JP2011006417A - シクロスポリン類似体混合物及びそれらの免疫調整剤としての使用 - Google Patents

Abstract

【課題】高い効果及び低い毒性を有するシクロスポリン類似体の異性体混合物の提供。
【解決手段】ＩＳＡ_ＴＸ２４７と呼ばれるシクロスポリンＡ類似体のシス及びトランス−異性体の混合物は、天然及び現在公知のシクロスポリン類に比べてより高い効力とより低い毒性との組合わせを示す。ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体及びアルキル化、アリール化、及び重水素化誘導体は、立体選択的経路によって合成され、その際特定の反応条件が立体選択性の程度を決める。立体選択性経路は、ウィッティヒ反応を利用し、又はホウ素、珪素、チタン、及びリチウムなどの無機元素を含む有機金属試薬を使用することができる。混合物中の異性体の比率は、混合物の総重量を基準にして、約１０ないし９０重量パーセントの（Ｅ）−異性体から約９０ないし１０重量パーセントの（Ｚ）−異性体までの範囲である。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は２００１年１０月１９日に提出された米国特許出願第６０／３４６，２０１号及び２００２年４月５日に提出された米国特許出願第６０／３７０，５９６号に基づく優先権を請求する。これら各出願の全ての開示は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。

本発明は、シクロスポリンＡに関係するシクロスポリン類似体の異性体混合物類に関するものである。これらの混合物は、個々の異性体に比べて、及び天然、及びその他の現在公知のシクロスポリン類及びシクロスポリン誘導体類に比べて、高い効果及び／又は低い毒性を有すると考えられる。さらに本発明は、シクロスポリンＡ類似体の異性体を生成する合成経路に関し、その際このような経路では特異的反応条件によって立体選択性の程度が種々変動する。

下記の文献は本願に関連しており、本明細書の該当部分に、特許番号もしくは出願番号、又は著者名と発行年を括弧書きで記して、本明細書において参照する。

１．ベネット（Bennett,W.M.）著、「新旧の免疫抑制剤の腎臓毒性」、Renal Failure, Vol. 20, p.687-90(1998)。 ２．ビールマン（J.-F. Biellmann）、ドュセプ（J.-B. Ducep）著、「ヘテロ原子によって置換されたアリルカルボアニオン及びベンジルカルボアニオン」、Organic Reactions、Vol.27,（ウィリー、ニューヨーク、1982）,p. 9。 ３．カールセン（H. J. Carlsen）ら著、「四酸化ルテニウム触媒による有機化合物の酸化法の顕著な改良」, J. Org. Chem., Vol.46, No.19, p.3736-3738 (1981)。 ４．チャング（T. Chang）、ベネット（L. Z. Benet）、ヘバート（M. F.Hebert）著、「健康な志願者におけるシクロスポリンの薬物導体に与える水溶性ビタミンＥの影響」, Clin.Pharmacol. Ther., Vol.59, p. 297 - 303(1996)。 ５．エバール（M. K. Eberle）、ナニンガー（F. Nuninger）著「シクロスポリンＡの主代謝産物（ＯＬ−１７）の合成」, J. Org. Chem., Vol.57, p.2689-2691 (1992)。 ６．エーリンガ（E. Ehlinger）、マグナス（P. Magnus）著、「合成における珪素。１０．（トリメチルシリル）アニオン：アルデヒド及びケトンをγ−ラクトンに変換するためのβ−アシルアニオン同等物」, J. Am. Chem. Soc., Vol.102, No.15, p.5004-5011 (1980)。 ７．フルマン（D. S. Fruman）、クリー（C. B. Klee）、ビーラ（B. E. Bierer）、ブラコフ（S. J. Burakoff）著、「Ｔ細胞におけるカルシニューリン燐酸活性はＦＫ５０６及びシクロスポリンＡによって阻害される」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.89, p.3686-90 (1992)。 ８．グラネリ− ピペルノ（A. Granelli-Piperno）、アンドラス（L. Andrus）、スタインマン（R. M. Steinman）著、「刺激されたヒト細胞中のリンフォカイン及び非リンフォカインｍＲＮＡの濃度： シクロスポリンＡの動力学、マイトジェン要求性及び効果」, J. Exp. Med., Vol.163, p.922 (1986)。 ９．ハンソン（J. R. Hanson）著、「『アルコール類の保護』有機合成における保護基、２章」, p.24-25（シェフィールド・アカデミック・プレス、シェフィールド、英国、1999）。

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３３．米国特許第４，１０８，９８５号。 ３４．米国特許第４，１６０，４５２号。 ３５．米国特許第４，２１０，５８１号。 ３６．米国特許第４，２２０，６４１号。 ３７．米国特許第４，２５６，１０８号。 ３８．米国特許第４，２６５，８７４号。 ３９．米国特許第４，２８８，４３１号。 ４０．米国特許第４，３８４，９９６号。 ４１．米国特許第４，３９６，５４２号。 ４２．米国特許第４，５５４，３５１号。 ４３．米国特許第４，７７１，１２２号。 ４４．米国特許第５，２８４，８２６号。 ４５．米国特許第５，５２５，５９０号。 ４６．欧州特許公開公報第００３４５６７号。 ４７．欧州特許公開公報第００５６７８２号。 ４８．国際特許公開公報ＷＯ８６／０２０８０。 ４９．国際特許公開公報ＷＯ９９／１８１２０。

上記の参照特許、特許出願及び出版物の各々の開示は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。

シクロスポリン誘導体類は、真菌Tolypocladium inflatum Gams種によって第二の代謝産物として産生される、１１個のアミノ酸よりなる環式ポリペプチド類の一群を構成する。それらは、免疫担当リンパ球、特にＴ−リンパ球を、細胞周期のＧ_０又はＧ_１相において可逆的に阻害することが観察されている。シクロスポリン誘導体は、リンホカインの生成及び放出を可逆的に阻害することも観察されている（グラネリ−ピペルノら、１９８６）。多数のシクロスポリン誘導体が知られているが、シクロスポリンＡが最も広く使用されている。シクロスポリンＡ の抑制効果は、Ｔ−細胞仲介性活性化事象の阻害に関連する。この抑制は、シクロスポリンがいたるところに存在する細胞内蛋白、シクロフィリンと結合することによって実現する。この錯体は、今度は酵素カルシニューリンのカルシウム−及びカルモジュリン依存性のセリン−スレオニンホスファターゼ活性を阻害する。カルシニューリンの阻害は、Ｔ−細胞活性化中のサイトカイン遺伝子（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ）の誘導に必要な、ＮＦＡＴ_ｐ／ｃ及びＮＦ−κＢなどの転写因子の活性化を妨害する。また、シクロスポリンはin vitroにおけるＴ−ヘルパー細胞によるリンホカイン生成を阻害し、胸腺の成熟ＣＤ８及びＣＤ４細胞の発育を停止させる（グラネリ−ピペルノら、１９８６）。シクロスポリンのその他のin vitro特性には、ＩＬ−２生産Ｔ−リンパ球及び細胞傷害性Ｔ−リンパ球の阻害、活性化Ｔ−細胞によって放出されるＩＬ−２の阻害、同種抗原及び外因性リンホカインに反応する静止Ｔ−リンパ球の阻害、ＩＬ−１生産の阻害、及びＩＬ−２生産Ｔ−リンパ球のマイトジェン活性化の阻害がある（グラネリ−ピペルノら、１９８６）。

シクロスポリンは、体液性免疫及び細胞仲介性免疫反応、例えば同種移植片拒絶、遅延型過敏症、実験的アレルギー性脳脊髄炎、フロイントアジュバント関節炎、グラフト対ホスト疾患などを抑制することが証明された、強力な免疫抑制剤である。これは、臓器移植後の臓器拒絶の予防；リウマチ性関節炎の治療；乾癬治療；及びＩ型糖尿病、クローン病、狼瘡などを含むその他の自己免疫病の治療に使用される。

シクロスポリンが初めて発見されて以来、種々様々の天然シクロスポリンが分離され、同定され、多くの非天然シクロスポリンが全−又は半合成手段によって、又は改良培養法の適用によって調製された。こうしてシクロスポリンによって構成される群は、今や実質的な価値を有し、天然シクロスポリンＡからＺまで［トレイバーら（1977）；トレイバーら（1982）；コベルら（1982）；及びフォン ワルトバーグら（1986）を参照］並びに、次に記すような種々の非天然シクロスポリン誘導体及び人工又は合成シクロスポリン類を含む。これらにはジヒドロ−及びイソ−シクロスポリン類；誘導化シクロスポリン（例えば、−ＭｅＢｍｔ−残基の３'−Ｏ−原子がアシル化されるか又はまた別の置換基が３−位置のサルコシル残基のα−炭素原子に導入されたもの）；−ＭｅＢｍｔ−残基が異性体型で存在するシクロスポリン類（例えば、−ＭｅＢｍｔ−残基の位置６'及び７'を横切る構造がトランスよりもむしろシス型であるもの）；及びウェンガー（R. Wenger）によって開発されたシクロスポリン全合成生産法などを利用して、ペプチド配列内の特異的部位に変形アミノ酸類を挿入したシクロスポリン類などがある（トレイバーら（1977）、トレイバーら（1982）及びコベルら（1982）；米国特許第４，１０８，９８５号、第４，２１０，５８１号、第４，２２０，６４１号、第４，２８８，４３１号、第４，５５４，３５１号及び第４，３９６，５４２号；欧州特許公開公報第００３４５６７号及び第００５６７８２号；国際特許公開公報ＷＯ８６／０２０８０；ウェンゲル（1983）；ウェンゲル（1985）；ウェンゲル（1986）などを参照）。１−位置の修飾されたアミノ酸を含むシクロスポリンＡ類似体は、リッチら（1986）によって報告されている。免疫抑制性、抗炎症性及び抗寄生虫シクロスポリンＡ類似体が、米国特許第４，３８４，９９６号；第４，７７１，１２２号；第５，２８４，８２６号；及び第５，５２５，５９０号に記載されており、これらの特許は全てサンド社に譲渡されている。その他のシクロスポリン類似体が、アイソテクニカに譲渡されたＷＯ９９／１８１２０に開示されている。用語Ciclosporin、ciclosporin、cyclosporine及びCyclosporineは同義であり、シクロスポリンを意味する。

シクロスポリンＡ治療に関連する多くの副作用には、腎毒性、肝毒性、白内障誘発性、多毛症、パラセシス（parathesis）、及び歯肉過形成などがある（スケトリスら、1995）。これらのなかで腎毒性は、シクロスポリンＡ投与に起因するより深刻な用量関連性副作用の一つである。即時的に放出されるシクロスポリンＡ薬剤（例えばネオラル（商標）及びサンドインミューン（商標）など）は、速やかに遊離され、吸収されて血中薬剤濃度を高めることによって腎毒性及びその他の毒性副作用を起こし得る。その薬剤のピーク濃度が副作用と関係すると予想されている（ベネット、1998）。シクロスポリンＡが腎臓損傷を起こす正確なメカニズムは知られていないが、腎臓中の血管収縮物質の濃度増加が求心性糸球体細動脈の血管収縮に導くと言われている。これは腎虚血、糸球体濾過率の低下を招き、長期にわたると、間質性線維症を起こす可能性がある。用量を減らすか又は他の免疫抑制剤に代えると、腎機能は改善する（ヴァランチン及びシュローダ、1995）。よって、有効かつ低毒性の免疫抑制剤が必要である。

１−位置に修飾アミノ酸を含むシクロスポリン類似体が、ＷＯ９９／１８１２０に開示されており、この特許は本出願の譲渡人に譲渡され、そのまま本明細書に挿入されている。米国仮特許出願第６０／３４６，２０１号もこの譲渡人に譲渡されており、ここで出願人は「ＩＳＡ_ＴＸ２４７」と呼ばれる特に好ましいシクロスポリンＡ類似体を開示している。この類似体は、１−アミノ酸残基の修飾を除けば構造的にシクロスポリンＡと同一である。出願人は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７のシス及びトランス異性体のある種の混合物が、天然に発生し、現在公知のシクロスポリン類に勝る高い効力及び／又は低毒性の組み合わせを有することを発見した。ＩＳＡ_ＴＸ２４７のある種のアルキル化、アリール化、及び重水素化誘導体も開示された。

一般的に、米国仮特許出願第６０／３４６，２０１号に開示された混合物は、トランス異性体約１０ないし９０重量パーセント、及びシス異性体約９０ないし１０重量パーセントの範囲である；別の実施形態において、上記混合物は、約１５ないし８５重量パーセントのトランス異性体及び約８５ないし１５重量パーセントのシス異性体を含む；別の実施形態において、上記混合物は約２５ないし７５重量パーセントのトランス異性体及び約７５ないし２５重量パーセントのシス異性体を含む；また別の実施形態において、上記混合物は約３５ないし６５重量パーセントのトランス異性体及び約６５ないし３５重量パーセントのシス−異性体を含む；また別の実施形態において、上記混合物は約４５ないし５５重量パーセントのトランス異性体及び約５５ないし４５重量パーセントのシス異性体を含む。また別の実施形態において、異性体混合物は、約４５ないし５０重量パーセントのトランス異性体及び約５０ないし５５重量パーセントのシス異性体を含むＩＳＡ_ＴＸ２４７混合物である。これらの重量パーセンテージは、組成物の総重量を基準としている。言い換えれば、混合物は（Ｅ）−異性体を６５重量パーセント及び（Ｚ）異性体を３５重量パーセント含み、その逆もあり得る。別の命名法では、シス異性体は（Ｚ）-異性体と言うこともでき、トランス異性体は（Ｅ）−異性体と言うこともできる。

よって、当該技術では、異性体ＩＳＡ_ＴＸ２４７を含むシクロスポリン類似体の調製方法が必要である。個々の異性体に富む組成物、並びに上記２異性体の所望比を有する異性体混合物を生成する合成経路が必要である。ＩＳＡ_ＴＸ２４７の誘導体の調製方法も必要である。

シクロスポリン及びその類似体は、強力な免疫抑制活性を有する環状ポリペプチド群のメンバーである。これらの薬剤はそれらの免疫抑制活性、抗炎症性活性及び抗寄生虫活性に関する利点を提供する一方、シクロスポリンＡ治療に関しては腎毒性及び肝毒性などの副作用が多数ある。よって、天然化合物シクロスポリンＡと同様な薬理学的活性は有するが、関連する１つ又はそれ以上の毒性副作用はない、新しい免疫抑制剤が必要とされる。

本発明の実施形態は薬物学的に有効な、シクロスポリンＡ類似体のシス及びトランス異性体の幾つかの混合物を提供する。好ましい類似体は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７と呼ばれる。ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体の混合物は、天然シクロスポリン及び現在公知のシクロスポリン類に比べてより高い効力とより低い毒性の組合わせを示す。

本発明は、一部には、シクロスポリン類似体のある異性体混合物類がシクロスポリンＡに関連する１つ又はそれ以上の副作用をもたず、すぐれた免疫抑制作用を提供するという発見に基づいている。特に、１−アミノ酸残基を修飾したシクロスポリン類似体の約１０：９０ないし約９０：１０（トランス対シス）の範囲の異性体混合物類（すなわちシス−及びトランス−異性体両方の混合物）が予想外にすぐれた効果及び安全性をもたらすことを発見した。このような類似体の例は、ＷＯ９９／１８１２０に開示されており、重水素化及び非重水素化化合物を含んでいる。より詳細に述べれば、約４５：５５ないし約５０：５０（トランス対シス）の範囲、及び約５０％ないし約５５％トランス−及び約４５％ないし約５０％シス−の範囲の混合物が特に効率的であることが見いだされた。その上、これらの異性体混合物は、天然及びその他の現在公知のシクロスポリン及びシクロスポリン誘導体に比べてよりすぐれた効力とより低い毒性の組合わせを示すことが証明された。

特に好ましい類似体（本明細書では「ＩＳＡ_ＴＸ２４７」と名づける）は、分子の周囲の、１−アミノ酸残基に存在する修飾官能基を除けば構造的にシクロスポリンＡと同様である。この特定の異性体類似体混合物の構造をシクロスポリンＡの構造と比較して示す：

この異性体混合物は、とりわけ免疫抑制のために、そして種々の免疫障害、免疫病及び免疫疾患の予防、コントロール、緩和及び治療などのケアに使用できる。

本発明の実施形態により、ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体類（及びその誘導体類）は、選択性の程度が種々異なる立体選択的経路によって合成される。立体選択的経路は、（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体のどちらかに富む組成物を生成し、これらの組成物を、生成した混合物がこれら２異性体の所望比を有するように組合わせることもできる。或いは、生成した混合物が直接所望比を有するように立体選択的経路の反応条件を調節してもよい。ある混合物中の１異性体又は他の異性体のパーセンテージは、核磁気共鳴スペクトル法（ＮＭＲ）又は当該技術で公知のその他の方法を使用して確認することができる。

各経路は、一般的には不安定なアルコール官能基に保護基を適用して進む。一実施形態において、アルコールはアセテートとして保護され；他の実施形態において、保護基は安息香酸エステル類又はシリルエーテル類である。アセテート保護基は当該技術では一般的であるが、本明細書に記載される多くの典型的実施形態においては、安息香酸エステル又はシリルエーテルなどの保護基の使用によって、アセテート保護基に関係する幾つかの望ましくない副作用が回避されることを強調することは重要である。

保護された化合物は、ウィッティヒ反応に参加するリン含有試薬を用いる経路や、有機金属試薬のメンバーとして無機元素を用いる経路などを含む、種々の立体選択的合成経路の前駆体としてはたらく。後者のタイプは、六員環遷移状態を通過して進行する。この場合、立体障害が配置的結果を決める。多くの有機金属試薬、例えばホウ素、珪素、チタン、リチウム及び硫黄などの無機元素を特徴とするものなどが使用できる。個々の異性体は、単一又は複数の前駆体からつくられる。

立体選択的生成又は非立体選択的生成の如何にかかわらず、生成した混合物中の（Ｅ）対（Ｚ）−異性体の比は、広範囲の数値をとり得る。例えば、混合物は約１０ないし９０パーセントの（Ｅ）−異性体から約９０ないし１０パーセントの（Ｚ）−異性体までの範囲で構成される。その他の実施形態において、混合物は約１５ないし８５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約８５ないし１５パーセントの（Ｚ）異性体を含むことができる；別の実施形態において、混合物は約２５ないし７５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約７５ないし２５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含む；また別の実施形態において、混合物は約３５ないし６５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約６５ないし３５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含む；他の実施形態において、混合物は約４５ないし５５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約５５ないし４５パーセントの（Ｚ）−異性体を含む。また別の実施形態において、異性体混合物は約４５ないし約５０重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約５０ないし５５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含むＩＳＡ_ＴＸ２４７混合物である。これらの重量パーセンテージは組成物の総重量を基準としており、（Ｅ）−異性体と（Ｚ）−異性体との重量パーセントの合計が１００重量パーセントであることは当然である。言い換えれば、混合物は６５重量パーセントの（Ｅ）−異性体と３５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含むことができ、その逆でもよい。

