CN112679535A - 小分子pad4抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了分子PAD4抑制剂及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明采用两种官能团对氨基酸骨架进行修饰，一种是具有低极性、强荧光特点的NBD‑Cl，以其修饰氨基酸骨架的N端，可用于亚细胞成像，此外，由于其相对体积较小，缺乏反应正交性，对生物体自身生化反应干扰小；另一种是具有肿瘤靶向性的PBA，可以通过识别糖蛋白的顺式二醇单元与细胞膜结合，这种PBA/顺式二醇相互作用，还可以通过调节pH值或加入竞争分子来调控形成的动态共价键，实现可控的自组装系统。本发明的小分子PAD4抑制剂具有良好口服活性，且对小鼠肿瘤生长和转移具有抑制作用，同时对大鼠动脉血栓具有治疗作用。

Description

小分子PAD4抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及小分子PAD4抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

近些年来，人们在与癌症的斗争中取得了显著的进步，但它仍然是人们目前面临的极其严峻的公共卫生挑战。

组蛋白的翻译后修饰(PTM)是表观遗传调控的标志。研究表明，表观遗传修饰剂对肿瘤抑制基因的沉默，是肿瘤发生过程中的早期事件。在过去的几十年间，针对组蛋白脱乙酰基酶和DNA甲基转移酶的抗癌药物的批准，突出了表观遗传学在人类疾病中的重要作用，并表明控制基因表达的因素可作为新型药物靶标。肽基精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)就是这样一种靶标，因为它对基因表达的作用与组蛋白脱乙酰基酶类似。PAD4作为一种转录共调节剂，可催化蛋白质中特定精氨酸残基向瓜氨酸的钙依赖性转化。在癌症中，PAD4不仅是抑癌蛋白p53的转录共抑制因子，还参与介导恶性肿瘤的形成。由于其在细胞信号传导途径和疾病发病机理中的调控作用，PAD4已成为多种疾病的潜在治疗靶标。因此，PAD4抑制剂的开发变得非常重要。

基于PAD4的小分子底物N-苯甲酰-L-精氨酰胺(BAA)，研究者们已经开发出多种有效且不可逆的卤乙脒类PAD4抑制剂，但仍存在缺乏口服活性以及生物利用度差、活性不理想的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小分子PAD4抑制剂及其制备方法和应用，本发明提供的小分子PAD4抑制剂具有良好口服活性、肿瘤靶向性和生物利用度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种小分子PAD4抑制剂，具有式I所示结构：

所述式I中，当R₁为

时，R₂为

当R₁为

时，R₂为

本发明提供了上述技术方案所述小分子PAD4抑制剂的制备方法，其中，

(a)当R₁为

R₂为

时，所述制备方法包括以下步骤：

将第一反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第一活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第一缩合反应，得到第一中间产物；

将所述第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第一水解反应，得到第二中间产物；

将第二反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第二活化，之后将所得活化体系与所述第二中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第二缩合反应，得到第三中间产物；

将所述第三中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第一氢解反应，得到第四中间产物；

将所述第四中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第一取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第一反应原料、第一中间产物、第二中间产物、第三中间产物和第四中间产物的结构式依次如下：

所述第二反应原料为3-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、3-羧基-4-氟苯硼酸、3-羧基-5-氟苯硼酸、5-羧基-2-氟苯硼酸或3-羧基-2-氟苯硼酸；

(b)当R₁为

R₂为

时，所述制备方法包括以下步骤：

将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第三活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第三缩合反应，得到第五中间产物；

将所述第五中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第二氢解反应，得到第六中间产物；

将所述3-羧基-5-硝基苯硼酸溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第四活化，之后将所得活化体系与第六中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第四缩合反应，得到第七中间产物；

将所述第七中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第二水解反应，得到第八中间产物；

将所述第八中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第二取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第三反应原料、第五中间产物、第六中间产物、第七中间产物和第八中间产物的结构式依次如下：

(c)当R₁为

R₂为

时，所述制备方法包括以下步骤：

将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第四反应原料混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第三取代反应，得到第九中间产物；

将所述第九中间产物溶解于甲醇中，采用NaOH水溶液将所得混合液的pH值调节至11.5～12.5，进行皂化反应，得到第十中间产物；

将所述第十中间产物溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第五活化，之后将所得活化体系与第五反应原料混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第五缩合反应，得到第十一中间产物；

将所述第十一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第三水解反应，得到第十二中间产物；

将所述第十二中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第四取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第四反应原料、第九中间产物、第十中间产物、第十一中间产物和第十二中间产物的结构式依次如下：

所述第五反应原料为(3-氨基甲基苯基)硼酸、(2-氨基甲基苯基)硼酸或(4-氨基甲基苯基)硼酸。

优选地，所述(a)中，所述第一活化在冰浴条件下进行，所述第一活化的时间为8～12min；所述第一缩合反应在室温条件下进行，所述第一缩合反应的时间为7～9h；

所述第一水解反应在冰浴条件下进行，所述第一水解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第二活化在冰浴条件下进行，所述第二活化的时间为8～12min；所述第二缩合反应在室温条件下进行，所述第二缩合反应的时间为7～9h；

所述第一氢解反应在室温条件下进行，所述第一氢解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第一取代反应在室温条件下进行，所述第一取代反应的时间为7～9h。

优选地，所述(b)中，所述第三活化在冰浴条件下进行，所述第三活化的时间为8～12min；所述第三缩合反应在室温条件下进行，所述第三缩合反应的时间为7～9h；

所述第二氢解反应在室温条件下进行，所述第二氢解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第四活化在冰浴条件下进行，所述第四活化的时间为8～12min；所述第四缩合反应在室温条件下进行，所述第四缩合反应的时间为7～9h；

所述第二水解反应在冰浴条件下进行，所述第二水解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第二取代反应在室温条件下进行，所述第二取代反应的时间为7～9h。

优选地，所述(c)中，所述第三取代反应在室温、避光条件下进行，所述第三取代反应的时间为7～9h；

所述皂化反应在冰浴、避光条件下进行，所述皂化反应的时间为3.5～4.5h；

所述第五活化在冰浴条件下进行，所述第五活化的时间为8～12min；所述第五缩合反应在室温条件下进行，所述第五缩合反应的时间为7～9h；

所述第三水解反应在冰浴条件下进行，所述第三水解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第四取代反应在室温条件下进行，所述第四取代反应的时间为7～9h。

本发明提供了上述技术方案所述小分子PAD4抑制剂在制备抗肿瘤药物或抗血栓药物中的应用。

优选地，所述抗肿瘤药物和抗血栓药物的剂型包括冻干粉。

优选地，所述抗肿瘤药物包括抗肿瘤生长药物或抗肿瘤转移药物。

优选地，所述肿瘤包括肉瘤、肺癌、结肠癌或乳腺癌。

本发明提供了一种具有式I所示结构的小分子PAD4抑制剂，本发明以卤乙脒类PAD4抑制剂的骨架为主体，保留氯乙脒弹头的部分，并选用两种主要的官能团对氨基酸骨架进行修饰，具体的，一种是具有低极性、强荧光特点的4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(NBD-Cl)，以其修饰氨基酸骨架的N端，可用于亚细胞成像，此外，由于其相对体积较小，缺乏反应正交性，对生物体自身生化反应干扰小；另一种是具有肿瘤靶向性的苯硼酸(PBA)，可以通过识别糖蛋白的顺式二醇单元与细胞膜结合，这种PBA/顺式二醇相互作用，还可以通过调节pH值或加入竞争分子来调控形成的动态共价键，实现可控的自组装系统。本发明提供的小分子PAD4抑制剂具有良好口服活性，且对小鼠肿瘤生长和转移具有抑制作用，同时对大鼠动脉血栓具有治疗作用，在制备抗肿瘤药物和抗血栓药物中的应用前景广阔。

附图说明

图1为化合物ZD-E-10对A549的单细胞克隆实验结果图；

图2为鸟氨酸骨架化合物在小鼠S180肉瘤模型中的抗肿瘤活性结果图；

图3为鸟氨酸骨架化合物的小鼠脏体比统计图；

图4为化合物ZD-E-10(6k)的血清生化指标统计图；

图5为不同时间点条件下化合物在小鼠各脏器的分布图；

图6为化合物ZD-E-1、ZD-E-2和ZD-E-10的免疫荧光染色结果图；

图7为化合物ZD-E-1、ZD-E-2和ZD-E-10的蛋白印迹结果图；

图8为化合物ZD-E-1、ZD-E-2、ZD-E-10和YW3-56抑制4T1细胞迁移活性结果图；

图9为4T1荷瘤小鼠瘤重及瘤体积统计变化图；

图10为小鼠肿瘤免疫荧光染色观察中性粒细胞外陷阱(NETs)形成情况图；

图11为小鼠肺切片HE染色情况图；

图12为化合物的纳米自组装性质表征图。

具体实施方式

本发明提供了一种小分子PAD4抑制剂，具有式I所示结构：

所述式I中，当R₁为

时，R₂为

当R₁为

时，R₂为

本发明中小分子PAD4抑制剂的结构以及对应的简称具体如表1所示：

表1本发明提供的小分子PAD4抑制剂的结构以及对应的简称

本发明提供了上述技术方案所述小分子PAD4抑制剂的制备方法，具体根据式I中R₁和R₂的种类采用不同制备方法，下面详细说明。

在本发明中，若无特殊说明，所用原料为本领域技术人员熟知的市售商品。

在本发明中，当R₁为

R₂为

时，所述小分子PAD4抑制剂的制备方法包括以下步骤：

将第一反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第一活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第一缩合反应，得到第一中间产物；

将所述第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第一水解反应，得到第二中间产物；

将第二反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第二活化，之后将所得活化体系与所述第二中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第二缩合反应，得到第三中间产物；

将所述第三中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第一氢解反应，得到第四中间产物；

将所述第四中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第一取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第一反应原料、第一中间产物、第二中间产物、第三中间产物和第四中间产物的结构式依次如下：

所述第二反应原料为3-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、3-羧基-4-氟苯硼酸、3-羧基-5-氟苯硼酸、5-羧基-2-氟苯硼酸或3-羧基-2-氟苯硼酸；

反应路线如下所示：

本发明将第一反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第一活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第一缩合反应，得到第一中间产物。在本发明中，所述第一反应原料(简写为Boc-Orn(Z)-OH)与苄胺的用量比优选为10mmol：(1.5～1.7)mL，所述第一反应原料、四氢呋喃(THF)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)的用量比优选为10mmol：(90～110)mL：(11～13)mmol：(11～13)mmol。在本发明中，所述第一活化优选在冰浴条件下进行，所述第一活化的时间优选为8～12min。在本发明中，所述第一缩合反应的温度优选为室温，时间优选为7～9h。所述第一缩合反应后，本发明优选将所得产物体系进行减压过滤，并用乙酸乙酯(EA)润洗滤饼，滤液减压浓缩至干，除去THF，残留物用EA溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至分液漏斗中，依次用饱和NaHCO₃溶液萃洗、饱和NaCl溶液萃洗、5wt％KHSO₄溶液萃洗、饱和NaCl溶液萃洗、饱和NaHCO₃溶液萃洗、饱和NaCl溶液萃洗，观察到EA层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将EA层用无水Na₂SO₄干燥后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化，得到第一中间产物。

