WO2005064332A1 - 高活性型リゾホスファチジン酸およびそれを用いたスクリーニング方法 - Google Patents

高活性型リゾホスファチジン酸およびそれを用いたスクリーニング方法 Download PDF

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Akio Hayashi
Shinji Nakade
Hidehiro Suzuki
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a novel substance, a highly active lysophosphatidic acid (hereinafter sometimes abbreviated as a highly active LPA), and lysophosphatidic acid (hereinafter, referred to as “highly active LPA”).
  • LPA may be abbreviated.
  • LPA which is one of the lipid mediators, is collectively referred to as lysolin lipid together with sphingosine monophosphate.
  • LPA is a ligand for EDG (Endothelial differentiation gene)-a GPCR (receptor having a G protein-coupled seven transmembrane domain in the molecule) called 2, 4, and 7, and binds to these receptors
  • EDG Endothelial differentiation gene
  • GPCR receptor having a G protein-coupled seven transmembrane domain in the molecule
  • lipid mediators functioning as GPCR ligands are not detected in blood of healthy organisms, or are detected in trace amounts, such as PAF (platelet activating factor) and leukotriene.
  • PAF platelet activating factor
  • LPA has been confirmed to be present at extremely high concentrations of several / zg and V / mL in mammalian serum.
  • the ligand is in excess, it is expected that the LPA receptor is always in an active state.
  • a chemically synthesized LPA receptor agonist is administered to a living body while exerting force, such receptor exhibits an activating effect similar to a general ligand receptor response.
  • LPA receptors are normally inactivated, despite the excess of their ligand, LPA, for example.
  • LPA its ligand responsible for the activation of the LPA receptor
  • the ligand responsible for the activation of the LPA receptor is predicted to be another ligand other than LPA.
  • Patent Document 1 International Publication No. 99Z24569 pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication No. 96Z39436 pamphlet
  • An object of the present invention is to find a novel ligand other than LPA that is responsible for activating the LPA receptor in vivo, and to provide a high-sensitivity of a potent ligand and a substance that modulates their binding using the LPA receptor. To construct a screening system.
  • LPA is more active, undergoes a modification such as acidification in vivo, and has a higher activity as a novel ligand for the LPA receptor.
  • the present invention was completed by finding the fact that they function in combination and conducting further studies based on this finding.
  • the present invention provides:
  • the highly active LPA has the following general formula (1), (II) or ( ⁇ )
  • R 1 represents an oxidized, nitrated, nitrosated, nitrohydridylated, Z- or aminated aliphatic hydrocarbon group or an aliphatic hydrocarbon carbonyl group.
  • the asymmetric carbon may be in an R configuration or an S configuration, or may be mixed in any ratio.
  • the compound according to the above [1] which is a compound thereof, a salt thereof or a solvate thereof.
  • R ⁇ ⁇ is an aliphatic hydrocarbon group or an aliphatic hydrocarbon carbonyl group having at least one partial structure selected from the group Q below, wherein the group Q is
  • the asymmetric carbon may be in an R configuration or an S configuration, or may be mixed in any ratio.
  • an arrow represents a binding site
  • Y represents a carboxyl group or a methylene group
  • p and q each independently represent an integer of 0 or 1 to 7
  • E 1 and E 2 represent Each independently represents a C14 alkylene group, a C2-4 alkylene group or a bond
  • A represents a bond
  • n represents an integer of 1 to 6.
  • a plurality of EE 2 and A may be the same or different. Provided that at least one A in R 1 is
  • an arrow represents a binding site
  • Y represents a carboyl group or a methylene group
  • pi and ql each independently represent an integer of 1 to 7
  • T represents [0023]
  • the arrow represents a bonding site, provided that the asymmetric carbon is an R-configuration, an S-configuration force, or a mixture thereof at an arbitrary ratio.
  • R represents an integer of 1 to 5, and when r is 2 or more, a plurality of Ts may be the same or different. Where at least one T in R 1 is
  • the asymmetric carbon is assumed to have an R configuration, an S configuration, or a mixture thereof at an arbitrary ratio.
  • the LPA-related disease is a urinary disease, a central disease, an inflammatory disease, a circulatory disease, a cancer, a diabetes, an immune system disease, or a digestive system disease; 12] The method according to the above [11], wherein the urinary system disease is dysuria;
  • kits for screening a substance for preventing and / or treating a disease associated with LPA which comprises using a highly active LPA which may be labeled;
  • a urological disease comprising a compound, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof obtained using the method according to [1] and Z or the kit according to [13], Prophylactic and / or therapeutic agents for central, inflammatory, circulatory, cancer, diabetes, immune or digestive disorders;
  • a diagnostic agent for a disease associated with LPA comprising the antibody according to the above [23];
  • a method for producing a substance for preventing and / or treating LPA-related diseases which comprises a step of selecting a compound using the screening method according to [17].
  • General formula (1), ( ⁇ ) or (III) synthesized chemically or enzymatically
  • R 1 represents an oxidized, nitrated, nitrosated, nitrohydrylated or Z-amino group or an aminated aliphatic hydrocarbon group or an aliphatic hydrocarbon carbonyl group.
  • the asymmetric carbon may be in an R configuration or an S configuration, or may be mixed in any ratio.
  • the asymmetric carbon is an R-configuration, an S-configuration force, or a mixture thereof in an arbitrary ratio.
  • R 1 represents an oxidized, nitrated, nitrosated, nitrohydrylated or Z- or aminated aliphatic hydrocarbon group or an aliphatic hydrocarbon carbonyl group.
  • the asymmetric carbon may be in an R configuration or an S configuration, or may be mixed in any ratio.
  • a cell culture composition comprising a compound represented by the formula (I), a salt thereof or a solvate thereof;
  • composition according to the above [29] which is a cell differentiation controlling agent
  • R 1 represents an oxidized, nitrated, nitrosated, nitrohydrylated, Z- or aminated aliphatic hydrocarbon group or an aliphatic hydrocarbon carbonyl group.
  • the asymmetric carbon may be in an R configuration or an S configuration, or may be mixed in any ratio.
  • LPA is a compound represented by the general formula (I), (II) or (III), wherein R 1 is an "unsubstituted aliphatic hydrocarbon group” or " It means a “substituted aliphatic hydrocarbon carbonyl group”, which may be either naturally occurring or non-naturally occurring.
  • R 1 is an "unsubstituted aliphatic hydrocarbon group” or " It means a “substituted aliphatic hydrocarbon carbonyl group”, which may be either naturally occurring or non-naturally occurring.
  • the “unsubstituted aliphatic hydrocarbon group” may be a linear group composed of only carbon atoms and hydrogen atoms, and examples thereof include an alkyl group, an alkenyl group, and an alkenyl group. It includes a rukinyl group and the like.
  • the “unsubstituted aliphatic hydrocarbon group” may contain an alicyclic hydrocarbon group-like structure in the group.
  • "Alicyclic hydrocarbon group-like structure” means a divalent group formed by removing any two hydrogen atoms from an alicyclic hydrocarbon such as a lower cycloalkane or a lower cycloalkene.
  • Examples of the “lower cycloalkane” include cycloalkanes having 3 to 8 carbon atoms such as cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane and cyclohexane.
  • the “lower cycloalkene” includes, for example, carbon atoms such as cyclopropene, 1-cyclopentene, 2-cyclopentene, 3-cyclopentene, 1-cyclohexene, 2-cyclohexene, 3-cyclohexene and 3-cycloheptene. And 3 to 8 cycloalkenes.
  • Examples of the aliphatic hydrocarbon group having an alicyclic hydrocarbon group-like structure in the group include a 7- (2-xylcyclopropyl) heptyl group and the like.
  • alkyl group examples include, for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, noel, decyl, pendecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecinole, And linear C1-30 alkyl groups such as icosinole, henicosinole, docosinole, tricosinole, tetracosinole, pentacosinole, hexacosyl, heptacosyl, octacosyl, nonacosyl and triacontyl.
  • alkenyl group examples include, for example, etul, probenole, buteninole, penteninole, hexeninole, hepteninole, octeninole, noneninole, asenil, pendezell, dodecerl, tridisele , Tetradecer, pentadecer, hexadecer, heptadecer, octadecer, nonadecer, icoser, hecosininole, docoseninole, trichosininole, tetracosininole, pentacosinenole, hexacocinocenole, hexacosinocane And straight-chain C2-30 alkenyl groups such as octacosel, nonacosel and triacontyl groups.
  • alkyl group examples include, for example, ethur, propinolone, butyninole, pentinole, hexininole, heptinole, otachininole, nonininole, desil, pendecyl, dodecyl, tridecyl.
  • the "unsubstituted aliphatic hydrocarbon carbonyl group” means a monovalent group in which a carbonyl group is bonded to the "unsubstituted aliphatic hydrocarbon group”.
  • LPA has a carbon number of the carbon chain constituting the R 1, with the number of double bonds in R 1, for example, carbon in the carbon chain constituting the R 1 If the number is 18 and the number of double bonds in R 1 is 1, it may be written as 18: 1—LPA.
  • preferred LPAs include naturally occurring ones.
  • LPA is preferably used according to the above-mentioned notation, for example, 16: 1-LPA, 18: 1-LPA, 18: 2-LPA, 18: 3—LPA, 20: 1—LPA, 20: 2—LPA, 20: 3—LPA, 20: 4—LPA, 20: 5—LPA, 22: 1—LPA, 22: 2—LPA, 22: 3— LPA, 22: 4-LPA, 22: 5-LPA, 22: 6-LPA and the like.
  • LPAs are LPAs existing in living organisms of mammals, especially humans.
  • the highly active LPA is a substance having a structure different from that of the LPA, binding to the LPA receptor, and having an activity substantially equal to or higher than that of the LPA.
  • the structure is not limited as long as the structure shows.
  • a substance exhibiting substantially the same or higher activity than LPA includes, for example, (1) a receptor binding activity, or (2) a signal signal transduction action, etc., which are known to those of LPA receptor.
  • a material that is about 1 to about 10 times, preferably about 1 to about 100 times, more preferably about 1 to about 1000 times.
  • a highly active LPA is not required to exhibit an activity exceeding LPA in all activity measurement systems. If at least one of the test systems capable of detecting the activity of LPA exhibits an activity exceeding LPA in at least one system, #2.
  • the activity of the receptor-binding activity can be measured according to known methods. For example, it can be measured according to the screening method described later, the method described in the Examples, and the like. Monkey
  • R 1 is oxidized, nitrated, nitrosated, nitrohydrylated and / or Or an aminated aliphatic hydrocarbon group or an aliphatic hydrocarbon carbonyl group.
  • examples of the aliphatic hydrocarbon group include those exemplified as the “unsubstituted aliphatic hydrocarbon group”.
  • the term "aliphatic hydrocarbon carbonyl group” means, for example, the same as the above-mentioned "unsubstituted aliphatic hydrocarbon carbonyl group”.
  • Oxidation means that at least one oxygen atom is introduced into the target molecule (here, an aliphatic hydrocarbon group or an aliphatic hydrocarbon carbonyl group).
  • O—O— oxygen-containing groups
  • oxygen-containing groups such as formyl groups
  • amino acid to be added is not particularly limited, and may be a peptide.
  • an amino acid normally present in a living body for example, an ⁇ -amino acid or the like
  • a peptide thereof, or the like is used.
  • the number of amino acids constituting the peptide is not particularly limited.
  • two or more Ten more preferably two to five, particularly preferably two (ie, dipeptide) to three (ie, tripeptide) and the like.
