenijuma je razmatrano kod H.J. Carlsena i sar., u "A Greatly Improved Procedure for Ruthenium Tetroxide Catalyzed Oxidation of Organic Compounds", J. Org. Chem., Vol. 46, No.19, pp 3736-3738 (1981). Carlsen i sar., objašnjavaju daje, istorijski, visoka cena rutenijuma obezbedila podsticaj za razvoj katalitičkih procedura, od kojih je najpopularnija ona koja koristi perjodat ili hipohlorit kao stehiometrijske oksidante. Ovi istraživači su utvrdili gubitak katalitičke aktivnosti u toku reakcije uz konvencionalno korišćenje rutenijuma, za koji su postulirali daje posledica prisustva karboksilnih kiselina. Nadjeno je da dodavanje nitrila, naročito acetonitrila u reakcionu smešu značajno povećava brzinu i meru u kojoj se vrši oskidativno raskidanje dvostruke veze alkena u sistemu CCI4/EEO/IO4'.

Prema jednom izvodjenju ovog pronalaska, acetil ciklosporin A aldehid 51 moguće je dobiti iz acetil ciklosporina A 35 rastvaranjem ovog jedinjenja u smeši acetonitrila i vode, a zatim dodavanjem prvo natrijum perjodata, a potom rutenijum hlorid hidrata. Aldehid je moguće ekstrahovati sa etil acetatom. Važno je zapaziti daje sinteza aldehida 51 po ovom postupku oksidativnog raskidanja veze bitna za mnoge stereoselektivne puteve, 0 kojima će biti reči kasnije, te će u daljem tekstu čitalaac biti upućen da se vrati na odgovarajući deo teksta.

Treći korak u postupku 2 podrazumeva prevodjenje aldehida 51 u smešu diena (E) i (Z) \Vittig-ovom rekacijom, na sličan način kao u postupku 1. Kao u postupku 1, fosforni ilid se adira na aldehid da bi se dobio betain (koji nije izolovan ), sa neto rezultatom daje karbonilni atom kiseonika u aldehidu zamenjen R_2C= grupom koja je prvobitno bila vezana za fosfor. Naravno, i ovde važi da ovakve Wittigove reakcije mogu da budu izvršene i sa drugim jedinjenjima koja sadrže fosfor, pored derivata trifenilfosfonijuma, kao što su triarilfosfini, trialkilfosfini, arilalkilfosfmi i triarilarsini na različitim temperaturama, kao i sa različitim rastvorima baza i rastvarača ili dodavanjem različitih neorganskih soli, može se uticati na stereohemiju novoformirane dvostruke veze.

U jednom izvodjenju, acetil ciklosporin A aldehid 51 je rastvoren u toluenu, u koji je dodata baza kao što je natrijum hidroksid u vodi. Zatim je dodat alil trifenilfosfonijum bromid 52 i reakciona smeša je mešana neko vreme. Dobijanje i izdvajanje krajnjeg produkta, smeše acetil (E) i (Z)-1,3-diena 53 obuhvata ekstrakciju sa heksanom i/ili etil acetatom, gde izraz "dobijanje i izdvajanje" treba da označava proces ekstrakcije i/ili izolovanja proizvoda reakcije iz smeše reaktanata, proizvoda, rastvarača, itd.

U krajnjem koraku postupka 2, slično finalnom koraku postupka 1, uklanja se acetatna estarska grupa koja je štitila alkohol na poziciji (3-ugljenika sa kalijum karbonatom, i tako se dobija smeša ISATx247 izomera (E) i (Z) 54. Za uklanjanje grupe za zaštitu, pored kalijum karbonata mogu se koristiti i druge baze kao što su natrijum hidroksid, natrijum karbonat, natrijum alkoksid i kalijum alkoksid.

Putevi sinteze kompozicija koje su obogaćene jednim od 1SAtx247 izomera (E) i (Z) preko reakcija sa organometalnim jedinjenjima

Prema izvodjenjima ovog pronalaska, u streoselektivnim putevima sinteze mogu da se koriste neorganski reagensi koji sadrže elemente kao što su silicijum, bor, titanijum, sumpor, fosfor i/ili litijum. Ovi putevi mogu idu preko reakcija sa prelaznim stanjem šestočlanog prstena gde je jedan član prstena neorganski element koji potiče iz organometalnog reagensa. U nekim izvodjenjima, efekti sterne smetnje koji se odnose na prelazno stanje mogu da utiču na stereohemiju ishoda reakcije.

Biće navedeni primeri dve stereoselektivne šeme koje će biti diskutovane u ovom prikazu. U prvoj stereoselektivnoj šemi (postupak 3, takodje prikazana na SL. 3 u putu 32), jedinjenje koje sadrži silicijum podleže reakciji eliminacije, pri tom se dobija bilo (E) bilo (Z) izomer, u zavisnosti od toga da li je reakcija eliminacije izvršena pod kiselim ili baznim uslovima. Ovo je primer olefinacije po Peterson-u. U drugoj stereoselektivnoj šemi (postupak 4, takodje je prikazana kao put 33 na SL. 3), svaki od izomera je proizvod nastao od različitog prekursora. Izomer (Z) je nastao od intermedijera koji sadrže titanijum i fosfor, dok je izomer (Z) nastao preko intermedijera koji sadrži litijum.

Postupak 3

Ovaj put sinteze ide preko acetil ciklosporin A aldehida 51.

Slična šema reakcija je diskutovana kod D.J.S. Tsai i D.S. Matteson u "A Stereocontrolled Synthesis of (Z) and (E) Terminal Diens from Pinacol (E)-1 -Trimethylsily 1-1 - Propene-3-Boronate", Tetraheclron Letters, Vol.22, No. 29, pp.2751-2752 (1981). Šema postupka je ilustrovana na SL. 6. Generalno, sinteza obuhvata dobijanje

trimetilsililalilboronatnog estra reagens 62, a zatim reakciju acetil ciklosporin A aldehida 51 sa 62 i dobija se (3—trimetilsilil alkohol 64. Smatra se da se ovaj alkohol gradi preko prelaznog stanja u kom intermedijer sadrži bor 63. Kako boratni estri sporo reaguju u reakcijama alil borovanja, stručnjaci u ovoj oblasti će primetiti da korišćenjem boranskog reagensa koji brže reaguje, kao što je E-otrimetilsilil dietilboran ili 9-(E-otrimetilsililalil)-9-BBN ima svoje prednosti, p—trimetilsilil alkohol 64 zatim podleže reakciji Peterson-ove olefinacije, tako se dobija alken, u ovom slučaju ili dien 65 ili dien 67.

Dobijanje alkena ide preko jednog od dva različita puta, u zavisnosti od toga da li se reakcija eliminacije (olefmacija) vrši u kiselim ili baznim uslovima. U kiselim uslovima dolazi do tftt/7-eliminacije i dobija se izomer (E), dok se u baznim uslovima vrši cA-eliminacija što dajeizomer (Z). Stručnjaci u ovoj oblasti proceniće da se korišćenjem ovog puta sinteze, može dobiti svaki od izomera od istog prekursora. Proizvod svake od pomenutih reakcija eliminacije je kompozicija obogaćena jednim od dva izomera. U jednom izvodjenju, obogaćen znači da kompozicija sadrži veći ili jednak do oko 75 masenih procenata jednog izomera. U drugim izvodjenjima, obogaćena kompozicija može da sadrži 80, 85 i 90 masenih procenata jednog izomera. Kompozicije obogaćene jednim izomerom mogu onda da se mešaju po prethodno utvrdjenom odnosu da bi se dobila smesa željenog sastava stoje prikazano na SL. 10.

Reakcije prikazane na SL. 6 će sada biti diskutovane do detalja, počevši od dobijanja reagensa koji sadrži bor 62. Opšte istraživanje upotrebe reagenasa sa silicijumom u reakcijama gde dolazi do gradjenja ugljenik-ugljenik veze je diskutovano kod E.Ehlinger i P.Magnus u "Silicon in Synthesis. 10. A (Trimethylsilyl)allyl Anion: A (3—Acyl Anion Equivalent for the conversion of Aldehydes and Ketones into y-Lactones", J. Am. Chem. Soc., Vol. 102, No. 15, pp. 5004-5011 (1980). Autori ističu reakciju izmedju (trimetilsilil)alil anjona i aldehida. Anjon se može dobiti deprotonovanjem aliltrimetilsilana sa sek-butillitijumom u tetrahidrofuranu na - 76°C koji sadrži jedan ekvivalent tetrametiletilendiarnina (TMEDA).

Deprotonovanje aliltrimetilsilana (ovaj korak nije prikazan na SL. 6) je diskutovano kod J.-F. Biellmann i J.-B. Ducep u "Allylic i Benzyilic Carbanions Substituted by Heteroatoms", Orgcmic reactions, Vol.27 (Wiley, New York, 1982), p.9. Alfa proton u odnosu na heteroatom u supstituisanim alilnim sitemima može da se ukloni sa baznijim sredstvima. Dostupno je mnoštvo različitih sredstava sa ovim osobinama, dok je možda n-butillitjum najčešće korišćen. n- Butillitijum se koristi u stehiometrijskoj količini sa jedinjenjem koje treba da bude metilovano u rastvoru sa tetrahidrofuranom (THE). Temperatura se obično održava ispod 0°C (često i ispod - 76°C) kada je n-butillitijum slabo reaktivan zbog svoje polimerne prirode. Dodavanje helatnog sredstva kao što je N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin (TMEDA) dovodi do disocijacije polimera. Medjutim reakcija može da se izvrši i na sobnoj temperaturi, čak i u odsustvu TMEDA.

Alilsilani se lako deprotonuju jer je nastali anjon stabilizovan ne samo preko kojugovanja sa susednom dvostrukom vezom, nego takodje i sa susednom silil grupom. Anjon može da reguje sa elektrofilima preko, ili njegovog a-ugljenika ili njegovog y-ugljenika. Regiohemijski i stereohemijski ishod ovih reakcija zavisi od više faktora, od kojih je jedan od najvažnijih identitet kontrajona. Vidi razmatranje alilsilana kod S.E. Thomasa u Orgcmic Synthesis: The Roles of Boron and Silicon (Oxford University Press, New York, 1991), pp. 84-87.

U ovoj šemi reakcije, deprotonovani alilsilan zatim podleže elektrofilnom preuzimanju od trimetilborata da bi se dobio intermedijer, koji, kada reguje sa pinakolom daje trcms- (trimetilsilil) boronat jedinjenje 62. Boronat 62 može takodje da se označi kao "alilboran" (alilboronatni estar). Druga mogućnost je da se koristi 9-metoksi-9-dialkilboran u elektrofilnom preuzimanju, što dovodi do formiranja boronatnog kompleksa koji može da se demetoksiluje upotrebom trifluorida (kao što je BF3Et20) da bi se dobio odgovarajući 9-(gama-trans- trimetilsil ilalil)-9-dialkilboran.

Dodavanje aldehida u alilboran je diskutovano kod S. E. Thomas-a u gore pomenutoj referenci na stranama 34-35. Dodavanje aldehida u alilboran, gde je ovaj drugi nesimetrično supstituisan na distalnom kraju ugljenik-ugljenik dvostruke veze ("distalni" označava najudaljeniji od borovog atoma) daje homoalilni alkohol koji sadrži dva susedna hiralna centra. Od (E)-alilborana nastaje /reodijastereo izomer, dok (Z)-alilborani daju mVro-đijastereo izomer. Kao primer navodimo reakciju (E)-alilborana 62 sa ciklosporin A aldehidom 51, koja je prikazana na slici 6, u kojoj se dobija intermedijer 63 sa borom posle mešanja reaktanata u rastvoru THF u toku nekoliko dana.

Referentni broj 69 u intermedijeru 63 sa borom (SL. 6) treba da pokazuje daje moguć veliki broj struktura na poziciji bora. Na primer, ako je boronat reagens 62, trialkilsililalil boronatni estar, onda bi struktura pod brojem 69 u svojoj strukturi imala petočlani prsten koji uključuje dva kiseonikova atoma. Supstitucije u boronatnim i boranskim reagensima koje se izvrše u 62 će biti prisutne u strukturi 63.