得到第一中间产物后，本发明将所述第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第一水解反应，得到第二中间产物。在本发明中，所述HCl的乙酸乙酯溶液中HCl的浓度优选为1.8～2.2mol/L；所述第一中间产物、乙酸乙酯和HCl的乙酸乙酯溶液的用量比优选为9.8mmol：(4.8～5.5)mL：(18～22)mL。在本发明中，所述第一水解反应优选在冰浴条件下进行，所述第一水解反应的时间优选为2.5～3.5h。所述第一水解反应后，本发明优选将在37℃温水浴搅拌条件下，将所得产物体系进行减压抽干，残留物用干燥EA复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到第二中间产物。

得到第二中间产物后，本发明将第二反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第二活化，之后将所得活化体系与所述第二中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第二缩合反应，得到第三中间产物。在本发明中，所述第二反应原料与第二中间产物的摩尔比优选为5：(5.8～6.2)，所述第二反应原料、四氢呋喃、1-羟基苯并三唑和二环己基碳二亚胺的用量比优选为5mmol：(45～55)mL：(5.5～6.5)mmol：(11～13)mmol。在本发明中，所述第二活化条件的可选范围优选与第一活化条件的可选范围一致，所述第二缩合反应的可选范围优选与第一缩合反应条件的可选范围一致，所述第二缩合反应后的后处理方式优选与第一缩合反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

得到第三中间产物后，将所述第三中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第一氢解反应，得到第四中间产物。在本发明中，所述第三中间产物、甲醇和钯碳(Pd/C)的用量比优选为(3.1～4.7)mmol：(45～55)mL：(0.160～0.245)g。在本发明中，所述第一氢解反应的温度优选为室温，所述第一氢解反应的时间优选为2.5～3.5h。所述第一氢解反应后，本发明优选将所得产物体系进行常压过滤，以除去钯碳，滤液减压浓缩至干，得到第四中间产物。

得到第四中间产物后，本发明将所述第四中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第一取代反应，得到小分子PAD4抑制剂。在本发明中，所述第四中间产物与2-氯乙酰亚胺基乙酯的摩尔比优选为1：(4.5～5.5)；所述第四中间产物与甲醇的用量比优选为(1～3.2)mmol：(45～55)mL。在本发明中，所述第一取代反应的温度优选为室温，时间优选为7～9h。所述第一取代反应结束后，本发明优选将所得产物体系经C18硅胶柱层析分离纯化，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥除水，得到小分子PAD4抑制剂。

在本发明中，当R₁为

R₂为

时，所述小分子PAD4抑制剂的制备方法包括以下步骤：

将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第三活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第三缩合反应，得到第五中间产物；

将所述第五中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第二氢解反应，得到第六中间产物；

将所述3-羧基-5-硝基苯硼酸溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第四活化，之后将所得活化体系与第六中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第四缩合反应，得到第七中间产物；

将所述第七中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第二水解反应，得到第八中间产物；

将所述第八中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第二取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第三反应原料、第五中间产物、第六中间产物、第七中间产物和第八中间产物的结构式依次如下：

反应路线如下所示：

本发明将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第三活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第三缩合反应，得到第五中间产物。在本发明中，所述第三反应原料(简写为Z-Orn(Boc)-OH)与苄胺的用量比优选为10mmol：(1.5～1.7)mL，所述第三反应原料、四氢呋喃、1-羟基苯并三唑和二环己基碳二亚胺的用量比优选为10mmol：(90～110)mL：(11～13)mmol：(11～13)mmol。在本发明中，所述第三活化条件的可选范围优选与第一活化条件的可选范围一致，所述第三缩合反应条件的可选范围优选与第一缩合反应条件的可选范围一致，所述第三缩合反应后的后处理方式优选与第一缩合反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

得到第五中间产物后，本发明将所述第五中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第二氢解反应，得到第六中间产物。在本发明中，所述第六中间产物、甲醇和钯碳＝的用量比优选为(3.1～4.7)mmol：(45～55)mL：(0.160～0.245)g。在本发明中，所述第二氢解反应条件的可选范围优选与第一氢解反应条件的可选范围一致，所述第二氢解反应后的后处理方式优选与第一氢解反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

得到第六中间产物后，本发明将所述3-羧基-5-硝基苯硼酸溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第四活化，之后将所得活化体系与第六中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第四缩合反应，得到第七中间产物。在本发明中，所述3-羧基-5-硝基苯硼酸与第六中间产物的摩尔比优选为5：(5.5～6.5)，所述3-羧基-5-硝基苯硼酸、四氢呋喃、1-羟基苯并三唑和二环己基碳二亚胺的用量比优选为5mmol：(45～55)mL：(5.5～6.5)mmol：(5.5～6.5)mmol。在本发明中，所述第四活化条件的可选范围优选与第一活化条件的可选范围一致，所述第四缩合反应条件的可选范围优选与第一缩合反应条件的可选范围一致，所述第四缩合反应后的后处理方式优选与第一缩合反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

得到第七中间产物后，本发明将所述第七中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第二水解反应，得到第八中间产物。在本发明中，所述HCl的乙酸乙酯溶液中HCl的浓度优选为1.8～2.2mol/L；所述第七中间产物、乙酸乙酯和HCl的乙酸乙酯溶液的用量比优选为3.2mmol：(4.8～5.5)mL：(18～22)mL。在本发明中，所述第二水解反应条件的可选范围优选与第一水解反应条件的可选范围一致，所述第二水解反应后的后处理方式优选与第一水解反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

得到第八中间产物后，本发明将所述第八中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第二取代反应，得到小分子PAD4抑制剂。在本发明中，所述第八中间产物与2-氯乙酰亚胺基乙酯的摩尔比优选为1：(4.5～5.5)；所述第八中间产物与甲醇的用量比优选为(1～3.2)mmol：(45～55)mL。在本发明中，所述第二取代反应条件的可选范围优选与第一取代反应条件的可选范围一致，所述第二取代反应后的后处理方式优选与第一取代反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

在本发明中，当R₁为

R₂为

时，所述小分子PAD4抑制剂的制备方法包括以下步骤：

将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第四反应原料混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第三取代反应，得到第九中间产物；

将所述第九中间产物溶解于甲醇中，采用NaOH水溶液将所得混合液的pH值调节至11.5～12.5，进行皂化反应，得到第十中间产物；

将所述第十中间产物溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第五活化，之后将所得活化体系与第五反应原料混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第五缩合反应，得到第十一中间产物；

将所述第十一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第三水解反应，得到第十二中间产物；

将所述第十二中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第四取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第四反应原料、第九中间产物、第十中间产物、第十一中间产物和第十二中间产物的结构式依次如下：

所述第五反应原料为(3-氨基甲基苯基)硼酸、(2-氨基甲基苯基)硼酸或(4-氨基甲基苯基)硼酸；

反应路线如下所示：

本发明将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第四反应原料混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第三取代反应，得到第九中间产物。在本发明中，所述4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(NBD-Cl)与第四反应原料的摩尔比优选为5：(5.5～6.5)，所述4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑与甲醇的用量比优选为5mmol：(90～110)mL。在本发明中，所述第三取代反应优选在室温、避光条件下进行，所述第三取代反应的时间优选为7～9h。所述第三取代反应后，本发明优选将所得产物体系经中压制备柱分离纯化，得到第九中间产物。

得到第九中间产物后，本发明将所述第九中间产物溶解于甲醇中，采用NaOH水溶液将所得混合液的pH值调节至11.5～12.5，进行皂化反应，得到第十中间产物。在本发明中，所述第九中间产物与甲醇的用量比优选为3.7mmol：(25～35)mL。在本发明中，所述皂化反应优选在冰浴、避光条件下进行，所述皂化反应的时间优选为3.5～4.5h。所述皂化反应后，本发明优选在冰浴搅拌条件下，用饱和KHSO₄溶液调节所得产物体系的pH值至中性，减压浓缩除去甲醇，残留物用饱和KHSO₄溶液调节pH值至2；将溶液转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取，将所得有机相用饱和NaCl溶液萃洗；将萃洗后的有机相用无水Na₂SO₄干燥后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩，得到第十中间产物。

得到第十中间产物后，本发明将所述第十中间产物溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第五活化，之后将所得活化体系与第五反应原料混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第五缩合反应，得到第十一中间产物。在本发明中，在本发明中，所述第十中间产物与第五反应原料的摩尔比优选为3：(3～4)，所述第十中间产物、四氢呋喃、1-羟基苯并三唑和二环己基碳二亚胺的用量比优选为3mmol：(45～55)mL：(3～4)mmol：(3～4)mmol。在本发明中，所述第五活化条件的可选范围优选与第一活化条件的可选范围一致，所述第五缩合反应条件的可选范围优选与第一缩合反应条件的可选范围一致，所述第五缩合反应后的后处理方式优选与第一缩合反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

得到第十一中间产物后，本发明将所述第十一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第三水解反应，得到第十二中间产物。在本发明中，在本发明中，所述HCl的乙酸乙酯溶液中HCl的浓度优选为1.8～2.2mol/L；所述第十一中间产物、乙酸乙酯和HCl的乙酸乙酯溶液的用量比优选为(1.6～2.5)mmol：(4.5～5.5)mL：(10～15)mL。在本发明中，所述第三水解反应条件的可选范围优选与第一水解反应条件的可选范围一致，所述第三水解反应后的后处理方式优选与第一水解反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

得到第十二中间产物后，本发明将所述第十二中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第四取代反应，得到小分子PAD4抑制剂。在本发明中，所述第十二中间产物与2-氯乙酰亚胺基乙酯的摩尔比优选为1：(4.5～5.5)；所述第十二中间产物与甲醇的用量比优选为(1～2)mmol：(45～55)mL。在本发明中，所述第四取代反应条件的可选范围优选与第一取代反应条件的可选范围一致，所述第四取代反应后的后处理方式优选与第一取代反应后的后处理方式一致，在此不再赘述。

本发明提供了上述技术方案所述小分子PAD4抑制剂在制备抗肿瘤药物或抗血栓药物中的应用。

在本发明中，所述抗肿瘤药物优选包括抗肿瘤生长药物或抗肿瘤转移药物。在本发明中，所述肿瘤优选包括肉瘤、肺癌、结肠癌或乳腺癌。在本发明中，所述肉瘤优选包括S180小鼠肉瘤或U2Os人骨肉瘤，所述肺癌优选包括LLC小鼠肺癌或A549人非小细胞肺癌，所述结肠癌优选包括HCT116人结肠癌，所述乳腺癌优选包括4T1小鼠乳腺癌。

