CN106929482A - 定点突变的流感病毒、其活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经过定点突变的流感病毒、多个位点同时突变的流感病毒，所述流感病毒可以是人源的，也可以是其它动物的。本发明还涉及定点突变流感病毒的方法，所述方法包括使用反向遗传技术在流感病毒基因组中引入UAG、使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入流感病毒基因中。本发明进一步涉及定点突变或多个突变位点组合的流感病毒的应用，如作为减毒活疫苗、复制可控的安全流感病毒模型等的用途。

Description

定点突变的流感病毒、其活疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及定点突变、定点修饰、复制可控的流感病毒活疫苗，所述的定点突变为用非天然氨基酸定点突变流感病毒任意蛋白的天然氨基酸，还涉及将经过所述定点突变的位点进行组合制备在多个基因片段上引入非天然氨基酸的流感病毒。本发明还涉及定点突变流感病毒的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术和基因密码子拓展技术将非天然氨基酸定点引入流感病毒的任意基因中。本发明进一步涉及定点突变或多点组合的流感病毒的应用，如作为流感病毒活疫苗、流感病毒强毒的安全模型等的用途。
背景技术
流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病，可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型，其中以A型(又称甲型)流感病毒的暴发最为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科，其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成，编码10种蛋白：血凝素蛋白(HA)；基质蛋白(M)分为M1和M2；神经氨酸酶(NA)；核壳蛋白(NP)；非结构蛋白(NS)包括NS1和NEP；PB1，PB2和PA三种聚合酶，每种蛋白对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型，目前已发现了18种亚型的HA蛋白和11种亚型的NA蛋白。A型流感病毒大规模流行可引起极高的发病率和死亡率，严重威胁着人类的健康(W.H.O.2003；Coleman 2007)。A型流感病毒在二十世纪主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2，共造成约5000万人死亡(Kilbourne 2006；Taubenberger,Hultin et al.2007)。2009年甲型流感也是由H1N1流感病毒引起(Dawood,Jain et al.2009；Zimmer and Burke 2009)，其传播之迅速，引起了世界的关注。据统计，全世界平均每年有30-50万人死于流感(Fiore,Shay et al.2007)。
自流感发现以来，科学家们一直致力于对于流感病毒的防控，接种疫苗目前是最有利于预防流感，控制流感传播的手段。20世纪30年代末流感病毒疫苗开始在人类中使用，目 前的流感病毒疫苗分为以下几种：灭活病毒疫苗和减毒病毒疫苗，DNA疫苗，亚单位疫苗，重组病毒载体疫苗，类病毒颗粒疫苗。
目前应用的灭活流感疫苗为三价疫苗,包括H1N1、H3N2和B型流感病毒疫苗,多年的临床应用表明流感灭活疫苗具有很好的免疫效果和安全性,接种后可刺激机体产生相应的抗体，但缺点是不能刺激产生分泌型免疫球蛋白(sIgA)。另外,流感病毒在鸡胚上传代会发生抗原变异,且大部分鸡体内携带有多种病毒,疫苗有被这些病毒污染的可能。由于新流行的抗原变异株必须要能在鸡胚中高效复制,才有可能生产大量疫苗。随着制备疫苗所用的野生型病毒在鸡蛋中生长,其免疫原性在一定程度上被改变或降低。如果生产的疫苗株与当前流行株不匹配,就会失去免疫保护效果。近年来,一个重大进展就是利用哺乳动物细胞代替鸡胚培养,哺乳动物细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞,具有无外源因子污染、易于规模化生产、抗原稳定等优点,哺乳动物细胞培养的流感疫苗具有较好的免疫原性,接种后不良反应轻,较安全。研究阶段取得了很好的实验结果。但还有一些问题未能解决,临床尚未见到使用。
减毒活疫苗主要包括温度敏感型疫苗、重配疫苗、冷适应减毒流感活疫苗、反向遗传技术疫苗和复制缺陷流感疫苗5种类型。现在研制成功的是冷适应减毒流感活疫苗。该疫苗是一种降低了毒力并能在最佳适应温度下生长的流感病毒株。这种病毒只能在25℃左右复制,不能在37℃下传代,因此其感染只局限于上呼吸道，临床上无明显的流感症状。利用弱毒株与当前的流行毒株进行基因重组,得到带有弱毒株片段和流行株的HA和NA基因的重组病毒。多项研究证实,冷适应毒株生物学性质有很好的稳定性。弱毒流感疫苗与灭活疫苗的免疫后抗体阳转率都在50％～70％,能有效控制流感的流行。冷适应减毒活疫苗已在俄罗斯使用,美国也将被批准使用。其在接种途径、免疫效果方面比灭活疫苗有一定的优势,如可通过鼻内喷雾或者点滴方式来免疫。冷适应减毒活疫苗在上呼吸道复制,可诱导黏膜的sIgA和全身的体液及细胞免疫反应,产生比灭活疫苗更广泛更持久的保护。但冷适应减毒活疫苗可与其他流感病毒发生基因重配后得到有毒的重配株病毒,并且在二价或三价冷适应减毒活疫苗中可能会出现干扰现象。
理想的疫苗应具备下列条件:①免疫原性强.②毒性反应小.③遗传学上稳定.④在流行期能快速获得与流行株一致的抗原性。鉴于活疫苗相对于灭活疫苗的优势及活疫苗的安全考虑，使用哺乳动物细胞生产复制可控、遗传稳定、安全有效的新型流感病毒活疫苗，提高疫苗的安全性和有效性，将会促进流感疫苗快速发展。
遗传密码扩展技术
经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码扩展的技术—利用琥珀终止密码子(TAG)来编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将数种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质。使用这一方法，可以将非天然氨基酸(包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸)引入蛋白质中(L.Wang等人，(2001)，SCIENCE 292:498-500；J.W.Chin等，2002，Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin,& P.G.Schultz,2002,ChemBioChem 11:1135-1137)。这些研究表明，有可能且有选择性且常规地引入化学官能基团到蛋白质中，例如，羰基、炔基、和叠氮基团等特殊化学基团，这些基团一般能够有效且选择性地形成稳定的共价键，更加有利于蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。这一技术不仅可以用于蛋白质的定点修饰上，还被用在了活体生物体(如病毒、细菌等)的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面。这种在基因组中引入TAG的生物活体的复制、蛋白表达依赖于外源非天然氨基酸生物正交系统。
发明内容
发明人经过对现有技术的思考和研究，将琥珀终止密码子(TAG)引入到流感病毒的基因组中，并利用古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到相应的蛋白的相应位点上，从而得到了定点突变的流感病毒。这类流感病毒的复制、蛋白表达等一系列的生命过程依赖于非天然氨基酸生物正交系统，即该类病毒可以在非天然氨基酸生物正交系统中进行包装、繁殖、制备，而一旦脱离了该非天然氨基酸生物正交系统，病毒就不能进行复制、蛋白表达等生命活动。因此，利用对非天然氨基酸依赖性制备的流感病毒，具有很高的安全性。此外，该定点突变的流感病毒可以进一步修饰，进而得到定点修饰的流感病毒，所述的定点修饰例如将一些免疫增强剂定点到流感病毒蛋白的特定的氨基酸进行的方法，从而得到性能改善的流感病毒，如得到免疫原性增强的修饰产物。