Postulirano je da se stereoselektivnosl u reakcijama koje uključuju alilborane sa aldehidima, postiže zbog formiranja prelaznog stanja-šestočlanog prstena u stoličastoj konformaciji, koje je dato primerom intermedijera sa borom 63 i prikazano na SL. 6. Samo karbonilni atomi u aldehidu (ugljenik i kiseonik koji su spojeni dvostrukom vezom) postaju članovi strukture šestočlanog prstena u prelaznom stanju. Ostatak aldehida se proteže od prstena. CsA deo aldehida koji se proteže od šestočlanog prstena je postuliran da zauzima ekvatorijalnu poziciju pre nego aksijalnu u odnosu na prsten, jer bi ova druga konfiguracija dala nefavorizovanu sternu smetnju izmedju tog supstituenta i kiseonikovog atoma u alilboranu 62. Stručnjaci u ovoj oblasti će takodje proceniti daje pozicija SiMe3 grupe u (trimetilsilil)alil anjonu prikazana da zauzima ekvatorijalnu poziciju na SL. 6 jer je ovaj primer započeo sa dijastereomerom (E) alilborana. Alternativno, SiMes grupa je mogla da bude prikazana u aksijalnoj poziciji daje polazni alilboran bio dijasteromer (Z).

Druga mogućnost je, da se razmatra dobijanje eritro-silil alkohola, od kojeg bi kisela eliminacija dala cA-izomer a bazna eliminacija bi dala trans-izomer, na suprotan način reakcijama eliminacije koje su razmatrane u gornjem tekstu. Sturčnjacima iz ove oblasti biće očigledno da se isti proizvodi dobijjaju na kraju sinteze.

Reakcija produkta prelaznog stanja 63 sa trietanolaminom daje beta-trimetil-silil alkohol 64. S druge strane, alilborovanje (trimetilsililaliljdialkilborana daje silil alkohol 64, nakon oksidacije upotrebom NaOH/LLCb ili vodenom smešom. Alkohol 64 prikazan na SL. 6 je treo- dijastereoizomer, budući daje prelazno stanje alilboran 63 bio u (E)-konfiguraciji iako će stručnjaci iz ove oblasti znati daje moguće dobiti druge dijastereoizomere takodje, ako je polazni reagens (Z)-alilboran. Dijastereoselektivnost u novonastalim hiralnim centrima nije odredjivana u ovom stadijumu zbog uklanjanja ovih hiralnih centara u kasnijim fazama sinteze. Sturkura beta-trimetilsilil alkohola 64 prikazana na SL. 6, je potvrdjena od strane prijavilaca upotrebom spektralnih analiza. U postupku sinteze alkena poznate kao Petersonova eliminacijom trialki lsi li 1 grupe i hidroksil grupe u beta-trimetilsilil alkoholu 64 dobija se alken; u ovom slučaju dien, zbog dvostruke veze koja je već prisutna izmedju dva terminalna ugljenika u lancu. Razmatranje prevodjenja beta-hidroksisilana u alkene je pokazana kod S. E. Thomas-a u referenci na stranama 68-69. Dalja diskusija ovih reakcija je prezentovana od strane P. F. Hurdlik-a i D. Peterson-a u "Stereospecific Olefin-forming Elimination Reactions of P- Hydroxysilanes," J. Am. Chem. Soc. , Vol. 97, No. 6, pp 1464-1468 (1975).

Pozivajući se na sliku 6, reakcija eliminacije kojom se alkohol 64 prevodi u dien može da se vrši po jednom od dva različita mehanizma u zavisnosti od toga da li se rakcija izvodi pod kiselim ili baznim uslovima. Po jednom mehanizmu dobija se dien 65 dok se po drugom mehanizmu dobija 67. Pod kiselim uslovima dolazi do an/7-eliminacije dok pod baznim uslovima dolazi do sm-eliminacije. Drugim rečima, reakcije eliminacije beta-hidroksisilana su stereospecifične, a reakcije koje se dešavaju u kiselim i baznim uslovima imaju suprotan stereohemijski tok. Kao primer kiselina za reakciju u kiselim uslovima navodimo sirćetnu kiselinu, sumpornu kiselinu i različite Lewis-ove kiseline; kao primer baza za reakciju u baznim uslovima navodimo natrij um hidrid, kalij um hidrid ili kalij um tercbutoksid. Može da se desi da su reakcije eliminacije sa natrij um hidridom u THF spore na sobnoj temperaturi, dok se reakcije eliminacije koje koriste kalij um hidrid vrše mnogo lakše.

Ova faza puta sinteze je stereospecifična jer eliminacija pod kiselim uslovima zahteva da trimetilsilil i hidroksi grupa budu u antiperiplanarnom položaju. Nasuprot kiseloj, eliminacija pod baznim uslovima zahteva da trimetilsilil i hidroksi grupa zauzmu sinperiplanarni položaj. Drugi od pomenuta dva uslova favorizuje formiranje jake veze izmedju atoma silicijuma i kiseonika i četvoročlanog prstena koji je intermedijer, koji se razgradjuje na način sličan krajnjem koraku u Wittig-ovoj reakciji. Stručnjaci u ovoj oblasti znaju da jaka veza izmedju atoma kiseonika i silicijuma zamenjuje slabiju silicijum-ugljenik vezu, koja kompenzuje zamenu jake veze izmedju ugljenika i kiseonika gradjenjem slabije n veze izmedju dva atoma ugljenika.

Dakle, proizvodi stereospecifične eliminacije p—hidroksi alkilsilana su acetil-(E)-l,3-dien jedinjenje 67 i acetil-(Z)-l,3-dien jedinjeje 65. Kao i u prethodnim postupcima zaštitna grupa se sada može ukloniti iz svakog od ovih diena, sa K2CO3 u metanolu i vodi. Na ovaj način se uklanja acetatna grupa koja je vezana za (3-ugljenik 1 -aminokiselinskog ostatka, tako vraćajući funkcionalnu grupu na tom ugljeniku u alkohol. Osim kalij um karbonata za uklanjanje zaštitne grupe mogu se koristiti još neke baze kao što su natrij um hidroksid, natrij um karbonat, natrij um alkoksid i kalijumalkoksid.

U ovoj fazi dobijanja proizvoda, sinteza je već prilično završena. Kompozicije obogaćene jednim ili drugim izomerom se mogu mešati kako bi se dobila smeša sa željenim odnosom izomera. Pod izrazom "obogaćena" se podrazumeva proizvod koji sadrži najmanje 75 masenih procenata tog izomera; drugim rečima, proizvod može da sadrži i do 25 masenih procenata "neželjenog" izomera. Smeša je napravljena tako da postiže željeni farmakološki efekat.

Postupak 4

Ovaj put takodje ide preko acetil ciklosporin A aldehida 51.

Alternativna šema za dobijanje stereoselektivnih izomera je ilustrovana na SL. 7-8. Ovaj put sinteze se razlikuje od onih koji su bili ranije razmatrani po tome što 1) Put za sintezu ISATx247 izomera (E) ide preko različitih intermedijera u odnosu na put za sintezu izomera (Z) i 2) ovi putevi sinteze obuhvataju reagense koji sadrže titanijum i litijum i/ili intermedijere.

Poznato je da su reagensi sa titanijumom naročito korisni uorganskim sintezama, jer su oni regio- i stereoselektivni u njihovim reakcijama sa aldehidima i ketonima. Priroda titamjuma u stereoselektivnim hemijskim reakcijama je diskutovana kod M.T. Reetz-a u Organotitanium Reagents in Orgcmic Synthesis (Springer-Verlag, Berlin, 1986), pp. VII, 148-149 i 164-165. U ovom izdanju je rečeno da se priroda liganda sa titanijumom može menjati tako da se elektronski i sterni identitet reagensa može prilagodjavati potrebama, te se stereohemijski ishod mnogih reakcija u kojima dolazi do gradjenja C-C veze može predvideti. Prema ovim hemijskim reakcijama, jedinstvo dva prohiralna centra ahiralnih molekula stvara dva centra hiralnosti. Opšte pravilo koje odredjuje stereoselektivni ishod jeste da enolati sa Z konfiguracijom ili krotil metalna jedinjenja prevashodno grade sin-adukte, dok reagensi sa E konfiguracijom favorizuju anti-dijastereoizomere. Ove trendove je opet moguće objasniti pretpostavkom da postoji prelazno stanje u obliku šestočlanog prstena koji ima stoličastu geometriju.

Specifičan primer ovog tipa stereoselektivne sinteze je diskutovan kod Y. Ikeda i sar., u "Stereoselective Synthesis of (Z)- and (E)-1,3-Alkadienes from Aldehydes Using Organotitanium and Lithium Reagents", Tetrahedron, Vol. 43, No. 4, pp. 723-730 (1987). Ova referenca objašnjava, da se alildifenilfosfin može koristiti za dobijanje [3- (difenilfosfmo)alil]titanijum reagensa, koji se zauzvrat može kondenzovati sa aldehidom nakon čega se formira fosfonijum so i tako se dobija (Z)-l ,3-alkadien na veoma regio- i stereoselektivan način. Nasuprot tome, litijumom obeleženi alildifenilfosfin oksid može da se kondenzuje sa aldehidom i da se dobije direktno (E)-l,3-alkadien, opet sa željenom stereoselektivnošću.

Pozivajući se na SL. 7 sinteza ISAtx247 izomera (Z) ide (kao i u prethodnim šemama) preko dobijanja acetil ciklosporin A aldehida 51 od ciklosporina A 34. Reakcija [3- (difenilfosfino)alil]titanijum reagensa 72 sa jakom bazom kao što je t-BuLi, a zatim reakcija proizvoda sa titatnijum tetraizopropoksidom. Prelazno stanje 73 je teoretski predloženo i od njega se dobija eritro-a-adukt 74 koji se zatim može prevesti u p-oksidofosfonijum so 75, reakcijom 74 sa jodometanom (Mel). Postulirano je daje postojanje prelaznog stanja 73 u najmanju ruku bar delimično odgovorno za streoselektivnost ovog sintetskog puta.

U saglasnosti sa uzornim postupcima koji su navedeni u ovom prikazu, mesto na koje se nalazi metal u organometalnom reagensu može da bude entitet koji kontroliše regioselektivnost (Ikeda, p.725). Ovo znači da aldehid 51 na SL. 7 reaguje sa difenilfosfmo jedinjenjem 72 na njegovoj a—poziciji da bi nastao odgovarajući a-adukt 74, budući daje y-ugljenik difenilfosfino grupe koordinisan sa metalom, koji je u ovom slučaju titanijum. Zapažena Z selektivnost proizvoda koji je dien, se objašnjava time što se razmatra šestočlano prelazno stanje 73. Kako su i voluminozni bočni lanac ciklosporina A aldehida 35, i difenilfosfino grupa postulirani da zauzimaju ekvatorijalne položaje u prelaznom stanju, eritro a-adukt 74 nastaje seletivno, što omogućava dobijanje (Z)-l ,3-diena 76.

U suprotnosti sa mehanizmom reakcije koji je prikazana na SL. 7, po kom se ISATX247 izomer (Z) dobija preko prelaznog stanja sa titanijumom, izomer (E) se pak ne može tako lako dobiti primenom ovog postupka. U stvari, za pokušaje da se sintetiše izomer (E) primenom ovog postupka, uglavnom se saopštava da daju niske prinose. Umesto toga, kao što se vidi na SL. 8, derivat litijuma 82 može da reaguje sa aldehidom 51 i da se na taj način dobije struktura prelaznog stanja koja sadrži litijum 83, koja čini da odnos E/Z u smeši 1,3-diena, bude u opsegu većem od približno75:25. Kao što je prikazano na SL. 7, visok stepen stereoselektivnosti proizvoda reakcije je verovatno posledica formiranja strukture prelaznog stanja 83, u kojoj vinil grupa reagensa sa litijumom 82 i bočni lanac ciklosporin A aldehida 51 kako je postulirano zauzimaju ekvatorijalni položaj, te se tako dobija (E)-1,3-dien 84 na stereoselektivan način. Kao što je ranije razmatrano, odredjene neželjene sporedne reakcije koje uključuju i zaštitnu acetatnu grupu se mogu izbeći u svim stereoselektivnim sintezama, upotrebom grupa za zaštitu kao što su benzoatni estri ili silil estri.

Pobijanje smeša

Kao što je ranije rečeno, za odredjene smeše cis- i /r<ms-ISAT\247 izomeraje nadjeno da pokazuju kombinaciju poboljšane potentnosti i/ili smanjene toksičnosti u odnosu na ciklosporine koji su do danas poznati i koji su prisutni u prirodi.

