KR20170061192A - 항-인플루엔자 활성을 가진 자나미비르 포스포네이트 동족체 및 인플루엔자 바이러스의 오셀타미비르 감수성을 확인하는 방법 - Google Patents

항-인플루엔자 활성을 가진 자나미비르 포스포네이트 동족체 및 인플루엔자 바이러스의 오셀타미비르 감수성을 확인하는 방법 Download PDF

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Abstract

약물 내성인 병원체를 검출하고, 이의 감염증을 치료하기 위한, 방법과 조성물을 제공한다. 오셀타미비르 이외의 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 저해제, 및 오셀타미비르 카르복실레이트를 이용하는 경쟁적인 결합 분석을 톤한, 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 사용하기 유용한, 센서가 커플링된 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 저해제를 개시한다. H1N1, H5N1 및 H3N2 바이러스의 야생형 및 오셀타미비르 내성형 인플루엔자 균주에 대해 뉴라미니다제 저해제로서 활성을 나타내는 새로운 포스포네이트 화합물을 개시한다. 시알산을 통해 상기한 포스포네이트 화합물을 제조하기 위한 거울상이성질체 선택적인 합성 경로를 제공한다.

Description

항-인플루엔자 활성을 가진 자나미비르 포스포네이트 동족체 및 인플루엔자 바이러스의 오셀타미비르 감수성을 확인하는 방법 {ZANAMIVIR PHOSPHONATE CONGENERS WITH ANTI-INFLUENZA ACTIVITY AND DETERMINING OSELTAMIVIR SUSCEPTIBILITY OF INFLUENZA VIRUSES}
본 출원은 2010년 5월 10일자 미국 가출원번호 제 61/333,137호의 "인플루엔자 바이러스에 대한 오셀타미비르 감수성을 확인하기 위한 조성물 및 방법"에 대해 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스에 효과적인 새로운 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 H1N1, H5N1 및 H3N2 인플루엔자 바이러스의 야생형 균주와 오셀타미비르 내성 균주의 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(neuraminidase)를 저해하는 새로운 포스페이트 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 약물에 대한 내성 병원체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 본 발명에 개시된 새로운 화합물을 이용하여 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
인플루엔자 A 바이러스의 유행은 전세계적으로 광범위한 발병과 사망을 계속적으로 야기하고 있다. 미국에서만도, 인구의 5 내지 20%가 매년 인플루엔자 A 바이러스에 감염되는 것으로 추산되고 있으며, 이로 인해 대략 200,000명이 입원하고, 36,000명이 사망하고 있다. 포괄적인 백신접종 정책들로 인플루엔자 발병율을 억제하기 위한 효과적인 방안이 확립되어 있다. 그러나, 바이러스의 잦은 유전자 변이로 인해 해마다 백신을 재설정하여야 하며, 백신에 존재하는 바이러스 균주와 유행하는 균주가 일치되지 않을 가능성도 존재한다.
인플루엔자 A 바이러스는 9개의 구조 단백질로 이루어져 있으며, 부가적으로 조절 기능을 갖춘 2개 NS1 비구조 단백질을 코딩하고 있다. 바이러스 게놈의 분절화된 특성으로 인해, 하나의 세포에 여러가지 바이러스 균주들이 혼성 감염된 경우에 유전자 재집합(genetic reassortment) 기전이 이루어질 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 표면에 제시되는 상이한 혈구 응집소(HA: hemagglutinin)와 뉴라미니다제(NA: neuraminidase)에 따라 다양한 서브타입들로 분류된다. 인플루엔자 A 바이러스 서브타입들은 2종의 바이러스 표면 당단백질, 혈구 응집소 (HA 또는 H) 및 뉴라미니다제 (NA 또는 N)로 동정된다. 각 인플루엔자 바이러스 서브타입은 H와 N 단백질의 조합에 따라 동정된다. 공지된 HA 서브타입은 16종이며, 공지된 NA 서브타입은 9종이다.
인플루엔자 바이러스는 인간 등의 다수의 동물 종들에 감염할 수 있는 (-) 센스 가닥의 분절화된 RNA 바이러스이다. 바이러스에 코딩되어 있는 RNA 의존형 RNA 중합효소에 의해 이루어지는 인플루엔자 게놈을 복제하는 과정은 에러 발생 경향이 있어, 늘 변형된 유전자 서열을 가진 자손들이 만들어진다. 유전자 변형된 생존가능한 바이러스를 "항원소변이(antigenic drift)" 돌연변이로 지칭한다. 바이러스 게놈의 분절화된 특성과 여러가지 동물 종에 대한 감염 가능성으로 인해 "항원대변이(antigenic shift)" 돌연변이도 생겨날 수 있다 (P. K. Cheng et al., Emerg. Infect. Dis . 15, 966 (2009)). 바람직한 조건 하에 지배적인 변이체는 인간 또는 동물에 대한 유의한 병원체가 될 수 있다. 돌연변이 진화를 일으키는 다단계 선별 과정들은 완전히 해명되지 않은 상태이다 (L. Cohen-Daniel et al., J. Clin. Virol . 44, 138 (2009); R. Wagner, M. Matrosovich, H. D. Klenk, Rev. Med. Virol . 12, 159 (2002)). 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하기 위해 흔히 백신이 사용되고 있지만, 인플루엔자 감염을 치료하기 위한 가장 유용한 치료법은 타미플루(Tamiflu®) (오셀타미비르 에틸 에스테르의 포스페이트 염, Roche Laboratories, Inc.) 및 렐렌자(Relenza®) (자나미비르, Glaxo Wellcome, Inc.)의 투여이다 (N. J. Cox, J. M. Hughes, N. Engl . J. Med . 341, 1387 (1999)). 오셀타미비르와 자나미비르는, 점액성 분비물내로의 자손 비리온의 방출과 분산을 예방하여, 바이러스 감염성을 낮추는, 바이러스 시알리다제 (뉴라미니다제) 저해제이다. 인플루엔자 바이러스 표면 상에 발현되는 당단백질인 뉴라미니다제 (NA)는, 숙주 세포 표면의 시알로-수용체로부터 자손 바이러스의 결합을 파괴하는 것으로, 바이러스의 복제와 전염에 필수적이다. 따라서, 구조에 기반한 전략에 기인한 NA의 저해는 항-인플루엔자 약물 개발에도 적용되고 있다.
자나미비르 (Relenza™) (von Itzstein, M. et al. Nature 1993, 363, 418. Dunn, C.J.; Goa, K.L. Drugs 1999, 58, 761)는 인플루엔자를 치료하기 위한 대중적인 약물이다. 타미플루는, 간의 에스테라제에 의해 쉽게 가수분해되어, 바이러스 뉴라미니다제 (NA)의 활성부에 존재하는 3개의 아르기닌 잔기들 (Arg118, Arg292 및 Arg371)과 상호작용하는 활성형의 저해제로서, 대응되는 오셀타미비르 카르복시산을 제공하는 프로드럭이다 (von Itzstein, M. et al. Nature 1993, 363, 418. Lew, W. et al. Curr . Med . Chem. 2000, 7, 663. Russell, R. J. et al. Nature 2006, 443, 45). 오셀타미비르와 자나미비르는, 숙주 세포의 표면 시알로-수용체와 자손 바이러스 간의 연결을 절단함으로써 바이러스 증폭에 필수적인, 인플루엔자 바이러스의 NA를 저해한다. NA 저해제는, 바이러스 NA의 활성부에 결합하기 위한 세포 표면 당단백질 상의 가장 끝쪽에 위치한 사카라이드인 시알산 (N-아세틸뉴라민산)을 효소로 절단함에 있어, 옥소늄 전이-상태를 모방하기 위해, (옥사)사이클로헥센 스캐폴드를 가지도록 설계된다. 오셀타미비르 카르복시산과의 결합을 수용하기 위해서는, NA에 큰 소수성 포켓을 형성하는 유도 적합에 3-펜틸 측쇄가 요구된다 (Collins, P.J., et al. Nature 2008, 453, 1258). 이에 비해, 자나미비르는 새롭게 생겨나는 내성 바이러스에 대한 감수성이 오셀타미비르 포스페이트에 비해 더 낮은 편이다. 그러나, 소수성 결합 포켓을 형성할 필요가 없어, 자나미비르의 NA 돌연변이 (예, 임상적으로 관련있는 H274Y 돌연변이)에 대한 저해 효능은 변하지 않는다.
인플루엔자 A(H1N1) 바이러스는 뉴라미니다제 (NA) 단백질의 274번 위치의 히스티딘이 타이로신 (H274Y)으로 아미노산 치환됨으로써 부여되는 오셀타미비르 내성을 가지고 있다. 2008년, 계절성 H1N1에서 오셀타미비르 내성인 H274Y 돌연변이가 갑자기 증가하였는데, 이러한 돌연변이의 증가는 다수의 H274Y 유행 지역들에서의 오셀타미비르의 사용과는 상호 관련성이 없었기 때문에, 당혹스러운 일이었다 (J. Mossong et al., Antiviral Res. 84, 91 (2009); M. Jonges et al., Antiviral Res. 83, 290 (2009)). 아울러, H274Y 오셀타미비르에 대해 내성을 나타내는 유행성 H1N1 (A. Gulland, Br. Med . J. 339, b4975 (2009)) 돌연변이와 H5N1 돌연변이 (Q. M. Le et al., Nature 437, 1108 (2005))들이 환자들에게서 보고되었는데, 이는 이들 돌연변이들이 인플루엔자 치료법의 옵션에 변동을 줄 수 있음을 시사한다 (I. Stephenson et al., Clin. Infect. Dis. 48, 389 (2009)).
시알산의 효소 절단에서 옥소늄 전이-상태를 모방하기 위해, 글리세릴 모이어티 스캐폴드를 변형시킴으로써 자나미비르에 대한 다수의 유도체들이 제조되고 있다. 포스포네이트기는 일반적으로 약물 설계시 카르복실레이트의 생물학적 동족체(bioisostere)로서 사용된다 (White, C. L. et al. J. Mol . Biol . 1995, 245, 623. Schug, K. A.; Lindner, W. Chem . Rev. 2005, 105, 67. Streicher, H.; Busseb, H. Bioorg . Med . Chem . 2006, 14, 1047). 포스포네이트 이온은, 카르복실레이트-구아니디늄 이온 쌍에 비해, 구아니디늄 이온과 보다 강력한 정전기적 상호작용을 나타낼 것이다. 즉, 자나미비르 포스포네이트 동족체는 H1N1 및 H5N1 바이러스, 심지어 H274Y 돌연변이의 뉴라미니다제에 대해 보다 강력한 효능을 가질 것으로 예상된다. 친화성 강화는 생리학적 조건에서 포스포네이트기와 3개의 아르기닌 잔기들 (Arg118, Arg292 및 Arg371) 간의 강력한 정전기적 상호작용에 기인할 수 있다.
액상 뉴라미니다제 저해 분석은 통상적으로 형광발생 기질인 2'-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-아세틸-뉴라민산을 이용하며, 상기 기질은 뉴라미니다제에 의해 절단되어 형광측정기로 정량할 수 있는 형광 산물이 되지만 (Potier et al., Anal. Biochem. 94:287-296 (1979)), 이러한 분석 방법은 고성능 포맷(high-throughput format)으로 처리할 수 없어 (참조: McKimm-Breschkin, J. L. Antiviral Res. 2000, 47, 1-17), 새로운 인플루엔자 뉴라미니다제 저해제 개발이 필요한 실정이다.
2008년, 전세계적으로 오셀타미비르에 대해 내성인 H1N1 인플루엔자 바이러스가 대유행하여, 내성 돌연변이주에 대한 연구와 신속한 오셀타미비르 감수성 검사법에 대한 개발 필요성이 촉구되었다. 유행할 가능성이 있는 오셀타미비르 내성 H1N1 바이러스들 중에서, 의료원에서 환자 생검의 오셀타미비르 감수성을 신속하게 평가하기 위한, 치료 옵션 결정에 도움이 될 수 있는, "현장용 (point-of-care)" 검사법이 요구되고 있다.
본 발명에서는 새로운 포스포네이트 화합물들을 개시한다. 이 화합물은 H1N1, H5N1 및 H3N2에 속하는 야생형의 인플루엔자 바이러스 균주와 오셀타미비르 내성인 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 뉴라미니다제 저해제로서 활성을 가진다. 일부 구현예에서, 상기 오셀타미비르 내성인 인플루엔자 균주는 뉴라미니다제에 H274Y 돌연변이를 포함한다. 또한, 본 발명은 시알산을 경유한 신규한 포스포네이트 화합물의 거울상이성질체 선택적인 합성 경로를 제공한다.
본 발명의 측면에서, 식 (I)에 따른 화합물을 기술한다.
Figure pat00001
상기 식에서,
A는 PO(OR)(OR5)이되, R 및 R5는 독립적으로 H, C1-C10 알킬, 아릴, 아랄킬 및 X 중에서 선택되고, X는 암모늄, 메틸 암모늄, 디메틸암모늄, 트리메틸암모늄, 테트라메틸암모늄, 에탄올-암모늄, 디사이클로헥실암모늄, 구아니디늄, 에틸렌디암모늄 양이온, 리튬 양이온, 소듐 양이온, 포타슘 양이온, 세슘 양이온, 베릴륨 양이온, 마그네슘 양이온, 칼슘 양이온, 및 아연 양이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 반대이온이고;
B는 NHR6, NH3 +Y-, R6N(C=NH)NH2 또는 R6N(C=NH2 +)NH2Y-이되, R6는 수소, C1-C10 알킬, 아릴, 또는 아랄킬이고, Y-는 클로라이드, 브로마이드, 요오드화물, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 디포스페이트, 나이트레이트, 설페이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 하이드록시나프토에이트, 퓨마레이트, 말리에이트, 락테이트, 말레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 사이트레이트, 글루타메이트, 글루코네이트, 및 스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온성의 반대이온이고;
R1은 CH3 또는 CF3이고;
R2는 H, C1-C10 알킬 또는 O=C-NHR7이되, R7은 바이오틴, 형광단(fluorophore) 및 항염증제와 같은 기능성 모이어티가 결합된 링커이고;
R3 및 R4는 독립적으로 H, C1-C10 알킬 또는 O=C-R8이되, R8은 C1-C10 알킬, 아릴, 또는 아랄킬이다.
치료학적 유효량의 식 (I)의 화합물과 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제의 활성을 저해하기 위해 유기체에 투여하도록 고안된, 조성물을 기술한다.
본 발명의 측면에서,
Figure pat00002
및
Figure pat00003
중 하나 이상,
Figure pat00004
및
Figure pat00005
중 하나 이상, 또는
Figure pat00006
및
Figure pat00007
중 하나 이상을 치료학적 유효량으로 포함하는 조성물을 기술한다.
본 발명의 측면에서, 하기 단계를 포함하는 식 I의 화합물의 제조 방법을 기술한다:
(a) 키랄 전구체 시알산 (2)을 아세틸화하여, 중간 화합물 (3)을 제조하는 단계:
Figure pat00008
;
(b) 상기 중간 화합물 (3)에 디에틸 트리메틸실릴 포스파이트를 처리하여, 중간 화합물 (4)을 제조하는 단계:
Figure pat00009
;
(c) 상기 중간 화합물 (4)에 N-브로모숙신이미드를 광 조사하에 처리하여, 브로모-치환된 화합물을 수득하고, 이를 피리딘 중에서 중간 화합물 (5)을 제조하는 단계:
Figure pat00010
;
(d) 상기 중간 화합물 (5)에 트리메틸실릴 트리플루오로설포네이트를 처리하여, 중간 화합물 (6)을 제조하는 단계:
Figure pat00011
; 및
(e) 상기 중간 화합물 (6)에 트리메틸실릴 아지드를 처리하여, 중간 화합물 (7)을 제조하는 단계:
Figure pat00012
.
일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 중간 화합물 (7)에 순차적으로 브로모트리메틸실란 처리, 소듐 메톡사이드 처리 및 수소 첨가 반응을 수행하여, 화합물 (1a)을 제조하는 단계를 더 포함한다:
Figure pat00013
일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 중간 화합물 (7)에 소듐 에톡사이드를 처리한 다음. 수소 처리 반응을 수행하여, 화합물 (1c)를 제조하는 단계를 더 포함한다:
Figure pat00014
일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 중간 화합물 (7)에 수소 첨가 반응을 수행한 다음, 1,3-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸티오슈도우레아 및 Et3N과 반응시켜, 중간 화합물 (8)을 제조하는 단계를 더 포함한다:
Figure pat00015
일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 중간 화합물 (8)에 브로모트리메틸실란을 처리한 다음, 소듐 메톡사이드를 처리하여, 화합물 (1b)를 제조하는 단계를 더 포함한다:
Figure pat00016
일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 중간 화합물 (8)에 소듐 에톡사이드와 트리플루오로아세트산을 순차적으로 처리하여, 화합물 (1d)를 제조하는 단계를 더 포함한다:
Figure pat00017
.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 제조되는 식 (I)에 따른 임의의 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 측면에서, 식 (I)에 따른 컴포지션을 치료학적 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 제공하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 감염 치료 방법을 개시한다.
본 발명의 특정 측면에서, 식 (I)에 따른 화합물은 하기 화합물들 중 1종 이상이다:
Figure pat00018
Figure pat00019
,
Figure pat00020
, 및
Figure pat00021
본 발명의 다른 구현예는 임의의 한가지 화합물 (I)을 뉴라미니다제와 접촉시키는 단계를 포함하는 뉴라미니다제의 활성을 저해하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 상기 뉴라미니다제는 인플루엔자 뉴라미니다제이며, 상기 활성은 시험관내에서 저해된다.
본 발명은 약물 및 경쟁적인 저해제의 결합성을 측정함에 의한, 병원체의 약물 감수성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, (a) 오셀타미비르 내성 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플에 인플루엔자 뉴라미니다제 인지 유닛 (R)을 포함하는 결합 분자를, 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC)의 부재 및 존재하에 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 결합 분자와, 상기 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 입자의, 오셀타미비르의 존재시와 부재시의 결합 차이를 확인하는 단계를 포함하며, 오셀타미비르의 존재시의 상기 인지 유닛 (R)에 의한 결합 수준의 감소가, 오셀타미비르 존재시의 상기 인지 유닛 (R)에 의한 결합 수준의 감소가, 오셀타미비르 민감성 인플루엔자 바이러스 대조군과의 접촉시의 결합 수준 감소에 비해 미비(lack)한 것은, 샘플내 오셀타미비르 내성인 인플루엔자 바이러스가 존재함을 의미하는 것을 특징으로하는, 오셀타미비르 내성 인플루엔자 바이러스의 존재를 확인하는 방법에 관한 것이다. 상기 인지 유닛 (R)에 대한 상기 인플루엔자 바이러스의 결합성은, 오셀타미비르 카르복실레이트에 의한 동시 결합에 의해 경쟁적으로 저해된다.
일부 구현예들에서, 오셀타미비르 내성 인플루엔자는 인플루엔자의 뉴라미니다제 (NA) 단백질의 274번 아미노산 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 돌연변이는 H274Y이다.
일부 측면들에서, 인플루엔자 바이러스가 함유된 샘플은, 점액, 타액, 호흡기 분비물, 인후 세척물(throat wash), 코 세척물, 척수액, 가래, 뇨, 정액, 땀, 변, 혈장, 혈액, 기관지폐포액, 질액, 눈물 및 조직 생검으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 인플루엔자 바이러스는 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 구현예들에서, 상기 세포 배양물은 Vero 세포 배양물을 포함한다. 일부 구현예들에서, 인플루엔자 바이러스가 함유된 샘플은 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포이다.
일부 측면들에서, 인플루엔자 바이러스 함유된 샘플은 고체 기판 상에 고정된다. 고체 기판은 마이크로웰, 마이크로타이터 플레이트, 실리콘 칩, 유리 슬라이드, 비드, 미세입자, 필름, 크로마토그래피 페이퍼, 멤브레인, 병, 디쉬, 슬라이드, 블롯팅 물질(blotting material), 필터, 섬유, 직조 섬유(woven fiber), 형상화된 폴리머(shaped polymer), 입자, 딥-스틱(dip-stick), 시험관, 칩, 마이크로칩, 랭뮤어 블로드젯막(Langmuir Blodgett film), 유리, 게르마늄, 실리콘, (폴리)테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 갈륨비소, 갈륨인, 규소 산화물, 규소 질화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예들에서, 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스의 혈구 응집소 성분과 탄수화물 수용체의 결합을 통해 고체 기판 상에 고정된다.
일부 측면에서, 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 입자를 고체 기판에 고정시키는 것은, 상기 결합 분자 또는 오셀타미비르 카르복실레이트가 인플루엔자 바이러스 또는 이의 입자의 뉴라미니다제 인자에 결합하는 것을 변형시키지 않는다.
일부 구현예들에서, 상기 인지 유닛 (R)은 자나미비르, 타미포스포르 구아니딘 모노에스테르(tamiphosphor guanidine monoester), 또는 포스파자나미비르(phosphazanamivir) 또는 이의 모노에스테르, 및 이들의 염, 에스테르 및 유도체들 중에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 인지 유닛 (R)은 검출가능한 감지 유닛(sensing unit) (S)에 커플링된다. 일부 구현예들에서, 상기 인지 유닛 (R)은 상기 결합 분자가 R-L-S 구조를 가지도록 링커 (L)를 통해 상기 감지 유닛과 커플링된다. 일부 구현예들에서, 상기 링커 (L)는 상기 인지 유닛의 인플루엔자 바이러스와의 결합 효능와 상기 감지 유닛 (S)의 검출을 감소시킨다.
링커 (L)는 지방족 체인, 트리아졸, 수용성 링커 및 에틸렌 글리콜 링커 중에서 선택할 수 있다.
일부 측면들에서, 상기 감지 유닛은 직접 또는 간접적으로 검출가능하다. 일부 구현예들에서, 감지 유닛은 스트렙타비딘-바이오틴 상호작용에 의해 검출가능한 모이어티와 커플링된다.
일부 측면들에서, 상기 감지 유닛은 플루오레센트 표지, 금 표지, 효소 표지, 방사성 표지, 양자점(quantum dot) 표지 및 단백질 표지 중에서 선택되는 검출가능한 모이어티이다. 일부 구현예들에서, 상기 검출가능한 모이어티는 발광 신호, 비색계 신호(colorimetric signal), 형광 신호 또는 방사성 신호 중에서 선택되는 신호에 의해 검출가능한다.