在本发明中，所述抗肿瘤药物优选包括所述小分子PAD4抑制剂和药学上可接受的辅料；所述抗肿瘤药物中小分子PAD4抑制剂含量优选为9.1～33.3wt％，所述药学上可接受的辅料优选包括生理盐水和/或羟丙基-β-环糊精；所述抗肿瘤药物的剂型优选包括冻干粉。

在本发明中，所述抗血栓药物优选包括所述小分子PAD4抑制剂和药学上可接受的辅料；所述抗血栓药物中小分子PAD4抑制剂含量优选为9.1～33.3wt％，所述药学上可接受的辅料优选包括生理盐水和/或羟丙基-β-环糊精；所述抗血栓药物的剂型优选包括冻干粉。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1(3-boronobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-2)的合成

(1)Boc-Orn(Z)-NBzl的合成

减重法准确称取3.660g(10mmol)Boc-Orn(Z)-OH置于茄瓶中，用100mL无水THF溶解至无色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，依次加入1.620g(12mmol)1-羟基苯并三唑(HOBt)和2.472g(12mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，活化10min后，有白色固体析出；向茄瓶中滴加入1.6mL苄胺，并用N-甲基吗啡啉(NMM)调节pH至8；撤冰浴，室温(25℃)下搅拌反应8h后，用TLC(按体积比计，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝30：1，R_f＝0.35)检测反应进程，观察到原料点消失，判断反应完全。反应结束后用真空循环水泵减压过滤，并用EA润洗滤饼，滤液减压浓缩至干，除去THF，残留物用150mLEA溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至250mL分液漏斗中，依次用饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(30mL/次)、5wt％KHSO₄溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(30mL/次)，观察到EA层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将EA层用无水Na₂SO₄干燥2h后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为5％)，得到4.440g(97.6％)目标产物Boc-Orn(Z)-NBzl，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):478.1[M+Na]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝8.32(t,J＝4.7Hz,1H),7.35(m,5H),7.28(m,5H),7.20(s,1H),6.90(d,J＝7.4Hz,1H),5.01(s,2H),4.29(d,J＝3.9Hz,2H),3.94(s,1H),3.00(s,2H),1.58(m,2H),1.49(m,2H),1.39(m,9H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝172.7,156.6,155.9,139.9,137.7,128.8,128.6,128.2,127.5,127.1,78.5,65.6,54.6,42.4,40.3,29.7,28.6,26.6。

(2)HCl·Orn(Z)-NBzl的合成

将4.440g(9.8mmol)Boc-Orn(Z)-NBzl置于茄瓶中，加入5mL干燥的乙酸乙酯使其溶解，在通风橱中，冰浴搅拌下，继续向溶液中滴加20mLHCl的乙酸乙酯溶液(记为HCl/EA溶液，HCl的浓度为2mo/L)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌条件下反应3h，观察到有白色固体逐渐沿瓶壁析出，TLC(按体积比计，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝10：1，R_f＝0.25)监测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，在37℃温水浴搅拌条件下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20mL干燥EA复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到3.525g(92.3％)目标产物HCl·Orn(Z)-NBzl，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):356.4[M+H]⁺。

(3)(3-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl的合成

减重法准确称取0.830g(5mmol)3-羧基苯硼酸(3-boronobenzoic acid)置于茄瓶中，用50mL无水THF溶解至无色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，依次加入0.810g(6mmol)HOBt和1.236g(6mmol)DCC，活化10min后，有白色固体析出；向茄瓶中加入2.349g(6mmol)HCl·Orn(Z)-NBzl，并用NMM调节pH至8；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，用TLC(按体积比计，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1，R_f＝0.32)检测反应进程，观察到原料点消失，判断反应完全。反应结束后用真空循环水泵减压过滤，并用EA润洗滤饼，滤液减压浓缩至干，除去THF，残留物用60mLEA溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至100mL分液漏斗中，依次用饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)、5wt％KHSO₄溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)，观察到EA层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将EA层用无水Na₂SO₄干燥2h后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为8％)，得到2.203g(87.6％)目标产物(3-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):538.5[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.47(t,J＝5.3Hz,1H),8.37(dd,J＝10.9Hz,8.6Hz,1H),8.31(dd,J＝9.8Hz,9.5Hz,1H),8.17(s,1H),7.92(d,J＝6.6Hz,1H),7.43(t,J＝7.5Hz,1H),7.29(m,10H),5.00(s,2H),4.49(dt,J＝7.4Hz,4.7Hz,1H),4.31(d,J＝5.1Hz,2H),3.66(s,1H),3.03(m,2H),1.77(m,2H),1.51(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝172.3,167.4,156.6,139.8,137.7,137.3,133.8,133.7,129.6,128.8,128.7,128.2,127.6,127.5,127.2,65.6,53.7,49.1,42.5,29.7,26.8。

(4)(3-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl的合成

将2.203g(4.4mmol)(3-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl置于茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向茄瓶中加入0.220g Pd/C，接上三通和氢气袋，用真空循环水泵抽尽茄瓶内空气，通入氢气，重复操作3次，保持茄瓶与氢气袋相通，于通风橱中搅拌反应3h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝6：1：1，R_f＝0.33)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到1.440g(89.1％)目标产物(3-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl，为无色油状物。ESI-MS(m/z):370.4[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.18(m,4H),7.60(d,J＝7.2Hz,1H),7.40(s,1H),7.26(m,5H),4.47(m,1H),4.28(d,J＝4.1Hz,2H),3.96(s,2H),1.84(s,1H),1.76(m,2H),1.48(m,2H)。

(5)(3-boronobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-2)的合成

将369mg(1mmol)(3-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入785mg(5mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)调节pH值至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝6：1：1，R_f＝0.35)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为60％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到150mg(33.7％)目标产物ZD-E-2，为白色固体粉末。M.p.:166.6～169.3℃；

(C＝1mg/mL,CH₃OH)；ESI-MS(m/z):479.4[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.29(s,1H),9.65(s,1H),9.24(s,1H),8.64(t,J＝5.7Hz,1H),8.50(d,J＝7.7Hz,1H),8.44(s,1H),8.19(s,2H),7.96(dd,J＝11.8Hz,8.0Hz,2H),7.26(m,5H),4.53(dt,J＝8.4Hz,4.4Hz,1H),4.46(s,2H),4.31(d,J＝5.5Hz,2H),3.32(m,2H),1.89(m,2H),1.65(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝172.1,167.4,162.7,139.9,137.4,133.9,133.5,129.7,128.7,127.7,127.5,127.1,53.6,42.5,42.4,39.6,29.3,24.4。

实施例2(2-boronobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-3)的合成

(1)(2-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl的合成

参照实施例1中步骤(3)的方法制备目标产物，不同之处在于将“3-羧基苯硼酸(3-boronobenzoic acid)”替换为“2-羧基苯硼酸(2-boronobenzoic acid)”，最终得到1.650g(65.6％)目标产物(2-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):538.6[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.78(t,J＝5.7Hz,1H),7.76(dt,J＝7.7Hz,1.9Hz,1H),7.57(d,J＝7.4Hz,1H),7.44(m,1H),7.41(m,1H),7.38(m,1H),7.30(m,10H),6.88(m,1H),5.01(s,2H),4.28(m,2H),3.97(t,J＝6.6Hz,1H),3.03(t,J＝6.7Hz,2H),1.75(m,2H),1.50(m,2H)。

(2)(2-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl的合成

参照实施例1中步骤(4)的方法制备目标产物，具体是将1.650g(3.3mmol)(2-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl置于茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向茄瓶中加入0.165gPd/C，之后按照实施例1步骤(4)的方法制备目标产物，最终得到1.120g(92.6％)目标产物(2-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl，为无色油状物。ESI-MS(m/z):370.3[M+H]⁺。

(3)(2-boronobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-3)的合成

参照实施例1中步骤(5)的方法制备目标产物，不同之处在于将“(3-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl”替换为“(2-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl”，最终得到148mg(33.3％)目标产物ZD-E-3，为白色固体粉末。M.p.:145.6～147.2℃；

(C＝1mg/mL,CH₃OH)；ESI-MS(m/z):479.4[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.22(s,1H),9.61(s,1H),9.19(s,1H),8.62(t,J＝5.6Hz,1H),8.51(t,J＝6.8Hz,1H),8.40(d,J＝10.0Hz,1H),7.95(m,1H),7.43(t,J＝7.4Hz,1H),7.27(m,5H),4.53(dt,J＝8.4Hz,3.1Hz,1H),4.43(s,2H),4.30(d,J＝5.3Hz,2H),3.65(s,1H),3.30(m,2H),1.84(m,2H),1.64(m,2H)。

实施例3(4-boronobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-4)的合成

(1)(4-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl的合成

参照实施例1中步骤(3)的方法制备目标产物，不同之处在于将“3-羧基苯硼酸(3-boronobenzoic acid)”替换为“4-羧基苯硼酸(4-boronobenzoic acid)”，最终得到1.900g(75.5％)目标产物(4-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):538.4[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝9.12(s,1H),8.46(d,J＝6.3Hz,2H),7.95(d,J＝7.2Hz,1H),7.86(s,2H),7.32(m,5H),7.25(m,5H),7.20(s,1H),5.00(s,2H),4.47(dt,J＝7.5Hz,4.8Hz,1H),4.30(d,J＝5.0Hz,2H),3.64(s,1H),3.03(m,2H),1.77(m,2H),1.50(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝172.3,167.1,156.6,139.9,137.7,135.9,134.3,128.8,128.7,128.2,127.5,127.1,126.9,65.6,53.8,49.1,42.5,29.5,26.8。

(2)(4-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl的合成

参照实施例1步骤(4)的方法制备目标产物，具体是将1.900g(3.8mmol)(4-boronobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl置于茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向反应瓶中加入0.190g Pd/C，之后按照实施例1步骤(4)的方法制备目标产物，最终得到1.145g(82.1％)目标产物(4-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl，为无色油状物。ESI-MS(m/z):370.1[M+H]⁺。

(3)(4-boronobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-4)的合成

参照实施例1步骤(5)的方法制备目标产物，具体是将1.145g(3.1mmol)(4-boronobenzoic acid)-Orn-NBzl置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入2.436g(15.5mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，之后按照实施例1步骤(5)的方法制备目标产物，最终得到480mg(34.8％)目标产物ZD-E-4，为白色固体粉末。M.p.:172.1～175.4℃；

(C＝1mg/mL,CH₃OH)；ESI-MS(m/z):479.4[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.21(s,1H),9.60(s,1H),9.19(s,1H),8.61(t,J＝5.4Hz,1H),8.23(s,2H),7.89(dd,J＝8.1Hz,4.3Hz,4H),7.26(m,5H),4.52(dt,J＝8.6Hz,3.7Hz,1H),4.43(s,2H),4.30(d,J＝5.6Hz,2H),3.29(t,J＝6.5Hz,2H),1.85(m,2H),1.63(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝172.1,167.2,162.7,139.9,135.7,134.3,128.7,127.5,127.1,127.0,53.6,42.5,42.4,29.2,24.4。