Prema izvodjenjima ovog pronalaska, ISAt.\247 izomeri (i njegovi derivati) su sintetisani stereoselektivnim putevima kod kojih se stepen stereoselektivnosti može menjati. Proizvodi stereoselektivnih puteva mogu da budu prvi materijal ili kompozicije obogaćene izomerom (E), i drugi materijal ili kompozicija obogaćena izomerom (Z), i ove materijale je moguće mešati tako da dobijena smeša ima željeni odnos dva izomera. Druga mogućnost je da se prvi mateijal dobije odvajanjem podukta reakcije da bi izolovali i obogatili izomerom (E), a drugi materijal odvajanjem produkta reakcije da bi izolovali i obogatili izomerom (Z). U pak drugom izvodjenju, uslovi reakcije stereoselektivnog puta se mogu menjati tako da proizvedu željeni odnos direktno u dobijenoj smeši.

Ovi principi su ilustrovani na SL. 9A-C i 10. Na SL. 9A -C, su prikazane tri hipotetičke sintetske reakcije koje daju odnose izomera (E) prema (Z) oko 65 do 35 masenih procenata, odnosno 50 do 50 masenih procenata, odnosno 35 do 65 masenih procenata. Naravno, ovi odnosi su dati samo kao primer i radi ilustracije samo, što znači daje mogao da bude odabran bilo koji hipotetički niz brojeva. Biće očigledno stručnjacima u oblasti da uslovi reakcije pod kojima je proizvedena smeša sa odnosom sa SL. 9A mogu da budu različiti u odnosu na one sa SL. 9B i 9C da bi napravili različite odnose izomera u smeši produkata. Uslovi pod kojima se vrši svaka od reakcija su podešeni tako da se dobije odredjeni odnos dva izomera za taj konkretan slučaj.

Nasuprot nekim putevima sinteze, u kojima se dobija smeša izomera, kod nekih puteva sinteze to nije slučaj nego se svaki izomer dobija pojedinačno, a zatim se oni mešaju u prethodno utvrdjenom odnosu kako bi bili zastupljeni u smeši u željenom odnosu. Ovaj koncept je prikazan na SL. 10, gde je proizvod jednog stereoselektivnog puta sinteze obogaćen jednim od izomera tako da proizvod sadrži više od 75 masenih procenata izomera (E), a proizvod drugog stereoselektivnog puta sinteze je obogaćen drugim izomerom tako da se ovaj sastoji od više od 75 masenih procenata izomera (Z). Ovi brojevi su takodje dati samo kao primer, a čistoća željenog izomera koji je proizvod stereoselektivnog puta sinteze može da bude veća od ili jednaka oko 75 masenih procenata u jednom izvodjenju. U drugim izvodjenjima željeni izomer može da čini više od ili jednako približno 80,odnosno 85,odnosno 90, odnosno 95 masenih procenata.

Posle sinteze svakog izomera pojedinačno, oni mogu da se mešaju kako bi postigli željeni odnos izomera, kao što je to ilustrovano na SL. 10. U ilustrativne svrhe, na SL. 10 su odabrani isti hipotetički odnosi kao oni koji su korišćeni na SL. 9A-C. Pozivajući se na SL. 10, izomeri (E) i (Z) su pomešani kako bi dobili tri različite smeše koje sadrže odnos izomera (E) prema (Z) od približno 65 do 35 masenih procenata, odnosno 50 prema 50 masenih procenata, odnosno 35 do 65 masenih procenata.

U alternativnom izvodjenju, ISAtx247 smeša izomera (E) i (Z) može da se razdvoji tako da smeša bude obogaćena jednim izomerom u odnosu na drugi. Na primer, Diels-Alder-ovom reakcijom moguće je prevesti cis-izomer ujedinjenje sa zatvorenim prstenom, reakcijom sa alkenom. Ako je alken vezan za supstrat koji se može izolovati (npr., filtriranjem), cis izomer se može u značajnoj meri ukloniti iz smeše, ostavljajući kompoziciju obogaćenu trans izomerom. Cis izomer može da se rekonstituiše iz jedinjenja sa zatvorenim prstenom delovanjem toplote, pri tom se dobija kompozicija obogaćena cis izomerom. Dakle, na ovaj način, mogu se razdvojiti cis i trans izomeri.

U praksi, odnos izomera (E) i (Z) u ma kojoj smeši, bez obzira na stepenstereoselektivnosti postupka prema kojem je proizveden, može da varira u širokom opsegu

vrednosti. Na primer, smeša može da se sastoji od oko 10 do 90 procenata izomera (E) do oko 90 do 10 procenata izomera (Z). U drugim izvodjenjima smeša može da sadrži od oko 15 do 85 masenih procenata izomera (E) i oko 85 do 15 procenataizomera (Z); ili oko 25 do 75 masenih procenata izomera (E) i oko 75 do 25 masenih procenata izomera (Z); ili oko 35 do 65 masenih

procenata izomera (E) i oko 65 do 35 masenih procenata izomera (Z); ili oko 45 do 55 masenih

procenata izomera (E) i oko 55 do 45 masenih procenata izomera (Z). U pak jednom drugom

izvodjenju pronalaska, smeša izomera je ISAjx247 smeša koja se sastoji od oko 45 do 55 masenih procenata izomera (E) i oko 50 do 55 masenih procenata izomera (Z). Maseni procenti se izražavaju u odnosu na ukupnu masu kompozicije i podrazumeva se da zbir masenih procenata izomera (E) i izomera (Z) iznosi 100 masenih procenata. Drugim rečima, smeša može da sadrži 65 masenih procenata izomera (E) i 35 masenih procenata izomera (Z), ili obrnuto.

Procenat jednog ili drugog izomera u smeši se može proveriti spektroskopijom nuklearne magnetne rezonancije (NMR), ili drugim tehnikama koje se upotrebljavaju u ovoj oblasti. Farmaceutske kompozicije

Ovaj pronalazak se odnosi na postupak tečenja pacijenata kojima je potrebna imunosupresivna terapija, kao što je primena farmaceutskih kompozicija koje kao aktivnu komponentu sadrže smešu koju navodi pronalazak. Indikacije za koje je ova kombinacija od interesa obuhvataju naročito autoimunska i inflamatorna stanja i stanja koja prate ili su uzrok odbacivanja transplantata, npr., lečenje (uključujući i poboljšanje, smanjenje, eliminaciju ili izlečenje etiologije ili simptoma) ili prevenciju (uključujući značajno ili potpuno ograničenje, profilaksu ili izbegavanje) sledećeg:

a) Akutno odbacivanje transplantiranog organa ili tkiva, npr., lečenje primalaca, npr., srca, pluća, kombinovano srca i pluća, jetre, bubrega, pankreasa, kože, creva ili kornealnog transplantata, naročito prevencija i/ili lečenje odbacivanja posredovanog T ćelijama, kao i bolesti kalem protiv domaćina, kao što je slučaj nakon transplantacije kostne srži.

b) Hronično odbacivanje transplatiranog organa, naročito, prevencija bolesti krvnih sudova kalema, npr., koju karakteriše stenoza arterija kalema što je posledica odebljavanja intime, usled proliferacije ćelija glatke muskulature i efektima koji prate ovu pojavu.

c) Odbacivanje ksenokalema, koje obuhvata akutno, hiperakutno ili hronično odbacivanje organa do kojeg dolazi kada je davalac organa pripadnik druge vrste u odnosu na primaoca, posebno odbacivanje posredovano B-ćelijama i odbacivanje posredovano antitelima.

d) Autoimunske bolesti i inflamatorna stanja, naročito inflamatorna stanja sa etiologijom koja uključuje imunološku ili autoimunsku komponentu kao što je artritis (na primer reumatoidni artritis, arthritis chronica progrdiente i arthritis deformans) i druga

reumatoidna oboljenja. Medju specifična oboljenja za koja može da se koristi sinergistička kombinacija koju navodi pronalazak, svrstavaju se autoimunski hematološki poremećaji (uključujući npr., hemolitičnu anemiju, aplastičnu anemiju, čisto eritrocitnu anemiju i idiopatsku trombocitopeniju), sistemski eritematozni lupus, polihondritis, skleroderma, Wegenerova granulomatoza, dermatomiozitis, hronični aktivni hepatitis, mijastenija gravis, psorijaza, Steven-Johnson-ov sindrom, idiopatski sprue (tropska bolest-upala creva i vrata), (autoimunska) inflamatorna boolest creva (tu se ubrajaju i ulcerativni kolitis i Crohn-ova bolest), endokrina oftalmopatija, Graves-ova bolest, sarkoidoza, multipla skleroza, primarna ciroza žuči, juvenilni dijabet (diabetes melitus tipa I), uveitis (anteriorni i posteriorni), keratoconjuctivitis sicca i prolećni konjuktivit, intersticijalna fibroza pluća, psorijatični artritis, glomerulonefritis (sa ili bez nefrotičnog sindroma ili nefropatija sa minimalnim promenama) i mladalački dermatomiozit. Autoimunska i inflamatorna stanja kože se takodje smatraju podložna lečenju i prevenciji kada se za lečenje koristi sinergistička kombinacija prema pronalasku, npr., psorijaza, kontaktni dermatitis, utopijski dermatitis, alopecija areata, eritema multiforma, dermatitis herpetiformis, skleroderma, vitiligoangiitis hipersenzitivnosti, urtikaria, bulozni pemfigoid, eritemski lupus, pemfigus, epidermolysis bullosa acquisita i druga inflamatorna i alergijska stanja kože, kao što su inflamatorna stanja pluća i disajnih puteva ubrajajući tu i astmu, alergije i pneumokoniozu. Smeše izomera analoga iz ovog pronalaska mogu da se primene same ili sa farmaceutskim nosačem kod toplokrvnih životinja kojima je neophodan ovakav tretman. Farmaceutski nosač može da bude u čvrstom ili u tečnom stanju. Smeša iz pronalaska može da se primeni oralno, topikalno, parenteralno, inhaliranjem spreja ili rektalno u formulacijama doznih jedinica koje sadrže konvencionalne netoksične farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvanse ili vehikulume. Izraz parenteralno, kao stoje ovde korišćen, obuhvata subkutane injekcije, intravenske, intramuskularne, intrasternalne injekcije ili različite tehnike primene infuzijom.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže smešu iz pronalaska su preferabilno u obliku koji je odgovarajući za oralnu primenu, na primer, tablete, dražeje, pastile, vodene ili uljane suspenzije, disperzibiIni prah ili granule, emulzije, čvrste ili meke kapsule, ili sirupi ili eliksiri. Kompozicije namenjene za oralnu upotrebu moguće je dobiti prema postupcima koji su dobro poznati u oblasti proizvodnje farmaceutskih kompozicija i ovakve kompozicije mogu da sadrže jedno ili više sredstava koji su odabrani iz grupe koja se sastoji od zasladjivača, sredstava koji daju aromu, sredstava koja daju boju i konzervanasa kako bi dobijanje bilo farmaceutski elegantno i prihvatljivo.Tablete koje sadrže aktivni sastojak u smeši sa netoksičnim farmaceutski aktivnim ekscipijentima mogu se takodje proizvesti prema poznatim metodama. U ekscipijente koji se mogu koristiti se ubrajaju (1) inertni diluenti kao što je kalcijum karbonat, laktoza, kalcijum fosfat ili natrij um fosfat; (2)sredstva za granulaciju i usitnjavanje kao što su škrob iz kukuruza ili alginska kiselina; (3) vezujuća sredstva kao što je škrob, želatin ili akacija, i (4) sredstva za podmazivanje kao što je magnezij um stearat, stearinska kiselina ili talk. Tablete mogu da budu neobložene ili mogu da budu obložene po proceduri neke od poznatih tehnika, što treba da odloži razgradnju i apsorpciju u gastrointestinalnom traktu i tako da obezbedi produženu aktivnost u toku dužeg vremenskog perioda. Kao materijal za odloženo delovanje mogu da se koriste na primer, gliceril monostearat ili gliceril distearat. Moguće je takodje obložiti tablete prema tehnikama koje su opisane u američkom patentu broj 4,256,108; 4,160,452; i 4,265,874 da bi napravili osmotske terapeutske tablete sa kontrolisanim oslobadjanjem.

U nekim slučajevima, formulacije za oralnu upotrebu mogu da budu u obliku čvrstih želatinskih kapsula, kod kojih je aktivni sastojak izmešan sa inertnim čvrstim diluentom, kao što je na primer, kalcij um karbonat, kalcijum fosfat ili kaolin. One takodje mogu da budu u obliku kapsula od mekanog želatina kod kojih je aktivni sastojak izmešan sa uljanim ili vodenim medijumom, kao što je ulje kikirikija, tečni parafin ili maslinovo ulje.

