CN104777301A - 具有抗流感活性的扎那米韦膦酸酯同类物及流感病毒的奥司他韦易感性的测定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测耐药病原菌和治疗其感染的方法和组合物。还提供了用于利用非奥司他韦流感病毒神经氨酸酶抑制剂和羧酸奥司他韦通过竞争性结合分析来检测奥司他韦耐药性流感病毒的方法。本发明公开了偶联至传感器且用于本发明方法中的流感病毒神经氨酸酶抑制剂。还公开了作为对抗H1N1、H5N1和H3N2病毒的野生型和奥司他韦耐药性的流感病毒的神经氨酸酶抑制剂的新型膦酸酯化合物。本发明还提供了通过唾液酸制备这些膦酸酯化合物的对映选择性合成途径。

Description

具有抗流感活性的扎那米韦膦酸酯同类物及流感病毒的奥司他韦易感性的测定

本申请是申请日为2011年5月10日、申请号为201180034218.3、发明名称为“具有抗流感活性的扎那米韦膦酸酯同类物及流感病毒的奥司他韦易感性的测定”的申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请为2011年5月10日提交的序号为PCT/US2011/035982的国际专利申请根据第371节在国家阶段提交并要求2010年5月10日提交的序号为61/333,137且题为“测定流感病毒的奥司他韦易感性的组合物和方法”的美国临时专利申请的优先权，其内容通过引入整体并入本文。

序列

本申请包括序列表。ASCII文本文件(创建于2011年7月26日，名为SEQLIST_ASN51301US_ST25.txt，大小为714字节)的整体内容通过引入整体并入本文。

技术领域

本发明涉及有效对抗流感病毒的新型化合物。本发明涉及抑制来自H1N1、H5N1和H3N2流感病毒的野生型和奥司他韦耐药性病毒株的流感病毒的神经氨酸酶的新型膦酸酯化合物。本发明涉及抗药病原体的检测。具体地，本发明涉及奥司他韦耐药性流感病毒的检测。更具体地，本发明涉及使用本发明公开的新型化合物检测奥司他韦耐药性流感病毒。

背景技术

甲型流感病毒的爆发持续引起世界范围内广泛的发病率和死亡率。仅在美国，每年估计5-20％的人群感染甲型流感病毒，导致约200,000人住院治疗和36,000人死亡。制定全面的接种疫苗政策已成为降低流感发病率的有效措施。然而，病毒的频繁遗传漂变需要每年都进行疫苗的重配制，从而很可能导致接种疫苗中的病毒株与传播中的病毒不匹配。

甲型流感病毒由9种结构蛋白组成并且编码具有调节功能的另外两种非结构NS1蛋白。病毒基因组的节段性质形成了在不同病毒株对细胞的交叉感染过程中发生基因重配(基因组节段交换)的机制。根据其表面显示的不同红细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)病毒蛋白，将甲型流感病毒分成不同亚型。甲型流感病毒亚型通过两种病毒表面糖蛋白，红细胞凝集素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)来鉴定。每组流感病毒亚型均通过其H和N蛋白组合来鉴定。有16种已知的HA亚型和9种已知的NA亚型。

流感病毒是可感染包括人在内的很多动物种类的负链RNA片段病毒(negative sense segmented RNA virus)。流感基因组通过病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶的复制是在所有时间都产生具有不同基因序列的子代的易出错过程。基因改变的活病毒被称为“抗原性漂变的”突变体。病毒基因组的节段性质和感染不同动物种类的可能性可产生“抗原性漂变的”突变体(P.K.Cheng等人,Emerg.Infect.Dis.15,966(2009))。在期望的条件下，显性变异体可能成为针对人或动物的突出病原菌。还不能完全了解导致突变体进化的多步骤筛选方法(L.Cohen-Daniel等人,J.Clin.Virol.44,138(2009)；R.Wagner,M.Matrosovich,H.D.Klenk,Rev.Med.Virol.12,159(2002))。然而，疫苗常被用于预防流感病毒感染，治疗流感感染的最有用疗法包括施用(奥司他韦乙酯的磷酸盐，Roche Laboratories,Inc.)和(扎那米韦，GlaxoWellcome,Inc.)(N.J.Cox,J.M.Hughes,N.Engl.J.Med.341,1387(1999))。奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)是防止子代病毒粒子在粘液分泌内的释放和散播并由此降低病毒感染性的病毒唾液酸酶(神经氨酸酶)抑制剂。作为在流感病毒表面表达的糖蛋白，神经氨酸酶(NA)对病毒复制和通过断裂宿主细胞的表面唾液酸受体(sialo-receptor)与子代病毒之间的键而产生的感染性至关重要。因此，基于结构的策略来抑制NA已应用于开发抗流感药。

扎那米韦(Relenza^TM)(von Itzstein,M.等人,Nature 1993,363,418.Dunn,C.J.；Goa,K.L.Drugs 1999,58,761.)是治疗流感的流行药。克流感(Tamiflu)是前药，该前药易于被肝酯酶水解产生相应的作为活性抑制剂的羧酸奥司他韦而与病毒的神经氨酸酶(NA)活性位点内的3个精氨酸残基相互作用(Arg118、Arg292和Arg371)(von Itzstein,M.等人,Nature 1993,363,418.Lew,W.等人,Curr.Med.Chem.2000,7,663.Russell,R.J.等人,Nature 2006,443,45.)。奥司他韦和扎那米韦均通过断裂宿主细胞的表面涎蛋白受体与子代病毒之间的键来抑制对病毒繁殖很重要的流感病毒NA。NA抑制剂设计为具有(氧杂)环己烯支架以模拟唾液酸(N-乙酰神经氨酸，其为用于与病毒NA的活性位点结合的细胞表面糖蛋白的最外糖)酶促裂解的氧鎓过渡态。为适应与羧酸奥司他韦结合，需要生成大疏水袋的NA的诱导装配，用于3-戊基侧链(Collins,P.J.,等人,Nature 2008,453,1258.)。相比之下，扎那米韦对新进化的耐药性病毒没有奥司他韦磷酸盐那样易感。由于不需要生成疏水性结合袋，扎那米韦对NA突变体(例如，临床相关的H274Y突变体)的抑制能力不变。

甲型流感(H1N1)病毒具有奥司他韦耐药性，这归功于神经氨酸酶(NA)蛋白274位组氨酸变为酪氨酸(H274Y)的氨基酸变化。2008年汹涌而来的季节性H1N1中的奥司他韦耐药性H274Y突变体(A.Moscona,N.Engl.J.Med.360,953(2009))令人困惑，因为这些突变的增长在很多H274Y流行地区与奥司他韦的使用无关(J.Mossong等人,Antiviral Res.84,91(2009)；M.Jonges等人,Antiviral Res.83,290(2009))。此外，在患者中报导了H274Y奥司他韦耐药性的全国流行性H1N1(A.Gulland,Br.Med.J.339,b4975(2009))和H5N1突变体(Q.M.Le等人,Nature 437,1108(2005))，这表明这些突变体会影响流感疗法的选择(I.Stephenson等人,Clin.Infect.Dis.48,389(2009))。

[]通过修饰甘油基部分支架以模拟唾液酸酶裂解中的氧鎓过渡态，已经制备了很多扎那米韦衍生物。膦酸酯基团通常在药物设计中用作羧酸盐的生物电子等排体(White,C.L.等人,J.Mol.Biol.1995,245,623.Schug,K.A.；Lindner,W.Chem.Rev.2005,105,67.Streicher,H.；Busseb,H.Bioorg.Med.Chem.2006,14,1047.)。相比于羧酸盐-胍盐离子对，膦酸根离子会显示与胍盐离子更强的静电作用。因此，期望扎那米韦膦酸酯同类物可更强地对抗H1N1和H5N1病毒甚至H274Y突变体的神经氨酸酶。亲合力的增强可归功于生理条件下膦酸酯基团与3个精氨酸残基(Arg118、Arg292和Arg371)之间的强静电作用。

溶液相的神经氨酸酶抑制测定通常使用荧光底物2'-(4-甲基伞形酮基)-α-D-乙酰基-神经氨酸，其被神经氨酸酶裂解而获得可使用荧光计定量的荧光产物(Potier等人,Anal.Biochem.94:287-296(1979))，然而，该测定法不适于高通量模式。此外，由于抗病毒株的快速出现(参见，McKimm-Breschkin,J.L.Antiviral Res.2000,47,1-17)，仍需要寻找新型流感病毒的神经氨酸酶抑制剂。

发明内容

2008年奥司他韦耐药性H1N1流感病毒的世界范围的涌现推动了对耐药性突变体的研究和对研发快速测试奥司他韦易感性的需求。在潜在流行奥司他韦耐药性H1N1病毒期间，需要用于快速评估就诊患者样本的奥司他韦易感性的“即时检验”(point-of-care)测试法，这将有益于治疗方案的确定。

本文记载了新型膦酸酯化合物。所述化合物作为神经氨酸酶抑制剂具有对抗H1N1、H5N1和H3N2流感病毒的野生型和奥司他韦耐药性病毒株的活性。在一些实施方案中，奥司他韦耐药性流感病毒株在神经氨酸酶中含有H274Y突变。本公开内容还提供了通过唾液酸生成新型膦酸酯化合物的对映选择性合成途径。

根据本公开内容的特点，公开了根据式(I)的化合物，

其中，A是PO(OR)(OR⁵)，其中，R和R⁵独立地选自H、C1-C10烷基、芳基、芳烷基和X，其中，X是阳性抗衡离子(cationic counterion)，其选自由以下组成的组：铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵(ethanol-ammonium)、二环己铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、钙阳离子和锌阳离子，其中，B是NHR⁶、NH₃ ⁺Y^–、R⁶N(C＝NH)NH₂或R⁶N(C＝NH₂ ⁺)NH₂Y^–，其中，R⁶表示氢、C1-C10烷基、芳基、或芳烷基，其中，Y^–是阴性抗衡离子(anioniccounterion)，其选自由以下组成的组：氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根离子、三氟乙酸根离子、磷酸根离子、二磷酸根离子、硝酸根离子、硫酸根离子、苯磺酸根离子、苯甲酸根离子、水杨酸根离子、羟萘酸根离子、延胡索酸根离子、马来酸根离子、乳酸根离子、苹果酸根离子、琥珀酸根离子、酒石酸根离子、柠檬酸根离子、谷氨酸根离子、葡糖酸根离子和硬脂酸根离子，其中，R¹是CH₃或CF₃；其中，R²是H、C1-C10烷基或O＝C-NHR⁷，其中，R⁷表示附有功能性部分的连接部，如生物素、荧光团和抗炎剂，和其中，R³和R⁴独立地是氢、C1-C10烷基或O＝C-R⁸，其中R⁸表示C1-C10烷基、芳基、或芳烷基。

公开的组合物包括治疗有效量的式(I)化合物和药学上可接受的赋形剂，其中，所述组合物设计为给予生物体以抑制流感病毒神经氨酸酶的活性。

根据本发明的特点，公开的组合物包括治疗有效量的以下化合物中的至少一种：

或以下化合物中的至少一种：

或以下化合物中的至少一种：

根据本发明的特点，公开一种制备式(I)组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)乙酰化手性前体唾液酸(2)以制备中间体化合物(3)

(b)用二乙基三甲基甲硅烷基亚磷酸盐处理中间体化合物(3)以形成中间体化合物(4)：

(c)用N-溴代琥珀酰亚胺在光照射下处理中间体(4)以获得溴取代的化合物，其在吡啶中形成中间体(5)：

(d)用三甲基甲硅烷基三氟磺酸盐处理中间体化合物(5)以形成中间体化合物(6)：

(e)用叠氮基三甲基硅烷处理中间体化合物(6)以形成中间体化合物(7)：

在一些实施方案中，所述方法进一步包括按顺序用溴代三甲基硅烷、甲醇钠处理中间体化合物(7)，然后将其氢化以形成化合物(1a)：

在一些实施方案中，所述方法进一步包括用乙醇钠处理中间体化合物(7)，然后将其氢化以形成化合物(1c)：

在一些实施方案中，所述方法进一步包括氢化中间体化合物(7)，然后使其与1,3-双(叔丁氧基羰基)-2-甲基异硫脲(1,3-bis(tert-butoxycarbonyl)-2-methyl)和Et3N反应以形成中间体化合物(8)：

在一些实施方案中，所述方法进一步包括用溴代三甲基硅烷，然后用甲醇钠处理中间体化合物(8)，以形成化合物(1b)：

在一些实施方案中，所述方法进一步包括用乙醇钠，然后用三氟乙酸处理中间体化合物(8)以形成化合物(1d)的步骤：

在本发明的一个方面中涉及通过本文公开的方法所生产的式(I)的任何产物。

根据本公开内容的特点，公开了用于治疗流感感染的方法，所述方法包括给需要的受试者提供治疗有效量的根据式(I)的组合物。

根据本发明的某些方面，根据式(I)的化合物是以下化合物中的至少一种：

本发明的另一个实施方案提供抑制神经氨酸酶活性的方法，所述方法包括使所述神经氨酸酶与任何一种化合物(I)接触。在一个方面，神经氨酸酶是流感神经氨酸酶且其活性在体内受抑制。在另一个方面，其活性在体外受抑制。

本发明涉及通过测量药物与其竞争性抑制剂与病原菌的结合来测定病原菌的药物易感性。

本发明涉及一种用于测定奥司他韦耐药性流感病毒的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供疑似包括奥司他韦耐药性流感病毒或病毒颗粒的样品；(b)在存在和不存在羧酸奥司他韦(OC)的情况下，使所述样品与含有流感神经氨酸酶识别单位(R)的结合分子接触；和(c)测定在存在和不存在奥司他韦的情况下，结合分子所述流感病毒或病毒颗粒在结合上的差别。其中，相比于接触奥司他韦敏感型流感病毒对照时结合水平降低，在奥司他韦存在下未出现由识别单位(R)导致的结合水平的降低表明所述样品中存在奥司他韦耐药性流感病毒。识别单位与流感病毒的结合受同时发生的与羧酸奥司他韦的结合的竞争性抑制。

在一些实施方案中，所述奥司他韦耐药性流感包括在流感的神经氨酸酶(NA)蛋白的氨基酸位点274的突变。在一些实施方案中，突变是H274Y。

在一些方面，含流感病毒样品选自由粘液、唾液、呼吸分泌物、洗喉液、洗鼻液、脊髓液、痰、尿、精液、汗、粪、血浆、血、支气管肺泡液、阴道液、泪液和组织活检构成的组。在一些实施方案中，流感病毒从细胞培养物中获得。在一些实施方案中，细胞培养物是Vero细胞培养物。在一些实施方案中，含流感病毒样品是感染流感病毒的细胞。

在一些方面中，含流感病毒样品固定于固体底物上。固体底物可选自由微孔、微滴定板、硅片、载玻片、珠粒、微粒、薄膜、色谱纸、膜、瓶、盘(dishes)、片(slides)、印迹材料(blotting material)、过滤器、纤维物质、纺织纤维(woven fibers)、塑形聚合物、颗粒、浸量尺(dip-sticks)、试管、芯片、微芯片、Langmuir Blodgett膜、玻璃、锗、硅、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、砷化镓、磷化镓、二氧化硅、氮化硅，和它们的组合构成的组。在一些实施方案中，流感病毒或病毒颗粒通过碳水化合物受体结合到流感病毒的红细胞凝集素组分固定化于固体底物上。

在一些方面中，流感病毒或病毒颗粒固定化至固体底物不改变结合分子或羧酸奥司他韦与流感病毒的神经氨酸酶或其颗粒组分的结合。

[]在一些实施方案中，识别单位(R)选自扎那米韦、或零流感(tamiphosphor)胍单酯、或磷杂扎那米韦(phosphazanamivir)或其单酯、和它们的盐、酯和衍生物。在一些实施方案中，识别单位(R)偶联至可检测的传感单元(S)。在一些实施方案中，识别单位(R)通过连接部(L)偶联至所述传感单元，以使结合分子具有R-L-S结构。在一些实施方案中，连接部(L)降低了识别单位结合到流感病毒对传感单元(S)检测的效应。

连接部(L)可选自脂肪族链、三唑、水溶性连接部和乙二醇连接部。

在一些方面中，传感单元是直接或间接可检测的。在一些实施方案中，传感单元通过链霉亲和素-生物素(streptavidin-biotin)的相互作用偶联至可检测的部分。

在一些方面中，传感单元是可检测的部分，其选自荧光标记、金标记、酶标记、放射性标记、量子点标记和蛋白标记。在一些实施方案中，可检测的部分通过选自发光的、色度的、荧光计的、或放射性信号的信号来检测。

在一些实施方案中，荧光标记选自由以下组成的组：荧光素、BODIPY、Alexa Fluor、Cy3、Cy5、Oregon Green、四甲基若丹明、若丹明红、德克萨斯红、吡啶基噁唑、苯并噁二唑衍生物、NBD卤化物、碘代乙酰胺类、SBD；莹黄、碘代乙酰胺；芪、香豆素、萘、氮丙啶、dapoxyl、芘、bimanes、呫吨、花青、芘、酞菁染料、藻胆蛋白、方酸菁染料、能量转移染料组合，和它们的衍生物。