实施例4(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-5)的合成

(1)Z-Orn(Boc)-NBzl的合成

减重法准确称取3.660g(10mmol)Z-Orn(Boc)-OH置于茄瓶中，用100mL无水THF溶解至无色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，依次加入1.620g(12mmol)HOBt和2.472g(12mmol)DCC，活化10min后，有白色固体析出；向反应瓶中滴加入1.6mL苄胺，并用NMM调节pH至8；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，用TLC(按体积比计，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝30：1，R_f＝0.38)检测反应进程，观察到原料点消失，判断反应完全。反应结束后用真空循环水泵减压过滤，并用EA润洗滤饼，滤液减压浓缩至干，除去THF，残留物用150mLEA溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至250mL分液漏斗中，依次用饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(30mL/次)、5wt％KHSO₄溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(30mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(30mL/次)，观察到EA层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将EA层用无水Na₂SO₄干燥2h后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为5％)，得到4.490g(98.7％)目标产物Z-Orn(Boc)-NBzl，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):478.3[M+Na]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.39(m,1H),7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.34(m,5H),7.27(m,5H),6.79(m,1H),5.03(s,2H),4.28(d,J＝5.3Hz,2H),3.99(m,1H),2.89(t,J＝5.8Hz,2H),1.60(m,2H),1.51(m,2H),1.37(s,9H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝172.3,156.4,156.0,139.8,137.5,128.8,128.7,128.2,128.1,127.5,127.2,77.9,65.9,54.9,42.4,39.8,29.8,28.7,26.7。

(2)Orn(Boc)-NBzl的合成

将得到的4.490g(9.9mmol)Z-Orn(Boc)-NBzl置于茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向茄瓶中加入0.449g Pd/C，接上三通和氢气袋，用真空循环水泵抽尽茄瓶内空气，通入氢气，重复操作3次，保持茄瓶与氢气袋相通，于通风橱中搅拌反应3h后，TLC(按体积比计，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝10：1，R_f＝0.25)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到3.988g(88.8％)目标产物Orn(Boc)-NBzl，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):322.7[M+H]⁺。

(3)(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(Boc)-NBzl的合成

减重法准确称取1.055g(5mmol)3-羧基-5-硝基苯硼酸(3-borono-5-nitrobenzoic acid)置于茄瓶中，用50mL无水THF溶解至无色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，依次加入0.810g(6mmol)HOBt和1.236g(6mmol)DCC，活化10min后，有白色固体析出；向反应瓶中加入1.926g(6mmol)Orn(Boc)-NBzl，并用NMM调节pH至8；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，用TLC(按体积比计，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝20：1，R_f＝0.35)检测反应进程，观察到原料点消失，判断反应完全。反应结束后用真空循环水泵减压过滤，并用EA润洗滤饼，滤液减压浓缩至干，除去THF，残留物用60mLEA溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至100mL分液漏斗中，依次用饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)、5wt％KHSO₄溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)，观察到EA层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将EA层用无水Na₂SO₄干燥2h后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为7％)，得到1.657g(64.5％)目标产物(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(Boc)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):549.6[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.93(d,J＝7.6Hz,1H),8.80(s,1H),8.76(s,1H),8.71(s,1H),8.67(t,J＝6.8Hz,1H),8.55(t,J＝5.1Hz,1H),7.27(m,5H),6.83(t,J＝5.3Hz,1H),4.50(dt,J＝8.0Hz,4.6Hz,1H),4.31(d,J＝5.3Hz,2H),2.94(m,2H),1.77(m,2H),1.46(m,2H),1.36(s,9H)。

(4)(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(HCl)-NBzl的合成

将1.657g(3.2mmol)(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(Boc)-NBzl置于茄瓶中，加入5mL干燥的乙酸乙酯使其溶解，在通风橱中，冰浴搅拌下，继续向溶液中滴加20mLHCl/EA溶液(HCl的浓度为2mo/L)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌下反应3h，观察到有白色固体逐渐沿瓶壁析出，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.25)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，37℃温水浴搅拌下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20mL干燥EA复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到1.447g(99.7％)目标产物(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(HCl)-NBzl，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):415.3[M+H]⁺。

(5)(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-5)的合成

将1.447g(3.2mmol)(3-borono-5-nitrobenzoic acid)-Orn(HCl)-NBzl置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入2.521g(16mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.28)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为60％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到230mg(14.6％)目标产物ZD-E-5，为浅棕色固体粉末。ESI-MS(m/z):508.8[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.24(s,1H),9.62(s,1H),9.21(s,1H),8.82(s,1H),8.80(s,1H),8.76(s,1H),8.70(s,1H),8.68(s,2H),7.27(m,5H),4.56(m,1H),4.44(s,2H),4.32(d,J＝4.5Hz,2H),3.32(m,2H),1.89(m,2H),1.67(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝172.8,166.8,163.6,148.6,140.4,140.0,135.8,131.9,129.5,128.2,128.1,124.9,54.5,43.3,43.0,29.6,29.4,25.0。

实施例5(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-6)的合成

(1)(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl的合成

参照实施例1步骤(3)的方法制备目标产物，不同之处在于将“3-羧基苯硼酸(3-boronobenzoic acid)”替换为“3-羧基-4-氟苯硼酸(3-borono-4-fluorobenzoic acid)”，且用TLC检测反应进程时R_f＝0.35，后处理过程中经中压制备柱分离纯化时，所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为7％；最终得到1.600g(61.4％)目标产物(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):556.4[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.46(q,J＝5.7Hz,1H),8.42(s,1H),8.35(s,1H),8.14(dd,J＝3.4Hz,2.1Hz,1H),7.97(m,1H),7.34(s,5H),7.31(s,1H),7.27(m,5H),7.18(t,J＝8.7Hz,1H),5.00(s,2H),4.47(dt,J＝7.9Hz,4.9Hz,1H),4.30(d,J＝5.6Hz,2H),3.03(m,2H),1.77(m,2H),1.48(m,2H)。

(2)(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl的合成

参照实施例1步骤(4)的方法制备目标产物，具体是将1.600g(3.1mmol)(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl置于茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向茄瓶中加入0.160gPd/C，接上三通和氢气袋，用真空循环水泵抽尽反应瓶内空气，通入氢气，重复操作3次，保持茄瓶与氢气袋相通，于通风橱中搅拌反应3h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝6：1：1，R_f＝0.35)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到1.092g(91.9％)目标产物(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):388.2[M+H]⁺。

(3)(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-6)的合成

参照实施例1步骤(5)的方法制备目标产物，具体是将774mg(2mmol)(3-borono-4-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入1.570g(10mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.38)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为60％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到200mg(21.6％)目标产物ZD-E-8，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):497.4[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.21(s,1H),9.63(s,1H),9.22(s,1H),8.57(s,1H),8.39(s,1H),8.20(dd,J＝5.8Hz,2.3Hz,1H),8.01(m,1H),7.27(m,5H),7.19(t,J＝8.7Hz,1H),4.51(m,J＝4.4Hz,1H),4.42(s,2H),4.30(d,J＝5.9Hz,2H),3.29(t,J＝6.8Hz,2H),1.85(m,2H),1.63(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝172.0,169.4,166.4,162.7,139.9,135.9,132.0,130.0,128.7,127.5,127.2,115.3,53.6,42.5,42.4,39.6,29.2,24.4。

实施例6(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-7)的合成

(1)(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl的合成

参照实施例1步骤(3)的方法制备目标产物，不同之处在于将“3-羧基苯硼酸(3-boronobenzoic acid)”替换为“3-羧基-5-氟苯硼酸(3-borono-5-fluorobenzoic acid)”，且用TLC检测反应进程时R_f＝0.35，后处理过程中经中压制备柱分离纯化时，所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为7％；最终得到2.450g(94.0％)目标产物(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):556.1[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.51(d,J＝7.6Hz,1H),8.48(t,J＝5.2Hz,1H),8.36(s,2H),8.15(s,1H),7.74(d,J＝9.7Hz,1H),7.68(d,J＝9.2Hz,1H),7.32(m,5H),7.26(m,5H),7.19(m,1H),5.00(s,2H),4.47(dt,J＝8.8Hz,4.8Hz,1H),4.30(d,J＝5.5Hz,2H),3.02(m,2H),1.77(m,2H),1.49(m,2H)。

(2)(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl的合成

参照实施例1步骤(4)的方法制备目标产物，具体是将2.450g(4.7mmol)(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl置于茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向茄瓶中加入0.245gPd/C，接上三通和氢气袋，用真空循环水泵抽尽茄瓶内空气，通入氢气，重复操作3次，保持茄瓶与氢气袋相通，于通风橱中搅拌反应3h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝6：1：1，R_f＝0.35)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到1.780g(97.8％)目标产物(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl，为无色油状物。ESI-MS(m/z):388.4[M+H]⁺。

(3)(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-7)的合成

参照实施例1步骤(5)的方法制备目标产物，具体是将774mg(2mmol)(3-borono-5-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入1.570g(10mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，Rf＝0.38)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全，经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为60％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到180mg(19.5％)目标产物ZD-E-7，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):497.4[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.33(s,1H),10.29(s,1H),9.67(s,1H),9.26(s,1H),8.64(m,1H),8.27(s,1H),7.76(dd,J＝22.5Hz,9.6Hz,1H),7.28(m,5H),6.79(dt,J＝10.6Hz,2.2Hz,1H),4.48(m,1H),4.45(s,2H),4.30(d,J＝5.5Hz,2H),3.30(m,2H),1.87(m,2H),1.64(m,2H)。

实施例7(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-8)的合成

(1)(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl的合成

参照实施例1步骤(3)的方法制备目标产物，不同之处在于将“3-羧基苯硼酸(3-boronobenzoic acid)”替换为“5-羧基-2-氟苯硼酸(5-borono-2-fluorobenzoic acid)”，且用TLC检测反应进程时R_f＝0.35，后处理过程中经中压制备柱分离纯化时，所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为7％；最终得到2.220g(85.2％)目标产物(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):556.4[M+Cl]^-。

(2)(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl的合成

参照实施例1步骤(4)的方法制备目标产物，具体是将2.220g(4.3mmol)(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl置于茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向茄瓶中加入0.222gPd/C，接上三通和氢气袋，用真空循环水泵抽尽茄瓶内空气，通入氢气，重复操作3次，保持茄瓶与氢气袋相通，于通风橱中搅拌反应3h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝6：1：1，R_f＝0.35)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到1.550g(94.0％)目标产物(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl，为无色油状物。ESI-MS(m/z):388.4[M+H]⁺。

(3)(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-8)的合成

参照实施例1步骤(5)的方法制备目标产物，具体是将774mg(2mmol)(5-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入1.570g(10mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.38)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为60％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到230mg(24.9％)ZD-E-8，为白色固体粉末。M.p.:158.5～161.7℃；