ある態様において、本発明は、１−アミノ酸残基が修飾されたシクロスポリンＡ類似体の異性体混合物を含む組成物に関するものであり、前記異性体混合物の範囲は、約１０：９０から約９０：１０（トランス−対シス）までである。好ましい組成物（本明細書では「ＩＳＡ_ＴＸ２４７」と呼ぶ）は、異性体Ｅ−及びＺ−の異性体混合物を含む：

一般的には、異性体混合物は約１０％ないし約９０％のＥ−異性体及び約９０％ないし約１０％のＺ−異性体を含み、好ましくは混合物は約１５％ないし約８５％のＥ−異性体及び約８５％ないし約１５％のＺ−異性体を含み；より好ましくは混合物は約２５％ないし約７５％のＥ−異性体及び約７５％ないし約２５％のＺ−異性体を含み、さらに好ましくは混合物は約３５％ないし約６５％のＥ−異性体及び約６５％ないし約３５％のＺ−異性体を含み；さらにより好ましくは混合物は約４５％ないし約５５％のＥ−異性体及び約５５％ないし約４５％のＺ−異性体を含む。最も好ましい実施形態において、異性体混合物は：約４５ないし約５０％のＥ−異性体及び約５５ないし５０％のＺ−異性体；約５０％ないし約５５％のＥ−異性体及び約４５％ないし約５０％のＺ−異性体；約５５％ないし約６５％のＥ−異性体及び約３５％ないし約４５％のＺ−異性体；約６５％ないし約７５％のＥ−異性体及び約２５％ないし約３５％のＺ−異性体；約７５％ないし約８５％のＥ−異性体及び約１５％ないし約２５％のＺ−異性体；約８５％ないし約９０％のＥ−異性体及び約１０％ないし約１５％のＺ−異性体を含むＩＳＡ_ＴＸ２４７である。さらに好ましい異性体混合物には、約７５％ないし約６５％Ｚ−異性体及び約２５％ないし約３５％Ｅ−異性体、及び約６５％ないし約５５％Ｚ−異性体及び約３５％ないし約２５％Ｅ−異性体の異性体混合物が含まれる。（パーセンテージは重量ベースである。）

別の態様において、本発明は、上記のような異性体シクロスポリン類似体混合物と薬物学的に容認される賦形剤とを含む医薬組成物に関するものである。異性体類似体混合物は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７混合物であるのが好ましい。

また別の態様において、本発明は免疫抑制をもたらす方法であって、上記のような異性体シクロスポリン類似体混合物又は前記異性体類似体混合物を含む組成物の有効量を、それを必要とする動物に投与することを含む方法に関するものである。好ましい実施形態において、その混合物はＩＳＡ_ＴＸ２４７混合物である。この方法を利用して、移植体拒絶、自己免疫病又は自己免疫障害、又は炎症性疾患又は障害を、治療又は緩和することができる。

もう一つの態様において、本発明は、免疫抑制剤として使用するための類似体の異性体混合物をつくることによって、免疫抑制剤シクロスポリン類似体の毒性を軽減する方法に関するものである。好ましい一実施形態において、その混合物はＩＳＡ_ＴＸ２４７混合物である。

さらにまた別の態様において、本発明は、免疫抑制剤として使用するための類似体の異性体混合物をつくることによって、免疫抑制シクロスポリン類似体の効果を高める方法に関するものである。好ましい一実施形態において、その混合物はＩＳＡ_ＴＸ２４７である。

また別の態様において、異性体類似体混合物の合成方法が提供される。

発明を実施するための形態
合成
シクロスポリン及びその類似体は、強力な免疫抑制活性を有する環式ポリペプチド群のメンバーである。これらの薬剤は、それらの免疫抑制性、抗炎症性及び抗寄生虫活性に関して利点を提供する一方、シクロスポリンＡ治療に関係した腎毒性及び肝毒性を含む多くの副作用がある。よって、薬理学的活性は天然化合物シクロスポリンＡと同様であり、しかも関連する毒性副作用はない、という新しい免疫抑制剤が必要である。

出願人は以前、「ＩＳＡ_ＴＸ２４７」と呼ばれるシクロスポリンＡ 類似体を開示した。この類似体は、１−アミノ酸残基が修飾されていることを除けばシクロスポリンＡと同様の構造を有する。出願人は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７のシス及びトランス−異性体の幾つかの混合物が、天然及び現在公知のシクロスポリン類に勝る高い効力と低い毒性との組合わせを示すことを発見した。

本発明の実施形態により、ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体類（及びそれらの誘導体類）は、立体選択性程度が種々異なる立体選択的経路によって合成される。立体選択的経路は、（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体のどちらかに富む組成物を生成し、生成混合物が前記２異性体の所望比を有するように、これらの組成物を組み合わせることができる。或いは、立体選択的経路の反応条件を調節して、つくられた混合物が直接所望比を有するようにすることができる。

本発明の、ＩＳＡ_ＴＸ２４７と呼ばれる一免疫抑制剤シクロスポリン類似体の化学名は、シクロ｛（Ｅ，Ｚ）−（２Ｓ、３Ｒ、４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−２−（メチルアミノ）−６,８−ノナジエノイル｝−Ｌ−２−アミノブチリル−Ｎ−メチル−グリシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−Ｄ−アラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル｝と化学的に記載される。その実験式はＣ_６３Ｈ_１１１Ｎ_１１Ｏ_１２であり、約１２１４．８５の分子量を有する。用語「ＩＳＡ_ＴＸ２４７」は、この薬理学的活性化合物に与えられた商品名である。

ＩＳＡ_ＴＸ２４７の構造は、主として核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって確認された。１Ｈ及び１３Ｃスペクトルは両方とも、一次元及び二次元ＮＭＲ実験系列を使用して設定され、シクロスポリンＡの公知のＮＭＲ設定と比較された。ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の絶対的設定は核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）実験によって確認された。その他の証拠が、質量分析及び赤外スペクトルによって確認された。質量分析は分子量を確認し、この化合物の赤外スペクトルはシクロスポリンＡ の赤外スペクトルに非常に近いことが判明した。２化合物間に類似性があるため、後者の結果は予期されたものである。

シクロスポリンＡの構造を図１Ａに示す。その構造は分子の環式ペプチド環を構成する１１個のアミノ酸残基を確認するものである。これらの１１個のアミノ酸残基は、環の頂上部中心に示されるアミノ酸（「１−アミノ酸」の基準標識を有する）から出発し、時計方向に増加するナンバーで標識化される。わかりやすいように第一アミノ酸を点線で四角く囲む。本明細書に記載される合成反応が起こる典型的部位であるので、１−アミノ酸残基の側鎖は化学的に書き表した。一般に、アミノ酸のカルボニル基に隣接する炭素は、α−炭素と標識付けられる。その鎖の下流方向、ペプチド環から離れる方向に隣接する炭素に、ギリシャアルファベット文字を順次付ける。シクロスポリンＡの場合、図１Ａに示すように、側鎖のβ−炭素はヒドロキシル基に結合し、側鎖のε−炭素とζ−炭素との間にはトランス方向の二重結合がある。

シクロスポリンＡ構造のもう一つの略図を図１Ｂに示す。ここでは、前記分子の別の部分が点線で四角く囲まれる。この図は、本明細書に使用される命名法を明らかに示す：ここで用語「ＣｓＡ」は四角く囲まれたシクロスポリンＡの部分を指す。この命名法は、反応を記載するたびに分子の残りの部分を再記述することなく、合成反応が起こる領域（すなわち、図１Ｂ中の点線四角外に描かれた１−アミノ酸残基の側鎖）を示すという簡便な手段を提供する。側鎖のα−炭素とβ−炭素との間の結合は通常の長さであり、この図では用語「ＣｓＡ」の定義をより明確にするために誇張されていることは当業者には当然のことである。

上述のように、特に好ましいシクロスポリンＡ類似体はＩＳＡ_ＴＸ２４７と呼ばれ、その２種類の立体異性体Ｅ（又はトランス）及びＺ（又はシス）は、それぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示される。これらの立体異性体のシス又はトランス性は、側鎖のε及びζ−炭素間の二重結合の配置（すなわち、側鎖の末端にある二重結合に対して、ペプチド環により近い二重結合）を基準としている。

立体化学的命名法について一言言及しなければならない。本明細書において、用語シスと（Ｚ）とは交換可能に使用され、用語トランスと（Ｅ）とが交換可能に使用される。用語「エリスロ」及び「スレオ」の使用は、これらの意味に関して文献中に明らかな混乱があるため、最小限にとどめる。ホフマン及びゼイ著「アルコールの立体選択的合成。８．クロチルボロネートを介するβ−メチルホモアリルアルコールのジアステレオ選択的合成」J. Org. Chem., Vol.46, p.1309-1314 (1981)；ストレイトウィーザ及びヒースコック著、「有機化学入門、第２版」、（マクミラン、ニューヨーク、1981）、p.845-846；スミス及びマーチ著、「マーチの最新有機化学」、（ウィリー、ニューヨーク、2001）、p.144-147を参照されたい。本明細書において、スレオ／エリスロの用語を使用する数例では、ストレイトウィーザー及びヒースコックの約束事を適用する；その際「エリスロ」異性体は（Ｒ，Ｓ）及び（Ｓ，Ｒ）配置を、「スレオ」異性体は（Ｒ，Ｒ）及び（Ｓ，Ｓ）配置を指す。

命名法に関する最後のコメントは、図２Ａ及び図２Ｂに示される末端炭素−炭素二重結合に関するものである。別のナンバリングスキームにより、１−アミノ酸残基の側鎖の炭素類に、末端（θ）炭素から出発し、ペプチド環の方に戻るように標識ナンバーを付けてもよい。この系において、ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体は有機化学の一般的命名法により１，３−ジエンと考えることができる。この場合、各二重結合は最小ナンバーの炭素によって決定される。

図３−８に示される合成経路について述べる。本発明の実施形態により、異性体混合物が直接つくられる。その際、特定の合成経路の反応条件を調節して、混合物中の異性体の所望比を得る。或いは、シクロスポリンＡ類似体の２種類の幾何学的異性体のうちの一種類に富む組成物をつくり、それらの組成物を所定の比で合一して所望の混合物を得る。

本発明の実施形態による合成経路の概観を図３に示す。ここでは、化学及び立体選択性による反応経路のグループ化が特に強調されている。図３を参照すると、ウィッティヒ反応を使用する合成経路が大体図の右手に示され、参照番号３１が付けられる。一方、六員環遷移状態を形成すると考えられる有機金属試薬を利用する経路３２及び３３が、図の中央及び左側に示されている。いずれの合成経路も異性体類の混合物を与えるか、２異性体のうちの一つに富む組成物を生成する。

本発明の実施形態は、所望の異性体混合物に到達する種々の方法を提供する。ここに開示する合成戦略のフレキシビリティ及び融通性が、図３の対称性及び非対称性によって一部反映される。各経路に共通する反応は、シクロスポリンＡ３４の官能基の保護である；この典型的実施形態において、この反応はシクロスポリンＡ３４からアセチルシクロスポリンＡ３５への変換である。図３の非対称性は、チタン及びリチウム有機金属試薬経路の全てにおいて、前駆体としてアセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１を使用するが、リン含有ウィティッヒ反応経路が若干あることである。

異性体を所望比で有する混合物を生成するように反応条件を調節した図３の合成経路は、概して、ウィティッヒ反応に関与する試薬としてリン含有試薬を使用する。その他の立体選択的経路は、無機元素類並びに、典型的に六員環遷移状態を通過する有機金属試薬のメンバー類を使用する。この遷移状態において、立体障害が配置的結果を決める。ホウ素、珪素、チタン、リチウム及び硫黄などの無機元素を特徴とする多数の有機金属試薬が、本発明に有用である。

１対の異性体のうちの一つ又は他の一つどちらかに富む組成物を単一の前駆体からつくることができる；又は、上記２組成物を異なる前駆体からつくることもできる。図３の立体選択的経路の一つ（経路３２）において、選択した反応条件によって、単一の前駆体からＩＳＡ_ＴＸ２４７の２異性体の両方が生成する。別の立体選択的経路（経路３３）では、富化組成物の各々を生成するために２種類の前駆体が必要である。

図３の反応を次に詳細に述べる。各経路に共通の反応は、１−アミノ酸残基の側鎖のβ−位置のアルコールの保護である。このような保護スキームは、第一官能基がその分子上のどこか別の部位にある第二（類似及び／又は同一の）官能基に対して行われる反応によって偶然に変形されるという有機合成では通常遭遇する問題である。前記スキームを実施するためには、第一官能基を保護基と反応させ、第二官能基で所望反応を行い、その後に第一官能基から保護基を除去する。

保護基は有機合成においてはよく知られており、ハンソンが「有機合成における保護基（Protecting Groups in Organic Synthesis）」（シェフィールド・アカデミック・プレス、シェフィールド、英国、1999）の第２章（p.24-25）「アルコールの保護」において述べている。ハンソンは、ヒドロキシル基を、エステルかエーテルのどちらかに変換することによって保護する方法を教示している。おそらく酢酸エステルは、ヒドロキシル基を保護するために最もよく用いられるタイプの化学物質である。アセテート基を導入するために、広範囲の反応条件を取り得る。これらの試薬及び溶媒としては、無水酢酸及びピリジン；無水酢酸、ピリジン及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）；無水酢酸及び酢酸ナトリウム；無水酢酸及びトルエン−ｐ−スルホン酸、塩化アセチル、ピリジン及びＤＭＡＰ；及びケテンがある。ＤＭＡＰは、無水物から高い反応性を有するＮ−アシルピリジニウム塩を形成するため、有用なアシル化触媒である。

本発明の一実施形態において、シクロスポリンＡ３４のβ−アルコールは、塩化アセチル、酢酸エチル、又はこれらの組合わせと反応させて、化合物アセチルシクロスポリンＡ３５を形成させることによって、アセテートとして保護される。別の実施形態において、β−アルコールは無水酢酸への求核付加を受け、アセチルシクロスポリンＡ３５及び酢酸が形成される。これらの反応は、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在のもとで行われ、無水酢酸の過剰は溶媒として作用する。これらの場合、接頭語「アセチル」は合成経路全体における、又はアセチル基が除去されるまでの間の名称として使用される。例えば、β−炭素にアセチル基を有する一経路の最後の中間体は、「アセチル−（Ｅ）−１，３−ジエン」と呼ばれる。

アセチルシクロスポリンＡの製法は、文献において十分確立されているが、酢酸エステル以外の保護基を使用してシクロスポリンＡ３４の１−アミノ酸残基のβ−アルコールを保護することは、当業者には明らかである。これらの保護基には、安息香酸エステル類、置換安息香酸エステル類、エーテル類及びシリルエーテル類がある。ある反応条件のもとでは、アセテート保護基は脱離や加水分解などの不都合な副反応をおこしがちである。安息香酸エステル類、エーテル類及びシリルエーテル類は、同じ反応条件下でこのような副反応により強く抵抗することが多いため、アセテートの代わりにこのような保護基を使うことが有利であることが多い。アセチル基又はその他の保護基によって保護されたシクロスポリン又はシクロスポリン誘導体を、「保護−シクロスポリンＡ」と呼ぶ。同様に、上記の典型的経路における最後の中間体は、「アセチル−（Ｅ）−１，３−ジエン」の代わりに「保護−（Ｅ）−１，３−ジエン」と呼んでもよい。選択した保護基の性質は、反応系列のその後の工程の所望コースに影響を与えることがある。

図３を参照すると、アセチルシクロスポリンＡ３５は、この典型的経路において保護β−アルコールを有し、この化合物は数種の合成経路においてＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体を合成するための前駆体として役立つ。ウィッティヒ反応経路を先ず最初に論ずる。

ウィッティヒ反応によるＩＳＡ _ＴＸ ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物の合成
ここに例示されるウィッティヒ反応経路は、図３の参照番号３１によって確認される。方法１は、臭素中間体アセチル−η−ブロモシクロスポリン４１を経て進むが、方法２は、出発点としてアセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１を使用する。以下に記載する典型的方法はウィッティヒ反応を用い、混合立体化学的配置を有するアルケン官能基を導入する。

本明細書に開示される典型的実施形態において、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物を合成するために用いられるウィッティヒ反応は、任意にリチウムハリドの存在下で行ってもよい。ウィッティヒ反応におけるリチウムハリドの存在は、生成する幾何異性体類の比に影響をもつことはよく知られており、したがってこのような化合物の添加は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の所望混合物の生成に役立つ。

方法１
本発明の一実施形態において、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物は、図４に示すようにつくられる。図４における波線（特に、化合物４３と４４を参照）の表示の使用は、例示的反応系列が（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の混合物を生成することを示すものとする。一実施形態において、生成した（Ｅ）対（Ｚ）−異性体のパーセント比は、（Ｅ）−異性体の約１０ないし９０パーセントから（Ｚ）−異性体の約９０ないし１０パーセントまでの範囲であるが、これらの範囲は単なる例示であり、多くの他の範囲が可能である。例えば、混合物は約１５ないし８５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約８５ないし１５パーセントの（Ｚ）−異性体を含むことができる。その他の実施形態において、混合物は約２５ないし７５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約７５ないし２５重量パーセントの（Ｚ）−異性体；約３５ないし６５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約６５ないし３５重量パーセントの（Ｚ）−異性体；及び、約４５ないし５５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約５５ないし４５パーセントの（Ｚ）−異性体を含む。また別の実施形態において、異性体混合物は、約４５ないし５０重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約５０ないし５５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含むＩＳＡ_ＴＸ２４７混合物である。これらの重量パーセントは組成物の総重量を基準としており、（Ｅ）異性体及び（Ｚ）異性体の重量の合計が１００重量パーセントであることは当然である。言い換えれば、混合物は６５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び３５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含むことができ、又はその逆でもよい。

図４を参照すると、アセチルシクロスポリンＡの１−アミノ酸残基の側鎖の末端η炭素を次の反応工程において臭素化する；すなわち、四塩化炭素などの溶媒中でアセチルシクロスポリンＡ３５をＮ−ブロモスクシンイミド及びアゾ−ビス−イソブチロニトリルと共に還流し、中間体アセチル−η−ブロモシクロスポリンＡ４１を生成する。Ｎ−ブロモスクシンイミドは、アリル水素を臭素で置換するためによく用いられる試薬であり、これは遊離基メカニズムによって行われると考えられている。この中間体４１の製法は、エバール及びナニンガーによって「シクロスポリンＡの主代謝産物（ＯＬ−１７）の合成」（J. Org. Chem., Vol.57, p.2686-2691 (1992)）で詳細に記載されている。

新規の中間体、アセチルシクロスポリンＡトリフェニルホスホニウムブロミド４２は、アセチル−η−ブロモシクロスポリンＡ４１から、この化合物をトルエンなどの溶媒中でトリフェニルホスフィンと共に加熱することによってつくることができる。

新規の中間体４２及びこれに類似するその他のものは、１−アミノ酸残基中に共役ジエン系を含む複数のシクロスポリンＡ類似体の合成における重要な中間体であると考えられる。例えば、トリフェニルホスフィンに加えて、トリアリールホスフィン類、トリアルキルホスフィン類、アリールアルキルホスフィン類、及びトリアリールアルシン類などの化合物をアセチル−η−ブロモシクロスポリンＡ４１と反応させて４２に類似するその他の活性化合物をつくることができる。