일부 구현예들에서, 플루오레센트 표지는 플루오레세인, BODIPY, 알렉산 플루오르(Alexa Fluor), Cy3, Cy5, 오레곤 그린(Oregon Green), 테트라메틸로다민, 로다민 레드, 텍사스 레드, 피리딜옥사졸, 벤즈옥사디아졸 유도체, NBD 할라이드, 요오도아세트아미드, SBD; 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 요오도아세트아미드; 스틸벤(stilbene), 쿠마린(coumarin), 나프탈렌, 아지리딘(aziridine), 다폭실(dapoxyl), 피렌(pyrene), 비만(bimanes), 잔텐(xanthene), 시아닌(cyanine), 피렌(pyrene), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 피코빌리단백질(phycobiliprotein), 스쿠아렌 염료(squarene dye), 에너지 전달 염료 조합물(energy transfer dye combination), 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 바이오틴 감지 유닛은 플루오레센스로 표지된 스트렙타비딘에 의해 검출가능하다. 일부 구현예들에서, 플루오레센스 감지 유닛은 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 알렉사 염료 및 양자점으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 바이오틴 감지 유닛은 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 말의 라디시 퍼옥시다제 등의 효소가 접합된 스트렙타비딘에 의해 검출가능하다. 일부 구현예들에서, 타미포스포르 구아니딘 모노에스테르(tamiphosphor guanidine monoester)는 이의 암모늄 염이다. 일부 구현예들에서, 포스파자나미비르는 이의 암모늄 염이다.
본 발명은, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 입자의 뉴라미니다제에 결합하며, 이러한 결합이 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC)에 의해 경쟁적으로 저해되는 화합물에 관한 것으로, 이 화합물은 식 R-L-S를 포함하며, 이때 R은 자나미비르, 타미포스포르 구아니딘 모노에스테르 또는 포스파자나미비르 또는 이의 모노에스테르, 또는 이의 염, 에스테르 및 유도체 중에서 선택되며; L은 임의적이며, 트리아졸 링커, 지방족 링커 또는 에틸렌 글리콜 링커 중에서 선택되고; S는 (a) 형광 검출, 비색 검출, 발광 검출 및 방사성 검출 중에서 선택되는 방법에 의해 직접 검출가능하거나, 또는 (b) 리포팅 시스템이 접합된 바이오틴 및 스트렙타비딘 중에서 선택되는 간접적으로 검출가능한 모이어티 중에서 선택된다.
본 발명은, 패키징 물질과 샘플내 오셀타미비르 내성 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출하기 위한 조성물을 포함하는, 진단 키트에 관한 것으로, 상기 조성물은 본 발명에 따른 화합물을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 키트는, 샘플에서 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 키트 사용에 대한 지침 또는 지시를 포함하는 라벨 또는 패키지 인서트(package insert)를 더 포함한다.
이러한 측면들과 기타 측면들은, 첨부된 도면을 참조하여 하기 바람직한 구현예에 대한 설명들에서 명확해질 것이나, 이에 대한 변형 및 수정이 본원의 새로운 개념의 사상과 범위내에서 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어들은 본 발명의 문맥과 각 용어가 사용되는 구체적인 문맥에서 일반적으로 당해 기술 분야의 통상적인 의미를 가진다. 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 특정 용어들은 본 발명의 내용과 관련된 실무자에게 추가적인 지침을 제공하기 위해, 아래에서 또는 명세서 도처에 논의되어 있다. 편의상, 특정 용어들은 예를 들어 이탤릭체 및/또는 인용 표시를 이용하여 강조 표시될 수 있다. 강조 표시는 용어의 범위 및 의미와는 무관하며; 용어의 범위와 의미는 강조 표시 여부와 상관없이 동일 문맥에서 등가이다. 동일한 것을 2가지 이상의 방식으로 칭할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이에, 본원에 논의된 하나 이상의 임의의 용어에 대해 다른 언어 및 동의어가 사용될 수 있거나, 또는 용어가 본원에서 논의되거나 서술되던지 아니던 간에 제시되는데 임의의 특별히 중요한 것은 아니다. 하나 이상의 동의어의 인용이 다른 동의어의 사용을 배제하진 않는다. 본원에 논의된 임의의 용어에 대한 예를 포함하여 본 명세서 도처에서의 예를 사용한 것은 단순한 예에 불과하며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위와 의미를 제한하거나 또는 임의의 예시된 용어의 범위와 의미를 제한하는 것은 아니다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 기술된 다양한 구현예들로 제한되지 않는다.
다르게 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어들과 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들이 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함하여 본 문헌에 따른다.
오셀타미비르는 내인성 에스테라제에 의해 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC)로 변환되는 경구 프로드럭이다. 자나미비르는 뉴라미니다제 단백질의 활성부에 결합함으로써 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포에서 탈출하여 다른 세포에 감염될 수 없도록 작용한다 (Cyranoski D (September 2005) Nat. Medicine 11 (9): 909). 또한, 이것은 시험관내 및 생체내에서의 인플루엔자 바이러스의 복제 저해제이다. 자나미비르의 생체이용성은 2%이며, 통상 흡입에 의해 투여된다.
최근 약물 내성을 나타내는 조류 독감 감염 및 타미플루® 치료제를 복용한 어린이에서의 부작용에 대한 보고서에 따르면, 유행성 독감의 위협과 싸우는데 뉴라미니다제 저해제 (NAI)에 대한 신규한 화합물들의 동정이 필요한 것으로 시사되었다. NA 저해제들은 시알산의 효소 절단에서의 옥소늄 전이-상태를 모방하기 위해, (옥사)사이클로헥센 스캐폴드를 가지도록 설계된다 (Russell et al., Nature 2006, 443:45). 간의 에스테라제에 의한 가수분해시, 활성형 카르복실레이트, 즉 오셀타미비르가 노출되어, NA의 활성부에서 3개의 아르기닌 잔기들 (Arg118, Arg292 및 Arg371)과 상호작용하게 된다.
항-인플루엔자 활성을 가진 자나미비르 포스포네이트 동족체의 합성
본 발명의 내용은 자나미비르의 신규한 포스포네이트 동족체에 대한 새로운 합성 경로를 제공한다. D-시알산을 새로운 활성형 뉴라미니다제 저해제를 합성하기 위한 키랄 전구체로서 이용하였다. 새로운 포스포네이트 동족체는 H1N1 및 H5N1의 야생형 바이러스와 H274Y 돌연변이주의 뉴라미니다제를 저해함으로써, 자나미비르 및 오셀타미비르 보다 우수한 항-독감 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명은 다양한 자나미비르 포스포네이트 동족체 및 유도체를 합리적으로 높은 수율로 거울상이성질체 선택적으로 합성하는 새로운 합성 방법을 제공한다. 합성 경로는 도 1에 나타낸다. 도 1에 기술된 시약 및 단계들은 다음과 같다:
단계 1. 시알산(2)에 피리딘 중의 아세트산 무수물을 처리하여, 퍼아세틸화된 중간산물을 제조하고, 이를 100℃로 가열하여 탈카르복시화를 유도함으로써, 화합물 3을 제조한다 (Horn, E. J., et al Carbohydr. Res. 2008, 343, 936).
단계 2. 상기 화합물 3에 트리메틸실릴 디에틸 포스페이트를 적정 친핵기로 처리하여, α 및 β 아노머 혼합물 (2:3) 형태로 포스포네이트 화합물 4를 제조하며, 이는 크로마토그래피로 분리하여, NMR 스펙트럼 분석으로 특정화할 수 있다.
단계 3. (아노머 혼합물로서) 포스포네이트 4에 CH2Cl2 용액 중의 N-브로모숙신이미드 (NBS)를 조사 하에 처리하여, 라디컬 타입의 브롬화를 경유한 다음, 이를 피리딘으로 인 시츄 처리하여, β-제거 산물 5인 Neu5Ac2en의 포스포네이트 유도체 (DANA)를 제조한다. 이러한 5의 합성 방법은 디메틸 포스포네이트의 유사체에 대해 기존에 보고된 긴 공정 보다 훨씬 더 효율적이었다 (Vasella, A.; Wyler, R. Helv. Chim. Acta 1991, 74, 451).
단계 4. 아세트산 무수물, 아세트산 및 진한 H2SO4 매질 중에서, 화합물 5를 옥사졸린 6으로 변환시킨다.
단계 5. 옥사졸린 6에 대해, 아지도트리메틸실란을 이용하여, 위치이성질체- 및 입체이성질체 선택적인 개환 반응을 수행하여, 화합물 1a, 1b, 1c 및 1d가 되는 중요한 중간산물로서 아지도 화합물 7을 제조한다.
단계 6. 3가지의 순차적인 반응을 통해 화합물 7을 포스폰산 1a로 변환시킨다: 브로모트리메틸실란을 이용한 포스포네이트 7의 양쪽 에틸기의 제거, 메탄올 중의 소듐 메톡사이드를 이용한 탈아세틸화, 및 린들라(Lindlar) 촉매의 존재하에 수소 첨가 반응에 의한 아지도기의 아민으로의 선택적인 환원.
다른 예로, 에탄올 중의 소듐 에톡사이드를 처리하여, 포스포네이트 디에스테르 7로부터 하나의 에틸기만 제거한 다음, 아지도기를 환원하여, 포스포네이트 디에스테르 1c를 제조한다.
단계 7. 구아니디노 치환기를 도입하기 위해, 화합물 7에서 아지도기를 먼저 환원시켜, 아민을 만들고, 이를 염화 수은과 트리에틸아민의 존재 하에 1,3-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸티오슈도우레아와 반응시켜, 구아니딘 화합물 8을 제조한다.
단계 8. 브로모트리메틸실란에 의해 포스포네이트 8로부터 양쪽 에틸기를 제거하고, 동시에 tert-부톡시카르보닐 (Boc)기를 인 시츄로 제조된 HBr로 인해 메탄올 처리에 의해 제거한다. 탈아세틸화에 의해 자나미비르 포스포네이트 (1b)를 수득한다.
다른 예로, 포스포네이트 디에스테르 7을 소듐 에톡사이드를 이용하여 모노에스테르로 변환시킨 다음, 트리플루오로아세트산으로 Boc기를 제거하여 화합물 1d를 제조한다.
본 발명의 조성물은, 선택적으로, 본원의 화합물의 염, 특히 약제학적으로 허용가능한 무독성 염, 예를 들어 Na+, Li+, K+, Ca++ 및 Mg++를 함유하는 염을 포함한다. 이러한 염으로는, 알칼리 및 알칼리 토금속 이온 또는 암모늄 및 4급 아미노 이온 등의 적정 양이온을 산 음이온 모이어티와 조합함으로써 유래되는 염을 포함할 수 있다.
금속 염은, 금속 하이드록사이드를 본 발명의 화합물과 반응시켜 제조한다. 이러한 방식으로 제조되는 금속 염의 예로는 Na+, Li+, K+를 포함하는 염이 있다.
또한, 염은, 특정 유기산 및 무기산, 예를 들어 HCl, HBr, H2SO4, 또는 유기 설폰산의, 염기성 센터, 전형적으로 아민에 산 부가함으로써 제조할 수 있다. 마지막으로, 본원의 조성물은 비-이온화된 형태 뿐만 아니라 양성 이온 형태(zwitterionic form)의 본 발명의 화합물과, 수화물과 같이 화학량론적 함량의 물과의 조합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 다른 측면은, 뉴라미니다제를 함유할 것으로 의심되는 샘플에 본 발명의 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 뉴라미니다제의 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 통상적인 실무에 따라 선택되는 통상적인 담체 및 부형제로 제형화된다. 정제는 부형제, 활택제, 충전제, 결합제 등을 함유할 것이다. 수계 제형은 멸균 형태로 제조되며, 경구 투여가 아닌 다른 형태로 전달하고자 하는 경우, 일반적으로 등장성일 것이다. 모든 제형들은 선택적으로 "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (1986)에 기술된 부형제 등의 부형제를 포함할 것이며, 상기 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다. 부형제는 아스코르브산과 기타 항산화제, EDTA와 같은 킬레이트제, 덱스트린과 같은 탄수화물, 하이드록시알킬셀룰로스, 하이드록시알킬메틸셀룰로스, 스테아르산 등을 포함한다. 제형의 pH는 약 pH 3 내지 약 pH 11의 범위이지만, 통상적으로는 약 pH 7 내지 pH 10이다.
본 발명의 하나 이상의 화합물 (본원에서는 활성 성분으로 언급됨)은 치료할 증상에 적합한 임의 경로로 투여된다. 적정 경로로는 경구, 직장, 코, 국소 (볼 및 설하 포함), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척추강내 및 경막외 포함) 등을 포함한다. 바람직한 경로는 예를 들어 수여자의 증상에 따라 달라질 수 있다.
활성 성분을 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 약제학적 제형으로서 이를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 수의학적 용도 및 인간 용도의 본 발명의 제형은 전술한 바와 같은 한가지 이상의 활성 성분을 하나 이상의 허용가능한 담체와 함께, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 성분을 함께 포함한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분들과 혼용가능하며 수여자에게 생리학적으로 무해하다는 의미에서 "허용가능"하여야 한다.
제형은 전술한 투여 경로에 적합한 제형을 포함한다. 제형은 단위 제형(unit dosage form)으로 편리하게 제공될 수 있으며, 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 기법과 제형들은 일반적으로 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.)에서 확인된다. 이러한 방법들은 활성 성분을 한가지 이상의 보조 성분들을 구성하는 담체와 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분화된 고체 담체 또는 둘다와 균일하고 친밀하게 조합한 다음, 필요에 따라서는 제품으로 형상화함으로써, 제조한다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은, 각각 활성 성분을 예정된 양으로 포함하는 캡슐제, 카시에(cachet) 또는 정제와 같은 개별 단위로서; 산제 또는 과립제로서; 수계 액체 또는 비수계 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제조한다. 또한, 활성 성분은 볼루스, 연약 또는 페이스트로서 제공할 수 있다.
정제는, 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께, 압축 또는 성형(molding)에 의해 제조한다. 압축 정제는 활성 성분을 산제 또는 과립제와 같은 자유-유동 형태로, 선택적으로 결합제, 윤활제, 무활성 희석제, 보존제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합하여, 적정 장치에서 압축시켜 제조할 수 있다. 성형 제조되는 정제는 분말화한 활성 성분에 무활성 액체 희석제를 젖신 혼합물을 적정 장치에서 몰딩 성형함으로써 제조할 수 있다. 정제는, 선택적으로, 코팅되거나 새김 표시될 수 있으며, 선택적으로 활성 성분의 느린 방출 또는 방출 제어를 제공하도록 제형화된다.
눈 또는 다른 외면 조직(external tissue), 예를 들어 입과 피부 감염증에 대해, 제형은 바람직하게는 활성 성분(들)을, 예를 들어 0.075 내지 20% w/w (활성 성분(들)을 0.1%로 증가시키는 비율로, 0.1% 내지 20%, 예를 들어, 0.6% w/w, 0.7% w/w 등), 바람직하게는 0.2 내지 15% w/w, 가장 바람직하게는 0.5 내지 10% w/w의 양으로 포함하는 국소 연고나 크림으로서 적용된다. 연고로 제형화하는 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 수-혼화성 연고 베이스와 함께 사용할 수 있다. 다른 예로, 활성 성분은 수중유 크림 베이스를 이용하여 크림으로 제형화할 수 있다.
적절한 경우, 크림 베이스의 수상은, 예를 들어, 폴리하이드로 알코올, 즉, 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG40 포함) 및 이들의 혼합물과 같이 2개 이상의 하이드록시기를 가지는 알코올을 함유할 수 있다. 국소 제형은 피부나 다른 적용되는 영역을 통해 활성 성분의 흡수 또는 침투를 강화하는 화합물을 적합하게 포함할 수 있다. 이러한 피부 침투 강화제의 예로는 디메틸 설폭사이드와 관련 유사체가 있다.
본 발명의 에멀젼의 오일상은 공지된 방식으로 공지 성분들로 구성될 수 있다. 상기 주로 유화제(다르게는 에물전트(emulgent)라고도 함)로 구성될 수 있지만, 적절하게는 하나 이상의 유화제와 지방 또는 오일, 또는 지방 및 오일 둘다와의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 친수성 유화제는 안정화제로서 작용하는 친지성 유화제와 함께 포함된다. 또한, 오일 및 지방 둘다를 포함하는 것이 바람직하다. 아울러, 안정화제(들)가 첨가 또는 무첨가된 유화제(들)은 소위 에멀시파잉 왁스(emulsifying wax)를 구성하며, 이 왁스는 오일 및 지방과 함께 크림 제형의 오일성의 분산된 상을 형성하는 소위 에멀시파잉 연고 베이스를 구성한다.
본 발명의 제형에 사용하기 적합한 에물전트와 에멀젼 안정화제로는 Tween™ 60, Span™ 80, 세토스테아릴 알코올, 벤질 알코올, 미리스틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트 및 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다.
제형에 적합한 오일 또는 지방의 선택은 원하는 코스메틱 특성의 달성 여부에 따라 이루어진다. 크림은 바람직하게는 튜브 또는 기타 용기로부터 누출되는 것을 방지하기 위해 기름기가 없으며, 무염색에, 세척가능한 제품이어야 한다. 직쇄 또는 분지쇄의 모노- 또는 다이베이직 알킬 에스테르, 예컨대 디이소아디페이트, 이소세틸 스테아레이트, 코코넛 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르, 이소프로필 미리스테이트, 데실 올리에이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 2-에틸헥실 팔미테이트 또는 Crodamol CAP로 공지된 분지쇄 에스테르의 블렌드가 사용될 수 있으며, 가장 나중에 언급된 3종이 바람직한 에스테르이다. 이들은 단독으로 사용되거나 또는 필요한 특성에 따라서 조합하여 사용될 수 있다. 다른 예로, 백색 연질 파라핀 및/또는 액체 파라핀 또는 기타 미네랄 오일과 같은 고융점의 지질을 사용한다.
눈에 국소 투여하기에 적합한 제형은 점안제(eye drops)를 포함하며, 이때 활성 성분은 적합한 담체, 특히 활성 성분에 대한 수성 용매에 용해되거나 현탁된다. 활성 성분은 바람직하게는 0.5 내지 20%, 유리하게는 0.5 내지 10%, 특히 약 1.5% w/w의 농도로 상기 제형에 존재한다.
입에 국소 투여하기 적합한 제형은 향미 기제 중의 활성 성분, 통상 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 포함하는 로젠지(lozenge); 불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아 중에 활성 성분을 포함하는 파스틸(pastille); 및 적합한 액체 담체 중에 활성 성분을 포함하는 구강세정제를 포함한다.
직장 투여에 적합한 제형은 예컨대 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 베이스를 구비한 좌약을 포함한다.
폐내 또는 코내 투여하기 적합한 제형은, 예컨대 0.1 내지 500 ㎛ 범위의 입자 크기(0.5, 1, 30 ㎛, 35 ㎛ 등과 같이 ㎛ 증분으로 증가하여 0.1 내지 500 ㎛ 범위의 입자 크기를 포함)를 가지며, 비강을 통한 빠른 흡입에 의해 또는 폐포낭에 도달하기 위해 입을 통한 흡입에 의해 투여된다. 적정 제형은 활성 성분의 수성 또는 오일성 용액을 포함한다. 에어로졸 또는 건조 분말로 투여하기 적합한 제형은 통상의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 인플루엔자 A 또는 B 감염의 치료 또는 예방를 위해 사용되는 화합물 등의 다른 치료제와 함께 전달할 수 있다.
질 투여에 적합한 제형은 활성 성분 이외에 당해 분야에 적절한 것으로 공지된 담체를 포함하는, 패서리(pessaries), 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼, 또는 스프레이 제형으로서 제공될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 의도한 수여체의 혈액과 제형이 등장성이게 하는 항산화제, 완충액, 세균증식억제제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.
상기 제형들은 예컨대 밀봉된 앰풀 및 바이얼과 같이 단일-투약 또는 다중-투약 용기내로 제공되며, 멸균 액체 담체, 예컨대 주사용수를, 사용하기 직전에 단순히 첨가하는 것만 필요한 냉동-건조된(동결건조된) 상태로 보관할 수 있다. 기존에 언급된 종류의 멸균 분말, 과립제 및 정제로부터 즉각적인 주사용액 및 현탁액을 제조한다. 바람직한 단위 투약 제형은 상기에 언급된 바와 같이 활성 성분을 매일 투여량 또는 단위 매일 서브-투여량으로, 또는 적정 분획으로 포함하는 것이다.
특히 전술한 성분 외에도, 본 발명의 제형은 고려하는 제형의 타입에 대해 당해 분야에서 통상적인 다른 물질을 포함할 수 있으며, 예컨대 경구 투여에 적합한 제형은 향미제를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 또한 상기에서 언급된 하나 이상의 활성 성분과 그의 수의학적 담체를 포함하는 수의학적 조성물을 제공한다. 수의학적 담체는 조성물을 투여하기 목적에 유용한 물질이며, 활성 성분과 혼용가능하며 수의학 분야에서 무활성이거나 허용가능한 고체, 액체 또는 기체 물질일 수 있다. 이들 수의학적 조성물은 경구로, 비경구로 또는 임의의 다른 적정 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 사용하여, 활성 성분의 방출이 제어되고, 투여 빈도를 낮출 수 있거나, 또는 소정의 활성 성분의 독성 프로파일 또는 약동학적 프로파일을 개선시키도록 조절되는, 본 발명의 하나 이상의 화합물을 활성 성분으로 포함하는 방출 제어형 약학 제형("방출 제어형 제형")을 제공한다. 활성 성분의 유효량은 적어도 치료 중인 증상의 특성, 독성, 화합물이 예방학적으로 (저 투여량) 사용되는지 또는 활성 인플루엔자 감염에 대해 사용되는지의 여부, 전달 방법 및 약학 제형에 따라 달라지며, 통상적인 용량 증가 연구를 통해 임상의가 결정할 수 있을 것이다. 투여량은 약 0.0001 내지 약 100 mg/kg 체중/일로 예상할 수 있다. 전형적으로, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg 체중/일이다. 보다 전형적으로는, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg 체중/일이다. 보다 전형적으로는, 약 0.05 내지 약 0.5 mg/kg 체중/일이다. 예를 들어, 흡입하는 경우, 약 70kg 체중의 성인에게 권장되는 1일 투여량은 1 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 500 mg이며, 1회 또는 여러번에 나누어 투여하는 형태로 복용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 활성 성분은 또한 다른 활성 성분과 조합하여 사용한다. 이러한 조합은 치료할 증상, 성분의 교차 반응성 및 조합물의 약리학적 특성을 기초로 선택한다. 예컨대, 호흡계에서 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 감염을 치료할 경우, 본 발명의 조성물은 항바이러스제(예, 아만티딘, 리만타딘 및 리바비린), 점액용해제, 거담제, 기관지확장제, 항생제, 해열제, 또는 진통제와 조합할 수 있다. 통상적으로, 항생제, 해열제, 및 진통제를 본 발명의 화합물과 함께 투여한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 기재된 화합물의 생체내 대사 산물도 포함하며, 이러한 산물은 종래 기술에 비하여 신규하고 비자명한 것이어야 한다. 상기 산물은 투여되는 화합물의, 예컨대, 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 에스테르화 등의 결과일 수 있으며, 주로 효소적 방법에 기인한다. 즉, 본 발명은 본 발명의 화합물을 이의 대사 산물을 수득하기에 충분한 시간 동안 포유류와 접촉시키는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조되는 신규하고 비자명한 화합물을 포함한다. 이들 산물은, 전형적으로 본 발명의 방사성표지된 (예, 14C 또는 3H) 화합물을 제조하고, 이를 검출가능한 양(예, 약 0.5 mg/kg 이상)으로, 비경구로, 랫, 마우스, 기니아 피그, 원숭이 또는 사람에게 투여하고, 대사가 이루어지기에 충분한 시간(전형적으로 약 30초 내지 30 시간)을 소요한 다음, 뇨, 혈액 또는 기타 생물학적 샘플로부터 이의 전환 산물을 분리함으로써, 확인한다. 이들 산물은 방사능표지되어 있기 때문에 쉽게 분리된다 (그렇지 않은 경우 대사 산물에 잔존하는 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 사용함으로써 동정함). 대사 산물의 구조는, 예컨대, MS 또는 NMR 분석과 같은 통상적인 방식으로 결정한다. 일반적으로, 대사 산물의 분석은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 공지되어 있는 일반적인 약물 대사 연구에서와 동일한 방식으로 이루어진다. 전환 생성물은, 생체내에서 발견되지 않는 한, 이들 자신의 뉴라미니다제 저해 활성을 보유하지 않더라도, 본 발명의 화합물의 치료학적 투여에 대한 진단 분석에 유용하다.