(C＝1mg/mL,CH₃OH)；ESI-MS(m/z):497.6[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.27(s,1H),9.66(s,1H),9.22(s,1H),8.69(t,J＝5.7Hz,1H),8.38(d,J＝5.5Hz,1H),8.24(s,2H),8.14(d,J＝7.3Hz,1H),7.93(t,J＝6.2Hz,1H),7.27(m,5H),4.55(dt,J＝7.9Hz,5.0Hz,1H),4.45(s,2H),4.32(d,J＝5.4Hz,2H),3.31(m,2H),1.80(m,2H),1.63(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝171.6,164.5,162.7,139.7,137.0,128.7,127.5,127.2,123.1,123.0,115.8,115.5,53.3,42.5,42.2,29.5,26.0,24.2。

实施例8(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-9)的合成

(1)(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl的合成

参照实施例1步骤(3)的方法制备目标产物，不同之处在于将“3-羧基苯硼酸(3-boronobenzoic acid)”替换为“3-羧基-2-氟苯硼酸(3-borono-2-fluorobenzoic acid)”，且用TLC检测反应进程时R_f＝0.35，后处理过程中经中压制备柱分离纯化时，所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为7％；最终得到1.980g(76.0％)目标产物(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl，为白色固体。ESI-MS(m/z):522.3[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝8.51(t,J＝5.4Hz,1H),8.33(s,2H),8.20(m,1H),7.67(dd,J＝14.9Hz,7.5Hz,1H),7.33(m,5H),7.28(m,5H),7.26(m,1H),7.23(t,J＝7.3Hz,1H),5.00(s,2H),4.50(dt,J＝7.0Hz,5.3Hz,1H),4.32(d,J＝5.5Hz,2H),3.02(m,2H),1.72(m,2H),1.49(m,2H)。

(2)(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl的合成

参照实施例1步骤(4)的方法制备目标产物，具体是将1.980g(3.8mmol)(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Z)-NBzl置于100mL茄瓶中，用50mL甲醇溶解至无色澄清透明；搅拌下，向茄瓶中加入0.198g Pd/C，接上三通和氢气袋，用真空循环水泵抽尽反茄内空气，通入氢气，重复操作3次，保持茄瓶与氢气袋相通，于通风橱中搅拌反应3h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝6：1：1，Rf＝0.35)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后常压过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩至干，得到1.380g(94.8％)目标产物(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl，为无色油状物。ESI-MS(m/z):556.2[M+Cl]^-。

(3)(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn(Cl)-NBzl(ZD-E-9)的合成

参照实施例1步骤(5)的方法制备目标产物，具体是将774mg(2mmol)(3-borono-2-fluorobenzoic acid)-Orn-NBzl置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入1.570g(10mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.38)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为60％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到220mg(23.8％)目标产物ZD-E-9，为白色固体粉末。ESI-MS(m/z):497.4[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.23(s,1H),9.65(s,1H),9.22(s,1H),8.38(s,1H),8.36(s,1H),7.68(m,2H),7.33(tt,J＝7.2Hz,1.2Hz,1H),7.27(m,5H),4.56(m,J＝4.2Hz,1H),4.43(s,2H),4.32(d,J＝5.7Hz,2H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),1.82(m,2H),1.64(m,2H)。

实施例9NBD-Orn(Cl)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid(ZD-E-10)的合成

(1)NBD-Orn(Boc)-OBzl的合成

减重法准确称取0.998g(5mmol)4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑(NBD-Cl)置于茄瓶中，用100mL无水甲醇溶解至黄色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入2.151g(6mmol)HCl·Orn(Boc)-OBzl，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下避光反应8h，观察到反应液颜色逐渐加深至墨绿色，伴有绿色荧光产生，TLC(按体积比计，展开剂为PE：EA＝2：1，R_f＝0.30)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为EA和PE的混合物，EA的体积分数为35％)，得到1.800g(74.2％)目标产物NBD-Orn(Boc)-OBzl，为橙红色固体，有机溶剂中具有明亮的绿色荧光。ESI-MS(m/z):484.5[M-H]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝9.51(s,1H),8.52(d,J＝8.9Hz,1H),7.32(s,5H),6.84(s,1H),6.41(s,1H),5.17(s,2H),3.34(s,1H),2.94(q,J＝6.1Hz,2H),1.99(m,2H),1.54(m,2H),1.34(s,9H)。

(2)NBD-Orn(Boc)-OH的合成

减重法准确称取1.800g(3.7mmol)NBD-Orn(Boc)-OBzl置于茄瓶中，用30mL甲醇溶解至橙红色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，用2MNaOH水溶液调节pH至12；冰浴搅拌下避光反应4h，TLC(按体积比计，展开剂为PE：EA＝10：1，R_f＝0.25)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，在冰浴搅拌下，用饱和KHSO₄溶液调节pH至中性，减压浓缩除去甲醇，残留物用饱和KHSO₄溶液调节pH至2；将溶液转移至250mL分液漏斗中，用50mLEA萃取3次，合并EA层，用饱和NaCl溶液萃洗3次；将EA层用无水Na₂SO₄干燥2h后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩，得到1.360g(92.9％)目标产物NBD-Orn(Boc)-OH，为橙红色固体，有机溶剂中具有明亮的橙黄色荧光。ESI-MS(m/z):394.1[M-H]^-。

(3)NBD-Orn(Boc)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid的合成

减重法准确称取1.185g(3mmol)NBD-Orn(Boc)-OH置于茄瓶中，用50mL无水THF溶解至无色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，依次加入0.486g(3.6mmol)HOBt和0.742g(3.6mmol)DCC，活化10min；向茄瓶中加入0.544g(3.6mmol)(3-氨基甲基苯基)硼酸((3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid)，并用NMM调节pH至8；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，用TLC(按体积比计，展开剂为CH₂Cl₂：CH₃OH＝15：1，R_f＝0.28)检测反应进程，观察到原料点消失，判断反应完全。反应结束后用真空循环水泵减压过滤，并用EA润洗滤饼，滤液减压浓缩至干，除去THF，残留物用60mL EA溶解，再次抽滤除去固体物料，并将滤液转移至100mL分液漏斗中，依次用饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)、5wt％KHSO₄溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaHCO₃溶液萃洗3次(15mL/次)、饱和NaCl溶液萃洗3次(15mL/次)，观察到EA层在萃洗过程中颜色变淡至无色；将EA层用无水Na₂SO₄干燥2h后，过滤除去Na₂SO₄，滤液减压浓缩得无色油状物，经中压制备柱分离纯化(所用纯化试剂为甲醇和二氯甲烷的混合物，甲醇的体积分数为9％)，得到1.320g(83.3％)目标产物NBD-Orn(Boc)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid，为橙红色固体。ESI-MS(m/z):527.4[M-H]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝9.35(s,1H),8.72(s,1H),8.52(d,J＝8.2Hz,1H),8.01(s,2H),7.67(s,2H),7.26(s,2H),6.81(t,J＝4.4Hz,1H),6.33(s,1H),4.36(m,1H),4.31(d,J＝5.3Hz,2H),2.95(dt,J＝6.5Hz,5.1Hz,2H),1.95(m,2H),1.51(m,2H),1.35(m,9H)。

(4)NBD-Orn(HCl)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid的合成

将1.320g(2.5mmol)NBD-Orn(Boc)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid置于茄瓶中，加入5mL干燥的乙酸乙酯使其溶解，在通风橱中，冰浴搅拌下，继续向溶液中滴加15mLHCl/EA溶液(HCl的浓度为2mo/L)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌下反应3h，观察到有橙红色固体逐渐沿瓶壁析出，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.32)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，37℃温水浴搅拌下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20mL干燥EA复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到1.145g(98.6％)目标产物NBD-Orn(HCl)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid，为橙红色固体粉末。ESI-MS(m/z):429.3[M+H]⁺。

(5)NBD-Orn(Cl)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid(ZD-E-10)的合成

将0.929g(2mmol)NBD-Orn(HCl)-(3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至橙红色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入1.570g(10mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.35)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为35％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到255mg(25.3％)目标产物ZD-E-10，为橙红色固体粉末。M.p.:198.2～202.0℃；

(C＝1mg/mL,CH₃OH)；ESI-MS(m/z):502.4[M-H]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.28(s,1H),9.67(s,1H),9.32(s,1H),8.97(s,1H),8.53(d,J＝8.8Hz,1H),8.02(s,1H),7.68(s,2H),7.28(s,2H),6.42(s,1H),4.52(t,J＝21.0Hz,1H),4.45(s,2H),4.31(s,2H),3.33(t,J＝6.0Hz,2H),2.07(m,2H),1.71(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝170.2,170.1,162.7,162.6,138.1,133.6,133.1,129.4,127.8,43.0,42.9,42.3,42.1,29.0,24.3。

实施例10NBD-Orn(Cl)-(2-(aminomethyl)phenyl)boronic acid(ZD-E-11)的合成

(1)NBD-Orn(Boc)-(2-(aminomethyl)phenyl)boronic acid的合成

参照实施例10的步骤(3)制备目标产物，不同之处在于将“(3-氨基甲基苯基)硼酸((3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid)”替换为“(2-氨基甲基苯基)硼酸((2-(aminomethyl)phenyl)boronic acid)”，最终得到0.828g(52.3％)目标产物ZD-E-11，为橙红色固体。ESI-MS(m/z):527.4[M-H]^-。

(2)NBD-Orn(HCl)-(2-(aminomethyl)phenyl)boronic acid的合成

参照实施例10的步骤(4)制备目标产物，具体是将0.828g(1.6mmol)NBD-Orn(Boc)-(2-(aminomethyl)phenyl)boronic acid置于茄瓶中，加入5mL干燥的乙酸乙酯使其溶解，在通风橱中，冰浴搅拌下，继续向溶液中滴加10mLHCl/EA溶液(HCl的浓度为2mo/L)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌下反应3h，观察到有橙红色固体逐渐沿瓶壁析出，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.32)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，37℃温水浴搅拌下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20mL干燥EA复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到0.700g(96.1％)目标产物NBD-Orn(HCl)-(2-(aminomethyl)phenyl)boronic acid，为橙红色固体粉末。ESI-MS(m/z):429.2[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝9.37(s,1H),8.91(t,J＝5.2Hz,1H),8.53(d,J＝8.9Hz,1H),8.23(s,1H),7.95(s,3H),7.40(dd,J＝64.6Hz,7.2Hz,2H),7.20(m,2H),6.37(s,1H),4.49(m,1H),4.44(d,J＝4.0Hz,2H),2.82(dt,J＝5.8Hz,5.7Hz,2H),2.03(m,2H),1.70(m,2H)。

(3)NBD-Orn(Cl)-(2-(aminomethyl)phenyl)boronicacid(ZD-E-11)的合成

参照实施例10步骤(5)制备目标产物，具体是将0.465g(1mmol)NBD-Orn(HCl)-(2-(aminomethyl)phenyl)boronic acid置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至橙红色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入0.785g(5mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，Rf＝0.35)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为40％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到100mg(19.9％)目标产物ZD-E-11，为橙红色固体粉末。M.p.:188.9～192.9℃；

