CN106867515B - 一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用。本探针通过4‑溴‑1,8‑萘酐与叠氮化钠、九水硫化钠、乙酰氯、二乙胺等反应得到,其结构为：其中R为探针1：或探针2：

Description

一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用
技术领域
本发明涉及一种用于蛋白标记的新型荧光探针的合成方法及应用。
背景技术
随着分子生物学，分析化学以及有机化学的逐步发展，研究工作者对蛋白功能及结构的研究，含量的检测，实时的追踪的需求极为迫切。因而，有机小分子荧光探针作为一种重要的蛋白标记手段逐渐被广泛应用于蛋白的监测。近年来，有机小分子荧光探针对蛋白的标记主要通过共价键(双砷-四半胱氨酸体系、SNAP-tag、Halo-tag等)，非共价键(氢键，金属配位等)以及基因工程(非天然氨基酸等)等对目标蛋白进行修饰而达到荧光标记的效果。
SNAP-tag蛋白是对由207个氨基酸组成的DNA修复蛋白酶(O6-鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，hAGT)进行突变改造而获得的。其中作为反应位点的半胱氨酸能够与O6修饰的苯甲基鸟嘌呤进行亲核反应。脱去鸟嘌呤后，半胱氨酸能够与苄基形成稳定的硫醚键，从而以共价键形式达到与荧光底物高特异性的结合。因此，通过有机合成手段可以将多种多样的有机小分子荧光探针引入苄基端，从而达到荧光探针与SNAP-tag蛋白的特异性结合。
有机小分子荧光探针作为蛋白的标记和检测手段的实例以屡见不鲜，但是在诸多荧光探针中其主要表现为与蛋白结合后出现荧光增强并伴有荧光的蓝移，这种探针容易受到设备、样品等外界因素影响。比率型的荧光探针能很好地克服这类缺点，但是成功用于蛋白标记与检测的却较为少见。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类用于蛋白标记的荧光探针的生物应用，该探针能够与SNAP-tag蛋白特异性结合并呈现出长波～550nm处的荧光增强。
本发明的另一目的是提供一类用于蛋白标记的荧光探针的合成方法，该方法具有操作方便、原料廉价、提纯简单等优点。
本发明提供一种用于荧光标记的荧光探针，以4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，荧光探针能够特异性与SNAP蛋白结合并呈现～8倍荧光增强，其在～550nm处荧光强度比例明显增加。
该荧光探针具有如下结构：
其中R为R1：或R2：中的一种或二种；当R为R1时，探针为探针1，当R为R2时，探针为探针2，结构为：
用于蛋白标记及检测的荧光探针合成路线，如下：
具体合成步骤如下：
(1)中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：
将4-溴-1,8-萘酐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成反应液。叠氮化钠溶于水中，滴加至反应液，加热至90-100℃，持续4-8h，冷却，倒入200-300mL冰水中抽滤，得4-叠氮基-1,8-萘酐。
(2)中间体4-氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-叠氮基-1,8-萘酐置于乙腈中，并加入九水硫化钠。加热至50-70℃，持续8-20h，冷却，倒入200-300mL冰水中，抽滤得4-氨基-1,8-萘酐。
(3)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下加入氯乙酰氯。室温搅拌过夜(10-16h)，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐。
(4)中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入二乙胺。加热至50-70℃，2-4h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1-20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐。
(5)当R为R1时，合成探针1：
将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入正丁胺。加热至80-90℃，3-6h，减压除去溶剂，得探针1；
或，当R为R2时，合成探针2：
将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤。加热至80-90℃，3-6h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1-10:1为洗脱剂，减压除去溶剂得探针2。
步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、叠氮化钠,其质量比例为2:10:1-2:30:1。步骤(2)中，4-叠氮基-1,8-萘酐、乙腈、九水硫化钠，其质量比为1:50:3-1:100:8。
步骤(3)中，4-氨基-1,8-萘酐、四氢呋喃、氯乙酰氯，其质量比为5:80:1-5:160:2。所述硅胶柱分离,以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐。
步骤(4)中，4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙腈、二乙胺，其质量比为2:80:1-2:160:1.5。所述硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1-20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐。。
步骤(5)中，4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、正丁胺，其质量比为1:200:1-1:800:3；4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤,其质量比为1:200:1.5-1:800:3；所述硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1-10:1为洗脱剂，减压除去溶剂得探针2。。
上述的用于蛋白标记及检测的荧光探针在SNAP蛋白标记与检测及在生物荧光成像中可以应用。
本发明具有以下特征：
该类探针拥有合成原料低价、方法简单易操作、易纯化等优点。