  • Suitable amino acids to be “aminated” include, for example, cysteine, serine, glutathione, glycylcysteine, 5-glutamylcysteine and the like.
  • oxidation the carbon chain of the aliphatic hydrocarbon group or the aliphatic hydrocarbon carboxyl group accompanies the “nitration”, “nitrosation”, “nitrohydrylation” and “amination”. It doesn't matter if is cut off.
  • R 1 is
  • an aliphatic hydrocarbon group having one or more partial structures selected from the group consisting of an aliphatic hydrocarbon group and an aliphatic hydrocarbon carbonyl group.
  • an asymmetric carbon may be represented by using the symbol "*" as described above, but even without the symbol, a person skilled in the art can determine that an asymmetric carbon exists.
  • the asymmetric carbon may have an R configuration, an S configuration, or a mixture thereof in an arbitrary ratio.
  • more preferred high-activity LPAs include, for example, the aforementioned general formula (I),
  • oxidized 22: 6-LPA, 20: 4-LPA, 18: 1-LPA, 18: 2-LPA, 18: 3-LPA, 16: 1-LPA are preferred.
  • 20: 4-LPA, 18: 1-LPA, 18: 2-LPA, 18: 3-LPA and the like are more preferred.
  • R 1 has 18 carbon atoms
  • R 1 is -CHO or
  • R 1 is [0062] [Formula 21]
  • R 1 is -CH 0, -CH 0, -CH 0, -CH 0, or C
  • R 1 is [0065]
  • examples of the C14 alkylene group include a methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene group and isomer groups thereof.
  • examples of the C2-4 alkylene group include eturene, probelene, butylene group, and isomer groups thereof.
  • preferred, highly active LPA is also defined by the length of the carbon chain of R 1 it can.
  • highly active LPA or carbon atoms in the main chain of R 1 is 6 to 26 Kodea shall like are also preferable.
  • the carbon number of the main chain also includes the carbon carbon in the aliphatic hydrocarbon carboxy group. That is, oxidized, nitrated, nitrosated, nitrohydrylated and Z or aminated C6-26alkyl, C6-26alkyl, C6-26alkyl, C6-25alkylcarbo- And a C6-25 alkylcarbyl group and a C6-25 alkylcarbyl group are preferred. In particular, these oxidized groups are preferred.
  • R 1 is more preferably, for example, one having 10 to 20 carbon atoms in the main chain, and particularly preferably one having 16 to 20 carbon atoms in the main chain. .
  • the high-activity LPA can be obtained by the following method.
  • it can be obtained by any method of (1) chemically synthesizing; (2) purifying a biological sample; (3) synthesizing enzymatically;
  • a suitable oxidizing agent for example, metaclonal solvent
  • any solvent containing LPA for example, water or an organic solvent (for example, chloroform, methanol, acetonitrile, etc.)).
  • Perbenzoic acid, etc. is added to any solvent containing LPA (for example, water or an organic solvent (for example, chloroform, methanol, acetonitrile, etc.)).
  • a suitable oxidizing agent for example, metaclonal solvent
  • any solvent containing LPA for example, water or an organic solvent (for example, chloroform, methanol, acetonitrile, etc.)
  • Perbenzoic acid, etc. perbenzoic acid, etc.
  • the reaction between LPA and oxygen may be brought into contact with oxygen gas or air oxidation. Further, it may be reacted with dissolved oxygen in an arbitrary solvent.
  • LPA is adsorbed to a suitable container (eg, a glass container such as an eggplant flask that can secure a certain surface area) and stored at an appropriate temperature (eg, room temperature) under a dry air stream, or Any solvent containing LPA (for example, water or an organic solvent (for example, chloroform, methanol, acetonitrile, etc.), etc.) can be used for any period (for example, 24 hours). (Time to several days) at an arbitrary temperature (preferably room temperature or the like).
  • a suitable container eg, a glass container such as an eggplant flask that can secure a certain surface area
  • an appropriate temperature eg, room temperature
  • Any solvent containing LPA for example, water or an organic solvent (for example, chloroform, methanol, acetonitrile, etc.), etc.) can be used for any period (for example, 24 hours).
  • a suitable container eg, a glass container such as an eggplant flask that can secure a certain surface area
  • Purification of the biological sample strength is performed by subjecting a fraction obtained by a method such as gel filtration to a purification method such as silica gel column chromatography or reverse phase column chromatography.
  • a purification method such as silica gel column chromatography or reverse phase column chromatography.
  • the desired highly active LPA is obtained as a mixture by these methods, it can be isolated by a known purification method.
  • isolation can be performed by silica gel chromatography using silica gel (eg, Merck7734 or the like) as a carrier and an appropriate solvent such as chloroform, methanol and a mixed solvent which also has hydrodynamic power.
  • the biological sample for example, blood or the like can be suitably used.
  • myelin peroxidase for example, myelin peroxidase, oxidase, 12 / 15-lipoxygenase, P450 metabolizing enzyme and the like can be used.
  • LPA used as a raw material is obtained, for example, by enzymatically treating lysophosphatidylcholine with an enzyme, for example, phospholipase D or the like, as described in Reference Examples below, or Further, it can be obtained by subjecting it to the known purification method described above.
  • an enzyme for example, phospholipase D or the like, as described in Reference Examples below, or Further, it can be obtained by subjecting it to the known purification method described above.
  • the LPA receptor protein may be a receptor protein capable of binding to the above-mentioned LPA and capable of transmitting a signal into a cell expressing a strong receptor protein. It can be used without particular limitation.
  • a receptor protein for example, known LPA receptor proteins such as EDG-2, EDG-4, EDG-7 and GPR23 are preferably used, but these proteins are substantially used. Proteins having the same activity or having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence of these proteins can also be used.
  • EDG-2, EDG-4, and EDG-7 are sometimes referred to as LPA1, LPA2, and LPA3, respectively.
  • proteins having substantially the same activity includes, for example, a protein having a similar property of a ligand-binding activity, a signal transduction action and the like. Therefore, proteins having substantially the same activity include those having the ligand binding activity and signal transduction activity, etc., having the above-mentioned known receptor proteins, ie, EDG-2, EDG-4, EDG- 7 and GPR23 (e.g., about 0. (01 to about 100 times, preferably about 0.5 to about 20 times, more preferably about 0.5 to about 2 times). The quantitative factors are different.
  • the activity such as the ligand binding activity and the signal transduction activity can be measured according to a force that can be performed according to a known method, for example, according to a screening method described later.
  • protein having substantially the same amino acid sequence includes, for example, about 50% of the amino acid sequence of the known receptor protein, ie, the protein such as EDG-2, EDG-4, EDG-7 and GPR23. % Or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, still more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. And the like.
  • the above-mentioned LPA receptor protein is not limited to its origin.
  • all cells of human mammals eg, guinea pig, rat, mouse, egret, pig, sheep, wedge, monkey, etc.
  • spleen cells nerve cells, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangium
  • Cells Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (e.g., macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils Basophils, eosinophils, monocytes, etc.), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or these Progenitor cells,
  • LPA receptor protein of the present invention in addition to the above-mentioned LPA receptor protein, some amino acids are modified, such as addition, deletion and Z or substitution, to their amino acid sequences. Or a receptor protein containing the amino acid sequence.
  • the LPA receptor protein in the present invention can be substituted, if desired, with an arbitrary functional group (for example, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, etc.) in the molecule to such an extent that the function as a receptor is not lost. It may be substituted by a group, or a sugar chain may be attached.
  • the partial peptide of the receptor protein includes a partial peptide of the receptor protein or an amino acid substantially identical to the partial peptide.
  • the peptide may be any peptide having a sequence, but is preferably a site of the receptor protein molecule that is exposed outside the cell membrane and has substantially the same ligand binding property. Those having activity or the like are used.
  • the above-mentioned known receptor proteins, that is, partial peptides such as EDG-2, EDG-4, EDG-7 and GPR23 include, for example, an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis.
  • the number of amino acids in the partial peptide used in the present invention is preferably at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more in the amino acid sequence constituting the receptor protein.
  • the “substantially identical amino acid sequence” is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, even more preferably the amino acid sequence of the partial peptide of the receptor protein.
  • substantially the same ligand binding activity means the same nature of the ligand binding activity, and can be measured in the same manner as the above-mentioned receptor protein ligand binding activity.
  • the partial peptide in the present invention contains, in addition to the partial peptide described above, an amino acid sequence in which some amino acids have been modified, such as addition, deletion and / or substitution, with respect to their amino acid sequences. Partial peptide or the like.
  • the partial peptide in the present invention may have any desired position so that any functional group (eg, carboxyl group, amino group, hydroxyl group, thiol group, etc.) in the molecule does not lose ligand binding activity, if desired. It may be substituted by a substituent or a sugar chain may be bonded.
  • examples of the salt of the receptor protein or its partial peptide include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and particularly a physiologically acceptable acid.
  • Addition salts and the like are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid,
  • salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like are used.
  • the above-mentioned LPA receptor protein, its partial peptide or its salt can be obtained by a known method.
  • the LPA receptor protein or a salt thereof according to the present invention can be produced by the above-described method for purifying a receptor protein of known human or mammalian cell or tissue strength. Alternatively, it can be produced by culturing a transformant containing a DNA encoding a strong receptor protein. Furthermore, it can also be produced by a known protein synthesis method or a method analogous thereto.
  • Methods for obtaining the LPA receptor protein include, for example, WO97Z00952 pamphlet, WO96Z39436 pamphlet, JP-A-10-210993, JP-A-11-18788, WO99Z29887, WO It is described in detail in pamphlet No. 99/24569 and the like.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, or the like. Purification and isolation can be achieved by combining chromatography.
  • the partial peptide or a salt thereof according to the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, a solid phase synthesis method, a liquid phase synthesis method, or the like can be used.
  • a labeling substance used for labeling high-activity LPA for example, a radioisotope
  • an enzyme for example, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like
  • a radioactive isotope for example, 125 ⁇ , 131 ⁇ , 3 ⁇ 4 , 14 C, 32 P or the like
  • the enzyme for example, ⁇ -galactosidase, j8-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance include fluorescamine, Fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • the highly active LPA of the present invention is safe and has low toxicity, it can be used as a screening tool!
  • the screening method of the present invention is characterized by using (1) a highly active LPA which may be labeled, and (2) an LPA receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • a substance having a specific function is found using these substances, for example, a substance for preventing and / or treating a disease associated with LPA, the substance is included in the present invention.
  • the screening method of the present invention comprises, for example, (a) contacting (a) a highly active LPA which may be labeled with (b) an LPA receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, (2) A comparison is made between (a) highly active LPA, which may be labeled, and (b) an LPA receptor protein, its partial peptide or a salt thereof, and (c) a test compound.
  • the LPA receptor protein, its partial peptide or its salt used in the screening method of the present invention impairs the ligand binding activity and may be in any state. For example, it may be in an isolated state or in a state of being expressed in a cell.
  • a vigorous cell force may be in the state of the prepared membrane fraction, and further, a living body (for example, a mammal) may be used.
  • the method for measuring the binding between the LPA receptor protein, its partial peptide or its salt and the highly active LPA ligand is a powerful LPA receptor protein, its partial peptide or its salt.
  • a binding assay can be used.
  • a phenomenon that occur in the cell e.g., increase or decrease in intracellular cyclic AMP (cAMP) or calcium ion concentration, increase or decrease in specific protein or mRNA encoding it, or Secretion of specific proteins to the outside
  • cAMP intracellular cyclic AMP
  • calcium ion concentration increase or decrease in specific protein or mRNA encoding it, or Secretion of specific proteins to the outside
  • a mammal eg, mouse, rat, dog, etc.