再び図４を参照すると、アセチルシクロスポリンＡのトリフェニルホスホニウムブロミド４２と過剰のホルムアルデヒドをトルエン中で室温で撹拌することによって、アセチル−１，３−ジエン４３の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物をつくることができる。ホルムアルデヒドの添加後、水酸化ナトリウムなどの塩基を滴下し、ジエン類の異性体混合物を酢酸エチルで抽出する。

多数の有機化学の教科書が、ウィッティヒ反応を説明している。説明の一つは、特にマクマリーが「有機化学（Organic Chemistry）」、５版（ブルックス／コール、パシフィック グローブ、2000）、p.780-783で記載しているものである。ウィッティヒ反応は、ケトン又はアルデヒドをアルケンに変換するために利用される。このようなプロセスにおいて、リンイリド（ホスホランとも呼ばれる）をアルデヒド又はケトンと反応させると、ベタインと呼ばれる二極性中間体が得られる。一般的には、ベタイン中間体は分離されない；むしろ、それは四員環を経て自然に分解して、アルケンとトリフェニルホスフィンオキシドを与える。正味の結果は、元々はリンに結合していたＲ_２Ｃ＝基によってカルボニル酸素原子が置換されることである。

非常に種々様々の試薬が上述の典型的ウィッティヒ反応試薬の代わりになり得ることは、当業者には明らかである。例えば、多数のアルキル、アリール、アルデヒド及びケトン化合物をホルムアルデヒドの代わりに使用すると、膨大な数のシクロスポリン誘導体がつくられる。出願人は、上記の合成をホルムアルデヒドで行い、また、ホルムアルデヒドの代わりにアセトアルデヒド、ジューテロ化ホルムアルデヒド、ジューテロ化アセトアルデヒド、２−クロロベンズアルデヒド、ベンズアルデヒド、及びブチルアルデヒドなどの化合物で行った。このようなウィッティヒ反応を、トリフェニルホスホニウム誘導体以外の化合物、例えばトリアリールホスフィン類、トリアルキルホスフィン類、アリールアルキルホスフィン類及びトリアリールアルシン類などで行ってもよい。水酸化ナトリウムを使用する代わりに、種々のその他の塩類、例えば炭酸ナトリウム、ブチルリチウム、ヘキシルリチウム、ナトリウムアミド、リチウム ジイソプロピルアミドのようなリチウム障害性塩基、及びアルカリ金属アルコキシド類などを使用してもよい。これら種々の試薬が使用できる上に、反応は種々の有機溶媒中又は有機溶媒と水との混液中で、種々の塩、特にリチウムハリドの存在下で、種々の温度で行うことができる。上に列挙した因子の全ては、当業者によって合理的に選択され、形成される二重結合の立体化学、すなわちシス対トランス−異性体の比に所望の効果を与える。

この合成の最終工程において、β−炭素上の保護基を下記の手順によって除去する。アセチル−（Ｅ）−１，３−ジエン及びアセチル−（Ｚ）−１，３ジエンの混合物４３をメタノールに溶解し、それから水を加える。炭酸カリウムのような塩基を加え、反応混合物を室温で撹拌する。使用できる炭酸カリウム以外の塩基として水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、ナトリウムアルコキシド及びカリウムアルコキシドなどがある。その後、酢酸エチルを使用して最終生成物であるＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物４４を抽出する。

方法２
ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物を、ウィッティヒ反応戦略によって合成するまた別の反応経路においては、以下のように４工程の合成経路を使用する：１）方法１のようなβ−アルコールの保護、２）第一工程から生成したアセチル−シクロスポリンＡを酸化してアルデヒドをつくる；３）ウィッティヒ反応；４）ウィッティヒ反応生成物を脱アシル化し、又は同等に、酢酸エステルを加水分解して、アルコールを回復させる。この反応系列は、図５で明らかにされる。

この合成経路は、第一工程が酢酸エステル基でβ−アルコールを保護するという点で、図４のウィッティヒ反応経路と同様にして開始される。しかし、これら２経路は次の点で互いに異なる；方法２の次の工程は、アセチル−シクロスポリンＡ３５をアルデヒド、すなわちアセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１に変換する。この反応は、十分強い酸化剤を使用し、Ｃ＝Ｃ結合を切断して２つの断片を生成する。アルケン切断は、当該技術では公知である。オゾンはおそらく最も一般的に使用される二重結合切断試薬であるが、その他の酸化剤、例えば過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ_４）又は四酸化オスミウムも、二重結合切断を起こすことができる。

ルテニウム−ベースの酸化剤の使用が、カールセンらの「四酸化ルテニウム触媒による有機化合物の酸化法の顕著な改良」J. Org. Chem., Vol.46, No.19, p.3736-3738(1981)で述べられている。カールセンらは、歴史的に、ルテニウム金属の費用が触媒法の発達の動機となったことを教示しており、最も人気のある触媒法は、化学量論的酸化剤として過ヨウ素酸塩か次亜塩素酸塩を使用している。これらの研究者はルテニウムの一般的使用では反応経過中に触媒活性が喪失することを見いだし、それはカルボン酸の存在によると仮定した。反応混合物にニトリル、特にアセトニトリルを加えると、ＣＣｌ_４／Ｈ_２Ｏ／ＩＯ_４−系においてアルケン類の酸化分解の速度及び程度が顕著に高まることが判明した。

本発明の一実施形態によると、アセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１は、次の手順でアセチルシクロスポリンＡ３５から生成する；すなわち、アセチルシクロスポリンＡ３５をアセトニトリルと水との混液に溶解し、それから最初に過ヨウ素酸ナトリウムを加え、次に塩化ルテニウム水加物を加える。アルデヒド５１は酢酸エチルで抽出される。この酸化分解戦略によるアルデヒド５１の合成は、以下に論ずる多くの立体選択的経路にとって重要であることに留意すべきであり、したがって読者はこの章を読み返して参考にすべきである。

方法２の第三工程は、方法１のそれと同様に、アルデヒド５１をウィッティヒ反応によって（Ｅ）及び（Ｚ）ジエンの混合物に変換することを含む。方法１と同様に、リンイリドをアルデヒドに加えるとベタインを生じ（これは分離しない）、その結果、アルデヒドのカルボニル酸素原子が、元々はリンに結合していたＲ_２Ｃ＝基によって置換される。ここでも、このようなウィッティヒ反応は、トリフェニルホスホニウム誘導体以外のリン含有化合物、例えばトリアリールホスフィン、トリアルキルホスフィン、アリールアルキルホスフィン及びトリアリールアルシンなどで、種々の温度で行うことができる。また種々の塩基性溶液及び溶媒の使用又は種々の無機塩の添加によって、新たに形成される二重結合の立体化学に影響を与えることもできる。

一実施形態において、アセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１をトルエンに溶解し、それに水酸化ナトリウム水溶液のような塩基を加える。それからアリルトリフェニルホスホニウムブロミド５２を加え、反応物をしばらく撹拌する。生成したアセチル（Ｅ）及び（Ｚ）−１，３−ジエン混合物５３の処理は、ヘキサン及び／又は酢酸エチルによる抽出を含む；ここで、用語「処理（workup）」は、反応体、生成物、溶媒などの混合物から反応生成物を抽出及び／又は分離するプロセスを意味する。

方法２の最終工程において、方法１の最終工程と同様に、β−炭素位置のアルコールを保護する酢酸エステル基を炭酸カリウムで除去すると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物５４が得られる。保護基の除去に使用できる炭酸カリウム以外の塩基としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、ナトリウムアルコキシド、及びカリウムアルコキシドなどがある。

ＩＳＡ _ＴＸ ２４７（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体のいずれかに富む組成物の有機金属経路による合成
本発明の実施形態によると、立体選択的合成経路は、珪素、ホウ素、チタン、硫黄、リン、及び／又はリチウムなどの元素類を含む無機試薬を使用することができる。これらの経路は六員環遷移状態を通過し、その際その六員環のメンバーの一つは、有機金属試薬からの無機元素である。幾つかの実施形態において、この遷移状態に関係する立体障害効果が反応の立体化学的結果に影響を与え得る。

この開示において、２つの例示的立体選択的スキームが議論される。第一の立体選択的スキーム（方法３；図３の経路３２としても示される）において、珪素含有化合物は脱離反応を受け、その脱離反応が酸性又は塩基性のいずれの条件において行われたかによって、（Ｅ）又は（Ｚ）−異性体のいずれかを生成する。これはピーターソンのオレフィン化の一例である。第二の立体選択的スキーム（方法４；図３の経路３３としても示される）において、各異性体は異なる前駆体から生成する。（Ｚ）−異性体はチタン及びリン含有中間体から生成されるが、（Ｅ）−異性体はリチウム含有中間体を経て生成される。

方法３
この経路は、アセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１を経て進む。
同様な反応スキームは、ツァイ及びマッテソン著「ピナコール（Ｅ）−１−トリメチルシリル−１−プロペン−３−ボロネートからの（Ｚ）及び（Ｅ）末端ジエン類の立体コントロールド合成」（Tetrahedron Letters, Vol.22, No.29, p.2751-2752 (1981)）において大体述べられている。この方法は、図６に示される。一般に、この合成は、トリメチルシリルアリルボロネートエステル試薬６２をつくり、その後アセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１を６２で処理してβ−トリメチルシリルアルコール６４を形成することを含む。このアルコールは、ホウ素含有遷移状態６３を介して形成されると考えられている。ボロネートエステル類は、アリル硼酸化（allylboration）反応では緩徐に反応するので、Ｅ−γ-トリメチルシリル ジエチルボラン又は９−（Ｅ−γ−トリメチルシリルアリル）−９−ＢＢＮなどの迅速反応性ボラン試薬の使用が有利であることは当業者には明らかである。β−トリメチルシリルアルコール６４は、その後ピーターソンのオレフィン化を受けてアルケン、ここではジエン６５かジエン６７のいずれかをつくる。

アルケンの形成は、脱離反応（オレフィン化）が酸性条件で行われるか塩基性条件で行われるかによって、異なる２経路のどちらかの経路を辿る。酸性条件下では、アンチ脱離が起こり（Ｅ）−異性体を形成し、塩基性条件下ではシス−脱離が起こり、（Ｚ）−異性体が形成される。この合成経路の利用によって、同じ前駆体からどちらの異性体もつくることができることは当業者には明らかである。各脱離反応の生成物は、２異性体のどちらかの異性体に富む組成物を含む。一実施形態において、富む（又は富化）とはその組成物が約７５重量パーセント以上の異性体を含むことを意味する。その他の実施形態において、富化組成物は１つの異性体を８０、８５及び９０重量パーセント含むことができる。その後１異性体に富む組成物類を所定の比で組み合わせて、図１０に示すような所望混合物を得ることができる。

次に、図６の反応を、ホウ素含有試薬６２の製法から始めて詳細に説明する。炭素−炭素結合形成反応体の合成における珪素試薬の使用に関する一般的研究は、エーリンガ及びマグナス著「合成における珪素。１０．（トリメチルシリル）アリルアニオン：アルデヒド及びケトンをγ−ラクトンに変換するためのβ−アシルアニオン同等物」（J. Am. Chem. Soc., Vol.102, No.15, p.5004-5011 (1980)）において論じられている。特に、これらの研究者は、（トリメチルシリル）アリルアニオンとアルデヒドとの反応について述べている。アニオンは、１当量のテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を含む−７６℃のテトラヒドロフラン中で、アリルトリメチルシランをｓｅｃ−ブチルリチウムで脱プロトン化することによってつくることができる。

アリルトリメチルシランの脱プロトン化（この工程は、図６には示されていない）は、ビールマン及びドュセプの「ヘテロ原子によって置換されたアリルカルボアニオン及びベンジルカルボアニオン」（Organic Reactions、２７巻（ウィリー、ニューヨーク、1982)、p.9）で述べられている。置換されたアリル系において、ヘテロ原子に対してアルファの位置にあるプロトンは、より塩基性の強い作用物質で除去される。種々のこのような作用物質が使用できるが、ｎ−ブチルリチウムが多分最も一般的である。化学量のｎ−ブチルリチウムを、メタレーションをする予定の化合物と共に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む溶液中で使用する。温度は、通常０℃未満に維持する（−７６℃未満の場合もよくある）；その際ｎ−ブチルリチウムは、その重合性のために低い反応性を有する。Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）などのキレート剤を添加すると、その重合体は解離する。しかし、この反応は室温でも、ＴＭＥＤＡが存在しなくても起こり得る。

アリルシランは、容易に脱プロトン化される。なぜならば、生成するアニオンは、隣接二重結合との共役によって安定化するだけでなく、近くのシリル基によっても安定化するからである。このアニオンは、求電子剤と、そのα炭素又はそのγ炭素を介して反応する。これらの反応の位置化学的及び立体化学的結末は幾つかの要因に依存するが、その最も重要な要因の一つは対イオンのアイデンティティである。トーマスの「有機合成：ホウ素及びシリコーンの役割」（（オックスフォード大学プレス、ニューヨーク、1991）、p.84-87）によるアリルシラン類に関する議論を参照されたい。

この反応スキームにおいて、脱プロトン化アリルシランはその後トリメチルボレートによる求電子捕獲を受け、中間体を生成する。この中間体はピナコールと反応すると、トランス−（トリメチルシリル）ボロネート化合物６２を与える。ボロネート６２は、「アリルボラン」（アリルボロネートエステル）とも呼ばれる。或いは、求電子捕獲に９−メトキシ−９−ジアルキルボランを使用するならば、ボロネート錯化合物が生成する。それを三フッ化ホウ素試薬（ＢＦ_３Ｅｔ_２Ｏなど）によって脱メトキシル化すると、対応する９−（γ−トランス−トリメチルシリルアリル）−９−ジアルキルボランを生成することができる。

アリルボランへのアルデヒドの付加について、Ｓ．Ｅ．トーマスが上記文献の３４−３５頁に述べている。アリルボランへのアルデヒド付加（この際アリルボランは、炭素−炭素二重結合の遠位端が非対称的に置換されている（「遠位（distal）」は、ホウ素原子から最も遠く離れていることを意味する））は、隣接する２つのキラル中心を含むホモアリルアルコールを生成する。（Ｅ）−アリルボラン類は、スレオ−ジアステレオ異性体を生じ、一方（Ｚ）−アリルボラン類は、エリスロ−ジアステレオ異性体を生ずる。（Ｅ）−アリルボラン６２とシクロスポリンＡアルデヒド５１との典型的反応が、図６に示される。ここでは、反応体をＴＨＦ溶液中で数日間撹拌した後、ホウ素中間体６３が形成される。

ホウ素中間体６３（図６）中の参照番号６９は、このホウ素位置でかなり多数の構造が可能であることを示すものである。例えば、ボロネート試薬６２がトリアルキルシリルアリルボロネートエステルである場合、６９の構造は、２個の酸素原子を含む五員環を構成する。６２に使用するボロネート又はボラン試薬上の置換基が、６３の構造中に存在する。

アリルボランとアルデヒドを含む反応において得られる立体選択性は、ホウ素中間体６３によって例示され、図６に描かれるような六員環いす形遷移状態によるものであると仮定されている。アルデヒドの２個のカルボニル原子（二重結合している炭素と酸素）だけが、六員環遷移のメンバーとなる；アルデヒドの残りは環を離れて延びる。六員環から離れて延びるアルデヒドのＣｓＡ部分は、その環に対してアキシアル配座というよりむしろエクアトリアル配座で存在すると仮定される。なぜならば、アキシアル配座はその置換基とアリルボラン６２の酸素原子との間に好ましくない立体障害をおこすからである。図６において、（トリメチルシリル）アリルアニオンからのＳｉＭｅ_３基の位置がエクアトリアル位置を占めるように示されていることは当業者には明らかである。なぜならば、この例はアリルボランの（Ｅ）−ジアステレオマーから出発したからである。これとは異なり、開始アリルボランが（Ｚ）−ジアステレオマーである場合は、ＳｉＭｅ_３基はアキシアル位置に描かれる。

或いは、上述の脱離反応とは反対に、酸脱離がシス−異性体を与え、塩基脱離がトランス−異性体を与えるようなエリスロ−シリルアルコールを形成することが考えられる。合成の最後には同じ生成物が得られることは、当業者にとって当然である。

遷移状態の生成物６３をトリエタノールアミンで処理すると、β−トリメチルシリルアルコール６４が得られる。他方、（トリメチルシリルアリル）ジアルキルボランのアリルボレーション生成物は、ＮａＯＨ／Ｈ_２Ｏ_２を使用する酸化又は水性処理でシリルアルコール６４を与える。図６に描かれているアルコール６４は、遷移状態のアリルボラン６３が（Ｅ）−配置であったため、スレオ−ジアステレオ異性体である。ただし、Ｚ−アリルボラン試薬から出発する場合は、その他のジアステレオ異性体がつくられることは当業者には明らかである。新しく作られたキラル中心におけるジアステレオ選択性は、この工程では確認されない；それは、この後の合成工程で、これらのキラル中心は脱離するからである。図６に示されるβ−トリメチルシリルアルコール６４の構造は、出願人が分光法を用いて確認した。

ピーターソンのオレフィン化として知られるアルケン合成法において、β−トリメチルシリルアルコール６４からトリアルキルシリル基及びヒドロキシ基が除去され、アルケンが生成する；ここでは、鎖の２つの末端炭素の間にすでに二重結合が存在するため、ジエンが生成する。β−ヒドロキシシランのアルケンへの変換に関する議論が、Ｓ．Ｅ．トーマスの参考文献の６８−６９頁に記されている。この反応のより詳細な議論が、ハードリク及びピーターソンの「β−ヒドロキシシラン類の立体特異的オレフィン形成性脱離反応」J. Am. Chem. Soc., Vol.97, No.6, p.1464-1468 (1975)に記されている。

図６を参照すると、アルコール６４をジエンに変える脱離反応は、その反応が酸性条件で行われるか塩基性条件で行われるかによって、２つの異なるメカニズム経路を辿る。一方の経路はジエン６５に導き、他方の経路はジエン６７に導く。酸性条件下ではアンチ脱離が起き、一方塩基性条件下ではシン脱離が起きる。言い換えれば、β−ヒドロキシシランの脱離反応は立体特異的であり、酸−及び塩基−促進反応が反対の立体化学的コースをとる。酸促進反応のための典型的酸は、酢酸、硫酸及び種々のルイス酸などであり；典型的塩基は、水素化ナトリウム及び水素化カリウム又はカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどである。ＴＨＦ中水素化ナトリウムを使用する脱離反応は室温では緩徐で、水素化カリウムを使用する脱離反応はより速やかにあらわれるという場合もある。

酸性条件下の脱離では、トリメチルシリル及びヒドロキシ基がアンチペリプラナー関係にあることが必要であるので、反応経路のこの工程で立体特異性が生ずる。反対に、塩基性条件下の脱離ではトリメチルシリル及びヒドロキシ基がシンペリプラナー関係にあることが必要である。後者の条件は、強い珪素−酸素結合及び中間体である四員環の形成を容易にする。この四員環は、ウィッティヒ反応の最終工程と同様の仕方で分解する。強い珪素−酸素結合はより弱い珪素−炭素結合にとって代わり、それはより弱い炭素−炭素π結合による強い炭素−酸素結合の置換を上回ることは当業者には明らかである。