Vodena suspenzija normalno sadrži aktivne materijale u smeši sa ekscipijentima koji su odgovarajući za prizvodnju vodenih suspenzija. Medju ovakve ekscipijente se ubrajaju: (1) suspenziona sredstva kao stoje natrij um karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrij um alginat, polivinilpirolidon, tragakantova guma (kozinac) i biljna smola akacije; ili (2) disperziona ili kvaseća sredstva koja su prirodno prisutna, fosfatidi kao što je lecitin, kondenzacioni proizvod rekacije alkilen oksida sa masnom kiselimnom, na primer, polioksietilen stearat, kondenzacioni proizvod reakcije etilen oksida sa alifatičnim alkoholom dugog lanca, na primer, heptadekaetilenoksicetanol, kondenzacioni proizvod etilen oksida sa delimičnim estrom koji potiče od masane kiseline i heksitola kao što je polioksietilensorbitol monooleat, ili kondenzacioni proizvod reakcije etilen oksida sa delimičnim estrom koji je izveden od masne kiseline i anhidrida heksitola, kao stoje polioksietilen sorbitan monooleat.

Vodene suspenzije mogu takodje da sarže jedan ili više konzervanasa, na primer, etil ili n-propil p-hidrksibenzoat; jedno ili više sredstava koja daju boju,; jedno ili više sredstava koja daju aromu; i jedan ili više zasladjivača kao što je saharoza, aspartam ili saharin.

Uljana suspenzija može da bude formulisana resuspendovanjem aktivnog sastojka u biljnom ulju, na primer ulju arahisa, maslinovom ulju, susamovom ulju ili kokosovom ulju, ribljem ulju koje sasdrži omega 3 masnu kiselinu, ili u mineralnom ulju kao stoje parafinsko. Uljane suspenzije mogu da sdrže sredstvo za očvršćavanje, na primer pčelinji vosak, čvrsti parafin ili cetil alkohol. Zasladjivači i veštačke arome mogu da se dodaju kako bi se dobio ugodan preparat za oralnu upotrebu. Ove kompozicije je moguće konzervisati dodavanjem antioksidansa kao stoje askorbinska kiselina.

Dispezibilni prah i granule su pogodni za dobijanje vodenih suspenzija. U ovoj formulaciji aktivni sastojak se nalazi u smeši sa disperzionim ili kvasećim sredstvom, suspenzionim sredstvom i sa jednim ili više konzervanasa. Primeri za pogodna disperziona ili vlažeća sredstva i resuspenziona sredstva su već pomenuti u gornjem tekstu. Dodatni ekscipijenti, na primer, sredstva za zasladjivanje, aromu i boju koja su gore opisana mogu takkodje da budu prisutna.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže smešu koju navodi pronalazak mogu takodje da budu u obliku emulzije ulje u vodi. Uljana faza može da bude bljno ulje kao što je maslinovo ulje ili arahisovo uje, ili mineralno ulje kao što je tečni parafin ili njegova smeša. Odgovarajući emulgatori mogu da budu (1) u prirodi prisutne biljne smole kao što je guma akacija i guma tragakant, (2) u prirodi prisutni fosfatidi kao stoje soja ili lecitin, (3) estri ili delimični estar 30 koji je izveden iz masnih kiselina anhidrida heksitola, na primer sorbitan monooleat, (4) kondenzacioni proizvodi reakcije pomenutih delimičnih estara sa etilen oksidom, na primer polioksietilen sorbitan monooleat. Emulzije takodje mogu da sadrže zasladjivače i veštačke arome.

Sirupi i eliksiri mogu da budu formulisani sa zasladjivačima kao stoje glicerol , propilen glilcol, sorbitol, aspartam ili saharoza. Ovakve formulacije mogu takodje da sadrže melem (koji ublažava bol), konzervans i veštačku aromu i veštačku boju.

Farmaceutske kompozicije mogu da budu u obliku sterilnih injektabilnih vodenih ili oleagenih suspenzija. Ova suspenzija može da bude formulisana prema poznatim postupcima u kojima se koriste ona pogodna disperziona i vlažeća sredstva i resuspenziona sredstva koja su gore već pomenuta. Sterilan injektabilni preparat može takodje da bude i sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom diluentu ili rastvaraču koji je prihvatljiv za parenteralnu primenu, na primer rastvor u 1,3-butandiolu. U prihvatljive vehikulume i rastvarače koji se mogu koristiti, ubrajaju se Ringer-ov rastvor i izotoni rastvor natrij um hlorida. Povrh toga, upotrebljavaju se uobičajena sterilna fiksirana ulja u svojstvu rastvarača ili suspenzionog sredstva. U ovu svrhu može da se koristi svako blago fiksirano ulje, uključujući sintetičke mono- ili di-gliceride. Osim toga, masne kiseline kao stoje oleinska kiselina su našle primenu u pripremanju injekcija.

Smeša iz pronalaska takodje može da se primeni u obliku supozitorija za rektalnu primenu leka. Ove kompozicije mogu da se pripreme mešanjem leka sa odgovarajućim neiritabilnim ekscipijentom koji je u čvrstom stanju na običnoj temperaturi, ali je tečan na

rektalnoj temperaturi, te će se zbog toga otopiti u rektumu i osloboditi lek. Takve supstance su puter od kakaoa i polietilen glikoli.

Za topikalnu primenu se koriste kreme, masti, gelovi, rastvori ili suspenzije, itd.. koje sadrže opisane ciklosporine.

U naročito poželjnom izvodjenju, koristi se tečni rastvor koji sadrži površinski aktivnu supstancu, etanol, lipofilni i/ili amfifilni rastvarač kao neaktivni sastojak. Tačnije, koristi se oralna višestruka emulzija koja sadrži smešu izomera analoga i sledeće nelekovite sastojke: d- alfa Tokoferil polietilen glikol 1000 sukcinat (vitamin E TPGS), ulja triglicerida srednjeg niza (MCT), Tvveen 40 i etanol. Takodje se mogu preferabilno koristiti mekane želatinske kapsule (koje sadrže želatin, glicerin, vodu i sorbitol) sadrže smešu izomera analoga i iste nelekovite sastojke kao i oralni rastvor.

Za lečenje gore nazančenih stanja koriste se nivoi doza reda od oko 0,05 mg do oko 50 mg po kg telesne težine na dan. Nivo doze i plan primene mogu da variraju u zavisnosti od odredjene smeše izomera koja je upotrebljena, stanja koje se leči i rtekih dodatnih faktora kao što su starost i stanje ispitanika. Poželjne doze variraju od oko 0,5 do oko 10 mg/kg/na dan i od oko 0,1 do oko 10 mg/kg/na dan. U poželjnom izvodjenju, od oko 2 do oko 6 mg/kg/na danje primenjeno oralno b.i.d. U naročito poželjnom izvodjenju, primenjeno je oralno b.i.d. oko 0,5 do oko 3 mg/lcg/na dan

Količina aktivnog sasstojka koja može da se kombinuje sa supstancama koje imaju ulogu nosača za dobijanje jednostruke doze će varirati u zavisnosti od tretiranog domaćina i od konkretnog našina primene. Na primer, formulacija koja je namenjena za oralnu primenu kod ljudi sadrži od 2,5 mg do 2,5 g aktivne supstance udružene sa odgovarajućom količinom nosača koja može da varira od oko 5 do oko 95 procenata ukupne kompozicije. Jedinica za doziranje će najčešće da sadrži izmedju od oko 5 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka. U poželjnom izvodjenju, za oralnu primenu koriste se pojedinačne kapsule koje sadrže oko 50 mg smeše izomera. U drugom poželjnom izvodjenju, za oralnu primenu koriste se oralni rastvori koji sadrže oko 50 mg/ml smeše izomera.

Međjutim podrazumeva se da će specifični nivo doze za svakog pacijenta zavisiti od brojnih faktora kao što su aktivnost specifičnog jedinjenja, starost, telesna težina, stanje opšteg zdravlja, pol, ishrana, vreme primene, način primene, brzina ekslcrecije, kombinacija leka i priroda i ozbiljnost odredjene bolesti ili stanja koje se podvrgava terapiji.

Metodologija

Upotreba derivata cikklosporina, klase cikličnih polipeptida koje proizvodi gljiva iz vrste Tolypocladium inflatum Gans, je sve veća u imunosupresivnoj terapiji usled njihovog prevashodnog delovanja na T-ćelijski posredovane reakcije. Zapaženo je da derivati ciklosporina ne samo da reversibilno inhibiraju imunokompetentne limfocite, naročito T-limfocite, nego inhibitorno deluju i na produkciju i oslobadjanje limfokina. Ovo delovanje ciklosporina je primarno posredovano inhibicijom kalcineurina, fosfataznog enzima koji je prisutan u citoplazmi ćelija (Schreiber i Crabtree, 1992). Indikator efikasnosti ciklosporina A ili derivata ciklosporina A je njegova sposobnost da inhibira fosfataznu aktivnost kalcineurina. Test odredjivanja inhibicije kalcineurina meri aktivnost lelca na mestu delovanja i kao takav je najtačniji i direktan in vilro pokazatelj jačine delovanja analoga ciklosporina A (Fruman i sar., 1992).

ISAtx247 je analog ciklosporina A, i on je sličan ciklosporinu A, osim nove modifikacije funkcionalne grupe na 1-aminokiselinskom ostatku molekula. Mi smo našli da ISAxx247 pokazuje i do tri puta snažnije delovanje od ciklosporina A u in vitro testu odredjivanja inhibicije kalcineurina.

Farmakodinamske studije su pokazale {in vivo i in vitro) da ISATx247 ima snažnije delovanje u odnosu na druga postojeća ciklosporinska jedinjenja. Efikasnost smeša izomera analoga ciklosporina koja je po sastavu izomera od oko 10:90 do oko 90:10 (trans- prema cis-), a naročito ISATx247 koji se sastoji od 50-55 % izomera Z i 45-50 % izomera E, kao imunosupresivnog sredstva (u odnosu na ciklosporin A) je pokazana u in vitro testu odredjivanja aktivnosti kalcineurina, na modelu transplantiranog srca kod pacova, na modelu alotransplantacije ćelija ostrvaca kod miša, na modelu kolagenom indukovanog artritisa kod miša, i/ili na modelu artritisa koji je indukovan antigenom kod kunića. Podaci su pokazali da ove smeše izomera imaju ekvivalentno do ili snažnije delovanje od ciklosporina A, te su zbog toga korisni u terapiji poremećaja imunomodulacije.

Poznato je da brojna nepovoljna delovanja prate terapiju ciklosporinom A, kao što su nefrotoksičnost, hepatotoksičnost, kataraktogeneza, hirzutizam, parateza i hiperplazija gingiva, pomenuli smo samo neke (Sketris i sar., 1995). Od pomenutih najozbiljniji je nefrotoksični efekat, od dozno zavisnih nepovoljnih efekata koji prate primenu ciklosporina A. Nije poznat precizan mehanizam po kom ciklosporin A dovodi do oštećenja bubrega; medjutim, ponudjeno je objašnjenje da povećanje nivoa vazokonstriktivnih supstanci u bubregu dovodi do vazokonstrikcije aferentnih arteriola glomerula. Ovo može da ima za posledicu renalnu ishemiju, smanjenje brzine filtracije u glomerulu i u toku dužeg vremenskog perioda, intersticijalnu fibrozu.

Procenjivana je neklinička bezbednost primene ISAtx247 na brojnim životinjskim vrstama. Ispitivanje oralne toksičnosti sa ponavljanim dozama kod pacova, pasa i primata su pokazala da se ovaj preparat dobro podnosi i proizvodi efekte koji su konzistentni sa imunosupresijom. Jedini toksikološki efekat koji je primećen kod svih vrsta je dijareja/retka sotlica.

ISAtx247 ne pokazuje mutagenu aktivnost što je pokazano u in vitro testovima reversne mutacije i hromozomske aberacije na bakterijama, i u in vivo testu mikronukleusa u pacova. Do današnjeg dana nisu radjena ispitivanja karcinogeničnosti. Ispitivanja reproduktivne toksičnosti sa ISAtx247 su radjena na gravidnim ženkama pacova i kunića, nisu primećene malformacije ili promene vezane za tretman. Pri dozama koje su bile toksične za majke, primećeni su toksični efekti i kod embriona.