该类探针在水溶液中呈现出～470nm的蓝色荧光，在乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺等极性溶剂中呈现出525-560nm的绿色到黄色荧光。在水溶液与不同有机极性溶剂混合液中，随着有机极性溶剂的增加～470nm处荧光逐渐减弱而～550nm处的荧光逐渐增强。
该类探针能成功用于荧光标记，探针2与SNAP-tag蛋白特异性结合之后，～550nm处荧光比例明显增加，通过这种比率的变化，可以排除其他因素的干扰，达到更精准的定位SNAP-tag蛋白。
该类探针可以通过SNAP-tag技术，引入到目标蛋白中，对目标蛋白进行更精准的监测。其可应用于生物 荧光成像等领域。
附图说明
图1该类荧光探针合成路线图。
图2实施例1制备的该荧光探针1核磁谱图氢谱。
图3实施例1制备的该荧光探针1核磁谱图碳谱。
图4实施例1制备的该荧光探针2核磁谱图氢谱
图5为实施例1制备的探针1在不同溶剂中的荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图6为实施例1制备的探针1在不同溶剂中的紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。
图7为实施例1制备的探针1在水与二甲基亚砜不同比例(水：二甲基亚砜＝10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9,0:10)下荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图8实施例1制备的探针2与10μMSNAP-tag蛋白结合前后荧光谱图。
图9实施例1制备的探针2与10μMSNAP-tag蛋白结合前后归一化荧光谱图。
具体实施方式
实施例1：定位于溶酶体的H2S荧光探针的合成方法。
中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：
将4-溴-1,8-萘酐(2.0g，7.2mmol)置于100mL单口瓶中，加入20mL N,N-二甲基甲酰胺。将叠氮化钠(1.4g，21.6mmol)溶于3mL水中并滴加至反应液，加热至100℃，持续6h，冷却，倒入冰水中抽滤，真空干燥得深黄色固体1.6g，产率93％。
中间体4-氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-叠氮基-1,8-萘酐(1.5g，6.3mmol)溶于100mL乙腈中，并加入九水硫化钠(6.0g，37.8mmol)。加热至60℃，持续10h，冷却，倒入冰水中，抽滤，真空干燥得到黄色固体1.1g，产率80％。
中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-氨基-1,8-萘酐(1.0g，4.7mmol)置于60mL四氢呋喃中，并在冰浴下加入0.5mL氯乙酰氯。室温搅拌过夜，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体1.0g，产率76％。
中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐(500mg,1.7mmol)置于50mL乙腈中，搅拌下加入356μL二乙胺。将反应液加热至50℃，持续2h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得淡黄色固体293mg，产率52％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.91(s,1H),8.84(d,J＝8.3Hz,1H),8.67(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.64(d,J＝8.3Hz,1H),8.26(d,J＝8.4Hz,1H),7.87(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H),3.36(s,2H),2.81(q,J＝7.1Hz,4H),1.20(t,J＝7.1Hz,6H)。
探针1的合成：
将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐(50mg，0.15mmol)溶于20mL乙醇中，搅拌下加入50μL正丁胺。加热至85℃，持续6h，减压除去溶剂，得淡黄色固体49mg，产率85％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ10.71(s,1H),8.70(d,J＝8.2Hz,1H),8.60(d,J＝7.2Hz,1H),8.56(d,J＝8.2Hz,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(t,J＝7.9Hz,1H),4.16(t,J＝8.2Hz,2H),3.34(s,2H),2.81(q,J＝7.0Hz,4H),1.78–1.65(m,2H),1.45(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ170.49,164.09,163.55,138.58,132.70,130.94,128.88,126.63,125.44,123.50,122.84,117.87,116.59,58.64,49.00,40.18,30.20,20.38,13.82,12.64。
探针2的合成：
将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐(50mg，0.15mmol)溶于20mL乙醇中，搅拌下加入2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤(83mg,0.30mmol)。将反应液加热至85℃，持续6h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝20:1-10:1为洗脱剂，减压除去溶剂得淡黄色固体65mg，产率75％。1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.60(d,J＝7.2Hz,1H),8.56(d,J＝8.3Hz,1H),8.47(d,J＝8.2Hz,1H),8.37(d,J＝8.6Hz,1H),7.90–7.79(m,2H),7.49(s,4H),5.52(s,2H),5.35(s,2H),3.54(s,2H),2.90(d,J＝6.9Hz,4H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H).