  • a phenomenon occurring in such a living body can be used as an index.
  • the biopower can also be evaluated using a specific tissue extracted. For example, a Magnus test using the trachea or other smooth muscle or the intestinal tract may be used.
  • preferable screening methods include, for example, the following methods [I] to [IV].
  • a screening method comprising: [II] (l) (a) the case where a labeled high-activity type LPA is brought into contact with (b) the LPA receptor protein, its partial peptide or a salt thereof; When the active LPA is brought into contact with (b) an LPA receptor protein, a partial peptide or a salt thereof, and (c) a test compound, the labeled LPA receptor protein of the highly active LPA, A screening method comprising measuring and comparing the amount of binding to a partial peptide or a salt thereof.
  • [IV] (1) When (a) labeled high-activity type LPA is brought into contact with (b) the membrane fraction of cells containing LPA receptor protein, and (2) (a) labeled Highly active LPA, (b) membrane fraction of cells containing LPA receptor protein, and (c) the membrane of labeled high active LPA cells when contacted with a test compound
  • a screening method comprising measuring and comparing the amount of binding to a fraction.
  • the measurement of the amount of binding that is, the activity of increasing the intracellular calcium ion concentration of bound Atsushi cells, can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
  • cells containing LPA receptor protein or cells containing LPA receptor protein may be used.
  • the cells may be fixed with dartalaldehyde, formalin or the like before use.
  • the fixing method can be performed according to a known method.
  • a cell containing the LPA receptor protein a host cell expressing the LPA receptor protein or the like is suitably used.
  • the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • normal cells can be used as long as they are applicable to the LPA receptor protein expression level screening system.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a known method.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Waring Blender / Polytron (manufactured by Kinematica), crushing with ultrasonic waves, or pressing cells with a French press or the like. Squirting from the fine zuzzles.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is preferably used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (for example, about 500 rpm to about 3000 rpm) for a short time (for example, about 1 minute to about 10 minutes), and the supernatant is further processed at a higher speed (for example, about 15000 rpm to about 30,000 rpm). Centrifugation for about 30 minutes to about 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed LPA receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the LPA receptor protein in the cells or membrane fraction containing the LPA receptor protein is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. It is.
  • the compounds obtained by the screening method of the present invention and exhibiting LPA receptor binding activity include agonists and antagonists of LPA receptor.
  • LPA receptor agonists or antagonists from a group of compounds exhibiting LPA receptor binding activity, for example, (1) confirm the presence or absence of a signal signaling effect of the compound alone; (2) If LPA or highly active LPA is added in the presence of the compound, the presence or absence of a signal signal transduction effect is confirmed;
  • the presence / absence of a signal signal transduction action refers to, for example, a phenomenon occurring in a cell or a phenomenon occurring in a tissue or a living body, as described above. It can be confirmed by setting a target.
  • the kit for labeling ! which is characterized by using a highly active LPA, which is a kit for the prevention of diseases associated with LPA and the screening of Z or therapeutic substances, comprises: However, it is composed mainly of highly active LPA and (b) cells containing LPA receptor protein or its membrane fraction.
  • the screening kit of the present invention include, for example, the following.
  • Measurement buffer and washing buffer Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) plus 0.05% serum albumin (manufactured by Sigma) and the like. The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 ⁇ m filter and stored at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • LPA receptor protein preparation Chinese Hamster Ovary (CHO) cells expressing the LPA receptor protein were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells. , 37 ° C, 5% CO, 95% air
  • (C) labeled high-activity LPA a commercially available solution containing high-activity LPA labeled with [], [ 12 ], [ 14 C], [ 35 S] or the like. Store at 4 ° C or 20 ° C, and dilute to 1 ⁇ with buffer solution for use before use.
  • the labeled high-activity LPA bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 mL of liquid scintillator A (Wako Pure Chemical Industries).
  • PMB represents the Percent Maximum Binding
  • B represents the value obtained when the sample is dried
  • NSB represents Non-specific Binding (non-specific binding amount)
  • B0 represents the maximum binding amount.
  • the antibody against highly active LPA may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the highly active LPA! / ⁇ .
  • the antibody against the highly active LPA of the present invention comprises (1) a highly active LPA of the present invention, (2) a complex of the highly active LPA and a carrier protein, or (3) a highly active amino-carboxyl group. It can be produced according to a known method for producing an antibody or antiserum using a complex of a derivative having a type LPA side chain and a carrier protein as an antigen. An example of a specific method is shown below.
  • the highly active LPA of the present invention is administered to a mammal alone or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant—incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • mammals to be used for example, power mice and rats including monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and the like are preferably used.
  • the administration site is not particularly limited, and may be any site capable of producing an antibody.
  • Monoclonal antibody-producing cells were prepared by selecting a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual whose antibody titer was also recognized as a mouse, and sampling the spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained in the above with myeloma cells.
  • the antibody titer in antisera can be measured, for example, by reacting the labeled high-activity LPA with antiserum and then measuring the activity of a labeled substance bound to the antibody. You.
  • the fusion operation with myeloma cells can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • PEG polyethylene glycol
  • Sendai virus is preferred.
  • the myeloma cell is preferably a force P3U1, such as NS-1, P3U1, SP2Z0, or the like.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably, PEGIOOO to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be performed efficiently by incubating the mixture and incubating at about 20 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 ° C for about 1 to 10 minutes.
  • an antigen that is, a solid phase (for example, a microplate or the like) on which a highly active LPA is adsorbed directly or together with a carrier can be used.
  • a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, and adding a receptor protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, etc. And a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase.
  • Monoclonal antibodies can be selected according to a known method or a method analogous thereto. Usually, an animal cell culture medium or the like to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added can be used. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI-1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries) containing 1 to 10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be determined in the same manner as in the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of the monoclonal antibody can be performed according to the immunoglobulin separation and purification method in the same manner as ordinary separation and purification of polyclonal antibodies.
  • Such purification methods include: For example, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using an ion exchanger (for example, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase, or A specific purification method in which only an antibody is collected with an active adsorbent such as mouth tin A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody is used.
  • an active adsorbent such as mouth tin A or protein G
  • the polyclonal antibody can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • a complex of a highly active LPA, which is an immunizing antigen, and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting a substance containing an antibody against type LPA and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the efficiency of the antibody against the hapten immunized by crosslinking with the carrier.
  • Any material can be crosslinked at any ratio as long as it can be prepared.
  • serum albumin, thyroglobulin, keyhole 'Limpet' hemocyanin, etc. are added in a weight ratio.
  • a method of coupling the hapten 1 at a ratio of about 0.1 to about 20, preferably about 1 to about 5 is used.
  • a dartartaldehyde carbodiimide capable of using various condensing agents, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group.
  • the condensation product is administered alone or together with a carrier or diluent to a mammal.
  • the administration site is not particularly limited as long as it is a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually
  • the polyclonal antibody can be collected preferably from the blood, ascites, etc. of the aforementioned immunized mammal, preferably by blood.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • an antibody against high-activity LPA can specifically recognize high-activity LPA, it is useful for quantification of high-activity LPA in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
  • the antibody against high-activity LPA of the present invention can be used, for example, for diagnosis of diseases and the like. For example, the amount of highly active LPA in a biological sample (preferably, tissue at the lesion site, blood, etc.) collected from a patient with a certain disease is measured and compared with the amount of highly active LPA in a normal tissue or healthy sample. By doing so, it is possible to determine whether or not the potential disease is a potential LPA-related disease.
  • the disease is a disease involving LPA
  • LPA obtained using the following neutralizing antibody or the screening method or the screening kit of the present invention can be used.
  • the disease can be effectively treated.
  • the screening method or screening kit of the present invention By administering the preventive substance for the LPA-related disease, the onset of the LPA-related disease can be effectively prevented.
  • a neutralizing antibody against highly active LPA refers to a function of inhibiting the binding of highly active LPA to the LPA receptor protein and transmitting a signal from the LPA receptor protein.
  • protein e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release,
  • high-activity LPA can be used in the above-described screening method, the above-mentioned antibody preparation, and the like, and can also be mixed with a commonly used basal medium for cell culture to perform cell culture.
  • a composition for use Since the cell culture composition containing highly active LPA has an effect as a cell sorting control agent, for example, undifferentiated cells It can be differentiated into cells having a specific function (differentiation-inducing action), or can suppress the phenomenon that undifferentiated cells autonomously or heterogeneously shunt (shuffle-inhibiting action).
  • an undivided cell is a cell that expresses the above-mentioned LPA receptor protein and that can be proliferated by a specific stimulus and has a specific function by a specific stimulus.
  • Possible cells not limited by their origin.
  • the origin of the cells is preferably an animal, especially a mammal, and more preferably a human.
  • embryonic stem cells For example, embryonic stem cells, ectodermal stem cells, mesodermal stem cells, endodermal stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, neural progenitor cells, hepatic stem cells, muscle stem cells, splenic stem cells, skin stem cells, retinal stem cells, Cells such as hair follicle stem cells, osteoprogenitor cells, adipose precursor cells, chondrocytes, hair matrix cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, and the like, as well as cells in the cell lineage of these cells. It is preferably used.
  • the basal medium for cell culture used for mixing with the highly active LPA is not particularly limited.
  • Dulbecco's modified Eagle medium, Williams E medium, Ham's F-10 medium, F-12 medium, Conventionally known media such as RPMI-1640 medium, MCDB153 medium, and 199 medium can be used as a basic medium for cell culture.
  • an antibiotic / antifungal substance can be added to the cell culture basal medium, if desired.
  • the basal medium for cell culture may further contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS), bovine serum (Horse Serum), etc.), insulin, EGF, FGF2, bFGF, interleukin (IL) , Stem cell growth factor (SCF), erythropoietin (EPO), interferon (IFN), thrombopoietin (TPO), tumor necrosis factor (TNF), colony stimulating factor (CSF), dexamethasone, j8-glycerol phosphate, Additives such as ascorbic acid, TGF-j8, 1-methyl-3-isobutylxanthine, indomethacin, and the like, which have an activity of inducing self-partitioning, can also be appropriately added.
  • serum eg, fetal bovine serum (FBS), bovine serum (Horse Serum), etc.
  • insulin e.g, fetal bovine serum (FBS), bovine serum (Hors
  • the concentration, time to act, cell density, and other culture conditions of high active LPA (for example, And the like) can be appropriately changed according to the type of cells to be cultured!
  • a method for determining whether or not the cells cultured by the cell culture composition containing the highly active LPA have a divided force can be performed by a known method. For example, It is preferable to detect proteins, mRNAs, and the like that the cultured cells characteristically express according to the respective differentiation stages, using as an index.
  • Cells cultured using the cell culture composition containing highly active LPA can be used for various purposes.
  • cells for cell transplantation can be prepared by culturing and differentiating undifferentiated cells collected from a living body using a cell culture composition containing highly active LPA.
  • the alkyl group, alkoxy group, alkylene group and the like include straight-chain and branched ones.
  • isomers (E, Z, cis, trans) in double bonds, rings and fused rings isomers due to the presence of asymmetric carbon (R, S, ⁇ , j8, enantiomer, diastereomer), Optically active substance with optical activity (D, L, d, 1 body), polar form by chromatographic separation (high polar form, low polar form), equilibrium conjugate, mixture of these at any ratio, racemic mixture Objects are all included in the present invention.