신규 포스포네이트 동종체의 프로드럭도 고려할 수 있다. 극성 포스포네이트 및 구아니디늄 기들 둘다 약동학적 및/또는 약력학적 특성들을 향상시키기 위해, 당해 기술 분야에 공지된 기법에 의해 선택적으로 추가로 관능화시킬 수 있다. 예컨대, 프로드럭의 제형 및 용도, 예를 들어, 아실옥시메틸- 및 아릴 포스포네이트 에스테르를 사용하여, 경구 생체이용율을 향상시킬 수 있다 (Krise and Stella, Adv. Drug Deliv. Rev. 1996, 19, 287).
본 발명의 일 측면에서, 뉴라미니다제가 함유된 것으로 의심되는 샘플은 살아있는 유기체; 조직 또는 세포 배양액; 생물학적 샘플, 예컨대 생물학적 물질 샘플 (혈액, 혈청, 뇨, 뇌척수액, 눈물, 가래, 타액, 조직 샘플, 등); 실험 샘플; 식품, 물, 또는 공기 샘플; 바이오프로덕트(bioproduct) 샘플, 예컨대 세포 추출물, 특히 바람직한 당단백질을 합성하는 재조합 세포 등의, 천연 또는 인간이 만든 물질을 포함한다. 전형적으로, 샘플은 뉴라미니다제를 생산하는 유기체, 흔히 바이러스와 같은 병원성 유기체가 포함된 것으로 의심될 것이다. 샘플은 물 및 유기 용매/물 혼합물을 포함하는 임의의 매질 중에 함유될 수 있다. 샘플은 인간과 같은 살아있는 유기체, 그리고 세포 배양물과 같이 인간이 만든 물질을 포함한다.
본 발명의 처리 단계는 본 발명의 조성물을 샘플에 부가하는 것을 포함하거나, 또는 상기 조성물의 전구체를 샘플에 부가하는 것을 포함한다. 상기 부가 단계는 전술한 바와 같은 임의 투여 방법을 포함한다. 필요에 따라, 조성물을 적용한 후 뉴라미니다제의 활성을 뉴라미니다제 활성을 검출하는 직접적인 방법 및 간접적인 방법을 비롯한 임의의 방법으로 관찰할 수 있다. 뉴라미니다제 활성을 측정하는 정량적, 정성적 및 반정량적 방법을 모두 고려할 수 있다. 전형적으로, 전술한 스크리닝 방법들 중 한가지가 적용되지만, 살아있는 유기체의 생리학적 특성을 관찰하는 것 등의 다른 방법도 적용할 수 있다.
뉴라미니다제를 함유하는 유기체는, 박테리아 (비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 클로스트리듐 퍼프링겐스(Clostridium perfringens), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 및 아르트로박터 시알로필루스 (Arthrobacter sialophilus)) 및 바이러스 (특히, 오르쏘믹소바이러스(orthomyxo virus) 또는 파라믹소바이러스(paramyxo virus), 예컨대 인플루엔자 바이러스 A (예, H1N1, H5N1), 및 B, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 가금류 유행병 바이러스, 및 센다이 바이러스)를 포함한다. 이들 임의의 유기체로부터 유래되거나 확인되는 뉴라미니다제 활성의 저해는 본 발명의 범위에 포함된다. 인플루엔자 바이러스의 바이러스학은 "Fundamental Virology" (Raven Press, New York, 1986), Chapter 24에 기재되어 있다. 본 발명의 화합물은 오리 및 기타 조류, 설치류, 돼지 등의 동물, 또는 인간에서 인플루엔자 감염의 예방 및 기존재하는 인플루엔자 감염을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 조성물은 효소의 활성을 평가하기 위한 통상의 임의 기법으로 뉴라미니다제에 대한 저해 활성을 스크리닝한다. 본 발명의 범위내에서, 전형적으로 시험관에서 뉴라미니다아제 저해에 대해 먼저 조성물을 스크리닝한 다음, 저해 활성을 나타내는 조성물을 생체내에서 활성을 스크리닝한다. 시험관 내 Ki (저해 상수)가 약 5 x 1O-6M 미만, 전형적으로 약 5 x 10-7M 미만, 바람직하게는 약 5 x 10-8M 미만인 조성물을 생체내에서 사용하는 것이 바람직하다.
유용한 시험관내 스크리닝에 대해서는 자세히 기술된 바 있어, 본원에서는 상술하지 않는다 (Itzstein, M. von et al.; "Nature", 363(6428):418-423 (1993); Potier, M.; et al.; "Analyt. Biochem.", 94:287-296 (1979); Chong, A. K. J.; et al.; "Biochem. Biophys. Acta", 1077:65-71 (1991); 및 Colman, P. M.; et al.; International Publication No. WO 92/06691 (Int. App. No. PCT/AU90/00501, publication date Apr. 30, 1992)). 또한, 생체내 스크리닝도 상세하게 기술된 바 있다 (Itzstein, et al., 1993 in particular page 421, column 2, first full paragraph, to page 423, column 2, first partial paragraph, and Colman, p. 36).
표 1은, 자나미비르 포스포네이트 유도체 1a 및 1b의 뉴라미니다제 저해, 항-인플루엔자 및 세포독성 활성을, 자나미비르 및 오셀타미비르산과 비교하여 나타낸다. 포스포네이트 유도체 1a 및 1b는 다양한 야생형 및 돌연변이형 인플루엔자 바이러스에 대해 자나미비르 보다 강력한 효능을 나타내었다.
표 1. 뉴라미니다제 저해, 항-인플루엔자 활성 및 세포독성 활성
생물분석 a 측정항목 1a 1b 자나미비르 오셀타미비르산
WSN (H1N1) IC50 (nM) b 0.65 ± 0.05 1.2 ± 0.4 5.3 ± 2.1 2.6 ± 1.1
EC50 (nM) c 1.3 2.4 ± 0.8 23.5 ± 8.5 12.2 ± 2.3
WSN_274Y (H1N1) IC50 (nM) b 0.5 0.25 ± 0.05 1.75 ± 0.75 593 ± 68
EC50 (nM) c 27 26 ± 8 290 ± 15 30000 ± 1600
Pandemic (H1N1) IC50 (nM) b 0.9 0.8 4.3 1.7
EC50 (nM) c 20.3 26.5 267 76
RG14 (H5N1) IC50 (nM) b 1.0 0.8 4.0 0.6
EC50 (nM) c 978 1700 ± 500 16360 ± 2980 1250 ± 440
Udorn (H3N2) IC50 (nM) b 6.4 5.2 37.9 3.2
EC50 (nM) c 55 32 ± 23 41 ± 6 3.0 ± 1.8
293T cell CC50 (nM) d > 30,000 > 50,000 > 100,000 > 100,000
a 인플루엔자 바이러스 A/WSN/1933 (H1N1), A/WSN/1933 (H1N1) 유래 H274Y 뉴라미니다제 돌연변이, A/California/7/2009 (pandemic H1N1), A/Vietnam/1194/2004 RG14 (H5N1), 및 A/Udorn/307/1972 (H3N2)를 뉴라미니다제 저해 및 항-인플루엔자 분석을 위한 생물분석 재료로 사용하였다. 인간 293T 세포는 화합물의 세포독성 측정에 사용하였다.
b 형광 기질, 2'-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산(MUNANA)을 이용하여, 여러가지 인플루엔자 뉴라미니다제 효소들의 50% 저해를 야기하는 화합물 농도인 IC50 값을 결정하였다.
c 저해 상수는 기질로 MUNANA를 이용한 카이네틱 연구로 결정하였다.
d 여러가지 인플루엔자 균주들에 대한 항-인플루엔자 활성은, 여러가지 인플루엔자 균주의 감염으로 인한 세포변성 효과를 50% 예방하는 화합물의 농도인 EC50 값으로 측정하였다.
e 293T 세포에 대한 세포독성 분석에서 현저한 독성 효과가 나타나지 않는 최고 사용 농도
뉴라미니다제 저해 분석은 효소 소스로서 인플루엔자에 조합된 뉴라미니다제를 이용하여 수종의 인플루엔자 균주의 뉴라미니다제를 측정하였다. 형광 기질 MUNANA (2'-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산)을 사용하여, 모든 바이러스 효소들에 대해 뉴라미니다제 활성을 측정하였다. 표 1은 뉴라미니다제 활성을 50% 저해하는 화합물의 농도를 측정하고, 이들 화합물의 상대적인 뉴라미니다제 저해 효능을 분석한 IC50 값을 나타낸다.
5종의 뉴라미니다제에 대한 1a 및 1b의 IC50 값은 자나미비르 보다 모두 현저하게 높았고, 오셀타미비르산과 비슷하다. 이들 2종의 포스포네이트 화합물은, 뉴라미니다제의 274번 위치에서 본래의 히스티딘이 타이로신 잔기로 치환된 오셀타미비르 내성인 WSN 274Y 뉴라미니다제 돌연변이를 저해하는데 보다 더 현저하게 우수하였다.
인플루엔자 감염 매개의 세포변성 효과를 방어하는 능력에 대해, 5종의 인플루엔자 균주에 대한 이들 화합물의 항-인플루엔자 활성을 측정하였다. 항-인플루엔자 활성은, 감염으로 인한 세포변성 효과를 50% 방어하는 농도인 EC50 값으로 결정하였다. 표 1은 1a 및 1b가 WSN 균주 및 2009 pandemic H1N1 균주 등의 H1N1 인플루엔자 바이러스에 대해 높은 항-인플루엔자 활성을 나타냄을 보여준다.
1a 및 1b의 항-인플루엔자 활성은 특히 오셀타미비르-내성인 WSN (H1N1) 바이러스에서 특히 현저하였다. 274번 위치에 오셀타미비르-내성 뉴라미니다제 돌연변이를 가지고 있는 H1N1 인플루엔자 바이러스가 임상적으로 우세한 H1N1 분리주이었다 (Moscona, A. N. Engl . J. Med . 2005, 353, 2633). 이들 돌연변이 뉴라미니다제에 대한 1a 및 1b의 월등한 항-인플루엔자 활성은 이들 유행성 인플루엔자 균주를 치료하는 옵션에 변화를 야기할 수 있다. 1a 및 1b는 H1N1 인플루엔자 균주들에 대한 강력한 항-인플루엔자 저해제일 뿐만 아니라, 또한 RG14 (H5N1) 및 Udorn (H3N2) 인플루엔자 균주들에 대한 항-인플루엔자 제제로서 자나미비르와 유사하다.
생물분석 측정에서, 1a 및 1b 둘다 강력한 항-뉴라미니다제 및 항-인플루엔자 화합물인 것으로 확인되었다. 이들은 일반적으로 자나미비르 보다 강력하며, 오셀타미비르 내성인 H1N1 인플루엔자 바이러스에 대해 매우 강력하게 작용한다. 이들 화합물은, 강력한 항-인플루엔자 물질일 뿐만 아니라, 테스트한 최고 농도에서도 인간 293T 세포에 무독성이었다 (표 1).
본 발명의 일 구현예에서, 포스포네이트 1a는 A/WSN/1933 (H1N1)에 대한 강력한 NA 저해제 및 항-독감 제제이며, IC50 및 EC50 값은 각각 0.65 및 1.3 nM이다.
본 발명의 일 구현예에서, 포스포네이트 1a는 A/WSN/1933 (H1N1) 바이러스의 H274Y 돌연변이에 대해 강력한 NA 저해제 및 항-독감 제제이며, IC50 및 EC50 값은 각각 0.5 및 27 nM이다. 자나미비르 포스포네이트의 IC50 및 EC50 값은 타미플루-내성인 H1N1 바이러스에서 특히 현저하다.
본 발명의 일 구현예에서, 포스포네이트 1a는, A/California/7/2009 (pandemic H1N1), A/Vietnam/1194/2004 RG14 (H5N1), 및 A/Udorn/307/1972 (H3N2) 바이러스에 대해, 강력한 NA 저해제이고 항-독감 제제이다.
본 발명의 일 구현예에서, 포스포네이트 1b는, A/WSN/1933 (H1N1) 바이러스에 대해, 강력한 NA 저해제 및 항-독감 제제이며, IC50 및 EC50 값은 각각 1.2 및 2.4 nM이다.
본 발명의 일 구현예에서, 포스포네이트 1b는, A/WSN/1933 (H1N1) 바이러스의 H274Y 돌연변이에 대해, 강력한 NA 저해제 및 항-독감 제제이며, IC50 및 EC50 값은 각각 0.25 및 26 nM이다. 타미플루 내성인 H1N1 바이러스에 대해, 1b가 가장 현저히 높은 효능을 나타내었다.
본 발명의 일 구현예에서, 포스포네이트 1b는, A/California/7/2009 (pandemic H1N1), A/Vietnam/1194/2004 RG14 (H5N1) 및 A/Udorn/307/1972 (H3N2) 바이러스에 대해, 강력한 NA 저해제 및 항-독감 제제이다.
본 발명의 일 측면에서, 뉴라미니다제-포스페이트 복합체의 분자 모델링은, 활성부내 3개의 아르기닌 잔기들과 포스포네이트의 적절한 결합 모드를 보여준다. 공지된 N1 결정 구조 (PDB code: 2HU4)를 이용한 분자 도킹 실험(도 2)을 통해, 포스포네이트 저해제 1b가, 뉴라미니다제-자나미비르 복합체와 비슷한 결합 포켓에서 C7-C9 글리세릴, C4-아세트아미도 및 C5-구아니디노기에 의해 이루어지는 다른 상호작용 외에도, NA의 아르기닌 잔기 3개와 강하게 결합하는 것으로 나타났다.
본 발명의 일 측면에서, 포스포네이트 저해제 1a의 분자 모델링에서, 결합 포켓에서 C7-C9 글리세릴, C4-아세트아미도 및 C5-아미노기에 의해 이루어지는 다른 상호작용 외에도, 뉴라미니다제의 아르기닌 잔기 3개와의 강력한 상호작용이 확인되었다 (도 2).
타미플루-내성 바이러스 분리주의 동정
본원에서는 타미플루 내성 바이러스 분리주에 대한 효과적인 진단제를 개발하기 위한 RABC(Resistance Assessment by Binding Competition) 방법의 설계와 실무를 기술한다.
자나미비르와 OC는 인플루엔자 뉴라미니다제 (NA)의 동일한 활성부에 결합한다. 하지만, 오셀타미비르-내성인 H5N1 바이러스의 뉴라미니다제는 자나미비르에 대해 여전히 감수성을 유지할 수 있다 (Collins PJ, et al. (2008). Nature 453 (7199): 1258-1261). Glu276 잔기를 Arg224 쪽으로 방향 전환(reorientation)하여 보다 큰 소수성 포켓을 형성하는 뉴라미니다제의 유도 적합이 OC의 측쇄를 수용하는데 필요하다 (M. Z. Wang, C. Y. Tai, D. B. Mendel, Antimicrob . Agents Chemother. 46, 3809 (2002); P. J. Collins et al., Nature 453, 1258 (2008)). N1 그룹 뉴라미니다제는 소수성 포켓 형성을 방지하는 H274Y와 같은 돌연변이를 가가지고 있어, 오셀타미비르의 K i 값이 수백배 증가된 내성 형태로 진화할 수 있다. 소수성 포켓이 필요 없는 경우, H274Y 뉴라미니다제에 대한 자나미비르의 K i 값은 바뀌지 않는다 (P. J. Collins et al., Nature 453, 1258 (2008)). 본 발명의 측면에서, 결합 차이를 연구하여 바이러스 분리주의 OC 감수성에 대한 새로운 진단법을 개발하였다.
인플루엔자 바이러스의 오셀타미비르-민감 버전과 오셀타미비르-내성 버전 간에 결합 차이를 이용하여, 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제에서 오셀타미비르가 결합하는 결합부에 결합하는 인지 유닛 (R)을 선택하는 것이, 인플루엔자 바이러스의 타미플루-내성 균주를 검출하는 토대가 된다는 것을 놀랍게도 확인하였다.
본 발명의 특정 측면에서, 인지 유닛 (R)은 감지 유닛 (S)과 커플링된다. 일부 구현예에서, 인지 유닛 (R)은 링커 (L)와 커플링되고, 다음으로 감지 유닛 (S)과 커플링된다. R-L-S 분자로 타미플루-내성 형태와 타미플루-민감성 인플루엔자 바이러스를 구분한다.
강력한 뉴라미니다제 저해제인 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC; Tamiflu®)는 인플루엔자 바이러스의 NA 분자에 결합하는 OC 이외의 (non-OC) 분자 (R)에 대한 효과적인 경쟁자이다. 그러나, OC는 여전히 OC 이외의 인지 유닛 (R)과 동등하게 결합하는 OC-내성 돌연변이 (예, H274Y)와 야생형 NA와의 결합에서는 불량한 경쟁자이다.
인지 유닛 (R)은, 전형적으로, 자나미비르, 타미포스포르 구아니딘 모노에스테르 또는 자나미비르 포스포네이트 1a 또는 이의 유도체들 1b, 1c 및 1d 등의 공지된 NA 결합 모이어티로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R은 미국 특허 7,888,337B2에 개시된 바와 같이 H1N1 및 H5N1 형의 야생형과 H274Y 돌연변이 바이러스에 대한 뉴라미니다제 저해제로서의 활성을 가지는, 오셀타미비르를 포함하는 포스포네이트 화합물들로부터 선택된다.
감지 모이어티 (즉, 검출 모이어티)에서 유래되는 신호에 의해, 검출되는 NA와의 결합을 관찰할 수 있다. 이러한 상동적인 형광 및 비색 감지 모이어티들은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 예로, Wang Q. M. et al., "펩타이드 p-니트로아닐리드를 기질로 이용한 리노바이러스 -14 3C 프로테아제의 연속적인 비색 분석법" Anal. Biochem. Vol. 252, pp. 238-45 (1997), 및 Basak S. et al. "분자내 퀀칭된 형광성 펩타이드를 이용한 프로단백질 컨버타제 4의 기질 특이성과 생물분석에 대한 시험관내 평가" Biochem. J. Vol. 380, pp. 505-14 (2004)를 참조한다.
감지 유닛은, 형광 표지, 금 표지 및 효소 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 모이어티에 직접, 또는 간접(아비딘/스트렙타비딘-바이오틴, 항체-항원 또는 그외 당해 기술 분야에 공지된 방법들을 통해)적으로 연결된다. 다양한 종류의 센서들은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 그 예로는 방상성 표지, 양자점 표지, 단백질 표지 등을 포함한다.
일부 측면들에서, 감지 유닛은 접합된 결합 파트너와 검출가능한 결합 복합체를 형성하고, 상기 결합 파트너는 시약과 접합된 결합 쌍을 이룬다. 결합 쌍은, 스트렙탑딘:바이오틴; 아비딘:바이오틴; 엽산:폴레이트 결합 단백질; 시알산, 탄수화물 또는 당단백질:레시틴; 올리고- 또는 폴리-dA:올리고- 또는 폴리-dT; 올리고- 또는 폴리-dC:올리고- 또는 폴리-dG; 페닐보론산:살리실하이드록사믹산; 알데하이드 및 케톤 모이어티:하이드라지드; 설프하이드릴 모이어티:말레이미드; 아미노 모이어티:N-하이드록시숙신이미드 에스테르; 및 중금속:티올; IgG의 Fc 영역: 단백질 A/단백질 G/단백질 A/G; 디곡시게닌:항-디곡시게닌; 5-브로모데옥시우리딘:항-브로모데옥시우리딘; 디니트로페닐:항-디니트로페닐; 플루오레세인 이소티오시아네이트:항-플루오레세인 이소티오시아네이트; N-2-아세틸아미노플루오렌:항-N-2-아세틸아미노플루오렌; 및 N-2-아세틸아미노-7-요오도플루오렌:항-N-2-아세틸아미노-7-요오도플루오렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 것을 기반으로 하거나 임의의 하나일 수 있다.
특정 측면에서, 표지는 형광단을 포함한다. 일부 측면들에서, 형광단은 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 레소루핀, 잔텐, 시아닌, 피렌. 프탈로시아닌, 피코빌리단백질, Alexa, Cy3, Cy5, 스쿠아렌 염료, 에너지 전달 염료를 만드는 조합물, 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. Alexa 플루오레센트 염료는 Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 546 및 Alexa Fluor 532로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광단은 BODIPY 말레이미드, 요오도아세트아미드 및 메틸 브로마이드; Alexa Fluor 말레이미드; 플루오레세인 5- 및 6-이성질체 말레이미드 및 메틸 브로마이드; 오레곤 그린 이소티오시아네이트 및 말레이미드; 테트라메틸로다민 5- 및 6-이성질체 요오도아세트아미드 및 말레이미드; 로다민 레드 말레이미드; 텍사스 레드 브로모아세트아미드 및 말레이미드; 피리딜옥사졸 말레이미드; 벤즈옥사디아졸 유도체, 예로, NBD 할라이드 및 요오도아세트아미드, SBD; 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) 요오도아세트아미드; 스틸벤 요오도아세트아미드 및 말레이미드; 쿠마린 말레이미드 및 요오도아세트아미드, 즉, MDCC, IDCC, 등; 나프탈렌 유도체, 즉, 아크릴로단(acrylodan), 바단(badan), IAANS, MIANS, IAEDANS 및 단실(Dansyl); 아지리딘(aziridine); 다폭실 유도체(dapoxyl derivative), 즉, 다폭실(2-브로모아세트아미딜)설폰아미드; 피렌 말레이미드 및 요오도아세틸 유도체; 및 모노브로모- 및 모노클로로비만(monochlorobimane)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
감지 유닛 (S)로부터 신호를 검출하기 위한 방법 또는 수단은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 신호가 방출, 퀀칭 등인 경우, 이는 광검출기, 카메라 등으로 검출한다.