このように、β−ヒドロキシアルキルシランの立体特異的脱離の生成物は、アセチル−（Ｅ）−１,３−ジエン化合物６７及びアセチル−（Ｚ）−１,３−ジエン化合物６５である。これまでに述べた方法のように、保護基は今やメタノール及び水中Ｋ_２ＣＯ_３による処理によって、これらのジエンの各々から除去される。これは１−アミノ酸残基のβ−炭素に結合した酢酸基を除去し、その炭素に結合する官能基をアルコールに戻す。保護基を除去するために使用できる炭酸カリウム以外の塩基類には、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、ナトリウムアルコキシド、及びカリウムアルコキシドなどがある。

この製造工程によって、合成は実質的に完了する。２異性体のうちのどちらか１つに富む組成物を混合し、混合物中の異性体類の所望比を得ることができる。「富む」とは、その異性体を少なくとも約７５重量パーセント含む生成物を意味する；言い換えれば、その生成物が２５重量パーセント以下の「望まない」異性体を含むことを意味する。望ましい薬理学的結果が得られるように混合物を設計する。

方法４
この経路も、アセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１を経て進む。
立体選択的異性体を生成するためのまた別のスキームを、図７−８に示す。この合成経路がこれまでに述べた経路と異なる点は、１）ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）−異性体を生成する合成経路が、（Ｚ）−異性体のための中間体と異なる中間体を介して進むこと、及び２）これらの合成経路が、チタン及びリチウム含有試薬及び／又は中間体を使用することである。

チタン試薬が有機合成では特に有用であることは知られている。なぜならば、それらはアルデヒド及びケトンとの反応において、位置−及び立体選択的であるからである。立体選択的化学におけるチタンの一般的性質は、リーツが「有機合成における有機チタン試薬」（（スプリンガー出版、ベルリン、1986）、p.VII、148-149及び164-165）で述べている。チタン試薬の電子的及び立体的アイデンティティが巧みに操作できるように、チタンリガンドの性質を変えることができ、多くのＣ−Ｃ結合形成反応の立体化学的結果が予測できると、ここには記されている。この化学的性質により、アキラル分子の２つのプロキラル中心の合体が、キラリティーの２つの中心を造り出す。立体選択的結果を決定する一般的ルールは、Ｚ−配置のエノラート又はクロチル金属化合物が優先的にシン付加物を形成し、Ｅ−配置試薬はアンチ−ジアステレオマーを好んで形成することである。これらの傾向は、ここでもいす形を有する六員環状遷移状態を想定することによって説明できる。

このタイプの立体選択的合成の特殊な例は、イケダらの「有機チタン及びリチウム試薬を使用した、アルデヒドから（Ｚ）−及び（Ｅ）−１，３−アルカジエン類の立体選択的合成」（Tetrahedron, Vol.43, No,4, p.723-730 (1987)）に記載されている。この参考文献は、アリルジフェニルホスフィンを使用して［３−（ジフェニルホスフィノ）アリル］チタン試薬を生成し、この生成した試薬はその後アルデヒドと縮合し、その後ホスホニウム塩の形成によって、高度に位置選択的及び立体選択的な仕方で（Ｚ）−１，３−アルカジエンを与えることを開示している。これに対して、リチウム化アリルジフェニルホスフィンオキシドはアルデヒドと縮合し、ここでも所望の立体選択性をもって直接（Ｅ）−１，３−アルカジエンを生成する。

図７を参照すると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｚ）−異性体の合成は、（これまでのスキームと同様に）シクロスポリンＡ３４からアセチルシクロスポリンＡアルデヒド５１を形成することから始まる。アリルジフェニルホスフィン７１をｔ−ＢｕＬｉのような強塩基で脱プロトン化し、その後生成物をチタンテトライソプロポキシドと反応させることによって、［３−（ジフェニルホスフィノ）アリル］チタン試薬７２をつくる。遷移状態７３は、理論的にはエリスロ−α−付加物７４に移行すると考えられる。それは、その後７４をヨードメタン（ＭｅＩ）で処理することによって、β−オキシドホスホニウム塩７５に変換できる。遷移状態７３の存在が、少なくとも一部はこの合成経路の立体選択性をもたらすと考えられる。

本明細書に概略した典型的方法によると、有機金属試薬の金属部位は、位置選択性をコントロールする存在でありうる（イケダ、ｐ．７２５）。これは、図７のアルデヒド５１がジフェニルホスフィノ化合物７２とそのα位置で反応して、対応するα−付加物７４を与えることを意味する。なぜならば、ジフェニルホスフィノ基のγ−炭素は、その金属（この場合はチタン）に配位しているからである。観察されるジエン生成物のＺ選択性は、六員環遷移状態７３を考慮することによって説明される。アルデヒド３５のかさばったシクロスポリンＡ側鎖もジフェニルホスフィノ基も両方とも、遷移状態ではエクアトリアル位置を占めると考えられるので、エリスロα−付加物７４が選択的に形成され、（Ｚ）−１，３−ジエン７６を生成する。

ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｚ）−異性体がチタン遷移状態を経て形成される図７に描かれる反応経路とは異なり、（Ｅ）−異性体はこの方法では容易には生成しない。実際、この方法によって（Ｅ）−異性体を合成する試みは、概して低収率に終わることが報告されている。その代わり、図８に示すように、リチオ誘導体８２は、アルデヒド５１と反応してリチウム含有遷移状態８３をつくり、それは約７５：２５より大きい範囲のＥ／Ｚ比で１，３−ジエンを形成する。図７におけるように、反応生成物の高い立体選択性は、おそらく遷移状態８３によるものである。この状態では、リチウム試薬８２のビニル基及びアルデヒド５１のシクロスポリンＡ側鎖はエクアトリアル位置を占め、それによって（Ｅ）−１，３−ジエン８４を立体選択的に生成すると仮定される。前述のように、酢酸保護基に関する幾つかの不都合な副反応は、全ての立体選択的合成において、安息香酸エステル又はシリルエーテルなどの保護基の使用によって回避される。

混合物の製法
前述のように、ＩＳＡ_ＴＸ２４７のシス及びトランス−異性体のある種の混合物は、天然及び現在公知のシクロスポリンに勝る高い効力及び／又は低い毒性の組合わせを示すことが判明した。

本発明の実施形態によると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体（及びこれらの誘導体）は、立体選択性の程度が種々異なる立体選択的経路によって合成される。立体選択的経路は、（Ｅ）−異性体に富む第一の材料又は組成物、及び（Ｚ）−異性体に富む第二の材料又は組成物を生成し、これらの材料を組み合わせて、生成した混合物が２異性体を所望比で有するようにすることができる。或いは、反応生成物を分離して（Ｅ）−異性体を単離し、富化することによって第一材料をつくり、反応生成物を分離して（Ｚ）−異性体を単離し、富化することによって第二材料をつくることが考えられる。また別の実施形態においては、立体選択的経路の反応条件を調節して、生成混合物に直接所望比をもたらす。

これらの原理は、図９Ａ−Ｃ及び図１０に説明される。図９Ａ−Ｃには、（Ｅ）対（Ｚ）−異性体の比がそれぞれ約６５対３５重量パーセント、５０対５０重量パーセント、及び３５対６５重量パーセントである仮定の合成反応が示される。もちろんこれらの比は例示的なものであり、説明の目的のために過ぎず、仮定のあらゆる数の組合わせが選択できる。生成混合物中の異なる異性体比を実現するために、図９Ａの比を形成するために適用する反応条件は図９Ｂ及び図９Ｃのそれらと異なってよい、ということは当業者には当然である。各反応の条件を調節し、その場合に応じた２異性体の特定の比が形成される。

異性体の混合物を生成する幾つかの合成経路とは異なり、異性体をまず最初に個々につくり、所定の比率で混合して所望比を得ることもできる。この概念は、図１０に示される。ここでは、一立体選択的経路の生成物はこれら異性体のうちの１異性体に富み、生成物が約７５重量パーセントより多い（Ｅ）異性体を含み、他の立体選択的経路の生成物は他の異性体に富み、この生成物は約７５重量パーセントより多い（Ｚ）異性体を含む。これらの数字も例示的であり、一実施形態において、立体選択的経路によって生成した所望異性体の純度は、約７５重量パーセント以上であり得る。他の実施形態において、所望異性体はそれぞれ約８０、８５、９０及び９５重量パーセント以上を含みうる。

これらの異性体を個々に合成した後、それらを混合して図１０に示すように所望比を得ることができる。例示目的のために、図１０では図９Ａ−Ｃで用いた比率と同じ仮定的比率を選択する。図１０を参照すると、（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体を混合して、それぞれ約６５対３５重量パーセント、５０対５０重量パーセント、及び３５対６５重量パーセントの（Ｅ）対（Ｚ）−異性体比を有する３種類の混合物を得る。

また別の実施形態において、ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の混合物を分離し、混合物中において、ある異性体が他の異性体より多いようにする。例えば、ディールス−アルダー反応を利用して、シス異性体を、アルケンとの反応により閉鎖環化合物に変換する。もしアルケンが単離可能の（例えば濾過可能の）基質に結合するならば、シス異性体はその混合物から実質的に除去され、トランス異性体に富む組成物が残る。シス異性体は閉鎖環化合物から加熱によって再構成され、シス異性体に富む組成物を生成する。このやり方で、シス及びトランス異性体が分離できる。

実際、混合物を生成する方法の立体選択性の程度には無関係に、いかなる混合物中でも（Ｅ）対（Ｚ）−異性体の比は広範囲の数値をとる。例えば、混合物は約１０ないし９０パーセントの（Ｅ）−異性体から約９０ないし１０パーセントの（Ｚ）−異性体までを含む。その他の実施形態において、混合物は約１５ないし８５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約８５ないし１５パーセントの（Ｚ）−異性体；又は約２５ないし７５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約７５ないし２５重量パーセントの（Ｚ）−異性体；又は約３５ないし６５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約６５ないし３５重量パーセントの（Ｚ）−異性体；又は約４５ないし５５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約５５ないし４５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含む。また別の実施形態において、異性体混合物は、約４５ないし５０重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び約５０ないし５５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含むＩＳＡ_ＴＸ２４７混合物である。これらの重量パーセントは組成物の総重量を基準にしており、（Ｅ）異性体及び（Ｚ）異性体の重量パーセントの合計が１００重量パーセントであることは当然である。言い換えれば、混合物は６５重量パーセントの（Ｅ）−異性体及び３５重量パーセントの（Ｚ）−異性体を含むことがあり、その逆でもよい。

混合物中のある異性体又はその他の異性体のパーセンテージは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又は当該技術で公知のその他の方法を使用して確認できる。

医薬組成物
本発明は、活性成分として本発明の混合物を含む医薬組成物の投与を含む、免疫抑制を必要とする患者の治療法にも関係する。この組合わせが対象とする適応症は、特に自己免疫病及び炎症性疾患、及び移植拒絶に関係するか、これに起因する異常などであり、例えば下記のような異常の治療（病因又は症状の改善、軽減、排除又は治癒を含む）又は防止（実質的又は完全な制限、予防又は回避を含む）を含む：

ａ）急性臓器又は組織移植拒絶、例えば心臓、肺、心−肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸又は角膜移植片などのレシピエントの治療、特に、Ｔ細胞性拒絶、並びに例えば骨髄移植後のグラフト対ホスト疾患の予防及び／又は治療。

ｂ）移植臓器の慢性拒絶、特にグラフト血管疾患、例えば平滑筋細胞増殖による内膜肥厚や関連効果の結果としてのグラフト血管狭窄を特徴とするグラフト血管疾患の予防。

ｃ）臓器ドナーがレシピエントと異なる種である場合に起きる、臓器の急性、超急性、又は慢性拒絶、非常に特別なＢ 細胞性拒絶又は抗体仲介性拒絶を含む、異種移植片拒絶。

ｄ）自己免疫病及び炎症性疾患、特に免疫学的又は自己免疫要素を含む病因を有する炎症性疾患、例えば関節炎（例えばリウマチ性関節炎、慢性進行性関節炎及び変形性関節炎）及びその他のリウマチ性疾患など。本発明の共力的組合わせを適用できる特異的自己免疫病は、自己免疫性血液疾患（溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症など）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ウェーゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーヴン− ジョンソン症候群、特発性スプルー、（自己免疫性）炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ぶどう膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎（特発性ネフローゼ症候群又はリポイドネフローゼなどのネフローゼ症候群を伴う又は伴わない）、及び若年性皮膚筋炎を含む。皮膚の自己免疫病及び炎症性疾患も本発明の共力的組合わせを適用して治療及び予防できると考えられる；例えば乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形性紅斑、疱疹状皮膚炎、硬皮症、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、水泡性類天疱瘡、エリテマトーデス、天疱瘡、後天性表皮水疱症、その他の炎症性又はアレルギー性皮膚障害などである；喘息、アレルギー及びじん肺症などの肺及び気道の炎症性異常も含まれる。

本発明の異性体同族混合物はそれだけで、又は薬物学的担体と共に、それらを必要とする温血動物に投与される。薬物学的担体は固体でも液体でもよい。本発明の混合物は従来の毒性のない薬物学的に容認される担体、アジュバント及びビヒクルを含む投与単位の処方で、経口的、局所的、非経口的に、又は吸入スプレーによって、又は直腸内に投与される。ここに使用する用語「非経口的」とは、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入法を含む。

本発明の混合物を含む医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳濁液、硬又は軟カプセル、又はシロップ又はエリキシルのような経口的使用に適した形であるのが好ましい。経口使用のための組成物は、医薬組成物を製造する当該技術で公知の方法によってつくられ、そのような組成物は甘味料、香料、着色料及び保存料からなる群から選択される１種類以上の材料を含み、医薬品として洗練され、口当たりのよい製剤が提供される。活性成分を無毒性の薬物学的に容認される賦形剤と共に含む錠剤も、公知の方法によって製造される。使用する賦形剤は例えば、（１）炭酸カルシウム、乳糖、燐酸カルシウム又は燐酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；（２）コーンスターチ又はアルギン酸などの顆粒化剤及び崩壊剤；（３）澱粉、ゼラチン又はアカシアなどの結合剤；及び（４）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなどの滑剤である。これら錠剤は、コーティングしなくてもよいが、公知の方法によってコーティングし、消化管における崩壊及び吸収を遅らせ、それによって長時間にわたって持続的作用を提供することもできる。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートなどの徐放性材料を使用してもよい。それらは、米国特許第４,２５６,１０８号；第４,１６０,４５２号；及び第４,２６５,８７４号に記載されている方法によってコーティングされ、浸透性治療錠を形成し、放出をコントロールする。

ある場合には、経口使用のための処方は、ハードゼラチンカプセルの形で、その中に活性成分が炭酸カルシウム、燐酸カルシウム又はカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合して含まれる。それらは、ソフトゼラチンカプセルの形でもよく、その中に活性成分が水、又はピーナツ油、液体パラフィン、又はオリーブ油などの油性メジウムと混合して含まれる。

水性懸濁液は、活性成分を水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して含むのが普通である。このような賦形剤としては：（１）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム及びアカシアゴムなどの懸濁剤；又は（２）分散剤又は湿潤剤、例えばレシチンなどの天然ホスファチド、ポリオキシエチレンステアレートなどのアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどのエチレンオキシドと長鎖脂肪アルコールとの縮合産物、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような、脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物、又はポリオキシエチレンソルビタン モノオレエートのような、脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物がある。

水性懸濁液は、１種類以上の保存料、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート；１種類以上の着色料；１種類以上の香料；及び１種類以上の甘味料、例えばスクロース、アスパルターム又はサッカリンを含むことができる。

油性懸濁液は、活性成分をアラキス油、オリーブ油、ゴマ油又はココナツ油などの植物油、オメガ３脂肪酸を含む魚油、又は液体パラフィンなどの鉱油に懸濁させることによって処方される。油性懸濁液は、蜜蝋、ハードパラフィン又はセチルアルコールなどの濃化剤を含むことができる。甘味料及び香料を加えて、口当たりのよい経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を加えることによって保存できる。

分散性粉末及び顆粒は、水性懸濁液の調製に適する。それらは、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１種類以上の保存料と混合した活性成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤の例はすでに上述されている。その他の賦形剤、例えば上記の甘味料、香料及び着色料も含むことができる。

本発明の混合物を含む医薬組成物は、水中油型エマルションの形でもよい。油相は、オリーブ油又はアラキス油のような植物油、又は液体パラフィンのような鉱油又はそれらの混合物でよい。適切な乳化剤は、（１）アカシアゴム又はトラガントゴムのような天然のゴム類、（２）大豆油及びレシチンなどの天然のホスファチド類、（３）脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導されるエステル類又は部分エステル３０、例えばソルビタンモノオレエートなど、（４）前記部分エステル類とエチレンオキシドとの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタン モノオレエート。乳化剤は、甘味料及び香料も含むことができる。

シロップ類及びエリキシル類は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビタン、アスパルテーム又はスクロースなどの甘味料と共に処方される。このような処方は、緩和剤、保護剤、保存料及び香料及び着色剤も含むことができる。

本発明の医薬組成物は、無菌の注射可能水溶液又は油性懸濁液の形でもよい。この懸濁液は、上述した適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、公知の方法によって処方される。無菌の注射可能の製剤は、無毒性の非経口的投与可能の希釈液又は溶媒を使用した無菌の注射可能溶液又は懸濁液でもよく、例えば１,３−ブタンジオール溶液などである。使用できるビヒクル及び溶媒は水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液である。その上、無菌の固定油が溶媒又は懸濁メジウムとして一般的に使用される。この目的のためには、合成モノ−又はジ−グリセリドを含む、あらゆるブランドの固定油も使用できる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射用製剤に使用できる。

本発明の混合物は、薬剤の直腸投与用坐薬の形でも投与できる。これらの組成物は、薬剤を、普通の温度では固体であるが直腸温度では液体となり、そのため直腸で融解して薬剤を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することによってつくられる。このような材料は、ココアバター及びポリエチレングリコール類である。

局所的使用のためには、開示されたシクロスポリン類を含むクリーム、軟膏、ゲル、溶液又は懸濁液などが使われる。

特に好ましい実施形態において、不活性成分として界面活性剤、エタノール、親油性及び／又は両極親和性溶媒を含む液体溶液を使用する。より詳細に述べれば、異性体類似体混合物と、非薬剤成分：ｄ−アルファトコフェロール ポリエチレングリコール１０００琥珀酸（ビタミンＥ ＴＰＧＳ）、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）油、ツィーン４０、及びエタノールとを含む経口マルチプルエマルション処方が用いられる。異性体類似体混合物と経口溶液の場合と同じ非薬剤成分とを含むソフトゼラチンカプセル（ ゼラチン、グリセリン、水及びソルビトールを含む） も好適に使用される。

１日に体重１ｋｇあたり約０．０５ｍｇないし約５０ｍｇの桁の投与量、が上記の疾患の治療に有効である。投与量及び投与スケジュールは、使用する特定の異性体混合物、治療する症状、及び患者の年齢及び症状などの付加的要素によって変動する。好ましい投与量は、約０．５ないし約１０ｍｇ／ｋｇ／日及び約０．１ないし約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。好ましい実施形態において、約２ないし約６ｍｇ／ｋｇ／日が１日２回経口投与される。特に好ましい実施形態においては約０．５ないし約３ｍｇ／ｋｇ／日を１日２回投与する。

