CN104144919A - 茶氨酸衍生物与羧酸香豆素衍生物的缩合产物及其中间体、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茶氨酸衍生物与羧酸香豆素衍生物的缩合产物式(I)的化合物及其中间体化合物式(II)、式(III)的化合物、制备这些化合物的方法、包含所述化合物的药物组合物及其在制备预防和治疗肿瘤、炎症、心脑血管和免疫缺陷疾病的药物中的用途。

Description

茶氨酸衍生物与羧酸香豆素衍生物的縮合产物

及其中间体、 其制备方法和用途 技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体涉及茶氛酸衍生物与羧酸香豆素衍生物的缩合产物式

( I ) 的化合物及其中间体化合物式（ I I )、 式（ I I I ) 的化合物、 制备这些化合物的方 法、 包含所述化合物的药物組合物及其在制备预防和治疗肿瘤、 炎症、 心脑血管和免疫 缺陷等疾病的药物中的用途。 背景技术

人肺癌、 乳腺癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 肝癌、 胰腺癌、 淋巴瘤和黑色素瘤等恶性 肿瘤的非正常生长、侵袭和转移是导致每年数以万记患者死亡的重要原因，其发病也保持 一定的水平， 已经成为严重危害人类健康的重大疾病。 由于临床化疗和放疗的毒副作用， 限制了对其有效的防治。 茶氛酸（又名谷氨酰乙胺）为茶叶中一种表明其品质优劣的特 征性赛基酸， 由于是无毒副作用的食品成分，使其成为无限制用量的食品添加剂，得以广 泛用于食品工业； 研究表明： 茶氛酸能够增高抗癌药物在肿瘤中的浓度而协同增效治疗 人卵巢癌（Sadzuki et al.， Toxicol Lett. 123: 159-67, 2001 )。 我们先前的实验证明 茶氛酸有抑制肝癌和肺癌的作用（ Liu， et al.， Cy to techno logy 59: 211-217, 2009; Zhang et al. Biosci Biotechnol Biochem. 2002, 66 (4) : 711-6. )。 本发明将茶氛酸通过化学 方法形成了一类新的茶氛酸衍生物与羧酸香豆素衍生物的缩合产物及其中间体化合物，其 抗肿瘤活性超过抗癌药物和茶氨酸。

組蛋白转甲基酶 EZH2 抑制剂和蛋白脱乙酰酶 （ HDAC ) 抑制剂如 SAHA

( suberoylani l ide hydroxamic acid ), valproic acid, 和 sodium butyrate等已经在 美国进行了 I 期或 I I期血液和实体肿瘤临床试验， EZH2和 HDAC在多种人的癌症包括乳 腺癌、 肺癌、 前列腺癌、 白血病、 胰腺癌、 宫颈癌、 肠癌和肝癌等恶性肿瘤中过度表达， 美国对其作用抗癌药物靶点进行了大量的研究，这些 EZH2抑制剂和 HDAC抑制剂被广泛应 用于各种肿瘤疾病的治疗中， 被认为是应用前景较好的潜在的新型抗癌药物（Yamaguchi et al.， Cancer Sci.， 10: 355-62, 2010; Denis, et al.， Cl in Exp Metastasis 25: 183

- 189, 2008; Kel ly et al. , Nat Clin Pract Oncol 2: 150 - 157, 2005 ; Mart ί nez-Iglesias et al. , Cl in Trans 1 Oncol. 10: 395-8, 2008 )。

核蛋白因子 NF- K B被认为是 多种肿瘤和炎症及心脑血管、 免疫缺陷病等疾病的 蛋白因子， 正成为防治这类疾病的重要药物耙点 ( Ishi i et al. , J Cl in Biochem Nutr. 50: 91-105, 2012 )。

高水平的受体 VEGFR、 EGFR和 c-Met、 ER-alpha非正常高表达的肿瘤信号传导相关的 蛋白因子 K-Ras， H-Ras , Akt , Cycl in Dl， MMP-9 , MMP-2 , Dvl-1, Dvl-2, Dvl-3, β -catenin和 Be卜 2与多种肿瘤发生和恶化发展相关， 而上调肿瘤抑制蛋白 p53 , p21 , E-cadherin, Caspase3, Bax和胞浆细胞色素 C水平显示了对多种癌细胞生长、 0^和（或） 转移的抑制作用 ( Cengel, et al.， Neoplasia 9: 341-8, 2007; Huang et al.， Biochem Pharmacol. 77: 794-803, 2009; Prasad et al. , Oncology. 73: 112-7, 2007) , 因此， 这些癌症相关因子成为潜在的防治癌症的重要药物靶点，能够有效地影响这些蛋白因子表 达水平和活性的化合物具有广泛防治癌症的应用前景。

本发明提供的茶氛酸衍生物与羧酸香豆素衍生物的缩合产物式（ I ) 的化合物及其 中间体化合物式（ I I )、 式（ I I I ) 的化合物具有显著的影响上述一系列蛋白因子的水平 和活性，在制备预防和治疗肿瘤、炎症、心脑血管疾病和免疫缺陷病等疾病抑制剂的应用 中有广阔的前景。 发明内容

本发明的一个目的是提供下式（ I )的化合物及其中间体化合物式（ I I )、式（ I I I ) 的化合物：

式 (I)

其中， (qni)

(Sill)

(JIII)

(sill)

( HI)

(。III)

(Πΐ)¾ί

ειε8請 ΪΟΖ OA ε 本发明的另一个目的是提供制备本发明化合物的方法:

1 )制备上述化合物 Ia-Ib、 Ila-IIb的方法，

2 )制备上述化合物 Ic-Ih、 Illc-IIIh的方法，

(Ig) R= CH2CH3 Rl= CI R2= CI (Ih) R= CH2CH3 Rl= Br R2= Br

3 )制备上述化合物 I i的方法： 在还原条件下， 可以容易地将化合物 If 还原为化合 物 I i。

本发明的另一个目的是提供包含本发明化合物的药物組合物， 所述药物組合物包 括至少一种本发明化合物， 和任选的药学上可以接受的賦形剂。

本发明的另一个目的是提供本发明化合物或下式 I l ia的化合物或包含本发明化 合物或式 I l ia的化合物的药物組合物在制备药物、特别是预防和治疗人肝癌、乳腺癌、 肺癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 淋巴瘤和黑色素瘤等肿瘤的药物中的用途。 相应 地， 本发明提供预防和治疗人肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 淋 巴瘤和黑色素瘤等肿瘤的方法， 包括给予需要治疗的患者治疗有效量的至少一种上述 本发明的化合物或式 Ilia的化合物或包含本发明化合物或式 Ilia的化合物的药物組 合物：

式 (Ilia)

本发明还涉及用于预防和治疗人肝癌、 乳腺癌、 肺癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胰腺 癌、淋巴瘤和黑色素瘤等肿瘤的本发明的化合物或式 Ilia的化合物或包含本发明化合 物或式 Ilia的化合物的药物組合物。

本发明的另一个目的是提供本发明化合物或式 Ilia的化合物或包含本发明化合 物或式 Ilia的化合物的药物組合物在制备組蛋白转甲基酶 EZH2抑制剂中的用途、 在制 备組蛋白脱乙酰酶（HDAC)抑制剂中的用途、在制 ^^ 瘤、 炎症和心脑血管病 SLfe疫缺 陷等疾病相关的因子 NF- κ B抑制剂中的用途、 在制备肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺 陷等疾病相关的因子 VEGFR, EGFR, c-Met, ER-alpha, K-Ras, H-Ras, Akt, Cyclin Dl， MMP-9, MMP-2, Dvl-1, Dvl-2, Dvl-3, β -catenin， Be 1-2抑制剂和上调 Bax、 p53, p21, E-cadherin, Caspase3，胞浆与线粒体细胞色素 C之比激活剂中的用途。 相应地， 本发明提供抑制組蛋白转甲基酶 EZH2的方法、 抑制組蛋白脱乙酰酶（HDAC)的方法、抑 制促肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 NF-κΒ的方法、 抑制肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 VEGFR, EGFR, c-Met, ER-alpha, K-Ras, H-Ras, Akt, Cyclin Dl， MMP-9, MMP-2, Dvl-1, Dvl-2, Dvl-3, β -catenin， Bcl-2 和上调 Bax， p53, p21, E-cadherin, Cas pa se 3，胞浆与线粒体细胞色素 C之比激活剂的 方法。

本发明还涉及用于抑制組蛋白转甲 J EZH2剂的方法、抑制組蛋白脱乙酰 SK HDAC )、 抑制促肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 NF-KB、 抑制肿瘤、 炎症 和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 VEGFR, EGFR, c-Met, ER-alpha, K-Ras, H-Ras, Akt, Cyclin Dl， MMP-9, MMP-2, Dvl-1, Dvl-2, Dvl-3, β -catenin， Bcl-2 和上调 Bax, p53, p21, E-cadherin, Cas pa se 3，胞浆与线粒体细胞色素 C之比激活剂的本发明 的化合物。 附图简述

图 1提供了实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih在动物体内外可以检测的萤光显像。 具体实施方式

本发明的一个目的是提供下式（ I )的化合物及其中间体化合物式（ II )、式（ III ) 的化合物：

式 (I)

其中,

式（π)

其中，

式 (III)

其中，

具体地， 化合物 la名称为 5-乙赛基 -5-氧代 -2- (2-氧代 -2H-苯并吡喃 -3-甲酰胺基) 戊酸甲酯， 简称茶甲香酸（TM 具有下式所示的化学结构式：

其物理性状为白色粉末状固体， 熔点在摄氏 154° 以上分解。

中间体茶氛酸甲酯 Ila如下面结构式所示；

化合物 lb名称为 5-乙赛基 -5-氧代 -2- (2-氧代 -2H-苯并吡喃 -3-甲酰胺基)戊酸乙酯, 简称茶乙香酸（TEC ), 具有

其物理性状为白色粉末状固体， 熔点在摄氏 180° 以上分解。

中间体茶氛酸乙酯 lib的制备， 如下面结构式所示：

化合物 Ic名称为（R ) -乙酯 -2- ( 6-C1-2-0-2H-苯并吡喃 -3-羧基） -5- (乙氛基） -5-氧代戊酸酯， 简称茶氨酸氯 的化学结构式：

该化合物的物理性状为淡黄色粉末状固体， 熔点在摄氏 242° 以上分解。

中间体 6-氯香豆素 -3-羧酸的制备， 如下式所示；

0

^^。 。 I IIc 。

化合物 Id名称为（R ) -乙酯 -2- ( 6-Br-2-0-2H-苯并吡喃 -3-羧基） -5- (乙氛基） -5-氧代戊酸酯， 简称茶氨酸溴香酰胺（TBrC ), 具有下式所示的化学结构式：

该化合物的物理性状为淡黄色粉末状固体， 熔点在摄氏 211。 以上分解.