将该探针，包括探针1和探针2，溶于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化。
实施例2：探针1在水、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的荧光性质。每次取20μL荧光探针母液，分别加入4mL水、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光光谱的测试。
图5中荧光探针浓度为10μM，探针1在水、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的荧光性质。探针1在水中呈现470nm左右的荧光，而在乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中呈现～550nm左右的荧光，激发光为370nm。
实施例3：探针1在水、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的紫外吸收。每次取20μL荧光探针母液，分别加入4mL水、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行紫外吸收光谱的测试。
图6中荧光探针浓度为10μM，探针1在水、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的紫外吸收。探针1在水中的吸收出现～355nm左右，而乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜的吸收在～370nm左右。
实施例4：探针1在水与二甲基亚砜不同比例下荧光性质。每次取20μL荧光探针1母液，分别加入4mL水与二甲基亚砜不同比例的测试液中(水：二甲基亚砜＝10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9,0:10),并进行荧光光谱的测试
图7中荧光探针浓度为10μM，探针1在水中呈现～470nm左右的荧光，随着二甲基亚砜的含量增加～550nm左右的荧光逐渐增强，激发光为405nm。
实施例5：探针2与SNAP-tag蛋白结合后荧光前后变化。取200μL探针母液2溶于5mL20μM SNAP-tag蛋白母液，37℃下搅拌3h，凝胶柱分离，以PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4)为洗脱剂，并将探针浓度稀释至10μM，进行荧光光谱测试。
图8中10μM探针2与SNAP-tag蛋白结合后，探针荧光明显增强(～8倍)且～550nm荧光比例明显增加，激发光为370nm。
图9为10μM探针2与SNAP-tag蛋白结合后，荧光强度前后归一化结果，～550nm的荧光比例明显增加，I466nm/I542nm在未结合蛋白之前为3.65，而结合SNAP-tag蛋白之后为2.11。

Claims (8)

1.一种用于蛋白标记及检测的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构如下：
2.一种如权利要求1所述的用于蛋白标记及检测的荧光探针的合成方法，其特征在于包含步骤如下：
(1)中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：
将4-溴-1,8-萘酐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成反应液，叠氮化钠溶于水中，滴加至反应液，加热至90-100℃，持续4-8h，冷却，倒入200-300mL冰水中抽滤，得4-叠氮基-1,8-萘酐；
(2)中间体4-氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-叠氮基-1,8-萘酐置于乙腈中，并加入九水硫化钠，加热至50-70℃，持续8-20h，冷却，倒入200-300mL冰水中，抽滤得4-氨基-1,8-萘酐；
(3)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下加入氯乙酰氯，室温搅拌10-16h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐；
(4)中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：
将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入二乙胺，加热至50-70℃，2-4h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1-20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐；
(5)将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤，加热至80-90℃，3-6h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1-10:1为洗脱剂，减压除去溶剂得探针。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、叠氮化钠,其质量比例为2:10:1-2:30:1。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，4-叠氮基-1,8-萘酐、乙腈、九水硫化钠，其质量比为1:50:3-1:100:8。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，4-氨基-1,8-萘酐、四氢呋喃、氯乙酰氯，其质量比为5:80:1-5:160:2，所述硅胶柱分离,以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙腈、二乙胺，其质量比为2:80:1-2:160:1.5，所述硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1-20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤,其质量比为1:200:1.5-1:800:3；所述硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1-10:1为洗脱剂，减压除去溶剂得探针。
8.一种如权利要求 1 所述的用于蛋白标记及检测的荧光探针在SNAP蛋白标记与检测及在生物荧光成像中的应用,所述应用不包含在疾病诊断和疾病治疗中的应用。
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