本发明最重要的突破是在流感病毒基因组中引入了琥珀终止密码子(UAG)，使得流感病毒只有在非天然氨基酸生物正交系统中才可以复制。利用流感病毒对该非天 然氨基酸生物正交系统的依赖性，我们可以在该系统中进行流感病毒的大量制备，由于动物和人体中并没有该生物正交系统，因此制备出来的流感病毒在动物和人体中不能进行复制繁殖，增加了病毒的安全性，从而使得该流感病毒成了名副其实的流感病毒活疫苗。此外，由于人工合成的非天然氨基酸可以修饰具有不同功能的官能团，可以为后续定点修饰的特异性提供保证，例如Click反应仅仅能够发生在所述的非天然氨基酸上，而不会在病毒蛋白的其他位点发生，这对于定点修饰的流感病毒均质性及免疫原性的保留至关重要。
该突变系统的原理在于：突变型的tRNAPyl，PylRS满足下列关系：(1)：tRNAPyl不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA酶，只能被突变型的PylRS酰化；(2)：突变型的PylRS只能酰化tRNAPyl，不能酰化其它tRNA，因此，突变性tRNAPyl和PylRS之间的关系式正交性的。这种正交性的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸酰化到这种正交的tRNA上，并且只能酰化这种tRNA，而不能酰化其它的tRNA。获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA系统，使非20种常见氨基酸的Lys-diazirine或Lys-azido等与琥珀密码子TAG相对应，从而将非天然氨基酸定点引入到流感病毒的各个蛋白中。由于动物和人体中并没有该生物正交系统，因此制备出来的流感病毒在动物和人体细胞中不能进行复制繁殖，增加了病毒的安全性。
具体地，在本发明的一个具体的实施方案中，提供了引入非天然氨基酸的流感病毒，主要通过3个步骤：(1)构建可以稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系，优选HEK293-PYL(已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日为2015年11月17日、保藏号为CGMCC No：11592。其分类命名为人HEK293T细胞)，(2)通过生物信息学手段，分析流感病毒各个蛋白中氨基酸的保守性，并确定引入TAG的位点，(2)构建含有在选定的位点具有TAG突变的编码流感病毒各个蛋白基因的质粒，(3)获得pACYC-tRNA/PylRS质粒，该质粒已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日为2011年6月14日。其在中国专利号为201210214451.6的专利中已经公开。本保藏号为CGMCC No：4951的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)含有该质粒pACYC-tRNA/PylRS，该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。利用反向遗传技术，将步骤(2)与(3)中的质粒在293T细胞中共转染，且在培养基中添加需要的非天然氨基酸，获得在基因组中引入了TAG终止密码子、从而在对应的蛋白中引入非天然氨基酸的流感病毒。
在本发明的一个具体的实施方案中，通过将带有琥珀密码子TAG的流感病毒基因插入到载体(例如pHH21质粒)中，将所述的与pACYC-tRNA/PylRS一起转染293T细胞，即可通过在培养液中添加非天然氨基酸例如Lys-diazirine或Lys-azido获得定点突变的流感病毒。
在本发明的一个实施方案中，在流感病毒的PA、PB1、PB2、NP基因片段上分别引入TAG，然后将Lys-azido定点修饰到流感病毒的PA、PB1、PB2、NP蛋白相应的位点，经中空纤维柱和凝胶层析方法或者蔗糖梯度密度离心方法，即可得到纯化后的突变型流感病毒。经体内外实验初步证明，突变型的流感病毒具有非常高的安全性和遗传稳定性，并且与灭活病毒相比具有更好的免疫效果。
在本发明的一个实施方案中，为了提高流感病毒的产出效率，以及将来的工业化生产，发明人建立了可以稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL。该哺乳动物稳定细胞系还解决了传统使用鸡胚繁殖病毒易引起人体过敏等不良反应的缺点。在本发明中提供了一种可由哺乳动物细胞制备，在基因组和相应蛋白中分别引入琥珀终止密码子UAG和非天然氨基酸的突变流感病毒。该病毒也可以由稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系(如293T细胞)来制备。制备的突变流感病毒具有很好的安全性和免疫活性。
tRNA的稳定表达国际上尚缺乏理想的方法，为了提高突变型流感病毒的拯救效率，经过反复摸索，发明人建立了一套双慢病毒转导和质粒稳定转染结合的三轮筛选方法，建立了稳定表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的特殊细胞系，可以稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL(图12A)。发明人构建了分别带有puromycin和hygromycin抗性的2个慢病毒过表达载体，两者分别携带氨酰tRNA合成酶和带有39位TAG突变的报告基因GFP，通过两轮病毒转导HEK-293T细胞和puromycin/hygromycin筛选,得到稳定细胞株pylRS/GFP39TAG。之后,我们构建了携带12个拷贝数tRNA和zeomycin抗性的bjmu-zeo-12tRNA载体，质粒线性化转染细胞株pylRS/GFP39TAG，后经UAA存在下zeomycin筛选，最后分离出GFP阳性细胞(UAA存在下细胞呈绿色，去除UAA细胞呈无色)，从而得到了表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系HEK293-PYL。
在本发明的一个实施方案中，利用反向遗传技术，发明人可以将现用的流感病毒模型 的任意基因替换成其他亚型或者毒株的基因，从而制备出其他亚型或者毒株的流感病毒，使得该方法可以应用于任意亚型或毒株的流感病毒，而且制备出的病毒对非天然氨基酸生物正交系统具有严格的依赖性。此外，利用反向遗传技术和基因密码子技术，还可以制备多价流感病毒，如含有H1N1、H3N2、B型流感病毒表面抗原的多价流感病毒。更重要的是，制备出的突变型强毒和多价病毒具有非常高的安全性和有效性。
更为具体地，本发明提供了
1.定点突变的流感病毒，其在不同基因片段的特定位点引入1个琥珀终止密码子UAG，并在对应蛋白的相应位点1个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自：
所示的Lys-diazirine，
所示的Lys-azido，或
其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种；
所述的不同基因片段选自：流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS、M中的至少一个。
所述特定位点选自：上述至少一个基因片段中的任意位点。
2.定点突变的流感病毒，其与野生型的流感病毒的序列的区别在于：在野生型流感病毒至少一个基因片段的第N个密码子被突变为琥珀终止密码子UAG，而相应的蛋白的第N个氨基酸被突变为Lys-diazirine，所述突变氨基酸在流感病毒相应蛋白中的连接方式如下式所示：
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸 选自被突变蛋白序列中的任意一个氨基酸，
R1为被突变蛋白所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为被突变蛋白所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基，