在一些实施方案中，生物素传感单元可通过荧光标记的链霉亲和素来检测。在一些实施方案中，荧光传感单元选自异硫氰酸荧光素(FITC)、Alexa染料和量子点。在一些实施方案中，生物素传感单元可通过链霉亲和素结合酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或辣根过氧化物酶检测。在一些实施方案中，零流感胍单酯是其铵盐。在一些实施方案中，磷杂扎那米韦是其铵盐。

本公开内容涉及与流感病毒的神经氨酸酶或其颗粒结合的化合物，其中，所述结合受羧酸奥司他韦(OC)竞争性抑制，所述化合物包括式R-L-S，其中：R选自扎那米韦、或零流感胍单酯、或磷杂扎那米韦或其单酯、和它们的盐、酯和衍生物；L是任选的，且选自三唑连接部(triazole linker)、脂肪族连接部、或乙二醇连接部；且S选自(a)通过选自荧光、色度、发光和放射性检测的方法可直接检测的部分，或(b)选自生物素和链霉亲和素结合的报告系统(streptavidin conjugated reporting systems)的可间接检测部分。

本公开内容涉及诊断试剂盒，其包括包装材料和用于检测样品中奥司他韦耐药性流感病毒的存在的组合物，其中，所述组合物包括根据本公开内容的化合物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括标注(label)或含有使用所述试剂盒用于检测样品中的奥司他韦耐药性流感病毒的说明或指示的产品说明书(package insert)。

本发明的上述方面和其他方面由结合以下附图的以下优选实施方案的描述将得以进一步明确，在不脱离本公开内容的新观点的精神和范围的情况下，可对其进行变化和修改。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在本说明书中以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个该附图并结合本文所示的具体实施方案的详细描述，能更好地理解本发明。本专利或申请文件包括至少一个彩色附图。带有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本将经过请求且支付必要的费用由专利局官方提供。

图1显示扎那米韦膦酸酯同类物和衍生物的合成路线图。

图2A-2D显示化合物1a(2A)、1b(2B)、扎那米韦(2C)和奥司他韦酸(2D)的分子模型。

图3显示扎那米韦-生物素结合物(ZB,9)的合成路线图。

图4显示扎那米韦-荧光结合物15和17的合成路线图。

图5显示零流感(tamiphosphor)-生物素结合物24的合成路线图。

图6显示二扎那米韦-生物素结合物26的合成路线图。

图7A-7B显示使用固定的流感样品测定羧酸奥司他韦(OC)易感性。(7A)用于本研究的化合物的结构。(7B)以每孔10⁵、10⁴或10³PFU将OC易感性(S)或OC耐药性(R)WSN病毒样品固定于抗HA包被的微孔板内。将三个复孔内的固定病毒样品与用于全结合的30nM ZB或30nM ZB和150nM竞争性OC温育，以测量OC耐药性ZB的结合。将所结合的病毒先后与结合有链霉亲和素的碱性磷酸酶和化学发光底物进一步温育，以测量因结合的碱性磷酸酶的催化导致的相对发光单位(RLU)的增加。OC耐药性ZB结合的数值计算为存在OC竞争时测量的RLU与不存在OC时测量的RLU之比。由竞争性OC导致结合显著降低(p<0.001)的条件用“**”标记。虚线标出当采用高滴度(每孔10⁵PFU)274H病毒样品时用OC不能完全抑制的3％的残余ZB结合。

图8A-8D显示在2005-2009年于台湾收集的临床流感分离株的OC易感性的测定。将2005-2007年(8A)、2008年(8B)和2009(8C)在台湾收集的季节性H1N1用于OC易感性研究。OC耐药性ZB结合的测量和计算如图1所述。将结合数值低于1％表示为1％。虚线标出使用5％结合数值表示测试病毒的易感性状态。(8D)除了对全结合和OC耐药性结合进行三次测量之外，以相同的方式测量7个2009年全国流行的H1N1分离株的OC易感性。此外，还显示了全结合和OC耐药性结合。

图9A-9D显示用于流感病毒样品的OC易感性测定的“即时检验”典型实验。(9A)使用带有固定的抗HA抗体缝隙的PVDF膜吸收与30nM ZB或30nM ZB和150nM OC预孵育的流感样品。在该研究中，每个缝隙使用10⁴、10⁵、10⁶PFU的野生型WSN(274H)或OC耐药性WSN(274Y)突变病毒。在印迹和洗涤后，用结合有链霉亲和素的碱性磷酸酶处理膜并用BCIP/NBT染色以肉眼测定病毒样品的OC易感性。(9B)使用所述膜实验验证图8B中所示的10个2008年台湾季节性H1N1分离株。(9C)类似地，使用所述典型实验评价图8D中测试的4个全国流行性H1N1病毒株。(9D)使用改进的方法测定几个其他甲型或乙型流感病毒中ZB结合的OC竞争，所述改进的方法包括不用抗体而将病毒样品直接固定至PVDF膜上，然后以相同的方式进行。

图10显示ZB(扎那米韦生物素)在表达A/Hanoi/30408/2005H5N1的神经氨酸酶cDNA的293T细胞表面的结合。通过lipofectamine^TM 2000(Invitrogen,Carlsbad,USA)用NA表达载体pCDNA3.1-NA转染293T细胞。48小时后，转染细胞用100nM扎那米韦-生物素(ZB)染色并用结合有DyLight 488的链霉亲和素进一步温育。使用Leica TCS-SP5激光扫描共焦显微镜获取免疫荧光图像。

图11A-11F显示混合性293T细胞(具有不同含量的表达OC耐药性神经氨酸酶的细胞)的ZB结合。表达OC敏感(274H)和OC耐药性(274Y)细胞的重组293T细胞以下述所示不同比例混合：(11A)274H:274Y＝100:0、(11B)274H:274Y＝999:1、(11C)274H:274Y＝99:1、(11D)274H:274Y＝95:5、(11E)274H:274Y＝90:10、(11F)274H:274Y＝0:100。所述混合性细胞在室温下用10nM ZB处理1小时，然后用结合有APC的链霉亲和素进一步修饰并通过FACSCanto(Becton Dickinson)和FCS Express 3.0软件分析。ZB标记的细胞的百分数为11A，83.95％；11B，84.4％；11C，84.62％；11D，86.07％；11E，83.58％；和11F，75.1％。

图12A-12F显示混合性293T细胞(具有不同含量的表达OC耐药性神经氨酸酶的细胞)的羧酸奥司他韦耐药性ZB结合。如图11所示，用10nMZB和过量的300nM OC处理细胞并进行类似地后续处理。ZB标记的细胞百分数为12A，1.00％；12B，2.64％；12C，2.78％；12D，7.10％；12E，12.41％；和12F，68.29％。

图13A-13B显示流感病毒感染的MDCK细胞的ZB结合的OC竞争。(13A)用OC易感性274H或OC耐药性274Y病毒感染MDCK细胞。在感染后20小时，在不同浓度竞争性OC存在下用10nM(空心三角)或50nM(空心圆)ZB温育所述274H病毒感染的细胞。类似地，在不同的OC含量下，也用10nMZB(实心三角)或50nM ZB(实心圆)温育所述274Y感染的细胞。用结合有链霉亲和素的碱性磷酸酶进一步温育带有结合的ZB的细胞以测定在不同竞争性OC浓度下的相对ZB结合。(13B)用OC易感性(274H)或OC耐药性(274Y)WSN病毒感染并用30nM ZB或30nM ZB和150nM OC温育然后用结合有链霉亲和素的PE温育的MDCK细胞的图像。使用激光驱动板式读数仪(laserdriven plate reader)分别在488和575nm下激发和发射而获取荧光图像。

图14显示固定的WSN病毒的RABC分析，用于通过带有竞争性OC的ZB结合来估计OC耐药性病毒含量。以每孔10⁵PFU(三角形)、10⁴PFU(正方形)和10³PFU(圆形)将具有不同274H和274Y病毒含量的混合性WSN病毒样品一式三份地固定在抗HA包被的微孔中。添加30nM ZB和150nM OC持续1小时，其后与结合有链霉亲和素的碱性磷酸酶偶联以测定相对于实验所用的274Y含量作曲线的估计的百分OC耐药性数值。

具体实施方式

在本发明的上下文和使用各术语的具体上下文中，本说明书中使用的术语通常具有本领域的普通含义。用于描述本发明的某些术语在下文或说明书的其他位置有讨论，以对本发明的有关描述的实施者提供其他指导。出于方便，可能例如使用斜体和/或引号突出某些术语。突出使用对术语的范围和含义没有影响；术语的范围和含义在相同的上下文中相同，无论突出与否。可以理解的是，相同的事物可以以多种方式描述。因此，对于本文讨论的多个术语的任一个均可使用替代的语言和同义词，对这些术语没有任何特殊意义，无论本文是否对术语进行详细描述或讨论。提供了某些术语的同义词。叙述多个同义词不排斥使用其他同义词。本说明书任何地方所使用的实施例，含有本文讨论的任何术语的实例，决不限定本发明或任何例示的术语的范围和含义。同样，本发明不限于本说明书给出的多种实施方案。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本发明所属领域的普通技术人员公知的相同含义。在冲突的情况下，以含有定义的本公开内容为准。

奥司他韦是通过内源性酯酶转化为羧酸奥司他韦(OC)的口服前药。扎那米韦通过结合到神经氨酸酶蛋白的活性位点，使流感病毒不能脱离其宿主细胞和感染其他细胞来发挥作用(Cyranoski D(September 2005)Nat.Medicine11(9):909)。它也是流感病毒在体外和体内复制的抑制剂。扎那米韦的生物利用度是2％并且其经常经吸入给药。

近期关于抗药性禽流感感染和儿童接受治疗的副反应的报道暗示对抗全国流行性流感威胁的战役需要新化学性质的神经氨酸酶抑制剂(NAIs)。NA抑制剂设计为具有(氧杂)环己烯支架以模拟唾液酸酶裂解中的氧鎓过渡态(Russell等人,Nature 2006,443:45)。经肝酯酶水解，暴露出活性羧酸盐奥司他韦，以与NA活性位点(Id.)中的精氨酸残基(Arg118、Arg292和Arg371)相互作用。

具有抗流感活性的扎那米韦膦酸酯同类物的合成

本公开内容提供了扎那米韦的新型膦酸酯同类物的新合成途径。利用D-唾液酸作为合成新型活性神经氨酸酶抑制剂的手性前体。通过抑制H1N1和H5N1病毒的野生型和H274Y突变体的神经氨酸酶，新型膦酸酯同类物表现出比扎那米韦和奥司他韦更好的抗流感活性。

在一种实施中，本发明提供一种对映选择性合成各种扎那米韦膦酸酯同类物和衍生物的新型合成方法，其具有相当高的产率。图1示出了合成途径。图1中所记载的试剂和步骤如下所示：

步骤1.用乙酸酐在吡啶中处理唾液酸(2)以提供全乙酰化(peracetylation)中间体，将其在100℃下加热以诱导脱羧反应，得到化合物3(Horn,E.J.,等人,Carbohydr.Res.2008,343,936)。

步骤2.用二乙基三甲基甲硅烷基亚磷酸作为适当的亲核试剂处理化合物3以提供α和β异构体(2:3)混合物形式的膦酸酯化合物4，所述膦酸盐化合物4可用色谱分离并用NMR光谱分析表征。

步骤3.膦酸酯4(为异构体混合物)与CH₂Cl₂溶液中的N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)一起进行照射以进行自由基型溴化作用，然后用吡啶进行原位处理以提供β消去产物(β-elmination product)5，Neu5Ac2en(DANA)的膦酸酯衍生物。化合物5的该合成方法比其类似物二甲基膦酸酯以前报道的冗长步骤更有效率(Vasella,A.；Wyler,R.Helv.Chim.Acta 1991,74,451)。

步骤4.在作为介质的乙酸酐、乙酸和浓H₂SO₄中，化合物5转化为噁唑啉6。

步骤5.使用叠氮三甲基硅烷进行噁唑啉6的区域和立体选择性开环反应以提供作为关键中间体导致化合物1a、1b、1c和1d的叠氮化合物7。

步骤6.化合物7通过顺次三个反应转化为膦酸：用溴代三甲基硅烷去除膦酸酯7的两个乙基、用甲醇钠在甲醇中去乙酰化，和在Lindlar催化剂存在下通过氢化选择性还原叠氮基团为胺。

作为选择，经乙醇中的乙醇钠处理，仅从膦酸酯二酯7去除一个乙基，即可在随后的还原叠氮基团后得到膦酸酯二酯1c。

步骤7.为引入胍基取代基，首先将化合物7中的叠氮基团还原成胺，所述胺在氯化汞和三乙胺存在下与1,3-双(叔丁氧基羰基)-2-甲基异硫脲反应从而提供胍化合物8。

步骤8.用溴代三甲基硅烷去除膦酸酯8中两个乙基，同时发生的叔丁氧基羰基(Boc)基团的去除是通过用甲醇后处理而原位生成的HBr来实现的。通过去乙酰化获得扎那米韦膦酸酯(1b)。

作为选择，用乙醇钠将膦酸酯二酯7转化为单酯，其后用三氟乙酸去除Boc基团以得到化合物1d。

任选地，本发明组合物包括本文所述化合物的盐，特别是药学上可接受的含有例如，Na⁺、Li⁺、K⁺、Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的无毒盐。该盐可包括通过适当的阳离子如碱金属离子和碱土金属离子或铵和季铵离子与酸性阴离子部分的结合而衍生的那些盐。

金属盐通过金属氢氧化物与本发明化合物反应来制备。以该方式制备的金属盐实例是含有Na⁺、Li⁺、K⁺的盐。

此外，由某些有机酸和无机酸例如，HCl、HBr、H₂SO₄，或有机磺酸酸加成到碱性中心(通常是胺)可以形成盐。最后，可以理解的是，本文所述组合物包括以其未离子化形式和以两性离子形式存在的本发明化合物，及其与化学计量量的水组合的水合物形式。本发明的另一个方面涉及抑制神经氨酸酶活性的方法，其包括用本发明化合物处理疑似含有神经氨酸酶的样品的步骤。

用按常规选择的常规载体和赋形剂配制本发明化合物。片剂将包含赋形剂、助流剂、填充剂和粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，当试图通过通常的口服给药以外的方式给药时，则所述水性制剂是等张性的。所有制剂任选地将含有赋形剂如"Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)"(1986)中所列出的那些赋形剂，特意地将其整体引入作为参考。赋形剂包括抗坏血酸和其他抗氧化剂、螯合剂如EDTA、糖类(carbohydrates)如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素和硬脂酸等。制剂pH值范围在约pH 3至约pH 11，但是通常为约pH 7至pH 10。

通过任何适于所治疗病症的途径给予本发明的一种或多种化合物(此处是指活性成分)。适合的途径包括经口服、直肠的、经鼻的、局部的(包括口腔的和舌下的)和阴道的和肠胃外的(包括皮下的、肌内的、静脉内的、皮内的、鞘内的和硬膜的)等。可以理解的是，优选的途径可随例如受试者条件而改变。

尽管活性成分可以被单独给予，但优选活性成分以药物制剂的形式呈现。本发明的人兽两用的制剂包括至少一种如上定义的活性成分，以及一种或多种可接受的载体和任选的其他治疗成分。一种或多种载体必须是"可接受的"，某种意义上说，是与制剂的其他成分相容且生理学上对受试者无毒。

制剂包括适合于前述给药途径的那些制剂。制剂可便于以单位剂量形式存在且可通过药学领域熟知的任一种方法制备。通常在Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)中查找到技术和配制。这些方法包括将活性成分与构成一种或多种副成分的载体结合起来的步骤。一般而言，通过均一和紧密地将活性成分与液体载体或细分的固体载体或其两者结合来制备制剂，然后，如果必要，将产物塑形。

将适合于口服给药的本发明制剂制备成含有预定量活性成分的独立单元，如胶囊剂、扁囊剂(cachets)或片剂；制备成粉剂或颗粒剂；制备成溶液或混悬剂(水溶液或非水溶液)；或制备成水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以以大丸剂、干药糖剂(electuary)或糊剂呈现。

片剂通过压制或模制制备，任选地带有一种或多种辅料(accessoryingredient)。压制的片剂可通过在适合的机器上将活成成分压制成自由流动形式如粉剂或颗粒剂来制备，任选地混合有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。模制的片剂可通过在适合的机器内将经惰性液体稀释剂润湿的粉状活性成分混合物模制(molding)来制备。任选地片剂可以被包衣或刻痕，以及任选被配制使活性成分能够缓慢地或可控地释放。

对于眼部或其他外组织(例如口部和皮肤)的感染，优选制剂以局部膏剂或霜剂形式施用，所述局部膏剂或霜剂含有的活性成分的量例如为，0.075-20％w/w(包括增量为0.1％w/w，范围为0.1％-20％的活性成分，如0.6％w/w、0.7％w/w等)、优选0.2-15％w/w且最优选0.5-10％w/w。当配制成膏剂时，活性成分可与石蜡或与水混溶的膏基剂(ointment base)一起采用。作为选择，活性成分可以与水包油霜基剂(cream base)一起配制成霜剂。