中间体 6-溴香豆素 -3-羧酸 Illd, 如下式所示：

Hid 。

化合物 Ie名称为（1 )-乙酯-2_(6^-2-0-211-苯并吡喃-3- 基）-5-(乙氨基）-⁵- 氧代戊酸酯， 简称茶氨酸氟香酰胺（T 具有下式所示的化学结构式：

该化合物的物理性状为淡黄色粉末状固体， 熔点在摄氏 65。 以上分解。

中间体 6-氟香豆素 -3-羧酸 Ille的制备， 如下式所示； Ille „

化合物 If 名称为（R) -乙酯 -2- (6-N0₂- 0- 2H-苯并吡喃 -3-羧基） - 5- (乙氨基） 氧代戊酸酯， 简称茶氨酸硝香酰胺 （TNC), 具有下式所示的化学结构式：

该化合物的物理性状为淡黄色粉末状固体， 熔点在摄氏 300。 以上分解。 中间体 6-硝基香豆素 -3-羧酸 II If 的制备， 如下式所示;

化合物 Ig 名称为 （R) -乙酯 -2-(6, 8-二氯 -2-氧代 -2 笨并吡喃- 3-甲酰胺基）- 5- (乙氨基） -5-氧代戊酸酯， 简称 有下式所示的化学结构式：

化合物 Ih 名称为 （R) -乙 g旨- 2- (6, 8-二溴 -2-氧代- 2 苯并吡喃 -3-曱酰胺基） -5- (乙象基） -5-氧代戊酸酯， 简称 下式所示的化学结构式；

上述化合物 Ig和 Ih的物理性状为均淡黄色粉末状固体，熔点分别在摄氏 136° 和 12 以上分解。

中间体 6, 8-二氯-香豆素 -3-羧酸 Illg如下式所示： Illg 。

中间体 6, S-二溴-香豆素 - 所示： IIIh。 化合物 Ii名称为（ R ) -乙酯 -2- ( 6-NH₂-0-2H-苯并吡喃 -5- (乙氣基） - 5- 氧代戊酸酯， 具有下式所示的化学结构式：

本发明的另一个目的是提供制备本发明化合物的方法：

1 )制备上述化合物 Ia-Ib、 Ila-IIb的

茶氨酸

2 )

(lg) = CH2CH3 R1=C1 R2= CI (Ih) = CH2CH3 l= Br R2= Br 3 )制备上述化合物 Π的方法： 在还原条件下， 可以容易地将化合物 If 还原为化合 物 Π。

本发明还提供了包含上述本发明化合物的药物組合物。本发明提供了这样的药物組 合物， 其包含至少一种如上所述的本发明的化合物， 和任选的药学上可以接受的賦形 剂。

如本文所使用， 除非另外说明， 术语 "前药"是指可以在生物学条件（体外或体 内）下水解、 氧化或进行其他反应以提供本发明的化合物的衍生物。 前药仅在生物学 条件下经过该反应成为活性化合物， 或者它们在它们不反应的形式中具有活性。通常 可以使用公知的方法制备前药， 例如 1 Burger' s Medicinal Chemi stry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff 编， 笫 5版）中描述的那 些方法。

通过化学修饰成为前药如以下方式：在如下香豆素衍生物的 7位羟基或茶氨酸衍 生物氛基、 坑基、 羰基上接单糖如葡萄糖或维生素 C、 丙二醇等糖、 醇类化合物化学 修饰成为本发明化合物的前药， 这类修饰形成的糖苷键、 脂键、 酰胺键等在体内可分 解为

类似地， 可以在本发明的式 Ia、 Ib、 Ic、 Id、 Ie、 If、 Ig、 Ih和 I i的化合物上 引入羟基或类似的基团。 进一步地， 在上述的 7位羟基或其他任何可能引入羟基的位置（例如， 5位羟基 或茶氛酸直链上可能的位置）上接单糖， 比如葡萄糖、 维生素 C、 丙二醇等糖、 醇类化 合物等任何可能的修饰成分化学修饰成为本发明化合物的前药，这类修饰形成的糖苷 键、 脂键、 酰胺键等在体内可分解为本发明的活性化合物结构或本发明物为主体（或 基本

主产物结构式 （前药化合物) 制备各种含有一定量的活性成分的药物組合物的方法是已知的，或根据本发明的公 开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mart in, E. . , ed. , Mack Publ i shing Company, 19th ed. (1995)所述， 制备所述药物組合物 的方法包括掺入适当的药学賦形剂、 栽体、 稀释剂等。

以已知的方法制造本发明的药物制剂， 包括常规的混合、 溶解或冻干方法。 本发 明的化合物可以制成药物組合物，并向患者以适于选定的施用方式的各种途径施用，例如， 口服或肠胃外（通过静脉内、 肌内、 局部或皮下途径、 鼻腔等部位喷雾、 药片粘贴等）。

因此，本发明的化合物结合药学上可以接受的栽体 (如惰性稀释剂或可同化的可食用 的栽体）可以全身施用， 例如， 口服。 它们可以封闭在硬或软壳的明胶胶囊中， 可以压为 片剂。 对于口服治疗施用， 活性化合物可以结^ -种或多种賦形剂， 并以可吞咽的片剂、 颊含片剂、含片、胶囊剂、 酏剂、 悬浮剂、糖浆、 圆片等的形式使用。 这种組合物和制剂 应该包含至少 0. 1%的活性化合物。 这种組合物和制剂的比例当然可以变化， 可以占给定 的单位剂型重量的大约 1%至大约 99%。在这种治疗有用的組合物中，活性化合物的量使得 能够获得有效剂量水平。

片剂、含片、 丸剂、胶囊剂等也可以包含： 粘合剂， 如黄蓍胶、 阿拉伯胶、 玉米淀粉 或明胶； 賦形剂， 如磷酸氢二钙； 崩解剂， 如玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 藻酸等; 润滑剂， 如¾ 酸镁； 和 剂， 如蔗糖、 ^1、 乳糖或阿司帕坦； 或调味剂， 如薄荷、冬青油或 櫻桃香味。 当单位剂型 囊时， 除了上面类型的材料， 它还可以包含液体栽体， 如植物 油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在，作为包衣，或以其他方式改变固体单位剂型的物 理形式。 例如， 片剂、 丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、 虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以 包含活性化合物 ,蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂， 染料和调味剂（如^ ^香料或桔子香料）。 当然， 用于制备 单位剂型的任何材料应该 是药学上可以接受的且以应用的量羞本上无毒。此外，活性化合物可以掺入緩释制剂和緩 释装置中。

活性化合物也可以通过输注或注射来静脉内或^ I内施用。可以制备活性化合物或其 盐的水溶液， ^地混和无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三 乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在 逸的储存和使用条降下，这些制剂包含防腐剂 以防止微生物生长。 适于注射或输注的药物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散 剂的即时制剂的活性成分（任选封装在脂质体中）的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在 所有情况下，最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体栽体 可以是溶剂或液体分散介盾， 包括， 例如水、 乙醇、 多元醇（例如， 甘油、 丙二醇、 液体 聚乙二醇等）、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以维持合适的流动性，例如， 通过脂质体的形成，通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小，或通过表面活性剂的使 用。 可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂（如对羟苯甲酸酯、 氯丁醇、苯盼、 山椠酸、硫柳 汞等）产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、緩冲剂或氯化钠。 通过使用延緩吸收剂的組合物（例如，单硬脂酸铝和明胶）可以产生可注射的組合物的延 长吸收。

通过将合适的溶剂中的需要量的活性化合物与需要的上面列举的各种其他成分结合， 然后进行过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下， 优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,这会产生活性成分加上任何另外需要的以前 无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。

有用的固体栽体包 碎的固体 (如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧 氧化铝等）。 有用的液体栽体包括水、 乙醇或乙二醇或水 -乙醇 /乙二醇混合物，本发明的化合物可以任 选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。 可以加入佐剂 （如香味） 和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。

增稠剂（如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、 改性纤维素或改性无机 材料）也可和液体栽体用于形成可涂覆的糊剂、 、软骨、肥皂等， 直接用于使用者的 皮肤上。

化合物的治疗需要量， 不仅取决于选择的特定的盐， 而且取决于施药方式、待治疗的 疾病的本盾和患者的年龄和状态， 最终取决于在场医师或临床医生的决定。

上述制剂可以以单位剂型存在， 该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元， 适 于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂，或是很多胶囊或片剂。 根据所涉及的具体治疗， 活性成分的单位剂量的量可以在大约 1到大约 2000毫克或 更多之间进行变化或调整。

此外， 还包括各种药物新剂型如乳脂质体、 微球和纳米球的应用， 如使用微粒分 散体系包括聚合物胶束（polymeric micel les ) 、 纳米乳（ nanoemulsion ) 、 亚微乳 ( submicroemuls微嚢 ( microcapsule )、 ^ki^ ( microsphere )、 脂貭体 ( liposomes ) 和类脂囊泡（ niosomes ) (又称非离子表面活性剂囊泡）等制备的药剂。

本发明还提供本发明的化合物或式 Ilia的化合物或包含本发明化合物或式 Ilia 的化合物的組合物在制备药物、 特别是预防和治疗人肝癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 肺癌、 结 直肠癌、 前列腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等肿瘤的药物中的用途。 相应地， 本发明提供预 防和治疗人肝癌、 乳腺癌、胰腺癌、肺癌、 结直肠癌、前列腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等肿 瘤的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的至少一种本发明的化合物或式 Ilia 的化合物或包含本发明化合物或式 Ilia的化合物的組合物。

本发明还涉及用于预防和治疗人肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 结直肠癌、 前列腺癌、 胰腺 癌、 淋巴瘤和黑色素瘤等肿瘤的本发明的化合物或式 Ilia的化合物或包含本发明化合 物或式 Ilia的化合物的組合物。

本发明的另一个目的是提供本发明化合物或式 Ilia 的化合物或包含本发明化合 物或式 Ilia的化合物的药物組合物在制备組蛋白转甲基酶 EZH2抑制剂中的用途、 在制 备組蛋白脱乙酰酶（HDAC)抑制剂中的用途、在制备促肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺 陷等疾病相关的因子 NF-κΒ抑制剂中的用途、 在制备肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺 陷等疾病相关的因子 VEGFR, EGFR, c-Met, ER-alpha. K-Ras, H-Ras, Akt, Cyclin Dl, MMP-9, MMP-2, Dvl-l,Dvl-2, Dvl-3, β-catenin， Bcl-2/Bax抑制剂和上调 53, p21, E-cadherin, Cas pas e 3，胞浆与线粒体细胞色素 C之比激活剂中的用途。 相应地， 本发明 提供抑制組蛋白转甲基酶 EZH2的方法、 抑制組蛋白脱乙酰酶（HDAC)的方法、 抑制促肿 瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 NF-κΒ的方法、 抑制肿瘤、 炎症和 心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 VEGFR,EGFR， c-Met, ER-alpha. K-Ras, H-Ras, Akt, Cyclin Dl, P -catenin， MMP-9, MMP-2, Dvl-1, Dvl-2, Dvl-3, Bcl-2和上调 Bax, p53, p21, E-cadherin, Caspase3，胞浆与线粒体细胞色素 C之比激活剂的方法。