R3为
3.定点突变的流感病毒，其与野生型的流感病毒的序列的区别在于：在野生型流感病毒至少一个基因片段的第N个密码子被突变为琥珀终止密码子UAG，而对应的蛋白的第N个氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸与流感病毒相应蛋白序列的连接方式如下式所示：
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自被突变蛋白序列中的任意一个氨基酸，
R1为被突变蛋白所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为被突变蛋白所示序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基，
R4为
4.经过上述项目1-3任一项突变的流感病毒，其经过修饰，或者包含数个突变位点的组合。
5.项目4所述的定点突变的流感病毒，其是将PA上的R266、PB1上的R52、PB2上的K33、NP上的D101四个位点进行了组合突变。
6.项目1-5中任一项所述的突变的流感病毒，其特征在于，
未经突变的PB2的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的PB1的氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的PA的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的核酸编码的氨基酸序列相 同，
未经突变的HA的氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的NP的氨基酸序列与SEQ ID NO:6所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的NA的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的M的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的核酸编码的氨基酸序列相同，或
未经突变的NS的氨基酸序列与SEQ ID NO:9所示的核酸编码的氨基酸序列相同。
7.根据项目5所述的定点突变的流感病毒，其是WSN-RNP-TAG。
8.一种编码项目1-7中任一项所述的突变的流感病毒或其经突变的蛋白的核酸分子，其特征在于在终止密码子之外，还包含密码子UAG。
9.核酸载体，其可拯救项目1-7中任一项所述的突变型流感病毒。
10.定点突变流感病毒的方法，包括步骤：
(1)选择步骤：在流感病毒不同蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；
(2)基因突变：将编码对应于(1)中选择的位点的流感病毒蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG；
(3)表达载体构建：将(2)基因突变步骤得到的突变的流感病毒蛋白的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；
(4)获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒，
(5)包装病毒：将(3)得到的突变序列表达载体与(4)的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养；或者将(3)得到的突变序列表达载体转染可稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系，优选 HEK293-PYL，其保藏日为2015年11月17日、保藏号为CGMCC No：11592，将转染成功后的稳定系细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养；
(6)当包装出的野生型病毒使(5)中的宿主细胞完全病变后，收集上清，离心并过0.45um滤膜去除细胞碎片，对包装产物进行非天然氨基酸依赖性的检测，保留维持着非天然氨基酸依赖性的突变体设定为定点突变成功候选物。
11.项目10的定点突变流感病毒的方法，其中在步骤(6)之后还进一步包括：
(7)将(6)中定点突变成功的候选物的突变位点进行组合，再次包装病毒，使得包装出的病毒在多个基因片段上均引入了UAG，在相应的多个蛋白上均引入了非天然氨基酸。然后再次考察包装产物对非天然氨基酸的依赖性，保留经过长期传代仍旧维持着对非天然氨基酸依赖性的组合突变体设定为最优的定点突变成功候选物。
12.项目10的定点突变流感病毒的方法，其中在步骤(7)之后还进一步包括：
(8)最优定点突变成功候选物，并对产物进行纯化；
(9)对(8)中突变型流感病毒进行安全性或免疫原性检测，相比野生型病毒，安全的流感病毒为突变成功的流感病毒。
13.使用项目10-12中任一项的方法制备的含有定点突变的流感病毒。
14.使用项目10-12中任一项的方法制备的含有定点突变的流感病毒，其是H5N1、H3N2或B型流感病毒。
15.含有有效量的项目1-7或项目13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒的组合物。
16.含有有效量的项目1-7或项目13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒的疫苗。所述疫苗可以含有疫苗领域常用的佐剂和其它辅料。
17.药物组合物，其中含有有效量的项目1-7或项目13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒，以及药学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。
18.项目1-7或项目13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒在制备减毒活疫苗、制备预防和治疗流感病毒感染相关药物中的用途。
19.项目1-7或项目13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒在预防和治疗流感病毒感染中的用途。
20.项目10中所述的稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL，其保藏日为2015年11月17日、其保藏号为CGMCC No：11592。
上述的组合物、药物组合物和疫苗可以在本发明制备定点突变的流感病毒的基础上采用本领域常规技术制备；它们可以用于预防或治疗流感病毒感染，包括人和动物的流感病毒感染。
附图说明：
图1：流感病毒各个蛋白上氨基酸保守性的分析。
图1A.用生物信息学工具Consurf计算流感病毒各个蛋白氨基酸序列保守性的工作流程。
图1B.流感病毒NP蛋白氨基酸序列保守型分析。
图1C。流感病毒PA蛋白的氨基酸序列保守性分析。
图1D.流感病毒PB2蛋白的氨基酸序列保守性分析。
图1E.流感病毒PB1蛋白氨基酸序列保守性分析。
图1F.流感病毒HA蛋白的氨基酸保守性分析。
图1G.流感病毒NA蛋白氨基酸序列保守性分析。
图1H.流感病毒NS保守性分析。
图1I.流感病毒M1氨基酸保守性分析。
图1J.流感病毒M2氨基酸保守性分析。
图2.流感病毒各个蛋白上进行点突变后，拯救流感病毒的效果。位点仅作为代表，不局限于所示位点。
图2A.流感病毒NP蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图2B.流感病毒PA蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图2C.流感病毒PB2蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图2D.流感病毒PB1蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图2E.流感病毒HA蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图2F.流感病毒NA蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图2G.流感病毒NS蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图2H.流感病毒M1蛋白点突变后，拯救流感病毒的效果。