如果希望，霜基剂的水相可包括例如，至少30％w/w的多元醇，即，具有两个以上羟基的醇如丙二醇、1,3-丁二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)及它们的混合物。理想地，局部制剂可包括能增强活性成分经由皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的化合物。这种皮肤渗透强化剂的实例包括二甲基亚砜和相关类似物。

本发明乳剂的油相以已知方式由已知成分构成。虽然所述油相可仅包括乳化剂(或者已知为利泄剂)，但是也希望它包括至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起包括在乳剂中。还优选包括油和脂肪两者。乳化剂与或不与稳定剂一起组成所谓的乳化蜡，乳化蜡与油和脂肪一起组成所谓的乳化膏基剂，所述乳化膏基剂形成霜制剂的油分散相。

适合用于本发明制剂的利泄剂和乳液稳定剂包括Tween^TM 60、Span^TM80、鲸脂醇、苯甲醇、肉豆蔻醇、硬脂酸甘油单酯和月桂基硫酸钠。

适合制剂用的油或脂肪的选择取决于获得所希望的化妆性能(cosmeticproperties)。霜剂应优选为不油腻、不染色的和可洗涤的产物，具有适合的黏稠度以避免从管或其它容器中泄露出来。可使用直链或支链、单盐基或二盐基烷基酯如二异己二酸酯(di-isoadipate)、硬脂酸异十六烷酯、椰子油脂肪酸丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己酯或称为Crodamol CAP的支链酯的共混物，最后三个是优选酯。取决于所需性质，可单独或组合使用这些酯。作为选择，使用高熔点脂质如白矿蜡和/或液体石蜡或其他矿物油。

适合于局部给药至眼部的制剂还包括滴眼液，其中，活性成分溶解或悬浮于适合的载体，特别是活性成分的水性溶剂。优选存在于该制剂中的活性成分浓度为0.5-20％，有利地为0.5-10％，特别为约1.5％w/w。

适合于在口中局部给药的制剂包括活性成分包含在增味基剂(通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)中的菱形锭剂；活性成分包含在惰性基剂(如凝胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶)中的锭剂；和活性成分包含在适合的液体载体中的洗口药。

直肠给药的制剂可以栓剂形式呈现，其具有含有例如可可脂或水杨酸盐的合适的基剂。

适合于肺内给药或经鼻给药的制剂的颗粒尺寸例如在0.1-500微米的范围(包括微米增量为0.5、1、30微米、35微米等，范围为0.1-500微米的颗粒尺寸)，所述制剂通过快速经过鼻通道吸入或经过口吸入到达肺泡囊给药。适合的制剂包括活性成分的水性或油性溶液。适合于气雾剂或干粉给药的制剂可根据常规方法制备且可与其他治疗剂如此前治疗或预防流感A或B感染中所用的化合物一起给药。

适合于阴道给药的制剂可以阴道栓剂、卫生棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂的形式存在，除了活性成分还含有如本领域已知的适当的载体。

适合于肠胃外给药的制剂包括含水和不含水的灭菌注射溶液，所述含水和不含水的灭菌注射溶液可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与目标受试者的血等张的溶质；和包括含水和不含水性的菌悬浮液，所述含水和不含水的灭菌悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。

制剂可存在于单剂或多剂容器(例如密封安瓿和小瓶)中，且可以储存在冷冻干燥(冻干的)条件下，仅需要在使用前即刻添加灭菌液体载体(例如注射用水)。即时注射溶液和悬浮液由前述的灭菌粉末、颗粒和片剂制备。优选单剂量制剂是如下制剂：含有活性成分的日剂量或如上所述的单元每日次剂量(unit daily sub-dose)，或其适当的分数。

应该理解的是，除了上面具体提及的成分，考虑到讨论的制剂类型，本发明制剂可包括本领域常规的其他试剂，例如适合于口服给药的那些制剂可包括增味剂。

本发明进一步提供兽用组合物，所述兽用组合物包括上述定义的活性成分和至少一种兽用载体。兽用载体是用于将组合物给药的材料且可以为固体、液体或气体材料，所述固体、液体或气体材料在兽用领域是惰性或可接受的且与活性成分相容。这些兽用组合物可以口服给药、肠胃外给药或通过任何其他希望的途径给药。本发明化合物用于提供含有一种或多种本发明化合物作为活性成分的的控释药物制剂("可控释放的制剂")，其中活性成分的释放是可控的且可被调整以允许较小频率的剂量给药或改进已知活性成分的药物动力学或毒性。活性成分的有效剂量至少取决于所治疗的病症的性质、毒性、化合物是预防性使用(较低剂量)还是对抗活性流感感染、给药方法和药物制剂，并且将由临床医生使用常规剂量扩大研究来测定。期望剂量为每天约0.0001-约100mg/kg体重。通常，每天约0.01-约10mg/kg体重。更为通常的，每天约0.01-约5mg/kg体重。更为通常的，每天约0.05-约0.5mg/kg体重。例如，对于吸入，体重约70kg的成人的日候选剂量(daily candidate dose)为1mg-1000mg，优选5mg-500mg，且可以采取单剂量或多剂量的形式。

在一种实施方案中，本发明的活性成分还与其他活性成分组合使用。基于所治疗病症、成分的交叉反应性和组合的药学性能选择这种组合。例如，当治疗呼吸系统的病毒感染，特别是流感感染时，本发明组合物与抗病毒药(如金刚烷胺、金刚乙胺和病毒唑)、粘液溶解剂、除痰剂、支气管扩张剂、抗生素、退热剂、或止痛剂组合。通常，抗生素、退热剂和止痛剂与本发明化合物一起给药。

本发明的另一个实施方案包括本文记载的化合物的体内代谢产物，在某种程度上，这种产物相对于现有技术是新颖的而且是非显而易见的。这种产物可能由所给药的化合物的例如氧化、还原、水解、氨基化和酯化等得到，主要归因于酶作用。因此，本发明包括通过包括使本发明化合物与哺乳动物接触足以获得其代谢产物的一段时间的方法来生产新型和非显而易见的化合物。这种产物通常通过以下步骤来识别：制备放射性标记(例如，¹⁴C或³H)的本发明化合物，通过肠胃外给药以可检测的剂量(例如，大于约0.5mg/kg)对动物如大鼠、小鼠、豚鼠、猴、或人给药，提供足够的时间(通常约30秒至30小时)以发生代谢，以及从尿、血或其他生物样品中分离转化产物。因为产物被标记，这些产物容易被分离(其他产物通过使用能够与代谢物中存活的表位(epitopes)结合的抗体来分离)。以常规方式测定代谢产物结构，例如，通过MS或NMR分析。一般而言，以与本领域技术人员公知的常规药代谢研究相同的方式进行代谢产物分析。转化产物，只要不是另外在体内发现的，就可用于本发明化合物治疗剂量给药的诊断分析，即使它们本身没有神经氨酸酶抑制剂活性。

新型膦酸酯同类物的前药是可预见的。极性膦酸酯和胍盐基团两者均可任选通过本领域已知的技术进一步功能化以提高药物动力学和/或药效性能。例如，前药(例如，酰氧基甲基-和芳基膦酸酯)的配制和使用可用于提高口服生物利用度(Kriseand Stella,Adv.Drug Deliv.Rev.1996,19,287)。

在本发明的一个方面中，疑似含有神经氨酸酶的样品包括天然或人造材料，如活生物体；组织或细胞培养物；生物样品如生物材料样品(血、血清、尿、脑脊髓液、泪、痰、唾液和组织样品等)；实验室样品；食物、水、或空气样品；生物产物样品，如细胞提取物，特别是合成期望糖蛋白的重组细胞等。通常样品被疑似含有产生神经氨酸酶的生物体，常常是致病生物体如病毒。样品可处于任何介质中，所述介质包括水和有机溶剂/水混合物。样品包括活生物体(如人)和人造材料(如细胞培养物)。

本发明的治疗(或处理)步骤包括将本发明的组合物添加到样品中或将组合物的前体添加到样品中。添加步骤包括如上所述的任何施用方法。如果需要，可通过任何方法(包括直接和间接检测神经氨酸酶活性的方法)来观察应用组合物后的神经氨酸酶活性。测定神经氨酸酶活性的定量、定性和半定量的方法均是可以想到的。通常应用一种上述的筛选方法，然而，任何其他方法如观察活生物体的生理性性能也是可应用的。

含有神经氨酸酶的生物体包括细菌(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和Arthrobacter sialophilus)和病毒(特别是正黏液病毒或副黏液病毒如流感病毒A(例如，H1N1、H5N1)和流感病毒B、副流感病毒、腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒、真性鸡瘟病毒(fowl plague virus)和仙台病毒(sendai virus)。抑制由这些生物体获得或在这些生物体发现的神经氨酸酶的活性都是本发明的目的。在"基础病毒学"(Raven Press,New York,1986)，第24章中记载了流感病毒的病毒学。本发明化合物用于对动物(如鸭和其他鸟类、啮齿动物、猪或人)预防流感感染或治疗现有流感感染。

通过任何评价酶活性的常规技术来筛选本发明组合物对神经氨酸酶的抑制活性。在本发明的上下文中，通常首先筛选组合物体外的神经氨酸酶抑制，然后对示出抑制活性的组合物筛选体内活性。具有体外K_i(抑制常数)小于约5×10^–6M，通常小于约1×10^–7M和优选地小于约5×10^–8M的组合物优选用于体内用途。

可用的体外筛选已有详细记载，此处不再详述(Itzstein,M.von等人；"Nature",363(6428):418-423(1993)；Potier,M.；等人；"Analyt.Biochem.",94:287-296(1979)；Chong,A.K.J.；等人；"Biochem.Biophys.Acta",1077:65-71(1991)；和Colman,P.M.；等人；国际公开WO 92/06691(国际申请PCT/AU90/00501,公开日：1992年4月30日))。体内筛选也有详细记载(Itzstein,等人,1993，第421页，第2栏，第一段全段至第423页，第2栏，第一段部分，和Colman,p.36)。

表1示出了扎那米韦膦酸酯衍生物1a和1b相比于扎那米韦和奥司他韦酸的神经氨酸酶抑制、抗流感和细胞毒性活性。膦酸酯衍生物1a和1b示出了强于扎那米韦的抗各种野生型和突变型流感病毒的能力。

表1.神经氨酸酶抑制、抗流感活性和细胞毒性分析

^a流感病毒A/WSN/1933(H1N1)、来自A/WSN/1933(H1N1)的H274Y神经氨酸酶突变体、A/加利福尼亚/7/2009(流行的H1N1),A/越南/1194/2004RG14(H5N1)和A/乌隆/307/1972(H3N2)，用作神经氨酸酶抑制和抗流感分析的生物分析材料。人293T细胞用于化合物的细胞毒性测量。

^b荧光底物2’-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(MUNANA)用于测定IC₅₀数值，所述IC₅₀是导致达50％抑制的不同流感神经氨酸酶的化合物浓度。

^c使用MUNANA作为底物，通过动力学研究测定抑制常数。

^d测量抗不同流感病毒的抗流感活性，表示为EC₅₀值，所述EC₅₀是用于50％保护由不同的流感病毒感染引起的细胞病变效应的化合物浓度。

^e在293T细胞的细胞毒性分析中，没有显而易见的毒性作用时所使用的最高浓度。

神经氨酸酶抑制分析是使用流感相关的神经氨酸酶作为酶源测量对几种流感病毒的神经氨酸酶的抑制。使用荧光底物MUNANA(2’-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸)测量所有病毒的酶的神经氨酸酶活性。表1示出了IC₅₀值，所述IC₅₀值是测量用于50％抑制神经氨酸酶活性的化合物浓度且评价这些化合物的相对的神经氨酸酶抑制能力。

1a和1b抗全部5种神经氨酸酶的IC₅₀值均比扎那米韦显著有效且与奥司他韦酸的数值类似。这两种膦酸酯化合物在抑制WSN 274Y的奥司他韦耐药性神经氨酸酶突变体中显著地更活跃，所述突变体在神经氨酸酶的274位上具有取代了亲本组氨酸的酪氨酸残基。

测量这些化合物抗5种流感病毒的抗流感活性用于得到保护流感感染介导的细胞病变效应的能力。测定抗流感活性，表示为EC₅₀值，EC₅₀值是用于50％保护感染介导的细胞病变效应的浓度。表1示出1a和1b抗H1N1流感病毒(如WSN和2009流行的H1N1病毒株)的抗流感活性更强。

1a和1b奥司他韦耐药性WSN(H1N1)病毒的抗流感活性特别显而易见。在274位发生突变的奥司他韦耐药性神经氨酸酶的H1N1流感病毒已成为临床中主要的H1N1分离株(Moscona,A.N.Engl.J.Med.2005,353,2633)。1a和1b对突变的神经氨酸酶突出的抗流感活性可能影响到治疗该主要流感病毒的方案选择。除了是有效的抗H1N1流感病毒的抗流感抑制剂，1a和1b作为抗RG14(H5N1)和乌隆(H3N2)流感病毒的抗流感剂，也与扎那米韦相当。

生物分析测量示出1a和1b均是有效的抗神经氨酸酶和抗流感化合物。它们通常比扎那米韦更有效且抗奥司他韦耐药性H1N1流感病毒非常活跃。除了是有效的抗流感剂，它们在最高测试浓度下对人293T细胞无毒(表1)。

在本申请的一个实施方案中，膦酸酯1a是有效的NA抑制剂和抗A/WSN/1933(H1N1)病毒的抗流感剂，IC₅₀值和EC₅₀值分别为0.65和1.3nM。

在本申请的一个实施方案中，膦酸酯1a是有效的NA抑制剂和抗A/WSN/1933(H1N1)病毒的H274Y突变体的抗流感剂，IC₅₀值和EC₅₀值分别为0.5和27nM。扎那米韦膦酸酯的这些IC₅₀值和EC₅₀值对克流感耐药性H1N1病毒特别有意义。

在本申请的一个实施方案中，膦酸酯1a是有效的NA抑制剂和抗A/加利福尼亚/7/2009(流行的H1N1)、A/越南/1194/2004RG14(H5N1)和A/乌隆/307/1972(H3N2)病毒的抗流感剂。

在本申请的一个实施方案中，膦酸酯1b是有效的NA抑制剂和抗A/WSN/1933(H1N1)病毒的抗流感剂，IC₅₀和EC₅₀值分别为1.2和2.4nM。

在本申请的一个实施方案中，膦酸酯1b是有效的NA抑制剂和抗A/WSN/1933(H1N1)病毒的H274Y突变体的抗流感剂，IC₅₀和EC₅₀值分别为0.25和26nM。1b抗克流感耐药性H1N1病毒的高有效性非常显著。

在本申请的一个实施方案中，膦酸酯1b也是有效的NA抑制剂和抗A/加利福尼亚/7/2009(流行的H1N1)、A/越南/1194/2004RG14(H5N1)和A/乌隆/307/1972(H3N2)病毒的抗流感剂。

在本发明的一个方面，神经氨酸酶-膦酸酯复合物的分子模型展示了膦酸酯与活性位点中3个精氨酸残基的相关的结合模式。使用已知的N1晶体结构(PDB code:2HU4)分子对接实验(图2)揭示在类似于神经氨酸酶-扎那米韦复合物的结合袋中，膦酸酯抑制剂1b与NA的三个精氨酸残基强有力地结合，此外还有C₇-C₉甘油基、C₄-乙酰氨基和C₅-胍基基团施加的其他相互作用。

在本发明的一个方面，膦酸酯抑制剂1a的分子模拟示出了在结合袋中其与神经氨酸酶的3个精氨酸残基强有力的相互作用，此外还有C₇–C₉甘油基、C₄-乙酰氨基和C₅-氨基基团施加的其他相互作用(图2)。

克流感耐药性病毒的分离株的鉴定

说明书此处公开了设计和实施依据结合竞争的耐药性评估(RABC)法以产生克流感耐药性病毒分离株的有效诊断。

扎那米韦和OC结合到流感神经氨酸酶(NA)的相同活性位点。然而，奥司他韦耐药性的H5N1病毒神经氨酸酶可仍旧保持对扎那米韦的易感性(Collins PJ,等人,(2008).Nature 453(7199):1258-1261)。神经氨酸酶的诱导装配涉及Glu276残基再定向于Arg224而产生较大的疏水袋，这种诱导装配是容纳OC侧链所需要的(M.Z.Wang,C.Y.Tai,D.B.Mendel,Antimicrob.Agents Chemother.46,3809(2002)；P.J.Collins等人,Nature 453,1258(2008))。神经氨酸酶(N1)可进化为含有如H274Y的突变的耐药性形式，其阻止了疏水袋的形成，导致奥司他韦K_i值增大了几百倍。由于不需要疏水袋，扎那米韦对H274Y神经氨酸酶的K_i不变(P.J.Collins等人,Nature 453,1258(2008))。在本发明的特征中，研究结合的差别以开发病毒分离株的OC易感性的新型诊断法。