  • all isomers due to tautomerism are also included.
  • a carbon atom serving as an asymmetric center may be indicated by adding *.
  • the carbon atoms marked with * may be in the R configuration, in the S configuration, or they may be mixed in any ratio.
  • the asymmetric carbon may have an R configuration, an S configuration, or a mixture of these at an arbitrary ratio. You can do it.
  • the binding site may be indicated by an arrow.
  • the direction of the structure having two or more arrows is not limited as long as the arrows are connected to a position where the arrows can be connected.
  • [0108] indicates that it is connected to the near side of the paper (that is, ⁇ arrangement),
  • [0110] represents an ⁇ -configuration, a / 3-configuration or a mixture thereof in any ratio
  • [0112] represents that the mixture is in a mixture at an arbitrary ratio between the ⁇ configuration and the j8 configuration.
  • Salts of the compounds derived according to the present invention include all pharmacologically acceptable ones.
  • the pharmaceutically acceptable salts are preferably non-toxic and water-soluble. Suitable salts include, for example, salts of alkali metals (eg, potassium, sodium, lithium, etc.), salts of alkaline earth metals (eg, calcium, magnesium, etc.), and ammonium salts (eg, tetramethylammonium).
  • the N-aged oxide form of the compound derived by the present invention The nitrogen atom of the compound guided by Ming represents that it has been oxidized. Further, the N-aged oxide form of the compound derived according to the present invention may further form the above-mentioned salt.
  • the quaternary ammonium salt of the compound derived by the present invention is a compound wherein the nitrogen atom of the compound derived by the present invention is a group (wherein the group is an aliphatic hydrocarbon group which may have a substituent, Represents a cyclic group which may have.) Represents a quaternized group.
  • the quaternary ammonium salt of the compound derived by the present invention may further form the above-mentioned salt or the above-mentioned N-oxide.
  • Suitable solvates of the compound derived from the present invention, a salt thereof, an N-oxide thereof, and a quaternary ammonium salt thereof include, for example, a solvent such as water, an alcohol solvent (e.g., ethanol) and the like. Japanese products and the like.
  • the solvate is non-toxic and water-soluble.
  • the compounds derived by the present invention can be converted to the above-mentioned salts, the above-mentioned N-oxides, the above-mentioned quaternary ammonium salts, and the above-mentioned solvates by known methods.
  • the highly active LPA of the present invention may be in the form of a salt or may be a solvate.
  • these salts and solvates those similar to the salts and solvates of the compounds obtained using the above-described screening method or screening kit of the present invention are preferably used.
  • a prodrug of a compound derived by the present invention refers to a compound that is converted into a compound derived by the present invention by a reaction with an enzyme, gastric acid, or the like in a living body.
  • a prodrug of the compound derived by the present invention for example, when the compound derived by the present invention has an amino group, a compound wherein the amino group is acylated, alkylated or phosphorylated (for example, the present invention The amino group of the compound derived from the compound is converted to eicosayl, aryl, pentylaminocarboxy, (5-methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl) methoxycarbyl, tetrahydrofuran -Hydroxylation, pyrrolidylmethyl dianilide, bivaloyloxymethylation, acetooxymethylation, tert-butyl dianilide, etc.); when the compound derived by the compound derived
  • Alkylated, phosphorylated, and borated compounds for example, when the hydroxyl group of the compound derived by the present invention is acetylated, palmitoylated, I le of, pivaloyl reduction, illusion two
  • the carboxy group is esterified or amidated.
  • the prodrug of the compound derived by the present invention may be either a hydrate or a non-hydrate.
  • the prodrug of the compound derived by the present invention can be derived by the present invention under physiological conditions as described in Hirokawa Shoten 1990, “Development of Pharmaceuticals,” Vol. 7, “Molecular Design,” pp. 163 to 198. May be changed to a compound.
  • the compounds derived according to the present invention may be labeled with isotopes (eg, 3 H, “C, 35 S, 1251, etc.) and the like.
  • a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof may be a mammal (eg, a human, non-human animal such as a monkey, a higgin, a puppy, a puppy, a dog, a cat, a puppy, a rat, a mouse, etc.) )
  • LPA lipoprotein
  • the compound, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is particularly useful for prevention and Z or treatment of urological diseases.
  • Useful because LPA receptor agonists contract the urethra, urinary incontinence (e.g., stress incontinence due to impaired urethral function, dementia incontinence, reflex incontinence, overflow incontinence, urge incontinence, total incontinence) , Functional urinary incontinence, overflow urinary incontinence, etc.) and is useful for Z or treatment, and LPA receptor antagonist relaxes the urethra To prevent urethra and prostate contraction, and make urination difficult (e.g., delay in urination start, prolong urination time, small urine line, intermittent urination, two-stage urination, etc.), urine retention, urinary frequency, nocturia, etc.
  • urinary incontinence
  • the "disease involving LPA” is not limited to the diseases listed above, and is a disease in which LPA is known to be involved in formation, exacerbation and Z or continuation of the disease, and involvement of LPA. Include all diseases to be found in the future.
  • the antibody against highly active LPA of the present invention in particular, a neutralizing antibody may be used as a diagnostic agent, or may be used for signal transduction involving highly active LPA and Z or LPA receptor, for example, Cell stimulating activity via LPA receptor protein (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, increased intracellular calcium ion concentration, intracellular cyclic AMP (cAMP) generation, intracellular cyclic GMP (cGMP) generation, inositol Phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, activation of c fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.).
  • LPA receptor protein e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, increased intracellular calcium ion concentration, intracellular cyclic AMP (cAMP) generation, intracellular cyclic GMP (cGMP) generation, inositol Phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, activ
  • a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof (For example, humans and non-human animals such as monkeys, higgs, lions, pomeras, dogs, cats, puppies, rats, mice, etc.) to prevent the above-mentioned diseases involving LPA and It can be used as a therapeutic agent.
  • a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof (For example, humans and non-human animals such as monkeys, higgs, lions, pomeras, dogs, cats, puppies, rats, mice, etc.) to prevent the above-mentioned diseases involving LPA and It can be used as a therapeutic agent.
  • the antibody against the highly active LPA of the present invention it may be performed according to a general formulation of an antibody medicine.
  • the compound in order to use the compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof for the above-mentioned purpose, the compound is usually orally or parenterally administered as a pharmaceutical composition systemically or locally. It is administered in the form of
  • the dosage varies depending on the age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc. Usually, the dosage is in the range of lmg to lOOOOmg per adult, once a day, and several times a day. Oral administration or parenteral administration (preferably intravenous), once to several times a day, in the range of lmg to 100mg / dose per adult, or 1 hour / day Or It is continuously administered intravenously for 24 hours.
  • the dose varies depending on various conditions, and therefore, the dose may be smaller or larger than the above-mentioned dose, or may be necessary beyond the range.
  • a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof When administering the compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof, according to a method known per se which is generally used in a method for producing a pharmaceutical preparation,
  • the compound derived by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof may be used as it is or in the form of a mixture with a pharmacologically acceptable carrier, for example, a solid preparation for internal use (for example, tablets (sugar-coated tablets, (Including film-coated tablets), powders, pills, granules, capsules, etc.), liquid preparations for internal use, liquid preparations for external use, injections, suppositories, sustained release, etc.
  • a solid preparation for internal use for example, tablets (sugar-coated tablets, (Including film-coated tablets), powders, pills, granules, capsules, etc.
  • the content of the compound derived from the present invention in a vigorous preparation may range from about 0.01% to about 100% by weight of the whole preparation, preferably from about 0.1% to about 50% by weight, more preferably , From about 0.5% to about 20% by weight.
  • the compounds derived from the present invention used in the production of these pharmaceutical preparations are not limited to those that are substantially pure and a single substance, but may be impurities (for example, by-products derived from the production process). , A solvent, a raw material, or a degradation product, etc.) as long as the drug substance is acceptable.
  • Pharmacologically acceptable carriers used in the production of these pharmaceutical preparations include various organic or inorganic carrier substances commonly used as preparation materials, such as excipients in solid preparations, lubricants and the like. Examples include powders, binders and disintegrants, or solvents in liquids, dissolution aids, emulsifying or suspending agents, isotonic agents, buffers and soothing agents. Further, if necessary, usual additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents, sweeteners, adsorbents, wetting agents and the like can be used in appropriate amounts.
  • Examples of the solid preparation for oral administration for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, and granules.
  • Capsules include hard capsules and soft capsules.
  • one or more of the active substances may be intact or excipients (eg, ratatose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, starch, corn starch, light caffeic anhydride, etc.).
  • a binder for example, hydroxypropyl Lurose, polybutylpyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate, crystalline cellulose, sucrose, D-mantol, dextrin, hydroxypropylmethylcellulose, starch, sucrose, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc.
  • disintegrants eg fiber
  • lubricants eg, magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica, etc. It is formulated and used according to the usual method.
  • a coating agent eg, sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc.
  • a coating agent eg, sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc.
  • capsules made of a material that can be absorbed, such as gelatin may be used.
  • Liquid preparations for oral administration include pharmaceutically acceptable solutions, suspensions, emulsions, syrups, elixirs and the like.
  • viscous solutions one or more active substances are dissolved, suspended or emulsified using commonly used diluents (eg, purified water, ethanol or a mixture thereof).
  • the solution may further contain a wetting agent, a suspending agent, an emulsifier, a sweetening agent, a flavoring agent, a fragrance, a preservative, a buffer and the like.
  • Injections for parenteral administration include all injections and also include drops. For example, injections into muscle, subcutaneous injections, intradermal injections, intraarterial injections, intravenous injections, intraperitoneal injections, spinal injections And intravenous drops.
  • Injections for parenteral administration include solutions, suspensions, emulsions, and solid injections used by dissolving or suspending in a solvent for use. Injectables are used by dissolving, suspending or emulsifying one or more active substances in a solvent.
  • the solvent examples include distilled water for injection, physiological saline, macrogol, vegetable oils (eg, sesame oil, corn oil, olive oil, etc.), alcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, ethanol, and the like.
  • the injection further comprises a stabilizing agent (eg, D sorbitol, D mannitol, L-alanine, ascorbic acid, albumin, inositol, sodium dalconate, sodium thioglycolate).
  • a stabilizing agent eg, D sorbitol, D mannitol, L-alanine, ascorbic acid, albumin, inositol, sodium dalconate, sodium thioglycolate.
  • solubilizers for example, glutamic acid, aspartic acid, polysorbate 80 (registered trademark), polyethylene glycol, propylene dalicol, D-man-tol, benzyl benzoate, ethanol, tris
  • Aminomethane cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, etc.
  • emulsifying or suspending agents eg, surfactants (eg, stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylamino) Propionic acid, lecithin, benzalco-chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, etc.
  • hydrophilic polymers eg, polybutyl alcohol, polybutylpyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methinoresenolerose, hydrid
  • a sterile solid preparation for example, a lyophilized product
  • Freeze-drying can be performed by a method known per se. Generally, after freezing at a temperature of -25 ° C or less, the shelf temperature is raised until the temperature of the shelf reaches 25 ° C to 40 ° C while maintaining the degree of vacuum in the drying cabinet at about 13.3Pa or less. Drying method is preferred.
  • compositions for parenteral administration include external solutions, ointments, liniments, inhalants, sprays, suppositories and vagina which contain one or more active substances and are formulated in a conventional manner. And pessaries for internal administration.