PRIMERI

Primer 1: Acetilacija ciklosporina A

Dodat je acetatni anhidrid (140 mililitara) u ciklosporin A (50,0 grama, 41,6 milimoia) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u atmosferi azota sve dok se nije rastvorio sav Cyclosporin A. Dodat je dimetilaminopiridin aa8 7,62 grama, 62,4 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u atmosferi azota tokom 3 sata ili dok reakcija nije završena. Reakciona smeša je ohladjena na 5°C i onda filtrirana. Prikupljeni čvrsti ostatak je ispran u heksanu kako bi se oslobodili viška acetatnog anhidrida. Dobijena čvrsta supstanca koja ima konzistenciju paste je polako prebačena u snažno mešani 5 % vodeni rastvor natrijum bikarbonata (1,5 litara). Nastala suspenzija je mešana dok nije dobijena fini gusti rastvor i oslobadjanje CO2 je prekinuto. Čvrsta supstanca je prikupljena filtracijom i ispirana sa vodom dok filtrat nije pokazao neutralnu pH vrednost. Proizvod, čvrsta supstanca, je osušen pod vakumom preko noći (55°C) i dobijeno je 44,0 g (85%) proizvoda u vidu bezbojne čvrste supstance.

Primer 2: Oksidacija proizvoda iz primera 1

Acetonitril (320ml) i voda (80ml) su dodati u acetil Cyclosporin A (42,97 g, 34,54 mmol) i smeša je mešana sve dok sav materijal nije bio rastvoren. Dodat je natrijum perjodat (14,777 g, 69,08 mmol), a zatim i rutenijum hlorid hidrat (0,358 g, 1,73 mmol), a zatim je reakciona smeša mešana 3h na sobnoj temperaturi u atmosferi N?. Dodata je voda (300ml) i smeša je prebačena u levak za ekstrakciju. Smeša je zatim ekstrahovana dva puta sa etil acetatom (300 mli onda još 250 ml). Tamno crni ekstrakti etil acetata su prikupljeni i objedinjeni i isprani sa 250 ml vode, pa zatim sa 250 ml koncentrovanog rastvora soli. Organski rastvor je zatim osušen iznad MgS04 i rastvarač je uparivan do zelenkastocrne čvrste supstance. Sirovi proizvod je razdvojen hromatografijom na silika gelu sa eluentom 40% aceton/60% heksan i dobijen je proizvod (29, lg, 68%) u vidu bezbojne čvrste supstance.

Primer 3: Pobijanje acetil ISAtx247 i) Dobijanje ilida in situ

Acetil ciklosporin A aldehid (31,84g, 25,84mmol) je dodato u 340ml toluena i smeša je mešana sve dok se materijal nije u potpunosti rastvorio. U dobijeni rastvor je dodato 340ml 1 normalnog NaOH u vodi. Dobijena smeša je energično mešana i dodat je alil trifenilfosfonijumbromid (58,22g, 15 l,90mmol). Reakciona smeša je mešana 24h na sobnoj temperaturi a zatim je dodato još alil trifenilfosfonijum bromida (16,64g, 43,42mmol) i mešanje je nastavljeno još 24h. Smeša je prebačena u levak za ekstrakciju i odvojena je toluenska faza. Vodena faza je ekstrahovana sa dodatnih 200ml toluena. Dva toluenska ekstrakta su prikupljena i udružena i isprana postepeno sa 200ml dejonizovane vode i 200ml zasićenog vodenog rastvora natrijumhlorida. Rastvor je osušen iznad MgSCfi, filtriran i toluen je uparavan do veoma viskoznog gela. Ovaj materijal je tretiran sa 142ml etil acetata i mešan do formiranja finog gustog rastvora. Postepeno je dodat heksan (570ml) uz brzo mešanje. Mešanje je nastavljeno tokom 30min, a zatim je dobijena suspenzija filtrirana i prikupljena čvrsta supstanca je isprana sa 160ml 5:1 heksa/etilacetata. Prikupljeni filtrati su udruženi i koncentrovani na rotacionom uparivaču do viskozne polučvrste supstance. Ovaj materijal je tretiran sa 75ml etilacetata i mešan do dobijanja finog gustog rastvrora. Polako je dodat heksan (225ml) uz brzo mešanje. Mešanje je nastavljeno još trideset minuta i onda je dobijena suspenzija filtrirana, a prikupljena čvrsta supstanca je isprana sa lOOml 5:1 heksan/etilacetata. Filtrat je koncentrovan na rotacionom uparivaču do bledožute čvrste supstance. Sirovi proizvod je razdvojen hromatografijom na silika gelu sa eluentom 40% aceton/60% heksan i dobijen je proizvod (14,09g) u vidu bezbojne čvrste supstance.

ii) Dobijanje preformiranog ilida i reakcija u prisustvu LiBr:

U suspenziju alil trifenilfosfonijum bromida (7,62g, 20mmol) u THF (20ml) koja sa mesa i koja je ohladjena na 0°C , je dodat rastvor KOBu u tetrahidrofuranu (20ml, 20mmol, IM rastvor) mešanje je nastavljeno na ovoj temperaturi još trideset minuta i dodat je rastvor LiBr u TFIF (lOml, lOmmol, IM rastvor). Reakciona smeša je zatim mešana trideset minuta i dodat je rastvor acetil CsA-aldehida (4,93g, 4mmol) u THF (10ml) kroz kanilu. Posle mešanja 15 minuta na sobnoj temperaturi u reakcionu smešu je dodat zasićen rastvor NH4CI (25ml). Dobijanje i hromatografsko razdvajanje kako je to gore opisano acetilovanog ISAtx247 u vidu bezbojne čvrste supstance. (3,5g).

Primer 4: Pobijanje ISAtx247

Acetil ISAtx247 (14,6g, 1 l,62mmol) je rastvoreno u 340ml metanola a zatim je dodato 135ml dejonizovane vode. Dodat je kalijumkarbonat (13,36g, 96,66mmol) i smeša je meašana na sobnoj temperaturi 24 do 48 časova dok reakcija nije završena. Većina metanola je uparena, a zatim je dodato 250ml acetata uz mešanje. Polako je dodato 10% vodeni rastvor limunske kiseline (120ml) a zatim je odvojena etil acetatna faza. Vodena faza je ekstrahovana sa dodatnih 200ml etil acetata. Prikupljeni etil acetatni ekstrakti su isprani postepeno sa 150ml dejonizovane vode, lOOml 10% vodenog rastvora limunske kiseline i 150ml zasićenog vodenog rastvora

natrijumhlorida i osušeni iznad MgS04. Etil acetat je uparavan do bledožute čvrste supstance. Sirovi proizvod je razdvojen hromatografijom na silika gelu sa eluatom 40% aceton/60% heksana i dobija se ISATX247 (10,51 g, 75%) u vidu bezbojne čvrste supstance. ISATx247 sadrži 45-50% izomera E i 50-55% izomera Z.

Porizvodi u primerima 1-4 su okarakterisani masenom spektroskopijom i/ili spektroskopijom nuklearne magnetne rezonancije.

Primer 5: Pobijanje acetil-n-bromociklosporina A

Acetil ciklosporin A (41,48g, 33,3mmol) dobijen kao što je opisano u primeru 1, N- bromosukcinimid (10,39g, 58,4mmol) i azo-bis-izobutironitril (l,09g, 6,67mmol) su rastvoreni u 250ml ugljenik tetrahlorida i dobijena smeša je zagrevana preko refluksa 2,5h. Smeša je ohladjena i rastvrarač je uparen. Ostatak je tretiran sa 350ml dietil etra i filtriran da bi se uklonio nerastvorljivi materijal. Filtrat je ispran postepeno sa 150ml vode i 150ml koncentrovanog rastvora soli, a zatim je osušen iznad magnezij um sulfata i rastvarač je uparen. Sirovi materijal jer razdvojen hormatografijom na silika gelu sa aceton/heksan (2:3) i dobija se 28,57g (65%) acetil-gama-bromociklosporina A u vidu žute čvrste supstance.

Primer 6: Pobijanje trifenilfosfonijum bromida od acetil ciklosporina A

Acetil-gama-bromociklosporin A (28,55g, 21,6mmol) i trifenilfosfm (7,55g, 28,8mmol) je rastvoreno u 21 Omi toluena i dobijeni rastvor je zagrevan do 100°C tokom 2 lh. Rastvor je zatim ohladjen i toluen je uparen. Dobijena je uljasta, polučvrsta supstanca koja je tretirana sa 250ml heksan/etar (1:4), detaljno izmešana i rastvarač je odvojen dekantovanjem. Ovaj proces je ponovljen još tri puta sa 150ml etra. Ostatak je zatim rastvoren u 50ml etil acetata i istaložen sa 220ml heksana. Dobijena čvrsta supstanca je zatim prikupljena filtracijom i tako je dobijeno 22,5g (66%) trifenilfosfonijum bromida od acetil ciklosporina A u vidu tamne, čvrste supstance. Primer 7: Wittig-ova reakcija

Pomešano je trifenilfosfonijum bromid od acetil ciklosporina (100mg, 0,06mmol), 37% formaldehida u višku (0,25ml) i toluen (2ml) i brzo mešano na sobnoj temperaturi. Vodeni rastvor natrijumhidroksida je dodat kap po kap 1N (2ml) i mešanje je nastavljeno još 3,5h. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom (20ml) i vodom (lOml). Odvojena je etil acetatna faza, postupno isprana sa vodom (10ml) i koncentrovanim rastvorom soli (lOml), osušena iznad magnezijumsulfata i rastvarač je uparen. Sirovi materijal je razdvojen hromatografijom na silika gelu sa aceton/heksan (2:3) i dobijeno je 70mg (88%) smeše izomera (E) i (Z) acetil ISAtx247 u vidu bezbojne čvrste supstance.

Primer 8: Deacetilaciia produkta Wittig-ove reakcije

Smeša izomera iz primera 7 (70mg, 0,056mmol) je rastvorena u metanolu (5ml) a zatim je dodata voda (lml). Dodat je kalijumkarbonat (75mg) i reakciona smeša je mešana 19h na

sobnoj temperaturi. Većina metanolaje uparena i dodato je 15ml etil acetata u ostatak, a zatim je dodato još lOml 10% vodenog rastvora limunske kiseline. Etil acetatna faza je odvojena i vodena fazaje ekstrahovana sa dodatnih lOml etil acetata. Prikupljeni etil acetatni ekstrakti su spojeni i postepeno isprani sa 10ml vode, lOml 10% vodenog rastvora limunske kiseline i lOml koncentrovanog rastvora soli, a zatim je smeša osušena iznad magnezijumsulfata i rastvarač je uparen. Sirov materijal je razdvojen hromatografijom na silika gelu na aceton/heksan (2:3) i dobijeno je 37mg (54%) 1SATx247 u vidu bezbojne čvrste supstance koja sadrži oko 85% izomera E i oko 15% izomera Z.

Proizvodi iz primera 5-8 su okarakterisani masenom spektroskopijom i/ili spektroskopijom nuklearne magnetne rezonancije.

Primer 9: Pobijanje geometrijskih izomera ISAtx247

Cis- i trans- izomeri ISAtx247 mogu biti nezavisno sintetisani po sledećoj šemi reakcija. Sekvenca uključuje poznatu metalaciju aliltrimetil silana, elektrofilno preuzimanje trimetilboratom, hidroliza i transesterifikacija da bi se dobilo intemedijerni trans- (trimetilsilil)alilboronatni estar. Alilboracija ciklosporin aldehida daje intermedijer koji sadrži bor, koji je preveden u željeni p-trimetilsilil alkohol sekvestracijom. Dijastereoselektivnost pri stvaranju novih hiralnih centara nije odredjena u ovoj fazi jer ovi centri bivaju uklonjeni u kasnijim fazama. Treba primetiti daje relativna stereohemija dva centra u (3-trimeitlsilil alkoholu anti što je u suglasnosti sa očekivanjima i posledica je trans-orijentacije dvostruke veze u trans - (trimetilsilil)boronatnog prekursora.

Eliminacijom (3-timetilsilil alokohola u baznim uslovima (Hurdlick i sar., 1975) se dobija kompozicija obogaćena acetil-(Z)-1,3-dienom dok se eliminacijom u kiselim uslovima dobija kompozicija obogaćena acetil-(E)-1,3-dienom. Uklanjanje zaštitne grupe odgovarajućih diena alkohola ISAtx247 izomera (Z) i (E).