単回投与型を形成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分量は、治療するホスト及び特定の投与法によって変動する。例えば、ヒトに経口投与するための製剤は、２．５ｍｇないし２．５ｇの活性成分を適切かつ好都合な量の担体材料と組み合わせて含む。その量は、総組成物の約５ないし約９５パーセントまでの間で変動する。単回投与型は、一般的に約５ｍｇないし約５００ｍｇの活性成分を含む。好ましい実施形態においては、約５０ｍｇの異性体混合物を含む個々のカプセルを経口投与のために用いる。また別の好ましい実施形態においては、約５０ｍｇ／ｍＬの異性体混合物を含む経口溶液を経口投与のために使用する。

しかし、いかなる特定の患者においても、その特異的投与量は使用する特異的化合物、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤組合わせ及び治療を受ける特定の疾患又は異常の性質及び重症度、など種々の要素に左右される。

方法論
Tolypocladium inflatum Gams真菌によって産生される環式ポリペプチドの一群であるシクロスポリン誘導体は、Ｔ−細胞仲介性反応に対するそれらの好ましい効果のために、免疫治療における使用が増加しつつある。シクロスポリン誘導体は、免疫担当リンパ球、特にＴ−リンパ球を可逆的に抑制し、リンホカインの産生及び放出を抑制する。この作用は主として、シクロスポリンＡ−誘起性カルシニューリン阻害によって仲介される。カルシニューリンは、細胞の細胞質に見いだされるホスファターゼ酵素である（シュライバー及びクラブトリー、１９９２）。シクロスポリンＡ又はシクロスポリンＡ誘導体の効果の指標は、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する能力である。カルシニューリン阻害アッセイは、その作用部位における薬剤活性を測定する試験法であり、そのアッセイはシクロスポリンＡ類似体の効力の最も正確で直接的なin vitro評価である（フルマンら、1992）。

ＩＳＡ_ＴＸ２４７は、分子のアミノ酸１残基上の官能基の新規の修飾を除けば、シクロスポリンＡに類似したシクロスポリンＡ類似体である。我々は今や、in vitroカルシニューリン阻害アッセイにおいて、ＩＳＡ_ＴＸ２４７がシクロスポリンＡの３倍までの効力を示すことを見いだした。

薬力学的研究（in vivo及びin vitro）は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７がその他の存在するシクロスポリン化合物より効力が高いことを示した。シクロスポリン類似体の約１０：９０ないし約１０：９０（トランス−対シス−）の異性体混合物、特に５０−５５％Ｚ−異性体及び４５−５０％Ｅ−異性体を有するＩＳＡ_ＴＸ２４７の免疫抑制剤としての効果が（シクロスポリンＡに比較して）、in vitroカルシニューリン活性アッセイ、ラット心臓移植モデル、膵島細胞同種移植マウスモデル、マウスのコラーゲン誘起性関節炎モデル、及び／又はウサギの抗原誘起性関節炎モデルで証明されている。これらのデータは、これらの異性体混合物の効力が、シクロスポリンＡの効力と同等か又はより大きく、したがって免疫調節性疾患の治療に有効であることを示している。

腎毒性、肝毒性、白内障発生、多毛、パラセシス（parathesis）、歯肉増殖症などを含む、シクロスポリンＡ治療に関連する副作用が多数ある（スケトリスら、1995）。これらの中で、腎毒性はシクロスポリンＡ投与に起因するより深刻な用量関連性副作用の一つである。シクロスポリンＡが腎障害をおこす正確なメカニズムは知られていない。しかし、腎臓の血管収縮性物質の濃度の増加が、求心性糸球体細動脈の局所的血管収縮を起こすことが予想される。これは虚血、糸球体濾過率の減少を起こし、長期にわたると間質性線維症を起こす。

ＩＳＡ_ＴＸ２４７の非臨床的安全性が多数の動物種で評価された。ラット、イヌ及び霊長類における反復経口投与による毒性研究により、ＩＳＡ_ＴＸ２４７は耐容性がよく、免疫抑制と一致する効果をもたらすことが判明した。全ての種で認められた唯一の毒性作用は、下痢／軟便であった。

ＩＳＡ_ＴＸ２４７は、in vitro細菌逆突然変異及び染色体異常アッセイ、及びin vivoラット小核アッセイで証明されたように、突然変異誘発作用を示さない。発癌性の研究は、現在完了していない。ＩＳＡ_ＴＸ２４７の生殖毒性試験が、妊娠ラット及びウサギで完了した。治療に関連する先天性異常又は変化はなかった。母体毒性を起こす用量では、相応の胚毒性が認められた。

実施例１：シクロスポリンＡのアセチル化
無水酢酸（１４０ミリリットル）をシクロスポリンＡ（５０．０ｇ、４１．６ｍｍｏｌ）に加え、混合物を室温でＮ_２気流下で、シクロスポリンＡの全てが溶解するまで撹拌した。ジメチルアミノピリジン（７．６２ｇ、６２．４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温でＮ_２気流下で３時間、又は反応が完了するまで撹拌した。反応混合物を５℃に冷やし、その後濾過した。冷却した固体をヘキサンで洗い、付加した無水酢酸を除去した。生成したペースト状固体を激しく撹拌した５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１.５リットル）に徐々に移した。生成した懸濁液を、微細スラリーが生成し、ＣＯ_２の発生が止むまで撹拌した。固体を濾過によって集め、濾液が中性ｐＨを示すまで水で洗った。固体生成物を真空中で一晩乾燥すると（５５℃）、生成物が着色固体として４４．０ｇ（８５％）得られた。

実施例２：実施例１からの生成物の酸化
アセトニトリル（３２０ｍＬ）及び水（８０ｍＬ）をアセチルシクロスポリンＡ（４２．９７ｇ、３４．５４ｍｍｏｌ）に加え、材料の全てが溶解するまで混合物を撹拌した。過ヨウ素酸ナトリウム（１４．７７ｇ、６９．０８ｍｍｏｌ）を加え、その後塩化ルテニウム水加物（０．３５８ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を加え、その後反応物を室温でＮ_２気流下で３時間撹拌した。水（３００ｍＬ）を加え、混合物を分液漏斗に移した。混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ、その後２５０ｍＬ）で２度抽出した。暗黒色の酢酸エチル抽出液を合一し、水２５０ｍＬで、その後ブライン２５０ｍＬで洗った。有機溶液をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、溶媒を蒸発すると、緑色がかった黒い固体が生成した。その粗生成物をシリカゲル上で、４０％アセトン／６０％ヘキサンを溶出液としてクロマトグラフィーにかけると、生成物（２９．１ｇ、６８％）が無色固体として得られた。

実施例３：アセチルＩＳＡ _ＴＸ ２４７の製法
ｉ）イリドのin situ生成
アセチルシクロスポリンＡアルデヒド（３１．８４ｇ、２５．８４ｍｍｏｌ）を３４０ｍＬトルエンに加え、材料が完全に溶解するまで混合物を撹拌した。生成した溶液に１ノルマル水酸化ナトリウム水溶液を３４０ｍＬ加えた。生成した混合物を激しく撹拌し、それからアリル トリフェニルホスホニウムブロミド（５８．２２ｇ、１５１．９０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で２４時間撹拌し、追加的アリル トリフェニルホスホニウムブロミド（１６．６４ｇ、４３．４２ｍｍｏｌ）を加え、さらに２４時間撹拌し続けた。混合物を分液漏斗に移し、トルエン相を分離した。水相をさらに、２００ｍＬのトルエンで抽出した。２つのトルエン抽出液を合一し、２００ｍＬ脱イオン水及び２００ｍＬ塩化ナトリウム飽和水溶液で逐次洗った。その溶液をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、トルエンを蒸発すると非常に粘稠なゲルが生成した。この物質を１４２ｍＬ酢酸エチルで処理し、微細スラリーが形成されるまで撹拌した。急速撹拌下でヘキサン（５７０ｍＬ）をゆっくりと加えた。撹拌を３０分間続け、生成した懸濁液を濾過し、集めた固体を１６０ｍＬの５：１ヘキサン／酢酸エチルで洗った。合一した濾過を回転蒸発器で濃縮すると粘稠な半固体が得られた。この物質を７５ｍＬ酢酸エチルで処理し、微細スラリーが得られるまで撹拌した。ヘキサン（２２５ｍＬ）を急速撹拌下でゆっくりと加える。撹拌を３０分間続け、それから生成した懸濁液を濾過し、集めた固体を１００ｍＬの５：１ヘキサン／酢酸エチルで洗った。濾液を回転蒸発器で濃縮すると、淡黄色固体が得られた。粗生成物をシリカゲル上で、４０％アセトン／６０％ヘキサンを溶出液として使用してクロマトグラフィーにかけると、生成物（１４．０９ｇ）が無色固体として得られた。

ii）ＬｉＢｒの存在下におけるプレフォームド イリドの生成及び反応
０℃に冷却したＴＨＦ（２０ｍＬ）中アリルトリフェニルホスホニウムブロミド（７．６７ｇ、２０ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、テトラヒドロフラン中ＫＯＢｕ^ｔ溶液（２０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ、１Ｍ溶液）を加えた。この温度で撹拌を３０分間続け、ＴＨＦ中ＬｉＢｒ溶液（１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ、１Ｍ溶液）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中アセチルＣｓＡ−アルデヒド溶液（４．９３ｇ、４ｍｍｏｌ）溶液をカニューレによって加えた。室温で１５分間撹拌後、反応混合物に飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液（２５ｍＬ）を加えて反応を停止した。上記のような処理及びクロマトグラフィーにより、アセチル化ＩＳＡ_ＴＸ２４７が無色固体（３．５ｇ）として生成した。

実施例４：ＩＳＡ _ＴＸ ２４７の製法
アセチルＩＳＡ_ＴＸ２４７（１４．６ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）を３４０ｍＬメタノールに溶解し、その後脱イオン水１３５ｍＬを加えた。炭酸カリウム（１３．３６ｇ、９６．６６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２４ないし４８時間、反応が完結するまで撹拌した。メタノールの大部分を蒸発し、それから２５０ｍＬ酢酸エチルを撹拌しながら加えた。１０％クエン酸水溶液（１２０ｍＬ）をゆっくりと加え、酢酸エチル相を分離した。水相を追加２００ｍＬ部分の酢酸エチルで抽出した。合一した酢酸エチル抽出液を１５０ｍＬ脱イオン水、１００ｍＬ１０％クエン酸水溶液及び１５０ｍＬ塩化ナトリウム飽和水溶液で逐次洗い、ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。酢酸エチルを蒸発すると、淡黄色固体が得られた。粗生成物をシリカゲル上で、４０％アセトン／６０％ヘキサンを溶出液として用いてクロマトグラフィーにかけると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７（１０．５１ｇ、７５％）が無色固体として得られた。ＩＳＡ_ＴＸ２４７は４５−５０％Ｅ−異性体及び５０−５５％Ｚ−異性体を含む。
実施例１−４の生成物は、質量分析及び／又は核磁気共鳴分光法によって特徴づけられた。

実施例５：アセチル−η−ブロモシクロスポリンＡの製法
実施例１におけるようにつくられたアセチルシクロスポリンＡ（４１．４８ｇ、３３．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシミド（１０．３９ｇ、５８．４ｍｍｏｌ）及びアゾ−ビス−イソブチルニトリル（１．０９ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）を四塩化炭素２５０ｍＬに溶解し、生成した混合物を２．５時間加熱還流した。混合物を冷却し、溶媒を蒸発した。残留物を３５０ｍＬジエチルエーテルで処理し、濾過して不溶性物質を除去した。濾液を１５０ｍＬ水及び１５０ｍＬブラインで逐次洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を蒸発した。粗生成物をシリカゲル上でアセトン／ヘキサン（２：３）でクロマトグラフィーにかけるとアセチル−γ−ブロモシクロスポリンＡ２８．５７ｇ（６５％）が黄色固体として得られた。

実施例６：アセチルシクロスポリンＡのトリフェニルホスホニウムブロミドの製法
アセチル−γ−ブロモシクロスポリンＡ（２８．５５ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（７．５５ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）をトルエン２１０ｍＬに溶解し、生成した溶液を２１時間、１００℃に加熱した。溶液を冷却し、トルエンを蒸発した。生成した油性の半固体に２５０ｍＬのヘキサン／エーテル（１：４）を加え、徹底的に混合し、溶媒を傾瀉して除去した。このプロセスを、１５０ｍＬエーテルで３回繰り返した。残留物を５０ｍＬ酢酸エチルに溶解し、２２０ｍＬヘキサンで沈殿させた。生成した固体をその後濾過によって集めると、アセチルシクロスポリンＡのトリフェニルホスホニウムブロミド２２．５ｇ（６６％）が黄褐色固体として得られた。

実施例７：ウィッティヒ反応
アセチルシクロスポリンのトリフェニルホスホニウムブロミド（１００ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、過剰の３７％ホルムアルデヒド（０．２５ｍＬ）及びトルエン（２ｍＬ）を室温で速やかに撹拌した。１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）を滴下し、撹拌を３．５時間続けた。反応混合物を、酢酸エチル（２０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）で希釈した。酢酸エチル相を分離し、水（１０ｍＬ）及びブライン（１０ｍＬ）で逐次洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を蒸発した。粗物質をシリカゲル上で、アセトン／ヘキサン（２：３）でクロマトグラフィーにかけると、アセチルＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物７０ｍｇ（８８％）が無色固体として得られた。

実施例８：ウィッティヒ反応生成物の脱アセチル化
実施例７から生成した異性体混合物（７０ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、水（１ｍＬ）を加えた。炭酸カリウム（７５ｍｇ）を加え、反応物を室温で１９時間撹拌した。メタノールの大部分を蒸発し、残留物に酢酸エチル１５ｍＬを加え、その後１０％クエン酸水溶液１０ｍＬを加えた。酢酸エチル相を分離し、水相を追加的酢酸エチル１０ｍＬで抽出した。合一した酢酸エチル抽出液を、１０ｍＬ水、１０ｍＬ１０％クエン酸水溶液及び１０ｍＬブラインで逐次洗い、その後硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を蒸発した。粗物質をシリカゲル上で、アセトン／ヘキサン（２：３）でクロマトグラフィーにかけると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７、３７ｍｇ（５４％）が約８５％Ｅ−異性体及び約１５％Ｚ−異性体を含む無色固体として得られた。
実施例５−８における生成物は、質量分析及び／又は核磁気共鳴分光法によって特徴づけられた。

実施例９：ＩＳＡ _ＴＸ ２４７の幾何異性体の製法
ＩＳＡ_ＴＸ２４７のシス−及びトランス−異性体を下記の反応スキームを用いて独立的に合成した。反応系列は、アリルトリメチルシランの公知のメタレーション、トリメチルボレートによる求電子捕獲、及びその後の加水分解及びその後のエステル交換を含み、中間体トランス−（トリメチルシリル）アリルボロネートエステルを生成する。シクロスポリンアルデヒドのアリルボレーションはホウ素中間体を与え、それを金属イオン封鎖によって所望のβ-トリメチルシリルアルコールに変換する。新しいキラル中心の生成におけるジアステレオ選択性は、その後の段階でこれらの中心が除去されるため、この段階では決定しない。β−トリメチルシリルアルコールにおける２つの中心の相対的立体化学は予想通りアンチであり、トランス−（トリメチルシリル）ボロネート前駆体におけるトランス二重結合によるものであることに注目すべきである。

β−トリメチルシリルアルコールの塩基促進性脱離（ハードリクら、1975）はアセチル−（Ｚ）−１,３−ジエンに富む組成物を提供し、酸促進性脱離はアセチル−（Ｅ）−１,３−ジエンに富む組成物を与える。脱保護は、対応するジエンアルコール、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｚ）及び（Ｅ）−異性体をそれぞれ与える。

ジエンに至るまた別のアプローチは、アリルホスホランを使用する。アリルジフェニルホスフィンのメタレーション及びその後のＴｉ（ＯＰｒ^ｉ）_４によるトランスメタレーションは、チタン中間体を与える。アリルチタネーション及びその後の立体特異的脱離で、（Ｚ）−ジエンに富む組成物が生成する。
他方、アリルジフェニルホスフィンオキシドで同様な系列を行うと（図８）、主としてＥ−異性体が生成する（７５％）。

ｉ）アセチルＣｓＡ−ＣＨＯのアリルボレーション：
（Ｅ）−１−トリメチルシリル−１−プロペン−３−ボロネートを前に報告された方法にしたがってつくった（イケダら、１９８７）。ＴＨＦ（３ｍＬ）中（Ｅ）−１−トリメチルシリル−１−プロペン−３−ボロネート（０．２ｇ、０．８３２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、窒素気流下でアセチルシクロスポリンＡアルデヒド（１．０２６ｇ、０．８３２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を高性能液体クロマトグラフィー（Ｃ−８カラム、逆相）によってモニターし、合計７日間撹拌した。その後トリエタノールアミン（０．１９６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加え、さらに４日間撹拌し続けた。シリカゲルカラム上で精製すると、β−トリメチルシリルアルコールが得られた。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ １３６８．９（Ｍ＋Ｎａ^＋）。

無水ＴＨＦ（１ｍＬ）中ＫＨ懸濁液（３．５ｍｇ、２６．４μｍｏｌ、無水ヘキサンで洗浄した３０％鉱油分散液）に、β−トリメチルシリルアルコール（１０ｍｇ、７．４ｍｉｃｒｏｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテル（１０ｍＬ）で希釈し、その後ＮａＨＣＯ_３飽和溶液（２×５ｍＬ）で洗った。乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）及び溶媒除去により、富化（Ｚ）−アセチル−１，３−ジエンが得られた。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ １２９４．８（Ｍ＋Ｋ^＋）。

ii）アセチルＣｓＡ−ＣＨＯのアリルチタン化：
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中アリルジフェニルホスフィン（０．５４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の撹拌、冷却（−７８℃）溶液に、ｔ−ＢｕＬｉ（１．４２ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、１．７Ｍ溶液。ペンタン中）を加えた。赤煉瓦色の溶液をこの温度で１５分間撹拌し、その後０℃で３０分間撹拌した。それから再び−７８℃に冷やし、Ｔｉ（ＯＰｒ^ｉ）_４（０．７１ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ） を加えた。その褐色溶液をこの温度で１５分間撹拌し、それからＴＨＦ（１０ｍＬ）中アセチルＣｓＡ−ＣＨＯ（２．５ｇ、２ｍｍｏｌ）溶液をカニューレによって加えた。淡黄色溶液をさらに３０分間撹拌し、それから一晩室温に温めた。この反応混合物に０℃でＭｅＩ（０．１５ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌をこの温度で１時間続け、それから室温で２時間続けた。反応混合物を氷冷した１％ＨＣｌ（１００ｍＬ）に注いだ。水層をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合一した有機抽出液を水（２×２５ｍＬ）及びブライン（２５ｍＬ）で洗った。溶媒を除去すると黄色固体が得られ、それをシリカゲルカラムでクロマトグラフィーにかけた。１：３アセトン−ヘキサン混合物で溶出すると、アセチルＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｚ）−富化異性体が得られた。実施例４におけるように脱保護すると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｚ）−富化異性体が得られた（Ｚ／Ｅ比、７５：２５）。