광-방출부 및 퀀칭부의 조합은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 등의 기법과 같이 공지된 기법을 적절하게 적용할 수 있다.
광-방출부는 발광을 구현할 수 있는 한 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 이의 예로는 형광 기질, 화학발광 기질, 전기화학발광 기질 등을 포함하는 것 또는 이들 기질로 구성된 것을 포함한다. 이는 단독으로 사용하거나, 또는 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 것들 중에서, 퀀칭부가 광-방출부에 근접하게 존재하는 경우, 방출은 퀀칭부의 작용에 의해 퀀칭되는 바람직하며, 형광 기질은 이의 가시성이 우수하고 검출이 용이한 것이 더 바람직하다. 형광 기질은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 그 예로는 안트라센, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, 예로, 테트라메틸 로다민 및 설포로다민, 단실 클로라이드, Texas Red, AL 350, 인도카르보시아닌 (CY) 등을 포함한다.
퀀칭부는, 퀀칭부가 광-방출부와 인접하게 위치되었을 때 광-방출부의 발광을 퀀칭할 수 있다면 특별히 한정되지 않으며, 퀀칭부는 광-방출부의 타입 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 그 예로는 퀀칭 기질을 포함하는 것 또는 퀀칭 기질로 구성된 것이 있다. 퀀칭 기질은 특별히 한정되지 않으며, 목적에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 광-방출부가 형광 기질로 구성된 경우, 퀀칭 기질의 예로는 형광 기질이 광을 방출하는 경우 등일 때 방출되는 에너지를 흡수할 수 있는 기질을 포함한다. 적정 예로는 광-방출 기질들 간에 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 허용하는 기질을 포함한다. 구체적인 예로는 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), 디메틸아미노벤젠설포닐 (DABSYL), 금 나노입자, Black Hole Quencher 등이 있다.
인지 유닛은 센서에 접합된 다음 광-방출부와 퀀칭부와 커플링된다. 퀀칭부는 인지 유닛이 타겟 NA와 결합하기 전에, 즉, 퀀칭부가 광-방출부와 인접하게 존재할 때, 광-방출부의 발광을 퀀칭할 수 있다. 인지 유닛이 타겟 NA에 결합된 후, 퀀칭부는 타겟 핵산으로부터 해리된다. 그 결과, 퀀칭부는 광-방출부로부터 떨어져 존재하게 되고, 퀀칭부의 작용이 소실되어, 광-방출부에서 발광이 이루어지게 된다.
링커 유닛 (L)은 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 한에서 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 에틸렌 글리콜 링커와 같은 수용성 링커를 사용할 수 있다. 수용성 링커의 길이는 적정 길이로 결정할 수 있다.
일 측면에서, 테스트할 인플루엔자 바이러스 샘플 또는 R-L-S 복합체를 어레이와 같은 고체 표면에 고정시킨다. 고체 표면은 랭뮤어 블로드젯막, 유리, 게르마늄, 실리콘, (폴리)테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 갈륨 비소, 갈륨인, 규소 산화물, 규소 질화물 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다. 고체 표면은 마이크로웰 또는 마이크로타이터 플레이트 또는 디쉬, 실리콘 칩, 유리 슬라이드, 비드, 비세입자, 필름 또는 멤브레인, 병, 디휘, 슬라이드, 블롯팅 물질, 필터, 섬유, 직조 섬유, 형상화된 폴리머, 입자, 딥-스틱, 시험관, 칩 및 마이크로칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자는 글리코포린, α1-산 당단백질, α2-마크로글로불린, 오보무코이드(ovomucoid), 및 이들의 조합과 같은 당단백질이 접합되거나 조성물로 상태인 천연 또는 합성 올리고사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 타입 이상의 탄수화물 수용체를 포함하는 지지체에 결합되며, 탄수화물 수용체는 바이러스 및/또는 바이러스 입자의 혈구 응집소 성분과 결합한다. 특히, 정상적으로 타미플루®에 민감한 모든 공지된 조류 인플루엔자 (AI) 서브타입을 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 검출할 수 있다. 본 방법은 타미플루®에 내성인 고병원성 변이체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 바이러스 입자를 검출하는데 적합하다. 본 발명은 특히 크로마토그래피 페이퍼 또는 멤브레인인 지지체를 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 물질들은 당업자들에게 잘 공지되어 있다. 본 발명에서, 지지체에 탄수화물 수용체를 공유결합으로 결합시키거나 또는 물리적으로 흡착시킬 수 있다 (미국 출원 공개공보 20100009339).
본 발명의 방법은 점액, 타액, 호흡기 분비물, 인두 세척물, 코 세척물, 척수액, 가래, 뇨, 정액, 땀, 변, 혈장, 혈액, 기관지폐포 체액, 질액, 눈물 및 조직 생검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 샘플을 함유하는 의심되는 인플루엔자 바이러스를 이용할 수 있다. 또한, 유사한 기법은 세포 배양물 유래의 바이러스 샘플, 예를 들어 Vero 세포와 같은 세포에서 배양한 인플루엔자 샘플의 이용에도 적용할 수 있다. 본 발명의 방법은 무손상 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포 또는 세포가 제거된 인플루엔자 바이러스 샘플을 대상으로 수행하는데 적합하다. 인플루엔자 바이러스는 포유류 (인간, 말, 돼지 등) 또는 조류 기원의 바이러스일 수 있다.
키트
본 발명의 뉴라미니다제 결합 분자를 포함하는 키트도 고려된다. 여러가지 키트 구성 요소들이 별개의 용기로 개별 포장되어, 사용 직전에 혼합할 수 있다. 이렇듯 키트 구성 요소들이 각각 포장함으로써 활성 성분의 기능 상실없이 장기간 보관가능하게 할 수 있다. 2종 이상의 구성 요소들이 동일 용기에 존재하는 구현예도 고려된다. 예시적인 키트는 다음과 같은 시약들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 여러가지 분석에 이용하기 위한 세척 완충 시약; 뉴라미니다제-결합력이 없는 음성 대조군 시약; 시그널링 모이어티로부터 검출가능한 신호 발생을 위한 신호 발생 시약; 및 시린지, 인후 면봉(throat swab) 또는 기타 샘플 채집 디바이스 등의 샘플 수집 수단. 본 발명의 키트는, 필요에 따라, 본 발명의 키트의 하나 이상의 유닛을 포함할 수 있는 팩(pack)으로 제시될 수 있다. 상기 팩은 키트 이용 설명서가 동봉될 수 있다. 팩은 실험 보충물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관으로부터 지정된 형태로 용기에 첨부되는 고지를 수반할 수 있으며, 고지는 조성물의 형태에 대한 기관의 승인을 반영한다.
결합 분자에 대한 예시적인 구현예
본 발명은 인지 유닛 (R) - 임의의 링커 (L) - 감지 유닛 (S) 구조를 가지는 특이적인 결합 분자의 결합 능력을 측정함으로써, 타미플루 내성 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 결합 분자 (BM)에 대한 일부 구현예는 다음과 같다:
BM 1: 자나미비르-트리아졸 링커-바이오틴
Figure pat00022
트리아졸기를 포함하는 링커는 클릭(click) 화학 반응 (알킨 및 아지드의 1,3-이극성 사이클로부가)에 의해 형성된다. 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 바이오틴 유닛을 검출한다.
BM 2: 자나미비르-트리아졸 링커-플루오레세인
Figure pat00023
플루오레세인은 494 nm에서 최대 흡광을 나타내며, 521 nm에서 (수중) 최대 방출을 나타낸다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)를 사용하여 링커와 연결시킨다. 다른 예로, 알렉사 염료 및 양자점 등의 다른 플루오레센트 물질도 사용할 수 있다.
BM 3: 자나미비르-에틸렌 글리콜 링커-바이오틴
Figure pat00024
에틸렌 글리콜 링커의 길이는 x = 1 내지 x = 4로 조정될 수 있다.
BM 4: 자나미비르-에틸렌 글리콜 링커-플루오레세인
Figure pat00025
BM 5: 타미포스포르 구아니딘-링커-바이오틴
Figure pat00026
타미포스포르 구아니딘은 인플루엔자 바이러스의 타미플루-민감성 균주와 타미플루 내성 균주 (H274Y) 둘다에 결합한다. 타미포스포르 구아니딘 모너에스테르는 암모늄 염과 같은 염 형태일 수 있다. 지방족 체인은 링커에 1-6개의 탄소를 가진다(x = 1-4). 다른 예로, 지방족 체인은 실시예 3에 나타낸 바와 같이 에틸렌 글리콜 체인으로 치환될 수 있다.
BM 6: 타미포스포르 구아니딘-에틸렌 글리콜 링커-플루오레세인
Figure pat00027
BM 7: 포스파자나미비르-트리아졸 링커-바이오틴
Figure pat00028
포스파자나미비르는 암모늄 염 등의 염 형태일 수 있다.
BM 8: 포스파자나미비르-에틸렌 글리콜 링커-플루오레세인
Figure pat00029
포스파자나미비르는 암모늄 염 등의 염 형태일 수 있다.
BM 9: 포스파자나미비르 모노에스테르-에틸렌 글리콜 링커-바이오틴
Figure pat00030
에틸렌 글리콜 링커의 길이는 x = 1 내지 x = 4로 조정될 수 있다.
BM 10: 포스파자나미비르 모노에스테르-에틸렌 글리콜 링커-플루오레세인
Figure pat00031
에틸렌 글리콜 링커의 길이는 x = 1 내지 x = 4일 수 있다.
일반 구조 R-L-S인 인플루엔자 NA-결합 분자의 다른 예들은 Kale, R. R. et al., Am. Chem. Soc. 2008, 130, 8169-8171; Mckimm-Breschkin, J. L. et al., Angew, Chem . Int. Ed. 2003, 42, 3118-3121; Lu, C.-P. et al., Angew . Chem . Int. Ed. 2005, 44, 6888-6892; Kimura, Y. et al., Tetrahedron Lett . 2009, 50, 3205-3208에 기술되어 있다.
본 발명은 최초로 구조 R-L-S의 분자의 NA-결합 능력을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 타미플루-내성 버전을 검출할 수 있음을 확인하였다.
오셀타미비르 카르복실레이트 ( OC ) 및 R-L-S 타입의 결합 분자와 경쟁적인 NA 결합
인플루엔자 뉴라미니다제에 결합하는 바이오틴이 접합된 자나미비르 (ZB)를 효율적으로 제조하였다. 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC)가 자나미비르의 결합에 대한 경쟁자로서 존재하는 경우, OC에 대한 감수성을 측정할 수 있었다. OC와의 결합 경쟁적인 분석으로, 대만에서 2008년 OC 내성 H1N1 분리주의 급격한 증가와, OC 내성의 pandemic 2009 H1N1의 출현이 검증되었다. 경쟁적인 결합에 의한 내성 평가 (RABC) 분석을 이용하여, OC의 감수성 평가를 위한 프로토타입의 "현장용" 검사법을 개발하였다. RABC 분석 원리는 병원체의 약물 감수성에 대한 고성능 검사와 신속한 진단에 일반적으로 적용할 수 있었다.
이러한 실험을 위해 바이오틴이 접합된 자나미비르 (ZB)를 제조하였다 (도 1A, 실시예). ZB는 뉴라미니다제 저해를 유의하게 감소시키지 않으면서 유도체화할 수 있는 자나미비르의 7-OH 위치에 바이오틴을 링커를 통해 접합함으로써 제조하였다 (D. M. Andrews et al., Eur . J. Med . Chem . 34, 563 (1999); T. Honda et al., Bioorg . Med . Chem . Lett . 12, 1925 (2002); W. H. Wen et al., J. Med . Chem. 52, 4903 (2009)). 뉴라미니다제에 대한 ZB의 IC50 값은 자나미비르 (2.1 nM) 보다 높은 7.7 nM이었다. 인플루엔자 뉴라미니다제에 대한 ZB의 결합은 뉴라미니다제로 형질전환된 세포 (도 4), 인플루엔자로 감염된 세포 (실시예 참조), 및 고정된 인플루엔자 바이러스 (도 1B)에서 입증되었다. 강력한 뉴라미니다제 저해제인 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC)는 인플루엔자 바이러스와 ZB의 결합에 효과적인 경쟁자일 수 있다.
그럼에도 불구하고, OC는 또한 ZB가 동일하게 잘 결합하는 OC 내성인 H274Y 돌연변이와의 결합에 대해서는 불량한 경쟁자일 것으로 예상되었다. 도 1B는, ZB의 결합에 대한 유의한 OC의 저해 (p< 0.001)가 103-105 PFU 범위의 역가를 가진 274H 인플루엔자 바이러스의 측정 결과에서 확인되었음을 보여준다. ZB의 결합성 약 3%는, 고역가 274H 바이러스 샘플에서, OC와의 경쟁시 확인되었다. 이와는 대조적으로, OC 경쟁에 의한 ZB 결합의 유의한 저해는 동일 역가의 OC 내성인 274Y WSN 바이러스에서는 관찰되지 않았다.
동일한 결과는, 형질전환되고 인플루엔자로 감염된 세포를 이용한 실험에서 입증되었다 (도 11-14). 본 발명자들은 이를 결합 경쟁에 의한 내성 평가, 또는 간단하게는 RABC로 명명하였다. 또한, RABC 분석으로 내성인 균주가 10% 이상 높은 혼성 집단에서 OC 내성 274Y 돌연변이를 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 14).
2005 - 2009년에 수집한 총 137종의 대만 계절성 H1N1 임상 분리주들을 OC 감수성에 대해 RABC 분석으로 조사하였다. 바이러스 샘플을 항-H1N1으로 코팅된 마이크로플레이트 웰에 고정시키고, 2세트 분석으로 30 nM ZB 또는 30 nM ZB + 150 nM OC를 이용하여 결합성을 조사하였다. ZB 결합성 5%를 OC 감수성 측정의 컷-오프로 사용하였다. RABC 분석 결과, 2008년 이전 (도 8A) 또는 2008년 초기 (도 8B)에 수집한 검사한 계절성 H1N1 분리주들 모두 OC 감수성인 것으로 시사되었다. 2008년 중반까지는, OC 내성 H1N1 균주들이 대만에서 분리되지 않았다 (도 8B). 마찬가지로, 2009년에 수집된 50종의 계절성 H1N1 균주들 중 48종은 OC 내성인 것으로 기록되었다 (도 8C). 본 발명자들은, 또한, 대만에서 수집한 pandemic 2009 H1N1 분리주들의 OC 감수성을 조사하였다. 도 8D는, 분리주 ##1-4와 분리주 ##5-7이 각각 OC 감수성 바이러스 및 OC 내성 바이러스임을 보여준다. 7종의 균주들에 대한 RABC 분석을 맹검 조사하고, 그 결과는 나중에 OC 감수성이 서열 분석 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. RABC 분석을 이용하여 감수성 예측을 평가하기 위해, 도 8A-C에 언급된 계절성 H1N1 샘플들의 60종의 분리주들을 무작위로 취하여, 뉴라미니다제 서열을 분석하였다. RABC 분석에 의해 OC 민감성인 것으로 예측되는 샘플들 모두 히스티딘을 가지고 있지만, OC 내성인 것으로 예측되는 샘플은 뉴라미니다제의 대응되는 잔기 274번에 타이로신을 가지고 있었다 (표 2). 내성 집단 출현 가능성을 구하기 위해, ZB 결합 수준이 3-5%인 샘플을 근접 관찰하였다. 이들 샘플에서 분리한 수종의 바이러스 플라그 분석에서 결합성 또는 서열 분석에 의한 IC 내성 바이러스의 동정에는 실패하였다.
표 2는 RABC 분석으로 OC 감수성 상태를 측정하기 위해 본 실험에서 사용된 대만의 임상 H1N1 분리주들을 모두 열거한 것이다. 60종의 바이러스 분리주들을 무작위 선별하여, 바이러스 뉴라미니다제의 274번 아미노산의 서열 (AA274; N2 명명)을 확인하였다. 또한, OC 감수성을 결정하기 위해 멤브레인 상에서의 신속 분석을 수행하여 수종의 샘플들을 테스트하였다. 모든 분석 결과들에서 차이는 확인되지 않았으며, 이는 RABC가 OC 감수성 결정에 신뢰성이 있음을 의미한다.
표 2. 대만의 계절성 H1N1 분리주들의 OC 감수성 결정
RABC 분석으로 결정한 각 인플루엔자 분리주의 OC 감수성을 도 8의 결과에 따라 R (내성) 또는 S (감수성)으로 표시한다. AA274 분석 및/또는 멤브레인 상에서의 신속 검사를 통해 검증하기 위해 수종의 분리주들을 임위 추출하였다 (괄호안 번호는 도 8B에 사용된 샘플 번호임).
명칭 a OC b AA 274 신속 검사 명칭 a OC b AA 274 신속 검사
2009-03510 R Tyr 2008-09198 R
2009-02548 R Tyr 2008-90003 S S(49)
2009-02020 R 2008-09020 S His
2009-01051 R 2008-11548 R
2009-01022 R 2008-05866 R Tyr
2009-00516 R 2008-05860 R Tyr
2009-00513 R 2008-05859 R Tyr
2009-00512 R 2008-05858 R Tyr
2009-01524 R Tyr 2008-05857 R Tyr
2009-00521 R 2008-11547 R
2009-00519 R 2008-00286 R Tyr
2009-00518 R 2008-05855 R Tyr
2009-04512 R 2008-02901 R
2009-00511 R 2008-00279 R Tyr
2009-03518 R 2008-00839 R
2009-03019 R Tyr 2008-00275 R
2009-03005 R Tyr 2008-08451 R Tyr
2009-90010 R 2008-00273 R
2009-02530 R Tyr 2008-09159 R Tyr
2009-02027 R Tyr 2008-09042 R Tyr R(33)
2009-02031 R 2008-08949 R Tyr
2009-01026 R Tyr 2008-08885 S His
2009-04511 R Tyr 2008-05853 R Tyr
2009-01518 R 2008-08416 S His
2009-01516 R 2008-00258 S His
2009-04017 R 2008-10103 R Tyr R(26)
2009-03522 R Tyr 2008-06758 R Tyr
2009-03507 R 2008-02885 R Tyr
2009-03003 R Tyr 2008-06723 S His
2009-03002 R Tyr 2008-10099 R Tyr
2009-02022 R 2008-10095 S His
2009-01043 R 2008-08319 S His
2009-03006 R 2008-02832 R Tyr R(19)
2009-00024 R Tyr 2008-00233 S His S(18)
2009-04010 R Tyr 2008-05506 S His S(17)
2009-00515 R Tyr 2008-07903 S
2009-00514 R 2008-07895 R R(16)
2009-00510 R 2008-07860 R Tyr R(13)
2009-04503 R Tyr 2008-02808 S His
2009-01514 R 2008-05815 S His
2009-01021 S His 2008-03293 S
2009-02013 R 2008-09169 S
2009-04007 R 2008-04240 S
2009-02010 R Tyr 2008-03135 S
2009-01522 S His 2008-02612 S
2008-03020 S His S(73) 2008-04226 S
2009-00009 R 2008-04063 S
2009-00008 R Tyr 2008-04169 S
2008-11526 R Tyr 2007-05601 S
2008-00846 R 2007-02774 S
2008-00842 R 2007-02578 S
2008-09219 R 2007-05222 S
2008-00843 R 2007-04656 S
2008-02904 R 2007-02820 S
2008-09202 R 2007-02523 S
2008-05878 R Tyr 2007-02864 S
2008-09201 R 2007-03700 S
2008-06020 S His S(64) 2007-02782 S
2008-05879 R Tyr 2006-05288 S
2008-02906 R 2006-06542 S
2008-08884 S His 2006-00061 S
2008-09200 R Tyr 2006-05751 S
2008-09199 R 2006-00010 S
2008-02415 R Tyr 2006-04130 S
2008-00841 R 2005-05524 S
2008-10128 R Tyr 2005-10393 S
2008-02418 R 2005-05515 S
2008-05877 R Tyr 2005-03468 S
2008-00302 R
aCDC 바이러스 명
bOC 감수성
현장 분석
본원에서는 인플루엔자 바이러스의 OC 감수성 상태를 가시적으로 평가하기 위한 멤브레인 상에서의 프로토타입 분석을 기술한다. 도 9A는, OC 감수성 H1N1 (WSN)의 ZB에 의한 착색이 OC 경쟁에 의해 차단되었지만, OC 내성 274Y WSN의 착색은 동일 경쟁에 대해 내성임을 보여준다. 본 발명자들은 수종의 계절 유행성 H1N1 분리주들의 OC 감수성 상태를 검증하기 위해 멤브레인 상에서 착색하는 방법을 사용하였다 (도 9B 및 9C). 또한, 멤브레인 상에 직접 고정시킨 H1N1, H3N2, H5N1 및 flu B 인플루엔자 바이러스에 대해서도 민감한 ZB 결합도 입증되었다 (도 9D). 프로토타입 RABC 기반의 착색 분석은 신속하며, 검출 지침서가 필요없다. 이 방법은, 계절성 H1N1 또는 유행성 H1N1 감염에 대한 치료 옵션을 시기 적절하게 결정하기 위해, 의료원에서 "현장용" 분석으로 사용할 수 있었다. 아울러, 대부분의 다른 호흡기 감염 병원체는 뉴라미니다제를 가지고 있지 않기 때문에, 본 검사법을 이용하여 인플루엔자 바이러스와 다른 호흡기 감염증을 구별할 수 있었다.
RABC 분석은 단순하며 강력한 방법이며, 여러가지 인플루엔자 바이러스와 감염된 세포에서 다양한 분석 플랫폼을 이용하여 입증된 바 있다. 분석 원리는 약물 감수성 평가를 위한 다른 병원체 타겟에도 적용할 수 있었다.