  • Sprays may be used in addition to commonly used diluents to make them isotonic with stabilizers such as sodium bisulfite, for example sodium chloride, sodium citrate or citric acid. It may contain a suitable isotonic agent.
  • stabilizers such as sodium bisulfite, for example sodium chloride, sodium citrate or citric acid. It may contain a suitable isotonic agent.
  • the method for producing sprays is described in detail in, for example, US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355.
  • the compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof is prepared. (1) complement and / or enhance the preventive and Z or therapeutic effects of the compound, (2) improve the kinetics, absorption, decrease the dose of the compound, and (3) side effects of the compound It may be administered as a concomitant drug in combination with another drug for the purpose of, for example, reducing the amount of the drug.
  • concomitant drugs in addition, (1) supplementation and / or enhancement of the preventive and Z or therapeutic effects of other concomitant drugs (hereinafter sometimes abbreviated as concomitant drugs), (2) improvement of absorption of kinetics, reduction of dosage And / or Z or (3) a compound, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof according to the present invention for reducing side effects, which is administered in combination as a concomitant drug.
  • the concomitant drug of the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof and a concomitant drug may be administered in the form of a combination drug comprising both components in a single preparation. It may be in the form of administration as separate preparations. When administered as such separate preparations, simultaneous administration and administration at different times are included. In addition, the administration by the time difference may be performed by administering the compound derived by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof first, and administering the concomitant drug later, or the concomitant drug first.
  • the compound, its salt, its solvate, or its prodrug, which is administered by the present invention, and administered later may be administered without any force, and the respective administration methods may be the same or different.
  • Diseases in which a prophylactic and / or therapeutic effect is exhibited by the compound of the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a concomitant drug thereof and a concomitant drug are not particularly limited. Is a disease that supplements and / or enhances the prophylactic and / or therapeutic effects of its salts, solvates or prodrugs thereof, or complements and / or enhances the prophylactic and / or therapeutic effects of concomitant medications Any disease can be used as long as the disease enhances.
  • the weight ratio of the drug is not particularly limited.
  • the concomitant drug is not limited to a low molecular compound, and may be a high molecular protein, polypeptide, polynucleotide (DNA, RNA, gene), antisense, decoy, antibody, vaccine, or the like.
  • the dose of the concomitant drug can be appropriately determined based on the clinically used dose.
  • the present invention The compounding ratio of the compound, its salt, its solvate, or their prodrug and concomitant drug should be appropriately selected depending on the age and weight of the subject, administration method, administration time, target disease, symptoms, combination, etc. Can be.
  • the concomitant drug may be used in an amount of 0.01 to 100 parts by weight based on 1 part by weight of the solvate or prodrug thereof.
  • the concomitant drug may be arbitrarily administered in any combination of one or more of the following homologous groups and heterogeneous groups at any ratio.
  • Other drugs for preventing and supplementing Z or enhancing the effect of LPA receptor agonist on urinary system disease and complementing or enhancing Z or therapeutic effect include other therapeutic agents for urological diseases, for example, a1agonist, ⁇ 2agonist And anticholinergic drugs.
  • X 1 agonist includes, for example, midodrine hydrochloride and the like.
  • ⁇ 2 agonist includes, for example, clenbuterol hydrochloride and the like.
  • Anticholinergic agents include, for example, oxyptinin hydrochloride, shiridani bethanechol , Propiverine hydrochloride, propantheline bromide, methyl benactidium bromide, butyl scopolamine bromide, tolterodine tartrate, trospium chloride, 338-338, UK-112 166-04, KRP-197, darifenacin, YM-905 and the like. .
  • Other drugs for preventing and complementing or enhancing Z or therapeutic effects of LPA receptor antagonists against urinary system diseases and for enhancing or enhancing Z or therapeutic effects include other therapeutic agents for urological diseases, for example, a1 antagonist, Choline drugs, 5 ⁇ -reductase inhibitors, and ⁇ or antiandrogen drugs.
  • ⁇ 1 antagonists include terazosin hydrochloride, bunazosin hydrochloride, perapidil, tamsulosin hydrochloride, doxazosin mesylate, prazosin hydrochloride, indolamin, naphtovidil, anorefuzosine hydrochloride, AIO-8507L, silodosin and the like.
  • anticholinergic agents for example, oxyptinin hydrochloride, Propiverine acid, propanthelin bromide, methyl benactidium bromide, butyl scopolamine bromide, tolterodine tartrate, trospium chloride, Z-338, UK-112166-04, KRP-197, Darifenacin, YM-905 and the like.
  • anticholinergic drugs are used only in cases without prostatic hypertrophy. It is mainly used for the treatment of pollakiuria and urinary incontinence without prostatic hypertrophy.
  • 5 ⁇ -reductase inhibitors include, for example, finasteride, G-998998, and the like.
  • the antiandrogen include oxendrone, osaterone acetate, bicalutamide and the like.
  • a compound derived by the present invention By combining a compound derived by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof with a concomitant drug, (1) a compound derived by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, Or the dose can be reduced as compared to the case where the prodrug or the concomitant drug is administered alone.
  • a compound derived by the present invention a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof and a concomitant drug.
  • a concomitant drug having a different mechanism of action from its salt, its solvate, or its prodrug By selecting a concomitant drug having a different mechanism of action from its salt, its solvate, or its prodrug, it can be used safely for a long period of time, and the treatment period can be set longer.
  • the therapeutic effect By selecting a compound, a salt thereof, a solvate thereof, or a concomitant drug having a different mechanism of action from the prodrug derived from the present invention, the therapeutic effect can be sustained.
  • an excellent effect such as a synergistic effect can be obtained.
  • the use of a compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof in combination with a concomitant drug is referred to as “the concomitant drug of the present invention”.
  • the administration time of the compound derived by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof and a concomitant drug is not limited, and the compound derived by the present invention is not limited.
  • a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof or a pharmaceutical composition thereof and a concomitant drug or a pharmaceutical composition thereof may be administered to a subject at the same time or at a time interval.
  • the dose of the concomitant drug should be suitable for the administration subject, administration route, disease, combination, etc., according to the clinically used dose. You can choose any.
  • the administration form of the concomitant drug of the present invention is not particularly limited as long as the compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof and a concomitant drug are combined in vivo. .
  • Such dosage forms include, for example, (1) a single preparation obtained by simultaneously formulating a compound, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof, and a concomitant drug derived from the present invention.
  • Administration (5) Administration of two compounds obtained by separately formulating a compound, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof and a concomitant drug derived according to the present invention, by the time difference between different administration routes by different administration routes (For example, a compound derived by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof; administration of the concomitant drug in the order of administration, or administration in the reverse order).
  • a compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a compound thereof When administering the concomitant drug of the present invention, a compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a compound thereof according to a means known per se generally used in a method for producing a pharmaceutical preparation.
  • These prodrugs and Z or the concomitant drug may be used as they are or as a mixture with a pharmacologically acceptable carrier.
  • solid dosage forms for internal use e.g., tablets (including sugar-coated tablets, film-coated tablets), powders, pills, etc.) Preparations, granules, capsules, etc.), orally or parenterally (eg, topically, rectally, intravenously) Administration etc.) can be safely administered.
  • Pharmacologically acceptable carriers used in the production of these pharmaceutical preparations include various organic or inorganic carrier substances commonly used as preparation materials, such as excipients in solid preparations, lubricants, and the like. Examples include powders, binders and disintegrants, or solvents in liquids, dissolution aids, emulsifying or suspending agents, isotonic agents, buffers and soothing agents. If necessary, use ordinary preservatives, antioxidants, coloring agents, sweeteners, adsorbents, wetting agents, etc. An appropriate amount of the additive can be used as appropriate.
  • Excipients include, for example, ratatose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, starch, corn starch, light caffeic anhydride and the like.
  • binder examples include hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate, crystalline cellulose, sucrose, D-mantol, dextrin, hydroxypropylmethylcellulose, starch, sucrose, gelatin, methylcellulose, And carboxymethyl cellulose sodium.
  • Disintegrators include, for example, cellulose glycolate, starch, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, sodium carboxymethyl starch, L-hydroxypropylcellulose and the like.
  • Examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • Examples of the solvent include distilled water for injection, saline, macrogol, vegetable oils (eg, sesame oil, corn oil, olive oil, etc.), alcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, ethanol, and the like. Combinations and the like can be mentioned.
  • Examples of the stabilizer include D sorbitol, D mannitol, L-alanine, ascorbic acid, albumin, inositol, sodium dalconate, sodium thioglycolate, and polyoxyethylene hydrogenated castor oil.
  • solubilizers include glutamic acid, aspartic acid, polysorbate 80 (registered trademark), polyethylene glycol, propylene glycol, D-mantol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, and the like.
  • Sodium carbonate, sodium citrate and the like can be mentioned.
  • the emulsifying or suspending agent include surfactants (eg, stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, lauryl aminopropionic acid, lecithin, benzalco-chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, etc.).
  • Hydrophilic polymers eg, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, hydroxypropinoresenorelose, etc.
  • the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • the tonicity agent include glucose, D-sorbitol, sodium salt, glycerin, D-mantol and the like.
  • As a buffer for example, phosphate, acetate, carbonate And buffers such as citrate.
  • Examples of the preservative include parahydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Examples of the antioxidant include sulfite, ascorbic acid, ⁇ -tocopherol and the like.
  • the compounding ratio of the compound induced by the present invention, its salt, its solvate, or its prodrug in the concomitant drug of the present invention varies depending on the form of the preparation. It is from 0.01% to about 100% by weight, preferably from about 0.1% to about 50% by weight, more preferably from about 0.5% to about 20% by weight.
  • the compounding ratio of the concomitant drug in the concomitant preparation of the present invention varies depending on the form of the preparation, but is usually about 0.01% to about 100% by weight, preferably about 0.1% by weight, based on the whole preparation. To about 50% by weight, more preferably from about 0.5% to about 20% by weight.
  • the content of additives such as carriers in the concomitant drug of the present invention varies depending on the form of the preparation, but is usually about 1% to about 99.99% by weight, preferably about 10% to about 9% by weight, based on the whole preparation. About 90% by weight. Similar contents may be used when the compound derived by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof and a concomitant drug are separately formulated.
  • a tablet is prepared by granulating a drug as it is or by adding an excipient, a binder, a disintegrant or other appropriate additives, and mixing them uniformly to obtain granules by an appropriate method.
  • a tablet is prepared by granulating a drug as it is or by adding an excipient, a binder, a disintegrant or other appropriate additives, and mixing them uniformly to obtain granules by an appropriate method.
  • the granules can be produced as they are or by adding an appropriate additive to the granules and mixing them uniformly, followed by compression molding.
  • Such tablets may optionally contain a coloring agent, a flavoring agent, and the like.
  • the coating can be applied with an appropriate coating agent.
  • Injectables are prepared by dissolving, suspending, or emulsifying a certain amount of the drug in an aqueous solvent, water for injection, physiological saline, Ringer's solution, etc. Alternatively, a quantity of the medicinal product can be prepared in a sealed container for injection.
  • Carriers used in formulations for oral administration include, for example, starch, mannitol, crystals Substances commonly used in the field of pharmaceuticals such as cellulose and sodium carboxymethylcellulose are used.
  • As the carrier used for the preparation for injection for example, distilled water, physiological saline, glucose solution, infusion solution and the like are used.
  • additives generally used in preparations can be appropriately added.