惊奇地发现结合到流感病毒神经氨酸酶的奥司他韦结合区域的识别单位(R)的选择和使用奥司他韦敏感型型与奥司他韦耐药性流感病毒之间的不同结合是检测流感病毒的克流感耐药性病毒株的基础。

在本发明的某些方面中，识别单位(R)偶联至传感器单元(S)。在有些实施方案中，识别单位(R)偶联至连接部(L)，再依次偶联至传感单元(S)。R–L–S分子用于辨别克流感耐药性病毒和克流感敏感型流感病毒。

作为有效的神经氨酸酶抑制剂，羧酸奥司他韦(OC；)是结合到流感病毒中NA分子的非OC分子(R)的有效竞争剂。然而，OC是结合OC耐药性突变体(例如，H274Y)的不良竞争剂，而这样的OC耐药性突变体仍与野生型NA一样结合非OC识别单位(R)。

识别单位(R)通常选自已知的NA结合部分，如扎那米韦、零流感胍单酯、或扎那米韦膦酸酯1a或其衍生物1b、1c和1d。在有些实施方案中，R选自含奥司他韦的膦酸酯化合物，其具有作为抗H1N1和H5N1病毒的野生型和H274Y突变体的神经氨酸酶抑制剂的活性，如美国专利7,888,337B2所公开的。

结合到NA是通过可观察到的来自传感部分(即，可检测部分)的信号来检测。这种均相荧光和量热式传感部分是本领域技术人员已知的。参见，例如：Wang Q.M.等人,"以肽对硝基苯胺作为底物的鼻病毒-143C蛋白酶的连续式量热式分析(A continuous calorimetric assay for rhinovirus-14 3C proteaseusing peptide p-nitroanilides as substrates)"Anal.Biochem.Vol.252,pp.238-45(1997)，和Basak S.等人,"使用分子内淬火的荧光肽的体外蛋白质原转换酶4的底物特异性和生物分析(In vitro elucidatin of substrated specificity andbioassay of proprotein convertase 4using intramolecularly quenched fluorogenicpeptides)"Biochem.J.Vol.380,pp.505-14(2004)。

直接或间接(通过抗生物素蛋白/链霉亲和素-生物素、抗体-抗原、或本领域已知的其他方法)连接至可检测部分的传感器单元选自由荧光标记、金标记和酶标记构成的组。传感器的类型不受限制且可根据目的适当选择。传感器的实例包括放射性标记、量子点标记和蛋白标记等。

在有些方面，传感单元与结合的结合伙伴形成可检测的结合复合物，形成结合对，其中，所述结合伙伴与试剂结合。结合对可基于以下任一种：结合对是选自由以下构成的组的任一种结合对：链霉亲和素:生物素；抗生物素蛋白:生物素；叶酸:叶酸盐结合蛋白；唾液酸、碳水化合物或糖蛋白:凝集素；寡或多聚dA:寡或多聚dT；寡或多聚dC:寡或多聚dG；苯硼酸:水杨羟肟酸；醛和酮部分:肼；巯基部分:马来酰亚胺；氨基部分:N-羟基琥珀酰亚胺酯；重金属:硫醇；IgG的Fc部分:蛋白A/蛋白G/蛋白A/G；地高辛:抗地高辛；5-溴代脱氧尿苷:抗溴代脱氧尿苷；二硝基苯:抗二硝基苯；异硫氰酸荧光素:抗异硫氰酸荧光素；N-2-乙酰基氨基芴:抗N-2-乙酰基氨基芴；和N-2-乙酰基氨基-7-碘代芴:抗N-2-乙酰基氨基-7-碘代芴。

在某些方面中，标记包括荧光团。在有些方面中，荧光团选自以下构成的组：荧光素、若丹明、香豆素、试卤灵、氧杂蒽、花青、芘、酞菁染料、藻胆蛋白、Alexa、Cy3、Cy5、方酸菁染料、导致能量转移染料的组合、和它们的衍生物。Alexa荧光染料可选自由Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 546和Alexa Fluor 532构成的组。在有些实施方案中，荧光团选自由以下构成的组：BODIPY马来酰亚胺类、碘代乙酰胺类和甲基溴化物类；Alexa Fluor马来酰亚胺类；荧光素5-和6-异构体马来酰亚胺类和甲基溴化物类；OregonGreen异硫氰酸盐类和马来酰亚胺类；四甲基若丹明5-和6-异构体碘代乙酰胺类和马来酰亚胺类；若丹明红马来酰亚胺类；德克萨斯红溴代乙酰胺类和马来酰亚胺类；吡啶基噁唑马来酰亚胺类；包括NBD卤化物和碘代乙酰胺类、SBD的苯并噁二唑衍生物类；莹黄碘代乙酰胺；芪碘代乙酰胺类和马来酰亚胺类；香豆素马来酰亚胺和碘代乙酰胺类，即，MDCC、IDCC和其他；萘衍生物类，即，acrylodan、badan、IAANS、MIANS、IAEDANS和Dansyl；氮丙啶；dapoxyl衍生物类，即，dapoxyl(2-溴代酰基)磺酰胺；芘马来酰亚胺类和碘代乙酰基衍生物类；和monobromobimanes和monochlorobimanes。

检测来自传感器单元(S)信号的方法或手段不受特别限制且可根据目的适当选择。例如，当信号是发射、淬灭等，则通过光电探测器、照相机等检测。

光发射部分和淬灭部分的组合不受特别限制且可根据目的适当选择。例如，可适当采用已知为荧光共振能量转移(FRET)的技术等。

光发射部分不受特别限制，只要其可以产生发射，且可根据目的适当选择。其实例包括含有荧光物质、化学发光物质、电化学发光物质等的光发射部分或由这些物质形成的光发射部分。它们可单独使用或两个或多个组合使用。其中，当淬灭部分邻近光发射部分时，优选通过淬灭部分淬灭光发射部分的发射，优选荧光物质，因为其可见性优异且检测容易。荧光物质不受特别限制且可根据目的适当选择。其实例包括蒽、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明类如四甲基若丹明和磺酰罗丹明、丹酰氯、德克萨斯红、AL350和吲哚羰花青(CY)等。

淬灭部分不受特别限制，当淬灭部分位于邻近光发射部分的位置时，只要可以淬灭光发射部分的发射。淬灭部分可根据光发射部分的类型等适当选择。其实例包括含有淬灭物质或由淬灭物质形成的那些物质。淬灭物质不受特别限制且可根据目的适当选择。当光发射部分由荧光物质形成时，淬灭物质的实例包括当荧光物质发射光时其能够吸收释放的能量的那些物质。适合的实例包括允许光发射物质之间的荧光共振能量转移(FRET)的物质。具体实例包括四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)、二甲基氨基苯磺酰(DABSYL)、金纳米颗粒和Black Hole Quencher等。

识别单位结合至传感器，传感器依次偶联至光发射部分和淬灭部分。在识别单位结合至目标NA之前，淬灭部分可淬灭光发射部分的发射，即，此时淬灭部分邻近光发射部分。在识别单位已结合至目标NA后，淬灭部分从目标核苷酸脱离出。结果，淬灭部分远离光发射部分，导致淬灭部分失去作用，致使光发射部分产生发射。

连接部单元(L)不受特别限制并可适当选择，只要其不削弱本发明效果。例如，可使用水溶的连接部如乙二醇连接部。水溶连接部的长度可确定为适当的长度。

在一个方面中，将待测试的流感病毒样品或R-L-S复合物作为阵列固定在固体表面上。固体表面可选自以下组成的组：Langmuir Blodgett膜、玻璃、锗、硅、(聚)四氟乙烯、聚苯乙烯、砷化镓、磷化镓、二氧化硅、氮化硅和它们的组合。固体表面可为微孔或微滴定板或盘、硅片、载玻片、珠粒、微粒、薄膜或膜、瓶、盘、片、印迹材料、过滤器、纤维、编织纤维、聚合物(shaped polymers)、颗粒、浸量尺、试管、芯片和微芯片中的任一种。

在一个实施方案中，流感病毒和/或病毒颗粒结合至含有至少一种碳水化合物受体的支撑物上，所述碳水化合物受体选自结合至或位于与糖蛋白的组合物中的天然或合成的寡糖如血型糖蛋白(glycophorin)、α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein)、α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin)、卵类粘蛋白(ovomucoid)和它们的组合，所述碳水化合物受体结合至病毒和/或病毒颗粒的红细胞凝集素组分。特别地，可检测包括通常对敏感的所有已知的禽流感(AI)亚型的流感病毒和/或病毒颗粒。适合于检测流感病毒和/或病毒颗粒的方法包括克流感耐的高致病性变体。特别地，可用色谱纸或膜作为支撑物来完成本发明。这些材料为技术人员所公知。根据本发明，可以共价连接或物理吸附碳水化合物受体至至支撑物上(美国专利申请公开20100009339)。

可对含疑似流感病毒的样品使用本发明的方法，所述含疑似流感病毒的样品选自：粘液、唾液、呼吸分泌物、洗喉液、洗鼻液、脊髓液、痰、尿、精液、汗、粪、血浆、血、支气管肺泡液、阴道液、泪液和组织活检。类似的技术也可以应用于来自细胞培养物(例如，在如Vero细胞等的细胞内生长的流感样品)的病毒样品。本发明的方法适合应用于完整的流感病毒感染细胞或无细胞的流感病毒样品。流感病毒可以来自哺乳动物(人、马、猪等)或禽类来源。

试剂盒

本发明还包括含本发明的神经氨酸酶结合分子的试剂盒。不同的试剂盒组分可包装在单独容器中并在使用前混合。这种组分的单独包装可允许长时间储存而不丧失活性组分的功能。同一容器中有两种或多种组分的实施方案也是允许的。示例性试剂盒可包括一种或多种以下试剂：用于使用异质分析应用的洗涤缓冲液试剂；无神经氨酸酶结合能力的阴性对照试剂；从信号部分形成可检测信号的信号生成剂；和样品收集工具，如注射器、喉拭子、或其他样品收集装置。如果需要，本发明试剂盒可以包装形式存在，所述包装可含有一个或多个本发明的试剂盒。包装中可含有试剂盒的使用说明书。包装还提供以政府部门管理实验室设施的生产、使用或销售规定的形式存在的通知，该通知反映了政府部门对该形式组合物的批准。

结合分子的示例性实施方案：

本发明涉及通过测定具有识别单位(R)-任选的连接部(L)-传感单元(S)结构的特定结合分子的结合能力来检测克流感耐药性流感病毒株。

根据本发明的结合分子(BM)的某些实施方案的实施例：

BM 1：扎那米韦-三唑连接部-生物素

通过链接化学(炔和叠氮化物的1,3-偶极环加成)形成的含有三唑基团的连接部。荧光标记的链霉亲和素用于检测生物素单元。

BM 2：扎那米韦-三唑连接部-荧光素

荧光素在494nm处有最大吸收和在521nm处有最大发射(在水中)。使用异硫氰酸荧光素(FITC)与连接部连接。作为选择，可使用其他荧光实体如Alexa染料和量子点。

BM 3：扎那米韦-乙二醇连接部-生物素

乙二醇连接部长度可从x＝1至x＝4。

BM 4：扎那米韦-乙二醇连接部-荧光素

BM 5:零流感胍–连接部-生物素

零流感胍与流感病毒的克流感敏感型和克流感耐药性病毒株(H274Y)结合。零流感胍单酯可以盐形式存在，如铵盐。脂肪族链在连接部中可具有1-6个碳原子(x＝1-4)。作为选择，脂肪族链可如实施例3中所示用乙二醇链取代。

BM 6:零流感胍-乙二醇连接部-荧光素

BM 7:磷杂扎那米韦-三唑连接部-生物素

磷杂扎那米韦可以盐形式存在，如铵盐。

BM 8:磷杂扎那米韦-乙二醇连接部-荧光素

磷杂扎那米韦可以盐形式存在，如铵盐。

BM 9:磷杂扎那米韦单酯–乙二醇连接部-生物素

乙二醇连接部长度可从x＝1至x＝4。

BM 10：磷杂扎那米韦单酯-乙二醇连接部-荧光素

乙二醇连接部长度可从x＝1至x＝4。

常规结构R-L-S的流感NA-结合分子的其他样本公开于如下文献：Kale,R.R.等人,Am.Chem.Soc.2008,130,8169–8171；Mckimm-Breschkin,J.L.等人,Angew,Chem.Int.Ed.2003,42,3118–3121；Lu,C.-P.等人,Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,6888–6892；Kimura,Y.等人,Tetrahedron Lett.2009,50,3205–3208。

本公开首次揭示了结构为R-L-S的分子的NA-结合能力可用于用于检测克流感耐药性流感病毒。

NA与羧酸奥司他韦(OC)和R-L-S型结合分子的竞争性结合

制备有效结合流感神经氨酸苷酶的生物素结合的扎那米韦(ZB)。在作为扎那米韦的结合竞争剂的羧酸奥司他韦(OC)存在下，可测定OC易感性。OC结合竞争实验证实在台湾2008年的OC耐药性H1N1分离株急剧增加和OC耐药性2009H1N1的大范围出现。通过结合竞争(RABC)分析进行的耐药性评估用于建立OC易感性评估用的原型“即时检验”测试。RABC分析原理通常可适用于高通量研究和病原菌对药物易感性的快速诊断。

制备生物素结合的扎那米韦(ZB)用于该研究(图1A，实施例)。生物素经连接部在7-OH位结合至扎那米韦来制备ZB，ZB可衍生化而不降低其对神经氨酸苷酶的抑制(D.M.Andrews等人,Eur.J.Med.Chem.34,563(1999)；T.Honda等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.12,1925(2002)；W.H.Wen等人,J.Med.Chem.52,4903(2009))。发现ZB抗神经氨酸苷酶的IC₅₀值为7.7nM，高于扎那米韦的IC₅₀值(2.1nM)。使用神经氨酸苷酶转染的细胞(图4)、流感感染的细胞(参见实施例)和固定的流感病毒(图1B)显示了ZB结合至流感神经氨酸酶。作为有效的神经氨酸酶抑制剂，羧酸奥司他韦(OC)可为ZB结合至流感病毒的有效竞争剂。

然而，预期对于ZB结合同样好的OC耐药性H274Y突变体，OC是不良的竞争剂。图1B示出了在滴度为10³-10⁵PFU的274H流感病毒测量中，OC对ZB结合的显著抑制(p<0.001)。在较高滴度274H病毒样品的OC竞争中观察到约3％的残余ZB结合。以此对照，在相同滴度下，在OC耐药性274YWSN病毒中未观察到竞争性OC对ZB结合的显著抑制。

使用转化的和流感感染的细胞显示了相同的观察(图11-14)。我们称该分析为通过结合竞争进行的耐药性评估，或简单表示为RABC。我们还示出了RABC分析允许在大于10％耐药性株含量下检测混合种群中的OC耐药性274Y突变体(图14)。

通过RABC分析确定2005-2009年收集的总共137个台湾季节性H1N1临床分离株的OC易感性。将病毒样品固定于抗H1N1涂布的微板孔内并且使用30nM ZB或30nM ZB和150nM OC以两次分析进行结合测试。将5％的残余ZB结合用作OC易感性测定的分界线。RABC分析结果提示了2008前(图8A)或2008年早期(图8B)收集的所有测试的季节性H1N1分离株是OC易感的。直至2008年中期才在台湾分离出OC耐药性H1N1(图8B)。2009年收集的50株季节性H1N1中48株评估为OC耐药性(图8C)。我们还检验了在台湾收集的大范围的2009年H1N1分离株的OC易感性。图8D示出了分离株##1-4和分离株##5-7分别为OC易感性病毒和OC耐药性病毒。7株病毒株的RABC分析以盲性实验进行，后来示出的结果与它们的OC易感性和随后结果一致。为使用RABC分析评价易感性预测，随机取出图8A-C中所记载的60株季节性H1N1样品分离株以分析它们的神经氨酸苷酶序列。通过RABC分析所有预测为OC敏感的样品都具有组氨酸，而预测为OC耐药性的病毒则在相应的神经氨酸苷酶残基274上具有酪氨酸(表2)。为寻找进化耐药性种群存在的可能性，我们仔细查看那些具有3-5％残余ZB结合数值的样品。来自这些样品的几个分离的病毒斑分析通过结合或序列分析没有鉴定出OC耐药性病毒。

表2列出了所有通过RABC分析测定其OC易感性的本研究所用的台湾临床H1N1分离株。随机选择60株病毒分离株以测定病毒神经氨酸苷酶的序列的氨基酸274(AA₂₇₄；命名为N2)。此外，利用快速分析在膜上测试几株样品用于测定OC易感性。所有分析结果未发现分歧，说明RABC用于OC易感性测定是可靠的。

表2.台湾季节性H1N1分离株的OC易感性测定

根据图8的结果将通过RABC分析测定的各流感分离株的OC易感性指定为R(耐药)或S(易感)，随机选几株分离株用于通过AA₂₇₄分析确认和(或)在膜上快速测试(括号内的数字对应于图8B中使用的样品数)。