图3.在流感病毒NP、PA、PB1、PB2上同时引入点突变后，拯救流感病毒的效果。即选择流感病毒的NP-S3、PA-S1、PB1-S4、PB2-S4这四个位点，进行组合，同时突变这四个位点，使用所得的质粒，拯救流感病毒。将所得到的流感病毒命名为WSN-RNP-TAG。
图4.对制备出的WSN-RNP-TAG的遗传稳定性进行考察，说明制备出的突变型流感病毒在多次传代后，仍旧是稳定的。在实验过程中，对该病毒连续传代时间长达4个月，制备的病毒一直维持着对非天然氨基酸的依赖性。
图5.通过病毒噬斑实验，发现突变型WSN-RNP-TAG是不能形成噬斑的，进一步说明了该种突变病毒的安全性。
图6.通过qRT-PCR说明，使用我们发明的方法制备的流感病毒的产量很高，接近野生型流感病毒的产量。
图7.通过测定野生型和突变型WSN-RNP-TAG的病毒的抗原红细胞凝集效价，说明突变型流感病毒和野生型病毒而的抗原红细胞凝集效价是基本一致的，进一步说明，制备出的突变型流感病毒的产量很高。
图8.为了检测突变型病毒WSN-RNP-TAG的安全性和免疫原性，设计了如下的动物实验方案。其中病毒的接种方式是鼻腔接种，取血方式是眼眶取血。
图9.突变型病毒WSN-RNP-TAG的动物水平安全性考察结果(每组小鼠数量为10只)。当接种野生型流感病毒时，所有的小鼠体重均明显下降，并在接种后第10天全部死亡。当接种突变型WSN-RNP-TAG或者灭活的流感病毒WSN-positive control时，所有的小鼠体重均没有明显下降，且观察期间所有的小鼠均存活。说明，突变型WSN-RNP-TAG在动物水平具有很好的安全性。
图10.突变型WSN-RNP-TAG在动物水平的有效性考察。
图10A.按照图8的实验方案，取各组小鼠肺组织，通过qRT-PCR的方式检测肺组织中病毒的相对含量。结果如图所示，当用灭火病毒或者突变型WSN-RNP-TAG对小鼠免疫后，小鼠肺组织中的病毒含量下降，并呈现免疫剂量依赖性。此外，突变型WSN-RNP-TAG的免疫效果优于灭活病毒的免疫效果。
图10B.通过Elisa实验检测免疫前后的各组小鼠体内抗HA抗体的含量。结果说明免疫后14天和免疫后21天小鼠体内的抗体含量均增加，且21天的抗体含量高于14天时的抗体含量。
图10C.按照图8的实验方案，对各组小鼠分别进行免疫之后，用100LD50的WSN进行攻毒。并进行了小鼠体重和死亡率的考察，发现我们制备的突变型病毒WSN-RNP-tag可以很好地保护动物不受病毒的感染。并且，1倍剂量的突变型WSN-RNP-tag对小鼠的保护效果甚至和10倍剂量的灭活WSN的保护效果相当。这充分显示了我们制备的减毒流感疫苗相对于灭活疫苗具有更好的优势。
图11.比较使用普通哺乳动物细胞293T和稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL拯救突变型流感病毒的效率。结果说明，使用稳定细胞系拯救突变型流感病毒的效率远远高于使用普通293T细胞。
图12A.正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系HEK293-PYL筛选方法的建立。
图12B.双病毒过表达体系的构建。
图12C.bjmu-12t-zeo载体的构建。
图13接种流感病毒疫苗后的小鼠体内抗NA和NP蛋白的抗体含量测定，WSN-RNP-tag可以诱导小鼠产生NA特异性抗体和NP的特异性抗体。
图14 WSN-RNP-tag对小鼠肺内病毒特异性抗体IgA的诱导作用。相对于灭活的WSN，WSN-RNP-tag可以诱导高水平的IgA。
图15 WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量。灭活的WSN几乎不能影响NP特异性的CD8+T细胞的含量，而WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量明显增加。
为了更好地理解本发明，发明人用实施例对具体试验进行阐述和说明，其中所述实施例仅用于说明，并不限定本发明的保护范围。任何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。
实施例1：包含定点突变的流感病毒WSN的基因载体的构建
(1)辅助质粒的获得
从保藏地：中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏地址：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的含有质粒pACYC-tRNA/PylRS的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS(以下简称该质粒为辅助质粒)，该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。
(2)拯救野生型流感病毒WSN的质粒的获得
根据pubmed公布的流感病毒A/WSN/1933的基因序列，经全基因合成，获得该流感病毒各个基因片段的基因。流感病毒各基因序列分别如SEQ ID NO:2-9所示。然后将其分别连接在pHH21、pCDNA 3(neo)、pcAAGGS/MCS载体上，获得拯救野生型流感病毒WSN的质粒。获得的质粒的命名及构成如表1所示。
(3)定点突变位点的选择
通过生物信息学工具Consurf对流感病毒各个蛋白的氨基酸的保守性进行分析，并根据已被解析的流感病毒蛋白的晶体结构(NP-PDB:2IQH；PA-PDB：4IUJ；PB1-PDB：3A1G、2ZNL；PB2-PDB：4ENF；NA-PDB：3TI6；HA-PDB：1RVT；M-PDB：4PUS、2RLF、3BKD；NS-PDB：3L4Q)。从中选择保守、相对保守、相对不保守、不保守的氨基酸位点进行突变。在每个蛋白上选择的突变位点分别如表2a)-表2i)所示。
表2a)NP蛋白上被选择的位点及保守性
表2b)PB1蛋白上被选择的位点及保守性：
表2c)PA蛋白上被选择的位点及保守性：
表2d)PB2蛋白上被选择的位点及保守性：
表2e)HA蛋白上被选择的位点及保守性：
表2f)NA蛋白上被选择的位点及保守性：
表2g)NS1蛋白上被选择的位点及保守性：
表2h)M1蛋白上被选择的位点及保守性：
表2i)M2蛋白上被选择的位点及保守性：
(4)定点突变的引物设计以及突变载体构建
发明人针对流感病毒WSN的各个蛋白上选定的突变位点，分别设计能够使编码所述氨基酸的密码子突变为TAG的引物，具体的引物如下所示。
表3 NP蛋白上被选择的位点的突变引物：
表4 PA蛋白上被选择位点的突变引物：
表5 NA蛋白上被选择位点的点突变引物：
表6 HA蛋白上被选择位点的点突变引物：
表7 PB1蛋白上被选择位点的点突变引物：
表8 PB2蛋白上被选择位点的点突变引物：
表9 M1蛋白上被选择位点的点突变引物：
表10 M2蛋白上被选择位点的点突变引物：
表11 NS蛋白上被选择位点的点突变引物：
表12 PA蛋白上被选择位点的突变引物：
表13 NA蛋白上被选择位点的点突变引物：
表14 HA蛋白上被选择位点的点突变引物：
表15 PB1蛋白上被选择位点的点突变引物：
表16 PB2蛋白上被选择位点的点突变引物
表17 M1蛋白上被选择位点的点突变引物：
表18 M2蛋白上被选择位点的点突变引物：
表19 NS蛋白上被选择位点的点突变引物：
以Ben1 pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben3 pPolI-WSN-PA；Ben4 pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS作为模板质粒，利用定点突变试剂盒( Lightning Site-DirectedMutagenesis Kits，Catalog#210518)，按说明书操作将各个蛋白上被选择的位点的氨基酸密码子通过上述引物位点突变为琥珀终止密码子TAG,经测序验证突变成功。