  • the dose of the concomitant drug of the present invention varies depending on age, body weight, symptom, therapeutic effect, administration method, treatment time and the like. Oral administration once a day, several times a day, in a range of 0.1 mg lOOOOmg per person, or in a range of 0.1mg lOOmg per adult, once a day. It is administered parenterally (preferably intravenously) several times once a day, or is continuously administered intravenously in the range of 1 hour to 24 hours a day.
  • the concomitant drug can be used in any amount as long as side effects do not become a problem and the object of the present invention can be achieved.
  • the daily dosage of the concomitant drug varies depending on the severity of symptoms, age, sex, weight, sensitivity difference, timing of administration, interval of administration, nature of pharmaceutical preparation, preparation, type, type of active ingredient, etc. There is no particular limitation.
  • the concomitant drug When administering the concomitant drug of the present invention, the concomitant drug may be administered at the same time. However, after administering the concomitant drug first, the compound induced by the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a solvate thereof is obtained. These prodrugs may be administered, or the compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof may be administered first, and then a concomitant drug may be administered. .
  • the time difference varies depending on the active ingredient to be administered, dosage form, and administration method.
  • the concomitant drug is administered first, within 1 minute to 3 days after administration of the concomitant drug, preferably examples include a method of administering the compound induced by the present invention within 10 minutes to 1 day, more preferably within 15 minutes to 1 hour.
  • a compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof is previously applied, the compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof are provided.
  • the concomitant drug is administered within 1 minute to 1 day, preferably within 10 minutes to 6 hours, more preferably within 15 minutes to 1 hour. [Pharmacological activity]
  • Examples of the screening method of the present invention include the following methods.
  • the following screening methods can be used to find LPA receptor agonists or antagonists.
  • the method exemplified below uses EDG-2 as the LPA receptor, but other LPA receptors may be used as well.
  • EDG-2 The effect on EDG-2 can be evaluated, for example, by the following experiment.
  • Hamster Ovary (CHO) cells can be used to evaluate the receptor's agonist and antagonist activities.
  • EDG-2 expressing cells were obtained using Ham's F12 medium (manufactured by Gibco) containing 10% FBS ( ⁇ fetal serum), penicillin Z streptomycin, and blasticidin (5 ⁇ g / mL). Incubate.
  • FBS ⁇ fetal serum
  • penicillin Z streptomycin ⁇ fetal serum
  • blasticidin 5 ⁇ g / mL.
  • the cells were treated with a Fura2-AM solution [10% FBS, HEPES buffer (20 mM, pH 7.4), probenecid (2.5 mM). , Sigma, No. P-8761) containing Ham, sF12 medium] (5 M) at 37 ° C for 60 minutes, HEPES buffer (20 mM, pH 7.4) and probenecid (2M). Wash once with Hanks solution containing 5 mM) and soak in the same Hanks solution. It is possible to continue evaluation according to the following method (i) or (ii).
  • EDG-2 antagonistic activity is the control value (A) of the peak value of highly active LPA in a well containing DMSO without compound and the value before addition of the highly active LPA in cells treated with the compound.
  • the IC value is defined as the concentration of the test compound showing 50% inhibition. Can be calculated.
  • the plate is set in the above-mentioned fluorescent drug screening system, measured without stimulation for 30 seconds, and a test compound solution is added.
  • the compound to be evaluated is dissolved in DMSO or the like, and added so that the final concentration of the DMSO solution will be 1Z1000 at a final concentration in the range of 0. InM to M.
  • LPA for example, 18: 3-LPA
  • the screening method of the present invention uses a highly active LPA, which is a causative substance of various diseases, as a ligand. It is.
  • FIG. 1 shows mass spectrometry data of 1-linolenoyl (18: 3) —LPA and highly active LPA obtained by acidifying it.
  • the whole operation was based on basic biological techniques and utilized conventional methods.
  • the measurement method of the present invention is used to evaluate a compound derived from the present invention, a salt thereof, a solvate thereof, or a prodrug thereof, as described below. Above and Z or with improved measurement sensitivity. The detailed experimental method is shown below.
  • TLC confirmed that no LPA remained in the aqueous layer, and the organic layers were combined and concentrated under reduced pressure.
  • Example 1 It was confirmed by mass spectrometry that the highly active LPA obtained in Example 1 was different from 1-linolenoyl (18: 3) -LPA obtained in Reference Example 1. The measurement conditions and methods are shown below.
  • Silica gel column Develosil60-5 (2. Omm X 150mm) (Nomura Chemical Co., LTD.)
  • Capillary 2.9; Cone: 40; RF Lensl: 50.0; Sourse Temp (° C): 100; Desolvation Temp (° C): 200; Cone Gas Flow (L / Hr): 50; Desolvation Gas Flow (L / (Hr): 800
  • HPLC Gradient Parentheses [] indicate the ratio (%) of buffer A to buffer B.
  • Capillary 2.9; Cone: 40; RF Lensl: 50.0; Sourse Temp (° C): 100; Desolvation Temp (° C): 200; Cone Gas Flow (L / Hr): 50; Desolvation Gas F low (L / Hr): 800
  • the 1-linolenoyl (18: 3) LPA obtained in Reference Example 1 and the highly active LPA obtained in Example 1 showed different spectrum charts (FIG. 1) by mass spectrometry.
  • the agonist activity of the receptor was evaluated using Chinese Hamster Ovary (CHO) cells overexpressing the human EDG-2 gene.
  • EDG-2 expressing cells were cultured using Ham's F12 medium (Gibco BRL) containing 10% FBS (fetal fetal serum), penicillin Z streptomycin, and blasticidin (5 ⁇ g / mL).
  • FBS fetal fetal serum
  • penicillin Z streptomycin penicillin Z streptomycin
  • blasticidin 5 ⁇ g / mL
  • Fura2-AM Dojindo
  • the cells were treated with a Fura2-AM solution [10% FBS, HEPES buffer (20 mM, pH 7.4), probenecid (2.5 mM) (Sigma, P -8761) containing Ham, sF12 medium] (5 / zM), incubate at 37 ° C for 60 minutes, contain HEPES buffer (20 mM, pH 7.4) and probenecid (2.5 mM) It was washed once with Hanks solution and immersed in Hanks solution.
  • a Fura2-AM solution 10% FBS, HEPES buffer (20 mM, pH 7.4), probenecid (2.5 mM) (Sigma, P -8761) containing Ham, sF12 medium] (5 / zM)
  • HEPES buffer 20 mM, pH 7.4
  • probenecid 2.5 mM
  • the plate was set in a fluorescent drug screening system (manufactured by Hamamatsu Photonitas), measured without stimulation for 30 seconds, and the solution containing the highly active LPA obtained in Example 1 was added.
  • LPA was dissolved in physiological saline and added at a final concentration of 0.1 nM to 10 M.
  • the intracellular Ca 2+ concentration (Fura2-Ca 2+ fluorescence) before and after the addition was measured at 3-second intervals (excitation wavelengths 340 and 380 nm, emission wavelength 500 nm).
  • Example 1 It was found that the highly active LPA obtained in Example 1 had an effect of increasing the intracellular calcium ion concentration in EDG-2 expressing cells.
  • IGS rats Female or male CD (SD) IGS rats (Nippon-charlsriver, 8-9 weeks of age) were exsanguinated by head bruising and jugular arteriovenous transection, the urethra below the pubic bone was carefully removed. Immediately use Krebs-Henseleit solution (112 mM NaCl, 5.9 mM KC1, 2.0 mM CaCl2)
  • Extirpated specimen force The urethra was cut off, cut into a plate, cut in parallel with the oratoris muscle, and two or three strips of 2 to 3 mm in width and 3 to 4 mm in length were prepared per animal.
  • the suspension was suspended in a Magnus tube filled with 22 aeration (volume: 10 mL). After applying a tension load of about 0.5g and stabilizing for 60 minutes, a force displacement transducer (Nihon Kohden, FD pick-up TB-61IT) force A recorder (Nippon Koden, AP-621G) is used for the recorder. The contraction movement was recorded on GRAPHTEC CORP., Linear coder WR3320).
  • the contractile response of the control was obtained by stimulating with a high-concentration KC1 solution (Krebs-Henseleit in which all NaCl was replaced with KC1).
  • Example 1 The solution containing the highly active LPA obtained in Example 11 or Example 12 was added, and the dose dependence of urethral contraction was measured.
  • Example 1-1 Example 1-1 contracts the isolated urethra of the rat in a dose-dependent manner.
  • the urethral pressure was adjusted to around 20 mmHg, and the patient was allowed to stand still until it stabilized (about 20 minutes). Thereafter, the highly active LPA obtained in Example 11 or 12 or LPA used as a raw material for producing them was intravenously administered, and the effect of increasing intraurethral pressure was evaluated.
  • the highly active LPA showed an activity to increase the intraurethral pressure in the urethra as compared to LPA.
  • a comparison between 1-linolenoyl (18: 3) -LPA obtained in Reference Example 1 and the highly active LPA obtained in Example 1 shows that at the dose of 0.3 mgZkg, iv, the highly active LPA was obtained.
  • LPA showed at least a 1.5- to 2-fold increase in intraurethral pressure compared to 1-linolenoyl (18: 3) -LPA.
  • OmL was added, and after stirring for 5 seconds, methanol (2.5 mL) and acetic acid (60 L) were immediately added and stirred at room temperature for 2 minutes. Further, form (1.25 mL) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 1 minute and allowed to stand for 10 minutes.
  • Buffer B 10mM ammonium formate (pH 6.4) in methanol
  • HPLC Hewlett Packard, HP1100
  • LM1 Resolution 15; HM 1 Resolution: 15; Ion Energyl: 0.5; Entrance: -3; Exit: l; LM2 Resolution: 15; HM2 Resolution: 15; Ion Energy2: 3; Multiplier (V): 650; Syringe Pump Flow ( ⁇ L / min): 10; Gas Cell Piran i Pressure (mbar): 2.86E— 03
  • Cycle time (sees): 1. 760; Inter Channel delay (sees): 0. 02; Retention window (mins): 0. 000 to 35. 000; Ionization mode: ES—; Data type: M RM data
  • HPLC Gradient Parentheses [] indicate the ratio (%) of buffer A to buffer B.
  • the oxidized form was specifically and separated from the non-oxidized form under the present analysis conditions, and detected by a tandem mass spectrometer.
  • 20: 4-1-8 with one oxygen atom shows a peak area of 113 in the plasma of normal rats, which was below the detection limit (BQL) in blank.
  • BQL detection limit
  • the present invention can be applied to the medical field as described below.
  • a preventive and / or Z or therapeutic substance for a disease associated with LPA can be obtained efficiently.
  • the screening method of the present invention is different from the conventional method using LPA. In other words, since highly active LPA, which is a causative substance of various diseases, is used as a ligand, this is a screening method that more closely reflects the biological environment.
  • the substance obtained by the screening method of the present invention can be applied as a pharmaceutical.