実施例１０：ＩＳＡ _ＴＸ ２４７異性体の（Ｅ）−富化混合物の製法
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中アリルジフェニルホスフィンオキシド（１ｍｍｏｌ）及びヘキサメチルホスホルアミド（２ｍｍｏｌ）の溶液に、−７８℃で、ｎ−ブチルリチウム（１ｍｍｏｌ、ヘキサン中）を加えた。混合物を−７８℃で３０分間撹拌した。テトラヒドロフラン（７ｍＬ）中アセチルシクロスポリンＡアルデヒド（０．８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応混合物を徐々に室温まで温め、それから１８時間撹拌した。混合物を氷冷した１Ｎ塩酸（５０ｍＬ）に注入し、それから酢酸エチルに抽出した。有機抽出液を水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を蒸発した。残留物をシリカゲル上で、２５％アセトン／７５％ヘキサンを溶出液としてクロマトグラフィーにかけると、アセチルＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体混合物が得られた。実施例４におけるようにアセテート保護基を除去すると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７異性体の（Ｅ）−富化混合物が得られた。プロトンＮＭＲ分光法は、この混合物がＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）−異性体７５％及び（Ｚ）−異性体２５％からなることを示した。この反応は、シュロッセルの改良法（リュ−（R. Liu）、シュロッセル（M. Schlosser）、Synlett、１９９６、１１９５）によっても行うことができる。ＴＨＦ（２０ｍＬ）中アリルジフェニルホスフィンオキシド（１．２１ｇ、５ｍｍｏｌ）の撹拌した冷却（−７８℃）溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（２ｍＬ、５ｍｍｏｌ、２．５Ｍ溶液、ヘキサン中）を加えた。その赤色溶液を−７８℃で４０分間撹拌した。その後ＴＨＦ（１２ｍＬ）中アセチルＣｓＡ−ＣＨＯ（１．２５ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）溶液をカニューレによって１５分間にわたって加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。上記のように処理及びクロマトグラフィーを行うと、アセチルＩＳＡ_ＴＸ２４７（Ｚ：Ｅ比 ４０：６０、１ＨＮＭＲ分析による）が得られた。

実施例１１：ベンゾイル保護シクロスポリンＡの製法
シクロスポリンＡ（６.０１ｇ、５ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（３０５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をピリジン（５ｍＬ）に溶解した。無水安息香酸（３．４ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５０℃で１９時間撹拌した。追加的無水安息香酸（１．７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３０５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加え、５０℃でさらに２４時間撹拌を続けた。無水安息香酸（０．８５ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加え、反応物をさらに２３時間撹拌した。反応混合物を撹拌しながらゆっくりと水中に注入した。沈殿したシクロスポリンＡ安息香酸を濾取し、水で洗った。集めたケーキを最小容量のメタノールに溶解し、１０％クエン酸溶液に加え、１時間撹拌した。沈殿した生成物を濾過によって集め、濾液のｐＨが水のｐＨと等しくなるまで水で洗った。固体シクロスポリンＡ安息香酸を５０℃で、真空下で乾燥すると無色固体が得られる。

実施例１２：トリエチルシリルエーテル−保護シクロスポリンＡの製法
シクロスポリンＡ（３．６０６ｇ、３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（８ｍＬ）に溶解し、その後ＤＭＡＰ（１２２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃に冷やし、それからトリエチルシリル トリフルオロメタンスルホネート（３．６ｍｍｏｌ）を滴下した。その混合物を放置して室温まで温め、一晩撹拌した。反応混合物を、撹拌しながらゆっくりと水中に注入した。沈殿したトリエチルシリルエーテルを濾別し、水で洗った。集めたケーキを最小容量のメタノールに溶解し、５％クエン酸溶液に加え、３０分間撹拌した。沈殿した生成物を濾過によって集め、水で、濾液のｐＨが水のｐＨに達するまで洗った。固体トリエチルシリルエーテルを５０℃で、真空下で乾燥すると無色固体が得られた。トリイソプロピルシリル及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル保護基を、類似の方法によって導入することもできる。

実施例１３：カルシニューリン阻害アッセイを使用する免疫抑制活性
シクロスポリンＡ又はシクロスポリンＡ誘導体の効果の指標は、カルシニューリンのホスファターゼ活性を阻害する能力である。カルシニューリン阻害アッセイは、薬剤のその作用部位における活性を測定する。このようなアッセイは、シクロスポリンＡ類似体の効力の直接的in vitro評価である（フルマンら、１９９２）。

ＩＳＡ_ＴＸ２４７（４５−５０％のＥ−異性体及び５０−５５％のＺ−異性体）対シクロスポリンＡの免疫抑制活性は、カルシニューリン（ＣＮ）阻害アッセイを使用して評価される。このアッセイの結果は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７（４５−５０％のＺ−異性体及び５０−５５％のＥ−異性体）によるカルシニューリンホスファターゼ活性の阻害が、シクロスポリンＡに比べて３倍より強力である（ＩＣ_５０により測定）ことを示す（図１１）。

種々の重水素化及び非重水素化異性体類似体混合物対シクロスポリンＡの免疫抑制活性が、カルシニューリン（ＣＮ）阻害アッセイを用いて評価されている。これらの類似体の構造及び異性体組成は、図１２に示される。図１２において、「Ｉ４」は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の構造に対応する。Ｉ４−Ｍ２とは、実施例５−８に記載の方法によって生成されたＩＳＡ_ＴＸ２４７を指す（この図では方法２である）。Ｉ４−Ｄ４は、実施例１−４に記載の方法によって生成された重水素化ＩＳＡ_ＴＸ２４７を指す。Ｉ４−Ｄ２は、実施例５−８に記載の方法によって生成された重水素化ＩＳＡ_ＴＸ２４７を指す。その他の異性体混合物も図に示されている。

このアッセイの結果は、これらの異性体類似体混合物によるカルシニューリンホスファターゼ活性の阻害効果は、少なくともシクロスポリンＡと同様であることを示す（ＩＣ_５０によって測定した）（図１３）。ＣｓＡはシクロスポリンＡを指す；Ｉｓｏｃｙｃｌｏ４は、実施例１−４に記載の方法によって生成されたＩＳＡ_ＴＸ２４７を指す。Ｉｓｏｃｙｃｌｏ５は、図１２のＩ５−Ｍ１に対応する。Ｉｓｏｃｙｃｌｏ４−ｄ４は、図１２のＩ４−Ｄ４に対応する。Ｉｓｏｃｙｃｌｏ５−ｄ５は、図１２のＩ５−Ｄ５に対応する。Ｉｓｏｃｙｃｌｏ４−ｄ２は、図１２のＩ４−Ｄ２に対応する。Ｉｓｏｃｙｃｌｏ４−Ｍ２は、図１２のＩ４−Ｍ２に対応する。Ｉｓｏｃｙｃｌｏ５−ｍ２は、図１２のＩ５−Ｍ５に対応する。

実施例１４：ラット心臓移植片モデルを使用する免疫抑制活性
異なる系統のラット間で移植された心臓の拒絶を阻止するＩＳＡ_ＴＸ２４７（４５−５０％のＥ−異性体及び５０−５５％のＺ−異性体）の効果を評価し、シクロスポリンＡのそれと比較した。ラット心臓移植片モデルは、新しい免疫抑制剤のin vivo効力を評価する際に最もよく用いられるモデルである。それは、このモデルでは免疫拒絶により、持続的グラフト生存を実現することが難しいからである。

この方法は、ウィスターラット（Wister Furth rats）からルイスラット（Lewis rats）への心臓の異所性移植（腹部大動脈及び下大静脈への）を含む。シクロスポリンＡ又は異性体類似体混合物のいずれかの腹腔内注射が移植片レシピエントに行われ、それは移植の３日前から始まり、移植後３０日間続けられた。グラフト異機能が移植後３０日の期間に認められた場合は、動物を殺した。動物が移植後３０日より長く生きている場合は、試験及び対照試験を中止し、動物をグラフト異機能になるまで、又は移植後１００日まで生存させた。

レシピエント動物の各群の平均生存率を、表１にまとめる。これらの結果は最適量１．７５ｍｇ／ｋｇ／日のＩＳＡ_ＴＸ２４７（４５−５０％のＥ−異性体及び５０−５５％のＺ−異性体）が、シクロスポリンＡに比較して生存時間を約３倍延長することを示す。ＩＳＡ_ＴＸ２４７を投与した多数の動物が、移植後１００日目（投与中止後７０日）にまだ機能するグラフトを有していた。これらのデータはこの異性体類似体混合物が、グラフト拒絶を阻止するための免疫抑制活性を有することを証明する。

種々の重水素化及び非重水素化異性体類似体混合物（構造は図１２に示される）が、異なる系統のラット間で移植された心臓の拒絶を阻止する効果も評価し、シクロスポリンＡのそれと比較した。１．７５ｍｇ／ｋｇ／日の用量を３０日間投与した。表２に結果をまとめる。これらの結果は、１．７５ｍｇ／ｋｇ／日の異性体混合物は、生存期間を少なくともシクロスポリンＡと同様に延長することを示し、これらの異性体類似体混合物がグラフト拒絶阻止における免疫抑制活性を有することを証明した。

実施例１５：膵島細胞の同種移植術における免疫抑制活性
ＩＳＡ_ＴＸ２４７（４５−５０％のＥ−異性体及び５０−５５％のＺ−異性体）対シクロスポリンＡの、マウスモデルにおける移植膵島細胞の生存を延長する能力を試験した。この研究は、ＣＢＡ／Ｊマウスからの５００個の膵島を糖尿病Ｂａｌｂ／ｃマウスレシピエントの腎臓嚢に移植することを含む。

移植後、ＩＳＡ_ＴＸ２４７又はシクロスポリンＡの投与量０（ビヒクル）、１．７５、１０、２０又は２５ｍｇ／ｋｇ／日を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって３０日間投与した。連続２日間１７ｍｍｏｌ／Ｌより高い血糖濃度を示す、という定義によるグラフト不全になるまで血糖値を毎日モニターした。

その結果は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７が２０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量でグラフト生存期間を４０％延長することを示している。投与量を増加すると、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の方がシクロスポリンＡより毒性が小さいことも認められた。これは２５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で特に明らかであった。

実施例１６：関節炎における免疫抑制活性
過去３０年間に、ヒトリウマチ性関節炎の３動物モデルが詳細に試験され、新規の抗リウマチ薬の臨床前スクリーニング及び開発に広く用いられた。これらはアジュバント誘起性、コラーゲン誘起性、及び抗原誘起性関節炎モデルを含む。次の研究はマウスのコラーゲン誘起性関節炎モデル及びウサギの抗原誘起性関節炎モデル両方において、ＩＳＡ_ＴＸ２４７（４５−５０％のＥ−異性体及び５０−５５％のＺ−異性体）の抗炎症性効果を評価するために計画された。これら２つのモデルに認められた組織病理学及び免疫病理学は、ヒト疾患における知見と似ている。両モデルにおいて、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の関節炎発生阻止効果（予防プロトコル）及び関節炎治療効果（治療プロトコル）を調べた。これらの研究は、請求の異性体類似体混合物が免疫抑制活性を有することを支持している。

Ａ．コラーゲン誘起性関節炎
ウィルス抗体をもたない状態の齢８ないし１０週の雄ＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスを、フロイント完全アジュバント中に乳化したヒナドリII型コラーゲン１００マイクログラムの皮下注射によって免疫した。ＩＳＡ_ＴＸ２４７、シクロスポリンＡ、又はビヒクル（クレモフォルＥＬ／エタノール７２：２８、容量／容量）を、生理食塩液で１−５０倍に希釈した保存薬剤（０．２５、０．５又は１ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射によって毎日投与し、０（ビヒクル）；ＩＳＡ_ＴＸ２４７では、１２５、２５０、又は５００μｇ／マウス；シクロスポリンＡでは２５０、又は５００μｇ／マウスの濃度で与えた。予防プロトコルに割り当てられた動物（１２匹／群）ではコラーゲンで免疫した日（０日目）から始めて、４０日目に殺すまで投与した。治療プロトコルに割り当てられた動物（１２匹／群）では、発病の日（〜２８日目）に始めて、３８日目に殺すまで投与した。

評価パラメーターは、死亡率、血清クレアチニン、組織検査、及び結末の評価、例えば臨床的スコア（目視）、後足のむくみ、組織学的スコア、糜爛スコア、及び免疫組織学的検査などであった。

糜爛スコア測定は盲検法で、中指の近位指節間（ＰＩＰ）関節の矢状領域に糜爛（軟骨又は骨における炎症性組織の充満した、境界のはっきりした障害、と定義された）があるかないかによって行われた。このアプローチでは、同じ関節を比較することができた。これまでの研究では、未治療の関節炎動物の９０％より多くの動物において、この関節の糜爛が明らかにされている。

結果は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７多量投与群（５００μｇ／マウス）の負の糜爛スコアが、ビヒクル投与群の負の糜爛スコアより有意に高いことを示した（ｐ<０．０５）。中程度量のＩＳＡ_ＴＸ２４７（２５０μｇ／マウス）及び多量シクロスポリンＡ（５００μｇ／マウス）治療群両方共ビヒクル投与群に比較して高い負の糜爛スコアを示した（ｐ<０．１）。さらに、少量ＩＳＡ_ＴＸ２４７（１２５μｇ／マウス）及び中程度量シクロスポリンＡ対照（２５０μｇ／マウス）治療群は、ビヒクル対照群に比較して有意に高いとは言えないまでも、より高い負の糜爛スコアを有した。

関節の糜爛の発達を顕著に予防する唯一の治療は、５００μｇ／マウスのＩＳＡ_ＴＸ２４７であった。糜爛変化を示すＰＩＰ関節の比率が、ＩＳＡ_ＴＸ２４７投与マウスの方がビヒクル対照群マウスに比較して有意に低いということは、ＩＳＡ_ＴＸ２４７が疾患を変化させる性質を有することを証明するものである。

Ｂ．抗原誘起性関節炎
特異的病原体のない状態で飼育されたニュージーランド白ウサギを、フロイント完全アジュバントと共に乳化した生理食塩液中卵白アルブミン１０ｍｇで免疫した。これは、首筋の数箇所に筋肉内及び皮下注射によって投与された。１４日後、全ての動物で卵白アルブミン５ｍｇ及び生理食塩液中ヒト組換え形質転換増殖因子２（６５ｎｇ）の１日おきの関節内注射が始められた。

ＩＳＡ_ＴＸ２４７、シクロスポリンＡ、又はビヒクル（クレモフォルＥＬ／エタノール７２：２８、Ｖ／Ｖ）を、保存薬剤（ビヒクル中） を生理食塩液で１−ないし４倍に希釈した希釈液の皮下注射によって毎日投与し、０（ビヒクル）；ＩＳＡ_ＴＸ２４７では２．５、５．０、又は１０ｍｇ／ｋｇ／日；シクロスポリンＡでは５．０、１０又は１５ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で与えた。予防プロトコルに割り当てられた動物（８／群）には、卵白アルブミン免疫の日（０日目）から始めて、４２日目に殺すまで投与した。治療プロトコルに割り当てられた動物（８／群）では、発病の日（〜２８日目）に始めて、４２日目に殺すまで投与した。

評価したパラメーターは、死亡率、体重、血清クレアチニン、組織検査、及び結末の評価、例えば膝関節の腫張、滑液カウント、肉眼による死後分析及び組織検査などを含む。

ビヒクル対照動物と比較して、滑液の組織病理学スコアの顕著な減少が、ＩＳＡ_ＴＸ２４７（Ｐ０．０５）及びシクロスポリンＡ（Ｐ０．０５）において、治療２８日後（予防プロトコル）に認められた。これは滑液カウントの顕著な減少を伴った（ＩＳＡ_ＴＸ２４７、Ｐ０．０５；シクロスポリンＡ、Ｐ０．０５）。確立された関節炎を有する動物の滑液組織病理学的スコアも、１４日間のＩＳＡ_ＴＸ２４７（Ｐ０．０５）及びシクロスポリンＡ（Ｐ０_ＴＸ０５）治療後、ビヒクル対照に比較して有意に改善されることが判明した（治療プロトコル）。巨視的関節炎スコアの有意な減少が、ＩＳＡ_ＴＸ２４７では明らかになったが（Ｐ＝０．０１）、シクロスポリンＡ治療動物では明らかでなかった。治療は耐容性がよく、血清クレアチニン分析又は死後組織検査で顕著な毒性は認められなかった。

これらのデータは、ＩＳＡ_ＴＸ２４７がウサギの抗体誘起性関節炎モデルにおいて、リウマチ性関節炎の治療及び予防においてシクロスポリンＡと同等であるか、又は多分よりすぐれていることを示している。

実施例１７：薬物動態及び毒物動態特性
ＩＳＡ_ＴＸ２４７（４５−５０％のＥ−異性体及び５０−５５％のＺ−異性体）及びシクロスポリンＡの薬物動態及び毒物動態パラメーターを、ウサギモデルで試験した。そのウサギは、シクロスポリンＡ腎臓毒性を研究するためのモデルとしても使われているが、ラットほどよく使われてはいない。研究では、ウサギに投与したシクロスポリンＡは他の動物モデルでこれまでに報告されたものより低い用量、しかもヒトにおける治療範囲の少なくとも高い方の濃度以下でもある用量で、構造的及び機能的変化を引き起こすことが見いだされた（スリヴァリスら、１９９１、１９９４）。また、細管の細胞学的変化に加えて、間質性線維症及び動脈症の所見があることは、ウサギが腎臓毒性の研究により適したモデルであることを示唆する。なぜならば、これらの構造的変化は、ヒトで認められる腎臓毒性の顕著な特徴だからである。下記のスケジュールによって、ＩＳＡ_ＴＸ２４７を最初の７日間静脈注射（ｉ．ｖ．）し、さらに２３日間皮下注射した（ｓ．ｃ．）。

認められたいかなる腎臓変化もＩＳＡ_ＴＸ２４７効果によるもので、病原体によるものではないことを確実にするために、無病原体ウサギ（ＳＰＦ）を使用した。１及び７日目に、薬剤を投与する前と、投与後０．５、１、２、４、８、１２、１８及び２４時間後に血液サンプルを集め、薬物動態曲線を作成した。その他の評価パラメーターは、臨床的観察、体重、食餌消費量、血液検査値、臨床化学検査、肉眼的病理試験、及び選択された組織／臓器の組織病理学的検査などである。
血液サンプルを、質量分析と高性能液体クロマトグラフィーとの組合わせ（ＬＣＭＳ）によって分析した。下の表５は、シクロスポリンＡ又はＩＳＡ_ＴＸ２４７の１０ｍｇ／ｋｇを投与したウサギにおける平均薬物動態パラメーターをまとめたものである。

１０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した雄ウサギでは、シクロスポリンＡとＩＳＡ_ＴＸ２４７との薬物動態パラメーターの間に統計的有意差はなかった。同量を投与した雌ウサギのＩＳＡ_ＴＸ２４７の薬物動態パラメーターは、７日目の最大濃度を除けば雄ウサギで認められたパラメーターと有意に異ならなかった。