本发明还涉及用于抑制組蛋白转甲 J EZH2剂的方法、抑制組蛋白脱乙酰 SK HDAC )、 抑制促肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 NF-KB、 抑制肿瘤、 炎症 和心脑血管病及免疫缺陷等疾病相关的因子 VEGFR,EGFR， c-Met, ER-al ha. K-Ras, H-Ras, Akt, Cyclin Dl, P -catenin , MMP-9, MMP-2, Dvl-1, Dvl-2, Dvl-3， Bcl-2/Bax和上 调 p53, p21, E-cadherin, Caspase3，胞浆与线粒体细胞色素 C之比激活剂的本发明的化 合物。 本发明的化合物， 可用于协同放疗、化疗、手术和热疗等药物联合治疗肿瘤， 在制备 用于配合放疗、 化疗、 手术和热疗等肿瘤药物中的用途。

本发明的化合物在能够有效地杀伤肿瘤细胞、能够增强放疗和化疗药物治疗肿瘤的疗 效，本化合物抑制肿瘤的药效超过抗癌药物和茶氛酸， 而且， 毒副作用大大降低， 无明显 毒副作用。

所述肿瘤包括肺癌、 乳腺癌、 肝癌、 直肠癌、 结肠癌、 前列腺癌、 胃癌、食道癌、 脑 和神经性肿瘤、 喉癌、 白血病、淋巴瘤、 黑色素瘤、 子宫癌、视网膜肿瘤、 卵巢癌、皮肤 癌、支气管癌、细支气管癌、尿道癌、 腎癌、 口腔癌、 阴道癌、胆管癌、 癌、膀胱癌、 鼻咽癌以及其它各种肿瘤。

本发明提出的化合物能够整合化疗和增效放疗为一体的功效，是具有应用更广泛、疗 效更好、毒副作用更小、适应症更广、潜在的应用价值和市场效益更大的新型抗肿瘤药物。

本发明所得到的化合物以及其中间体可以通过肌肉、 皮下、 静脉和^注射或口服， 对多种人癌和动物癌细胞和对动物人癌移植瘤的治疗均优于茶氨酸和临床一些抗癌药物 如 新碱、 柔红尊素、 环磷 BsUfe和恩度等。

本发明所得到的化合物以及其中间体可以通过如下方式发挥其萤光特性的应用 功能。 关于其荧光特性用途： 1、 萤光标签作用： 用于一切在黑暗中指示和装饰、 照 明标识、 装饰、 玩具、 道具、 日常用品特别荧光标识、 节能灯、 兗虹灯、 黑暗服饰如 衣服帽鞋、 手套、 背包、 器具的位置标识和安全状态等。 2、 用于环境条件变化的指 示标识， 如： 当环境 pH值、 0₂、 C0₂、 Na、 Ca、 N0₃, 氧化还原状态等改变引起萤光顧 色发生改变而预测环境变化、 食品品质正常与否等指示功能（如： 向本化合物荧光探 针溶液中加入 Ca²⁺时探针在 450 nm左右的荧光强度急剧增加； 当应用香豆素类阴离 子荧光探针，这类探针能在水溶液中选择性的识别 HS0₃—等）。 还可以用于实验研究和 应用作为分子探针， 如在医疗卫生方面： 当用本发明标识细胞或药物或成分， 它可显 示在细胞或体内的位置、 细胞在体内迁移的位置、 结合的靶点如蛋白、 酶、 受体等， 从而发挥诊断预测和评估的作用。

在下列实施例中， 将更加具体地解释本发明。 但应理解， 下列实施例旨在说明本 发明而不对本发明的范围构成任何限制。

以下实施例中所用的化学原料均为商购获得或通过本领域熟知的合成方法获得。 (本申请书中所有涉及到的温度均为摄氏温度 )。 实施例

实施例 1: 化^ la及其中间体 Ila的制备

步骤 1: 制备茶氛酸甲酯 Ila

茶氨酸按照 87g/L的比例溶解在甲醇（指^ ~甲醇溶解 87g克茶氛酸）， l¾U&向体系 緩慢添加二氯亚 ί«体积比为 55 ml, 混合物在室温条件下搅拌 1小时后， 将产生的混合物 在减压条件下浓缩， 获得茶氛酸甲酯 IIa。

步骤 2: 制备茶甲香酸 la

2 Og茶氛酸甲酯溶解于 2L无水二氯甲烷， 加入 27g 3-羧酸香豆素， 分别添加 0.21 L DIPEA (二异丙基乙胺）， 76gEDCI„ 混合物在室温条件下搅拌一小时， 接着减压浓缩， 除 去溶剂， 通过柱层析进行纯化， 收集产物获得茶甲香酸 la, 该产物为淡黄色粉末状固 体， 熔点摄氏 180° 以上分解，该化合物分子的结构特征如下：

^ NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1.15 (t, 3H, 7 = 7.2 Hz) , 2.10-2.17 (m, 1H)， 2.28 - 2.31 (m, 2H)， 2.34-2.41 (m, 1H)， 3.27 - 3.33 (m, 2H)， 3.78 (s, 3H), 4.78 - 4.83 (m, 1H)， 6.07 (br s, 1H)， 7.38 - 7.43 (m, 2H)， 7.67-7.71 (m, 2H)， 8.88 (s, 1H)， 9.35 (br d, 1H， /= 7.6 Hz); ¹³C NMR (125 MHz, CDC1₃) δ 14.81, 28.72, 32.57, 34.47, 52.29, 52.63, 116.75, 117.93, 118.47, 125.39, 129.89, 134.40, 148.81, 154.57, 161.17, 161.74, 171.22, 171.75; ESI-MS m/z 361 [M+l] . 实施例 2： 化^ lb及其中间体 lib的制备

反应总步綠如下：

步骤 1: 制备茶氛酸乙酯 lib

茶氨酸按照 87g/L的比例溶解在乙醇（指^ ~乙醇溶解 87g克茶氛酸）， l¾U&向体系 緩慢添加二氯亚 ί«体积比为 55 ml, 混合物在室温条件下搅拌 1小时后， 将产生的混合物 在减压条件下浓缩， 获得茶氛酸乙酯 IIb。

步骤 2: 制备茶乙香酸 lb

2 Og茶氛酸乙酯溶解于 2L无水二氯甲烷， 加入 27g 3-羧酸香豆素， 分别添加 0.21 L DIPEA (二异丙基乙胺）， 76gEDCI„ 混合物在室温条件下搅拌一小时， 接着减压浓缩， 除 去溶剂， 通过柱层析进行纯化， 收集产物获得茶乙香酸 lb, 该产物为淡黄色粉末状固 体， 熔点摄氏 180° 以上分解，该化合物分子的结构特征如下：

^ NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1.11 (t, 3H, J= 7.2 Hz), 1.28 (t, 3H, 7 = 7.1 Hz) ,

2.17- 2.28 (m, 3H), 2.31-2.40 (m, 1H)， 3.23 - 3.28 (m, 2H)， 4.10-4.13 (m, 1H)，

4.18- 4.22 (q, 2H， 7 = 7.1 Hz) , 5.61 (br s, 1H)， 6.90 (dt, 1H， 7= 7.5, 0.8 Hz), 6.97 (d, 1H， 7 = 8.2 Hz) , 7.28 (dd, 1H， 7= 7.7, 1.6 Hz), 7.34 (dt, 1H， 7= 8.5, 1.6 Hz), 8.39 (s, 1H)， 12.96 (br s, 1H); ¹³C NMR (125 MHz, CDC1₃) δ 14.2, 14.8, 29， 32, 34, 61， 70， 117， 118.5, 118.9, 131, 132, 160， 167， 170， 171; ESI -MS m/z 375 [M+ll. 实施例 3: 化^ Ic及其中间体 IIIc的制备

具体步骤 1: 制备 6-氯-香豆素 -3-羧酸 IIIc

( 1 )依次加入 200 g 5-氯水杨 、 200 mL丙二酸二乙酯、 600 mL无水乙醇和 lOmL 六氢吡啶 (10.3g)及 1ml冰醋酸；（ 2 )在无水条件下，水浴 80Ό条件下，搅拌回流 2h,冷却； (3)加入约 600mL冷水（0Ό),待结晶析出后抽滤并用 100 mL被冰水（0Ό)冷却过的 50% 乙醇洗两次，可得 6-氯香豆素 -3-缩酸酯；（4)分别用加入 6-氯香豆素 -3-欺酸乙酯 124g 和 100g氢氧化钠， 然后加入 500mL无水乙醇和 500mL水， 80Ό水浴条件下， 加热回流约 2h; (5)待^^结束后， 立即置于 0Ό冰浴， 加浓盐酸， 使体系 pH在 2-3之间， 体系会 析出固体，冰^^却后过滤， 用少量冰水洗涤， 干^的粗品用水重结晶进行纯化，获得 6-氯香豆素 -3-羧酸 II Ic。

步骤 2: 制备茶氛酸乙酯 lib

茶氨酸按照 87g/L的比例溶解在乙醇（指^ ~乙醇溶解 87g克茶氛酸）， l¾U&向体系 緩慢添加二氯亚 ί«体积比为 55 ml, 混合物在室温条件下搅拌 1小时后， 将产生的混合物 在减压条件下浓缩， 获得茶氛酸乙酯 IIb。

步骤 3: 制备茶氛酸氯香 BSUfe Ic

20g茶氨酸乙酯溶解于 2L无水二氯甲烷， 加入 27g 6-氯-香豆素 -3-羧酸， 分别添加 0.21 L DIPEA (二异丙基乙胺）， 76g EDCI. 混合物在室温 下搅拌一小时， 接着减压 浓缩， 除去溶剂，通过柱层析进行纯化， 收集产物获得茶氛酸氯香酰胺 Ic, 该产物为淡 黄色粉末状固体， 熔点摄氏 242° 以上分解，该化合物分子的结构特征如下：