(C＝1mg/mL,CH₃OH)；ESI-MS(m/z):538.6[M+Cl]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.27(s,1H),9.68(d,J＝5.1Hz,1H),9.28(t,J＝6.2Hz,1H),9.00(t,J＝5.3Hz,1H),8.52(d,J＝8.9Hz,1H),8.28(s,1H),7.36(dd,J＝89.0Hz,6.9Hz,2H),7.29(dt,J＝27.3Hz,7.1Hz,2H),6.38(s,1H),4.50(m,1H),4.45(s,2H),4.43(s,2H),3.33(t,J＝6.4Hz,2H),2.04(m,2H),1.70(m,J＝6.8Hz,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝170.6,170.5,162.65,162.59,162.5,142.9,134.2,129.6,127.6,126.4,43.2,43.1,42.2,42.1,39.5,24.3。

实施例11NBD-Orn(Cl)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronicacid(ZD-E-12)的合成

(1)NBD-Orn(Boc)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronic acid的合成

参照实施例10的步骤(3)制备目标产物，不同之处在于将“(3-氨基甲基苯基)硼酸((3-(aminomethyl)phenyl)boronic acid)”替换为“(4-氨基甲基苯基)硼酸((4-(aminomethyl)phenyl)boronic acid)”，最终得到1.045g(66.0％)目标产物NBD-Orn(Boc)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronic acid，为橙红色固体。ESI-MS(m/z):527.4[M-H]^-。

(2)NBD-Orn(HCl)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronicacid的合成

参照实施例10的步骤(4)制备目标产物，具体是将1.045g(2.0mmol)NBD-Orn(Boc)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronic acid置于茄瓶中，加入5mL干燥的乙酸乙酯使其溶解，在通风橱中，冰浴搅拌下，继续向溶液中滴加15mLHCl/EA溶液(HCl的浓度为2mo/L)，瓶口接上干燥管，冰浴搅拌下反应3h，观察到有橙红色固体逐渐沿瓶壁析出，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.32)检测反应进程，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后，37℃温水浴搅拌下，茄瓶接具塞单通，用真空循环水泵将反应液减压抽干，残留物用20mL干燥EA复溶后再次抽干，重复该操作3次，至无明显酸气残留，最后加入无水乙醚磨洗抽干，得到0.890g(96.8％)目标产物NBD-Orn(HCl)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronic acid，为橙红色固体粉末。ESI-MS(m/z):429.3[M+H]⁺。

(3)NBD-Orn(Cl)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronicacid(ZD-E-12)的合成

参照实施例10的步骤(5)制备目标产物，具体是将0.465g(1mmol)NBD-Orn(HCl)-(4-(aminomethyl)phenyl)boronic acid置于茄瓶中，用50mL无水甲醇溶解至橙红色澄清透明，加入搅拌子；冰浴搅拌下，加入0.785g(5mmol)2-氯乙酰亚胺基乙酯，并用DIPEA调节pH至10；撤冰浴，室温下搅拌反应8h后，TLC(按体积比计，展开剂为EA：H₂O：HAc＝5：1：1，R_f＝0.35)检测反应进程，并用茚三酮显色，观察到原料点消失后，判断反应完全。反应结束后所得体系经C18硅胶柱层析分离纯化(所用试剂为体积分数为40％的甲醇水溶液)，减压浓缩除去甲醇后，经真空冷冻干燥机冻干除水，得到180mg(35.7％)目标产物ZD-E-12，为橙红色固体粉末。M.p.:211.1～216.2℃；

(C＝1mg/mL,CH₃OH)；ESI-MS(m/z):502.4[M-H]^-；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)＝10.25(s,1H),9.62(s,1H),9.29(s,1H),8.97(t,J＝4.7Hz,1H),8.54(d,J＝8.8Hz,1H),7.99(s,2H),7.72(d,J＝7.7Hz,2H),7.20(d,J＝7.5Hz,2H),6.43(s,1H),4.53(m,1H),4.44(s,2H),4.32(s,2H),3.32(m,2H),2.05(m,2H),1.70(m,2H)；¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝170.3,170.1,162.7,156.8,144.9,141.3,137.9,133.1,129.5,129.0,126.6,122.5,115.5,100.6,57.6,42.8,42.4,42.2,39.6,29.0,24.3。

测试例1评价小分子PAD4抑制剂抑制体外PAD4酶活性

由于PAD4与底物BAEE发生作用时会产生游离氨基，反应式如下所示，因此测试反应生成的游离氨基的含量，即可反映PAD4酶活性。

基于这一机理，通过PAD4抑制剂筛选试剂盒验证，将受试化合物与PAD4及底物BAEE在37℃下共孵育半小时后，465nm波长下检测吸光度，并重复至少三次；所得结果见表1。

表1受试化合物对PAD4酶的抑制活性(Mean±SDμM)

Compounds	PAD4inhibition(μM)	Compounds	PAD4inhibition(μM)
				YW3-56	2.86±0.40	ZD-E-6	5.045±2.61
ZD-E-1	n.d.	ZD-E-10	n.d.
				ZD-E-2	2.388±0.62	ZD-E-11	n.d.
ZD-E-4	1.894±0.33	ZD-E-12	n.d.
				ZD-E-5	9.581±4.48

注：表1中“YW3-56”化学名称为N-(1-(苄基氨基)-5-(2-氯乙二酰亚胺基)-1-氧戊烷-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘酰胺，采用US20120108562(Gong Chen,Yanming Wang,Pingxin Li,Jing Hu,Shu Wang,Yuji Wang.Therapeutic compositions and methods)专利公开的方法制备得到；

“ZD-E-1”化学名称为(S)-N-苄基-5-(2-氯乙酰亚胺基)-2-((7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑-4-基)氨基)戊烷酰胺，结构式为

“n.d.”表示干扰大，无法测试。

由于含有荧光基团NBD的化合物，在465nm波长下具有紫外干扰，因此传统的比色法并不适用这类化合物对PAD4酶活性的检测。采用本测试例的方法进行测试，从表1中可以发现，用苯硼酸(PBA)修饰的化合物对PAD4酶活性的抑制作用，与YW3-56相比无明显差异；然而，当在苯环上引入-F或-NO₂时，又使化合物对PAD4酶活性的抑制作用降低了2～4倍。

测试例2评价小分子PAD4抑制剂的体外抗肿瘤细胞增殖活性(MTT法)

S180(小鼠腹水瘤细胞)、LLC(小鼠肺癌细胞)、A549(人非小细胞肺癌细胞)、HCT116(人结肠癌细胞)、U2Os(人骨肉瘤细胞)和4T1(小鼠乳腺癌细胞)均购自南京凯基公司。

制备受试样品时，将受试化合物用含0.5％DMSO的PBS缓冲液配成浓度为500μM(终浓度100μM)的样品溶液，用于体外抗细胞增殖实验的初筛。对于对待测细胞株的半数抑制浓度，即IC₅₀值低于100μM的化合物，将样品溶液逐级稀释为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM后，再次用MTT法检测其对细胞株的IC₅₀值，并在相同的实验条件下重复测定至少三次以上，直至所得IC₅₀值稳定可靠。

阳性对照组：阿霉素，用含0.5％DMSO的PBS缓冲液配制成所需浓度；阴性对照组：为含0.5％DMSO的PBS缓冲液。

具体方法为：1)接种细胞：将生长状况良好，处于对数生长期的细胞用培养基稀释至(3～5)×10⁴个/mL的细胞浓度，均匀接种于96孔板中，每孔100μL(外围各孔用100μLPBS缓冲液液封)，将接种后的96孔板置于37℃、5％CO²的细胞培养箱中孵育8h。2)给药：观察细胞生长及贴壁情况，当贴壁率达50％以上时，按照预设复孔给25μL不同化合物或不同浓度的受试样品溶液，每板均设置阴性对照组、阳性对照组以及Blank组，轻轻拍打使其样品液分散均匀，置于细胞培养箱中孵育48h。3)后处理：每孔加入事先配制好的MTT溶液25μL，继续孵育4h后取出，弃去上清液(悬浮细胞需离心3000rpm，10min)后，每孔加入150μLDMSO，于细胞摇床上震荡15min，使甲臜充分溶解后，酶标仪测定各孔在570nm波长下的OD值(理想范围在0.3～1.4之间)。

按照式a计算受试化合物的抗细胞增殖活性的抑制率，每个实验至少重复三次，在prism中计算受试化合物的IC₅₀值，结果如表2所示。

抑制率＝[(阴性对照组的平均OD值-受试化合物组的平均OD值)/阴性对照组的平均OD值-Blank组的平均OD值]×100％式a。

表2受试化合物对各细胞株的体外抗细胞增殖活性的IC₅₀值(Mean±SDμM)

Compounds

S180

LLC

A549

HCT116

U2Os

4T1

DOX

0.490±0.092

0.190±0.095

0.229±0.052

0.375±0.108

1.201±0.034

1.032±0.188

YW3-56

n.d.

n.d.

n.d.

8.51±0.31

9.73±4.2

11.86±0.71

ZD-E-1

24.641±1.716

26.112±2.582

45.548±0.672

22.569±1.450

28.801±1.143

7.93±0.88

ZD-F-1

23.710±2.295

＞100

＞100

38.890±2.047

45.724±1.680

12.86±0.73

ZD-E-2

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

ZD-E-3

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

ZD-E-4

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

ZD-E-5

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

ZD-E-6

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

ZD-E-7

＞100

＞100

＞100

70.916±5.112

＞100

＞100

ZD-E-8

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

ZD-E-9

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

ZD-E-10

＞100

＞100

＞100

＞100

130.102±4.394

＞100

ZD-E-11

＞100

＞100

＞100

47.018±5.367

＞100

＞100

ZD-E-12

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

＞100

测试例3评价小分子PAD4抑制剂单细胞克隆形成实验

由于采用MTT法测定化合物体外抗细胞增殖活性时，细胞接种密度较大，使细胞聚集，大大降低了细胞膜的比表面积，从而降低了细胞对受试化合物的摄取。因此，本实验通过单细胞克隆形成的方法，来减轻这些不利因素对细胞毒性测定的影响。

选用细胞株：A549

组别：Control，ZD-E-10(100μM、50μM、25μM)

具体方法为：1)选取状态良好、处于对数生长期的A549细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化并吹打成单个细胞，并将细胞悬浮在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中备用。2)将细胞悬液做梯度倍数稀释，按200个/皿的细胞密度接种于5cm培养皿中，每皿含5mL 37℃的预温培养基，轻轻转动，使细胞均匀分散；置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中孵育4h后给药，继续孵育10天。3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。用5mL4％的多聚甲醛固定细胞15min；然后弃去固定液，用10％Gimsa染液染色10～15min，然后用流水缓慢洗去染液，放置干燥，镜检计数。4)显微镜下随机选取9个区域，拍照取样，用image pro plus软件统计细胞数。