(5)可稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系HEK293-PYL的建立。
构建了分别带有puromycin和hygromycin抗性的2个慢病毒过表达载体，两者分别携带氨酰tRNA合成酶和带有39位TAG突变的报告基因GFP，通过两轮病毒转导HEK-293T细胞和puromycin/hygromycin筛选,得到稳定细胞株pylRS/GFP39TAG。之后,构建了携带12个拷贝数tRNA和zeomycin抗性的bjmu-zeo-12tRNA载体，质粒线性化转染细胞株pylRS/GFP39TAG，后经UAA存在下zeomycin筛选,最后分离出GFP阳性细胞(UAA存在下细胞呈绿色，去除UAA细胞呈无色)，从而得到了表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系HEK293-PYL(图12A)。
a.载体的构建
我们首先构建了分别带有puromycin和hygromycin抗性的2个慢病毒过表达载体，两者分别携带氨酰tRNA合成酶和带有39位TAG突变的报告基因GFP。我们从psd31载体出发，我们先通过BamHI/xbal酶切位点将sv40-puroR基因分别替换成IRES-puroR和IRES-hygroR基因，这样就得到了2个不同抗性的病毒载体psd31-IRES-puroR和psd31-IRES-hygroR。其中，IRES为内部核糖体进入序列(internal ribosome entry site)，IRES序列常用于多顺反子基因表达。例如，在目的基因之后插入IRES序列，后面是选择标记基因，这样转录出来的mRNA就可以同时表达两种蛋白。利用IRES系统过表达目的基因有2个优势：1.目的基因与标记基因共用一个启动子，避免了假阳性的出现；2.IRES翻译效率低于传统翻译起始位点,使得目的基因表达量高于标记基因。所以，我们在IRES位点的前面通过BamHI酶切位点分别引入CMV-pylRS序列和CMV-GFP39TAG序列，就得到了能同时过表达两个目的蛋白的双病毒体系psd31-CMV-pylRS-IRES-puroR/psd31-CMV-GFP39TAG-IRES-hygroR。所用主要引物见表20。
表20.双病毒构建引物
发明人用质粒稳定转染的方法过表达tRNA。为了保证tRNA的表达量，发明人构建得到了载体bjmu-12t-zeo，其序列如SEQ ID NO:1所示。(图12C)。
b.慢病毒的包装和转导
先包装psd31-CMV-pylRS-IRES-puroR病毒，转导HEK293T细胞，puromycin筛选浓度为0.6ug/ml,得到稳定细胞系1号后，再加入psd31-CMV-GFP39TAG-IRES-hygroR病毒，hygromycin筛选浓度为200ug/ml,得到稳定细胞系2号。
c.质粒的稳定转染
发明人通过质粒稳定转染，进行了第三轮筛选，最后得到了稳定表达正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的特殊细胞系，步骤如下：
A.将bjmu-12t-zeo载体酶切线性化后，转染表达pylRS和GFP39TAG蛋白的稳定细胞系2号(10cm培养皿，每皿10ug质粒，转染时不能有抗生素的存在)。
B.转染6小时后换液，加入非天然氨基酸。
C.转染48小时后，观察绿色荧光，换液，加入400ug/ml的zeomycin。
D.每3天换液，直到blank组全部死亡，转染组形成克隆。
E.分离纯化GFP阳性克隆，继续用剂量减半的zeomycin扩大培养，得到12t-zeo稳定细胞系HEK293-PYL。
质粒稳定转染筛选单克隆的要点如下:
A.质粒稳定转染细胞密度很重要，筛选时细胞密度偏稀，易死亡难形成克隆。
B.从单克隆化时开始，就要加大营养，血清和生长因子。
C.单克隆接种到孔中细胞数目很少时，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。可以使用一种特殊的培养液：即细胞汇合度达到80％的时候的旧培养液通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。或者适当增加血清浓度。
D.单克隆消化后，不要加zeomycin和UAA,等细胞贴壁后再加，避免细胞死亡。
(6)定点突变后的流感病毒的拯救
按照正常的拯救流感病毒而方法，将拯救流感病毒所用的12个质粒共转染稳定细胞系，只是用定点突变的质粒替换这12个质粒中相应的质粒。对应于六孔板的每个孔，每种质粒加0.1ug。转染后，观察细胞的病变情况，筛选出可以拯救出病毒并且对非天然氨基酸具有依赖性的突变位点。筛选出的位点根据蛋白及突变的位点进行命名，如点突变引物名称所示。示例说明，将Ben3 pPolI-WSN-PA质粒上使用PA-S1引物进行突变，突变成功后，将该质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben1 pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben4pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA 3(neo)-PB2；Ben10 pcDNA 3(neo)-PB1；Ben11 pcDNA 3(neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染(5)建立的稳定细胞系，从而拯救出在流感病毒PA基金片段的S1位点上引入TAG的突变型流感病毒，命名为PA-S1。
依照同样的方法，可获取其他位点引入TAG的突变型流感病毒，并根据突变位点进行命名。
发明人从上述突变位点中，选择了拯救流感病毒效率高且遗传稳定的位点PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3进行组合，即使用这四种质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben4pPolI-WSN-HA；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA3(neo)-PB2；Ben10 pcDNA 3(neo)-PB1；Ben11 pcDNA 3(neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染(5)建立的稳定细胞系，拯救出在PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3位点同时引入TAG的突变型流感病毒，命名为WSN-RNP-tag。
实施例2：定点突变的流感病毒的表达和纯化
本发明中构建引入TAG的流感病毒拯救质粒在可以稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系进行转录和表达后，在细胞中，从原理上看，利用这套蛋白质翻译系统能够使非天然氨基酸Lys-diazirine或者与Lys-diazirine结构近似的叠氮非天然氨基酸Lys-azido掺入到蛋白中，从而造成在流感病毒被突变位点的定点突变。
下面，发明人对Lys-diazirine和Lys-azido这两种非天然氨基酸的掺入可能性和突变蛋白质的生产性能进行了检测。
(1)非天然氨基酸Lys-diazirine的合成和鉴定
非天然氨基酸Lys-diazirine的化学合成反应式如下。
如上式所示，将原料1(5-羟基-2-戊酮)15mL与液氨40mL在-40℃下搅拌反应5h，之后降温至-60℃，缓慢滴加NH2OSO3H的甲醇溶液，加毕升至室温，反应过夜。滤除沉淀，向上清液中加入三乙胺，冰浴条件下缓慢加入I2，至反应液颜色变深，不再产生气泡为止。反应完全后蒸除溶剂，经乙醚萃取后干燥。蒸除乙醚，剩余液体减 压蒸馏获得25.4g无色粘稠液体产物2。
将上述产物2用吡啶溶解，0℃搅拌下加入11g TsCl，反应过夜。待反应完全后将反应液倒入浓盐酸与冰水的混合液中，乙醚萃取，醚层分别用1N盐酸和1N NaOH洗涤。有机相干燥柱分得到11.8g无色粘稠液体产物3。