^-NMR (500MHz, CDC1₃) δ: 1.12 (t, J = 7.25 Hz, 3H, Cff₃), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, Cff₃), 2.15-2.40 (m, 4H, Cff^, 3.26 (m, 2H， NH-C¾), 4.14 (m, 1H， NH-C¾, 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H， Q-Cff^ , 5.47 (br， 1H， 确， 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H， coumarin-^), 7.25-7.28 (m, 2H， coumarin-J¾ 7^), 8.33 (s, coumarin-^, 12.93 (s, 1H， 确. ¹³C-NMR δ: 14.1 (CH₃)， 14.8 (CH₃)， 29.1 (CH₂)， 32.0 (CH₂)， 34.4 (CH₂)， 61.6 (CH)， 70.0 (CH₂)， 118.7 (C)， 119.3 (CH)， 123.4 (C)， 130.9 (CH)， 132.7 (CH)， 159.6 (C)， 166.3 (C)， 170.7 (C)， 171.2 (C). ESI -MS (a/z)： 407.1 [M-H]— · 实施例 4: 化合物 Id及其中间体 I lid的制备

反应总步綠如下：

具体步骤 1: 制备 6-溴-香豆素 -3-羧酸 11 Id

( 1 )依次加入 200 g 5-溴水杨醛、 200 mL丙二酸二乙酯、 600 mL无水乙醇和 lOmL 六氢吡啶 (10. 3g)及 1ml冰醋酸；（ 2 )在无水条件下，水浴 80Ό条件下，搅拌回流 2h,冷却； ( 3 )加入约 600 mL冷水（0Ό) ,待结晶析出后抽滤并用 100 mL被冰水（0Ό)冷却过的 50% 乙醇洗两次，可得 6-溴香豆素 -3-缩酸酯；（4 )分别用加入 6-溴香豆素 -3-欺酸乙酯 124g 和 100g氢氧化钠， 然后加入 500mL无水乙醇和 500mL水， 80Ό水浴条件下， 加热回流约 2h; ( 5 )待^^结束后， 立即置于 0Ό冰浴， 加浓盐酸， 使体系 pH在 2-3之间， 体系会 析出固体，冰^^却后过滤， 用少量冰水洗涤， 干^的粗品用水重结晶进行纯化，获得 6-溴香豆素 -3-羧酸 II Id。

步骤 2: 制备茶氛酸乙酯 lib

茶氨酸按照 87g/L的比例溶解在乙醇（指^ ~乙醇溶解 87g克茶氛酸）， l¾U&向体系 緩慢添加二氯亚 ί«体积比为 55 ml , 混合物在室温条件下搅拌 1小时后， 将产生的混合物 在减压条件下浓缩， 获得茶氛酸乙酯 IIb。

步骤 3: 制备茶氛酸溴香酰胺 Id

20g茶氨酸乙酯溶解于 2L无水二氯甲烷， 加入 27g 6-溴-香豆素 -3-羧酸， 分别添加 0. 21 L DIPEA (二异丙基乙胺）， 76g EDCI. 混合物在室温 下搅拌一小时， 接着减压 浓缩， 除去溶剂，通过柱层析进行纯化， 收集产物获得茶氛酸溴香酰胺 Id, 该产物为淡 黄色粉末状固体， 熔点摄氏 211° 以上分解，该化合物分子的结构特征如下：

^- MR δ : 1. 12 (t, J = 7. 2 Hz, 3H, Cff₃) , 1. 28 (t, J = 7. 2 Hz, 3H, fi¾) , 2. 17-2. 38 (m, 4H, Cff^ , 3. 26 (m, 2H， -Cff^ , 4. 15 (t, J = 5. 4 Hz, 1H， NH— C¾>， 4. 21 (q, J = 7. 1 Hz, 2H， 0- CH、 5. 50 (br， 1H， 鴯， 6. 87 (d, J = 8. 5 Hz, 1H， coumarin-^ , 7. 39-7. 42 (m, 2H， coumarin-J¾ 7^ , 8. 32 (s, coumarin-^ , 12. 95 (s, 1H， 确. ¹³C-NMR δ: 14.2 (CH₃)， 14.8 (CH₃)， 29.1 (CH₂)， 32.0 (CH₂)， 34.4 (CH₂)， 61.6 (CH) 70.0 (CH₂)， 110.3 (C)， 119.2 (CH), 119.9 (C)， 133.9 (CH), 139.7 (CH), 160.1 (C) 166.2 (C)， 170.7 (C)， 171.2 (C). ESI-MS (a/z)： 451.0 [M-H]— · 实施例 5 : 化合物 Ie及其中间体 Ille的制备

具体步骤 1: 制备 6-氡-香豆素 -3-羧酸 Ille

( 1 )依次加入 200 g 5-氣水杨醛、 200 mL丙二酸二乙酯、 600 mL无水乙醇和 lOmL 六氢吡啶 (10.3g)及 1ml冰醋酸；（ 2 )在无水条件下，水浴 80Ό条件下，搅拌回流 2h,冷却； (3)加入约 600mL冷水（0Ό),待结晶析出后抽滤并用 100 mL被冰水（0Ό)冷却过的 50% 乙醇洗两次，可得 6-氣香豆素 -3-缩酸酯；（4)分别用加入 6-氣香豆素 -3-欺酸乙酯 124g 和 100g氢氧化钠， 然后加入 500mL无水乙醇和 500mL水， 80Ό水浴条件下， 加热回流约 2h; (5)待^^结束后， 立即置于 0Ό冰浴， 加浓盐酸， 使体系 pH在 2-3之间， 体系会 析出固体，冰^^却后过滤， 用少量冰水洗涤， 干^的粗品用水重结晶进行纯化，获得 6-氣香豆素 -3-羧酸 IIIe。

步骤 2: 制备茶氛酸乙酯 lib

茶氨酸按照 87g/L的比例溶解在乙醇（指^ ~乙醇溶解 87g克茶氛酸）， l¾U&向体系 緩慢添加二氯亚 ί«体积比为 55 ml, 混合物在室温条件下搅拌 1小时后， 将产生的混合物 在减压条件下浓缩， 获得茶氛酸乙酯 IIb。

步骤 3: 制备茶氛酸氣香酰胺 Ie

20g茶氨酸乙酯溶解于 2L无水二氯甲烷， 加入 27g 6-氡-香豆素 -3-羧酸， 分别添加 0.21 L DIPEA (二异丙基乙胺）， 76g EDCI. 混合物在室温 下搅拌一小时， 接着减压 浓缩， 除去溶剂，通过柱层析进行纯化， 收集产物获得茶氛酸氣香酰胺 Ie, 该产物为淡 黄色粉末状固体， 熔点摄氏 300。 以上分解，该化合物分子的结构特征如下：

m. p.: 109-111 C. ^- MR δ: 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3H, Cff₃), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, Cff₃), 2.17-2.38 (m, 4H, Cff^, 3.26 (m, 2H， NH-C¾)， 4.15 (t, J = 5.4 Hz, 1H， NH-C¾, 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H， 0- Cff₂), 5.50 (br， 1H， 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H， coumarin-^), 7.39-7.42 (m, 2H， coumarin-J¾ 7^), 8.32 (s, coumarin - 12.95 (s, 1H， 确. ¹³C-NMR δ: 14.2 (CH₃)， 14.8 (CH₃)， 29.1 (CH₂)， 32.0 (CH₂)， 34.4 (CH₂)， 61.6 (CH)， 70.0 (CH₂)， 110.3 (C)， 119.2 (CH)， 119.9 (C)， 133.9 (CH)， 139.7 (CH)， 160.1 (C)， 166.2 (C)， 170.7 (C)， 171.2 (C). ESI -MS (a/z)： 451.0 [M-H]— · 实施例 6: 化^ If及其中间体 Illf的制备

反应总步綠如下：

具体步骤 1: 制备 6-硝基-香豆素 -3-羧酸 II If

将香豆素 -3-酸 50 g溶于 240 mL浓硫酸， 冷至 -10 °C, 加入浓硝酸和浓硫酸的混酸溶 液（80 mL， 浓硝酸和浓硫酸体积比为 1 ： 3), 在 0 °C下搅拌反应 1小时， 再升至室温 搅拌反应 1小时。 将反应液倾入 5000 mL冰水， 静置析晶， 抽滤， 用冰水洗涤， 干燥， 得 6-硝基香豆素 -3-羧酸淡黄色无定形固体获得 6-硝基香豆素 -3-羧酸 Illf。

步骤 2: 制备茶氛酸乙酯 lib

茶氨酸按照 87g/L的比例溶解在乙醇（指^ ~乙醇溶解 87g克茶氛酸）， l¾U&向体系 緩慢添加二氯亚 ί«体积比为 55 ml, 混合物在室温条件下搅拌 1小时后， 将产生的混合物 在减压条件下浓缩， 获得茶氛酸乙酯 IIb。

步骤 3: 制备茶氛酸硝香 BSUfe If

20g茶氨酸乙酯溶解于 2L无水二氯甲烷， 加入 27g 6-硝基-香豆素 -3-羧酸， 分别添 加 0.21 L DIPEA (二异丙基乙胺）， 76g EDCI。 混合物在室温条件下搅拌一小时， 接着减 压浓缩， 除去溶剂， 通过柱层析进行纯化， 收集产物获得茶氛酸硝香酰胺 If， 该产物为 淡黄色粉末状固体， 熔点摄氏 165° 以上分解，该化合物分子的结构特征如下： m. p.: 109-111 C. ^- MR δ: 1.12 (t, J = 7.2 Hz, 3H, Cff₃), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, Cff₃), 2.17-2.38 (m, 4H, Cff^, 3.26 (m, 2H， NH-C¾)， 4.15 (t, J = 5.4 Hz, 1H， NH-C¾, 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H， 0- Cff₂), 5.50 (br， 1H， 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H， coumarin-^), 7.39-7.42 (m, 2H， coumarin-J¾ 7^), 8.32 (s, coumarin - 12.95 (s, 1H， 确. ¹³C-NMR δ: 14.2 (CH₃)， 14.8 (CH₃)， 29.1 (CH₂)， 32.0 (CH₂)， 34.4 (CH₂)， 61.6 (CH)， 70.0 (CH₂)， 110.3 (C)， 119.2 (CH)， 119.9 (C)， 133.9 (CH)， 139.7 (CH)， 160.1 (C)， 166.2 (C)， 170.7 (C)， 171.2 (C). ESI-MS (a/z)： 451.0 [M—H]— · 实施例 7: 化合物 Ig、 Ih及其中间体 IIIg、 Illh的制备