即时检验分析

此处公开的是在膜上原型分析用于视觉评估流感病毒的OC易感状态。图9A示出经ZB处理的OC易感性H1N1(WSN)的染色被OC竞争封闭，而OC耐药性274Y WSN的染色抵制相同的竞争。使用膜上染色确认几株季节性和大范围的H1N1分离株的OC易感状态(图9B和9C)。直接固定于膜上的H1N1、H3N2、H5N1和流感B流感病毒也显示了敏感性ZB结合(图9D)。基于原型RABC的染色分析快速且不需要检测装置。可在就诊时将其作为“即时检验”分析使用，以对季节性H1N1或大范围的H1N1感染及时决定治疗方案。此外，该测试可用于区分流感病毒与其他呼吸感染，因为多数其他呼吸感染性病原菌没有神经氨酸苷酶。

RABC分析是简单而有效的方法并且在使用各种实验分析平台的不同流感病毒和感染细胞上得到证实。其原理可适用于其他病原菌靶以用于药物易感性评价。

实施例

下面给出根据本发明实施方案的示例性装置、仪器、方法和它们相关的结果，其并非出于限定本发明的范围的目的。请注意，为方便读者，实施例中将使用标题和副标题，其并非用于限定本发明的范围。而且，本文提出和公开了某些理论；然而，无论这些理论是否正确，它们绝不应该用于限定本发明的范围，只要根据本发明实施本发明，不考虑任何特定的理论和实施方式。

所有试剂均是商购可得的且除非另有说明，不用进一步纯化即可使用。所有溶剂均是无水级别的，除非另有说明。所有非水性反应均在烘干的玻璃器皿内略为正压的氩气下进行，除非另有说明。磁力搅拌反应并通过在凝胶上的薄层层析监测反应。在粒径为60-200μm的硅胶上完成快速柱色谱。对光谱纯化合物的产率进行记录。Electrothermal MEL-1101D熔点仪记录熔点且不作校正。Bruker AVANCE 600分光计记录¹H和¹³C NMR光谱。Bruker AVANCE 500分光计记录³¹P NMR光谱。以δ数值表示相对于四甲基硅烷(TMS)的化学位移；偶联常数J的单位是Hz。¹H-NMR光谱的内标物是CDCl₃(δ_H＝7.24),甲醇-d₄(δ_H＝3.31)或D₂O(δ_H＝4.79)，¹³C-NMR光谱的内标物是CDCl₃(δ_c＝77.0)或甲醇-d₄(δ_c＝49.15)，和³¹P-NMR光谱的内标物是D₂O中的H₃PO₄(δ_P＝0.00)。分裂模式记载为s(单峰),d(二重峰),t(三重峰),q(四重峰),m(多重峰),br(宽峰)和dd(双二重峰)。Thermo Nicolet 380FT-IR分光计记载IR光谱。Perkin-Elmer Model 341偏光计记载旋光。Bruker Daltonics分光计记载高分辨率ESI质谱。

实施例1：3-乙酰氨基-4,6-二乙酰氧基-2-(1,2,3-三乙酰氧基)丙基-3,4,5,6-四氢-2H-吡喃(3)。

在氮气氛下，在室温下将吡啶(75mL)和乙酸酐(75mL)中的N-乙酰神经氨糖酸(5g,16.2mmol)悬浮液搅拌12h，然后在100℃下加热5h。将反应混合物冷却至室温，在减压下浓缩。将残余的褐色玻璃状油溶解于CH₂Cl₂(150mL)中，连续用饱和的NaHCO₃水溶液(100mL)、1M HCl水溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤。用MgSO₄干燥有机层，过滤并浓缩。用柱色谱在硅胶上纯化(乙酸乙酯/己烷，67:33至100:0)褐色残余物从而得到为浅黄色泡沫的3(3.8g,50％)，其含有不可分离的端基异构体(anomer)混合物(α/β＝1:5)。3的端基异构体混合物在下一步骤中使用，不用进一步分离。C₂₀H₂₉NO₁₂；TLC(乙酸乙酯)R_f＝0.35；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ 6.26(0.83H,d,J＝2.5Hz,H-1β),5.62(0.17H,dd,J＝10.3,2.1Hz,H-1α),5.43(0.17H,ddd,J＝6.1,4.4,1.9Hz),5.29-5.27(1.66H,m),5.22(0.83H,td,J＝10.6,4.9Hz),5.17(0.83H,td,J＝6.5,2.7Hz),5.11-5.07(0.34H,m),5.03(0.17H,ddd,J＝6.5,2.7Hz),4.36(0.17H,dd,J＝12.5,2.6Hz),4.31(0.83H,dd,J＝12.5,2.8Hz),4.08-3.98(2.83H,m),3.74(0.17H,dd,J＝10.5,2.5Hz),2.17-2.15(0.17H,m),2.15-2.13(0.83H,m),2.11(2.49H,s),2.10(0.51H,s),2.09(0.51H,s),2.08(2.49H,s),2.07(0.51H,s),2.04(2.49H,s),2.03(0.51H,s),2.017(2.49H,s),2.013(0.51H,s),2.00(2.49H,s),2.00-1.98(0.83H,m),1.98-1.96(0.17H,m),1.88(2.49H,s),1.87(0.51H,s)。

实施例2：二乙基(5-乙酰氨基-4-乙酰氧基-6-(1,2,3-三乙酰氧基)丙基-3,4,5,6-四氢-2H-吡喃-2-基)膦酸酯(4)。

用三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐(TMSOTf,1.23mL,6.78mmol)在0℃下处理无水CH₂Cl₂(30mL)中的二乙基三甲基甲硅烷基亚磷酸盐(3.11mL,13.65mmol)和3(2.15g,4.52mmol)的端基异构体混合物。30min后，将混合物温热至室温，搅拌24h。将混合物倒入冰水(20mL)，用CH₂Cl₂(20mL,2×)提取水层。连续用饱和NaHCO₃水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤混合的提取物，用MgSO₄干燥，过滤和浓缩。用柱色谱在硅胶上纯化(丙酮/EtOAc,1:9)残余物得到呈无色浆的4(1.55g,62％)，其含有α-和β-端基异构体(2:3)的混合物。膦酸酯4的端基异构体混合物在下一步骤中使用，不用进一步分离。通过在硅胶上的快速柱层析(EtOAc/丙酮,100:0至90:10)获得纯α-和β-端基异构体(4α和4β)的分析样品。

α-端基异构体4α:C₂₂H₃₆NO₁₃P；无色泡沫；TLC(EtOAc/丙酮,9:1)R_f＝0.25；(α)_D ²⁰＝+39.4(c＝4.6,CH₂Cl₂)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ 5.30(1H,dd,J＝5.7,1.7Hz),5.24(1H,d,J＝9.9Hz,NH),5.18(1H,td,J＝6.6,2.5Hz),4.98(1H,td,J＝10.6,5.0Hz),4.40(1H,dd,J＝12.3,5.0Hz),4.22-4.09(5H,m),3.97(1H,q,J＝10.1Hz),3.74(1H,td,J＝12.5,2.4Hz),3.62(1H,dd,J＝10.3,2.0Hz),2.27(1H,dd,J＝12.8,4.9Hz),2.09(3H,s),2.05(3H,s),2.02(3H,s),2.01(3H,s),1.98-1.92(1H,m),1.87(3H,s),1.35-1.31(6H,m)；¹³CNMR(150MHz,CDCl₃)δ 170.9(C),170.5(C),170.3(C),170.2(C),170.1(C),79.0(CH,d,³J_c-p＝17.3Hz),71.8(CH,d,¹J_c-p＝174.6Hz,C-1),71.6(CH,d,³J_c-p＝20.9Hz),71.0(CH),67.9(CH),63.4(CH₂,d,²J_c-p＝6.9Hz,POCH₂),62.8(CH₂,d,²J_c-p＝6.2Hz,POCH₂),62.2(CH₂,C-8),49.6(CH,C-4),31.3(CH₂,C-2),23.1(CH₃),20.9(CH₃),20.8(CH₃),20.7(CH₃,2×),16.5(CH₃,d,³J_c-p＝5.4Hz,POCH₂ CH₃),16.3(CH₃,d,³J_c-p＝5.4Hz,POCH₂ CH₃)；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃)δ 18.48；HRMS计算得到C₂₂H₃₅NO₁₃P:552.1846,发现:m/z 552.1921(M-H)⁺。

β-c4β:C₂₂H₃₆NO₁₃P；无色泡沫；TLC(乙酸乙酯/丙酮,9:1)R_f＝0.28；(α)_D ²⁰＝-40.1(c＝3.0,CH₂Cl₂)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ 5.45(1H,d,J＝10.1Hz,NH),5.35(1H,dd,J＝7.3,2.3Hz),5.32(1H,td,J＝15.0,4.8Hz),5.21-5.18(1H,m),4.45(1H,d,J＝10.0Hz),4.33(1H,dd,J＝12.4,2.8Hz),4.30(1H,dd,J＝12.3,7.1Hz),4.19-4.13(2H,m),4.12-4.04(4H,m),2.35-2.31(1H,m),2.11(3H,s),2.08(3H,s),2.017(3H,s),2.011(3H,s),2.09-2.03(1H,m),1.88(3H,s),1.34(3H,t,J＝7.0Hz),1.33(3H,t,J＝7.0Hz)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ 170.8(C),170.6(C),170.2(C),170.1(C),169.8(C),74.0(CH),69.7(CH),69.5(CH),67.9(CH,d,¹J_c-p＝157.2Hz,C-1),67.7(CH),63.0(CH₂,d,²J_c-p＝7.2Hz,POCH₂),62.7(CH₂,d,²J_c-p＝6.6Hz,POCH₂),62.0(CH₂,C-8),49.0(CH,C-4),29.5(CH₂,d,²J_c-p＝3.2Hz,C-2),23.1(CH₃),21.0(CH₃),20.9(CH₃),20.7(CH₃,2×),16.2(CH₃,d,³J_c-p＝5.1Hz,POCH₂ CH₃),16.3(CH₃,d,³J_c-p＝5.1Hz,POCH₂ CH₃)；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃)δ 21.36；HRMS计算得到C₂₂H₃₅NO₁₃P:552.1846,发现:m/z 552.1879(M-H)⁺。

实施例3：二乙基(5-乙酰氨基-4-乙酰氧基-6-(1,2,3-三乙酰氧基)丙基-4,5,6-三氢吡喃-2-基)膦酸酯(5)。

将无水CH₂Cl₂(20mL)中的N-溴代琥珀酰亚胺(885mg,5mmol)和膦酸酯4(1.1g,2mmol)的端基异构体混合物在100W钨灯照射下回流加热。用TLC监测反应过程。完成(～6h)后，将混合物冷却至室温，将沉淀的琥珀酰亚胺过滤掉。在减压下蒸发滤出液从而得到为黄色浆的2-溴代衍生物粗品，其在下一步骤中使用，不用进一步纯化。

将上述制备的溴代化合物在无水吡啶(10mL)中的溶液在50℃下搅拌2h。在减压下浓缩溶液，用柱色谱在硅胶上纯化褐色残余物(EtOAc/丙酮，100:0至90:10)以得到为无色泡沫的结合的膦酸酯5(827mg,两步计75％)。C₂₂H₃₄NO₁₃P；TLC(EtOAc/丙酮,9:1)R_f＝0.28；(α)_D ²⁰＝+43.8(c＝0.59,CH₂Cl₂)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ 5.74(1H,dd,J＝10.7,2.2Hz),5.54(1H,d,J＝8.2Hz,NH),5.42-5.40(2H,m),5.26(1H,td,J＝6.4,2.9Hz),4.39-4.34(2H,m),4.29(1H,q,J＝9.1Hz),4.17-4.09(5H,m),2.09(3H,s),2.05(3H,s),2.04(3H,s),2.02(3H,s),1.91(3H,s),1.35(3H,t,J＝7.0Hz),1.31(3H,t,J＝7.0Hz)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ 170.8(C),170.4(C),170.3(C),169.8(C),169.7(C),147.8(C,d,¹J_c-p＝225Hz,C-1),113.0(CH,d,²J_c-p＝22.8Hz,C-2),76.5(CH,d,³J_c-p＝9.3Hz),69.9(CH),68.4(CH,d,³J_c-p＝15.2Hz),67.2(CH),63.2(CH₂,d,²J_c-p＝5.4Hz,POCH₂),63.0(CH₂,d,²J_c-p＝5.7Hz,POCH₂),61.8(CH₂,C-8),46.4(CH,C-4),23.0(CH₃),20.78(CH₃),20.73(CH₃),20.63(CH₃),20.60(CH₃),16.16(CH₃,d,³J_c-p＝4.8Hz,POCH₂CH₃),16.12(CH₃,d,³J_c-p＝4.8Hz,POCH₂ CH₃)；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃)δ 6.374；HRMS计算得到C₂₂H₃₃NO₁₃P:550.1690,发现:m/z 550.1684(M-H)⁺。

实施例4：二乙基(4-(1,2,3-三乙酰氧基)丙基-2-甲基-3a,7a-二氢-4H-吡喃并(3,4-d)噁唑-6-基)膦酸酯(6)

用浓H₂SO₄(0.2mL)处理在乙酸(2mL)和乙酸酐(2mL)混合物中的膦酸盐5(550mg,1mmol)溶液。在室温下搅拌混合物48h，倒入冷(0℃)饱和NaHCO₃水溶液(pH 9)中，在用EtOAc(30mL,5×)提取前搅拌30min。用MgSO₄干燥混合的提取物，在减压下过滤和浓缩。通过在硅胶上的柱色谱(丙酮/EtOAc,1:9)纯化残余油从而得到呈浅黄浆的6(394mg,两步计80％)。C₂₀H₃₀NO₁₁P；TLC(EtOAc/丙酮,9:1)R_f＝0.30；(α)_D ²⁰＝-11.6(c＝0.50,CH₂Cl₂)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ 6.20(1H,dd,J＝10.3,4.0Hz),5.58(1H,ddd,J＝6.6,2.9,1.1Hz),5.38(1H,td,J＝7.7,2.5Hz),4.71(1H,ddd,J＝8.6,4.0,2.0Hz),4.40(1H,dd,J＝12.4,2.5Hz),4.19(1H,dd,J＝12.5,5.9Hz),4.18-4.07(4H,m),3.93(1H,td,J＝9.2,0.6Hz),3.34(1H,dd,J＝10.1,2.7Hz),2.11(3H,s),2.04(3H,s),2.03(3H,s),1.98(3H,s),1.34(3H,t,J＝7.0Hz),1.32(3H,t,J＝7.0Hz)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ 170.5(C),169.7(C),169.4(C),167.2(C,N＝CCH₃),150.1(C,d,¹J_c-p＝225Hz,C-1),111.9(CH,d,²J_c-p＝23.4Hz,C-2),76.1(CH,d,³J_c-p＝6.3Hz),71.2(CH,d,³J_c-p＝15.3Hz),69.6(CH),68.8(CH),63.1(CH₂,d,²J_c-p＝5.9Hz,POCH₂),62.9(CH₂,d,²J_c-p＝5.7Hz,POCH₂),61.8(CH,C-4),61.6(CH₂,C-8),20.7(CH₃),20.6(CH₃),20.5(CH₃),16.2(CH₃,d,³J_c-p＝5.1Hz,POCH₂CH₃),16.1(CH₃,d,³J_c-p＝5.1Hz,POCH₂CH₃),14.0(CH₃,N＝CCH₃)；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃)δ 6.375；HRMS计算得到C₂₀H₂₉NO₁₁P:490.1478,发现:m/z 490.1374(M-H)⁺。

实施例5：二乙基(5-乙酰氨基-4-叠氮-6-(1,2,3-三乙酰氧基)丙基-4,5,6-三氢吡喃-2-基)膦酸酯(7)

用叠氮三甲基硅烷(0.53mL,4mmol)在80℃下处理噁唑啉6(393mg,0.8mmol)在t-BuOH(10mL)中的溶液24h。将溶液倒入饱和的NaHCO₃水溶液中，用EtOAc(30mL,3×)提取。用MgSO₄干燥混合的提取物，过滤和浓缩以得到为无色浆的叠氮化合物7(371mg,87％)，其特别纯从而用于下一步骤中。通过在硅胶上的快速柱层析(EtOAc中的10％丙酮)获得分析样品。C₂₀H₃₁N₄O₁₁P；TLC(EtOAc/丙酮,9:1)R_f＝0.30；(α)_D ²⁰＝+82.7(c＝0.58,CH₂Cl₂)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ 5.75(1H,dd,J＝10.3,2.4Hz),5.73(1H,d,J＝8.6Hz),5.38(1H,dt,J＝7.1,1.5Hz),5.26(1H,ddd,J＝8.5,5.8,2.6Hz),4.53-4.50(2H,m),4.36(1H,dd,J＝12.5,2.6Hz),4.17-4.08(5H,m),3.67(1H,q,J＝9.2Hz),2.10(3H,s),2.05(3H,s),2.02(3H,s),1.99(3H,s),1.34(3H,t,J＝7.1Hz),1.32(3H,t,J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ170.8(C),170.5(C),170.1(C),169.7(C),147.7(C,d,¹J_c-p＝224Hz,C-1),112.4(CH,d,²J_c-p＝22.9Hz,C-2),75.9(CH,d,³J_c-p＝9.2Hz),69.7(CH),67.3(CH),63.5(CH₂,d,²J_c-p＝5.7Hz,POCH₂),63.3(CH₂,d,²J_c-p＝5.9Hz,POCH₂),61.9(CH₂,C-8),57.8(CH,d,³J_c-p＝14.7Hz),48.5(CH,C-4),23.2(CH₃),20.8(CH₃),20.77(CH₃),20.71(CH₃),16.27(CH₃,d,³J_c-p＝5.7Hz,POCH₂CH₃),16.23(CH₃,d,³J_c-p＝5.7Hz,POCH₂ CH₃)。