将上述产物3用DMF溶解，加入NaN3室温反应隔夜至反应完全，加入大量水，乙醚萃取。蒸除乙醚，剩余产物用THF:水(9:1)混溶，加入三苯基磷，室温反应。反应完后加1N HCl混匀，旋干THF，二氯甲烷把未反应的原料，PPh3和O＝PPh3洗掉，液相加1N NaOH调pH到12，二氯甲烷萃取出4.0g产物4。
将5.2g原料5(Boc-Lys-OMe)与羰基二咪唑反应，制备出5.9g化合物6。之后化合物6与上述产物4(4.0g)偶联得到化合物7，最后经过两步脱保护，将Boc和甲酯脱除，得到目标4.5g产物8，即Lys-diazirine。经谱学验证，结果为：
1H NMR(400MHz,D2O):δ3.10(1H,t,J＝6.3Hz),2.96(4H,m),1.25(10H,m),0.90(3H,s)；13C NMR(100MHz,D2O):183.63,160.66,56.00,39.80,39.30,34.49,30.84,29.20,26.75,23.92,22.43,18.80；HREIMS m/z 308.16937[M+1]+(calcd for C12H22N5NaO3,308.16931)，证明所得到的Lys-diazirine结构正确。
(2)突变流感病毒的非天然氨基酸Lys-diazirine掺入拯救
将实施例1的步骤(6)定点突变后的流感病毒的拯救中获得的突变型流感病毒包装质粒共转染步骤5中的稳定细胞系，6小时候换成新的培养基，培养基中含有1％的FBS、2ug/ml的TPCK-trypsin、1mM的非天然氨基酸Lys-diazirine，并以无非天然氨基酸Lys-diazirine的培养基作为对照。此拯救实验采用的阳性对照为野生型流感病毒WSN，除了拯救病毒的质粒不同之外，其余条件均与突变型流感病毒的拯救条件相同。转染完成后，每天观察细胞的状态，用含非天然氨基酸培养基培养的细胞中出现病变，而不含非天然氨基酸培养基培养的细胞不出现病变的突变体为阳性突变体。而野生型流感病毒无论培养基中有没有非天然氨基酸，均出现病变。
(3)Lys-diazirine突变流感病毒的纯化
1).当步骤2拯救突变型流感病毒的稳定系细胞完全病变时，收集细胞上清，于5000g离心10min，取上清过0.45um的滤膜。
2).使用蔗糖梯度梯度密度离心的方法纯化流感病毒。具体步骤如下：将1)中的病毒液用50ml离心管(高速专用)于105g离心2h，沉淀用1mlPBS重悬。
3).用NTE Buffer(100mM NaCl，10mM Tris-Cl，pH7.4，1mM EDTA)溶解蔗糖，配成20％蔗糖溶液，过0.45um滤膜。
4).将步骤3)的蔗糖加入到50ml或者15ml离心管中，将2)中的PBS重悬液 滴在蔗糖溶液上。11×104g，离心2h。
5).沉淀加约15ml NTE buffer，11×104g，继续离心2h。
6).将步骤5)中的沉淀用PBS重悬。
(4)突变流感病毒的Lys-azido掺入表达及纯化
非天然氨基酸Lys-azido的化学合成反应式如下
如上式所述，将原料1(2-溴乙醇)2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液，加入NaN3 3.12g，60℃油浴加热回流反应20h。冷却至室温，旋蒸除去丙酮，无水乙醚萃取(30mL×8)，无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂得2.62g无色液体产物2。
将2(500mg，5.74mmol)加入到三光气(1.70g，5.74mmol)的THF(10ml)溶液中。0℃搅拌反应8h，溶剂蒸干。剩余物在真空下干燥1h，得到无色油状产物3。
将3溶解在1.5ml的THF中并缓慢加入Boc-Lys-OH(1.7g，6.88mmol)的1M NaOH(20ml)/THF(5ml)的溶液中。0℃搅拌反应12h并逐渐升温到室温。重新将反应液冷却到0℃并用0℃的1M的盐酸溶液将反应液pH值调整至2～3。反应液用EtOAc萃取(30mL×5)，有机层用2×100ml的饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥有机层、过滤、旋蒸除去溶剂得到1.65g无色粘稠液体产物4不用进一步纯化。
将4溶于15mL CH2Cl2中，搅拌下缓慢滴加15mL TFA，室温下反应30min后蒸出溶剂，剩余液体产物用5mL甲醇溶解，加入100mL乙醚，析出大量白色固体沉淀，过滤干燥得到1.38g白色固体终产物5。1H NMR(D2O):δ＝1.22-1.45(m,4H),1.67-1.73(m,2H),2.99(m,2H),3.38(m,2H),3.70(m,1H),4.09(m,2H).13C NMR(D2O):δ＝21.4,28.4,29.6,39.5,53.4,56.2,57.8,116.0(TFA),153.1,162.3(TFA),172.9.HRMS:m/z calcd for C9H17N5O4[M]+:259.1281；found:259.1283，证明得到的Lys-azido结构正确。
除了用Lys-azido替换Lys-diazirine外，其它条件与前述步骤2－3相同，观察引入突变的流感病毒是否引起细胞病变，即可确认突变是否成功，从而得到在相应突变位点引入UAG的突变型流感病毒。
部分的突变型流感病毒的拯救情况作为示例，可见图2.所述结果表明在流感病毒的8个基因片段上均可引入UAG，并且可以拯救出突变型流感病毒。其中，PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3这四个位点拯救突变型流感病毒的效率高，且具有遗传稳定性，是较为理想的突变位点。将这四个位点进行组合，即使用这四种质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben4pPolI-WSN-HA；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA3(neo)-PB2；Ben10 pcDNA 3(neo)-PB1；Ben11 pcDNA 3(neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染(5)建立的稳定细胞系，拯救出在PA-S1、PB1-S4、PB2-S4、NP-S3位点同时引入UAG的突变型流感病毒，命名为WSN-RNP-tag。突变型流感病毒WSN-RNP-tag的拯救效率很高，且产率高，而且具有很高的遗传稳定性。是发明人制备出来的最终突变产物。
5.突变型流感病毒WSN-RNP-tag拯救效率的考察
发明人比较了使用普通哺乳动物细胞293T和稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系拯救突变型流感病毒WSN-RNP-tag的效率。
考察实验分为三组：第一组，使用稳定细胞系HEK293-PYL，同时转染1.2ug可表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的质粒和1.2ug拯救突变型流感病毒的质粒；第二组，使用稳定细胞系，只转染2.4ug拯救突变型流感病毒的质粒；第三组，使用普通293T细胞，同时转染1.2ug可表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的质粒和1.2ug拯救突变型流感病毒的质粒。结果如图11所示，使用稳定细胞系HEK293-PYL拯救流感病毒的效率远远高于使用普通293T细胞。
此外，发明人还考察了制备出的突变型流感病毒WSN-RNP-tag的产量。通过测定相同条件下制备的野生型和突变型病毒的M基因节段的vRNA水平，说明制备出的突变型流感病毒的产量与野生型基本一致(图6)。另外通过测定野生型和突变型WSN-RNP-TAG的病毒的抗原红细胞凝集效价，说明突变型流感病毒和野生型病毒而的抗原红细胞凝集效价是基本一致的(图7)，进一步说明，制备出的突变型流感病毒的产量很高。具体的实验操作可参考qRT-PCR的实验步骤和病毒的抗原红细胞凝集效价测定实验方法。
实施例3.突变型流感病毒WSN-RNP-tag在细胞水平的安全性考察