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Abstract

［課題］高活性型ＬＰＡおよびそれを用いたスクリーニング方法を提供する。 ［解決手段］一般式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）。 　　［化１］ ［式中、記号の意味は明細書中に記載。］で示される化合物を用いることを特徴とする、ＬＰＡが関与する疾患の予防および／または治療物質のスクリーニング方法。本発明のスクリーニング方法もしくはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグは、ヒトやその他の哺乳動物に対して、高活性型ＬＰＡとＬＰＡ受容体の結合をモジュレートするので、ＬＰＡが関与する疾患、例えば、泌尿器系疾患、中枢性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、糖尿病、免疫系疾患または消化器系疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。

Description

明 細 書
高活性型リゾホスファチジン酸およびそれを用いたスクリーニング方法 技術分野
[0001] 本発明は、新規な物質である高活性型リゾホスファチジン酸 (以下、高活性型 LPA と略記する場合がある。）、およびそれを用いることを特徴とする、リゾホスファチジン 酸 (以下、 LPAと略記する場合がある。）が関与する疾患の予防および Zまたは治療 物質のスクリ一二ング方法等に関する。
背景技術
[0002] 脂質メディエーターの一つである LPAは、スフインゴシン 1 リン酸とともに、リゾリ ン脂質と総称されている。 LPAは、 EDG (Endothelial differentiation gene)— 2 、 4、 7と称される GPCR(G蛋白質共役型の 7回膜貫通領域を分子内に持つ受容体） のリガンドであり、これらの受容体に結合することで、種々の細胞機能や生体機能等 の調節、および各種疾患 (例えば、泌尿器系疾患、中枢性疾患、炎症性疾患、循環 器疾患、癌、糖尿病、免疫系疾患および消化器系疾患等)の発症、進展等に関与す ることが知られている。
[0003] LPAとその受容体の結合をモジュレートする化合物は、これらの疾患の予防および Zまたは治療薬となる可能性があるため、それらを得るために種々のスクリーニング 方法が開発されている (例えば、国際公開第 99Z24569号パンフレット (特許文献 1 )、国際公開第 96Z39436号パンフレット (特許文献 2)参照)。
[0004] 通常、 GPCRリガンドとして機能する脂質メディエーターは、例えば、 PAF (血小板 活性ィ匕因子)やロイコトリェンの様に、健常な生体の血中では検出されないか、また は検出されても微量である。一方、 LPAは、哺乳動物の血清中に lmLあたり数/ z gと V、う極めて高濃度での存在が確認されて 、る。このようにリガンドが過剰な状態では、 LPA受容体は常時活性ィ匕状態にあることが予想される。し力しながら、化学的に合 成した LPA受容体のァゴニストを生体に投与すると、かかる受容体は、一般的なリガ ンドー受容体の反応と同様に活性化作用を示す。従って、 LPA受容体は、そのリガン ドである LPAが過剰に存在するのにも関わらず、通常、不活化状態にあり、例えば、 種々の疾患時等のように LPA受容体が活性ィ匕する場合、 LPA受容体の活性ィ匕を担 うリガンドは、 LPA以外の別のリガンドであることが予測された。
[0005] 特許文献 1：国際公開第 99Z24569号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 96Z39436号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の課題は、生体内において LPA受容体の活性化を担う、 LPA以外の新規 リガンドを見出し、力かるリガンドと LPA受容体を用いてそれらの結合をモジュレート する物質の高感度スクリーニング系を構築することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、 LPAは生体内で酸ィ匕等の 修飾を受けることにより、より高活性で、新規なリガンドとして LPA受容体に結合して 機能するという事実を見出し、この知見に基づいてさらに検討を加えることにより本発 明を完成した。
[0008] すなわち、本発明は、
[1]標識されて 、てもよ 、高活性型 LPAを用いることを特徴とする、 LPAが関与する 疾患の予防および Zまたは治療物質のスクリーニング方法；
[2]高活性型 LPAが、以下の一般式 (1)、（II)または (ΙΠ)
[0009] [化 1]
H2C-0-R1 H2C— OH H2C-0-R1
I 一 I 一 I
HO-C-H O R1— O-C-H O H-C-O^ O
I II I II I Ρζ
H2C-0— P-OH H2C-0-P-OH H2C— O OH
I I OH OH
( I ) ( I D ( I I I )
[0010] [式中、 R1は、酸化、ニトロ化、ニトロソ化、ニトロヒドリルイ匕および Zまたはァミノ化され た脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボ二ル基を表す。ただし、不斉炭 素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいもの とする。 ]で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物である前記 [1]記載の 方法；
[3] の主鎖の炭素数が、 6乃至 26である前記 [2]記載の方法；
[4]R^\以下の Q群から選択される 1種以上の部分構造を有する脂肪族炭化水素 基もしくは脂肪族炭化水素カルボニル基であって、 Q群が、
[0011] [化 2]
)N02
Figure imgf000004_0001
[0012] [式中、矢印は結合部位を表し、 Gは、
[0013] [化 3]
Figure imgf000004_0002
[0014] (式中、矢印は結合部位を表す。）または水素原子を表す。ただし、不斉炭素は、 R 配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいものとする。 ]からなる群である前記 [2]記載の方法；
[5] が、 [0015] [化 4]
+ Y—(CH2)p~ E1— A— E2 -(CH2)q— H
[0016] [式中、矢印は結合部位を表し、 Yはカルボ-ル基またはメチレン基を表し、 pおよび qはそれぞれ独立して 0または 1乃至 7の整数を表し、 E1および E2はそれぞれ独立し て、 C1 4アルキレン基、 C2— 4ァルケ-レン基または結合手を表し、 Aは、結合手、
[0017] [化 5]
Figure imgf000005_0001
[0018] (式中、矢印は結合部位を表し、 Gは前記 [4]の記載と同じ意味を表す。ただし、不 斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよ いものとする。）を表し、 nは 1乃至 6の整数を表し、 nが 2以上の場合、複数の E E2 および Aはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。但し、 R1中、少なくとも 1つの Aは、
[0019] [化 6] 、
Figure imgf000005_0002
[0020] (式中、矢印は結合部位を表し、 Gは前記 [4]の記載と同じ意味を表す。ただし、不 斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよ いものとする。）を表すものとする。 ]である前記 [4]記載の方法；
[6] が、
[0021] [化 7]
+Y— (CH2)p1—(T)r_(CH2)q厂 H
[0022] [式中、矢印は結合部位を表し、 Yはカルボ-ル基またはメチレン基を表し、 piおよ び qlはそれぞれ独立して 1乃至 7の整数を表し、 Tは、 [0023] [化 8]
Figure imgf000006_0001
[0024] (式中、矢印は結合部位を表す。ただし、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力 また はそれらが任意の比率で混合していてもよいものとする。）を表し、 rは 1乃至 5の整数 を表し、 rが 2以上の場合、複数の Tはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。但し、 R 1中、少なくとも 1つの Tは、
[0025] [化 9]
Figure imgf000006_0002
[0026] (式中、矢印は結合部位を表す。ただし、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力 また はそれらが任意の比率で混合していてもよいものとする。）を表すものとする。 ]である 前記 [5]記載の方法；
[7]R^\ 1個のヒドロペルォキシ基で置換され、 2乃至 3個の二重結合を有する炭素 数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である前記 [6]記載の方法；
[8] が、
[0027] [化 10]
Figure imgf000007_0001
[0028] [式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合し て！、てもよ 、ものとする。 ]である前記 [7]記載の方法；
が、 1乃至 3個のエポキシ基で置換され、 0または 1乃至 2個の二重結合を有す る炭素数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である前記 [6]記載の方法；
[10]!^が、 [0029] [化 11]
Figure imgf000008_0001
[0030] [式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合し ていてもよいものとする。 ]である前記 [9]記載の方法；
[11]LPAが関与する疾患が、泌尿器系疾患、中枢性疾患、炎症性疾患、循環器疾 患、癌、糖尿病、免疫系疾患または消化器系疾患である前記 [1]記載の方法； [ 12]泌尿器系疾患が、排尿障害である前記 [11]記載の方法；
[13]標識されていてもよい高活性型 LPAを用いることを特徴とする、 LPAが関与す る疾患の予防および または治療物質のスクリーニング用キット； [ 14]前記 [ 1 ]記載の方法および Zまたは前記 [13]記載のキットを用 、て得られた 化合物、その塩、その溶媒和物またはそれらのプロドラッグを含有してなる泌尿器系 疾患、中枢性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、糖尿病、免疫系疾患または消化 器系疾患の予防および Zまたは治療剤；
[ 15]排尿障害の予防および Zまたは治療剤である前記 [14]記載の剤；
[ 16]前記 [ 1 ]記載の方法および Zまたは前記 [13]記載のキットを用 、て得られた 化合物、その塩、その溶媒和物またはそれらのプロドラッグと、 a 1拮抗薬、抗コリン 薬、 5 α—リダクターゼ阻害薬および抗アンドロゲン薬力も選択される 1種以上とを組 み合わせてなる排尿障害の予防および Ζまたは治療剤；
[17] (1)標識されていてもよい高活性型 LPAと、（2) LPA受容体蛋白質、その部分 ペプチドまたはその塩とを用 、ることを特徴とする前記 [ 1 ]記載の方法；
[18]LPA受容体力 EDG—2、 EDG— 4、 EDG—7または GPR23である前記 [17] 記載の方法；
[19] (1) (a)標識されていてもよい高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有す る細胞とを接触させた場合と、（2) (a)標識されていてもよい高活性型 LPAと、 (b)LPA 受容体蛋白質を含有する細胞および (c)試験化合物とを接触させた場合における該 細胞の細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定し、比較することを特徴とする、 前記 [17]記載の方法；
[20] (l) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質、その部分ペプチド またはその塩とを接触させた場合と、（2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受 容体蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および (c)試験化合物とを接触させた場 合における、標識された高活性型 LPAの該 LPA受容体蛋白質、その部分ペプチド またはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、前記 [17]記載 の方法；
[21] (l) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞とを 接触させた場合と、（2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含 有する細胞および (c)試験化合物とを接触させた場合における、標識された高活性型 LPAの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、前記 [17]記載 の方法；
[22] (1) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞の膜 画分とを接触させた場合と、（2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白 質を含有する細胞の膜画分および (c)試験化合物とを接触させた場合における、標 識された高活性型 LPAの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを 特徴とする、前記 [17]記載の方法；