하기 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본원에 제시된 구체적인 구현예들에 대한 상세한 설명과 이들 도면들 중 하나 이상의 도면을 함께 참조하여 더 잘 이해할 수 있는 본 발명의 특정한 측면들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 특허 또는 출원 파일에는 하나 이상의 유색 도면에 포함되어 있다. 이러한 유색 도면(들)이 포함된 특허 또는 특허 출원 공개공보들은 요청서와 관납료를 특허청에 제출하여 제공받을 수 있을 것이다.
도 1은 자나미비르 포스포네이트 동족체 및 유도체의 합성 경로를 도시한 것이다.
도 2A-2D는 화합물 1a (2A), 화합물 1b (2B), 자나미비르 (2C) 및 오셀타미비르산 (2D)의 분자 모델을 도시한 것이다.
도 3은 자나미비르-바이오틴 접합체 (ZB, 9)의 합성 경로를 도시한 것이다.
도 4는 자나미비르-형광 접합체 15 및 17의 합성 경로를 도시한 것이다.
도 5는 타미포스포르-바이오틴 접합체 24의 합성 경로를 도시한 것이다.
도 6은 디자나미비르-바이오틴 접합체 26의 합성 경로를 도시한 것이다.
도 7A-7B는 고정된 인플루엔자 샘플을 이용한 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC) 감수성 확인을 도시한 것이다. (7A) 본 실험에 사용된 화합물의 구조. (7B) OC 감수성 (S) 또는 OC 내성 (R) WSN 바이러스 샘플들을 항-HA 코팅된 마이크로플레이트 웰에 웰 당 105, 104 또는 103 PFU로 고정하였다. 3개의 동일한 웰에 고정한 바이러스 샘플을 전체 결합의 경우에는 30 nM ZB와 인큐베이션하거나, 또는 OC 내성 ZB와의 결합성을 측정하기 위해 30 nM ZB + 150 nM 경쟁적인 OC와 인큐베이션하였다. 결합된 바이러스를 스트렙타비딘이 접합된 알칼리 포스파타제와 다시 인큐베이션한 다음, 화학발광 기질과 인큐베이션하여, 결합된 알칼리 포스파타제에 의한 촉매 반응으로 인한 상대적인 발광 단위 (RLU) 증가를 측정하였다. OC 내성 ZB 결합성 수치를 OC 경쟁 존재 하에 측정한 RLU : OC 부재시에 측정한 RLU 비로서 계산하였다. 경쟁적인 OC에 의한 유의한 결합 감소를 일으키는 조건을 p < 0.001로 "**"로 표시하였다. 점선은 고역가 (웰 당 105 PFU) 274H 바이러스 샘플을 사용하였을 때 OC로 경쟁적으로 저해할 수 없는 ZB 잔류 결합성 3%를 표시한 것이다.
도 8A-8D는 2005-2009년간 대만에서 수집한 임상 인플루엔자 분리주의 OC 감수성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 2005-2007년 (8A), 2008년 (8B), 및 2009년 (8C) 대만에서 수집한 계절성 H1N1을 OC 감수성 연구에 사용하였다. OC 내성 ZB 결합성을 측정하고, 도 1B에 나타낸 바와 같이 계산하였다. 결합 결과가 1% 미만이면 1%로 나타내었다. 결합성 5%를 표시하는 점선을 사용하여 검사 바이러스들의 감수성 상태를 표시하였다. (8D) 2009년 유해성 H1N1 분리주 7종의 OC 감수성을 전체 결합성 및 OC-내성 결합성에 3세트 측정을 수행하는 것을 제외하고는, 동일한 방식으로 측정하였다. 또한, 전체 결합성과 OC 내성 결합성을 나타낸다.
도 9A-9D는 인플루엔자 바이러스 샘플의 OC 감수성을 측정하기 위한 프로토타입의 "현장용" 분석을 나타낸 것이다. (9A) PVDF 막과 항-HA 항체가 고정된 슬롯을 이용하여, 30 nM ZB 또는 30 nM ZB + 150 nM OC와 예비 인큐베이션한 인플루엔자 샘플을 흡착시켰다. 본 실험에서, 야생형 WSN (274H) 또는 OC 내성 WSN (274Y) 돌연변이 바이러스를 슬롯 당 104, 105, 106 PFU로 사용하였다. 블롯팅과 세척한 후, 막에 알칼리 포스파타제와 스트렙타비딘 접합체를 처리하고, BCIP/NBT로 염색하여, 바이러스 샘플의 OC 감수성을 가시적으로 확인하였다. (9B) 도 8B에 나타낸 2008년 대만 계절성 H1N1 분리주 10종을 멤브레인 분석을 통해 검증하였다. (9C) 마찬가지로, 도 8D에서 테스트한 4종의 유행성 H1N1 바이러스 균주를 프로토타입 분석을 통해 평가하였다. (9D) ZB 결합에 대한 OC의 경쟁은 항체를 사용하지 않고 PVDF 막에 바이러스 샘플을 직접 고정시키는 수정된 방법을 이용하고, 동일한 방식으로 처리하여, 수종의 다른 A 타입 또는 B 타입 인플루엔자 바이러스에서 확인하였다.
도 10은 A/Hanoi/30408/2005 H5N1 뉴라미니다제 cDNA를 발현하는 293T 세포의 표면에서의 ZB (자나미비르 바이오틴) 결합성을 나타낸 것이다. 293T 세포를 NA 발현 벡터인 pCDNA3.1-NA로 리포펙타민™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA)을 이용하여 형질감염시켰다. 48시간 후, 형질감염시킨 세포를 100 nM 자나미비르-바이오틴 (ZB)으로 염색한 다음, DyLight 488와 접합된 스트렙타비딘과 추가로 인큐베이션하였다. 면역형광 이미지를 Leica TCS-SP5 레이저 주사 공초점 현미경을 이용하여 포착하였다.
도 11A-11F는 OC 내성 뉴라미니다제를 발현하는 세포를 다양한 함량으로 293 세포와 혼합하였을 때의 ZB 결합성을 도시한 것이다. OC 민감 (274H)을 발현하는 재조합 293T 세포를 OC 내성 (274Y) 세포와 다음과 같은 여러가지 비율로 혼합하였다: (11A) 274H:274Y = 100:0, (11B) 274H:274Y = 999:1, (11C) 274H:274Y = 99:1, (11D) 274H:274Y = 95:5, (11E) 274H:274Y = 90:10, (11F) 274H:274Y = 0:100. 혼합 세포에 10 nM ZB를 실온에서 1시간 처리한 다음, APC-스트렙타비딘 접합체를 부가한 후, FACSCanto (Becton Dickinson)와 FCS Express 3.0 소프트웨어로 분석하였다. ZB 표지된 세포 퍼센트는 11A, 83.95%; 11B, 84.4%; 11C, 84.62%; 11D, 86.07%; 11E, 83.58%; 및 11F, 75.1%이었다.
도 12A-12F는 293T 세포를 OC 내성 뉴라미니다제를 발현하는 다양한 비율의 세포와 혼합한 경우의, 오셀타미비르 카르복실레이트 내성 균주에 대한 ZB 결합성을 도시한 것이다. 도 11에서와 같이, 세포에 10 nM ZB와 과량의 OC 300 nM를 처리하고, 유사하게 가공하였다. ZB 표지된 세포 퍼센트는 12A, 1.00%; 12B, 2.64%; 12C, 2.78%; 12D, 7.10%; 12E, 12.41%; 및 12F, 68.29%이었다.
도 13A-13B는 MDCK 세포로 감염된 인플루엔자 바이러스와 ZB의 결합에 대한 OC의 경쟁성을 도시한 것이다. (13A) MDCK 세포에 OC 감수성 274H 바이러스 또는 OC 내성 274Y 바이러스를 감염시켰다. 감염 후 20시간 후, 274H 바이러스로 감염된 세포를, 경쟁적인 OC가 다양한 농도로 존재하는 조건 하에 ZB 10 nM (△) 또는 50 nM (○)과 인큐베이션하였다. 마찬가지로, 274Y 바이러스로 감염된 세포도 다양한 함량의 OC 존재 하에 10 nM ZB (▲) 또는 50 nM ZB (●)와 인큐베이션하였다. ZB가 결합된 세포를, 스트렙타비딘이 접합된 알칼리 포스파타제와 추가로 인큐베이션하여, 여러가지 농도의 경쟁적인 OC 존재 하에 상대적인 ZB 결합성을 측정하였다. (13B) OC 감수성 (274H) 바이러스 또는 OC 내성 (274Y) WSN 바이러스를 감염시키고, 30 nM ZB 또는 30 nM ZB + 150 nM OC와 인큐베이션한 다음 스트렙타비딘이 접합된 PE와 인큐베이션한, MDCK 세포 사진. 형광 이미지를 488 및 575 nm에서 여기 및 방출시킨 레이저 유도 플레이트 판독기로 포착하였다.
도 14는 경쟁적인 OC와 ZB의 결합에 의해 OC에 내성인 바이러스 함량을 추산하기 위한 고정된 WSN 바이러스에 대한 RABC 분석 결과를 도시한 것이다. 274H 및 274Y 바이러스 함량이 다양한 혼성 WSN 바이러스 샘플들을 항-HA로 코팅된 마이크로웰에 각각 웰 당 105 PFU (▲), 104 PFU (□) 및 103 PFU (●)로 3세트로 고정하였다. 여기에, 30 nM ZB와 150 nM OC를 1시간 동안 첨가한 다음, 스트렙타비딘이 접합된 알칼리 포스파타제와 커플링시켜, 실험에 사용된 274Y의 양에 대해 그래프로 작성된 OC 내성 퍼센트 추정치를 결정하였다.
도 15-63은 본 발명의 화합물들의 NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
실시예
본 발명의 범위로 한정하고자 하는 것은 아니나, 예시적인 장치, 장비, 방법 및 본 발명의 구현예에 따른 관련 결과들을 아래에 제공한다. 제목 또는 부제를 예를 들어 읽는 사람의 편의를 위해 사용할 수 있지만, 본 발명의 범위를 전혀 제한하지 않아야 함에 유념하여야 한다. 아울러, 본원에 특정 이론들이 제시되고 기술된다. 그러나, 이러한 사항이 옳거나 틀리던간에, 본 발명이 임의의 특정 이론 또는 작용 방식에 대해 무관하게 본 발명에 따라 수행되는 한 본 발명의 범위를 전혀 제한하지 않아야 한다.
모든 시약들은 상업적으로 구입가능하며, 달리 언급되지 않은 한 추가적인 정제없이 사용하였다. 모든 용매들은 달리 언급되지 않은 한 무수물 등급이었다. 모든 비수성 반응은 다른 언급이 없는 한 오븐 건조시킨 유리제품에서 약간의 아르곤 양압 하에 수행하였다. 반응물을 자기 교반하고, 실리카겔 상에서의 박막 크로마토그래피에 의해 모니터링하였다. 플래시 크로마토그래피를 60 - 200 ㎛ 입자 크기의 실리카겔 상에서 수행하였다. 수율은 분광분석에서 순수한 화합물에 대해 기록하였다. 융점은 열전 MEL-TEMP® 1101D 융점 장치로 기록하였고, 보정하진 않았다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker AVANCE 600 스펙트로미터로 기록하였다. 31P NMR 스펙트럼은 Bruker AVANCE 500 스펙트로미터로 기록하였다. 화학적 쉬프트는 테트라메틸실란 (TMS)에 상대적인 δ 값으로 나타내고; 커플링 상수 J는 Hz로 표시한다. 내부 표준 물질로는, 1H-NMR 스펙트럼의 경우 CDCl3 (δH = 7.24), MeOH-d 4 (δH = 3.31) 또는 D2O (δH = 4.79)이었고, 13C-NMR 스펙트럼의 경우 CDCl3 (δc = 77.0) 또는 MeOH-d 4 (δc = 49.15)이었고, 31P-NMR 스펙트럼의 경우 D2O 중의 H3PO4 (δP = 0.00)이었다. 분할 패턴은 s (단선), d (이중선), t (삼중선), q (사중선), m (다중선), br (넓은 피크) 및 dd (double of doublets). IR 스펙트럼은 Thermo Nicolet 380 FT-IR 스펙트로미터에서 기록하였다. 광학 회전은 Perkin-Elmer Model 341 편광계로 기록하였다. 고해상 ESI 중량 스펙트럼은 Bruker Daltonics 분광측정기로 기록하였다.
실시예 1: 3 - 아세트아미도 -4,6- 디아세톡시 -2-(1,2,3- 트리아세톡시 )프로필-3,4,5,6-테트라하이드로-2 H -피란 (3).
Figure pat00032
질소 분위기 하에, 피리딘 (75 mL) 및 아세트산 무수물 (75 mL) 중의 N-아세틸뉴라민산 (5 g, 16.2 mmol)의 현탁액을 실온에서 12시간 교반한 다음, 5시간 동안 100℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 감압 하에 농축하였다. 잔류하는 갈색빛이 도는 유리질 오일을 CH2Cl2 (150 mL)에 용해하고, NaHCO3 포화 수용액 (100 mL), 1 M HCl (100 mL) 수용액 및 브린 (100 mL)으로 순차적으로 헹구었다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과 및 농축하였다. 갈색빛이 도는 잔사를 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (EtOAc/헥산, 67:33 -> 100:0), 연노란색 폼으로서 3을 수득하였으며 (3.8 g, 50%), 여기에는 아노머 혼합물이 분리되지 않은 상태로 함유되어 있다 (α/β = 1:5). 3의 아노모 혼합물을 추가적인 분리없이 다음 단계에 사용하였다. C20H29NO12; TLC (EtOAc) R f = 0.35; 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 6.26 (0.83 H, d, J = 2.5 Hz, H-1β), 5.62 (0.17 H, dd, J = 10.3, 2.1 Hz, H-1α), 5.43 (0.17 H, ddd, J = 6.1, 4.4, 1.9 Hz), 5.29-5.27 (1.66 H, m), 5.22 (0.83 H, td, J = 10.6, 4.9 Hz), 5.17 (0.83 H, td, J = 6.5, 2.7 Hz), 5.11-5.07 (0.34 H, m), 5.03 (0.17 H, ddd, J = 6.5, 2.7 Hz), 4.36 (0.17 H, dd, J = 12.5, 2.6 Hz), 4.31 (0.83 H, dd, J = 12.5, 2.8 Hz), 4.08-3.98 (2.83 H, m), 3.74 (0.17 H, dd, J = 10.5, 2.5 Hz), 2.17-2.15 (0.17 H, m), 2.15-2.13 (0.83 H, m), 2.11 (2.49 H, s), 2.10 (0.51 H, s), 2.09 (0.51 H, s), 2.08 (2.49 H, s), 2.07 (0.51 H, s), 2.04 (2.49 H, s), 2.03 (0.51 H, s), 2.017 (2.49 H, s), 2.013 (0.51 H, s), 2.00 (2.49 H, s), 2.00-1.98 (0.83 H, m), 1.98-1.96 (0.17 H, m), 1.88 (2.49 H, s), 1.87 (0.51 H, s)..17 H, m), 1.88 (2.49 H, s), 1.87 (0.51 H, s).
실시예 2: 디에틸 (5- 아세트아미도 -4- 아세톡시 -6-(1,2,3- 트리아세톡시 )프로필-3,4,5,6-테트라하이드로-2 H -피란-2-일) 포스포네이트 (4).
무수 CH2Cl2 (30 mL) 중의 3의 아노머 혼합물 (2.15 g, 4.52 mmol) 및 디에틸트리메틸실릴 포스파이트 (3.11 mL, 13.65 mmol)에, 트리메틸실릴 트리플루오로메틸설포네이트 (TMSOTf, 1.23 mL, 6.78 mmol)를 0℃에서 처리하였다. 30분 후, 혼합물을 실온으로 가온하여, 24시간 교반하였다. 혼합물을 빙수 (20 mL)에 부은 다음, 수층을 CH2Cl2 (20 mL, 2 x)로 추출하였다. 추출물을 조합하여, NaHCO3 포화 수용액 (50 mL)과 브린 (50 mL)으로 순차적으로 세척한 다음, MgSO4 상에서 건조한 후, 여과 및 농축하였다. 잔사를 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (아세톤/EtOAc, 1:9), 무색 시럽으로서 4를 수득하였고 (1.55 g, 62%), 여기에는 α-아노머와 β-아노머 (2:3)의 혼합물이 함유되어 있었다. 포스포네이트 4의 아노머 혼합물은 추가적인 정제없이 다음 단계에 사용하였다. 순수한 α-아노머 및 β-아노머 (4α 및 4β)의 분석용 샘플을 실리카 겔 상에서의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 수득하였다 (EtOAc/아세톤, 100:0 -> 90:10).
α-아노머 4α: C22H36NO13P; 무색 폼; TLC (EtOAc/아세톤, 9:1) R f = 0.25; (α)D 20 = +39.4 (c = 4.6, CH2Cl2); 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.30 (1 H, dd, J = 5.7, 1.7 Hz), 5.24 (1 H, d, J = 9.9 Hz, NH), 5.18 (1 H, td, J = 6.6, 2.5 Hz), 4.98 (1 H, td, J = 10.6, 5.0 Hz), 4.40 (1 H, dd, J = 12.3, 5.0 Hz), 4.22-4.09 (5 H, m), 3.97 (1 H, q, J = 10.1 Hz), 3.74 (1 H, td, J = 12.5, 2.4 Hz), 3.62 (1 H, dd, J = 10.3, 2.0 Hz), 2.27 (1 H, dd, J = 12.8, 4.9 Hz), 2.09 (3 H, s), 2.05 (3 H, s), 2.02 (3 H, s), 2.01 (3 H, s), 1.98-1.92 (1 H, m), 1.87 (3 H, s), 1.35-1.31 (6 H, m); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 170.9 (C), 170.5 (C), 170.3 (C), 170.2 (C), 170.1 (C), 79.0 (CH, d, 3 J c -p = 17.3 Hz), 71.8 (CH, d, 1 J c-p = 174.6 Hz, C-1), 71.6 (CH, d, 3 J c -p = 20.9 Hz), 71.0 (CH), 67.9 (CH), 63.4 (CH2, d, 2 J c -p = 6.9 Hz, POCH2), 62.8 (CH2, d, 2 J c -p = 6.2 Hz, POCH2), 62.2 (CH2, C-8), 49.6 (CH, C-4), 31.3 (CH2, C-2), 23.1 (CH3), 20.9 (CH3), 20.8 (CH3), 20.7 (CH3, 2 x), 16.5 (CH3, d, 3 J c -p = 5.4 Hz, POCH2 C H3), 16.3 (CH3, d, 3 J c-p = 5.4 Hz, POCH2 C H3); 31P NMR (202 MHz, CDCl3)δ 18.48; HRMS 계산치 C22H35NO13P: 552.1846, 실측치: m/z 552.1921 (M - H)+.
β-아노머 4β: C22H36NO13P; 무색 폼; TLC (EtOAc/아세톤, 9:1) R f = 0.28; (α)D 20 = -40.1 (c = 3.0, CH2Cl2); 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.45 (1 H, d, J = 10.1 Hz, NH), 5.35 (1 H, dd, J = 7.3, 2.3 Hz), 5.32 (1 H, td, J = 15.0, 4.8 Hz), 5.21-5.18 (1 H, m), 4.45 (1 H, d, J = 10.0 Hz), 4.33 (1 H, dd, J = 12.4, 2.8 Hz), 4.30 (1 H, dd, J = 12.3, 7.1 Hz), 4.19-4.13 (2 H, m), 4.12-4.04 (4 H, m), 2.35-2.31 (1 H, m), 2.11 (3 H, s), 2.08 (3 H, s), 2.017 (3 H, s), 2.011 (3 H, s), 2.09-2.03 (1 H, m), 1.88 (3 H, s), 1.34 (3 H, t, J = 7.0 Hz), 1.33 (3 H, t, J = 7.0 Hz); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 170.8 (C), 170.6 (C), 170.2 (C), 170.1 (C), 169.8 (C), 74.0 (CH), 69.7 (CH), 69.5 (CH), 67.9 (CH, d, 1 J c -p = 157.2 Hz, C-1), 67.7 (CH), 63.0 (CH2, d, 2 J c -p = 7.2 Hz, POCH2), 62.7 (CH2, d, 2 J c -p = 6.6 Hz, POCH2), 62.0 (CH2, C-8), 49.0 (CH, C-4), 29.5 (CH2, d, 2 J c-p = 3.2 Hz, C-2), 23.1 (CH3), 21.0 (CH3), 20.9 (CH3), 20.7 (CH3, 2 x), 16.2 (CH3, d, 3 J c -p = 5.1 Hz, POCH2 C H3), 16.3 (CH3, d, 3 J c -p = 5.1 Hz, POCH2 C H3); 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 21.36; HRMS 계산치 C22H35NO13P: 552.1846, 실측치: m/z 552.1879 (M - H)+.
실시예 3: 디에틸 (5- 아세트아미도 -4- 아세톡시 -6-(1,2,3- 트리아세톡시 )프로필-4,5,6-트리하이드로피란-2-일) 포스포네이트 (5)
무수 CH2Cl2 (20 mL) 중의 포스포네이트 4의 아노머 혼합물 (1.1 g, 2 mmol)과 N-브로모숙신이미드 (885 mg, 5 mmol)를 100 W 텅스텐 램프로 조사하면서 환류 가열하였다. 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 완료시 (~ 6 h), 실온으로 냉각시키고, 침전물 숙신이미드를 여과하였다. 여과물을 감압 하에 증발시켜, 노란색 시럽으로서 조산물 2-브로모 유도체를 수득하였고, 이를 추가적인 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
무수 피리딘 (10 mL) 중의 상기에서 제조한 브로모 화합물의 용액을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 감압 농축하고, 갈색 잔가를 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (EtOAc/아세톤, 100:0 -> 90:10), 무색 폼으로서 공액된 포스포네이트 5를 수득하였다 (827 mg, 2단계의 수율 75%). C22H34NO13P; TLC (EtOAc/아세톤, 9:1) R f = 0.28; (α)D 20 = +43.8 (c = 0.59, CH2Cl2); 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.74 (1 H, dd, J = 10.7, 2.2 Hz), 5.54 (1 H, d, J = 8.2 Hz, NH), 5.42-5.40 (2 H, m), 5.26 (1 H, td, J = 6.4, 2.9 Hz), 4.39-4.34 (2 H, m), 4.29 (1 H, q, J = 9.1 Hz), 4.17-4.09 (5 H, m), 2.09 (3 H, s), 2.05 (3 H, s), 2.04 (3 H, s), 2.02 (3 H, s), 1.91 (3 H, s), 1.35 (3 H, t, J = 7.0 Hz), 1.31 (3 H, t, J = 7.0 Hz); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 170.8 (C), 170.4 (C), 170.3 (C), 169.8 (C), 169.7 (C), 147.8 (C, d, 1 J c -p = 225 Hz, C-1), 113.0 (CH, d, 2 J c -p = 22.8 Hz, C-2), 76.5 (CH, d, 3 J c -p = 9.3 Hz), 69.9 (CH), 68.4 (CH, d, 3 J c -p = 15.2 Hz), 67.2 (CH), 63.2 (CH2, d, 2 J c -p = 5.4 Hz, POCH2), 63.0 (CH2, d, 2 J c -p = 5.7 Hz, POCH2), 61.8 (CH2, C-8), 46.4 (CH, C-4), 23.0 (CH3), 20.78 (CH3), 20.73 (CH3), 20.63 (CH3), 20.60 (CH3), 16.16 (CH3, d, 3 J c -p = 4.8 Hz, POCH2 CH3), 16.12 (CH3, d, 3 J c -p = 4.8 Hz, POCH2 C H3); 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 6.374; HRMS 계산치 C22H33NO13P: 550.1690, 실측치: m/z 550.1684 (M - H)+.