Drugi mogući pristup dobijanju diena ide preko alilfosforana. Metalacija alildifenilfosfma i potom transmetilacija sa Ti(OPr)4 daje intermedijer koji sadrži titanijum. Aliltitanacija praćena stereospecifičnom eliminacijom generiše kompoziciju obogaćenu dienom (Z).

S druge strane, kada se alildifenilfosfin oksid podvrgne sličnom nizu reakcija (SL. 8), dobija se predominantno (75%) izomer E. i) Alilboracija acetil CsA-CHO:

(E)-l-trimetilsilil-l-propen-3-boronat je dobijen prema prethodno navedenim postupcima (Ikeda i sar., 1977.). U rastvor (E)-l-trimetilsilil-l-propen-3-boronata (0,2g, o,832mmol) u THF (3ml) koji se meša u atmosferi azotaje dodat acetil ciklosporin A aldehid (l,026g, 0,832mmol). Reakciona smeša je praćena tečnom hromatografijom sa visokom performansom (C-8 kolona,

reversna faza) i mešana u ukupnom trajanju od sedam dana. Zatim je dodat trietanolamin

(0,196g, lJjmmol) i mešanje je nastavljeno tokom daljeg perioda od četiri dana. (3-trimetilsilil

alkohol je dobijen prečišćavanjem na koloni silika gela. MS(ES) m/z 1368,9 (M+Na+).

U suspenziju KH (3,5mg, 26,4mmol, 30% disperzija mineralnog ulja isprana sa anhidrovanim heksanom) u anhidrovanom THF (lml) je dodat P-trimetiIsilil alkohol (lOmg, 7,4mmol) i mešano na sobnoj temperaturi 10 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa dietil etrom (10ml) i onda je isprana sa zasićenim rastvorom NaHC03 (2 x 5ml). Nakon sušenja (Na2S04) i uklanjanja rastvrarača dobijena je smeša obogaćena (Z)-acetil-l ,3-dienom. MS (ES) m/z 1294,8 (M+K+). ii) Aliltitanacija acetil CsA-CHO:

U rastvor alildifenilfosfma (0,54g, 2,4mmol) koja je mešana i ohladjena (-78 °C) u anhidrovanom THF (8ml) je dodat t-BuLi (l,42ml, 2,4mmol, 1,7M rastvor u pentanu). Rastvor boje cigle je mešan 15 minuta na ovoj temperaturi, a onda na 0°C 30min. Zatim je ponovo ohladjen na -78 °C i dodat je Ti(OPr')4 (0,71ml, 2,4mmol). Braon rastvor je mešan na ovoj temperaturi 15 minuta, a zatim je dodat rastvor acetil CsA-CHO (2,5g, 2mmol) u THF (10ml) kroz kanilu. Bledožuti rastvor je mešan tokom narednih 30 minuta, a zatim je zagrejan na sobnu temperaturu preko noći. U reakcionu smešu je dodato Mel (0,15ml, 2,4mmol) na 0°C. Mešanje je nastavljeno 1 sat na ovoj temperaturi i zatim na sobnoj temperaturi još 2 sata. Reakcija je prebačena u 1% HC1 (lOOml) na ledu. Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 x 50ml). Prikupljeni organski ekstrakti su spojeni i isprani sa vodom (2 x 25ml) i koncenrovanim rastvorom soli (25ml). Uklanjanjem rastvrarača je dobijena žuta čvrsta supstaca koja je razdvojena hromatografijom na koloni silika gela. Elucija sa 1:3 aceton-heksan smešom je dala acetil ISAtx247 obogaćen izomerom (Z). Uklanjanje zaštitne grupe kao u primeru 4 je dalo ISAtx247 obogaćen izomerom (Z) (odnos Z/E, 75:25)

Primer 10: Pobijanje ISAtx247 smeše obogaćene izomerom (E)

U rastvor alildifenilfosfm oksida (lmmol) i heksametilfosforamida (2mmol) u tetrahidrofuranu (5ml) na-78°C je dodat n-butillitijum (lmmol, u heksanu). Smeša je mešana na -78°C 30 minuta. Rastvor acetil ciklosporin A aldehida (0,8mmol) u tetrahidrofuranu (7ml) je dodat i reakciona smeša je ostavljena da se postepeno zagreje do sobne temperature, a zatim je mešana osam sati. Smeša je zatim prebačena u 1N hidrohlornu kiselinu (50ml) na ledu i onda je ekstrahovana etil acetatom. Organski ekstrakt je ispran sa vodom, osušen iznad magnezij um sulfata i rastvarač je uparen. Ostatak je razdvojen hromatografijom na silika gelu sa 25% aceton/75% heksan i dobijena je smeša izomera acetil ISAtx247 (E) i (Z). Uklanjanjem acetatne grupe za zaštitu kao što je to opisano u primeru 4 je dobijena ISAjx247 smeša izomera obogaćena izomerom (E). Protonska NMR spektroskopija je pokazala da se smeša sastoji od 75% izomera (E) i 25% izomera (Z). Ova rakcija je takodje izvršena prema Schlosserovoj modifikaciji (R. Liu, M. Schlosser, Synlett, 1996, 1 195). U rastvor alildifenilfosfm oksida (1,21 g, 5mmol) u THE (20ml) koji je mešan i ohladjen na-78°C je-dodat n-BuLi (2ml, 5mmol, 2,5M rastvor u heksanu). Crveni rastvor je mešan 40 minuta na-78°C. Zatim je dodat rastvor acetil CsA-CHO (l,25g, l,02mmol) u THF (12ml) kroz kanilu tokom 15 minuta. Reakciona smeša je mešana 2h na sobnoj temperaturi. Dobijanje i razdvajanje hromatografijom je uradjeno kao što je to gore opisano i dobijen je acetil ISATx247 (odnos Z:E, 40:60 'H NMR analizom). Primer 11: Pobijanje modifikovanog ciklosporina A sa zaštitnom benzoil grupom

Ciklosporin A (6,0lg, 5mmol) i 4-metilaminopiridin (305mg, 2,5mmol) su rastvoreni u piridinu (50ml). Dodat je anhidrid benzoeve kiseline (3,4g, 15mmol) i smeša je mešana 19 sati na 50°C. Dodato je još anhidrida benzoeve kiseline (l,7g, 7,5mmol) i DMAP (305mg, 2,5mmol) i nastavljeno je mešanje na 50°C naredna 24 časa. Dodat je anhidrid benzoeve kiseline (0,85g, 3,8mmol) i reakciona smeša je mešana još 23 časa. Reakciona smeša je zatim prebačena polako u vodu uz mešanje. Istaloženi ciklosporin A benzoat je odvojen filtriranjem i ispran sa vodom. Prikupljeni kolač je rastvoren u minimalnoj zapremini metanola i rastvor je dodat 10% rastvor limunske kiseline i mešanje 1 sat. Istaloženi proizvod je prikupljen filtriranjem i ispran sa vodom sve dok pH vrednost filtrata nije dostigla pH vode. Čvrsti ciklosporin A benzoat je osušen na 50°C pod vakumom i tako je dobijena bezbojna čvrsta supstanca.

Primer 12: Pobijanje trietilsilil etrom modifikovanog ciklosporina A

Ciklosporin A (3,606g, 3mmol) je rastvoren u suvom (bezvodnom) piridinu (8ml), a zatim je dodat DMAP (122mg, lmmol). Reakciona smeša je ohladjena na 0°C, a zatim je trietilsilil trifluorometansulfat (3,6mmol) dodat kap po kap. Smeša je ostavljena da se ohaldi na sobnoj temperaturi i mešana preko noći. Reakciona smeša je polako prebačena u vodu uz mešanje. Istaloženi trietilsilil etar je odvojen filtriranjem i ispran je.sa vodom. Prikupljeni kolač je rastvoren u minimalnoj zapremini metanola i dodat u 5% rastvor sirćetne kiseline i mešan 30 minuta. Istaloženi proizvod je prikupljen filtriranjem i ispiran u vodi sve dok pH vrednost filtrata ne dostigne pH vode. Čvrsti trietilsilil etar je osušen na 50°C pod vakumom i dobijena je bezbojna čvrsta supstanca. Grupe za zaštitu, triizopropilsilil i /erc-butildimetilsilil su uvedene u molekul prema sličnoj proceduri.

Primer 13: Imunosupresivna aktivnost prema testu za odredjivanje inhibicije kalcineurina

Indikator efikasnosti delovanja ciklosporina A i derivata ciklosporina A je sposobnost da inhibiraju fosfataznu aktivnost kalcineurina. Testom za odredjivanje inhibicije kalcineurina meri se aktivnost leka na mestu njegovog delovanja i kao takav, test je direktna in vitro procena jačine delovanja analoga ciklosporina A (Fruman i sar., 1992).

Imunosupresivno delovanje ISAjx247 (45-50% izomera E i 50-55% izomera Z) u poredjenju sa ciklosporinom A je procenjena preko testa inhibicije kalcineurina (CN). Rezultati ovog testa pokazuju daje inhibicija fosfatazne aktivnosti kalcineurina sa ISAjx247 (45-50% izomera E i 50-55% izomera Z) i do 3 puta snažnija (što se odredjuje preko IC50) u poredjenju sa ciklosporinom A (SL. 11).

Imunosupresivna aktivnost obeleženih deuterijumom i neobeleženih analoga smeše izomera u odnosu na cikosporin A je procenjena preko testa inhibicije kalcineurina (CN). Struktura i sastav smeše izomera ovih analoga su prikazane na slici 12. Na slici 12 oznaka "14" odgovara strukturi ISAtx247. I4-M2 označava ISATx247 dobijen prema postupku koji je opisan u Primerima 5-8 (označeno kao postupak 2 na ovoj slici). I4D4 označava ISAtx247 obeležen deuterijumom, dobijen prema postupku opisanom u primerima 1-4. I4-D2 označava ISATx247 obeležen deuterijumom dobijen prema postupku koji je opisan u primerima 5-8. Druge smeše izomera su prikazane na slici.

Rezultati ovog testa pokazuju da inhibicija fosfatazne aktivnosti kalcineurina posredstvom ovih smeša izomera analoga je u najmanjem bila jednako snažna (odredjeno preko IC50) kao delovanje ciklosporina A (Slika 13). CsA označava Cyclosporine A; Izociklo4 označava ISAjx247 dobijen prema postupku opisanom u primerima 1-4. Izociklo 5 označava 15- M1 na slici 12. Izociklo4-d4 odgovara I4-D4 na slici 12. Izociklo5-d5 odgovara I5-D5 na slici 12. Izociklo4-d2 odgovara I4-D2 na slici 12.Izociklo4-M2 odgovara I4-M2 na slici 12. Izociklo5-m2 odgovaraI5-M5 sa slike 12.

Primer 14: Odredjivanje imunosupresivne aktivnosti na modelu transplantiranog srca kod pacova

Efikasnost ISAtx247 (45-50% izomera E i 50-55% izomera Z) u sprečavanju odbacivanja srca transplantiranog sa jednog na drugi soj pacova je procenjena i uporedjena sa delovanjem ciklosporina A. Model transplantiranog srca kod pacova je do sada najčešće upotrebljavani model za odredjivanje in vivo delovanja novih imunbsupresiva, jer je teško postići produženo preživljavanje presadjenog kalema u ovom modelu zbog imunološke reakcije odbacivanja kalema.

Procedura uključuje heterotopijsko presadjivanje (u abdominalnu aortu i inferior vena cava) srca iz NVistar Furth pacova u Levvis pacove. Intraperitonealne injekcije bilo ciklosporina A bilo smeše izomera analoga su davane primaocu kalema sa početkom 3 dana pre transplantacije i računajući 30 dana posle transplantacije. Ukoliko je disfunkcija kalema primećena u toku perioda od 30 dana posle transplantacije, životinja je žrtvovana. Ako je životinja preživela duže od 30 dana nakon transplantacije, praćenje tretiranih primeraka i kontrolnih je prekinuto i životinja je puštena da nastavi da živi do disfunkcije kalema ili do 100 dana nakon transplantacije.

Prosečne stope preživljavanja za svaku grupu životinja primalaca su zbirno prikazane u tabeli 1. Ovi rezultati pokazuju da ISAyx247 (45-50% izomera E i 50-55% izomera Z) pri optimalnoj dozi od 1,75 mg/kg/dan povećava vreme preživljavanja približno 3 puta u odnosu na ciklosporin A. Ođredjeni broj životinja koje su primale ISAjx247 još uvek su imale funkcionalne kaleme 100 dana nakon transplantacije (tj., 70 dana nakon prekida doznog tretmana). Ovi podaci jasno pokazuju da ova smeša izomera analoga ima imunosupresivno delovanje u sprečavanju odbacivanja kalema.