ビヒクル対照、シクロスポリンＡ、又はＩＳＡ_ＴＸ２４７を投与されたウサギの血液学的パラメーターにおいて有意な変化は認められなかった。下の表６に示すように、研究コース中、種々の群においてクレアチニン濃度に差が認められた。これらの差は、シクロスポリンＡが、ビヒクル対照又はＩＳＡ_ＴＸ２４７のいずれよりも有意に大きい負の効果を腎臓に与えることを示した。５０％多い量、すなわち１５ｍｇ／ｋｇ／日でさえ、１０ｍｇ／ｋｇ／日シクロスポリンＡに比べて、ＩＳＡ_ＴＸ２４７は血清クレアチニン濃度の有意な増加を誘起しなかった。

ビヒクル対照、１０ｍｇ／ｋｇシクロスポリンＡ、５ｍｇ／ｋｇＩＳＡ_ＴＸ２４７、又は１０ｍｇ／ｋｇ ＩＳＡ_ＴＸ２４７を投与した全てのウサギの試験では、有意な異常はあらわれなかった。これは特に腎臓では事実であった； 腎臓ではシクロスポリンＡ投与動物で通常見られる、間質性線維症（スリヴァリスら、1991, 1994）の徴候は認められなかった。１５ｍｇ／ｋｇ ＩＳＡ_ＴＸ２４７を投与した雄ウサギでは、精子形成の減少が認められた。この１５ｍｇ／ｋｇ用量のＩＳＡ_ＴＸ２４７投与で試験を完了した３匹の雌ウサギには、変化は認められなかった。

実施例１８：ＩＳＡ _ＴＸ ２４７の免疫抑制効果
カニクイザル（ｎ＝４）からの全血をＩＳＡ_ＴＸ２４７又はシクロスポリンと共にインキュベートし、培養培地において種々のマイトジェンで刺激した。ＳＧ_２Ｍ期の細胞で、トリチウム標識チミジンの挿入によって、及び増殖中の細胞核抗原（ＰＣＮＡ）発現のフローサイトメトリー分析によって、リンパ球の増殖を評価した。フローサイトメトリーを利用して、Ｔ細胞による細胞内サイトカインの産生及びＴリンパ球活性化抗原の発現も評価した。その後ＥＣ_５０（最大効果の５０％に達するために必要な薬剤濃度）をウィンノンリン（WinNonlin）（商標）ソフトウエアを用いて計算した。その結果は、下の表７に示されるＥＣ_５０（ｎｇ／ｍＬ）からわかるように、リンパ球増殖、サイトカイン産生、及びＴ細胞表面抗原の発現は、シクロスポリンよりもＩＳＡ_ＴＸ２４７によってより強力に阻止されることを示した。

こうして、ex vivo全血アッセイにより、ＩＳＡ_ＴＸ２４７が種々の免疫機能をシクロスポリンよりも２．３−６倍強く抑制することが判明した。

実施例１９：トリブチルアリルホスホニウムブロミドを使用するウィッティヒ反応
カリウムｔｅｒｔブトキシド（０．３１ｇ、２．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２０ｍＬに溶解した。約−４０℃で、テトラヒドロフラン３ｍＬに溶解したトリブチルアリルホスホニウムブロミド（０．９９ｇ、３．１ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。生成した黄色混合物を約−４０℃で約１０分間撹拌し、その後テトラヒドロフラン６ｍＬ中アセチルシクロスポリンＡアルデヒド（１．５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）溶液をゆっくり加えた。黄橙色反応混合物を１．５時間撹拌後、反応が完了した。反応を停止するために反応混合物を燐酸水溶液（１．２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）に移した。生成水溶液をトルエン１００ｍＬで抽出し、その後トルエン５０ｍＬで抽出した。合一した有機層を水で洗い、減圧下で濃縮乾固した。生成物、アセチル化ＩＳＡ_ＴＸ２４７がかすかに黄色の固体として約９０％収率で得られた。異性体比は、約８７％Ｅ−異性体及び約１３％Ｚ−異性体であった（１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって測定）。

実施例２０：トリブチルアリルホスホニウムブロミド及びリチウム塩基を使用するウィッティヒ反応
トリブチルアリルホスホニウムブロミド（１．３８ｇ、４．３ｍｍｏｌ）をトルエン２０ｍＬ及びテトラヒドロフラン３ｍＬの混液に溶解した。約−７８℃でブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、２．４３ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。生成した黄色混合物を約−７８℃で約１０分間撹拌し、その後トルエン６ｍＬ中アセチルシクロスポリンＡアルデヒド溶液（１．５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。黄橙色の反応混合物を３.５時間撹拌後、その反応混合物を５０ｍＬトルエンと燐酸水溶液（０．２５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）との混液に移すことによって反応を停止した。生成した二相混合物を放置して周囲温度まで温め、その後二相を分離した。トルエン層を２０ｍＬの水で洗い、減圧下で濃縮乾固した。生成物、アセチル化ＩＳＡ_ＴＸ２４７がかすかに黄色の固体として約８０％収率で得られた。異性体比は、約７０％Ｅ−異性体及び約３０％Ｚ−異性体であった（１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって測定）。

実施例２１：トリブチルアリルホスホニウムブロミド及びリチウム塩基を使用するウィッティヒ反応
上記のように、ただし約−４０℃の温度でＳＡＰ０１８を作動する。実施例２０の実験条件を反復した。このときは、反応温度約−４０℃を使用した。これらの条件のもとで、分離した生成物、アセチル化ＩＳＡ_ＴＸ２４７の異性体比は、１Ｈ−ＮＭＲ分光法で測定して、Ｅ−異性体約７４重量％及びＺ−異性体約２６重量％であった。

実施例２２：トリブチルアリルホスホニウムブロミドを使用するウィッティヒ反応
テトラヒドロフラン１５ｍＬ中アセチルシクロスポリンＡアルデヒド（１．５ｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びトリブチルアリルホスホニウムブロミド（０．９９ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の溶液を約−８０℃に冷却した。テトラヒドロフラン９ｍＬに溶解したカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．１９ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。反応を完了するために、生成した黄色混合物を約−８０℃で１時間撹拌し、その後６ｍＬのテトラヒドロフラン溶液をゆっくり加えた。黄橙色反応混合物を１.５時間撹拌後、反応は完了した。反応混合物の反応を停止するために、燐酸水溶液（０．１５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加えた。生成混合物を濃縮し、残留物をメタノール５ｍＬに溶解した。その後、混合物を水５ｍＬにゆっくり加えた。生成した沈殿を濾過し、４ｍＬのメタノール／水（１／１）で洗い、真空中で乾燥した。生成物アセチル化ＩＳＡ_ＴＸ２４７が無色固体として約９０％収率で得られた。異性体比は、約９１重量％Ｅ−異性体及び９重量％Ｚ−異性体であった（１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって測定） 。

実施例２３：アセチルＣｓＡのオゾン分解
メタノール２００ｍＬ中アセチルシクロスポリンＡ（１５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）の溶液を、サンダーオゾン発生機を使って約１．１バールで、３００Ｌ Ｏ_２／時間の流量で、反応が完了するまで（約５分間）オゾン化した。溶液にアルゴンガスを通し、メタノールに溶解したジメチルスルフィドを加えた。還元を完全にするために、混合物を室温で一晩撹拌した。約５０ｍＬに濃縮後、その溶液を水５００ｍＬにゆっくりと加えた。生成した沈殿を濾過し、水６０ｍＬで洗い、真空中で乾燥した。生成物、アセチル化ＣｓＡアルデヒドが純度約９８％の無色固体として約９５％収率で得られた（ＨＰＬＣによって測定）。

実施例２４：トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡの製法
シクロスポリンＡ（４０ｇ、１当量）を３０℃で、ジクロロメタン（１００ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ビス−（トリメチルシリル）尿素（１．１当量）を加えた。３０℃で５分撹拌後、ｐ−トルエンスルホン酸（０．０２当量）を加えた。反応混合物を反応が完了するまで還流加熱し、その後室温にまで冷やした。反応の完了は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高圧又は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析（ＭＳ）によって確認された。半飽和状態の炭酸水素ナトリウム溶液（１００ｍｌ）を加えた。水相を分離し、ジクロロメタンで再抽出した。合一した有機相を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で除去すると、粗トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡが得られた。

実施例２５：トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡアルデヒドの製法
トリメチルシリル保護シクロスポリンＡ（５ｇ、１当量）をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解した。溶液を約−７８℃の温度に冷やし、その後オゾンをその溶液に、青色があらわれるまでぶくぶく通した。次に、その溶液が無色になるまでその溶液にアルゴンをぶくぶく通し、無色になった過剰のオゾンを除去した；この工程は過剰のオゾンを除去するために行われた。トリメチルアミン（５当量）を加え、反応混合物を室温で１７時間撹拌した。水性処理後にトリメチルシリル−保護シクロスポリンＡアルデヒドが得られた。

実施例２６：ウィッティヒ反応による、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ対Ｅ二重結合異性体の３：１混合物の製法
６０分間あらかじめ撹拌した、トルエン（１０ｍｌ）中カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３当量）及びアリルトリフェニルホスホニウムブロミド（２当量）の混合物に、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡアルデヒド（１ｇ、１当量）を加えた。この反応混合物を室温で１時間反応させた後に処理すると、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ及びＥ二重結合異性体の３：１混合物（ＮＭＲによる）が得られた。

実施例２７：ウィッティヒ反応による、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ対Ｅ二重結合異性体の１：１混合物の製法
トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡアルデヒド（２．５ｇ）を２５ｍｌトルエンに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（１０当量）で処理した。反応混合物を激しく撹拌し、アリルトリフェニルホスホニウムブロミド（７．５当量、一部分ずつ）を加えた。室温で数時間反応後、反応混合物を処理すると、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ及びＥ二重結合異性体の約１：１混合物（ＮＭＲによる）が生成した。

実施例２８：ウィッティヒ反応による、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ対Ｅ二重結合異性体の１：２混合物の製法
トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡアルデヒド（１ｇ）を、トルエン５ｍｌに炭酸カルシウム（１．５当量）及びアリルトリフェニルホスホニウムブロミド（１．５当量）と共に溶解した。激しく撹拌しながら還流下で４時間反応させた後、その反応混合物を処理すると、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ及びＥ二重結合異性体の約１：２混合物（ＮＭＲによる）が生成した。

実施例２９：ウィッティヒ反応による、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ対Ｅ二重結合異性体の１：３混合物の製法
アリルトリブチルホスホニウムブロミド（３当量、アリルブロミド及びトリブチルホスフィンからつくられた）をＴＨＦ（３．５ｍｌ）に溶解した。トルエン（７．５ｍｌ）を加え、その後カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４当量）を加えた。室温で１時間撹拌後、溶液を約−３０℃に冷却した。トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡアルデヒド（１ｇ、１当量）のトルエン（５ｍＬ）溶液を滴下した。約−３０℃で４５分経過後、反応混合物を処理し、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンのＺ及びＥ二重結合異性体の約１：３混合物（ＮＭＲによる） を生成した。

下記の２実施例、実施例３０及び３１は、アリルメタレーションに関するものである。

実施例３０：アセチル−保護シクロスポリンＡ β−トリメチルシリルアルコールの製法
ＴＨＦ（１５ｍｌ）中アリルトリメチルシラン（１０．１当量）の溶液に、ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、１０当量）を室温で加えた。３０分間反応後、溶液を−７５℃に冷却し、ジエチル−Ｂ−メトキシボラン（１０．１当量）で処理した。１時間後、ホウ素トリフルオリド ジエチルエーテル錯体（１０．１当量）を加えると、Ｂ−（γ−トリメチルシリル−アリル）−ジエチルボラン試薬が生成した。１時間後、ＴＨＦ（１５ｍｌ）中アセチル−保護シクロスポリンＡアルデヒド（５ｇ、１当量）溶液を滴下した。２０分後、反応混合物を−１０℃に温め、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えた。室温で１時間撹拌後、水（４５ｍｌ）を加え、反応混合物を２５ｍｌ酢酸エチルで３回抽出した。有機相を水（２５ｍｌ）及び飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（２５ｍｌ）で逐次洗った。合一した有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール又は酢酸エチル／ヘプタン）、アセチル−保護シクロスポリンＡ β−トリメチルシリルアルコールを得た。

実施例３１：トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡ β−トリメチルシリルアルコールの製法
ＴＨＦ（１５ｍｌ）中アリルトリメチルシラン（１０.１当量）の溶液に、室温でブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、１０当量）を加えた。約３０分間反応を進行させた後、溶液を−６５℃に冷却し、ジエチル−Ｂ−メトキシボラン（１０．１当量）で処理した。１時間後、ホウ素トリフルオリド ジエチルエーテル錯体（１０．１当量）を加え、Ｂ−（γ−トリメチルシリル−アリル）−ジエチルボラン試薬を生成した。１時間後、ＴＨＦ（１５ｍｌ）中トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡアルデヒド（５ｇ、１当量）の溶液を滴下した。１５分後、反応混合物を１０℃まで温め、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液を加えた。室温で１時間［１時間］撹拌後、水（１２．５ｍｌ）及び飽和ＮａＨＣＯ_３（２５ｍｌ）を加えた。反応混合物を２５ｍｌのメチル−ｔ−ブチルエーテルで２回抽出した。有機相を水（２×２５ｍｌ）で２回洗い、次に飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍｌ）で洗った。合一した有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をクロマトグラフィー（ シリカゲル、ヘプタン／酢酸エチル）にかけ、トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡ β−トリメチルシリルアルコールを得た。

下記の３実施例、実施例３２、３３及び３４は、ピーターソン脱離反応に関するものである。

実施例３２：Ｅ−アセチル保護シクロスポリンＡジエンの製法
アセチル保護シクロスポリンＡ β−トリメチルシリルアルコール（１００ｍｇ、１当量）を、ＴＨＦ（１ｍｌ）に溶解した。濃縮Ｈ_２ＳＯ_４（１０μＬ）を加え、反応混合物を室温で２０時間撹拌した。水（１ｍｌ）を加え、反応混合物をジクロロメタン（１０ｍｌ）で抽出した。水相をジクロロメタン（１０ｍｌ）で再抽出した。合一した有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮すると、アセチル− 保護シクロスポリンＡジエン（アセチル−保護ＩＳＡ_ＴＸ２４７）が得られた。その粗生成物をメチル−ｔ−ブチルエーテル／ＴＨＦから結晶化し、その後メチル−ｔ−ブチルエーテル／ＤＣＭから再結晶すると、アセチル−保護シクロスポリンＡジエン（アセチル保護ＩＳＡ_ＴＸ２４７）がＥ及びＺ二重結合異性体の９９．９７％：１−３％混合物として得られた（４００ＭＨｚ ＮＭＲによる。測定誤差２％）。

Ｅ−アセチル−保護シクロスポリンＡジエンの加水分解を次のように行った：アセチルシクロスポリンＡジエン（４ｇ、１当量）をメタノール（８０ｍｌ）及び水（３２ｍｌ）に溶解した。炭酸カリウム（３．６５ｇ、８．３当量）を加えた。室温で１５時間撹拌した後、反応混合物を４時間４０℃まで加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を酢酸エチル（７０ｍｌ）にとった。クエン酸水溶液１５％（３０ｍｌ）をゆっくりと加え、次に水（１０ｍｌ）を加えた。水層を分離し、酢酸エチル（５６ｍｌ）で再抽出した。有機相を水（３０ｍｌ）、１５％クエン酸溶液（４０ｍｌ）及び飽和ＮａＣｌ溶液（３０ｍｌ）で洗った。有機層を合一し、Ｎａ_２ＳＰ_４上で乾燥し、減圧下で濃縮するとシクロスポリンＡジエン（ＩＳＡ_ＴＸ２４７）が得られた。

実施例３３：Ｚ−トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンの製法及びＺ−シクロスポリンＡジエン（ＩＳＡ _ＴＸ ２４７）への変換
トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡ β−トリメチルシリルアルコール（２ｇ、１当量）をＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解した。溶液を０−２℃に冷却し、カリウムｔ−ブトキシド（４当量）を加えた。１．５時間の反応後、酢酸エチル（２０ｍｌ）及び水（４０ｍｌ）を加えた。水層を分離し、酢酸エチル（２０ｍｌ）で再抽出した。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液（２０ｍｌ）で洗った。合一した有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮すると、Ｚ−トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエン（トリメチルシリル−保護ＩＳＡ_ＴＸ２４７）及びＺ−シクロスポリンＡジエン（ＩＳＡ_ＴＸ２４７のＺ−異性体）の混合物が得られた。粗生成物混合物をメタノール（溶液中１０重量％）に溶解し、１Ｍ塩酸水溶液（１当量）を加えることによって、脱シリル化が完了した。室温で１５分後に、水及び酢酸エチルを加えた。水層を分離し、酢酸エチルで再抽出した。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗った。合一した有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮すると、シクロスポリンＡジエン（ＩＳＡ_ＴＸ２４７）がＺ及びＥ二重結合異性体の９４：６混合物として（ＮＭＲによる）生成した。

実施例３４：Ｅ−シクロスポリンＡジエン（ＩＳＡ _ＴＸ ２４７）の製法
トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡ β−トリメチルシリルアルコール（５００ｍｇ、１当量）をジクロロメタンに溶解した。この溶液を約０−２℃の範囲内に冷却し、ホウ素トリフルオリド ジエチルエーテル錯体（５当量）で処理した。１時間後、水（２０ｍｌ）及びジクロロメタン（２０ｍｌ）を加えた。有機層を分離し、水（２０ｍｌ）で洗い、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮すると、直接シクロスポリンＡジエン（ＩＳＡ_ＴＸ２４７）がＥ及びＺ二重結合異性体の９１：９混合物として（ＮＭＲによる）生成した。

実施例３５：トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンの脱保護
トリメチルシリル−保護シクロスポリンＡジエンをメタノールに溶解した（溶液中１０重量％）。この溶液を１Ｍ塩酸水溶液（１当量）で処理した。室温で１５分後、水と酢酸エチルを加えた。水層を分離し、酢酸エチルで再抽出した。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗った。合一した有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮すると、シクロスポリンＡジエン（ＩＳＡ_ＴＸ２４７）が生成した。

実施例３６：アセチルシクロスポリンＡのエポキシド化
アセチルシクロスポリンＡ（２．０ｇ、１．６１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解した。１，３−ジアセトキシ−アセトン（０．１４ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を加え、その後０．０００４Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（２０ｍＬ）及び炭酸水素ナトリウム（０．４０５ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）水溶液を加えた。撹拌下の混合物に、オキソン（４３．８％ＫＨＳＯ_５）（２．２３ｇ、６．４３ｍｍｏｌ）を２時間にわたって一部分ずつ加えた。ｐＨ装置を使用して、１Ｎ ＮａＯＨを一定状態で添加し（総量６．４ｍＬ）、ｐＨを８．２に維持した。冷水浴を用いて時々冷却することによって、温度を２２−２５℃に維持した。２．５時間後、反応混合物に数滴の重亜硫酸ナトリウム溶液を加えて反応を停止した。水（１００ｍＬ）を加え、混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ、その後７５ｍＬ）で２回抽出した。その有機抽出液を塩化ナトリウムの希水溶液（１００ｍＬ）で洗い、合一し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮すると、粗アセチルシクロスポリンＡエポキシド（１．９２ｇ、９５％；ＨＰＬＣ：９９．４％領域）が白色固体フォームとして得られた。