실시예 4: 디에틸 (4-(1,2,3- 트리아세톡시 )프로필-2- 메틸 - 3a,7a - 디하이드로 - 4H -피라노(3,4 -d )옥사졸-6-일)포스포네이트 (6)
Figure pat00033
아세트산 (2 mL)과 아세트산 무수물 (2 mL) 의 혼합물 중의 포스포네이트 5 용액(550 mg, 1 mmol)에, 진한 H2SO4 (0.2 mL)를 처리하였다. 이 혼합물을 실온에서 48시간 교반하고, 이를 차가운 (0 ℃) NaHCO3 포화 수용액 (pH 9)에 부은 다음, 30분간 교반하고, EtOAc (30 mL, 5 x)로 추출하였다. 추출물을 조합하여, MgSO4 상에서 건조한 후, 여과 및 감압 농축하였다. 잔류 오일을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (아세톤/ EtOAc, 1:9), 연노란색 시럽으로서 6을 수득하였다 (394 mg, 2 단계의 수율 80%). C20H30NO11P; TLC (EtOAc/아세톤, 9:1) R f = 0.30; (α)D 20 = -11.6 (c = 0.50, CH2Cl2); 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 6.20 (1 H, dd, J = 10.3, 4.0 Hz), 5.58 (1 H, ddd, J = 6.6, 2.9, 1.1 Hz), 5.38 (1 H, td, J = 7.7, 2.5 Hz), 4.71 (1 H, ddd, J = 8.6, 4.0, 2.0 Hz), 4.40 (1 H, dd, J = 12.4, 2.5 Hz), 4.19 (1 H, dd, J = 12.5, 5.9 Hz), 4.18-4.07 (4 H, m), 3.93 (1 H, td, J = 9.2, 0.6 Hz), 3.34 (1 H, dd, J = 10.1, 2.7 Hz), 2.11 (3 H, s), 2.04 (3 H, s), 2.03 (3 H, s), 1.98 (3 H, s), 1.34 (3 H, t, J = 7.0 Hz), 1.32 (3 H, t, J = 7.0 Hz); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 170.5 (C), 169.7 (C), 169.4 (C), 167.2 (C, N=CCH3), 150.1 (C, d, 1 J c -p = 225 Hz, C-1), 111.9 (CH, d, 2 J c -p = 23.4 Hz, C-2), 76.1 (CH, d, 3 J c -p = 6.3 Hz), 71.2 (CH, d, 3 J c -p = 15.3 Hz), 69.6 (CH), 68.8 (CH), 63.1 (CH2, d, 2 J c -p = 5.9 Hz, POCH2), 62.9 (CH2, d, 2 J c -p = 5.7 Hz, POCH2), 61.8 (CH, C-4), 61.6 (CH2, C-8), 20.7 (CH3), 20.6 (CH3), 20.5 (CH3), 16.2 (CH3, d, 3 J c -p = 5.1 Hz, POCH2 CH3), 16.1 (CH3, d, 3 J c -p = 5.1 Hz, POCH2 CH3), 14.0 (CH3, N=CCH3); 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 6.375; HRMS 계산치 C20H29NO11P: 490.1478, 실측치: m/z 490.1374 (M - H)+.
실시예 5: 디에틸 (5- 아세트아미도 -4- 아지도 -6-(1,2,3- 트리아세톡시 )프로필-4,5,6-트리하이드로피란-2-일) 포스포네이트 (7)
t-BuOH (10 mL) 중의 옥사졸린 6 용액(393 mg, 0.8 mmol)에 아지도트리메틸실란 (0.53 mL, 4 mmol)을 80℃에서 24시간 처리하였다. 이 용액을 NaHCO3 포화 수용액에 붓고, EtOAc (30 mL, 3 x)로 추출하였다. 추출물을 모아 MgSO4 상에서 건조한 후, 여과 및 농축하여, 무색 시럽으로서 아지도 화합물 7을 수득하였고 (371 mg, 87%), 이는 다음 단계에 사용할 만큼 실질적으로 순수하였다. 분석용 샘플은 실리카겔 상에서의 플래시 컬럼 크로마토그래피로 수득하였다 (EtOAc 중의 10% 아세톤). C20H31N4O11P; TLC (EtOAc/아세톤, 9:1) R f = 0.30; (α)D 20 = +82.7 (c = 0.58, CH2Cl2); 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.75 (1 H, dd, J = 10.3, 2.4 Hz), 5.73 (1 H, d, J = 8.6 Hz), 5.38 (1 H, dt, J = 7.1, 1.5 Hz), 5.26 (1 H, ddd, J = 8.5, 5.8, 2.6 Hz), 4.53-4.50 (2 H, m), 4.36 (1 H, dd, J = 12.5, 2.6 Hz), 4.17-4.08 (5 H, m), 3.67 (1 H, q, J = 9.2 Hz), 2.10 (3 H, s), 2.05 (3 H, s), 2.02 (3 H, s), 1.99 (3 H, s), 1.34 (3 H, t, J = 7.1 Hz), 1.32 (3 H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 170.8 (C), 170.5 (C), 170.1 (C), 169.7 (C), 147.7 (C, d, 1 J c -p = 224 Hz, C-1), 112.4 (CH, d, 2 J c -p = 22.9 Hz, C-2), 75.9 (CH, d, 3 J c -p = 9.2 Hz), 69.7 (CH), 67.3 (CH), 63.5 (CH2, d, 2 J c -p = 5.7 Hz, POCH2), 63.3 (CH2, d, 2 J c -p = 5.9 Hz, POCH2), 61.9 (CH2, C-8), 57.8 (CH, d, 3 J c -p = 14.7 Hz), 48.5 (CH, C-4), 23.2 (CH3), 20.8 (CH3), 20.77 (CH3), 20.71 (CH3), 16.27 (CH3, d, 3 J c-p = 5.7 Hz, POCH2 CH3), 16.23 (CH3, d, 3 J c-p = 5.7 Hz, POCH2 C H3).
실시예 6: 디에틸 {5- 아세트아미도 -4-( N 2 , N 3 - 비스 ( tert - 부톡시카르보닐 )) 구아니디노 -6-(1,2,3-트리아세톡시)프로필-4,5,6-트리하이드로피란-2-일} 포스포네이트 (8).
Figure pat00034
아지드 7 (350 mg, 0.71 mmol)의 에탄올 (25 mL) 용액을 린들라 촉매 (30 mg)를 이용하여 수소 분위기하에 수소 첨가 반응을 수행하였다. 이 혼합물을 5시간 동안 교반하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 에탄올로 세척하였다. 여과물을 감압 농축하여, 무색 폼을 수득하였다 (278 mg). 조산물 아민 산물을 무수 CH2Cl2 (30 mL)에 용해하고, 1,3-비스(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸티오슈도우레아 (247 mg, 0.85 mmol)와 Et3N (230 mL, 1.7 mmol)을 처리하였다. 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고, HgCl2 (231 mg, 0.85 mmol)를 서서히 첨가하였다. 현탁물을 실온으로 가온하여, 12시간 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석한 다음, 셀라이트 패드로 여과하였다. 여과물을 농축하고, 플래시 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc)로 정제하여, 구아니딘 8 (442 mg, 83% 수율)을 무색 폼으로 수득하였다. TLC (EtOAc) R f = 0.45; (α)D 20 = +18.5 (c = 0.88, CH2Cl2); 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 11.32 (1 H, s), 8.48 (1 H, d, J = 8.5 Hz), 6.12 (1 H, d, J = 8.5 Hz), 5.71 (1 H, dd, J = 10.3, 2.0 Hz), 5.35 (1 H, d, J = 6.6 Hz), 5.23 (1 H, td, J = 6.5, 2.7 Hz), 5.10-5.06 (1 H, m), 4.37 (1 H, dd, J = 12.5, 2.8 Hz), 4.25-4.20 (2 H, m), 4.19-4.12 (2 H, m), 4.12-4.05 (3 H, m), 2.09 (3 H, s), 2.06 (3 H, s), 2.02 (3 H, s), 1.85 (3 H, s), 1.46 (9 H, s), 1.45 (9 H, s), 1.36 (3 H, t, J = 7.1 Hz), 1.31 (3 H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 171.0 (C), 170.5 (C), 170.1 (C), 169.8 (C), 162.7 (C), 157.2 (C), 152.6 (C), 147.4 (C, d, 1 J c -p = 224 Hz, C-1), 114.2 (CH, d, 2 J c -p = 23.3 Hz, C-2), 83.9 (C), 79.8 (C), 77.9 (CH, d, 3 J c -p = 9.3 Hz), 70.1 (CH), 67.4 (CH), 63.4 (CH2, d, 2 J c -p = 5.7 Hz, POCH2), 63.0 (CH2, d, 2 J c -p = 5.7 Hz, POCH2), 62.1 (CH2, C-8), 49.0 (CH, d, 3 J c -p = 15.2 Hz), 48.1 (CH, C-4), 28.2 (CH3, 3 x), 28.0 (CH3, 3 x), 23.1 (CH3), 20.9 (CH3), 20.8 (CH3), 20.7 (CH3), 16.29 (CH3, POCH2 CH3), 16.25 (CH3, POCH2 CH3); HRMS 계산치 C31H50N4O15P (M+ - H): 749.3010, 실측치: m/z 749.3172.
실시예 7: (5- 아세트아미도 -4-아미노-6-(1,2,3- 하이드록시 )프로필-4,5,6- 트리하이드로피란 -2-일) 포스폰산 (1a).
Figure pat00035
0℃에서, 무수 CH2Cl2 (4 mL) 중의 디에틸 포스포네이트 7 (80 mg, 0.15 mmol) 용액에 브로모트리메틸실란 (0.12 mL, 0.87 mmol)을 처리하였다. 이를 0℃에서 24시간 교반한 후, MeOH (2 mL)를 첨가하고, 혼합물을 감압 농축하였다. 잔사를 무수 MeOH (5 mL)에 용해하고, 소듐 메톡사이드 (MeOH 중의 5.4 M 용액, 0.9 mL, 4.86 mmol)를 처리하였다. 실온에서 1시간 교반한 후, 혼합물을 Dowex 50WX8 (H+ form)로 여과한 다음, 감압 농축하였다. 잔사를 MeOH (5 mL)에 용해하고, 린들라 촉매 (20 mg)의 존재 하에 수소 첨가 반응을 (1 atm) 수행하였다. 3시간 후, 혼합물을 셀라이트 패드로 여과하고, MeOH로 세척하였다. 여과물을 농축하고, 잔사 고체를 Et2O (3 x 10 mL)로 헹구어, 포스포네이트 1a를 수득하였다.
실시예 8: (5- 아세트아미도 -4- 구아니디노 -6-(1,2,3- 하이드록시 )프로필-4,5,6-트리하이드로피란-2-일) 포스폰산 (1b).
Figure pat00036
무수 CH2Cl2 (4 mL) 중의 디에틸 포스포네이트 8 (130 mg, 0.17 mmol) 용액에, 브로모트리메틸실란 (0.13 mL, 0.94 mmol)을 0℃에서 처리하고, 반응 혼합물을 0℃에서 24시간 교반하였다. 여기에 MeOH (2 mL)를 왕성하게 교반하면서 첨가하였다. 30분 후, 용액을 감압 하에 증발시키고, 무수 MeOH (5 mL) 중의 용액으로서 잔류물에 메탄올(1 mL, 5.4 mmol) 중의 소듐 메톡사이드 5.4 M 용액을 처리하였다. 실온에서 1시간 교반한 후, 용액을 Dowex 50WX8 (H+ form)로 여과하고, 동결건조하였다. 남아있는 연노란색 고체를 Et2O (3 x 20 mL)로 헹궈, 포스포네이트 1b를 백색 고체로 수득하였다.
실시예 9: (5- 아세트아미도 -4-아미노-6-(1,2,3- 하이드록시 )프로필-4,5,6- 트리하이드로피란 -2-일) 포스폰산 모노에틸 에스테르 (1c).
Figure pat00037
아르곤 분위기 하에, PMe3 용액 (1.4 mL, THF 중의 1.4 M)을 무수 THF (5 mL) 중의 아지드 7 (148 mg, 0.28 mmol) 용액에 0℃에서 점적 첨가하였다. 이 혼합물을 19시간 동안 실온에서 교반하였다. 여기에 Et3N (0.5 mL)과 H2O (0.5 mL)를 첨가하고, 혼합물을 다시 30분간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축시키고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (MeOH/CH2Cl2, 6:94 -> 10:90), 아민 산물을 수득하였다 (112 mg, 79% 수율).
아민 산물 (110 mg, 0.22 mmol)을 EtOH (2 mL)에 용해하고, NaOEt (490 ㎕, EtOH 중의 2.68 M)를 점적 첨가하였다. 이 혼합물을 2일간 교반하고, TLC로 모니터링하였다. Dowex 50W 수지로 중화한 후, 여과물을 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다 (n-PrOH/H2O, 7:3). 적정 분획들을 모아, 감압 농축하였다. 잔사에 1 M HCl (2 mL)을 처리한 다음, 진공 농축하여, 포스포네이트 모노에스테르 1c (50 mg, 60% 수율)를 수득하였다. C12H23N2O8P: 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 5.48 (1 H, dd, J = 9.4, 7.6 Hz), 4.38-4.33 (2 H, m), 4.18-4.17 (1 H, m), 3.98-3.93 (2 H, m), 3.91-3.86 (2 H, m), 3.69-3.64 (2 H, m), 2.07 (3 H, s), 1.26 (3 H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ 174.7, 153.3 (d, 1 J C -P = 208.8 Hz), 104.3 (d, 2 J C -P = 22.5 Hz), 75.4 (d, 3 J C -P = 8.0 Hz), 69.6, 67.6, 62.9, 62.2 (d, 2 J C -P = 5.1 Hz), 49.9 (d, 3 J C -P = 13.4 Hz), 45.8, 22.1, 15.8 (d, 3 J C-P = 5.7 Hz); HRMS 계산치 C12H22N2O8P: 353.1108, 실측치: m/z 353.1198 [M - H]-.
실시예 10: (5- 아세트아미도 -4- 구아니디노 -6-(1,2,3- 하이드록시 )프로필-4,5,6-트리하이드로피란-2-일) 포스폰산 모노에틸 에스테르 (1d)
Figure pat00038
화합물 8 (52 mg, 0.07 mmol)을 EtOH (1 mL)에 용해하고, NaOEt (209 ㎕, EtOH 중의 2.68 M) 용액을 점적 첨가하였다. 이 혼합물을 4일간 교반하고, TLC로 모니터링하였다. Dowex 50W 수지로 중화한 후, 여과물을 감압 농축하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다 (n-PrOH/H2O, 8:2). 적정 분획들을 수집하고, 감압 농축하였다. 잔사에 1 M HCl (2 mL)을 처리한 후, 진공 농축하여 포스포네이트 모노에스테르 1d (9 mg, 30% 수율)를 수득하였다. C13H25N4O8P: 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 5.41 (1 H, dd, J = 9.4, 7.5 Hz), 4.42-4.40 (1 H, m), 4.35 (1 H, d, J = 10.6 Hz), 4.21 (1 H, t, J = 9.9 Hz), 3.97-3.93 (2 H, m), 3.90-3.85 (2 H, m), 3.67-3.62 (2 H, m), 2.01 (3 H, s), 1.25 (3 H, t, J = 7.1 Hz); 13C NMR (150 MHz, D2O) δ 174.3, 156.9, 151.3 (d, 1 J C -P = 211.2 Hz), 108.2 (d, 2 J C -P = 21.6 Hz), 75.8, (d, 3 J C -P = 8.6 Hz), 69.7, 67.9, 62.9, 62.1 (d, 2 J C -P = 4.8 Hz), 50.9 (d, 3 J C-P = 13.7 Hz), 47.8, 21.9, 15.8 (d, 3 J C-P = 5.7 Hz).
실시예 11: 자나미비르 바이오틴 접합체의 합성
도 3은 자나미비르-바이오틴 접합체 9의 합성 경로를 나타낸 것이다. 아지드가 달린 바이오틴 유도체 11은 트리에틸아민 및 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)의 존재 하에 바이오틴 (10)을 5-아지도-1-펜틸아민과 축합하여 제조하였다 (J. W. Lee, S. I. Jun, K. Kim, Tetrahedron Lett . 42, 2709 (2001)). 한편, 공지 공정 (M. Chandler et al., J. Chem. Soc ., Perkin Trans. 1: 1173 (1995); L. Ying, J. Gervay-Hague, ChemBi℃hem 6, 1857 (2005)) 에 따라 시알산으로부터 제조한 자나미비르 p-니트로페닐 카보네이트 12를 프로파르길아민과 커플링시켜, 알키닐 힌지를 포함하는 자나미비르 유도체 13를 수득하였다 (W.-H. Wen et al., J. Med . Chem . 52, 4903 (2009)). 이후, 아지드가 달린 바이오틴 유도체 11와 알키닐 자나미비르 유도체 13 사이에 1,3-이극성 부가 (click reaction; V. V. Rostovtsev et al., Angew . Chem ., Int . Ed. 41, 2596 (2002); B.-Y. Lee et al., Tetrahedron Lett . 47, 5105 (2006))를 CH2Cl2/H2O (1:1) 혼합 용매 중에서 수행하여, 전체 88% 수율로 원하는 자나미비르-바이오틴 접합체 9를 수득하였고, 이후 보호기를 제거하였다.
실시예 12: 바이오틴 유도체 11.
Figure pat00039
1,5-디브로모펜탄의 NaN3로의 치환 반응을 통해 제조한 PPh3 (5.0 g, 19.1 mmol)와 1,5-디아지도펜탄 (3.36 g, 21.8 mmol) 용액을 EtOAc/Et2O (v/v = 1:1, 35 mL) 중의 5% HCl (22 mL) 수용액과 함께 왕성하게 실온에서 24시간 교반하여, 5-아지도-1-펜틸아민 1 (1.60 g, 59%)을 수득하였다 (J. W. Lee, S. I. Jun, K. Kim, Tetrahedron Lett. 42, 2709 (2001).)
바이오틴 샘플 (10, 136 mg, 0.56 mmol)을 5-아지도-1-펜틸아민 (11, 86 mg, 0.69 mmol), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP, 360 mg, 0.69 mmol) 및 Et3N (0.116 mL, 0.84 mol)과 함께 DMF 용액 (5 mL) 중에서 실온에서 3시간 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축한 다음 H2O로 세척하였다. 잔사를 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (CH2Cl2/MeOH = 15:1), 아지드가 달린 바이오틴 유도체 11 (180 mg, 92%)을 수득하였다. C15H26N6O2S; 무색 고체, mp 121-122 ℃; [α]19D +87.6 (c 0.0275, MeOH); IR nmax (neat) 3297, 2924, 2100, 1698, 1647 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.34 (1 H, t, J = 5.2 Hz), 6.40 (1 H, s), 6.34 (1 H, s), 4.30-4.27, (1 H, m), 4.12-4.09 (1 H, m), 3.29 (2 H, t, J = 6.8 Hz), 3.10-3.05 (1 H, m), 3.03-2.98 (2 H, m), 2,80 (1 H, dd, J = 12.4, 5.2 Hz), 2.56 (1 H, d, J = 12.4 Hz), 2.03 (2 H, t, J = 7.2 Hz), 1.64-1.22 (12 H, m); 13C NMR (100 MHz, DMSO)δ171.5, 162.4, 61.0, 59.1, 55.4, 50.6, 39.8, 38.1, 35.2, 28.7, 28.3, 28.1, 28.0, 25.4, 23.6; ESI-HRMS 계산치 C15H27N6O2S: 355.1916, 실측치: m/z 355.1913 [M + H] + .
실시예 13: 자나미비르-바이오틴 접합체 9.
Figure pat00040
아지드가 달린 바이오틴 유도체 11 (100 mg, 0.28 mol) 용액과 알키닐-힌지의 자나미비르 유도체 13 (188 mg, 0.28 mmol)을 CuSO4.5H2O (10 mg, 0.04 mmol)와 소듐 아스코르베이트 (25 mg, 0.13 mmol)와 CH2Cl2/H2O (6 mL, v/v = 1:1) 중에서 실온에서 8시간 교반하였다. 수층을 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 조합하여, MgSO4 상에서 건조한 다음 여과하고, 회전식 증발기로 감압 하에 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (CH2Cl2/MeOH = 20:1 -> 10:1), 보호기를 포함하는 자나미비르-바이오틴 접합체를 수득하였다 (270 mg, 95%). C45H71N11O14S; TLC (CH2Cl2/MeOH = 9:1) R f = 0.29; 무색 고체, mp 157-158 ℃; [α]22 D +16.6 (c 0.5, CH2Cl2); IR nmax (neat) 2930, 1727, 1689, 1643, 1612 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.37 (1 H, s), 8.20 (1 H, d, J = 7.6 Hz), 8.04 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 7.95 (1 H, s), 7.76-7.70 (2 H, m), 6.40 (1 H, s), 6.33 (1 H, s), 5.81 (1 H, d, J = 2.0 Hz), 5.17 (1 H, d, J = 5.6 Hz), 4.79 (1 H, t, J = 7.6 Hz), 4.36 (1 H, d, J = 11.6 Hz), 4.30-4.21 (4 H, m), 4.15-4.10 (3 H, m), 4.04-3.97 (2 H, m), 3.86 (1 H, dd, J = 8.8, 5.6 Hz), 3.71 (3 H, s), 3.10-3.05 (1 H, m), 3.00-2.95 (2 H, m), 2.80 (1 H, dd, J = 12.4, 5.2 Hz), 2.56 (1 H, d, J = 12.4 Hz), 2.02 (2 H, t, J = 7.2 Hz), 1.80-1.77 (2 H, m), 1.74 (3 H, s), 1.64-1.19 (10 H, m), 1.45 (9 H, s), 1.39 (9 H, s), 1.25 (6 H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 173.0, 170.7, 163.7, 162.8, 161.8, 156.7, 155.6, 152.4, 145.4, 144.6, 122.9, 110.1, 108.6, 83.6, 79.6, 77.5, 77.2, 75.1, 69.9, 65.7, 61.9, 60.2, 55.8, 53.5, 52.5, 50.0, 49.5, 47.4, 40.6, 38.9, 37.0, 35.8, 29.6, 28.6, 28.3 (3 x), 28.1 (3 x), 26.5, 25.6, 25.5, 23.5, 23.2; ESI-HRMS 계산치 C45H72N11O14S: 1022.4981, 실측치: m/z 1022.4986 [M + H] + .