发明人通过对制备出的突变型流感病毒WSN-RNP-tag进行长期的传代培养，来考察该突变型病毒的突变位点的UAG密码子的稳定性。具体实验：将新制备出的突变型流感病毒WSN-RNP-tag按照1/1000的比例接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，培养基中含有1％FBS、2ug/ml的TPCK-trypsin、1mM非天然氨基酸NAEK，并用无非天然氨基酸NAEK的培养基作为对照。待含有1mM NAEK培养基中的细胞完全病后时，取出上清，过0.45um的滤膜，再按照1/1000的比例接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，同样以无非天然氨基酸NAEK的培养基作为对照。如此重复，进行长期的病毒传代。
由图4可知，经过长期传代，突变型WSN-RNP-tag抑制维持着对非天然氨基酸的依赖性，即只能在含有非天然氨基酸的培养基中才能大量复制，使细胞发生病变。这说明在流感病毒基因中引入的UAG密码子是一直稳定存在的，进而说明所选择的位点在遗传上是稳定的。
不仅如此，发明人还通过噬斑形成实验发现，突变型WSN-RNP-tag即使在非天然氨基酸NAEK存在的条件下，也不能形成噬斑。这也说明了突变型病毒在脱离液体培养基环境时是不能复制的，进一步证明的其安全性。
实施例4.突变型流感病毒WSN-RNP-tag在动物水平的安全性和有效性考察
实验流程可参考图8.具体实施方案如下：
1)将80只小鼠分成8组，每组10只。
2)饲养一天，让小鼠适应环境。
3)第二天，称量小鼠的体重，并从每组小鼠中选择5只，取它们的血清(采血体积在20-40ul即可，防止小鼠失血死亡。采集的血清在-80℃冷冻保存)。
4)饲养两天后(让被采血的动物回复正常状态)，根据组别和病毒液的管号，接种下面相应的病毒液。
接种病毒的方法：麻醉，以滴鼻的方式向小鼠的鼻腔内接种50ul病毒液。半数致死剂量LD50是10000个病毒颗粒/50ul。一倍致死剂量是10*LD50，即相当于105个病毒颗粒/50ul。10倍致死剂量是100*LD50，即相当于106个病毒颗粒/50ul。
第一组接种1号管的病毒液(成分：PBS)；
第二组接种2号管的病毒液(成分：1倍致死剂量的WSN-wild type)；
第三组接种3号管的病毒液(成分：1倍致死剂量的WSN-RNP-tag)；
第四组接种4号管的病毒液(成分：5倍致死剂量的WSN-RNP-tag)；
第五组接种5号管的病毒液(成分：10倍致死剂量的WSN-RNP-tag)；
第六组接种6号管的病毒液(成分：1倍致死剂量的灭活WSN)；
第七组接种7号管的病毒液(成分：5倍致死剂量的灭活WSN)；
第八组接种8号管的病毒液(成分：10倍致死剂量的灭活WSN)；
每组之间防止交叉感染。
5)接种以后的每一天，称量并记录小鼠的体重，并记录小鼠的死亡情况。
6)分别在接种病毒液后的第14天和第21天，再次取那5只小鼠的血清(采血体积在20-40ul即可，采集的血清在-80℃冷冻保存)。
7)在接种病毒液后的第21天，每只小鼠鼻腔内感染新的50ul病毒液，感染剂量为100LD50。
然后继续观察2-3周内，称量并记录小鼠的体重，并记录小鼠的死亡情况。此外，在感染病毒液后的第三天，从每组小鼠中取3只小鼠，取它们的肺组织，研磨匀浆后，收集上清(可置于-80℃冷冻保存)。剩下的小鼠继续观察。
由图9可知，当接种野生型流感病毒时，所有的小鼠体重均明显下降，并在接种后第10天全部死亡。当接种突变型WSN-RNP-TAG或者灭活的流感病毒WSN-positive control时，所有的小鼠体重均没有明显下降，且观察期间所有的小鼠均存活。说明，突变型WSN-RNP-TAG在动物水平具有很好的安全性。
由图10A可知，按照图8的实验方案，取各组小鼠肺组织，通过qRT-PCR的方式检测肺组织中病毒的相对含量。结果说明，当用灭火病毒或者突变型WSN-RNP-TAG对小鼠免疫后，小鼠肺组织中的病毒含量下降，并呈现免疫剂量依赖性。此外，突变型WSN-RNP-TAG的免疫效果优于灭活病毒的免疫效果。
由图10B可知，通过Elisa实验检测免疫前后的各组小鼠体内抗HA抗体的含量。结果说明免疫后14天和免疫后21天小鼠体内的抗体含量均增加，且21天的抗体含量高于14天时的抗体含量。
由图10C可知，按照图8的实验方案，对各组小鼠分别进行免疫之后，用100×LD50的WSN进行攻毒。并进行了小鼠体重和死亡率的考察，发现制备的突变型病毒WSN-RNP-tag可以很好地保护动物不受病毒的感染。并且，1倍剂量的突变型WSN-RNP-tag对小鼠的保护效果甚至和10倍剂量的灭活WSN的保护效果相当。这充分显示了发明人制备的减毒流感疫苗相对于灭活疫苗具有更好的免疫原性优势。
实施例5接种流感病毒疫苗后的小鼠体内抗NA和NP蛋白的抗体含量测定
按照与实施例4接种病毒方法完全一致的方法，用WSN-RNP-tag和灭活的WSN接种小鼠。
使用Elisa方法检测小鼠体内抗NA和NP蛋白的抗体含量。具体来说，将蛋白NA或NP用包被液稀释，30ng/100ul。Elisa专用96孔板用上述稀释液于4℃包被过夜。用Elisa洗涤液洗涤后，用含3％BSA的洗涤液于37℃阻断1h，然后将小鼠血清用0.5％BSA的洗涤液稀释后加入相应的空中，37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。然后加入HRP标记的goat anti-mouse IgG，于37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。用TMB显色液显色5-10min，并用Elisa终止液终止反应。于450nm测OD值。
结果如图13所示，WSN-RNP-tag可以诱导小鼠产生NA特异性抗体，其抗体产生水平高于灭活疫苗，说明发明人所制备的疫苗具有更好的免疫原性。更为重要的是，发明人发明的WSN-RNP-tag还可以诱导小鼠产生针对流感病毒内部蛋白NP的抗体，这有利于为小鼠提供交叉免疫保护。
实施例6WSN-RNP-tag对小鼠肺内病毒特异性抗体IgA的诱导作用
具体实施方案如下：
1)将15只小鼠分成3组，每组5只。
2)饲养一天，让小鼠适应环境。
3)第二天，根据组别和病毒液的管号，接种下面相应的病毒液。
接种病毒的方法：麻醉，以滴鼻的方式向小鼠的鼻腔内接种50ul病毒液。与实施例4中定义相同，半数致死剂量LD50是10000个病毒颗粒/50ul。一倍致死剂量是10*LD50，10倍致死剂量是100*LD50。
第一组接种1号管的病毒液(成分：PBS)；
第二组接种2号管的病毒液(成分：10倍致死剂量的WSN-RNP-tag)；
第三组接种3号管的病毒液(成分：10倍致死剂量的灭活WSN)；
每组之间防止交叉感染。
4)分别在接种病毒液后第21天，取每组小鼠的肺组织，用PBS洗涤，收集洗涤液。
收集的洗涤液可在-80℃冷冻保存。
使用Elisa的方法检测IgA的产生情况。具体来说，将纯化的WSN病毒用包被液稀释，0.5ug/100ul。Elisa专用96孔板用上述稀释液于4℃包被过夜。用Elisa洗涤液洗涤后，用含3％BSA的洗涤液于37℃阻断1h，然后将小鼠血清用0.5％BSA的洗涤液稀释后加入相应的空中，37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。然后加入HRP标记的goat anti-mouse IgA，于37℃孵育1h，弃上清。用洗涤液洗5次。用TMB显色液显色5-10min，并用Elisa终止液终止反应。于450nm测OD值。
结果如图14所示，说明，相对于灭活的WSN，WSN-RNP-tag可以诱导高水平的IgA，这有利于为小鼠提供交叉免疫保护。
实施例7WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量变化
试验方法：小鼠免疫三周后，取小鼠肺组织，分离其中的T淋巴细胞。将T淋巴细胞用anti-mouse CD8a-APC抗体和流感NP366-374-tetramer-PE染色。通过细胞流式实验测流感特异性CD8+T细胞的数量(比例)，具体操作可参考文献Budimir,N.etal.Heterosubtypic cross-protection induced by whole inactivated influenzavirus vaccine in mice:influence of the route of vaccineadministration.Influenza Other Respir Viruses 7,1202-1209(2013)。