反应总步綠如下：

X=C1, IIIg=DClC, 最终产物为 Ig; X=Br, IIIh=DBrC, 最终产物为 Ih。

具体步骤 1: 制备 6, 8-二氯-香豆素 -3-羧酸 II Ig和 6, 8-二溴-香豆素 -3-羧酸 II Ih

( 1 )依次加入 200 g 3, 5-二氯水杨 或 3, 5-二溴水杨醛、 200 mL丙二酸二乙酯、 600 mL无水乙醇和 lOmL六氢吡啶（10· 3g)及 1ml冰醋酸； （ 2 )在无水条件下，水浴 80Ό条 件下，搅拌回流 2h, 冷却； （3)加入约 600 mL冷水 (0Ό), 待结晶析出后抽滤并用 100 mL 被冰水 (ΟΌ)冷却过的 50%乙醇洗两次， 可得 6, 8-二氯香豆素 -3-缩酸酯或 6， 8-二溴香豆 素 -3-缩酸酯； （4)分别用加入 6, 8-二氯香豆素 -3-缩酸酯或 6， 8-二溴香豆素 -3-缩酸酯 124g和 100g氢氧化钠， 然后加入 500mL无水乙醇和 500mL水， 80Ό水浴条件下， 加热回 流约 2h; (5)待反应结束后， 立即置于 冰浴， 加浓盐酸， 使体系 pH在 2-3之间， 体 系会析出固体， 冰^^却后过滤， 用少量冰水洗涤， 干^的粗品用水重结晶进行纯化， 获得 6, 8-二氯香豆素 -3-羧酸或 6, 8-二溴香豆素 -3-羧酸。

步骤 2: 制备茶氛酸乙酯 lib

茶氨酸按照 87g/L的比例溶解在乙醇（指^ ~乙醇溶解 87g克茶氛酸）， l¾U&向体系 緩慢添加二氯亚 ί«体积比为 55 ml, 混合物在室温条件下搅拌 1小时后， 将产生的混合物 在减压条件下浓缩， 获得的茶氨酸乙酯。

步骤 3: 制备茶双氯香酰胺 Ig和茶双溴香酰胺 Ih

2 Og茶氛酸乙酯溶解于 2L无水二氯甲烷， 加入 27g 6, 8-二氯-香豆素 -3-羧酸或 6, 8-二溴香豆素 -3-羧酸， 分别添加 0.21 L DIPEA (二异丙基乙胺）， 76g EDCI。 混合物在 室温条件下搅拌一小时， 接着减压浓缩， 除去溶剂， 通过柱层析进行纯化， 收集产物获 得茶双氯香酰胺 Ig或茶双溴香酰胺 Ih,该产物为均淡黄色粉末状固体，熔点摄氏 136° 和 121。 以上分解，这两个化合物分子的结构特征分别如下： （I )所示的茶双氯香酰胺 ( DTC1C ): ^- MR δ: 1.11 (t, J = 1.2 Hz, 3H, NHCH₂CH₃) , 1.28 (t, J= 7.1 Hz, 3H, 0CH₂CH₃) , 2.19-2.40 (m, 4H, CH₂CH₂) , 3.20-3.29 (m, 2H， NHCH₂CH₃) , 4.18-4.25 (m, 3H),

6.20 (br s, 1H， 确， 7.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H， coumarin-5^) , 7.39 (d, J = 2.4 Hz, 1H， coumarin-7^), 8.35 (s, coumarin-^, 14.02 (br s, 1H， 确 12.95 (s, 1H， 确. ¹³C-NMR δ: 13.92 (CH₃)， 14.52 (CH₃)， 28.90 (CH₂)， 31.45 (CH₂)， 34.16 (CH₂)， 61.49 (CH)， 69.08 (CH₂)， 119.15 (C)， 122.43 (CH)， 122.65 (C)， 129.31 (CH)， 132.31 (CH)， 156.07 (C), 165.68 (C)， 170.14 (C)， 171.04 (C). ESI-MS (n/z)： 441.0 [M—H]— · 茶双溴香 BSUfe ( DTBrC ): ^-NMR δ: 1.12 (t, 7 = 7.3 Hz, 3H, NHCH₂CH₃) , 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, 0CH₂CH₃) , 2.17-2.28 (m, 4H, CH₂CH₂) , 3.22-3.29 (m, 2H， NHCH₂CH3), 4.18-4.26 (m, 3H), 5.75 (br s, 1H， 7.38 (d, J = 2.3 Hz, 1H， coumarin-5^) ,

7.71 (d, J = 2.3 Hz, 1H， coumarin-7^) , 8.32 (s, coumarin-^, 14.12 (br s, 1H， 确 12.95 (s, 1H， 确. ¹³C-NMR (100MHz, CDC1₃) δ: 14.07 (CH₃)， 14.71 (CH₃)， 28.99 (CH₂)， 31.65 (CH₂)， 34.34 (CH₂)， 61.66 (CH)， 69.16 (CH₂)， 109.80 (C)， 112.09 (CH)， 119.82 (C)， 133.14 (CH)， 137.96 (CH)， 157.48 (C)， 165.63 (C)， 170.20 (C)， 171.04 (C). ESI-MS (jn/z)： 528.5 [M-H]— · 实施例 8: 实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体以及式 Ilia的化合物对各种人癌细胞系 灭活作用

参照文献方法 ( Zhang Y, et al.， Cy to techno logy 2009, 59 (3) : 191-200 )测定 了上述实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体和阳性对照抗癌药物等体外培养对各种人癌 细胞灭活作用， 结果见下表 -1。

1、 细胞系和细胞培养： AJ^癌 A549和 H460, 人乳腺癌 MCF-7和 MDA-MB-231 , 人胃 癌 BGC-823,人前列腺癌 PC-3,人慢性白血病 K562,人淋巴瘤细胞 U937,人肝癌 SMMC7721 和 HepG2, 人结肠癌 HT29, A U^癌 PANC-1和 BxPC3和人宫颈癌 Hela 细胞系、 人脑瘤 Daoy、 人神经瘤 D54和耐药性强的人口腔表皮癌细胞 KBV200系 小鼠黑色素瘤 B16以及 高转移的 Lewis肺癌细胞系细胞系购于美国 American Type Culture Col lection. 这些 细胞分别用 DMEM和 RPMI-1640培养液培养；

2、 仪器设备：

二氧« ^培养箱： 3111型，美国 Thermo公司；倒置荧 E微镜： TE2000-U型，日本 Nikon 公司。 倒置显微镜： CKX31型， 日本 Olympus公司； 台式高速冷冻离心机： 5810R型， 德国 Eppendorf公司；微量加样器：德国 Eppendorf公司； 细胞培养塑料平板（ 96孔）： BD公司； 酶标仪： SYNERGY HT型多功能酶标仪， 美国 BI0-TEK公司； 制¾^： XB 70型， GRANT公司； 美国 Carestream Health公司柯达体内 X射线和萤t*J~动物体内活体显像仪 Kodak Image Station 2000。

实验采用 MTT法测试实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体以及式 I lia的化合物在体 外条件下对癌细胞生长的抑制作用， 苔芬蓝染色法对其验证。 步骤如下：

1、 主要试剂、 细胞系和仪器：

癌细胞系和仪器如上 1和 2所述。

RPMI1640和 DMEM培养液： Hyclone公司； 已灭活胎牛血清： Hyclone公司； 肢蛋白醉（trypsin) : Amersco公司； 0. 4%台盼蓝： Sigma公司；

四甲基偶氮唑盐 (MTT) : Sigma公司；

2、 实验步骤：

( 1 ) 用 0. 25%的胰蛋白酶消化对数生长期的癌细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓 度为 5 lOVmL, 以 100 μ 1每孔接种于 96孔培养板；

( 2 ) 将培养板移入 37 , 5% C02饱和湿度培养箱中培养 24 h; 加入浓度为（ 1-1000 Μ/L )的实施例 1 - 7获得 Ia-Ih的化合物及其中间体以及式 I lia的化合物或阳性药物 对照抗癌药物其终浓度为 0. 1-1500 μ Μ/L. 设对照孔（只加细胞悬液 200 μ 1 )和无药物 空白对照孔（含溶媒 0. 01% DMS0 ), 每組均设 8个复孔， 置 37Ό , 5% C02饱和湿度培养 箱内培养；

( 3 ) 分别于加药 48 h、 72 h后取出 96孔板， 小心吸弃原培养基， 每孔加入 100 μ ΐ无血清的 DMEM培养基及 ΙΟ μ Ι ΜΤΤ (5 mg/mL)溶液， 继续培养 4 h后， 终止培养；

( 4 ) 小心吸弃孔内上清液， 每孔加入 150 μ ΐ DMSO, 室温震荡 10-15 min, 使结 晶充分溶解。

( 5 ) 比色： 选择 570 nm波长， 在酶标仪上测定各孔吸光值（ A值）， 记录结果； 整 个均实验重复 3次；

( 6 ) 实验结果按下式计算：相对存活率 = (各实验組 A值 /细胞对照組 A值） X 100% 中效浓度 (IC50， 即抑制率为 50%时的药物浓度， 又称半数抑制浓; 的计算：

用回归方程求出受检测的成分的 IC50。

3、 实验结果（见表 1 )

表 1 实施例 1 - 7获得的化^ 及其中间体对人癌细胞生长的抑制作用

表 1-续

注： * p < 0. 05与溶媒对照相比较； 有关 MTT测试细胞生长的方法见上述实验方法部分. 上述结果使用苔芬蓝染色法对其验证表明药效相同无误.

§为表中所列化 ^^分别处理 72小时后 50¾癌细胞成活的药物浓度 ( IC50 )。

A549: AJJ^癌； NCI- H460: H460 AJ!^癌； MB231: MDA- MB231 (雌激素受体阴性高转移的人乳腺癌）； MCF-7:雌激素受体阳性的人乳腺癌； S- 7721: SMMC7721

( f癌）； PANC-1: J&^癌； Hela: 人宫颈癌； LLC: Lewis lung cancer (高转移小鼠肺癌）； BGC-823: 人胃癌； PC— 3: 人前列腺癌； U937: Λϋ织 细胞淋巴瘤细胞； Jf癌; HT29: 人结肠癌； B16: 黑色素瘤； K562: 人白血病； BxPc3: 人 癌； HepG2: 人肝癌； Caski: 人宫颈癌； Daoy: AJi¾瘤； D54: 神经瘤； KBV200: 强耐药性人口腔表皮癌细胞.