보호된 자나미비르-바이오틴 접합체 샘플 (34 mg, 0.033 mmol)에 MeOH (1 mL) 중의 NaOH (1 M, 1 mL) 수용액을 실온에서 15분간 처리하였다. 이 혼합물을 Dowex 50Wx8 (H+)로 중화시킨 후, 여과 및 감압 농축하였다. 잔사를 트리플루오로아세트산과 함께 CH2Cl2 (1 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (TFA, 1 mL)과 함께 실온에서 1.5시간 교반하였다. 이 혼합물을 감압 증발하고, H2O (1 mL)를 실온에서 첨가하였다. 10분간 교반한 후, 혼합물은 감압 농축한 다음, 세파덱스 G-10 컬럼에서의 크로마토그래피로 정제하여 (용리제: H2O 중의 0.1% TFA), 원하는 자나미비르-바이오틴 유도체 9 (24 mg, 93%)를 수득하였다. C31H49N11O10S; 무색 고체, mp 170-172 ℃; IR nmax (neat) 3355, 2937, 1675 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.92 (1 H, s), 5.96 (1 H, s), 4.98 (1 H, d, J = 8.4 Hz), 4.61-4.57 (2 H, m), 4.47-4.39 (5 H, m), 4.33-4.29 (1 H, m), 4.16 (1 H, t, J = 9.2 Hz), 4.06-4.04 (1 H, m), 3.65 (1 H, d, J = 9.6 Hz), 3.47 (1 H, dd, J = 6.4, 12.0 Hz), 3.31 (1 H, m), 3.20-3.10 (2 H, m), 2.98 (1 H, dd, J = 4.8, 13.2 Hz), 2.77 (1 H, d, J = 13.2 Hz), 2.22 (2 H, t, J = 7.2 Hz), 1.97 (3 H, s), 1.93-1.90 (2 H, m), 1.73-1.51 (6 H, m), 1.38-1.22 (4 H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 176.4, 173.8, 165.3, 164.9, 162.9 (CO2 of TFA, q, J = 35.0 Hz), 157.0, 156.5, 124.1, 116.5 (CF3 of TFA, q, J = 288.1 Hz), 109.1, 75.9, 70.2, 69.0, 62.6, 62.4, 60.5, 55.7, 51.3, 50.8, 47.4, 40.0, 39.2, 36.0, 35.8, 29.4, 29.3, 28.2, 28.1, 28.0, 25.5, 23.3, 22.2; ESI-HRMS 계산치 C31H50N11O10S: 768.3463, 실측치: m/z 768.3458 [M + H] + .
실시예 14: 화합물 14
Figure pat00041
카보네이트 12 (0.25 g, 0.33 mmol) 용액에, 피리딘 (2 mL) 중의 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 60 mg, 0.50 mmol)을 아민 H2N(CH2CH2O)3CH2CH2N3 (0.14 g, 0.66 mmol)과 함께 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 N2 분위기 하에 40시간 교반한 다음, HCl (1M 수용액 10 mL)과 EtOAc (50 mL)로 추출하였다. 유기층을 브린 (30 mL)과 NaHCO3 포화 수용액 (30 mL)으로 세척한 다음, MgSO4 상에서 건조하고, 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (실리카겔, EtOAc/헥산 = 1:1), 카바메이트 14 (0.2 g, 74%)를 수득하였다. C35H58N8O15; 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 11.41 (1 H, s), 8.45 (1 H, d, J = 9 Hz), 6.08 (1 H, d, J = 9 Hz), 5.91 (1 H, s), 5.45 (1 H, t, J = 6 Hz), 5.26 (1 H, t, J = 10 Hz), 5.22 (1 H, d, J = 6 Hz),4.41 (1 H, d, J = 9 Hz), 4.38 (1 H, q, J = 10, 6 Hz), 4.10-4.14 (2 H, m), 3.81 (3 H, s), 3.60-3.77 (12 H, m), 3.56-3.57 (1 H, m), 3.41 (2 H, t, J = 5 Hz), 3.37 (2 H, d, J = 5 Hz), 1.92 (3 H, s), 1.50 (18 H, s), 1.41 (3 H, s), 1.37 (3 H, s); 13C NMR (CDCl3) δ170.6, 163.0, 161.9, 156.9, 155.6, 152.7, 145.2, 132.1, 132.0, 131.9, 128.5, 128.4, 109.8, 108.9, 83.6, 79.6, 77.4, 74.5, 70.6, 70.5, 70.2, 70.0, 69.7, 66.0, 60.4, 52.4, 50.6, 48.7, 48.3, 41.0, 28.2, 28.0, 26.6, 25.4, 23.1; ESI-HRMS 계산치 C35H59N8O15: 831.4100, 실측치: m/z 831.4134 [M + H]+.
실시예 15: 자나미비르-FITC 접합체 15.
Figure pat00042
EtOH (1 mL) 중의 아지드 14 (80 mg, 0.096 mmol) 용액에 Pd(OH)2 (9 mg, 0.058 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 H2 분위기 하에 실온에서 1.5시간 교반한 다음, 셀라이트 패드로 여과하고, MeOH로 용출시켰다. 혼합물은 감압 농축하여, 아민 산물 (66 mg)을 수득하였다. C35H60N6O15; 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 11.36 (1 H, s). 8.40 (1 H, d, J = 8 Hz), 6.18 (1 H, d, J = 9 Hz), 6.04 (1 H, s), 5.87 (1 H, s), 5.17 - 5.22 (2 H, m), 4.32 - 4.39 (2 H, m), 3.98 - 4.10 (3 H, m), 3.75 (3 H, s), 3.55 - 3.72 (12 H, m), 3.31 (4 H, s), 2.89 (1 H, s), 2.73 (1 H, d, J = 7 Hz), 1.88 (3 H, s), 1.45 (18 H, s), 1.36 (3 H, s), 1.32 (3 H, s).
N2 분위기 하에, 플루오레센 티오시아네이트 (FITC, 37 mg, 0.095 mmol)를 무수 THF (1 mL) 중의 상기에서 제조한 아민 화합물 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 교반하고, 감압 농축한 다음, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (실리카겔, CH2Cl2/MeOH = 92:8), 접합체 산물 (50 mg, 52%)을 수득하였다. C56H71N7O20S; 1H NMR (MeOD, 600 MHz) δ 7.80 (1H, s), 7.56-7.59 (2 H, m), 7.48 (1 H, t, J = 8 Hz), 7.17 (1 H, d, J = 8 Hz), 7.09 (1 H, d, J = 8 Hz), 6.63 (2 H, s), 6.56 (2 H, d, J = 9 Hz), 6.48-6.51 (3 H, m), 5.86 (1 H, d, J = 8 Hz), 4.30 (1 H, t, J = 10 Hz), 4.12-4.23 (2 H, m), 4.07-4.10 (2 H, m), 3.96-4.06 (2 H, m), 3.93 (1 H, t, J = 8 Hz), 3.60-3.77 (15 H, m), 3.44-3.58 (4 H, m), 3.16-3.24 (2 H, m), 1.82 (3 H, s), 1.40-1.42 (18 H, m), 1.32 (3 H, s), 1.30 (3 H, s).
상기에서 제조한 FITC 접합체(47 mg, 0.039 mmol)의 MeOH (1.5 mL) 용액에 NaOH (1M 수용액, 1 mL)를 처리하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 교반한 다음, Dowex 50wx8 (H+)로 중화 후, 여과하였다. 여과물을 농축하고, 잔사에 CH2Cl2 (1 mL) 중의 트리플루오로아세트산 (TFA, 1 mL)을 처리하였다. 혼합물을 1시간 교반하고, 감압 농축한 다음, 세파덱스 G-10 컬럼에서 크로마토그래피로 정제하여 (용리제: 수중 0.1% TFA), 원하는 자나미비르-FITC 접합체 15 (10 mg, 56%)를 수득하였다. C38H41N7O14S; 1H NMR (MeOD, 600 MHz) δ 8.31 (1 H, s), 7.88 (1 H, d, J = 8 Hz), 7.48-7.57 (3 H, m), 7.30 (1 H, s), 7.36 (1 H, s), 7.13 (2 H, d, J = 9 Hz), 6.00 (1 H, s), 4.30-4.32 (1 H, m), 4.10-4.12 (2 H, m), 3.81-3.97 (2 H, m), 3.58-3.80 (14 H, m), 3.13-3.28 (3 H, m), 1.80 (3 H, s).
실시예 16: 자나미비르-FITC 접합체 17.
Figure pat00043
t-BuOH (1 mL) 및 H2O (1mL) 중의 알킨 13 (87 mg, 0.13 mmol) 및 10-아지도데칸아민 (30 mg, 0.16 mmol) 용액에, CuSO4·5H2O (4 mg, 0.016 mmol), 소듐 아스코르베이트 (18 mg, 0.091 mmol)와 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민 (TBTA, 8 mg, 0.04 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 교반한 다음, CH2Cl2 (30 mL)와 H2O (30 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조하고, 감압 농축한 다음, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (실리카겔, CH2Cl2/MeOH = 9:1), 화합물 16 (53 mg, 50%)을 수득하였다. C40H67N9O12; 노란색 고체, mp = 116 ℃ 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 11.38 (1 H, s), 8.43 (1 H, d, J = 8 Hz), 7.84 (1 H, br s), 5.88 (1 H, d, J = 14 Hz), 5.11-5.28 (2 H, m), 4.33-4.45 (6 H, m), 4.18 (1 H, s), 4.08 (1 H, s), 3.99 (1 H, s), 3.76 (3 H, s), 1.89 (3 H, s), 1.31 (18 H, s), 1.23 (22 H, s).
THF (1 mL) 및 MeOH (2 mL) 중의 상기에서 제조한 아민 (0.1 g, 0.115 mmol) 용액에, FITC (45 mg, 0.115 mmol)와 디이소프로필에틸아민 (0.038 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20시간 교반한 다음, 감압 농축하여, 붉은색 고체로서 접합체 화합물을 제조하였다. 상기에서 제조한 접합체 화합물의 MeOH (1 mL) 용액을 NaOH (1 mL, 1 M 수용액)와 함께 1시간 동안 실온에서 교반하고, Dowex 50wx8 (H+)로 중화한 다음 여과하였다. 농축 후, 잔사를 CH2Cl2 (1 mL)와 TFA (1 mL)에 용해하였다. 혼합물을 실온에서 30분간 교반하고, 감압 농축한 다음, 세파덱스 G-10 컬럼에서 크로마토그래피로 정제하여 (용리제: 0.1% TFA, H2O), 원하는 자나미비르-FITC 접합체 17 (50 mg, 43%)을 수득하였다. C47H56N10O13S; 노란색 고체, mp = 112 ℃; 1H NMR (d-MeOD, 600 MHz) δ 8.13 (1 H, d, J = 7 Hz), 7.63-7.67 (4 H, m), 7.55-7.58 (3 H, m), 6.89 (1 H, d, J = 7 Hz), 4.54 (1 H, br s), 4.31-4.38 (2 H, m), 4.17 (1 H, s), 4.00 (1 H, br s), 3.58-3.68 (12 H, m), 3.56 (2 H, t, J = 5 Hz), 3.42-3.47 (2 H, m), 2.00 (3 H, s), 1.70-1.72 (4H, m), 1.18-1.36 (12H, m); ESI-HRMS 계산치 C47H57N10O13S: 1001.3827; 실측치: m/z 1001.3768 [M + H]+.
실시예 17: 타미포스포르-바이오틴 접합체의 합성.
도 4는 타미포스포르-바이오틴 접합체 24의 합성 경로를 도시한 것이다. 요오드 화합물 18을 기존에 보고된 공정에 따라 제조하였다 [Shie, J.-J., et al. Angew. Chem . Int . Ed. 2008, 47, 5788]. 디[4-(트리메틸실릴)부트-3-인-1-일] 디알킬 포스페이트 17을, PCl3의 2당량의 4-(트리메틸실릴)부트-3-인-1-올로의 치환 반응에 의해 제조하였다. 18을 포스파이트 19로 인산화하는 과정은 Pd(PPh3)4의 촉매 반응에 의해 달성하여, 64% 수율로 포스포네이트 20을 수득하였다. Boc 기를 제거한 후, 아민 중간체에 N,N '-디-Boc-N''-트리플루오로메탄설포닐-구아니딘을 처리한 다음, KF로 트리메틸실릴기를 제거하여, 화합물 21을 수득하였다. 21을 5-아지도펜탄아민과 클릭 반응을 수행하고, KOH를 처리하여, 포스포네이트 모노에스테르 22를 수득하였다. 20과 바이오틴-OSu (23)를 커플링 반응시키고, 보호기 Boc를 제거한 후 원하는 타미포스포르-바이오틴 접합체 24를 수득하였다.
실시예 18: 화합물 20
Figure pat00044
무수 톨루엔 (2.1 mL) 중의 요오드 18 (100 mg, 0.21 mmol), 포스파이트 19 (85 mg, 0.26 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (100 mg, 0.64 mmol) 혼합물에, 10분간 질소를 버블링하여 산소를 제거한 다음, 질소 분위기 하에 둥근 바닥 플라스크 안에 든 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (10 mg, 8.6 mmol)에 첨가하였다. 수득되는 용액을 서서히 90℃로 가열하여, 12시간 동안 이 온도를 유지하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 피드로 여과한 다음, 여과물을 감압 증발하여, 노란색 폼 (110 mg)을 수득하였고, 이를 실리카겔 컬럼에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 [EtOAc/헥산 = 1:1 -> EtOAc], 포스포네이트 20 (92 mg, 64%)을 수득하였다. C32H57N4O9P; 노란색 오일; TLC (EtOAc/헥산, 1:1) R f = 0.29; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.59 (1 H, d, J = 22.0 Hz), 5.85 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 5.04 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 3.97-4.11 (5 H, m), 3.89 (1 H, br), 3.75-3.81 (1 H, m), 3.29-3.32 (1 H, m), 2.57-2.61 (1 H, m), 2.59 (4 H, t, J = 1.2 Hz), 2.20 (1 H, td, J = 10.0, 3.2 Hz), 2.00 (3 H, s), 1.43-1.51 (4 H, m), 1.39 (9 H, s), 0.83-0.88 (6 H, m), 0.07-0.21 (18 H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.2, 155.6, 142.1, 127.2, 101.2, 87.0, 82.2 (2 x), 79.7, 76.0, 63.7 (2 x), 54.8, 49.3, 49.1, 31.4, 28.6 (3 x), 26.4, 25.9, 23.7, 22.6, 22.5, 10.1, 9.9, 0.5 (6 x); 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 18.0.
실시예 19: 화합물 21
Figure pat00045
무수 CH2Cl2 (1.0 mL) 중의 포스포네이트 20 (92 mg, 0.14 mmol) 용액을 얼음조에서 0℃로 냉각시키고, 트리플루오로아세트산 (0.16 mL, 2.1 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 교반하고, 감압하에 농축시킨 후, 무수 CH2Cl2 (1.0 mL)에 용해하였다. N -N'-디-Boc-N''-트리플루오로메탄설포닐구아니딘 (67 mg, 0.21 mmol)과 트리에틸아민 (0.06 mL, 0.41 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 교반한 다음, 1 M HCl (5 mL)와 CH2Cl2 (5 mL x 3)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과 및 농축한 후, 실리카겔 컬럼 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 (EtOAc/헥산= 1:1), 구아니딘 유도체를 수득하였다.
MeOH/H2O (1.2 mL/1.2 mL, v/v) 중의 구아니딘 화합물 용액에 KF (71 mg, 1.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 교반한 다음, 감압 농축하였다. 혼합물을 CH2Cl2 (5 mL x 3)와 H2O (5 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과 및 농축한 다음, 실리카겔 컬럼에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (EtOAc/헥산 = 1:1), 화합물 21 (63 mg, 69%)을 수득하였다. C32H51N4O9P; 무색 오일; TLC (EtOAc/헥산, 1:1) R f = 0.24; [α]D 22 = -27.47 (c = 1, CH2Cl2); IR (film) nmax 3450, 2923, 2018, 1925, 1870, 1720, 1626, 1342, 1249, 1203; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.34 (1 H, s), 8.56 (1 H, d, J = 8.0 Hz), 6.66 (1 H, d, J = 22.4 Hz), 6.28 (1 H, d, J = 9.2 Hz), 4.34-4.40 (1 H, m), 4.06-4.16 (5 H, m), 3.96-4.04 (1 H, m), 3.29-3.33 (1 H, m), 2.65-2.71 (1 H, m), 2.59-2.61 (4 H, m), 2.26-2.40 (1 H, m), 2.03 (1 H, s), 2.00 (1 H, s), 1.90 (3 H, s), 1.00-1.78 (22 H, m), 0.83-0.90 (6 H, m); 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 18.0; HRMS 계산치 C32H52N4O9P: 667.3472, found : m/z 667.3450 [M + H] +.
실시예 20: 타미포스포르-바이오틴 접합체 24
Figure pat00046
t-BuOH/H2O (0.6 mL, v/v = 1:1) 중의 5-아지도-1-펜탄아민 아지드 (46 mg, 0.36 mmol) 및 화합물 19 (120 mg, 0.18 mmol) 용액에, 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 포스포러스 헥사플루오라이드를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 12시간 교반하고, 감압 농축한 다음, RP-18 역상 컬럼에서 MeOH/H2O (1:9 to 9:1)로 용출시켜 정제하였다. 트리아졸 화합물의 조산물을 1,4-디옥산 (1.0 mL)에 용해하고, 1 M KOH(aq) (1.0 mL)를 첨가하였다. 이 용액을 25℃에서 120시간 동안 교반하고(1H NMR로 모니터링함), Dowex 50Wx8을 첨가하여, 용액을 중화하였다. 이 혼합물을 여과 및 농축하였다. 조산물 (10 mg, 0.013 mmol)을 무수 DMF (0.1 mL)에 용해하고, 바이오틴-OSu (4.5 mg, 0.013 mmol)와 디이소프로필에틸아민 (4.2 mg, 0.026 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 교반하고, 감압 농축하였다. 잔사를 MeOH (0.5 mL)에 용해하고, 얼음조에서 0℃로 냉각한 후, 트리플루오로아세트산 (0.16 mL, 2.1 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 교반하고, 감압 농축한 다음 RP-18 역상 컬럼에서 MeOH/H2O (1:9 -> 9:1)로 용출시켜 정제하여, 표제 화합물 (40 mg, 전체 수율 30%)을 수득하였다. C33H57N10O7PS; 노란색 고체; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.89 (1 H,s), 6.39 (1 H, d, J = 19.6 Hz), 4.90 (1 H, t, J = 5.2 Hz), 4.38 (1 H, t, J = 7.2 Hz), 4.29-4.32 (1 H, m), 4.00 (2 H, m), 3.77-3.90 (2 H, m), 3.40-3.48 (2 H, m), 3.15-3.26 (2 H, m), 3.00 (1 H, t, J = 5.2 Hz), 2.91-2.95 (2 H, m), 2.71 (1 H, d, J = 12.8 Hz), 2.53-2.62 (2 H, m), 2.23 (2 H, t, J = 7.2 Hz), 1.90-2.03 (5 H, m), 1.29-1.79 (16 H, m), 0.86-0.97(6 H, m); 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 13.6; HRMS (-) 모드 계산치 C33H56N10O7PS: 768.3723, found : m/z 768.3723 [M - H] -.
실시예 21: 화합물 25
Figure pat00047
무수 DMF (5 mL) 중의 디(5-아지도펜틸)아민 (0.12 g, 0.49 mmol) 용액에, 바이오틴 (0.12 g, 0.41 mmol), PyBOP (0.25 g, 0.49 mmol) 및 Et3N (0.23 mL, 1.64 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 아르곤 하에 22시간 교반한 다음, 감압 농축하였다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (실리카겔, CH2Cl2/MeOH = 13:1), 바이오틴-디아지드 화합물 25 (0.15 g, 79%)를 수득하였다. C20H35N9O2S; 연노란색 오일; 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 4.48 (dd, J = 7, 5 Hz, 1 H), 4.29 (dd, J = 7, 5 Hz, 1 H), 3.28 (t, J = 7 Hz, 4 H), 3.25 (t, J = 7 Hz, 4 H), 3.20 (t, J = 7 Hz, 2 H), 2.89 (dd, J = 12, 5 Hz, 1 H), 2.71 (d, J = 12 Hz, 1 H), 2.29 (t, J = 7 Hz, 2H), 1.84 (br s, 3 H), 1.50-1.67 (m, 8 H), 1.43-1.44 (m, 2 H), 1.32-1.38 (m, 4 H); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ 172.4, 163.2, 61.8, 60.1, 55.3, 51.2, 47.0, 46.2, 45.6, 40.5, 32.5, 28.7, 28.6, 28.3, 27.3, 26.4, 25.1, 24.1. ESI-HRMS 계산치 C20H36N9O2S: 466.2707, 실측치: m/z 466.2703 [M + H]+.
실시예 22: 디자나미비르-바이오틴 접합체 26
Figure pat00048
t-BuOH (1 mL) 및 H2O (1 mL) 중의 바이오틴-디아지드 25 (36 mg, 0.075 mmol) 용액에 CuSO4·5H2O (4 mg, 0.015 mmol), 소듐 아스코르베이트 (10 mg, 0.045 mmol)와 TBTA (8 mg, 0.015 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 5분간 교반한 후, 알키닐-힌지의 자나미비르 유도체 13 (0.1 g, 0.15 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 교반한 다음, CH2Cl2 (20 mL)과 H2O (20 mL)로 추출하고, MgSO4 상에서 건조 및 감압 농축하였다. 잔가를 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (실리카겔, CH2Cl2/MeOH = 9.5:1), 커플링 산물을 수득하였다 (64 mg, 47%). 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 1.22 (s, 12 H), 1.30 (s, 36 H), 1.62 (s, 4 H), 1.79 (s, 2 H), 1.89 (s, 3 H), 1.94 (s, 3 H), 2.23 (t, J = 7 Hz, 2 H), 2.74 (d, J = 12 Hz, 1 H), 2.88 (d, J = 12 Hz, 1 H), 3.10-3.16 (m, 4 H), 3.23 (s, 2 H) 3.75 (s, 6 H), 3.98 (t, J = 7 Hz, 2 H), 4.06 (t, J = 8 Hz, 2 H), 4.15 (t, J = 10 Hz, 2 H), 4.28-4.43 (m, 14 H), 5.16 (s, 2 H), 5.23 (t, J = 6 Hz, 2 H), 5.35 (s, 1 H), 5.70 (s, 1 H), 5.86 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.04 (s, 1 H), 6.28 (s, 1 H), 6.54 (d, J = 9 Hz, 1 H), 6.63 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.79 (s, 2 H), 8.42 (d, J = 8 Hz, 2H), 11.38 (s, 2 H).