化合物ZD-E-10对A549的单细胞克隆实验结果如图1所示，图1中的A为不同浓度ZD-E-10对A549细胞克隆影响的拍摄图；图1中的B为image pro plus软件统计的细胞数差异柱状图，经单因素方差分析，*与Control组相比，P<0.05，有差异；**与Control组相比，P<0.01，有显著性差异。由图1可知，化合物ZD-E-10在给药浓度为25μM时，其癌细胞生长情况，即与control组相比有差异，在50μM及100μM时与control组相比有显著性差异。

测试例4评价小分子PAD4抑制剂体内抑制肿瘤生长实验(小鼠S180纤维肉瘤模型)

SPF级雄性ICR小鼠，体重20±2g，购买于北京维通利华动物实验技术有限公司，在首都医科大学实验动物部，动物屏障内进行饲养。按组别对成瘤小鼠进行连续7天的给药，每隔一天测量肿瘤长短并计算肿瘤体积；末次给药24h后，取出称重，并用乙醚麻醉后摘眼球取血，所得全血在1000rpm下离心10min，吸取血清备用；将小鼠断颈处死，并剥取瘤块及各脏器称重(应保证尽快操作且剥取完整干净)。按式b计算抑瘤率，并通过计算各脏器的脏体比，分析受试化合物对小鼠脏器有无明显的生理影响。

抑瘤率＝(Vehicle组平均瘤重-给药组平均瘤重)/Vehicle组平均瘤重×100％式b。

这里重点比较了荧光基团NBD-Cl和苯硼酸结构PBA两种主要官能团对鸟氨酸骨架修饰后，引起的活性差异及给药途径的改变。结果见表3和图2。

表3鸟氨酸骨架化合物的体内给药分组及结果统计表

注：表3中iv，尾静脉注射；ig，灌胃；n＝10。

图2为鸟氨酸骨架化合物在小鼠S180肉瘤模型中的抗肿瘤活性结果图，图2中的A为小鼠平均瘤重统计图，图2中的B为小鼠肿瘤生长趋势图；经单因素方差分析，*与Vehicle组相比，P<0.05，有差异；**与Vehicle组相比，P<0.01，有显著性差异；a：化合物ZD-E-1在2μmol/kg剂量下，尾静脉注射与灌胃活性无差异；b：尾静脉注射的化合物ZD-E-1与灌胃的ZD-E-10在10μmol/kg剂量下活性无差异。

设置10μmol/kg、5μmol/kg、2μmol/kg三个给药剂量，并采用尾静脉注射和灌胃这两种给药方式，比较以荧光基团NBD-Cl进行修饰的化合物ZD-E-1，以苯硼酸结构PBA进行修饰的化合物ZD-E-2，以及二者兼备的化合物ZD-E-10之间，对小鼠体内肿瘤生长抑制能力的差异。经单因素方差分析发现，化合物ZD-E-1在2μmol/kg剂量下，其灌胃给药的平均瘤重高于尾静脉注射。尽管二者之间未统计出差异，但灌胃给药的平均瘤重与Vehicle组相比，差异变小。化合物ZD-E-2和ZD-E-10在三种剂量下，灌胃给药的平均瘤重仍与Vehicle组相比有显著性差异，且表现出明显的剂量依赖关系。此外，在10μmol/kg的剂量下，灌胃给药的化合物ZD-E-10，其平均瘤重依旧低于尾静脉注射的化合物ZD-E-1。尽管二者之间未统计出差异，但从图2中的B可以看出，在第五天之后，化合物ZD-E-10的小鼠肿瘤生长基本处于平台期。实验结果表明，这三种化合物均具有良好的抗肿瘤生长活性，并具有剂量依赖性。其中，ZD-E-2和ZD-E-10在三种剂量下，仍具有良好的口服活性，尤其又以ZD-E-10最为显著，既克服了先导化合物YW3-56口服活性差的缺点，又能保持较高的抗肿瘤活性，同时还能起到荧光示踪的作用。这证实了苯硼酸结构对改善口服活性起到的作用。

为了进一步体现化合物ZD-E-10相较于化合物ZD-E-1的优势，通过小鼠脏体比，分析化合物对各脏器之间影响的差异。图3为鸟氨酸骨架化合物的小鼠脏体比统计图，经单因素方差分析，*与Vehicle组相比，P<0.05，有差异；**与Vehicle组相比，P<0.01，有显著性差异。由图3可以看出，尽管化合物ZD-E-10避免了化合物ZD-E-1对肝脏和脑的影响，但在10μmol/kg和5μmol/kg的剂量下，有使肾脏肿大的风险，且与Vehicle组相比有显著性差异，这可能与其在肾脏中的代谢有关。为进一步判断化合物ZD-E-10的毒副作用，在后续实验中通过血清生化指标分析，观察化合物对肝肾指标的影响；通过小动物荧光成像实验，观察给药后化合物在小鼠体内的分布。

测试例5化合物ZD-E-10的血清生化指标分析

为了衡量化合物ZD-E-10的毒副作用，通过生化分析仪检测其对小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)等指标含量的影响。其中，ALT和AST是肝脏生化指标，Cr和BUN是肾脏生化指标。从测试例4获得的小鼠血清，通过血清生化指标分析仪测定，将检测结果于prism中统计，并进行单因素方差分析，结果见图4。图4为化合物ZD-E-10的血清生化指标统计图，n＝6，经单因素方差分析，a与Vehicle组相比，P<0.05，有差异；b与Vehicle组相比，P>0.05，无差异。实验结果表明，除2μmol/kg的剂量下，对谷丙转氨酶(ALT)含量的影响，与Vehicle组相比有差异外，化合物ZD-E-10在各个剂量下，对ALT、AST、BUN和Cr等各项血清指标的影响，与Vehicle组相比无差异，说明化合物ZD-E-10并未发现明显的肝肾毒性。并且化合物ZD-E-10对ALT和AST这两项肝功指标的影响，随浓度的降低，有向Sham组水平恢复的趋势。这对化合物ZD-E-10治疗窗的研究提供了可能的依据。

测试例6比较化合物ZD-E-1和ZD-E-10在小鼠体内的荧光成像

为了进一步比较化合物ZD-E-1和化合物ZD-E-10这两种化合物的差异，通过离体小动物荧光成像试验，观察给药后不同时间点，药物在小鼠体内的分布及富集情况。SPF级雄性ICR小鼠，体重20±2g，购买于北京维通利华动物实验技术有限公司，在首都医科大学实验动物部，动物屏障内进行饲养。分组情况为Vehicle组：生理盐水，尾静脉注射；受试化合物组：ZD-E-1，10μmol/kg，尾静脉注射；ZD-E-10，10μmol/kg，灌胃给药；每组受试化合物均设置0.5h、2h、8h、24h四个时间点。所配药液均以生理盐水为溶媒，每个时间点2只种瘤ICR小鼠，并按0.1mL/10g体重计算给药量。

按组别对种瘤后第7天的小鼠(瘤体积可达1000mm³)进行分组标记，每组每个时间点2只种瘤小鼠作为重复。按组别在给药0.5h、2h、8h、24h后，用乙醚麻醉后断颈处死，剥取瘤块及心、肝、脾、肾、脑等脏器按顺序摆放于洁净玻璃皿中(应保证尽快操作且剥取完整干净)。通过小动物荧光成像仪，将激发波长设为450nm，发射波长设为520nm，对瘤块及各脏器进行荧光成像。

将所有脏器均按肝、肾、心、瘤、脾、脑的顺序进行摆放。以Vehicle组为参照，扣除自体荧光，并将所有结果置于同一荧光窗口下，比较瘤块及各脏器的荧光强度。图5为不同时间点条件下化合物在小鼠各脏器的分布图。在图5中，横向观察可以发现，化合物ZD-E-1在0.5h时，便在肝、心、瘤、脾、脑等部位的分布达到峰值，在2h时在肾脏中达到峰值，并随时间延长而减少。而化合物ZD-E-10在0.5h时，便在肝、肾、心、瘤等部位达到峰值，并随时间延长而减少。两种化合物均在肝、肾、瘤等部位长时间存在。纵向比较可以发现，化合物ZD-E-10在肾脏中的代谢速度明显快于化合物ZD-E-1，但其在肝脏中的停留时间更长。其在心脏中或者说血液中的消失速度也明显快于化合物ZD-E-1，这说明化合物ZD-E-10能够比化合物ZD-E-1更快地代谢并分布到肿瘤部位。其在肝脏内的长时间富集，也暗示其在肝癌模型中可能发挥功效。此外，化合物ZD-E-1还可以在脾、脑等部位富集，而化合物ZD-E-10则基本没有，说明化合物ZD-E-10的靶向性要更优于化合物ZD-E-1，所造成的毒副作用也更小。而化合物ZD-E-1在脑部的富集也可能与小鼠S180纤维肉瘤模型中脑部脏体比的增大直接相关。

测试例7小分子PAD4抑制剂的免疫荧光染色实验

本实验以抗H3cit抗体为一抗，山羊抗兔免疫球蛋白IgG H&L为二抗，对瓜氨酸化的H3组蛋白进行染色标记，并用DAPI对细胞核进行染色，观察目标化合物在U2Os细胞内的分布情况和对瓜氨酸化H3组蛋白含量的影响。图6为化合物ZD-E-1、ZD-E-2和ZD-E-10的免疫荧光染色结果图，其中，DAPI对细胞核进行染色，呈蓝色；Anti-H3cit antibody和Goatanti rabbit IgG H&L(AlexaFluor 568)标记瓜氨酸化的H3组蛋白，呈红色；化合物荧光为绿色(Ex＝480nm；Em＝520nm)；Merge为三者叠加图。从图6中可以看出，给药24h后，化合物ZD-E-1仍在细胞质和细胞核内有明显分布，且在胞质中富集更多。有趣的是，用化合物ZD-E-1处理的细胞，在核内发现有直径约200nm，具有明亮绿色荧光的小圆点。说明化合物ZD-E-1在细胞核内并不是均匀分布的，而可能是参与到了细胞的生理过程中，并聚集在染色体发生解聚的部位，进一步影响转录翻译过程。比较箭头处的重叠部分，发现在化合物ZD-E-1的亮绿色荧光点处，H3cit的红色荧光有明显的减弱，说明在化合物ZD-E-1聚集处可能存在对H3组蛋白瓜氨酸化的抑制。此外，值得注意的是，化合物ZD-E-10尽管在胞核和胞质中均有少量分布，但更多的是靶向在细胞膜上，这应该是归功于苯硼酸的作用。并且化合物ZD-E-10的红色荧光与Control组相比，发生明显减弱，说明化合物ZD-E-10能够降低核内H3组蛋白的整体瓜氨酸化水平。