",c Nema značajnih razlika h Značajna razlika (p<0,01)

Delotvornost različitih deuterijumom obeleženih i neobeleženih smeša izomera analoga (strukture prikazane na slici 12) u sprečavanju odbacivanja srca koja su presadjena sa jednog soja pacova na drugi, je takodje procenjena i uporedjena sa ciklosporinom A. Primenjene doze su 1,75 mg/kg/dan tokom 30 dana. Rezultati su zbirno prikazaniu tabeli 2. Ovi rezultati pokazuju da su smeše izomera u dozi od 1,75 mg/kg/dan povećale vreme preživljavanja najmanje isto onoliko koliko i ciklosporin A i jasno ukazuju na imunosupresivno delovanje ovih smeša izomera analoga u sprečacvanju odbacivanja kalema.

Primer 15: Imunosupresivno delovanje u ćelijama ostrvaca alotransplantata

Svojstvo ISAtx247 (45-50% izomera E i 50-55% izomera Z) da prolongira opstanak presadjenih ćelija ostrvaca na mišjem modelu, u odnosu na ciklosporin A, je ispitivano u istraživanju koje uključuje transplantat od 500 ćelija iz CBA/J miša u renalnu kapsulu dijabetičnog Balb/c miša primaoca.

Nakon transplantacije, ISAtx247 ili ciklosporin A je primenjen intraperitonealnom (i.p.) injekcijom u dozi od 0 (vehikulum), 1,75, 10, 20 ili 25 mg/kg/dan tokom 30 dana. Nivo glukoze u krvi je praćen svakodnevno do otkazivanja kalema, na šta ukazuje nivo glukoze u krvi, koji je u tom slučaju veći od 17 mmol/L u dva uzastopna dana.

Rezultati pokazuju da ISAjx247 povećava vreme preživljavanja kalema za 40 % pri dozi od 20 mg/kg/dan (tabela 3). Takodje je primećeno daje ISAtx247 imao manje toksične efekte u poredjenju sa ciklosporinom A kako je dozna količina povećavana. Ova prednost ISAjx247 je naročito uočljiva pri dozi od 25 mg/kg/dan.

Primer 16: Imunosupresivno delovanje kod artritisa

Tokom poslednje tri decenije, detaljno su ispitivana tri životinjska modela humanog reumatoidnog artritisa i široko su primenjivani u prekliničkim ispitivanjima, kao i za dobijanje i razvoj novih antireumatika. Ovi modeli su: adjuvansom indukovani, kolagenom indukovani i antigenom indukovani artritis. Sledeća istraživanja su dizajnirana za odredjivanje antiinflamatornog delovanja ISATx247 (45-50% izomera E i 50-55% izomera Z) kako na modelu artritisa indukovanog kolagenom kod miša, tako i na modelu artritisa indukovanog antigenom kod kunića. Histopatološki i imunopatološki nalazi koji su nadjeni kod ova dva modela izgledaju kao nalazi kod obolelih ljudi. U oba modela ispitivana je delotvornost ISATx247 u sprečavanju pojave artritisa (protokol za prevenciju) i delotvonosti u lečenju artritisa (protokol za terapijski tretman). Ova istraživanja idu u prilog imunosupresivnom delovanju pomenutih smeša izomera analoga.

A. Artritis indukovan kolagenom

Mužijaci DBA/1 Lac J miša, koji su gajeni pod uslovima bez virusnih antitela, su imunizovani subkutano pri starosti od osam do deset nedelja sa 100 mikrograma pilećeg kolagena tip 11 u Freund-ovom kompletnom adjuvansu. ISAtx247, ciklosporin A ili vehikulum (Chremophor EL/etanol 72:28, zapremina/zapremina) su primenjeni dnevno intraperitonealnom (i.p.) injekciom u razblaženjima stoka leka 1-do 50- puta (0,25, 0,5 ili 1 mg/ml) u fiziološkom rastvrou i pri tome se dobijaju sledeće koncentracije, 0 (vehikulum); 125, 250 ili 500mg/miš za ISAtx247: i 250 ili 500mg/miš za ciklosporin A. Životinje koje su rasporedjene u protokol za prevenciju (12/grupa) su dobile dozu počevši od dana imunizacije sa kolagenom (nulti dan) do žrtvovanja 40. dana. Životinje koje su rasporedjene u protokol za terapijski tretman (12/grupa) su dobile dozu počevši od dana pojave bolesti (~28. dan) do žrtvovanja 38. dana.

Medju procenjivane parametre se ubrajaju mortalitet, nivo kreatinina u serumu, histologija i procena ishoda, kao stoje klinički skoring (vizuelni), oticanje zadnje šape, histološki skoring, erozioni skoring i imunohistohemija.

Erozioni skoring je uradjen pregledanjem sagitalnih delova proksimalnog intefalangealnog zgoba (PIP) srednjeg prsta i utvrdjivanje prisustva ili odsustva erozija (defmisane kao demarkirani defekti hrskavice ili kost ispunjena inflamatornim tkivom). Ovaj pristup omogućava poredjenje promena na istom zglobu. Ranija ispitivanja su pokazala erozije kod >90% netretiranih životinja koje su imale artritis u ovom zglobu.

Rezultati pokazuju da su negativni erozioni skorovi u grupi koja je tretirana visokom dozom ISAtx247 (500 mikrograma/miš) značajno veći u odnosu na negativne erozione skorove u grupi koja je tretirana vehikulumom (p<0,05). I grupe koje su tretirane srednjom dozom ISAtx247 (250 pg /miš) i visokom dozom ciklosporina A (500 pg /miš) su imale veći negativni erozioni skor u odnosu na grupu tretiranu vehikulumom (p<0,l). Sta više, grupe tretirane niskom dozom 1SAtx247 (125 pg /miš) i srednjom dozom ciklosporina A kontrola (250 mikrograma/miš) imaju više, iako ne statistički značajane, negativne erozione skorove u poredjenju sa vehikulum-kontrolnom grupom.

Jedini tretman koji je značajno sprečio razvoj erozije zgloba je ISAtX247 u dozi od 500 pg/miš. Ovo značajno smanjenje u broju PIP zglobova koj su zahvaćeni erozivnim promenama kod miševa koji su tretirani sa 1SAtx247 u odnosu na kontrolnu grupu miševa sa vehikulumom, jasno pokazuje da ISAtx247 poseduje osobinu da modifikuje bolest.

Eh Artritis indukovan antigenom

Novozelandski beli kunići gajeni pod specifičnim uslovima bez patogena su imunizovani sa lOmg ovalbumina u fiziološkom rastvoru sa kompletnim Freund-ovim adjuvansom koji je primenjen intramuskularno i subkutano na različitim mestima sa zadnje strane vrata. 14 dana kasnije, sve životinje su počele da primaju dve dnevne intraartikularne injekcije od 5mg ovalbumina i 65ng humanog rekombinanrnog transformišućeg faktora rasta 2 u fiziloškom rastvoru.

ISAtx247, ciklosporin A ili vehikulum (Chremophor EL/etanol 72:28, V/V) su primenjeni dnevno u vidu subkutanih injekcija 1-do 4- puta razblaženjima štok rastvora leka (u vehikulumu); 2,5, 5,0 ili 10mg/kg/dan za 1SAtX247; i 5,0, 10 ili 15 mg/kg/dan za cikolosporin A. Životinje koje su rasporedjene u protokol za prevenciju (8/grupa) su primile dozu počevši od dana imunizacije sa ovalbuminom (nulti dan) do žrtvovanja 42. dana. Životinje koje su rasporedjene u protokol za terapijski tretman (8/grupa) su primile dozu počevši od dana kada se pojavila bolest (~28. dan) do žrtvovanja 42. dana.

Medju parametrima koji su odredjeni su mortalitet, telesna težina, nivo kreatinina u serumu, histologija i procenjivanje ishoda kao što je oticanje kolenog zgloba, broj ćelija u sinovijalnoj tečnosti, makroskopska postmortem analiza i histologija.

Značanjo samnjenje sinovijskih histopatoloških skorova je zapaženo kod ISAtx247 (P 0,05) i kod ciklosporina A (P 0,05) posle 28 dana terapije (protokol za prevenciju) u odnosu na životinje koje su primile vehikulum-kontrole. Ovo je praćeno značanjim smanjenjem broja ćelija u sinovijalnoj tečnosti (ISAtX247, P 0,05; ciklosporin A, P 0,05). Bilo je evidentno značajno poboljšanje u sinovijskim histopatološlcim skorovima kod životinjakod kojih je ustanovljen artritis nakon četrnaest dana od tretmana sa ISArX247 (P 0,05) i ciklosporinom A (P 0,05) u poredjenju sa vehikulumom-kontrole (protokol za terapijski tretman). Značajno smanjenje u skoru makroskopskog artritisa je bilo evidentno kod ISArX247 (P=0,1), ali ne i kod životinja tretiranih ciklosporinom A. Tetman je dobro podnošen bez značajnih toksičnih efekata pri analizi serumskog kreatinina ili post mortem histologije.

Podatci pokazuju daje delovanje ISAtX247 jednako ili potencijalno snažnije u odnosu na ciklosporin A, u lečenju i prevenciji reumatoidnog artritisa na modelu artritisa indukovanog antigenom kod kunića.

Primer 17: Farmakokinetičke i toksikokinetičke osobine

Farmakokinetički i toksikokinetički parametri ISATx247 (45-50% izomera E i 50-55% izomera Z) i ciklosporina A su ispitivani na modelu kunića. Kunić se takodje koristi kao model sistem za ispitivanje nefrotoksičnosti ciklosporina A, ali mnogo redje nego na modelu pacova. Istraživanja su pokazala da primena ciklosporina kod kunića dovodi do strukturnih i funkcionalnih promena pri dozi ne samo nižoj u odnosu na ranije primenjivane na drugim životinjskim modelima, nego takodje u okviru najmanje gornjeg nivoa terapijskog opsega kod ljudi (Thliveris i sar., 1991, 1994). POred citoloških promena na tubulama, nadjena je i intersticijalna fibroza i arteriolopatija, što upućuje na zaključak daje kunić pogodniji model za ispitivanje nefrotoksičnosti, budući da su ovi strukturni entiteti glavni pokazatelji nefrotoksičnosti kod ljudi. ISAtx247 je primenjen intravenski (i.v.) tokom prvih 7 dana i subkutano (s.c.) tokom narednih 23 dana prema sledećem programu.

Korišćeni su kunići oslobodjeni od patogena (SPF) da bi bili sigurni daje svaka zapažena promena na bubrezima posledica efekta ISAtx247, a ne prisustva patogena. Uzorci su prikupljeni 1. i 7. dana pre primene leka i 0,5., 1., 2., 4., 8., 12., 18. i 24. časa postdozno, kako bi napravili farmakokinetički profil. Medju druge odredjivane parametre ubrajaju se kliničko posmatranje, telesna težina, uzimanje hrane, hematologija, klinička biohemija, upadljiva patologija, i histopatološko ispitivanje odabranih organa/tkiva.

Uzorci krvi su analizirani tečnom hromatografijom visoke performanse u kombinaciji sa masenom spektroskopijom (LCMS). Tabela 5 dole zbirno prikazuje prosečne farmakokinetičke parametre kod kunića koji su primili 10 mg/kg ciklosporina A ili ISAjx247.

Nije bilo statistički značajnih razlika izmedju farmakokinetičkih parametara ciklosporina A i ISAtx247 kod mužjaka kunića koji su primali 10 mg/kg/dan. Farmakokinetički parametri ISAjx247 kod ženki kunića koje su primile istu dozu nisu bile značajno različiti u odnosu na one koji su zabeleženi kod mužjaka, izuzev maksimalne koncentracije 7. dana.

Nije bilo značajnih promena ni u hematološkim parametrima kunića koji su primali vehikulum-kontrolne, ciklosporin A ili ISAjx247. Razlika je zapažena u nivou kreatinina u različitim grupama u toku istraživanja, kao što će se videti iz tabele 6 dole. Ove razlike su ukazale na to da ciklosporin A ima značajno veće negativno delovanje na bubrege u odnosu na kako vehikulum-kontrolu, tako i ISAtx247. Treba zapaziti da čak i pri 50 % većoj dozi, 15 mg/kg/dan, u poredjenju sa 10 mg/kg/dan ciklosporina A, ISAtx247 nije doveo do bilo kakvog značajnog povećanja u nivou kreatinina.