结果如图15所示，说明，灭活的WSN几乎不能影响NP特异性的CD8+T细胞的含量，而WSN-RNP-tag免疫后的小鼠肺内NP特异性的CD8+T细胞的含量明显增加，这有利于为小鼠提供交叉免疫保护。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (20)

1.定点突变的流感病毒，其特征在于将选自流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M中的至少一个蛋白的至少一个位点的氨基酸突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自：
所示的Lys-diazirine，
所示的Lys-azido，或
其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种。
2.如权利要求1所述的定点突变的流感病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第N位的Lys-diazirine，其在流感病毒蛋白中的连接方式如下式所示：
其中，由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第N位可以是流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M中的任意一位，相应地，R1为第1至第N-1位氨基酸残基，R2为第N+1位至C末端的氨基酸残基，
R3为
3.如权利要求1所述的定点突变的流感病毒，其中所述的非天然氨基酸是位于第N位的Lys-azido，其在流感病毒蛋白中的连接方式如下式所示：
其中，由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，第N位可以是流感病毒的PA、PB1、PB2、NP、NA、HA、NS或M中的任意一位，相应地，R1为第1至第N-1位氨基酸残基，R2为第N+1位至C末端的氨基酸残基，
R4为
4.权利要求1－3中任一项的定点突变的流感病毒，其经过修饰，或者包含数个突变位点的组合。
5.如权利要求4所述的定点突变的流感病毒，其是将PA上的R266、PB1上的R52、PB2上的K33、NP上的D101四个位点进行了组合突变。
6.如权利要求1-5中任一项所述的突变的流感病毒，其特征在于，
未经突变的PB2的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的PB1的氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的PA的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的HA的氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的NP的氨基酸序列与SEQ ID NO:6所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的NA的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的核酸编码的氨基酸序列相同，
未经突变的M的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的核酸编码的氨基酸序列相同，或
未经突变的NS的氨基酸序列与SEQ ID NO:9所示的核酸编码的氨基酸序列相同。
7.根据权利要求5所述的定点突变的流感病毒，其是WSN-RNP-TAG。
8.一种编码如权利要求1-7中任一项所述的突变的流感病毒或其经突变的蛋白的核酸分子，其特征在于在终止密码子之外，还包含密码子UAG。
9.核酸载体，其可拯救权利要求1-7中任一项所述的突变型流感病毒。
10.制备权利要求1-7中任一项所述的定点突变病毒的方法，包括步骤：
(1)选择步骤：在病毒不同蛋白中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；
(2)基因突变：将编码对应于(1)中选择的位点的病毒蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG；
(3)表达载体构建：将(2)得到的突变的病毒蛋白的编码核酸与合适的载体可操作地连接，得到突变核酸表达载体；
(4)获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从中国专利号201210214451.6中公开的、保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒；
(5)包装病毒：将(3)得到的突变核酸表达载体与(4)的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养；或者将(3)得到的表达载体转染可稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系，优选HEK293-PYL，保藏日为2015年11月17日、保藏号为CGMCC No：11592，将转染成功后的稳定系细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养；
(6)当包装出的野生型病毒使(5)中的宿主细胞完全病变后，收集上清，离心并过0.45um滤膜去除细胞碎片，对包装产物进行非天然氨基酸依赖性的检测，保留维持着非天然氨基酸依赖性的突变体设定为定点突变成功候选物。
11.权利要求10的定点突变病毒的方法，其在步骤(6)之后还包括：
(7)将(6)中定点突变成功的候选物的突变位点进行组合，再次包装病毒，使得包装出的病毒在多个基因片段上均引入了UAG，在对应的多个蛋白上均引入了非天然氨基酸，然后再次考察包装产物对非天然氨基酸的依赖性，保留经过长期传代仍旧维持着对非天然氨基酸依赖性的组合突变体设定为最优的定点突变成功候选物。
12.权利要求11的定点突变病毒的方法，其中在步骤(7)之后还进一步包括：
(8)培养最优定点突变成功候选物，并进行产物纯化；和
(9)对(8)中获得的突变型病毒进行安全性或免疫原性检测，相比野生型病毒，安全的病毒为突变成功的病毒。
13.使用权利要求10-12中任一项的方法制备的含有定点突变的流感病毒。
14.使用权利要求10-12中任一项的方法制备的含有定点突变的流感病毒，其是H5N1、H3N2或B型流感病毒。
15.含有有效量的权利要求1-7或权利要求13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒的组合物。
16.含有有效量的权利要求1-7或权利要求13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒的疫苗。
17.药物组合物，其中含有有效量的权利要求1-7或权利要求13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒，以及药学上可以接受的赋形剂。
18.权利要求1-7或权利要求13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒在制备减毒活疫苗、制备预防和治疗流感病毒感染相关药物中的用途。
19.权利要求1-7或权利要求13-14中任一项所述的定点突变的流感病毒在预防和治疗流感病毒感染中的用途。
20.权利要求10所述的可稳定表达tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(tRNAPyl)的哺乳动物稳定细胞系，其为HEK293-PYL，保藏日为2015年11月17日、其保藏号为CGMCC No：11592。
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