实施例6：二乙基{5-乙酰氨基-4-(N²,N³-双(叔丁氧基羰基))胍基-6-(1,2,3-三乙酰氧基)丙基-4,5,6-三氢吡喃-2-基}膦酸酯(8)。

在氢气氛下用Lindlar催化剂(30mg)氢化乙醇(25mL)中的叠氮化物7(350mg,0.71mmol)的溶液。搅拌混合物5h，经硅藻土过滤，用乙醇洗涤。在减压下浓缩滤出液得到无色泡沫(278mg)。在无水CH₂Cl₂(30mL)中溶解胺产物粗品并用1,3-双(叔丁氧基羰基)-2-甲基异硫脲(247mg,0.85mmol)和三乙胺(230μL,1.7mmol)处理。将混合物冷却至0℃，并缓慢添加HgCl₂(231mg,0.85mmol)。将悬浮液温热至室温并搅拌12h。其后用EtOAc稀释混合物并经硅藻土过滤。浓缩滤出液并通过快速柱层析(EtOAc)纯化从而得到呈无色泡沫的胍8(442mg,83％产率)。TLC(EtOAc)R_f＝0.45；(α)_D ²⁰＝+18.5(c＝0.88,CH₂Cl₂)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ 11.32(1H,s),8.48(1H,d,J＝8.5Hz),6.12(1H,d,J＝8.5Hz),5.71(1H,dd,J＝10.3,2.0Hz),5.35(1H,d,J＝6.6Hz),5.23(1H,td,J＝6.5,2.7Hz),5.10-5.06(1H,m),4.37(1H,dd,J＝12.5,2.8Hz),4.25-4.20(2H,m),4.19-4.12(2H,m),4.12-4.05(3H,m),2.09(3H,s),2.06(3H,s),2.02(3H,s),1.85(3H,s),1.46(9H,s),1.45(9H,s),1.36(3H,t,J＝7.1Hz),1.31(3H,t,J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ171.0(C),170.5(C),170.1(C),169.8(C),162.7(C),157.2(C),152.6(C),147.4(C,d,¹J_c-p＝224Hz,C-1),114.2(CH,d,²J_c-p＝23.3Hz,C-2),83.9(C),79.8(C),77.9(CH,d,³J_c-p＝9.3Hz),70.1(CH),67.4(CH),63.4(CH₂,d,²J_c-p＝5.7Hz,POCH₂),63.0(CH₂,d,²J_c-p＝5.7Hz,POCH₂),62.1(CH₂,C-8),49.0(CH,d,³J_c-p＝15.2Hz),48.1(CH,C-4),28.2(CH₃,3×),28.0(CH₃,3×),23.1(CH₃),20.9(CH₃),20.8(CH₃),20.7(CH₃),16.29(CH₃,POCH₂CH₃),16.25(CH₃,POCH₂CH₃)；HRMS计算得到C₃₁H₅₀N₄O₁₅P(M⁺-H):749.3010,发现:m/z749.3172。

实施例7：(5-乙酰氨基-4-氨基-6-(1,2,3-羟基)丙基-4,5,6-三氢吡喃-2-基)膦酸(1a)。

用溴代三甲基硅烷(0.12mL,0.87mmol)处理0℃下的无水CH₂Cl₂(4mL)中的二乙基膦酸酯7(80mg,0.15mmol)溶液。在0℃下搅拌24h后，添加MeOH(2mL)，和在减压下浓缩混合物。在无水MeOH(5mL)中溶解残余物并用甲醇钠(MeOH中的5.4M溶液,0.9mL,4.86mmol)处理。室温下搅拌1h后，使混合物过滤通过Dowex 50WX8(H⁺型)，然后在减压下浓缩。在MeOH(5mL)中溶解残余物并在室温下在Lindlar’s催化剂(20mg)存在下进行氢化(1atm)。3h后，使混合物经硅藻土过滤，并用MeOH冲洗。浓缩滤出液，并用Et₂O(3×10mL)洗涤残余固体从而得到膦酸酯1a。

实施例8：(5-乙酰氨基-4-胍基-6-(1,2,3-羟基)丙基-4,5,6-三氢吡喃-2-基)膦酸(1b)。

在0℃下用溴代三甲基硅烷(0.13mL,0.94mmol)处理无水CH₂Cl₂(4mL)中的二乙基膦酸酯8(130mg,0.17mmol)溶液，并在0℃下搅拌反应混合物24h。在强力搅拌下添加MeOH(2mL)。30min后，在减压下蒸发溶液并用甲醇中的5.4M甲醇钠溶液(1mL,5.4mmol)处理无水MeOH(5mL)中的残余物溶液。在室温下搅拌1h后，使溶液经Dowex 50WX8(H⁺型)过滤并进行冻干。用Et₂O(3×20mL)洗涤残余的浅黄色固体从而得到呈白色固体的膦酸酯1b。

实施例9：(5-乙酰氨基-4-氨基-6-(1,2,3-羟基)丙基-4,5,6-三氢吡喃-2-基)膦酸酯单乙酯(1c)。

在氩气氛下，将PMe₃(1.4mL,THF中1.4M)溶液在0℃下逐滴添加到无水THF(5mL)中的叠氮化物7(148mg,0.28mmol)溶液中。在室温下搅拌混合物19h。添加三乙胺(0.5mL)和H₂O(0.5mL)，并搅拌混合物另一个30min。在减压下浓缩混合物，通过硅胶柱色谱(MeOH/CH₂Cl₂,6:94至10:90)将其纯化从而得到胺产物(112mg,79％产率)。

将胺产物(110mg,0.22mmol)溶解在EtOH(2mL)中，逐滴添加NaOEt(490μL,EtOH中2.68M)溶液。搅拌混合物2天并用TLC监测。在通过Dowex50W树脂中和后，在减压下浓缩滤出液，并用硅胶柱色谱(n-PrOH/H₂O,7:3)处理。收集适当的组份并在减压下浓缩。用1M HCl(2mL)处理残余物，然后真空浓缩从而得到膦酸盐单酯1c(50mg,60％产率)。C₁₂H₂₃N₂O₈P:¹H NMR(600MHz,D₂O)δ 5.48(1H,dd,J＝9.4,7.6Hz),4.38–4.33(2H,m),4.18–4.17(1H,m),3.98–3.93(2H,m),3.91–3.86(2H,m),3.69–3.64(2H,m),2.07(3H,s),1.26(3H,t,J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz,D₂O)δ 174.7,153.3(d,¹J_C–P＝208.8Hz),104.3(d,²J_C–P＝22.5Hz),75.4(d,³J_C–P＝8.0Hz),69.6,67.6,62.9,62.2(d,²J_C–P＝5.1Hz),49.9(d,³J_C–P＝13.4Hz),45.8,22.1,15.8(d,³J_C–P＝5.7Hz)；HRMS计算得到C₁₂H₂₂N₂O₈P:353.1108,发现:m/z 353.1198[M–H]^–。

实施例10：(5-乙酰氨基-4-胍基-6-(1,2,3-羟基)丙基-4,5,6-三氢吡喃-2-基)膦酸单乙酯(1d)

将化合物8(52mg,0.07mmol)溶解于EtOH(1mL)中并逐滴添加NaOEt(209μL,EtOH中2.68M)溶液。搅拌混合物4天并用TLC监测。用Dowex 50W树脂中和后，在减压下浓缩滤出液，并用硅胶柱色谱(n-PrOH/H₂O,8:2)处理。收集适当的组份并在减压下浓缩。用1M HCl(2mL)处理残余物，然后真空浓缩从而得到膦酸酯单酯1d(9mg,30％产率)。C₁₃H₂₅N₄O₈P:¹H NMR(600MHz,D₂O)δ 5.41(1H,dd,J＝9.4,7.5Hz),4.42–4.40(1H,m),4.35(1H,d,J＝10.6Hz),4.21(1H,t,J＝9.9Hz),3.97–3.93(2H,m),3.90–3.85(2H,m),3.67–3.62(2H,m),2.01(3H,s),1.25(3H,t,J＝7.1Hz)；¹³C NMR(150MHz,D₂O)δ 174.3,156.9,151.3(d,¹J_C–P＝211.2Hz),108.2(d,²J_C–P＝21.6Hz),75.8,(d,³J_C–P＝8.6Hz),69.7,67.9,62.9,62.1(d,²J_C–P＝4.8Hz),50.9(d,³J_C–P＝13.7Hz),47.8,21.9,15.8(d,³J_C–P＝5.7Hz)。

实施例11：扎那米韦生物素结合物的合成

图3示出了扎那米韦-生物素结合物9的合成。在三乙胺和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)存在下通过使生物素(10)与5-叠氮-1-戊胺缩合来制备叠氮附加(azide-annexed)的生物素衍生物11(J.W.Lee,S.I.Jun,K.Kim,Tetrahedron Lett.42,2709(2001))。另一方面，使根据已知步骤(M.Chandler等人,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1:1173(1995)；L.Ying,J.Gervay-Hague,ChemBioChem 6,1857(2005))由唾液酸制备的扎那米韦p-硝基苯碳酸酯12与炔丙胺偶联得到具有炔基铰链(alkynyl hinge)的扎那米韦衍生物13(W.-H.Wen等人,J.Med.Chem.52,4903(2009))。在混合溶剂CH₂Cl₂/H₂O(1:1)中进行随后的带有叠氮基的生物素衍生物11与炔基扎那米韦衍生物13之间的1,3-偶极加成(链接反应；V.V.Rostovtsev等人,Angew.Chem.,Int.Ed.41,2596(2002)；B.-Y.Lee等人,Tetrahedron Lett.47,5105(2006))从而在去除保护基后得到总产率为88％的所需的扎那米韦-生物素结合物9。

实施例12：生物素衍生物11。

在室温下强力搅拌由1,5-二溴代戊烷与NaN3的取代反应制备的PPh₃(5.0g,19.1mmol)与1,5-二叠氮戊烷(3.36g,21.8mmol)的溶液以及EtOAc/Et₂O(v/v＝1:1,35mL)中的5％HCl水溶液(22mL)24h，得到5-叠氮-1-戊胺1(1.60g,59％)(J.W.Lee,S.I.Jun,K.Kim,Tetrahedron Lett.42,2709(2001).)。

在室温下搅拌生物素样品(10,136mg,0.56mmol)与5-叠氮-1-戊胺(11,86mg,0.69mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP,360mg,0.69mmol)和三乙胺(0.116mL,0.84mol)在DMF(5mL)中的溶液3h。混合物在减压下浓缩，并用H₂O洗涤。通过硅胶色谱(CH₂Cl₂/MeOH＝15:1)纯化残余物从而得到带有叠氮基的生物素衍生物11(180mg,92％)。C15H26N6O2S；无色固体,mp 121-122℃；[α]19D+87.6(c 0.0275,甲醇)；IRνmax(纯样品)3297,2924,2100,1698,1647cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(1H,t,J＝5.2Hz),6.40(1H,s),6.34(1H,s),4.30-4.27,(1H,m),4.12-4.09(1H,m),3.29(2H,t,J＝6.8Hz),3.10-3.05(1H,m),3.03-2.98(2H,m),2,80(1H,dd,J＝12.4,5.2Hz),2.56(1H,d,J＝12.4Hz),2.03(2H,t,J＝7.2Hz),1.64-1.22(12H,m)；¹³CNMR(100MHz,DMSO)δ171.5,162.4,61.0,59.1,55.4,50.6,39.8,38.1,35.2,28.7,28.3,28.1,28.0,25.4,23.6；ESI–HRMS计算得到C₁₅H₂₇N₆O₂S:355.1916,发现:m/z 355.1913[M+H]⁺.

实施例13：扎那米韦-生物素结合物9。

在室温下搅拌带有叠氮基的生物素衍生物11(100mg,0.28mol)溶液和铰接有炔基(alkynyl-hinged)的扎那米韦衍生物13(188mg,0.28mmol)与CuSO₄.5H₂O(10mg,0.04mmol)和抗坏血酸钠(25mg,0.13mmol)在CH₂Cl₂/H₂O(6mL,v/v＝1:1)中的溶液8h。用CH₂Cl₂提取水层。合并有机层，用MgSO₄干燥，过滤，和通过在减压下旋转蒸发进行浓缩。通过柱色谱纯化残余物(CH₂Cl₂/MeOH＝20:1至10:1)从而得到含有保护基的扎那米韦-生物素结合物(270mg,95％)。C₄₅H₇₁N₁₁O₁₄S；TLC(CH₂Cl₂/甲醇＝9:1)R_f＝0.29；无色固体,mp 157-158℃；[α]²² _D+16.6(c 0.5,CH₂Cl₂)；IRν_max(纯样品)2930,1727,1689,1643,1612cm^-1；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 11.37(1H,s),8.20(1H,d,J＝7.6Hz),8.04(1H,d,J＝9.2Hz),7.95(1H,s),7.76-7.70(2H,m),6.40(1H,s),6.33(1H,s),5.81(1H,d,J＝2.0Hz),5.17(1H,d,J＝5.6Hz),4.79(1H,t,J＝7.6Hz),4.36(1H,d,J＝11.6Hz),4.30-4.21(4H,m),4.15-4.10(3H,m),4.04-3.97(2H,m),3.86(1H,dd,J＝8.8,5.6Hz),3.71(3H,s),3.10-3.05(1H,m),3.00-2.95(2H,m),2.80(1H,dd,J＝12.4,5.2Hz),2.56(1H,d,J＝12.4Hz),2.02(2H,t,J＝7.2Hz),1.80-1.77(2H,m),1.74(3H,s),1.64-1.19(10H,m),1.45(9H,s),1.39(9H,s),1.25(6H,s)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ 173.0,170.7,163.7,162.8,161.8,156.7,155.6,152.4,145.4,144.6,122.9,110.1,108.6,83.6,79.6,77.5,77.2,75.1,69.9,65.7,61.9,60.2,55.8,53.5,52.5,50.0,49.5,47.4,40.6,38.9,37.0,35.8,29.6,28.6,28.3(3×),28.1(3×),26.5,25.6,25.5,23.5,23.2；ESI–HRMS计算得到C₄₅H₇₂N₁₁O₁₄S:1022.4981,发现:m/z 1022.4986[M+H]⁺。

在室温下在甲醇(1mL)中用NaOH水溶液(1M,1mL)处理保护的扎那米韦-生物素结合物样品(34mg,0.033mmol)15min。用Dowex 50W×8(H⁺)中和混合物，过滤，并在减压下浓缩。然后残余物在室温下在CH₂Cl₂(1mL)中与三氟乙酸(TFA,1mL)一起搅拌1.5h。在减压下蒸发混合物，并在室温下添加H₂O(1mL)。搅拌10min后，在减压下浓缩混合物，并通过在SephadexG-10柱(洗提液:水中的0.1％TFA)上的色谱纯化从而得到所需的扎那米韦-生物素衍生物9(24mg,93％)。C₃₁H₄₉N₁₁O₁₀S；无色固体,mp 170-172℃；IRν_max(纯样品)3355,2937,1675cm^-1；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.92(1H,s),5.96(1H,s),4.98(1H,d,J＝8.4Hz),4.61-4.57(2H,m),4.47-4.39(5H,m),4.33-4.29(1H,m),4.16(1H,t,J＝9.2Hz),4.06-4.04(1H,m),3.65(1H,d,J＝9.6Hz),3.47(1H,dd,J＝6.4,12.0Hz),3.31(1H,m),3.20-3.10(2H,m),2.98(1H,dd,J＝4.8,13.2Hz),2.77(1H,d,J＝13.2Hz),2.22(2H,t,J＝7.2Hz),1.97(3H,s),1.93-1.90(2H,m),1.73-1.51(6H,m),1.38-1.22(4H,m)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ 176.4,173.8,165.3,164.9,162.9(CO₂of TFA,q,J＝35.0Hz),157.0,156.5,124.1,116.5(CF₃of TFA,q,J＝288.1Hz),109.1,75.9,70.2,69.0,62.6,62.4,60.5,55.7,51.3,50.8,47.4,40.0,39.2,36.0,35.8,29.4,29.3,28.2,28.1,28.0,25.5,23.3,22.2；ESI–HRMS计算得到C₃₁H₅₀N₁₁O₁₀S:768.3463,发现:m/z 768.3458[M+H]⁺。