实施例 9: 实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体抑制棵鼠体内多种人癌移植瘤生长和小 鼠肺癌转移的实验

参照文献方法 (George N. Naumov, et al. Combined Vascular Endothel ial Growth Factor Receptor and Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Blockade Inhibi ts Tumor Growth in Xenograft Models of EGFR Inhibi tor Res is tance Clin Cancer Res 2009， 15: 3484-3494; 杨镇洲等， )测定了实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体对多种 人癌动物移植瘤体内生长的抑制作用， 结果见下表 -2。

1、 实^物， 细胞系， 主要试剂和仪器：

SPF级 BALB/c棵小鼠和 C57/BL6J小黑鼠， 4 ~ 5周龄， 18 ~ 22g, 雌性， 购自北京华阜康 实验动物中心， 动物许可证号 SCXK (京） 2009-0004。 饲养于 SPF级动物实验室； IVC独立 送回风笼，苏州苏杭科技器材有限公司； 人肺癌 A549,雌激素受体阴性的人乳腺癌 MDA-MB231,雌激素受体阳性的人乳腺癌 MCF-7,人肝癌 SMMC7721, 人 U^癌 PANC-1, 人宫 颈癌 Hela, 高转移的 Lewi s lung cancer细胞系和其它仪器如上所述。 RPMI1640和 DMEM 培养液: Hyclone公司；已灭活胎牛血清： Hyclone公司，-20 O^M ;胰蛋白酶（tryps in)： Amersco公司； 0. 4%台盼蓝： Sigma公司；

2、 实验步骤：

(1) 细胞培养和移植性肿瘤动物模型的建立：人癌细; 分别培养于含 10%胎牛血 清的 DMEM或 RPMI-1640培养液中， 在 37 Ό、 5% C0₂的条件下培养， 收集对数生长期的细胞 并制备成浓度为 2 x l O⁷个 /ml的单细胞悬液，于超净工作台内每只棵小鼠于; 部皮下 分别接种 0. 1 ml细胞悬液，每^ 注射点有无红肿破溃。 约 2-5周后， 注射局部出现明 显皮丘， 所有棵鼠均出现直径约 10-15 mm的皮下结节，移植瘤模型建立； 对于建立小鼠 Lewis肺癌转移模型， 制备成浓度为 6 X 10⁶个 /ml的单细胞悬液， 静脉注射 0. 1 ml细胞悬 液进入 C57/BL6J小黑鼠尾静脉后分組笫 2天开始用药， 用药剂量和方式同于棵鼠见如下说 明。

(2) 棵鼠分組和给药： 于接种约 2-5周后将已建立皮下移植瘤模型的棵小鼠随机分 为 3組， 每組 7只； 阴性对照組（溶媒 DMDO 0. 05%, «Jg注射 0. 2ml/只， 每日一次； 药物和 成分均为腹腔注射 ( 60-90 mg/kg )： 抗癌药物顺铂（1. 5 mg/kg/day ). 环磷酰胺

( 60mg/kg/2day )和恩度（ 8 mg/kg )阳性对照組， 实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体 的各組，每日一次，用药治疗 3-5周；对于检测药物对体内肿瘤 EZH2H和 HDAC酶酶活性的影 响， 在用药 6小时后分别切除肿瘤， 分别提取总蛋白和提 蛋白用于酶活，1»测分析， 用阴性对照为 DMS0 ( 0. 05% )溶媒、 阳性对照 SAHA ( suberoylani l ide hydroxamic acid ) 25mg/kg鼠）或实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体处理小鼠 6小时后取瘤，总蛋白和核蛋 白提取物由总蛋白裂解液和核蛋白裂解液提取（总蛋白裂解液、 核蛋白裂解液以及 PMSF 购于碧云天生物技术研究所）， lmg肿瘤組织加人 1 mL裂解液中加入 10 μ ΐ PMSF, 反复吹 打混匀， 冰上放置 15 min; 将样品转移至 1. 5 mL EP管中， 14000 r/min, 离心 10 min, 将上清蛋白提取物转移到无菌 EP管中用于检测酶活性。

(3)棵鼠肿瘤瘤体生长的观察：每天观察棵鼠的活动情况（包括进食、 大小便性状、精 神状态等）、移植瘤的出瘤时间及生长情况，每 2-3天测量一次体重、瘤体的大小， 用游标 卡尺量瘤体的长径 a及短径 b (隱）， 计算其体积， 体积 ν= π 1/2 · ab2 ( mm3 );

(4) 动物的处死： 治疗实验结束， 麻醉小鼠， 照相； 断颈处死棵鼠， 在无菌条件 下剥离瘤組织， 称取瘤重； 检测药物对各器官和組织的病理和毒性影响情况。

(5) 通过实验組移植瘤的瘤重与空白对照組瘤重（或肺转移瘤）相比较计算抑瘤 率， 即抑瘤率（％) = ( 1 -实验組平均瘤重 /对照平均瘤重） χ ΐοο% 。

3. 实验结果 （JL^2 )

表 2-1 实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体对多种人癌动物移植瘤体内生长和小鼠肺癌转移的抑制作用 *

注： * ρ< 0. 05; 有关测试方法见上述实验方法部分； §抑制率 %是与 DMS0溶媒对照組相比较、用药組对肿瘤重量的平均抑制率（％ )；

Α549: AJ ^癌； MB231: MDA-MB231 (雌激素受体阴性高转移的人乳腺癌）； MCF-7: 雌激素受体阳性的人乳腺癌； S-7721 : SMMC772 (人肝癌）； PANC-1: 人 ^癌； Hela: 人宫颈癌； LLC: Lewi s lung cancer (高转移小鼠肺癌）； TMC: 茶甲香酰胺組； TEC: 茶乙香 BSUfe組； TCLC: 茶氛酸氯香 BSUfe組； TBrC: 茶氛酸溴香 BSUfe組； TFC: 茶氛酸氣香 BSUfe組； TNC: 茶氛酸硝香 BSUfe組； DTCLC:

茶双氯香酰胺組； DTBrC: 茶双溴香酰胺組； TE: 茶氨酸乙酯組； TM: 茶氨酸甲酯組； A: 顺铂組（ Cisplat in ); B: 环磷酰胺 ( CTX ); ES: 恩度組； Ctrl: 溶斜照（DMSO )。

动物病理和毒理学分析结果表明： 在实验期间， 全部合成成分使用剂量 60 mg/kg处理正常的动物和治疗的人癌移植瘤棵鼠， 未见产生毒副作用， 体重未见减少， 心、 肝、 脾、 肺、 腎、 胃肠道、 生殖腺、 脑、 骨骼肌未见毒性。 阳性对照药物顺铂組、 环磷 胺組小鼠有毒性反应， 表现体重下降、 厌食、 用药 2周后出现腹部肿脒 行动避緩等现象。 阳性对照組顺铂、 环磷酰胺和恩度的 鼠也出现体重下降、 厌 行动避緩等毒性现象。

急性毒性实验结果： 本发明的全部合成成分 2500 mg/kg 口服施用未见小鼠死亡。 表 2-2 实施例 1 - 7获得的化合物及其中间体对多种人癌动物移植瘤体内生长和小鼠肺癌转移的抑制作用 *

注： * ρ< 0. 05; 有关测试方法见上述实验方法部分； §抑制率 %是与 DMSO溶媒对照組相比较、用药組对肿瘤重量的平均抑制率（％ )； Α549: AJ ^癌； MB231: MDA-MB231 (雌激素受体阴性高转移的人乳腺癌）； MCF-7: 雌激素受体阳性的人乳腺癌； S-7721: SMMC772

(人肝癌）； PANC-1: 人 U^癌； Hela: 人宫颈癌； LLC: Lewis lung cancer (高转移小鼠肺癌）； TMC: 茶甲香酰胺組； TEC: 茶乙香 BSUfe組； TCLC: 茶氛酸氯香 BSUfe組； TBrC: 茶氛酸溴香 BSUfe組； TFC: 茶氛酸氣香 BSUfe組； TNC: 茶氛酸硝香 BSUfe組； DTCLC: 茶双氯香酰胺組； DTBrC: 茶双溴香酰胺組； TE: 茶氨酸乙酯組； TM: 茶氨酸甲酯組； A: 顺铂組（ Cisplat in ); B: 环磷酰胺

( CTX ); ES: 恩度組； Ctrl: 溶斜照（DMSO )。

动物病理和毒理学分析结果表明： 在实验期间， 全部合成成分使用剂量 90 mg/kg处理正常的动物和治疗的人癌移植瘤棵鼠， 未见产生毒副作用， 体重未见减少， 心、 肝、 脾、 肺、 腎、 胃肠道、 生殖腺、 脑、 骨骼肌未见毒性。 阳性对照药物顺铂組、 环磷 胺組小鼠有毒性反应， 表现体重下降、 厌食、 用药 2周后出现腹部肿脒 行动避緩等现象。 阳性对照組顺铂、 环磷酰胺和恩度的 鼠也出现体重下降、 厌 行动避緩等毒性现象。

急性毒性实验结果： 本发明的全部合成成分 2500 mg/kg 口 JI fe用未见小鼠死亡。

实施例 10: 实施例 1 - 7获得的化合物的萤光显像

参照文献方法（ Chen Y, et al. ,

2- (3- {l-Carboxy-5- [ (6- [18F] f luoro-pyridine-3-carbonyl) - amino] -pentyl} -ureido) -pentanedioic acid, [18F] DCFPyL, a PSMA- based PET imaging agent for prostate cancer. Clin Cancer Res, 2011， 17 (24) : 7645-53. ) , 测定了实 施例 1 - 7获得的化合物的萤 波长范围， 结果见下表 3以及附图 1。

1、 实 物， 细胞系， 主要试剂和仪器:详细参考实施例 9部分。

2、 实验步骤： 对于体外荧光显像和检测： 用实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih在 1. 5ml塑料离心管中配制为 60mg/0. 2ml浓度， 分别使用多功能酶标仪和动物体内显像仪 在如下激发和发射波长条件检测记录荧光信号和图像， 获得结果如表 3和附图 1 (小试管 照片）； 对于动物体内荧光显像的检测： 实验动物禁食 16小时（饮水正常供应）后， 用 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih按照 60mg/kg体重 /0. 2ml浓度配制和动物腹腔给药， 使用动物体内显像^ E如下 ¾ L和发射波长^ ^检测记录荧光图像，获得的结果如附图 1 (动物体内显像照片）； 实验 ¾ L波长范围： 360 nm至 590 nm; 检测波长范围： 410nm 至 700 nm.