Ispitivanje organa kod svih kunića koji su primili vehikulum-kontrola, 10 mg/kg ciklosporina A, 5 mg/kg ISAtx247, ili 10 mg/kf ISAtx247 nije pokazalo značajne abnormalnosti. Ovo važi naročito za bubrege, kod kojih nisu pronadjeni znaci intersticijalne fibroze, koja se normalno može naći kod životinja koje su tretirane sa ciklosporinom A

Claims

1.Kompozicija koja se sastoji od smeše izomera analoga cikoosporina koji je modifikovan na 1-aminokiselinskom ostatku sa 1.3-dienskim supstituentom, naznačena time što je opseg sastava smeše dienom supstituisanog izomera oko l 0% do oko 90% izomera E i oko 90% do oko 10% izomera Z.

2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena je time što su izomeri neobeleženi deuterij umom izomeri E i Z kao što je navedeno dole: izomer E izomer Z

3.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 15% do oko 85% izomera E i oko 85% do oko 15% izomera Z.

4.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 25% do oko 75% izomera E i oko 25% do oko 75% izomera Z.

5.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 35% do oko 65% izomera E i oko 65% do oko 35% izomera Z.

6.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 45% do oko 55% izomera E i oko 55% do oko 45% izomera Z.

7.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 45% do oko 50% izomera E i oko 50% do oko 55% izomera Z.

8.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 50% do oko 55% izomera E i oko 45% do oko 50% izomera Z.

9.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 55% do oko 65% izomera E i oko 35% do oko 45% izomera Z.

10.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 65% do oko 75% izomera E i oko 25% do oko 35% izomera Z.

11.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 75% do oko 85% izomera E i oko 15% do oko 25% izomera Z.

12.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 85% do oko 90% izomera E i oko 10% do oko 15% izomera Z.

13.Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se smeša izomera sastoji od oko 90% do oko 95% izomera E i oko 5% do oko 10% izomera Z

14.Farmaceutska kompozicija koja se sastoji od smeše izomera analoga ciklosporina prema bilo kom od patantnih zahteva od 1 do 13 i farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta.

15.Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13, koja se sastoji od tečnog rastvora koji sadrži površinski aktivnu supstancu (surfaktant), etanol, lipofilni i/ili amfifilni rastvarač.

16.Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14, koja se sastoji d-alfa tokoferil polietilen glikol 1000 sukcinata (vitamin E TPGS), ulja triglicerida srednjeg niza (MCT), Tween 40 i etanola.

17.Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13, koja se sastoji od želatinske kapsule koja sadrži smešu izomera analoga, tečni rastvor koji sadrži površinski aktivnu supstancu, etanol, liofilni i/ili amfifilni rastvarač.

18.Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 15 do 16, naznačena time što je u obliku jedinica za doziranje.

19.Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 17, naznačena time što sadrži izmedju od oko 5 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka.

20.Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 16, naznačena time što sadrži 50 mg smeše izomea.

21.Farmaceutska kompozicija prema patentni m zahtevima 14 ili 15, naznačena time što rastvor sadrži 50mg/ml smeše izomera.

22.Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13, koja je prilagodjena za oralnu primenu.

23.Postupak za ostvarivanje imunosupresivnog delovanja naznačen time se sastoji od primene kod životinje kojoj je ovakva terapija potrebna, efektivne količine smeše

24.Postupak prema patentnom zahtevu 22, naznačen time što je pomenuta životinja čovek.

25.Postupak prema patentnom zahtevu 22 naznačen time što je količina smeše izomera analoga ciklosporina oko 0,05 mg do oko 50 mg po kg telesne težine dnevno.

26.Postupak prema patentnom zahtevu 24 naznačen time što je količina smeše izomera ana loga ciklosporina oko 0,1 mg do oko 10 mg po kg telesne težine dnevno.

27.Postupak prema patentnom zahtevu 25 naznačen time što je količina smeše izomera analoga ciklosporina oko 0,5 mg do oko 10 mg po kg telesne težine dnevno.

28.Postupak prema patentnom zahtevu 26 naznačen time što je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina oko 2 do oko 6 mg/kg/dan, oralno primenjena b.i.d.

29.Postupak prema patentnom zahtevu 27 naznačen time što je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina oko 0,5 do oko 3 mg/kg/dan, oralno primenjena b.i.d.

30.Postupak za smanjivanje toksičnog delovanja imunosupresivnog analoga ciklosporina, pripremanjem smeše izomera analoga za upotrebu u svojstvu imunosupresivnog sredstva.

31.Postupak prema patentnom zahtevu 29 gde pomenuta smeša izomera sadrži kompoziciju prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 12.

32.Postupak prema patentnom zahtevu 29 ili 30 naznačen time što je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina oko 0,05 mg do oko 50 mg po kg telesne težine dnevno.

33.Postupak prema patentnom zahtevu 31 naznačen time što je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina oko 0,1 mg do oko 10 mg po kg tel esne težine dnevno.

34.Postupak prema patentnom zahtevu 32 naznačen time što je količina primenjene smeše izomera ana loga ciklosporina oko 0,5 mg do oko 10 mg/kg/dnevno.

35.Postupak prema patentnom zahtevu 33 naznačen time što je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina oko 2 mg do oko 6 mg/kg dnevno, oralno primenjeno b.i.d.

36.Postupak prema patentnom zahtevu 34 naznačen time što je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina oko 0,5 mg do oko 3 mg/kg/dnevno primenjeno oralno b.i.d.

37.Postupak za povećavanje efikasnosti imunosupresivnog delovanja analoga cilosporina pripremanjem smeše izomera analoga, za upotrebu u svojstvu imunosupresivnog sredstva.

38.Postupak prema patentnom zahtevu 36 gde se pomenuta smeša izomera sastoji od kompozicije prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 12.

39.Postupak prema patentnom zahtevu 36 ili 37 gde je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina je oko 0,05 mg do oko 50 mg po kilogramu telesne mase dnevno.

40.Postupak prema patentnom zahtevu 38 gde je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina je oko 0,1 mg do oko 10 mg po kilogramu telesne mase dnevno.

41.Postupak prema patentnom zahtevu 39 gde je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina je oko 0,5 mg do oko 10 mg/kg/dan.

42.Postupak prema patentnom zahtevu 40 gde je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina je oko 2 mg do oko 6 mg/kg/dnevno, primenjeno oralno b.i.d.

43.Postupak prema patentnom zahtevu 41 gde je količina primenjene smeše izomera analoga ciklosporina je oko 0,5 mg do oko 3 mg/kg/dnevno, primenjeno oralno b.i.d.

44.Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 22 do 42 naznačen time što je predvidjeno da pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem leči ili ublažava akutno odbacivanje presadjenog organa ili tkiva.

45.Postupak prema patentnom zahtevu 43 naznačen time što je pomenuto odbacivanje kalema odabrano iz grupe koju čine srce, pluća, zajedno srce i pluća, jetra, bubreg, pankreas, koža, creva i komealni transplantati.

46.Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 22 do 42 gde pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem leči ili ublažava odbacivanje trsnsplantata posredovano T ćelijama.

47.Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 22 do 42 gde pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem leči ili ublažava bolest kalema protiv domaćina.

48.Postupak prema patentnom zahtevu 46 naznačen time što pomenuto oboljenje sledi nakon transplantacije kostne srži.

49.Postupak prema bilo kojem od zahteva 22 do 42 naznačen je time što pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem leči ili ublažava hronično odbacivanje transplantiranog organa.

50.Postupak prema patentnom zahtevu 48 gde je pmenuto hronično odbacivanje bolest krvnih sudova kalema.

51.Postupak prema bilo kojem od zahteva 22 do 42 naznačen je time što pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem leči ili ublažava hronično odbacivanje ksenokalema.

52.Postupak prema patentnom zahtevu 50 naznačen time što je pomenuto odbacivanje ksenokalema odabrano iz grupe koju čine akutno, hiperakutno i hronično odbacivanje organa kada je davalac organa pripadnik druge vrste u odnosu na primaoca.

53.Postupak prema patentnom zahtevu 51 gde je pomenuto odbacivanje ksenokalema posredovano B ćelijama ili odbacivanje posredovano antitelima.

54.Postupak prema bilo kojem od zahteva 22 do 42 naznačen je time što pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem leči ili ublažava autoimunsko oboljenje ili stanje ili inflamatomo oboljenje ili stanje.

55.Postupak prema patentnom zahtevu 53 gde je pomenuto oboljenje ili stanje odabrano iz grupe koju čine artritis, reumatoidni artritis, arthritis chronica progrediente, arthritis deformans i druge reumatoidne bolesti.

56.Postupak prema patentnom zahtevu 53 gde je pomenuto oboljenje ili stanje odabrano iz grupe koju čine hematološki poremećaji, hemolitička anemija, apalstična anemija, čisto eritrocitna anemija, idiopatska trombocitopenija, sistemski eritemski lupus, polihondritis, skleroderma, Wegener-ova granulomatoza, dermatomiozitis, hronični aktivni hepaititis, miastenia gravis, psorijaza, Steven-Johnson-ov sindrom, idiopatski sprue, (autoimunski) inflamatoma bolest creva, ulcerativni kolitis, Chron-ova bolest, endokrina oftalmopatija, Graves-ova bolest, sarkoidoza, multipla skleroza, primarna ciroza žuči, juvenilni dijabetes (diabetes melitus tipa I), uveitis (anteriomi i posteriorni), suvi keratokonjuktivitis sicca, prolećni keratokonjuktivitis, intersticijalna fibroza pluća, psorijazni artritis, glomerulonefritis, idiopatski nefrotski sindrom, nefropatija sa minimalnim promenama i juvenilni dematomiozitis.

57.Postupak prema patentnom zahtevu 53 gde je pomenuto oboljenje ili stanje odabrano iz grupe koju čine psorijaza, kontaktni dermatitis, atopijski dermatits, kružna alopecija, erythema multiforma, dertmattits herpetiformis, sklerodemla, vitiligo, hipersenzitivni angiitis, urtikaria, bulozni pemfigoid, eritemski lupus, pemfigus, epidermolysis bullosa acquisita, druga inflamatoma ili alergijska stanja kože, inflamatoma stanja pluća I disajnih puteva, astma, alergije i pneumokonioza.

58.Kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do12 kao terapeutske kompozicije.

59.Upotreba kompozicije prema bilo kojem patentnom zahtevu 1 do 12 u cilju dobijanja Jeka koji će imati imunosupresivno delovanje u prevenciji odbacivanja alokalema ili ksenokalema, poželjno je bubrega, srca, jetre, ili u prevenciji ili lečenju autoimunskih stanja, pogotovo reumatoidnog artritisa ili psorijaze.

60.Postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 22 do 42 naznačen je time što pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem treba da spreči akutno odbacivanje presadjenih organa ili tkiva.

61.Postupak prema bilo kojem od zahteva 22 do 42 gde pomenuto imunosupresivno delovanje ili sredstvo sa imunosupresivnim delovanjem treba da spreči autoimunsko oboljenje ili stanje ili inflamatomo oboljenje ili stanje.

62.Upotreba smeše izomera analoga ciklosporina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 12 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojem od patentnih zahteva 13 do 21 u proizvodnji Jeka za ostvarivanje imunosupresivnog delovanja kada se primeni kod životinje.

63.Upotreba prema patentnom zahtevu 61 nazančena time što je životinja čovek.

64.Upotreba prema patentnom zahtevu 61 gde je količina smeše izomera analoga ciklosporina za primenu oko 0,05 mg do oko 50 mg po kilogramu telesne težine dnevno.

65.Upotreba prema patentnom zahtevu 63 gde je količina smeše izomera analoga ciklosporina za primenu oko 0,1 mg do oko 10 mg po kilogramu telesne težine dnevno.

66.Upotreba prema patentnom zahtevu 64 gde je količina smeše izomera analoga ciklosporina za primenu oko 0,5 do oko 10 mg/kg/dnevno.

67.Upotreba prema patentnom zahtevu 65 gde je količina smeše izomera aruloga ciklosporina za primenu oko 2 do oko 6 mg/kg/dnevno, primenjeno oralno b.i.d.

68.Upotreba prema patentnom zahtevu 66 gde je količina smeše izomera analoga ciklosporina za primenu oko 0,5 mg do oko 3 mg/kg/dnevno, primenjeno oralno b.i.d.