实施例14:化合物14

向碳酸酯12(0.25g,0.33mmol)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP,60mg,0.50mmol)在吡啶(2mL)中的溶液添加胺H₂N(CH₂CH₂O)₃CH₂CH₂N₃(0.14g,0.66mmol)。在N₂气氛下室温下搅拌混合物40h，然后用HCl(10mL 1M水溶液)和EtOAc(50mL)提取。用盐水(30mL)和饱和的NaHCO₃(水溶液)(30mL)洗涤有机层，用MgSO₄干燥，并在减压下浓缩。通过柱色谱纯化残余物(硅胶，EtOAc/己烷＝1:1)从而得到氨基甲酸酯14(0.2g,74％)。C₃₅H₅₈N₈O₁₅；¹HNMR(CDCl3,600MHz)δ 11.41(1H,s),8.45(1H,d,J＝9Hz),6.08(1H,d,J＝9Hz),5.91(1H,s),5.45(1H,t,J＝6Hz),5.26(1H,t,J＝10Hz),5.22(1H,d,J＝6Hz),4.41(1H,d,J＝9Hz),4.38(1H,q,J＝10,6Hz),4.10–4.14(2H,m),3.81(3H,s),3.60–3.77(12H,m),3.56–3.57(1H,m),3.41(2H,t,J＝5Hz),3.37(2H,d,J＝5Hz),1.92(3H,s),1.50(18H,s),1.41(3H,s),1.37(3H,s)；13C NMR(CDCl3)δ170.6,163.0,161.9,156.9,155.6,152.7,145.2,132.1,132.0,131.9,128.5,128.4,109.8,108.9,83.6,79.6,77.4,74.5,70.6,70.5,70.2,70.0,69.7,66.0,60.4,52.4,50.6,48.7,48.3,41.0,28.2,28.0,26.6,25.4,23.1；ESI–HRMS计算得到C35H59N8O15:831.4100,发现:m/z 831.4134[M+H]⁺。

实施例15：扎那米韦-FITC结合物15。

向乙醇(1mL)中的叠氮化物14(80mg,0.096mmol)溶液添加Pd(OH)₂(9mg,0.058mmol)。混合物在H₂气氛下室温下搅拌1.5h，然后通过用MeOH洗提经硅藻土过滤。在减压下浓缩混合物从而得到胺产物(66mg)。C₃₅H₆₀N₆O₁₅；¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 11.36(1H,s).8.40(1H,d,J＝8Hz),6.18(1H,d,J＝9Hz),6.04(1H,s),5.87(1H,s),5.17–5.22(2H,m),4.32–4.39(2H,m),3.98–4.10(3H,m),3.75(3H,s),3.55–3.72(12H,m),3.31(4H,s),2.89(1H,s),2.73(1H,d,J＝7Hz),1.88(3H,s),1.45(18H,s),1.36(3H,s),1.32(3H,s)。

在N₂气氛下，将荧光素硫氰酸盐(FITC,37mg,0.095mmol)添加到上述制备的胺化合物在无水THF(1mL)的溶液中。在室温下搅拌混合物4h，在减压下浓缩，并通过柱色谱(硅胶，CH₂Cl₂/MeOH＝92:8)纯化从而得到结合产物(50mg,52％)。C₅₆H₇₁N₇O₂₀S；¹H NMR(MeOD,600MHz)δ 7.80(1H,s),7.56–7.59(2H,m),7.48(1H,t,J＝8Hz),7.17(1H,d,J＝8Hz),7.09(1H,d,J＝8Hz),6.63(2H,s),6.56(2H,d,J＝9Hz),6.48–6.51(3H,m),5.86(1H,d,J＝8Hz),4.30(1H,t,J＝10Hz),4.12–4.23(2H,m),4.07–4.10(2H,m),3.96–4.06(2H,m),3.93(1H,t,J＝8Hz),3.60–3.77(15H,m),3.44–3.58(4H,m),3.16–3.24(2H,m),1.82(3H,s),1.40–1.42(18H,m),1.32(3H,s),1.30(3H,s)。

用NaOH(1mL 1M水溶液)处理上述制备的FITC结合物(47mg,0.039mmol)在MeOH(1.5mL)中的溶液。在室温下搅拌混合物1h，用Dowex 50w×8(H⁺)中和，并过滤。浓缩滤出液，并在CH₂Cl₂(1mL)中用三氟乙酸(TFA,1mL)处理残余物。搅拌混合物1h，在减压下浓缩，并通过在Sephadex G-10柱上色谱(洗提液:H₂O中的0.1％TFA)纯化从而得到所需的扎那米韦-FITC结合物15(10mg,56％)。C₃₈H₄₁N₇O₁₄S；¹H NMR(MeOD,600MHz)δ 8.31(1H,s),7.88(1H,d,J＝8Hz),7.48–7.57(3H,m),7.30(1H,s),7.36(1H,s),7.13(2H,d,J＝9Hz),6.00(1H,s),4.30–4.32(1H,m),4.10–4.12(2H,m),3.81–3.97(2H,m),3.58–3.80(14H,m),3.13–3.28(3H,m),1.80(3H,s)。

实施例16：扎那米韦-FITC结合物17。

向炔13(87mg,0.13mmol)和10-叠氮癸胺(30mg,0.16mmol)在t-BuOH(1mL)和H₂O(1mL)中的溶液添加CuSO₄·5H₂O(4mg,0.016mmol)、抗坏血酸钠(18mg,0.091mmol)和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA,8mg,0.04mmol)。在室温下搅拌混合物12h，然后用CH₂Cl₂(30mL)和H₂O(30mL)提取。用MgSO₄干燥有机层，在减压下浓缩，并通过柱色谱(硅胶，CH₂Cl₂/MeOH＝9:1)纯化从而得到化合物16(53mg,50％)。C₄₀H₆₇N₉O₁₂；黄色固体,mp＝116℃ ¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 11.38(1H,s),8.43(1H,d,J＝8Hz),7.84(1H,br s),5.88(1H,d,J＝14Hz),5.11–5.28(2H,m),4.33–4.45(6H,m),4.18(1H,s),4.08(1H,s),3.99(1H,s),3.76(3H,s),1.89(3H,s),1.31(18H,s),1.23(22H,s)。

向上述制备的胺(0.1g,0.115mmol)在THF(1mL)和MeOH(2mL)中的溶液添加FITC(45mg,0.115mmol)和二异丙基乙基胺(0.038mL)。在室温下搅拌混合物20h，然后在减压下浓缩从而得到呈红色固体的结合产物。在室温下用NaOH(1mL的1M水性溶液)搅拌上述制备的结合化合物在MeOH(1mL)中的溶液1h，通过Dowex 50w×8(H⁺)中和，并过滤。浓缩后，使残余物溶解在CH₂Cl₂(1mL)和TFA(1mL)中。在室温下搅拌混合物30min，在减压下浓缩，并通过在Sephadex G-10柱上的色谱(洗提液:H₂O中的0.1％TFA)纯化从而得到所需的扎那米韦-FITC结合物17(50mg,43％)。C₄₇H₅₆N₁₀O₁₃S；黄色固体,mp＝112℃；¹H NMR(d-MeOD,600MHz)δ 8.13(1H,d,J＝7Hz),7.63–7.67(4H,m),7.55–7.58(3H,m),6.89(1H,d,J＝7Hz),4.54(1H,br s),4.31–4.38(2H,m),4.17(1H,s),4.00(1H,br s),3.58–3.68(12H,m),3.56(2H,t,J＝5Hz),3.42–3.47(2H,m),2.00(3H,s),1.70–1.72(4H,m),1.18–1.36(12H,m)；ESI–HRMS计算得到C₄₇H₅₇N₁₀O₁₃S:1001.3827；发现:m/z 1001.3768[M+H]⁺。

实施例17：零流感-生物素结合物的合成。

图4示出了零流感-生物素结合物24的合成。根据以前报道的步骤制备碘化物化合物18[Shie,J.-J.,等人,Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,5788.]。通过PCl₃与两当量的4-(三甲基甲硅烷基)丁-3-炔-1-醇的取代反应制备二[4-(三甲基甲硅烷基)丁-3-炔-1-基]二烷基亚磷酸盐17。18与亚磷酸酯19的膦酰化通过Pd(PPh₃)₄的催化实现从而得到64％产率的膦酸酯20。去除Boc基团后，用N,N'-二-(Boc-N"-三氟甲磺酰胍处理胺中间体，其后用KF去除三甲基甲硅烷基，从而得到化合物21。21与5-叠氮戊胺的链接反应，其后用KOH处理，得到膦酸酯单酯(phophonate monoester)22。20与生物素-Osu(23)的偶联反应在去除保护的Boc基团后最终产生所需的零流感-生物素结合物24。

实施例18：化合物20。

通过用氮鼓泡10min使无水甲苯(2.1mL)中的碘18(100mg,0.21mmol)、亚磷酸酯19(85mg,0.26mmol)和二异丙基乙基胺(100mg,0.64mmol)的混合物去氧化，然后添加置于在氮气氛下圆底烧瓶中的四(三苯基膦)钯(0)(10mg,8.6μmol)。所得溶液逐渐加热至90℃并保持该温度12h。使反应混合物通过硅藻土过滤，并在减压下蒸发滤出液从而得到黄色泡沫(110mg)，通过在硅胶柱上的快速柱色谱[EtOAc/己烷＝1:1至EtOAc]纯化从而得到膦酸酯20(92mg,64％)。C₃₂H₅₇N₄O₉P；黄色油；TLC(EtOAc/己烷,1:1)R_f＝0.29；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 6.59(1Η，d,J＝22.0Hz)，5.85(1Η，d,J＝9.2Hz)，5.04(1Η，d,J＝9.2Hz),3.97-4.11(5H,m),3.89(1H,br),3.75-3.81(1H,m),3.29-3.32(1H,m),2.57-2.61(1H,m),2.59(4H,t,J＝1.2Hz),2.20(1H,td,J＝10.0,3.2Hz),2.00(3H,s),1.43-1.51(4H,m),1.39(9H,s),0.83-0.88(6H,m),0.07-0.21(18H,m)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ170.2,155.6,142.1,127.2,101.2,87.0,82.2(2×),79.7,76.0,63.7(2×),54.8,49.3,49.1,31.4,28.6(3×),26.4,25.9,23.7,22.6,22.5,10.1,9.9,0.5(6×)；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 18.0。

实施例19：化合物21

在冰浴中将膦酸酯20(92mg,0.14mmol)在无水CH₂Cl₂(1.0mL)中的溶液冷却至0℃，添加三氟乙酸(0.16mL,2.1mmol)。在室温下搅拌混合物1h，在减压下浓缩，然后在无水CH₂Cl₂(1.0mL)中溶解。添加N,N'-二-Boc-N"-三氟甲磺酰胍(67mg,0.21mmol)和三乙胺(0.06mL,0.41mmol)。在室温下搅拌混合物3h，用1M HCl(5mL)和CH₂Cl₂(5mL×3)提取。用MgSO₄干燥有机层，过滤，浓缩，并通过在硅胶柱上的快速柱色谱(EtOAc/己烷＝1:1)纯化从而得到胍衍生物。

向胍化合物在MeOH/H₂O(1.2mL/1.2mL,v/v)中的溶液添加KF(71mg,1.2mmol)。在室温下搅拌混合物24h，然后在减压下浓缩。用CH₂Cl₂(5mL×3)和H₂O(5mL)提取混合物。用MgSO₄干燥有机层，过滤，浓缩，并通过在硅胶柱上的快速柱色谱(EtOAc/己烷＝1:1)纯化从而得到化合物21(63mg,69％)。C₃₂H₅₁N₄O₉P；无色油；TLC(EtOAc/己烷,1:1)R_f＝0.24；[α]_D ²²＝-27.47(c＝1,CH₂Cl₂)；IR(膜)ν_max 3450,2923,2018,1925,1870,1720,1626,1342,1249,1203；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 11.34(1H,s),8.56(1H,d,J＝8.0Hz),6.66(1H,d,J＝22.4Hz),6.28(1H,d,J＝9.2Hz),4.34-4.40(1H,m),4.06-4.16(5H,m),3.96-4.04(1H,m),3.29-3.33(1H,m),2.65-2.71(1H,m),2.59-2.61(4H,m),2.26-2.40(1H,m),2.03(1H,s),2.00(1H,s),1.90(3H,s),1.00-1.78(22H,m),0.83-0.90(6H,m)；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 18.0；HRMS计算得到C₃₂H₅₂N₄O₉P:667.3472,发现:m/z 667.3450[M+H]⁺。

实施例20：零流感-生物素结合物24

向5-叠氮-1-戊胺叠氮化物(46mg,0.36mmol)和化合物19(120mg,0.18mmol)在t-BuOH/H₂O(0.6mL,v/v＝1:1)中的溶液添加六氟磷酸四乙腈铜(I)。在室温下搅拌混合物12h，通过减压浓缩，并且用MeOH/H₂O(1:9至9:1)洗提通过RP-18反相柱纯化。将三唑化合物粗产物溶解在1,4-二噁烷(1.0mL)中，并添加1M KOH_(aq)(1.0mL)。在25℃下搅拌溶液120h(通过¹H NMR监测)，并添加Dowex 50W×8以中和溶液。过滤和在减压下浓缩混合物。将粗产物(10mg,0.013mmol)溶解在无水DMF(0.1mL)中，并添加生物素-OSu(4.5mg,0.013mmol)和二异丙基乙基胺(4.2mg,0.026mmol)。在室温下搅拌混合物3h，并在减压下浓缩。将残余物溶解在MeOH(0.5mL)中，在冰浴中冷却至0℃，并添加三氟乙酸(0.16mL,2.1mmol)。在室温下搅拌混合物1h，在减压下浓缩，并通过用MeOH/H₂O(1:9至9:1)洗提在RP-18反相柱上纯化从而得到标题化合物(40mg,30％总产率)。C₃₃H₅₇N₁₀O₇PS；黄色固体；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.89(1Η，s),6.39(1H,d,J＝19.6Hz),4.90(1H,t,J＝5.2Hz),4.38(1H,t,J＝7.2Hz),4.29-4.32(1H,m),4.00(2H,m),3.77-3.90(2H,m),3.40-3.48(2H,m),3.15-3.26(2H,m),3.00(1H,t,J＝5.2Hz),2.91-2.95(2H,m),2.71(1H,d,J＝12.8Hz),2.53-2.62(2H,m),2.23(2H,t,J＝7.2Hz),1.90-2.03(5H,m),1.29-1.79(16H,m),0.86-0.97(6H,m)；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 13.6；HRMS负模式计算得到C₃₃H₅₆N₁₀O₇PS:768.3723,发现:m/z 768.3723[M–H]^–。

实施例21：化合物25

向二(5-叠氮戊基)胺(0.12g,0.49mmol)在无水DMF(5mL)中的溶液添加生物素(0.12g,0.41mmol)、PyBOP(0.25g,0.49mmol)和三乙胺(0.23mL,1.64mmol)。混合物在氩下室温下搅拌22h，然后在减压下浓缩。通过柱色谱(硅胶，CH₂Cl₂/甲醇＝13:1)纯化残余物从而得到生物素-二叠氮化物化合物25(0.15g,79％)。C₂₀H₃₅N₉O₂S；浅黄色油；¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 4.48(dd,J＝7,5Hz,1H),4.29(dd,J＝7,5Hz,1H),3.28(t,J＝7Hz,4H),3.25(t,J＝7Hz,4H),3.20(t,J＝7Hz,2H),2.89(dd,J＝12,5Hz,1H),2.71(d,J＝12Hz,1H),2.29(t,J＝7Hz,2H),1.84(br s,3H),1.50–1.67(m,8H),1.43–1.44(m,2H),1.32–1.38(m,4H)；¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ 172.4,163.2,61.8,60.1,55.3,51.2,47.0,46.2,45.6,40.5,32.5,28.7,28.6,28.3,27.3,26.4,25.1,24.1.ESI–HRMS计算得到C₂₀H₃₆N₉O₂S:466.2707,发现:m/z 466.2703[M+H]⁺。

实施例22：二扎那米韦-生物素结合物26

向生物素-二叠氮化物25(36mg,0.075mmol)在t-BuOH(1mL)和H₂O(1mL)中的溶液添加CuSO₄·5H₂O(4mg,0.015mmol)、抗坏血酸钠(10mg,0.045mmol)和TBTA(8mg,0.015mmol)。搅拌混合物5min，并添加铰接有炔基的扎那米韦衍生物13(0.1g,0.15mmol)。混合物在室温下搅拌12h，用CH₂Cl₂(20mL)和H₂O(20mL)提取，用MgSO₄干燥，并在减压下浓缩。通过柱色谱(硅胶，CH₂Cl₂/MeOH＝9.5:1)纯化残余物从而得到偶联产物(64mg,47％)。¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 1.22(s,12H),1.30(s,36H),1.62(s,4H),1.79(s,2H),1.89(s,3H),1.94(s,3H),2.23(t,J＝7Hz,2H),2.74(d,J＝12Hz,1H),2.88(d,J＝12Hz,1H),3.10-3.16(m,4H),3.23(s,2H)3.75(s,6H),3.98(t,J＝7Hz,2H),4.06(t,J＝8Hz,2H),4.15(t,J＝10Hz,2H),4.28-4.43(m,14H),5.16(s,2H),5.23(t,J＝6Hz,2H),5.35(s,1H),5.70(s,1H),5.86(d,J＝8Hz,2H),6.04(s,1H),6.28(s,1H),6.54(d,J＝9Hz,1H),6.63(d,J＝9Hz,1H),7.79(s,2H),8.42(d,J＝8Hz,2H),11.38(s,2H)。