3. 实验结果 （JL^J )

表 3 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih在动物体内外可以检测的萤 波长范围

注： 实验检测条件： 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih在动物体内外可以检测的萤光显像 和波长范围

( 1 )实验给药浓度： 60mg/kg体重 /0. 2ml; ( 2 ) 激发波长范围： 360nm至 590nm; 可 检测波长范围： 410nm至 690nm. 实施例 11： 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih对动物体内 EZH2酶活性抑制作用实验；

1、 实 物， 细胞系、 仪器和主要试剂、 ：

实 物棵小鼠， 细胞系和仪器详见上述详细参考实施例 9动物实 分。

EZH2 Assay Kit, 购自 BPS Bioscience公司。

检测实施例 1 - 7获得的化合物对 EZH2酶活性的抑制作用，实验方法严格按照试剂盒 附带的说明书操作，步綠如下：

2、 实验步骤：

(1) 向微孔板中每个反应孔中加入 150μ1的 TBST緩冲液，室温下孵育 15min，甩去緩冲液；

(2) 按照说明，配制 S-腺苷甲 酸和 EZH2酶工作液， 操作始终在冰浴上进行；

(3) 按照说明书所注明的比例，配制空白对照品，底物对照品， 阳性对照品和抑制剂对照 品；

(4) 将配制好的各对照品和待测试的样品（各組肿瘤蛋白提取物取代 EZH2酶）分别加入 孔中， 50μ1/孔，室温下反应 lh，每个样品均设 2个平行孔； 各組肿瘤蛋白提取物获得 方法详见如上（四）动物实验部分。 洗板封闭：每个反应孔加入 200μ1 TBST緩冲液洗板， 重复 3次； 再向每个反应孔加入 ΙΟΟμΙ封闭緩冲液，摇床上摇动封闭 lOmin,弃去液体；

(5) 将稀释好的一抗工作液加入反应孔中， ΙΟΟμΙ/孔，摇床上反应 lh;

(6) 封闭，同操作 (5) ;

(7) 将稀释好的 HRP标记的二抗工作液加入反应孔中， ΙΟΟμΙ/孔，摇床上反应 30min;

(8) 封闭，同操作 (5) ;

(9) 将 HRP化学发光底物 A和 B在冰浴上等体积混合均匀后，加 应孔中， 1 ΟΟμΙ/孔；

(10)立即在酶标仪上读取荧光数值

3、 实验结果 （JL^ 4 ) 表 4 实施例 1-7获得的化合物 Ia-Ih对体内调节与肿瘤生长、 侵袭和转移、 心脑血管疾病、 免疫缺陷疾病以及炎症等密切相关酶活性 的影响

表 4-续

注： * p<0.05; 有关测试方法见上述实猃方法部分。 H3和 H4乙酰化水平（¾)通过 Western Blotting分 LLC: 高转移 Lewis 小鼠肺癌析获得， 方法详见如 下实施例 12- 13相关部分内容。

实施例 12： 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih对組蛋白脱乙 Bit基酶 ( HDAC )酶活性抑制作 用的实验；

1、 实 物， 细胞系、 仪器和主要试剂

实 物棵小鼠， 细胞系和仪器详见上述详细参考实施例 9动物实 分。

EpiQuik HDAC Act ivity/Inhibition Assay Kit (Colorimetric) , Epigentek公司

EpiQuik Nuclear Extract ion Kit , Epigentek公司

2、 实验步骤：

(1) 严格按照 EpiQuik Nuclear Extraction Kit说明书的操作要求， 制备药物处理的肿瘤 核提取物见上述（四）动物实验部分； 每个样品均设 2个平行孔；

(2)在每个反应孔中加入样品稀释液 50μ11, 封板膜封板后室温下反应 30min;

(3)小心揭掉封板膜， 弃去液体， 甩干， 每孔加满洗涤液 150μ1 , 静置 30秒后弃去， 如此 重复 2次， 拍干；

(4) 将 2 μΐ的 HDAC酶或肿瘤組织核提取物分别与 28 μΐ的样品稀释液混匀，加入孔中， 封^ J封^ 37 下^^ 60min_;

(5)絲3次， 操作同（2)；将稀 ^的捕捉抗体工作 入到每个^^孔中， 50μ1/孔，室温

(6)絲 4次， 操作同（2) ;

(7)将稀 的检测抗体工作¾ 入到每个 孔中， 50μ1/孔，室温下 3( η;

(8) 5次， 操作同（2) ;

加入显色剂， ΙΟΟμΙ/孔， 室温下避光显色 2-10min;

(9)当标准品孔的顧色变为中等强度的蓝色时，每孔加入 50μ1的终止液终止反应， 此时蓝 色立转黄色；

(10) 450nm波长^ ^测量各孔的吸光度 (0D值）。 测定应在加终止^ 以内进行； (12)酶活性抑制率按照以下公式计算：

抑制率％= [1- (0D阳性对照- 0D样品） / (0D阳性对照- 0D空白对照）] 100%

3、 实验结果（JL^ 4 )

实施例 13: 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih对多种肿瘤生长、侵袭和转移、 心脑血管疾 病和免疫缺陷疾病以及炎症等等密切相关蛋白因子水平调控作用实验

应用 Western Blotting法检测实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih对以下肿瘤相关蛋白 因子水平调控作用， 步骤如下：

1、 主要试剂和仪器：

抗体： VEGFR , EGFR, c-Met, K-Ras, H-Ras , Akt, NF- B, Cycl in Dl， ER-alpha, Dvl-l, Dvl-2, Dvl-3, MMP-9, MMP2, β -catenin , Bcl-2, Bax, p53 , p21 , E-cadherin, Caspase3蛋白一抗购于美国 Cel l Signal ing Technology公司和 Santa Cruz Technology公司； H3乙酰化、 H4乙酰化和 HDAC ( HDAC3和 HDAC4等） Antibody Sample Kit抗体购自美国 Cel l Signal ing Technology公司。

RPMI-1640, DMEM培养液和已灭活胎牛血清购于 Hyclone公司； 胰蛋白酶（tryps in) 购于 Amersco公司； 蛋白质 Marker, 0. 4%台盼蓝： 购于美国 Sigma公司； PVDF膜购于 Mil l ipore公司；

总蛋白裂解液和核蛋白裂解液以及 PMSF (苯甲 酰氡）溶液购于碧云天生物技术 研究所； 二抗： 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、 ^t 氧化物酶标记驴抗山羊、 彩色预染蛋白分子量标准、 ECL Plus发光试剂盒、 定影粉、 显 影粉购于碧云天生物技术研究所； 医用 X射线胶片购于柯达公司。

二氧tt ^培养箱： 3111型， 美国 Thermo公司；倒置显微镜： CKX31型， 日本 Olympus 公司；台式高速冷冻离心机： 5810R型，德国 Eppendorf公司；微量加样器：德国 Eppendorf 公司； 细胞培养塑料平板（ 6孔）： Nunclon公司； 小型垂直电' t: 美国 BI0-RAD公司； 小型湿式电转移槽： 美国 BI0-RAD公司； 脱色摇床： TS-1型， 江苏海门市 贝尔仪器 制造有 司；制¾1^： XB 70型， GRANT公司； OMEGA10 像分析仪：美国 lTRA LUM 公司； 封口机： SF-B型， 温州市兴业 司； 蛋白分析灯箱： 上海荆轲实业有限 公司。

2、 实验步骤：

(1) 细胞处理： 取对数生长期的细胞接种于 6 ^中， 待细胞密度长至 70% ~ 80%左右， 分别向细胞中加入受检测实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih、 阳性对照药物环磷酰胺等， 使其终浓度分别为 1-1500 μ Μ/L, 另设无药物含溶媒 ( 0. 01%DMSO )等体积细胞培养液的 对照組， 继续培养 48h后， 收集细胞；

( 2 )细胞蛋白提取： 用冷 PBS洗 2次后， 用总蛋白或核蛋白细胞裂解液裂解细胞， l mL 裂解液中加入 10 μ ΐ PMSF, 吹打混匀， 冰上放置 15 min; 将样品转移至 1. 5 mL BP 管中， 14000 r/min, 离心 10 min, 将上清转移到无菌 EP管中， -80 °C^-\ (3)聚丙烯 BSUfe 电泳（SDS-PAGE): 使用等量的蛋白裂解液样品分离蛋白、转膜、封 闭、 先后分别使用适当的一抗和二抗处理、 之后、 用 ECL试剂盒显色， X光片膝光 检测印迹蛋白条带； 用 Gel-Pro Analyzer进行灰 L^L量分析， 对照与药物处理各浓度 ϋ 分别与各自的内参的光密度值相比，所得的比值分别与对照 B比，半定量蛋白表达水平。

实验结果 （JL^5和表 6)

表 5 实施例 1-7获得的化合物 Ia-Ih抑制肿瘤生长、侵袭和转移、 心脑血管疾病免疫 缺陷疾病以及炎症等密切相关的蛋白因子

表 5-续

有 效 浓 度 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih对相关重要信号传导通路受体、 调控蛋白和激

(mM/L) 瑭抑制作用的有效浓度 (IC50)

化合物 Ie 化合物 If 阳性药物对照 空白对照 蛋白或 (恩度、 环磷酰 (溶媒） 醉 胺）

Bcl-2/Bax <0.18 * <0.09 * >0.25 * ―

Cyclin D1 <0.16 * <0.09 * >0.25 *

Akt <0.16 * <0.09 * >0.25 * ―

K-Ras <0.06 * < 0.055 * >0.25 *

H-Ras <0.06 * < 0.055 * >0.25 * ― NF- Β <0.06 * <0.06 * >0.25 *

NF- <0.1 * <0.10 * >0.25 *

B-DNA binding

activity

Nuclear < 0.065 * <0.09 * >0.25 *

β -eaten in

Dvl-1 <0.15 * <0.20 * >0.25 *

VEGFR1 <0.11 * <0.09 * >0.25 *

VEGFR2 <0.09 * <0.09 * >0.25 *

EGFR <0.11 * <0.1 * >0.25 * - c— Met < 0.145 * < 0.141 * >0.25 * -

HDAC3 < 0.055 * < 0.055 * >0.25 * -

HDAC4 <0.05 * < 0.045 * >0.25 * - 表 5-续

注： p<0.05; 有关测试方法见上述实验方法部分。 表中有关蛋白因子均分别来自于由实施例 1 - 7获得的化 Ia-Ih或阳 'l±tt照抗癌药物或 DMS0 溶媒处理的人肝癌、 Lewis肺癌等癌细胞系和这些肿瘤組织的蛋白裂解液， 用 Western blotting检测 分析的结果. 表 6 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih对与肿瘤生长、 侵袭和转移、 心脑血管疾病、 免 疫缺陷疾病以及炎症等密切相关蛋白因子水平和酶活性的影响

表 6 -续

表 6 -续

注： * p < 0. 05; 有关测试方法见上述实验方法部分.

#:有关肿瘤抑制蛋白 ρ53、 细胞周期抑制蛋白 p21、 细胞凋亡水解酶 Caspase- 3、 细 浆与线粒体细 胞色素 C之比和细胞粘附蛋白 E- cadher in均分别来自于由实施例 1 - 7获得的化 Ia-Ih或阳性对 照抗癌药物或 DMS0溶媒处理的肝癌 Lewis肺癌等癌细胞系和这些肿瘤組织的蛋白裂解液，用 Western blotting检测分析的结果.