実施例３７：アセチルシクロスポリンＡアルデヒドの製法
粗アセチルシクロスポリンＡエポキシド（１．９２ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解した。水（２０ｍＬ）を加え、その後過ヨウ素酸ナトリウム（４８９ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）及び０．５Ｍ硫酸（３．０５ｍＬ、１．５２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４０℃で１８時間撹拌し、その後過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを重亜硫酸ナトリウムの添加によって消滅させた。塩化ナトリウムの希水溶液（１００ｍＬ）を加え、混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（各１００ｍＬ）で２回抽出した。有機抽出液を塩化ナトリウム希水溶液（１００ｍＬ）で洗い、合一し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮すると、粗アセチルシクロスポリンＡアルデヒド（１．７４ｇ、９２％；ＨＰＬＣ：９５．７％領域）が白色フォームとして得られる。粗生成物をシリカゲル上で、４０％アセトン／６０％ヘキサンを溶出液としてクロマトグラフィーにかけると、生成物（１．４１ｇ、アセチルシクロスポリンＡを基準にして７１％；ＨＰＬＣ：１００％領域）が白色固体フォームとして得られた。

実施例３８：ワンポット法を用いるアセチルシクロスポリンＡアルデヒドの製法
アセチルシクロスポリンＡ（２．０ｇ、１．６１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解した。１，３−ジアセトキシ−アセトン（０．０８４ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を加え、その後０．０００４Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（２０ｍＬ）及び炭酸水素ナトリウム（０．４０５ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）水溶液を加えた。撹拌下の混合物に、オキソン（４３．８％ ＫＨＳＯ_５）（１．６７ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）を２時間にわたって一部分ずつ加えた。ｐＨ装置を使用して、１Ｎ ＮａＯＨ を一定状態で添加し（総量３．４ｍＬ）、ｐＨを８．２に維持した。温度は２０−２５℃に維持した。３．５時間後、０．５Ｍ硫酸（５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、その後数滴の濃硫酸を加え、ｐＨ１．３までにした。それから過ヨウ素酸ナトリウム（５１６ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２時間、４０℃で２２時間撹拌した。水（１００ｍＬ）を加え、混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ、その後７５ｍＬ）で２回抽出した。有機抽出液を塩化ナトリウム希水溶液（１００ｍＬ）で洗い、合一し、Ｎａ_２ＳＯ_４ 上で乾燥し、濃縮すると粗アセチルシクロスポリンＡアルデヒド（１．９ｇ、９６％；ＨＰＬＣ：８３．４％領域）が白色フォームとして生成した。粗生成物をシリカゲル上で、４０％アセトン／６０％ヘキサンを溶出液としてクロマトグラフィーにかけると、生成物（１．３５ｇ、アセチルシクロスポリンＡを基準にして６８％；ＨＰＬＣ：１００％領域）が白色固体フォームとして得られた。

実施例３９（ＩＳＯ）；アセチルシクロスポリンＡアルデヒドと３−ジメチルアミノプロピルトリフェニルリンイリデンとのウィッティヒ反応
アセチル化シクロスポリンＡアルデヒド１を、３−ジメチルアミノプロピルトリフェニルホスホニウムブロミドとヘキサメチルジシラチドカリウムとの反応から生成した無塩イリド２と反応させた（コリー及びデサイ、Tetrahedron Letters、1985, Vol.26, p.5747）。シス化合物３の選択的Ｎ−酸化を、ｍ−クロロペル安息香酸を使用して０℃で行った。高温、真空下におけるＮ−オキシドのコープ脱離によって、アセチル化Ｚ−異性体が生成した。前記のように脱保護して、ＩＳＡ_ＴＸ２４７のＺ−異性体を得た。この化合物の１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ）スペクトルは、ＩＳＡ_ＴＸ２４７ Ｚ／Ｅ混合物中のＺ−異性体の特徴である□６．５８における三重線の二重線（Ｊ＝１６．９９及び１０．５Ｈｚ）を示し、Ｚ−幾何学構造を確認した。この異性体純度は≧９９％である；なぜならば、混合物中のＥ−異性体に特徴的な□６．２８における三重線の二重線（Ｊ＝１７．５、１０．０Ｈｚ）は検出されなかったからである。

無水トルエン（２０ｍＬ）中３−ジメチルアミノプロピルトリホスホニウムブロミド（２．５ｇ、５．８３ｍｍｏｌ）の撹拌中の懸濁液に、ヘキサメチルジシラジドカリウム（１１．６ｍＬ、５．８ｍｍｏｌ、トルエン中０．５Ｍ溶液）を注射器によって加えた。室温で１時間撹拌後、その赤色溶液を遠心分離し、上澄液をカニューレによって反応フラスコに移した。その固体に無水トルエン（１０ｍＬ）を加え、撹拌し、遠心分離した。上澄液を反応フラスコに移し、合一した赤色イリドにＯＡｃ−ＣｓＡ−ＣＨＯ（１．４４ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌を室温でさらに２時間続けると、色は淡黄色に変わった。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、その後飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗った。乾燥及び溶媒除去をすると、淡黄色の固体が得られる。シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行い、アセトン−ヘキサン混液（勾配：１０ないし７５％アセトン及び９０ないし２５％ヘキサン）で溶出すると、全てのリン関連不純物は除去される。アセトンでさらに溶出すると、所望の生成物が無色固体として提供された（１．２８ｇ、８４％収率）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：２．２３（ｓ，６Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１２９．３３、１２６．９５；ＭＳ ｍ／ｚ：１３０１（Ｍ＋）、１３２４（Ｍ＋Ｎａ^＋）。

Ｎ−オキシドへの変換
ウィッティヒ反応によって得られたジメチルアミノ化合物（０．４４ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ_３（３ｍＬ）に溶解した撹拌冷溶液（０℃）に、ＣＨＣｌ_３（２ｍＬ）中ｍ−ＣＰＢＡ（０．０７ｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。３０分間撹拌後、ジメチルスルフィド（０．５ｍＬ）を加え、その後ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）を加えた。ＮａＨＣＯ_３溶液（２５ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）で洗い、乾燥し、溶媒除去する処理を行うと固体（０．４３ｇ）が生成した。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：３．１９（ｓ，３Ｈ）、３．１８（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１３１．８９、１２４．１３；ＭＳ ｍ／ｚ：１３４０（Ｍ＋Ｎａ^＋）。

Ｎ−オキシドのコープ脱離。アセチルＩＳＡ _ＴＸ ２４７の（Ｚ）−異性体の製法
Ｎ−オキシド（３５０ｍｇ）をそのまま撹拌し、真空下で２時間１００℃で加熱した。これを、その後シリカゲルカラムを通過させた。アセトン−ヘキサン混液（勾配、５ないし２５％アセトン及び９５ないし７５％ヘキサン）による溶出は、無色固体（３１４ｍｇ）を提供した。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：６．４９（ｄｔ，Ｊ＝１６．９９、１０．５Ｈｚ、１Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１３２．２０、１３１．０９、１２９．７０、１１６．８５；ＭＳ ｍ／ｚ：１２７９（Ｍ＋Ｎａ^＋）。

ＩＳＡ _ＴＸ ２４７の（Ｚ）−異性体
ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中（Ｚ）−アセチルＩＳＡ_ＴＸ２４７（５０ｍｇ）の溶液に、水（１．５ｍＬ）及びＫ_２ＣＯ_３（６０ｍｇ）を加え、室温で４８時間撹拌した。反応混合物から溶媒を除去し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で抽出した。有機層を水（１０ｍＬ）及びブライン（１０ｍＬ）で洗った。乾燥及び溶媒除去により無色固体が生成した。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：６．５８（ｄｔ，Ｊ＝１６．９９、１０．５Ｈｚ、１Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ：１２３６．８（Ｍ＋Ｎａ^＋）。生成した化合物はＩＳＡ_ＴＸ２４７のＺ−異性体であった。ＮＭＲによる測定では、計り得るＥ−異性体は認められなかった。

本発明の好ましい実施形態のみを詳細に開示し、上述したが、上記の教示に照らして、そして添付の請求の範囲内で、本発明の精神及び目的の範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変形及び変更が可能であることは明らかである。

図１Ａは、分子の環式ペプチド環を構成する１１個のアミノ酸残基を示すシクロスポリンＡの構造、並びに１−アミノ酸残基の側鎖の構造を示す図である； 図１Ｂは、本明細書中に用いられる用語「ＣｓＡ」の定義を特に強調したシクロスポリンＡの構造を示すもう一つの図である； 図２Ａは、ＩＳＡ_ＴＸ２４７と呼ばれるシクロスポリンＡ類似体のＥ−異性体（又はトランス−異性体）の構造を示す図である； 図２Ｂは、シクロスポリンＡ類似体ＩＳＡ_ＴＸ２４７のＺ−異性体（又はシス−異性体）の構造を示す図である； 図３は、本発明のシクロスポリン類似体をつくるために使用できる典型的合成経路の概観を示し、ここで立体選択的経路は反応条件によってグループ化される； 図４は、臭素化前駆体からＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の混合物を生成する合成経路を示す図である； 図５は、アルデヒド前駆体からＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の混合物を生成する別の合成経路を示す図である； 図６は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）又は（Ｚ）−異性体どちらかに富む組成物をつくるために使用できる典型的立体選択的反応スキームを示し、その際いずれの異性体も同じ前駆体アルコールから合成できる； 図７は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｚ）−異性体に富む組成物の立体選択的合成の別の反応スキームを示す図である； 図８は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）−異性体に富む組成物の立体選択的合成の別の反応スキームを示す図である； 図９Ａ−Ｃは、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の混合物を生成する典型的合成経路を示す図であり、前記２異性体が特定の例示的比率で生成するように各反応条件は調節される； 図１０は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７の（Ｅ）及び（Ｚ）−異性体の混合物を生成するための典型的立体選択的経路を示す図であり、ここで２種類の異性体のうちの１種類の異性体に富む組成物を先ず第一につくり、その後所定の比率に合うように混合して所望比を得る； 図１１は、ＩＳＡ_ＴＸ２４７（Ｅ−異性体４５−５０％及びＺ−異性体５０−５５％）によるカルシニューリンホスファターゼ活性阻害効果が、シクロスポリンＡの阻害効果の３倍より強力であった（ＩＣ_５０によって測定）ことを示すアッセイ結果を提供する； 図１２は、幾つかの重水素化及び非重水素化類似体異性体混合物の構造及び異性体組成を示す； 図１３は、種々の重水素化及び非重水素化類似体異性体混合物によるカルシニューリンホスファターゼ活性の阻害効果が、シクロスポリンＡ に比較して少なくとも同様に強力であった（ＩＣ_５０によって測定）ことを示すアッセイ結果を提供する。

Claims (53)

1. １‐アミノ酸残基が１，３‐ジエン置換基で修飾されたシクロスポリン類似体の異性体混合物を含む組成物であって、前記異性体混合物が重量にして７５％から９５％のＥ−異性体及び重量にして２５％から５％のＺ−異性体を含み、ここでＥ−異性体とＺ−異性体の重量パーセントの合計が１００重量パーセントであり、前記異性体は以下に示すＥ−及びＺ−異性体である、組成物。
   

   
2. 前記異性体混合物が、７５％から８５％のＥ−異性体及び１５％から２５％のＺ−異性体を含む、請求項１記載の組成物。
3. 前記異性体混合物が、８５％から９０％のＥ−異性体及び１０％から１５％のＺ−異性体を含む、請求項１記載の組成物。
4. 前記異性体混合物が、９０％から９５％のＥ−異性体及び５％から１０％のＺ−異性体を含む、請求項１記載の組成物。
5. 治療組成物である、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
6. 請求項１から４のいずれかに記載のシクロスポリン類似体の異性体混合物及び薬物学的に容認される賦形剤を含む、医薬組成物。
7. 界面活性剤、エタノール、親油性及び／又は両親媒性溶媒を含有する液体溶液を含む請求項６に記載の医薬組成物。
8. d-アルファ トコフェリル ポリエチレングリコール１０００琥珀酸（ビタミンＥ ＴＰＧＳ）、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）油、ツイーン４０、及びエタノールを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 異性体類似体混合物、界面活性剤、エタノール、親油性及び／又は両親媒性溶媒を含む液体溶液を含有するゼラチンカプセルを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
10. 単位投与型である、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
11. ５ｍｇから５００ｍｇの活性成分を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. ５０ｍｇの異性体混合物を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
13. 溶液が５０ｍｇ／ｍＬの異性体混合物を含む、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
14. 経口投与に適した、請求項６に記載の医薬組成物。
15. 請求項６から１４のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記シクロスポリン類似体の異性体混合物を、動物に投与したときに免疫抑制をもたらすために有効な量含むものである、医薬組成物。
16. 前記動物がヒトである、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 投与されるシクロスポリン類似体の異性体混合物の量が、０．０５ｍｇから５０ｍｇ／ｋｇ体重／日である、請求項１５に記載の医薬組成物。
18. 投与されるシクロスポリン類似体の異性体混合物の量が、０．１ｍｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である、請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 投与されるシクロスポリン類似体の異性体混合物の量が、０．５から１０ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 請求項１９に記載の医薬組成物であって、投与されるシクロスポリン類似体の異性体混合物の量が２から６ｍｇ／ｋｇ／日であり、前記医薬組成物が一日２回の経口投与に適するよう構成されたものである、医薬組成物。
21. 請求項２０に記載の医薬組成物であって、投与されるシクロスポリン類似体の異性体混合物の量が０．５から３ｍｇ／ｋｇ／日であり、前記医薬組成物が一日２回の経口投与に適するよう構成されたものである、医薬組成物。
22. 前記免疫抑制が、急性臓器又は組織移植体拒絶を、治療又は緩和するためのものである請求項１５から２１に記載の医薬組成物。
23. 前記移植体拒絶が、心臓、肺、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸及び角膜の移植における拒絶からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. 前記免疫抑制が、Ｔ−細胞によって仲介される拒絶を治療又は緩和するものである請求項１５から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
25. 前記免疫抑制が、グラフト対ホスト疾患を治療又は緩和するためのものである、請求項１５から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
26. 前記疾患が骨髄移植によって起こるものである、請求項２５に記載の医薬組成物。
27. 前記免疫抑制が、移植臓器の慢性拒絶を治療又は緩和するためのものである請求項１５から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
28. 前記慢性拒絶が、移植血管疾患である請求項２７記載の医薬組成物。
29. 前記免疫抑制が、異種移植片拒絶を治療又は緩和するためのものである、請求項１５から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
30. 前記異種移植片拒絶が、臓器ドナーがレシピエントとは異なる種の場合に起きる、臓器の急性、超急性及び慢性拒絶からなる群から選択される、請求項２９に記載の医薬組成物。
31. 前記異種移植片拒絶が、Ｂ−細胞によって仲介される拒絶又は抗体仲介性拒絶である請求項３０に記載の医薬組成物。
32. 前記免疫抑制が、自己免疫疾患又は障害、又は、炎症性疾患又は障害を、治療又は緩和するためのものである、請求項１５から２１いずれかに記載の医薬組成物。
33. 前記疾患又は障害が、関節炎、リウマチ性関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎及びその他のリウマチ性疾患からなる群から選択される、請求項３２に記載の医薬組成物。
34. 前記疾患又は障害が、血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ウェーグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、（自己免疫性）炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ぶどう膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎、春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎、特発性ネフローゼ症候群、リポイドネフローゼ、及び若年性皮膚筋炎からなる群から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
35. 前記疾患又は障害が、乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形性紅班、疱疹状皮膚炎、硬皮症、白斑、過敏性血管炎、じんましん、水疱性類天疱瘡、エリテマトーデス、天疱瘡、後天性表皮水疱症、その他の炎症性又はアレルギー性皮膚障害、肺及び気道の炎症性障害、喘息、アレルギー、及び塵肺症からなる群から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
36. 免疫抑制剤の製造における１‐アミノ酸残基が１，３‐ジエン置換基で修飾されたシクロスポリン類似体の異性体混合物の使用であって、前記異性体混合物は重量にして７５％から９５％のＥ−異性体及び重量にして２５％から５％のＺ−異性体を含み、ここでＥ−異性体とＺ−異性体の重量パーセントの合計が１００重量パーセントであり、前記異性体混合物は以下に示すＥ−及びＺ−異性体である、使用。
    

    
37. 前記異性体混合物が７５％から８５％のＥ−異性体及び１５％から２５％のＺ−異性体を含む請求項３６記載の使用。
38. 前記異性体混合物が８５％から９０％のＥ−異性体及び１０％から１５％のＺ−異性体を含む請求項３６記載の使用。
39. 前記異性体混合物が９０％から９５％のＥ−異性体及び１０％から５％のＺ−異性体を含む請求項３６記載の使用。
40. 前記免疫抑制が、急性臓器又は組織移植体拒絶を、治療又は緩和するためのものである、請求項３６から３９のいずれかに記載の使用。
41. 前記移植体拒絶が、心臓、肺、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸及び角膜の移植における拒絶からなる群から選択される、請求項４０に記載の使用。
42. 前記免疫抑制が、Ｔ−細胞によって仲介される拒絶を治療又は緩和するものである請求項３６から３９に記載の使用。
43. 前記免疫抑制が、グラフト対ホスト疾患を治療又は緩和するものである請求項３６から３９に記載の使用。
44. 前記グラフト対ホスト疾患が、骨髄移植によって起こるものである、請求項４３に記載の使用。
45. 前記免疫抑制が、移植臓器の慢性拒絶を治療又は緩和するためのものである請求項３６から３９のいずれかに記載の使用。
46. 前記慢性拒絶が移植血管疾患である、請求項４５に記載の使用。
47. 前記免疫抑制が異種移植片拒絶を治療又は緩和するものである請求項３６から３９のいずれかに記載の使用。
48. 前記異種移植片拒絶が、臓器ドナーがレシピエントと異なる種である場合に起きる、臓器の急性、超急性及び慢性拒絶からなる群から選択される請求項４７記載の使用。
49. 前記異種移植片拒絶が、Ｂ−細胞によって仲介される拒絶又は抗体仲介性拒絶である、請求項３６から３９に記載の使用。
50. 前記免疫抑制が、自己免疫疾患又は障害、又は炎症性疾患又は障害を治療、又は緩和するものである請求項３６から３９記載の使用。
51. 前記疾患又は障害が、関節炎、リウマチ性関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎及びその他のリウマチ性疾患からなる群から選択される、請求項５０記載の使用。
52. 前記疾患又は障害が、血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ウェーグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、（自己免疫性）炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ぶどう膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎、春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎、特発性ネフローゼ症候群、リポイドネフローゼ、及び若年性皮膚筋炎からなる群から選択される、請求項５０に記載の使用。
53. 前記疾患又は障害が、乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形性紅班、疱疹状皮膚炎、硬皮症、白斑、過敏性血管炎、じんましん、水疱性類天疱瘡、エリテマトーデス、天疱瘡、後天性表皮水疱症、その他の炎症性又はアレルギー性皮膚障害、肺及び気道の炎症性障害、喘息、アレルギー、及び塵肺症からなる群から選択される請求項５０に記載の使用。

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