在室温下使MeOH(1mL)中的上述制备的偶联产物(60mg,0.033mmol)与NaOH(1mL的1M水性溶液)一起搅拌1h，用Dowex 50W×8(H⁺)中和，并过滤。浓缩后，将残余物溶解在CH₂Cl₂(1mL)和TFA(1mL)中。混合物在室温下搅拌1h，在减压下浓缩，并通过在Sephadex G-10柱上的色谱(洗提液:H₂O中的0.1％TFA)纯化从而得到二扎那米韦-生物素结合物26(50mg,43％)。C₅₂H₈₁N₁₉O₁₈S；¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ 1.29–1.33(m,6H),1.45(br s,2H),1.56–1.61(m,8H),1.75(br s,1H),1.84–1.87(m,1H),1.97–2.04(m,12H),2.36(br s,2H),2.73(d,J＝12Hz,1H),2.94(d,J＝12Hz,1H),3.51(br s,2H),3.65(d,J＝10Hz,2H),3.69(s,2H),3.78(s,4H),4.00(br s,2H),4.19(br s,2H),4.37–4.45(m,11H),4.55(br s,4H),4.68(d,J＝8Hz,4H),5.91(s,2H),7.57(s,1H),8.05(s,2H)；ESI–HRMS计算得到C₅₂H₈₂N₁₉O₁₈S:1292.5800,发现:m/z 1292.5916[M+H]⁺。

实施例23：细胞、病毒和生物试剂

MDCK和293T细胞以及两种流感病毒：甲型/Aichi/2/68(H3N2)和乙型/Lee/40均分别从ATCC(Manassas,VA,USA)获得。流感病毒甲型/WSN/1933(H1N1)、甲型/乌隆/307/1972(H3N2)、甲型/PR/8/1934(H1N1)、甲型/台湾/3446/2002(H3N2)、乙型流感/台湾/7064/2004分离株从Shin-Ru Shih博士的实验室(长庚大学,台湾)获得，甲型/越南/1194/2004RG14(H5N1)、甲型/加利福尼亚/7/2009(H1N1)、甲型/布里斯班/10/2007(H1N1)和甲型/布里斯班/10/2007(H3N2)从Jia-Tsrong Jan博士的实验室(基因组研究中心,中央研究院,台湾)获得。奥司他韦耐药性WSN突变体是用浓度逐渐增加的OC(羧酸奥司他韦)通过在MDCK细胞中的6次传代选出。该流感突变体株在1μM OC存在下生长很好且通过序列分析确认在其NA基因上携带单点突变H274Y。其他台湾临床H1N1分离株是从疾病控制中心的流感保藏中心(台北，台湾)获得的并记载在表1中。7株S-OIV分离株也是从疾病控制中心(台北，台湾)获得的且编号为#1(甲型/台湾/T1941/2009)、#2(甲型/台湾/T1338/2009)、#3(甲型/台湾/T1339/2009)、#4(甲型/台湾/6662/2009)、#5(甲型/台湾/6663/2009)、#6(甲型/台湾/7717/2009)和#7(甲型/台湾/7855/2009)。流感NP的抗体和荧光素标记的第二抗体分别购自Chemicon Inc.(Billerica,MA,USA)和Sigma(St.Louis,MO,USA)。抗WSN兔抗体是以灭活的WSN流感为抗原在实验室中制备而得。抗HA抗体(Abcam,Cambridge,MA,USA)购自InterlabLtd.(台北，台湾)。

实施例24:使用表达神经氨酸酶的细胞建立OC易感性实验

对扎那米韦和ZB的神经氨酸酶抑制活性进行比较，发现尽管比IC₅₀为2nM的扎那米韦的活性略低，但IC₅₀为7nM的ZB仍然是非常有效的神经氨酸酶抑制剂。在细胞表面表达的功能性神经氨酸酶可作为ZB结合和OC竞争的模型体系用于OC易感性评估。将甲型/河内/30408/2005(H5N1)的神经氨酸酶的cDNA克隆到表达质粒内并用其转染293T细胞以用于表达野生型(274H)神经氨酸酶。发现所表达的神经氨酸酶主要位于细胞表面，从而可以使用ZB进行结合和标记(图10)。对神经氨酸酶cDNA进行诱变以表达OC耐药性274Y突变体酶。使用野生型和诱变的cDNA来生成稳定的293T细胞系以分别表达274H和274Y神经氨酸酶。将这两种细胞以不同比例的混合物与ZB或ZB加上过量的OC一起温育，然后用结合有APC的链霉亲和素修饰，以通过流式细胞分析测定结合ZB的细胞群。图11显示ZB以相似程度结合表达274H和274Y的细胞。在过量OC存在下，ZB结合在表达274H神经氨酸酶的细胞中被完全阻断，然而ZB与表达274Y的细胞的结合几乎没有改变(图12)。这些结果证明，通过OC竞争ZB结合可用于区分OC敏感性和OC耐药性神经氨酸酶。

实施例25：使用流感病毒感染的细胞测定OC易感性

使用表达NA的细胞得到的对ZB结合的OC竞争性抑制结果促使我们确定ZB和OC浓度以评价流感病毒的OC易感性。使用不同的ZB和OC浓度，利用感染了OC易感性或OC耐药性WSN病毒的MDCK细胞测试OC易感性评估的可行性。图13A示出了针对流感病毒感染的MDCK细胞的ZB结合的OC竞争。通过用10或50nM ZB标记流感感染的细胞，可从OC浓度为标记ZB浓度的0.5-10倍下与OC的竞争结合推出感染病毒的OC易感性。例如，通过使用30nM的标记ZB和150nM的竞争性OC处理感染的细胞，观察到OC易感性与OC耐药性WSN变体之间的明显区别(图13B)。

用野生型(274H)或OC耐药性(274Y)WSN病毒感染MDCK细胞。在感染后的16-20小时，用30nM ZB或30nM ZB加上150nM OC处理所感染的细胞。用链霉亲和素-FITC修饰所产生的细胞，洗涤并使用荧光显微镜观察。对于流式细胞术研究，标记有ZB的细胞用抗NP抗体进一步标记，用胰蛋白酶消化，然后用结合有PE的链霉亲和素和标记有DyLight-649的抗兔二抗(两者均购自Jackson ImmunoResearch实验室，West Grove,PA,USA)处理。在进一步洗涤后，通过BD Biosciences的FACSCanto(San Jose,CA,USA)分析细胞。为了分析更多样品，通过使用底部透明的黑色96孔微板培养感染的细胞而建立了高通量方法。在感染后16-20小时，细胞用30nM ZB或30nMZB加上150nM OC标记，洗涤，并用PE-链霉亲和素处理。然后用Isocyte^TM分子设备激光扫描平台(Mountain View,CA,USA)在488nm下扫描该板。

实施例26：使用固定的流感样品评估OC耐药性含量

参考图7B如示，使用微孔中的固定病毒的RABC实验可用于OC易感性测定。使用固定病毒的RABC实验还可估测由OC易感性和OC耐药性病毒构成的混合群中OC耐药性突变体的含量。将总病毒含量为每孔10³、10⁴和10⁵PFU的不同比例274H与274Y WSN病毒的病毒样品固定，以测量OC耐药性的ZB结合作为OC耐药性含量的估测。图14显示所估测的OC耐药性含量与含量高于10％的实验性274Y病毒含量很好地匹配。对于含有少于10％耐药性病毒的混合群，观察到耐药性含量估测过高，这可能是由于使用高滴度病毒样品时实验中的背景结合较高。

用抗HA抗体(Abcam)以每孔150ng过夜包被来自Greiner Bio-One(Frickenhausen,德国)的高结合96孔微板655061，然后使用含3％BSA的PBS进行印迹。用30nM ZB或30nM ZB加上150nM OC处理流感样品30min并添加至用抗体包被的孔中。温育30min后，用含3％BSA的PBS洗涤微孔，添加结合有碱性磷酸酶的链霉亲和素持续30min，用含BSA的PBS再次洗涤，然后根据产品说明书添加发光底物Emerald-II^TM(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。使用来自Perkin Elmer的Envision(Waltham,MA,USA)读取RLU(相对发光单位)。将百分相对耐药性计算为通过在OC存在下计算的ZB结合的RLU除以在不存在OC竞争下计算的ZB结合的总RLU而得到的百分数。

实施例27：流感神经氨酸酶序列的测定

使用在Taipei Pharma(台北，台湾)购买的来自Roche Diagnostics的高纯病毒RNA试剂盒从流感病毒中提取总RNA。使用随机六聚体和Toyobo LifeScience Department(东京，日本)的MMLV RTase反转录RNA样品，用于合成cDNA，使用200nM的两条引物5’-tggtcagcaagtgcwtgccatg和5’-gacactggaccacaactgcct通过PCR扩增所述cDNA。纯化DNA产物并将其用于测定NA序列。

实施例28：在膜上快速检测流感病毒的OC易感性

将固定在Bio-Rad Inc.(Bio-Rad,CA,USA)的Bio-Dot SF上的PVDF膜用甲醇润湿并通过抽吸在每个缝隙中添加1μg抗HA抗体(Abcam)。通过抽吸将之前用30nM ZB或30nM ZB加上150nM OC处理1小时的流感病毒样品引入相邻的缝隙。使用含3％BSA的PBS对膜进行印迹，然后根据产品说明书用来自KPL(Gaithersburg,MD,USA)的结合有碱性磷酸酶的链霉亲和素温育所述膜。使用含3％BSA的PBS进一步洗涤后，添加作为碱性磷酸酶底物的Amresco Inc.(Solon,OH,USA)的Amresco E116溶液用于显色。通常在2分钟内显示肉眼可见的颜色并用图像记录。

实施例29：稳定表达重组的野生型(274H)和OC耐药性(274Y)神经氨酸酶的293T细胞的制备

使用由甲型流感/河内/30408/2005(H5N1)导出的神经氨酸酶基因的cDNA序列(GeneBank:AB239126.1)由Geneart(Regensburg,德国)合成该基因并克隆到pCDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的BamH1和XhoI限制性位点内，形成pCDNA3.1-NA。使用Agilent Technology(La Jolla,CA,USA)的XL定点突变试剂盒修饰NA基因以产生H274Y的OC耐药性NA突变体，所用引物如下：5'-gCTggACgCTCCCAACTACCACTACgAggAgTg-3'和5'-gTAgTTgggAgCgTCCAgCTCCACggAC-3。通过序列分析证实了野生型(274H)和OC耐药性突变体(274Y)NA基因。这些NA基因用于野生型和OC耐药性神经氨酸酶的瞬间NA表达。它们还被克隆到Clontech(Mountain View,CA,USA)的pRetro-IRES-GFP载体中，分别形成pRetro-NA(274H)-IRES-GFP和pRetro-NA(274Y)-IRES-GFP。使用这两种质粒和pGagPol制备重组逆转录病毒，并使用pVSVG转导293T细胞。通过荧光活化细胞分选仪选出表达GFP大于95％的群的稳定细胞系，并证实OC易感性或OC耐药性神经氨酸酶的合成。

本说明书中引用的所有公开物和专利申请均整体引入本文作为参考，如同各单独的公开物或专利申请均具体而独立地表明引入本文作为参考。

尽管出于清楚理解的目的已经通过例示和实施例详细描述了本发明，但是本领域普通技术人员显然知道，根据本发明的教导，可以对本发明做出某些改变和变化，而不偏离所附权利要求的精神和范围。

Claims (15)

1.一种用于测定奥司他韦耐药性流感病毒存在的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供疑似包括奥司他韦耐药性流感病毒或病毒颗粒的样品；

(b)在存在和不存在羧酸奥司他韦(OC)的情况下，使所述样品与含有流感神经氨酸酶识别单位(R)的结合分子接触；和

(c)测定存在和不存在奥司他韦的情况下，结合分子与所述流感病毒或病毒颗粒在结合上的差别；

其中，在奥司他韦存在下，相比于接触奥司他韦敏感型流感病毒对照时识别单位(R)结合水平的降低，如所述样品未出现结合水平的降低，表明该样品中存在奥司他韦耐药性流感病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述奥司他韦耐药性流感病毒包括神经氨酸酶(NA)蛋白的氨基酸位点274的突变。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流感突变体对神经氨酸酶抑制剂药物有耐药性，但是对本发明所述的识别单位(R)仍具敏感性。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述含流感病毒的样品选自以下组成的组：粘液、唾液、呼吸分泌物、洗喉液、洗鼻液、脊髓液、痰、尿、精液、汗、粪、血浆、血、支气管肺泡液、阴道液、泪液和组织活检。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述识别单位(R)与所述流感病毒的结合受同时与羧酸奥司他韦结合的竞争性抑制。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述识别单位(R)选自扎那米韦、或零流感胍单酯、或磷杂扎那米韦或其单酯、和它们的盐、酯和衍生物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述识别单位(R)偶联至可检测的传感单元(S)。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述识别单位(R)通过连接部(L)偶联至所述传感单元，以使所述结合分子具有R-L-S结构。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述连接部(L)选自脂肪族链、三唑、水溶性连接部和乙二醇连接部。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述传感单元是可检测部分，其选自荧光标记、金标记、酶标记、放射性标记、量子点标记、生物素-抗生物素蛋白类标记和蛋白标记。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述荧光标记选自以下组成的组：荧光素、BODIPY、Alexa Fluor、Cy3、Cy5、Oregon Green、四甲基若丹明、若丹明红、德克萨斯红、吡啶基噁唑、苯并噁二唑衍生物、NBD卤化物、碘代乙酰胺类、SBD；莹黄、碘代乙酰胺；芪、香豆素、萘、氮丙啶、dapoxyl、芘、bimanes、呫吨、花青、芘、酞菁染料、藻胆蛋白、方酸菁染料、能量转移染料组合，和它们的衍生物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述R-L-S分子选自以下化合物：

BM 1：扎那米韦-(三唑连接部)-生物素

BM 2：扎那米韦-(三唑连接部)-荧光素

BM 3：扎那米韦-(乙二醇连接部)-生物素

其中，x＝1至4，

BM 4：扎那米韦-(乙二醇连接部)-荧光素

BM 5：(零流感胍)-(脂肪族链连接部)-生物素

其中，x＝1至4，

BM 6：(零流感胍)-(乙二醇连接部)-荧光素

BM 7：磷杂扎那米韦-(三唑连接部)-生物素

BM 8：磷杂扎那米韦-(乙二醇连接部)-荧光素

BM 9：(磷杂扎那米韦单酯)-(乙二醇连接部)-生物素

其中，x＝1至4，和

BM 10：(磷杂扎那米韦单酯)-(乙二醇连接部)-荧光素

其中，x＝1至4。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，R是磷杂扎那米韦或其衍生物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，竞争性结合羧酸奥司他韦的化合物R是式(I)化合物，

其中，A是PO(OR)(OR⁵)，其中，R和R⁵独立地选自H、C1-C10烷基、芳基、芳烷基和X，其中，X是阳性抗衡离子，其选自由如下组成的组：铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、四甲基铵、乙醇铵、二环己铵、胍、乙二铵阳离子、锂阳离子、钠阳离子、钾阳离子、铯阳离子、铍阳离子、镁阳离子、钙阳离子和锌阳离子，其中，B是NHR⁶、NH₃ ⁺Y^–、R⁶N(C＝NH)NH₂或R⁶N(C＝NH₂ ⁺)NH₂Y^–，其中，R⁶表示氢、C1-C10烷基、芳基、或芳烷基、其中，Y^–是阴性抗衡离子，其选自由如下组成的组：氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根离子、三氟乙酸根离子、磷酸根离子、二磷酸根离子、硝酸根离子、硫酸根离子、苯磺酸根离子、苯甲酸根离子、水杨酸根离子、羟萘酸根离子、延胡索酸根离子、马来酸根离子、乳酸根离子、苹果酸根离子、琥珀酸根离子、酒石酸根离子、柠檬酸根离子、谷氨酸根离子、葡糖酸根离子和硬脂酸根离子，其中，R¹是CH₃或CF₃；其中，R²是H、C1-C10烷基或O＝C-NHR⁷，其中，R⁷表示连有功能性部分如生物素、荧光团和抗炎剂的连接部，且其中，R³和R⁴独立为氢、C1-C10烷基或O＝C-R⁸，其中其中R⁸表示C1-C10烷基、芳基、或芳烷基。

15.根据权利要求13所述的方法，其中竞争性结合羧酸奥司他韦的化合物R是选自以下化合物或其衍生物：