实施例 14: 实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih对核蛋白因子 NF- κ B ( p65 ) -DNA binding 活性抑制作用体外实验（EMSA )

1、 主要试剂和仪器：

化学发光法 EMSA试剂盒： 美国 Pierce Biotechnology公司； 生物素标记 EMSA探针 NF- Β: 美国 Pierce Biotechnology公司；

蛋白质分子 Marker和 0. 4%台盼蓝： 美国 Sigma公司； PVDF膜： Mi l l ipore公司； 核蛋白裂解液、 PMSF (苯甲 酰氡）溶液： 碧云天生物技^ M†究所

彩色预染蛋白分子量标准、 ECL Plus发光试剂盒、 定影粉、 显影粉： 碧云天生物技^ M† 究所。 医用 X射线胶片： 柯达公司。

2、 实验步骤：

分别用 1-500MM/L的实施例 1 - 7获得的化合物 Ia-Ih、0. 1-1 ΟΟΟμΜ/L ^J^ ^ DMSO ( 0. 01% )处理癌细胞 48小时后获得细; ^蛋白提取物，方法详见实施例 6实^ p分内容。

NF- Β ( p65 ) -DNA binding活性抑制作用体夕卜实验应用美国 Pierce Biotechnology公 司的化学发光法 EMSA试剂盒， 实验方法严 ^照试剂盒的说明书操作， 步骤如下： (1) EMSA胶的配制

EMSA胶的配制如下表所示。 药物处理的细胞经核蛋白提取液（碧云天生物技^ M†究 所提供）提取后的核蛋白提取物 10微克 /管分别用于如下所示的样品^ ^和电 '^¾分 析。

表 7-1 关于 4%*聚丙烯酰胺凝胶的配制

各組分名称 上 积

TBE buffer (10X) 1. 0ml

重蒸水 16. 2ml

39: lAcrylamide 2ml

80%甘油 625μ1

10%过疏酸铵 (ammonium persufate) 150μ1

TEMED Ι ΟμΙ

(2) 预电泳： 将胶固定在电泳槽中， 加满 0. 5 X ΤΒΕ电泳緩冲液， 按照 10V/厘米的电压电 泳 90分钟。 探针结合反应如下： 表 7-2 阴性对照^^

各組分名称

Nuc lease-Free Water 7μ1

EMSA/Gel-Shift 结合緩冲液 (5X) 2μ1

细胞核蛋白或纯化的转录因子 Ομΐ

标记好的探针 Ιμΐ 总体积 ΙΟμΙ

表 7-3 样品反应

各組分名称 体积

Nuc lease-Free Water Ομΐ

EMSA/Gel-Shift 结合緩冲液 (5Χ) 2μ1

细胞核蛋白或纯化的转录因子 7μ1

标记好的探针 Ιμΐ

总体积 ΙΟμΙ 按照上表依次加在 ΕΡ管中，混匀室温静置 15 消除可能发生的探针和蛋白的非 特异性结合。 分别加入生物素标记的探针 NF- κΒ Ιμΐ, 室温静置 20分钟。

( 3 )电泳： 换新鲜的 0.5 X ΤΒΕ电泳緩冲液， 按照 10V/厘米的电压电泳 1.5小时， 确保 胶的温度不超过 30

( 4 )转膜： EMSA j&J核蛋白因子与结合的探针转到尼gJ过程是在 380mA冰浴中电转 ( 5 )紫外交联： 将尼龙膜放在 254mn的紫外灯下照射 15分钟。

( 6 )化学发光法检测生物素标记探针：取封闭液封闭交联过的尼龙膜、按试剂盒要求对 处理的膜 X光片膝光、 显影和定影， 分析结果。

3、 实验结果

表 8实施例 1-7获得的化合物 Ia-Ih对与肿瘤生长、 侵袭和转移、 心脑血管疾病、 免 疫缺陷疾病以及炎等密切相关核蛋白因子 NF- B( p65 )与 DNA活性的抑制作用（细 胞和胖瘤組织核蛋白）

有效浓度 实施例 1 - 7获得的化^ Ia-Ih对核蛋白因子 NF- κ B ( p65 )与 DNA结合 50¾*抑 制作用的有效浓度 (mM/L)

化合物 化合物 化^ Ic 化合物 化合物 化合物 阳性药物 溶 抑制率 la lb § Id Ie If 对照 § 媒对 ( % ) 照 对 A549细胞 50% < < < >1 抑制 0.11 * 0.12 0.10 * .0 * 对 SMMC7721细胞 < < < < >1 50¾抑制 0.12 * 0.08* * 0.121 0.10 * .0 *

MDA-MB231 细胞 < < < >1 50¾抑制 0.1 * 0.11 0.10 * .0 * 对 MCF7细胞 50% < 0.125* <0.1 * <0.10 < 0.10 >1 - 抑制 .0 *

对 Lewis肺癌细胞 < 0.135

50¾抑制

表 8-续

§使用体内肿瘤組织核蛋白裂解液检测时实施例 1-7 获得的化合物和环磷酰胺^注射分别为 60mg/kg和 25mg/kg用量。 补充说明：本专利申请和其中成果相关的研究工作受国家 863课题 "肿瘤蛋白质分子标志 物的研究与开发 ( 2012AA020206 )"和山东省科技 计划项目 "酯型儿茶素 EGCG等活性 成分结构改造优化和抗癌候选新药的研究 (2009GG10002087) "以及山东省自然科学基金项 目 （ZR2012HM016)资助。

Claims (16)

1. 权 利 要 求

   1. 下式（I )的化合物:

   式（I) 其中，

   2. 下式（II)的化合物:

   式（π)

   其中,

   3. 下式（III)的化合物:

   式 (III)

   其中，

   4. 制备权利要求 1中的化合物 Ia-Ib、 权利要求 2中的化合物 Ila-IIb的方法,

   制备权利要求 1中的化合物 Ic-Ih、 权利要求 3中的化合物 Illc-I IIh的方法,

   R2=H R2=H R2=H R2=H

   (Ig) R= CH2CH3 R1= C1 R2= CI (Ih) R= CH2CH3 Rl= Br R2= Br

   6. 一种药物組合物，其包含权利要求 1-3任一项中的化合物和任选的药学上可以 接受的賦形剂。

   7.权利要求 6所述的药物組合物，所述药物組合物为各种药物新剂型， 例如乳脂 盾体、 微球和纳米球。

   8. 权利要求 1-3任一项中的化合物或下式 I l ia的化合物或权利要求 6或 7所述 的药物組合物或包含式 I l ia的化合物和任选的药学上可以接受的賦形剂的药物組合 物在制备预防和治疗人肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 宫颈癌、 白血病、 淋巴瘤、 结直 肠癌、 前列腺癌、 皮肤癌和黑色素瘤等肿瘤的药物中的用途： 式 (Ilia)

   9. 权利要求 1-3任一项中的化合物或下式 Ilia的化合物或权利要求 6或 7所述 的药物組合物或包含式 Il ia的化合物和任选的药学上可以接受的賦形剂的药物組合 物在制备組蛋白转甲基酶 EZH2抑制剂中的用途：

   式 (Ilia) 。

   10. 权利要求 1-3任一项中的化合物或下式 Il ia的化合物或权利要求 6或 7所述 的药物組合物或包含式 Il ia的化合物和任选的药学上可以接受的賦形剂的药物組合 物在制备組蛋白脱乙酰 制剂中的

   式 (Ilia) 。

   11. 权利要求 1 - 3任一项中的化合物或下式 111 a的化合物或权利要求 6或 7所述 的药物組合物或包含式 Il ia的化合物和任选的药学上可以接受的賦形剂的药物組合 物在制备促肿瘤、炎症和心脑血管病及免疫缺陷病等疾病相关的因子 NF- κ B抑制剂中的 用途： 式 (Ilia)

   12. 权利要求 1-3任一项中的化合物或下式 Il ia的化合物或权利要求 6或 7所述 的药物組合物或包含式 Il ia的化合物和任选的药学上可以接受的賦形剂的药物組合 物在制备下调促肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺陷病等疾病相关的因子 VEGFR, EGFR, c-Met, K-Ras, H-Ras， Akt, Cyclin Dl， β -catenin， ER-alpha, MMP-9, MMP-2, Dv卜 l，Dv卜 2，Dv卜 3和 Be卜 2等蛋白水平和上调 Bax, p53, p21, E-cadherin, Caspase3 SJfc浆细胞色素 C蛋白水平的药物中

   式 (Ilia)

   13. 权利要求 1-3任一项中的化合物或下式 Il ia的化合物或权利要求 6或 7所述 的药物組合物或包含式 Il ia的化合物和任选的药学上可以接受的賦形剂的药物組合 物与化疗药物联合在制备用于协同放疗、 S&合放疗、化疗和手术治疗以及热疗、综合治疗 肿瘤的药物中的用途：

   式 (Ilia)

   14. ^权利要求 11 - 13中任一项所述的用途， 其中所述肿瘤包括肺癌、 乳腺癌、 肝癌、 直肠癌、 结肠癌、 前列腺癌、 胃癌、 食道癌、 喉癌、 白血病、 淋巴瘤、 黑色素瘤、 子宫癌、 卵巢癌、皮肤癌、 支气管癌、 细支气管癌、尿道癌、 腎癌、 口腔癌、 阴道癌、 胆 子宫癌、 卵巢癌、 皮肤癌、 支气管癌、 细支气管癌、 尿道癌、 肾癌、 口腔癌、 阴道癌、 胆 管癌、 胰腺癌、 膀胱癌、 鼻咽癌以及其它各种肿瘤。

   15. 预防和治疗人肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 宫颈癌、 白血病、 淋巴瘤、 结直 肠癌、 前列腺癌、 皮肤癌和黑色素瘤等肿瘤患者的方法， 包括给予需要治疗的患者治疗 有效量的权利要求 1-3任一项的化合物或下式 I l ia的化合物或权利要求 6或 7所述 的药物组合物或包含式 I l ia 的化合物和任选的药学上可以接受的赋形剂的药物组合 物：

   式 (ma)

   16. 用作对于人肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 胰腺癌、 宫颈癌、 白血病、 淋巴瘤、 结直肠 癌、 前列腺癌、 皮肤癌和黑色素瘤等肿瘤的预防剂和治疗剂的权利要求 1-3任一项的化 合物或下式 I l ia的化合物或权利要求 6或 7所述的药物组合物或包含式 I l ia的化合 物和任选的药学上可以接受的赋形剂 ：

   式 (ma)

   17. 权利要求 1 中的化合物用作对于人肿瘤、 炎症和心脑血管病及免疫缺陷病等疾 病临床诊断萤光标志和其它日用品萤光标志化合物组合的应用。

   18. 一种药物前药活性成分， 其包含权利要求 1-3任一项中的化合物和任选的药 学上可以接受的化学修饰的主要结构成分。