MeOH (1 mL) 중의 상기에서 제조한 커플링 산물 (60 mg, 0.033 mmol)을 NaOH (1 mL, 1 M 수용액)와 함께 실온에서 교반하고, Dowex 50Wx8 (H+)로 중화한 후, 여과하였다. 이를 농축한 다음, 잔가를 CH2Cl2 (1 mL)와 TFA (1 mL)에 용해하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 교반하여, 감압 농축한 다음, 세파덱스 G-10 컬럼에서 크로마토그래피로 정제하여 (용리제: 수중 0.1% TFA), 디자나미비르-바이오틴 접합체 26 (50 mg, 43%)를 수득하였다. C52H81N19O18S; 1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 1.29-1.33 (m, 6 H), 1.45 (br s, 2 H), 1.56-1.61 (m, 8 H), 1.75 (br s, 1 H), 1.84-1.87 (m, 1 H), 1.97-2.04 (m, 12 H), 2.36 (br s, 2 H), 2.73 (d, J = 12 Hz, 1 H), 2.94 (d, J = 12 Hz, 1 H), 3.51 (br s, 2 H), 3.65 (d, J = 10 Hz, 2 H), 3.69 (s, 2 H), 3.78 (s, 4 H), 4.00 (br s, 2 H), 4.19 (br s, 2 H), 4.37-4.45 (m, 11 H), 4.55 (br s, 4 H), 4.68 (d, J = 8 Hz, 4 H), 5.91 (s, 2 H), 7.57 (s, 1 H), 8.05 (s, 2 H); ESI-HRMS 계산치 C52H82N19O18S: 1292.5800, 실측치: m/z 1292.5916 [M + H]+.
실시예 23: 세포, 바이러스, 및 생물학적 시약들
MDCK 세포와 293T 세포 및 2종의 인플루엔자 바이러스: A/Aichi/2/68 (H3N2) 및 B/Lee/40은 각각 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 입수하였다. 인플루엔자 바이러스 A/WSN/1933 (H1N1), A/Udorn/307/1972 (H3N2), A/PR/8/1934 (H1N1), A/Taiwan/3446/2002 (H3N2), 인플루엔자 B/ Taiwan/7064/2004 분리주들은 신루 시 박사의 실험실 (Chang Gung University, Taiwan)에서 제공받았고, A/Vietnam/1194/2004 RG14 (H5N1), A/California/7/2009 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H1N1) 및 A/Brisbane/10/2007 (H3N2)은 지아츠롱찬 실험실 (Genomics Research Center, Academia Sinica, Taiwan)에서 제공받았다. 오셀타미비르 내성 WSN 돌연변이주는 MDCK 세포에서 OC (오셀타미비르 카르복실레이트) 농도를 서서히 증가시켜 6세대 계대 배양함으로써 선별하였다. 이 돌연변이 인플루엔자는 1 μM OCn 존재 하에 잘 생육하며, 서열분석에 의해 검증된 NA 유전자에 하나의 H274Y 돌연변이를 가지고 있다. 그외 대만 임상 H1N1 분리주들은 질병 통제 센터의 인플루엔자 수집 센터 (Taipei, Taiwan)에서 입수하였고, 표 1에 나타낸다. 또한, 7종의 S-OIV 분리주들은 질병 통제 센터 (Taipei, Taiwan)로부터 입수하였고, 이들은 #1 (A/Taiwan/T1941/2009), #2 (A/Taiwan/T1338/2009), #3 (A/Taiwan/T1339/2009), #4 (A/Taiwan/6662/2009) , #5 (A/Taiwan/6663/2009), #6 (A/Taiwan/7717/2009), 및 #7 (A/Taiwan/7855/2009)로서 코드 지정되었다. 인플루엔자 NP 항체와 플루오레세인-표지된 이차 항체는 각각 Chemicon Inc. (Billerica, MA, USA)와 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 항-WSN 토끼 항체는 항원으로서 불활성화된 WSN을 이용하여 실험실에서 제작하였다. 항-HA 항체 (Abcam, Cambridge, MA, USA)는 Interlab Ltd. (Taipei, Taiwan)에서 구입하였다.
실시예 24: 뉴라미니다제 발현 세포를 이용한 OC 감수성 분석법의 개발
자나미비르 및 ZB의 뉴라미니다제 저해 활성을 비교하였으며, ZB가 IC50 2 nM인 자나미비르 보다 활성이 약간 낮음에도 불구하고, 여전히 뉴라미니다제에 대해 매우 강력한 저해제인 것으로 확인되었으며, IC50은 7 nM이었다. 세포 표면 상에 발현되는 기능성 뉴라미니다제는 ZB 결합성에 대한 모델 시스템으로서, 그리고 OC 감수성 평가에서 OC 경쟁으로서 유용할 수 있었다. A/Hanoi/30408/2005 (H5N1)의 뉴라미니다제에 대한 cDNA를 발현 플라스미드에 클로닝하고, 이를 야생형 (274H) 뉴라미니다제의 발현을 위해 293T 세포에 형질전환하였다. 발현된 뉴라미니다제는 세포 표면에 주로 위치되어, 결합과 ZB를 이용한 표지가 가능하였다 (도 10). OC 내성 274Y 돌연변이 효소 발현을 위해 뉴라미니다제 cDNA에 돌연변이를 유발하였다. 야생형 및 돌연변이형 cDNA를 사용하여, 각각 274H 및 274Y 뉴라미니다제를 발현시키기 위한 안정적인 293T 세포를 제작하였다. 이들 2종의 세포를 여러가지 비율로 혼합한 혼합물을 ZB 또는 ZB + 과량의 OC와 인큐베이션한 다음, APC 접합된 스트렙타비딘을 첨가하여, 유세포 측정 분석에 의해 ZB와 결합하는 세포 집단을 확인하였다. 도 11은 ZB가 274H 및 274Y 발현 세포에 비슷한 수준으로 결합함을 보여준다. 과량의 OC 존재시, ZB의 결합이 274H 뉴라미니다제를 발현하는 세포에서 완전히 차단되는 반면, 274Y를 발현하는 세포에 대한 ZB의 결합성은 가시적으로 변하지 않았다 (도 12). 이러한 결과들은, ZB의 결합을 이용하여 OC와의 경쟁을 통해 OC-민감성 및 OC-내성 뉴라미니다제를 구분할 수 있다는 원리를 입증해준다.
실시예 25: 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포를 이용한 OC에 대한 감수성 확인
NA 발현 세포를 이용한 ZB의 결합에 대한 경쟁적인 OC의 저해 결과로 인해, 인플루엔자 바이러스의 OC 감수성을 평가하기 위한 ZB 및 OC의 농도를 정하게 되었다. OC 감수성 또는 OC 내성 WSN 바이러스로 감염된 MDCK 세포를 이용하여, 다양한 ZB 및 OC 농도에서의 OC 감수성 평가의 타당성을 조사하였다. 도 13A는 인플루엔자 바이러스로 감염된 MDCK 세포에 대한 ZB의 결합에 있어 OC의 경쟁성을 보여준다. 10 또는 50 nM의 ZB로 인플루엔자 감염 세포를 표지함으로써, 감염성 바이러스의 OC 감수성을, 표지 ZB 0.5 - 10배 농도에서 OC와의 경쟁적인 결합으로부터 추론할 수 있었다. 예를 들어, OC 감수성 및 OC 내성 WSN 변이체의 명확한 차이는, 표지성 ZB를 30 nM로 이용하고 경쟁성 OC를 150 nM로 이용하여, 감염된 세포에 처리함으로써, 관찰되었다 (도 13B).
MDCK 세포에 야생형 (274H) 또는 OC 내성 (274Y) WSN 바이러스를 감염시켰다. 감염 후 16-20시간째에, 감염된 세포에 30 nM ZB 또는 30 nM ZB + 150 nM OC를 처리하였다. 제조되는 세포에 스트렙타비딘-FITC를 가하고, 세척한 다음, 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 유세포 측정 실험을 위해, ZB 표지된 세포에 트립신 처리된(trypsinized) 항-NP 항체를 이용하여 추가로 표지한 다음, PE-스트렙타비딘 접합체 + DyLight-649 표지된 항-토끼 2차 항체를 처리하였고, 이들 항체 둘다 Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, USA)에서 구입하였다. 다시 세척한 후, 세포를 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)의 FACSCanto로 분석하였다. 더 많은 샘플을 분석하기 위해, 감염된 세포를 배양하기 위해 96웰의 블랙 클리어 바닥 마이크로플레이트를 이용하여 고성능 방법을 개발하였다. 감염 후 16-20시간째에, 세포를 30 nM ZB 또는 30 nM ZB + 150 nM OC로 표지하고, 세척한 다음 PE-스트렙타비딘을 처리하였다. 그런 후, 플레이트를 분자 디바이스의 Isocyte™ 레이저 스캐닝 플랫폼 (Mountain View, CA, USA)를 이용하여 488 nm에서 스캐닝하였다.
실시예 26: 고정된 인플루엔자 샘플을 이용한 OC 내성주의 함량 추정.
도 7B를 참조하여 기술된 바와 같이, RABC 분석은 마이크로웰에 고정된 바이러스를 이용하여 OC 감수성 결정에 적용가능하다. 또한 고정된 바이러스를 이용한 RABC 분석으로, OC 감수성 바이러스와 내성 바이러스 2가지로 구성된 혼성 집단에서 OC 내성 돌연변이 균주의 양을 추정할 수 있다. 274H 바이러스와 274Y WSN 바이러스가 여러가지 비율로 존재하는 웰 당 총 바이러스 함량 103, 104 및 105 PFU로 바이러스 샘플을 고정하여, OC 내성 함량의 추정치로서 OC 내성에 대한 ZB 결합을 측정하였다. 도 14는, 추정된 OC 내성 함량이 실험 274Y 바이러스 함량이 10% 이상인 경우에 충분히 일치됨을 보여준다. 내성 바이러스 함량이 10% 미만인 혼성 집단의 경우, 내성 바이러스의 함량의 과대 평가는, 아마 고역가 바이러스 샘플을 이용한 분석에서의 더 높은 백그라운드 결합으로 인해 관찰되었을 것이다.
Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) 사의 고결합성의 96-웰 마이크로플레이트 655061에 항-HA 항체 (Abcam)를 150 ng/웰로 밤새 코팅한 다음, PBS + 3% BSA로 블롯팅하였다. 인플루엔자 샘플에 30분간 30 nM ZB 또는 30 nM ZB + 150 nM OC를 처리한 다음, 항체로 코팅된 웰에 첨가하였다. 30분간 인큐베이션한 후, 마이크로웰을 PBS 중의 3% BSA로 세척한 다음, 30분간 알칼리 포스파타제-스트렙타비딘 접합체를 30분간 가하고, 다시 PBS 중의 BSA로 세척한 후, 제조사 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 설명서에 따라 발광 기질 Emerald-II™을 첨가하였다. RLU (상대적인 발광 단위)를 Perkin Elmer (Waltham, MA, USA) 사의 Envision을 이용하여 판독하였다. 상대적인 내성 %는, OC 존재시에 측정되는 ZB 결합에 대해 측정된 RLU를 OC 경쟁 부재시에 측정되는 ZB 결합에 대한 총 RLU로 나누어, 계산하였다.
실시예 27: 인플루엔자 뉴라미니다제 서열 결정
Taipei Pharma (Taipei, Taiwan)에서 구입한 Roche Diagnostics의 고 순수 바이러스 RNA 키트를 이용하여 인플루엔자 바이러스로부터 총 RNA를 추출하였다. 2종의 프라이머 5'-tggtcagcaagtgcwtgccatg, 및 5'-gacactggaccacaactgcct를 200 nM로 이용하여 PCR로 증폭시킨 cDNA를 합성하기 위해, 랜덤 헥사머와 Toyobo Life Science Department (Tokyo, Japan)의 MMLV RTase를 이용하여, RNA 샘플을 역전사하였다. DNA 산물을 정제하고, NA 서열 결정에 사용하였다.
실시예 28: 멤브레인 상에서의 인플루엔자 바이러스의 OC 감수성 신속 검출
Bio-Rad Inc. (Bio-Rad, CA, USA) 사의 Bio-Dot SF 위에 올린 PVDF 멤브레인을 메탄올로 젖시고, 석션에 의해 슬롯 당 1 ㎍의 항-HA 항체 (Abcam)를 부가하였다. 30 nM ZB 또는 30 nM ZB + 150 nM OC로 1시간 동안 미리 처리한 인플루엔자 바이러스 샘플을 석션에 의해 이웃한 슬롯에 도입하였다. 멤브레인을 PBS + 3% BSA로 블롯팅한 다음, 제조사의 지침에 따라 KPL (Gaithersburg, MD, USA) 사의 알칼리 포스파타제-스트렙타비딘 접합체와 인큐베이션하였다. PBS + 3% BSA로 다시 세척한 후, 알칼리 포스파타제 기질인 Amresco Inc. (Solon, OH, USA) 사의 Amresco E116 용액을 발색을 위해 첨가하였다. 일반적으로 육안 확인되는 발색을 2분안에 이루어지며, 사진으로 기록하였다.
실시예 29: 재조합 야생형 (274H) 뉴라미니다제 및 OC 내성 (274Y) 뉴라미니다제를 안정적으로 발현하는 293T 세포의 제작
인플루엔자 A/Hanoi/30408/2005 (H5N1)로부터 유추된 뉴라미니다제 유전자의 cDNA 서열 (GeneBank: AB239126.1)을 이용하여, Geneart (Regensburg, Germany) 사에서 본 유전자의 합성 버전을 제작한 다음, Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사의 pCDNA3.1의 BamH1 및 XhoI 제한효소 부위에 pCDNA3.1-NA로서 클로닝하였다. NA 유전자를 Agilent Technology (La Jolla, CA, USA) 사의 QuickChange® XL 부위 특이적인 돌연변이 유발 키트를 이용하여 변형시켜, 한쌍의 프라이머 5'-gCTggACgCTCCCAACTACCACTACgAggAgTg-3'와 5'-gTAgTTgggAgCgTCCAgCTCCACggAC-3'를 이용하여 H274Y의 OC 내성 NA 돌연변이를 제조하였다. 야생형 (274H) NA 유전자와 OC 내성 돌연변이 (274Y) NA 유전자 둘다를 서열분석에 의해 검증하였다. 이들 NA 유전자는 야생형 및 OC 내성 뉴라미니다제의 일시적인 NA 발현을 위해 사용하였다. 또한, 이는 Clontech (Mountain View, CA, USA) 사의 pRetro-IRES-GFP 벡터에 각각 pRetro-NA(274H)-IRES-GFP 및 pRetro-NA(274Y)-IRES-GFP로서 클로닝하였다. 이들 2종의 플라스미드와 pGagPol을 이용하여 제조한 재조합 레트로바이러스와 pVSVG를 이용하여 293T 세포에 전이시켰다. GFP를 95% 이상으로 발현하는 집단에 대해 형광-활성화된 세포 분류기에 의해 안정적인 세포주를 선별하고, OC 감수성 또는 OC 내성 뉴라미니다제의 합성을 검증하였다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물과 특허 출원들은 각 개별 간행물과 특허 출원이 구체적이고, 개별적으로 원용에 의해 포함되는 것으로 언급된 바와 같이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전술한 발명의 내용은 예시로서 명확한 이해를 돕기 위해 일부 상세하게 기술되어 있지만, 특정 변화와 수정이 첨부된 청구항의 사상 또는 범위로부터 이탈되지 않는 범위내에서 이루어질 수 있음은 발명의 교시 내용에 비추어 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다.

Claims (15)

  1. 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자 바이러스의 존재를 확인하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (a) 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 입자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 상기 샘플에, 오셀타미비르 카르복실레이트 (OC)의 존재 또는 부재하에, 인플루엔자 뉴라미니다제 인지 유닛 (R)을 포함하는 결합 분자와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 결합 분자와, 상기 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 입자의, 오셀타미비르의 존재시와 부재시의 결합 차이를 확인하는 단계를 포함하며,
    오셀타미비르 존재시의 상기 인지 유닛 (R)에 의한 결합 수준의 감소가, 오셀타미비르 민감성 인플루엔자 바이러스 대조군과의 접촉시의 결합 수준 감소에 비해 미비(lack)한 것은, 샘플내 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자 바이러스가 존재함을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 오셀타미비르에 대해 내성인 인플루엔자는 인플루엔자의 뉴라미니다제 (NA) 단백질의 274번 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 돌연변이가 본 발명에 기술된 인지 유닛 (R)에는 여전히 민감하지만 뉴라미니다제 저해제 약물에는 내성인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스를 함유하는 샘플은 점액, 타액, 호흡기 분비물, 인후 세척물, 코 세척물, 척수액, 가래, 뇨, 정자, 땀, 변, 혈장, 혈액, 기관지폐포 체액, 질액, 눈물 및 조직 생검으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스에 대한 상기 인지 유닛 (R)의 결합이 오셀타미비르 카르복실레이트에 의한 동시 결합에 의해 경쟁적으로 저해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인지 유닛 (R)이 자나미비르, 타미포스포르 구아니딘 모노에스테르 또는 포스파자나미비르 또는 이의 모노에스테르, 및 이들의 염, 에스테르 및 유도체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인지 유닛 (R)이 검출가능한 감지 유닛 (S)에 커플링되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인지 유닛 (R)이, 상기 결합 분자가 R-L-S 구조가 되도록, 링커 (L)을 통해 감지 유닛 (S)에 커플링되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커 (L)는 지방족 체인, 트리아졸, 수용성 링커 및 에틸렌 글리콜 링커로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 감지 유닛은 형광 표지, 금 표지, 효소 효지, 방사성 표지, 양자점(quantum dot) 표지, 바이오틴-아비딘계 표지 및 단백질 표지로부터 선택되는 검출가능한 모이어티인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 형광 표지는 플루오레세인, BODIPY, Alexa Fluor, Cy3, Cy5, 오레곤 그린(Oregon Green), 테트라메틸로다민, 로다민 Red, Texas Red, 피리딜옥사졸, 벤즈옥사디아졸 유도체, NBD 할라이드, 요오도아세트아미드, SBD; 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 요오도아세트아미드(iodoacetamide); 스틸벤(stilbene), 쿠마린(coumarin), 나프탈렌, 아지리딘, 다폭실(dapoxyl), 피렌(pyrene), 비만(bimanes), 잔텐(xanthene), 시아닌(cyanine), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 피코빌리단백질(phycobiliprotein), 스쿠아렌 염료(squarene dye), 에너지 전달 염료 조합물(energy transfer dye combination) 및 이들의 유도체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 R-L-S 분자는 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    BM 1: 자나미비르-(트리아졸 링커)-바이오틴
    Figure pat00049
    ,
    BM 2: 자나미비르-(트리아졸 링커)-플루오레세인
    Figure pat00050
    ,
    BM 3: 자나미비르-(에틸렌 글리콜 링커)-바이오틴
    Figure pat00051

    (x = 1 - 4),
    BM 4: 자나미비르-(에틸렌 글리콜 링커)-플루오레세인
    Figure pat00052
    ,
    BM 5: (타미포스포르 구아니딘)-(지방족 체인 링커)-바이오틴
    Figure pat00053

    (x = 1 - 4),
    BM 6: (타미포스포르 구아니딘)-(에틸렌 글리콜 링커)-플루오레세인
    Figure pat00054
    ,
    BM 7: 포스파자나미비르-(트리아졸 링커)-바이오틴
    Figure pat00055
    ,
    BM 8: 포스파자나미비르-(에틸렌 글리콜 링커)-플루오레세인
    Figure pat00056
    ,
    BM 9: (포스파자나미비르 모노에스테르)-(에틸렌 글리콜 링커)-바이오틴
    Figure pat00057

    (x = 1 - 4),
    BM 10: (포스파자나미비르 모노에스테르)-(에틸렌 글리콜 링커)-플루오레세인
    Figure pat00058

    (x = 1 - 4).
  13. 제1항에 있어서, 상기 R이 포스파자나미비르 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 오셀타미비르 카르복실레이트와 경쟁적으로 결합하는 화합물 R이 식 (I)의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pat00059

    상기 식 (I)에서,
    A는 PO(OR)(OR5)이되, R과 R5는 독립적으로 H, C1-C10 알킬, 아릴, 아랄킬 및 X로 이루어진 군으로부터 선택되고, X는 암모늄, 메틸 암모늄, 디메틸암모늄, 트리메틸암모늄, 테트라메틸암모늄, 에탄올-암모늄, 디사이클로헥실암모늄, 구아니디늄, 에틸렌디암모늄 양이온, 리튬 양이온, 소듐 양이온, 포타슘 양이온, 세슘 양이온, 베릴륨 양이온, 마그네슘 양이온, 칼슘 양이온 및 아연 양이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 반대이온이고;
    B는 NHR6, NH3 +Y-, R6N(C=NH)NH2 또는 R6N(C=NH2 +)NH2Y-이되, R6는 수소, C1-C10 알킬, 아릴 또는 아랄킬이고, Y-는 클로라이드, 브로마이드, 요오드화물, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 디포스페이트, 나이트레이트, 설페이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 하이드록시나프토에이트, 퓨마레이트, 말리에이트, 락테이트, 말레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 사이트레이트, 글루타메이트, 글루코네이트 및 스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온성 반대 이온이고;
    R1은 CH3 또는 CF3이고;
    R2는 H, C1-C10 알킬 또는 O=C-NHR7이되, R7은 바이오틴, 형광단 및 항염증제와 같은 기능성 모이어티가 결합된 링커이고; 및
    R3 및 R4는 독립적으로 수소, C1-C10 알킬 또는 O=C-R8이되, R8은 C1-C10 알킬, 아릴 또는 아랄킬이다.
  15. 제13항에 있어서, 오셀타미비르 카르복실레이트에 경쟁적으로 결합하는 화합물 R이 하기 화합물 또는 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pat00060
    ,
    Figure pat00061
    ,
    Figure pat00062
    ,
    Figure pat00063
    ,
    Figure pat00064
    ,
    Figure pat00065
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