测试例8小分子PAD4抑制剂的对U2Os细胞的蛋白印迹实验

本实验以Actin蛋白为内参，以YW3-56为阳性对照，检测了化合物ZD-E-1、ZD-E-2和ZD-E-10对U2Os细胞中H3cit和PD-L1蛋白含量的影响。图7为化合物ZD-E-1、ZD-E-2和ZD-E-10的蛋白印迹结果图，图7中的A为WesternBlot法测定的U2Os细胞48h时各蛋白的表达结果，图7中的B为U2Os细胞中各蛋白的相对灰度值分析结果。通过对蛋白的相对灰度值进行分析，发现化合物ZD-E-2处理的细胞，其瓜氨酸化的H3组蛋白水平与Control组相比无差异。而YW3-56、ZD-E-1和ZD-E-10处理的细胞，其瓜氨酸化的H3组蛋白的表达降低。并且在10μM和5μM的浓度下，化合物ZD-E-1和ZD-E-10对H3cit表达的降低，与阳性对照YW3-56相比无差异。此外，化合物ZD-E-1、ZD-E-2和ZD-E-10处理的细胞，其PDL1水平与Control组相比，均发生明显降低。提示化合物也可能通过抑制PDL1的表达，抑制肿瘤细胞的生长。

测试例9 Transwell小室法评价PAD4抑制剂体外抗4T1细胞迁移实验

1、受试化合物

化合物ZD-E-1，ZD-E-2和ZD-E-10以及阳性药YW3-56用0.5％DMSO的PBS缓冲溶液配制，阴性对照是0.5％DMSO的PBS缓冲溶液。

2、实验方法

(1)4T1细胞饥饿预处理8h：提前8h将细胞培养瓶中的培养基换成不含胎牛血清的培养基；(2)8h后用不含胎牛血清的培养基调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，上室中加入细胞悬液100μL，再加入受试化合物25μL，使得化合物终浓度分别为5μM和10μM；各受试化合物组设2复孔；(3)下孔尽快匀速加入600μL的10％FBS的培养基并排出膜下气泡(防止气泡打入膜下)，放入37℃、5％CO₂的孵箱培养24h；(4)使用移液枪小心吸出上室残液，每个孔加入50μLPBS缓冲液，用松软的棉签蘸上层细胞，过程中防止transwell小室的膜破裂，此操作重复两遍；(5)吸出下室培养基残液，加入相同体积的4％固定液，置于4℃冰箱固定上室下层膜1h；(6)吸出下室固定液，加入结晶紫染色30min，吸出染色液后，用镊子夹着小室轻轻漂洗干净染色液，于倒置显微镜下拍照。

图8为化合物ZD-E-1、ZD-E-2、ZD-E-10和YW3-56抑制4T1细胞迁移活性结果图。通过transwell小室实验初步判定PAD4抑制剂对4T1小鼠乳腺癌细胞在体外有抑制迁移作用。

测试例10 PAD4抑制剂对BALB/C荷4T1瘤小鼠肿瘤生长及转移的作用

通过BALB/C小鼠荷4T1瘤模型，评价了化合物对小鼠肿瘤生长的抑制作用，结果如表4和图9所示，图9为4T1荷瘤小鼠瘤重及瘤体积统计变化图。由表4和图9可知，给药组能明显抑制肿瘤的生长，并且随着浓度的降低，抑制作用明显减弱；2μmol/kg的化合物ZD-E-1和ZD-E-2对肿瘤没有抑制作用，而化合物ZD-E-10三个浓度都有明显抑制作用。

表4.PAD4抑制剂对BALB/C荷4T1瘤小鼠肿瘤生长抑制作用

注：表4中，*表示有差异，**表示有显著性差异。

测试例11免疫荧光研究PAD4抑制剂对BALB/C荷4T1瘤小鼠NETs形成的影响

每组选择三只4T1小鼠的肿瘤组织，4％多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋，切片备用。Ly6G是中性粒细胞表面marker，ly6G阳性可代表中性粒细胞，免疫荧光双染观察中性粒细胞聚集部位H3cit的表达情况，即可代表肿瘤组织中性粒细胞的NETs形成情况。进行实验时染色使用的抗体及货号为：①Ly6G(Abcam,ab210204)，二抗DonkeyAnti-Rat IgG H&L(Alexa

568)preadsorbed(ab175475)；②H3cit(Abcam Cat#ab5103,二抗Donkeyanti-Rabbit IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,AlexaFluor 647,Thermo Fisher Scientific Cat#A-31573；③Hoechst 33342:蓝色。

图10为小鼠肿瘤免疫荧光染色观察中性粒细胞外陷阱(NETs)形成情况图。通过小鼠免疫荧光切片可以看到，在中性粒细胞聚集部位，正常组有NETs形成，而给药组组蛋白瓜氨酸化明显减少，即抑制了NETs的形成。

测试例12 HE染色研究PAD4抑制剂对BALB/C荷4T1瘤小鼠肺转移的影响

4T1荷瘤小鼠每组选取3只小鼠，摘取肺组织，4％多聚甲醛固定，24小时后，石蜡包埋，切片备用，HE染色。图11为小鼠肺切片HE染色情况图。肺切片HE染色结果表明，YW3-56组和ZD-E-1肺部出现明显炎症细胞浸润，没有明显的瘤结，ZD-E-2组出现瘤结，ZD-E-10组肺切片正常。说明ZD-E-10对小鼠4T1细胞的肺转移有明显抑制作用，并且没有炎症副作用。

测试例13 PAD4抑制剂的纳米自组装性质研究

利用透射电子显微镜和扫描电子显微镜研究化合物的纳米形态，并用纳米粒度仪(DSL)研究其在溶液中的水合粒径和Zeta电位。图12为化合物的纳米自组装性质表征图。由图12可知，在TEM和SEM下，化合物ZD-E-1、ZD-E-2和ZD-E-10呈球状；在纳米粒度仪连续72小时测定的粒径变化曲线中，三种化合物粒径都在100～200nm左右，并且随pH值的变化粒径变化不大；化合物ZD-E-10的分散性最好，在TEM和SEM中都显示均匀分布。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种小分子PAD4抑制剂，其特征在于，具有式I所示结构：

所述式I中，当R₁为

时，R₂为

当R₁为

时，R₂为

2.权利要求1所述小分子PAD4抑制剂的制备方法，其特征在于，

(a)当R₁为

R₂为

时，所述制备方法包括以下步骤：

将第一反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第一活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第一缩合反应，得到第一中间产物；

将所述第一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第一水解反应，得到第二中间产物；

将第二反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第二活化，之后将所得活化体系与所述第二中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第二缩合反应，得到第三中间产物；

将所述第三中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第一氢解反应，得到第四中间产物；

将所述第四中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第一取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第一反应原料、第一中间产物、第二中间产物、第三中间产物和第四中间产物的结构式依次如下：

所述第二反应原料为3-羧基苯硼酸、2-羧基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、3-羧基-4-氟苯硼酸、3-羧基-5-氟苯硼酸、5-羧基-2-氟苯硼酸或3-羧基-2-氟苯硼酸；

(b)当R₁为

R₂为

时，所述制备方法包括以下步骤：

将第三反应原料溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第三活化，之后将所得活化体系与苄胺混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第三缩合反应，得到第五中间产物；

将所述第五中间产物溶解于甲醇中，在钯碳存在条件下，于氢气氛围中进行第二氢解反应，得到第六中间产物；

将所述3-羧基-5-硝基苯硼酸溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第四活化，之后将所得活化体系与第六中间产物混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第四缩合反应，得到第七中间产物；

将所述第七中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第二水解反应，得到第八中间产物；

将所述第八中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第二取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第三反应原料、第五中间产物、第六中间产物、第七中间产物和第八中间产物的结构式依次如下：

(c)当R₁为

R₂为

时，所述制备方法包括以下步骤：

将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑、甲醇和第四反应原料混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第三取代反应，得到第九中间产物；

将所述第九中间产物溶解于甲醇中，采用NaOH水溶液将所得混合液的pH值调节至11.5～12.5，进行皂化反应，得到第十中间产物；

将所述第十中间产物溶解于四氢呋喃中，将所得混合液与1-羟基苯并三唑、二环己基碳二亚胺混合后进行第五活化，之后将所得活化体系与第五反应原料混合，采用N-甲基吗啡啉将所得混合液的pH值调节至8～9，进行第五缩合反应，得到第十一中间产物；

将所述第十一中间产物溶解于乙酸乙酯中，将所得混合液与HCl的乙酸乙酯溶液混合，之后进行第三水解反应，得到第十二中间产物；

将所述第十二中间产物、2-氯乙酰亚胺基乙酯和甲醇混合，采用N,N-二异丙基乙胺将所得混合液的pH值调节至9.5～10.5，进行第四取代反应，得到小分子PAD4抑制剂；

其中，所述第四反应原料、第九中间产物、第十中间产物、第十一中间产物和第十二中间产物的结构式依次如下：

所述第五反应原料为(3-氨基甲基苯基)硼酸、(2-氨基甲基苯基)硼酸或(4-氨基甲基苯基)硼酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述(a)中，所述第一活化在冰浴条件下进行，所述第一活化的时间为8～12min；所述第一缩合反应在室温条件下进行，所述第一缩合反应的时间为7～9h；

所述第一水解反应在冰浴条件下进行，所述第一水解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第二活化在冰浴条件下进行，所述第二活化的时间为8～12min；所述第二缩合反应在室温条件下进行，所述第二缩合反应的时间为7～9h；

所述第一氢解反应在室温条件下进行，所述第一氢解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第一取代反应在室温条件下进行，所述第一取代反应的时间为7～9h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述(b)中，所述第三活化在冰浴条件下进行，所述第三活化的时间为8～12min；所述第三缩合反应在室温条件下进行，所述第三缩合反应的时间为7～9h；

所述第二氢解反应在室温条件下进行，所述第二氢解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第四活化在冰浴条件下进行，所述第四活化的时间为8～12min；所述第四缩合反应在室温条件下进行，所述第四缩合反应的时间为7～9h；

所述第二水解反应在冰浴条件下进行，所述第二水解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第二取代反应在室温条件下进行，所述第二取代反应的时间为7～9h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述(c)中，所述第三取代反应在室温、避光条件下进行，所述第三取代反应的时间为7～9h；

所述皂化反应在冰浴、避光条件下进行，所述皂化反应的时间为3.5～4.5h；

所述第五活化在冰浴条件下进行，所述第五活化的时间为8～12min；所述第五缩合反应在室温条件下进行，所述第五缩合反应的时间为7～9h；

所述第三水解反应在冰浴条件下进行，所述第三水解反应的时间为2.5～3.5h；

所述第四取代反应在室温条件下进行，所述第四取代反应的时间为7～9h。

6.权利要求1所述小分子PAD4抑制剂在制备抗肿瘤药物或抗血栓药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物和抗血栓药物的剂型包括冻干粉。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括抗肿瘤生长药物或抗肿瘤转移药物。

9.根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肉瘤、肺癌、结肠癌或乳腺癌。

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