[23]高活性型 LPAに対する抗体；
[24] LPA受容体のシグナル伝達を不活性ィ匕する中和抗体である前記 [23]記載の 抗体；
[25]前記 [23]記載の抗体を含有してなる LPAが関与する疾患の診断薬；
[ 26 ]前記 [ 17]記載のスクリ一ユング方法を用 V、て化合物を選別する工程を含むこと を特徴とする、 LPAが関与する疾患の予防および Zまたは治療物質の製造方法； [27]化学的または酵素的に合成した、一般式 (1)、（Π)または (III)
[0031] [化 12]
H2C-0-R1 H2C— OH H2C-0-R1
I
HO-C-H O R1— O-C-H O H_C— 0、 O
I II I II P '
H2C-0— P-OH H2C-0-P-OH H2C-0^ 、OH
I I
OH OH
( I ) ( I I ) ( I I I )
[0032] [式中、 R1は、酸化、ニトロ化、ニトロソ化、ニトロヒドリルイ匕および Zまたはァミノ化され た脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボ二ル基を表す。ただし、不斉炭 素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいもの とする。 ]で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物；
が、 1個のヒドロペルォキシ基で置換され、 2乃至 3個の二重結合を有する炭 素数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である前記 [27]記載の化合物；
[29]!^が、 [0033] [化 13]
Figure imgf000011_0001
[0034] [式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置であるか、またはそれらが任意の比率で混合し てレ、てもよ 、ものとする。 ]である前記 [28]記載の化合物；
[30]R^\ 1乃至 3個のエポキシ基で置換され、 0または 1乃至 2個の二重結合を有 する炭素数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である前記 [27]記載の化合物； [3 R1が、 [化 14]
Figure imgf000012_0001
[式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合し て 、てもよレ、ものとする。 ]である前記 [30]記載の化合物；
[32]前記 [ 1]記載の方法および Zまたは前記 [ 13]記載のキットを用いて得られた 化合物、その塩、その溶媒和物またはそれらのプロドラッグ；
[33]—般式 (1)、 （Π)または (ΙΠ) [0037] [化 15]
H2C-0-R H2C— OH H2C-0-R
I
HO-C-H O R1— O-C-H O
I II I II H- -° °
H2C-0— P-OH H2C-0-P-OH H2C— O OH
I I
OH OH
( I ) ( I I ) ( I I I )
[0038] [式中、 R1は、酸化、ニトロ化、ニトロソ化、ニトロヒドリルイ匕および Zまたはァミノ化され た脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボ二ル基を表す。ただし、不斉炭 素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいもの とする。 ]で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含有してなる細胞培 養用組成物；
[34]細胞分化制御剤である前記 [29]記載の組成物；および
[35]—般式 (1)、（II)または (ΠΙ)
[0039] [化 16]
H C-0-R1 H2C— OH H2C-0-R1
" I
HO-C-H O R1— O-C-H O
I II I II Η+0Χ0
H2C-0— P-OH H2C-0-P-OH H2C-0 OH
" I I
OH OH
( I ) ( I D ( I I I )
[0040] [式中、 R1は、酸化、ニトロ化、ニトロソ化、ニトロヒドリルイ匕および Zまたはァミノ化され た脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボ二ル基を表す。ただし、不斉炭 素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいもの とする。 ]で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物の化学的または酵素的 製造方法；
等に関する。
[0041] 本発明にお 、て、 LPAとは、前記の一般式 (I)、 (II)または (III)にお 、て、 R1が「 無置換の脂肪族炭化水素基」もしくは「無置換の脂肪族炭化水素カルボニル基」で あるものを意味し、天然に存在するもの、天然に存在しないもののいずれであっても よい。ここで、「無置換の脂肪族炭化水素基」とは、炭素原子および水素原子のみに よって構成される直鎖状の基であればよぐ例えば、アルキル基、アルケニル基、ァ ルキニル基等が含まれる。また、該「無置換の脂肪族炭化水素基」は、脂環式炭化水 素基様構造をその基中に含んでいてもよい。「脂環式炭化水素基様構造」とは、例え ば、低級シクロアルカン、低級シクロアルケン等の脂環式炭化水素から、任意の二個 の水素原子を除いてできる二価の基を意味する。「低級シクロアルカン」としては、例 えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロへキサン等の炭素数 3乃 至 8のシクロアルカン等が挙げられる。「低級シクロアルケン」としては、例えば、シクロ プロペン、 1ーシクロペンテン、 2—シクロペンテン、 3—シクロペンテン、 1ーシクロへキセ ン、 2—シクロへキセン、 3—シクロへキセン、 3—シクロヘプテン等の炭素数 3乃至 8の シクロアルケン等が挙げられる。脂環式炭化水素基様構造を基中に含む脂肪族炭 化水素基としては、例えば、 7—（2 キシルシクロプロピル)ヘプチル基等が挙げら れる。「アルキル基」としては、例えば、メチル、ェチル、プロピル、ブチル、ペンチル、 へキシル、ヘプチル、ォクチル、ノエル、デシル、ゥンデシル、ドデシル、トリデシル、 テトラデシル、ペンタデシル、へキサデシル、ヘプタデシル、ォクタデシル、ノナデシ ノレ、ィコシノレ、へニコシノレ、ドコシノレ、 トリコシノレ、テトラコシノレ、ペンタコシノレ、へキサコ シル、ヘプタコシル、ォクタコシル、ノナコシル、トリアコンチル基等の直鎖状の C1— 3 0アルキル基等が挙げられる。「ァルケ-ル基」としては、例えば、ェテュル、プロべ- ノレ、ブテニノレ、ペンテ二ノレ、へキセニノレ、ヘプテニノレ、ォクテ二ノレ、ノネ二ノレ、ァセニ ル、ゥンデセ -ル、ドデセ -ル、トリデセ -ル、テトラデセ-ル、ペンタデセ -ル、へキ サデセ -ル、ヘプタデセ -ル、ォクタデセ -ル、ノナデセ -ル、ィコセ -ル、へ-コセ ニノレ、ドコセニノレ、 トリコセニノレ、テトラコセニノレ、ペンタコセニノレ、へキサコセニノレ、へ プタコセ -ル、ォクタコセ -ル、ノナコセ -ル、トリアコンテ-ル基等の直鎖状の C2— 3 0ァルケ-ル基等が挙げられる。「アルキ-ル基」としては、例えば、ェチュル、プロピ 二ノレ、ブチニノレ、ペンチ二ノレ、へキシニノレ、へプチ二ノレ、オタチニノレ、ノニニノレ、デシ -ル、ゥンデシ-ル、ドデシ-ル、トリデシ-ル、テトラデシ-ル、ペンタデシュル、へ キサデシ-ル、ヘプタデシュル、ォクタデシ-ル、ノナデシニル、ィコシ -ル、へニコ シニノレ、ドコシニノレ、 トリコシニノレ、テトラコシニノレ、ペンタコシ二ル、へキサコシニノレ、 ヘプタコシ -ル、ォクタコシ -ル、ノナコシ -ル、トリアコンチュル基等の直鎖状の C2 —30アルキニル基等が挙げられる。 [0042] 本発明にお 、て、「無置換の脂肪族炭化水素カルボニル基」とは、前記の「無置換 の脂肪族炭化水素基」にカルボニル基が結合した一価の基を意味する。
[0043] 本発明にお 、て、 LPAは、 R1を構成する炭素鎖の炭素数と、 R1中の二重結合の数 とを用いて、例えば、 R1を構成する炭素鎖の炭素数が 18個で、 R1中の二重結合の 数が 1個であれば、 18: 1— LPAというように表記することもある。
[0044] 本発明にお 、て、好まし ヽ LPAとしては、天然に存在するものが挙げられる。
[0045] また、本発明にお 、て、好まし 、LPAとしては、前記の表記法に倣って、例えば、 1 6:1— LPA、 18:1— LPA、 18:2— LPA、 18:3— LPA、 20:1— LPA、 20:2— LPA、 20:3— LPA、 20:4— LPA、 20:5— LPA、 22:1— LPA、 22:2— LPA、 22:3— LPA 、 22:4—LPA、 22:5—LPA、 22 :6— LPA等が挙げられる。
[0046] 本発明において、より好ましい LPAとしては、哺乳動物、特にヒトの生体内に存在 する LPAが好ましぐ例えば、 22:6— LPA、 20:5— LPA、 20:4— LPA、 18:1— LP A、 18:2—LPA、 18:3—LPA、 16： 1— LPA等が挙げられる。より具体的には、例え ば、 R1として、 cis— Δ9—ォクタデセノィル、 cis, cis-Δ9, Δ 12—才クタデカジエノィル、 全 cis— Δ9, Δ12, Δ15—ォクタデカトリエノィル、全 cis— Δ 5, Δ8, Δ11, Δ14—エイコサ テトラエノィル、 n—ドデカノィル、 n—テトラデカノィル、 n—へキサデカノィル、 n—才クタ デカノィル、 trans— Δ 9—ォクタデセノィル、 cis— Δ 9—へキサデセノィル、 cis— Δ 6—ォ クタデセノィル、（9Z)— 9—才クタデセン— 1 ィル、（9Z, 12Z)— 9, 12—ォクタデカジ ェンー 1 ィル、 (9Z, 12Z, 15Z)— 9, 12, 15—才クタデカトリェンー 1 ィル、 （5Z, 8Z , 11Z, 14Z)-5, 8, 11, 14 エイコサテトラェンー1 ィル、 n—ドデシル、 n—テトラデ シル、 n—へキサデシル、 n—才クタデシル、（9E)— 9—才クタデセン 1 ィル、（9Z)— 9一へキサデンー 1 ィル、（6Z)— 3—ォクタデセン 1 ィル基等を有する一般式 (1)、 ( II)または (III)の化合物等が挙げられる。
[0047] 本発明にお 、て、高活性型 LPAとは、前記 LPAとは異なる構造を有し、 LPA受容 体に結合する物質であり、かつ LPAに比較して実質的に同等以上の活性を示すも のであればよぐその構造は限定されない。ここで、「LPAに比較して実質的に同等 以上の活性を示すもの」としては、例えば、（1)受容体結合活性、または（2)シグナル 情報伝達作用等が、 LPA受容体の公知のリガンドである LPAと比較して、例えば、 約 1倍乃至約 10倍、好ましくは約 1倍乃至約 100倍、より好ましくは約 1倍乃至約 10 00倍である物質を意味する。本発明において、高活性型 LPAは、全ての活性測定 系で LPAを上回る活性を示す必要はなぐ LPAの活性を検出できる試験系の少なく とも一つの系で LPAを上回る活性を示すものであればょ ヽ。受容体結合活性ゃシグ ナル情報伝達作用等の活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、後述するスクリーニング方法や実施例に記載の方法等に従って測定するこ とがでさる。
本発明にお 、て、好ま 、高活性型 LPAとしては、例えば、前記の一般式 (I)、 (II )または (III)において、 R1が酸化、ニトロ化、ニトロソ化、ニトロヒドリル化および/また はァミノ化された脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボニル基であるもの 等が挙げられる。ここで、脂肪族炭化水素基としては、例えば、前記「無置換の脂肪 族炭化水素基」として例示したもの等が挙げられる。脂肪族炭化水素カルボニル基と は、例えば、前記「無置換の脂肪族炭化水素カルボニル基」と同様の意味を表す。「 酸化」とは、その対象となる分子 (ここでは、脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水 素カルボ二ル基を意味する。）に対し、酸素原子が少なくとも 1原子導入されることを 意味し、その他の原子の増減は特に限定されない。具体的には、脂肪族炭化水素 基もしくは脂肪族炭化水素カルボニル基が、水酸基 (一 OH)、ォキソ基（ = 0)、ヒドロ ペルォキシ基 (一 OOH)、エポキシ基 (鎖にある 2個の炭素原子と結合する酸素原子（ O—) )、ェピジォキシ基 (鎖にある 2個の炭素原子と結合する酸素原子 (一 O— O—) ) 、ホルミル基 (-CHO)等の酸素原子含有基を有するに至ることを意味するが、この「 酸化」に伴って、脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボニル基の炭素鎖 が切断されても構わない。「ニトロ化」は、ニトロ基 (-NO )が付加することを意味する
2
。「ニトロソ化」は、ニトロソ基 (-NO)が付加することを意味する。「ニトロヒドリル化」は 、ニトロ基と水酸基が同一炭素原子に付加することを意味する。「ァミノ化」は、「ァミノ 酸付加」を意味し、「アミノ酸付加」とは、任意のアミノ酸が付加することを意味する。 付加するアミノ酸は特に限定されず、また、ペプチドであってもよい。好ましくは、生体 内に通常に存在するアミノ酸 (例えば、 α アミノ酸等)や、そのペプチド等が挙げら れる。ペプチドを構成するアミノ酸の個数は特に限定されない。好ましくは、 2個乃至 10個、より好ましくは 2個乃至 5個、特に好ましくは、 2個（すなわち、ジペプチド）乃至 3個（すなわち、トリペプチド)等が挙げられる。「ァミノ化」する好適なアミノ酸としては 、例えば、システィン、セリン、グルタチオン、グリシルシスティン、 5—グルタミルシステ イン等が挙げられる。前記の「酸化」と同様、これら「ニトロ化」、「ニトロソ化」、「ニトロヒ ドリル化」、「ァミノ化」に伴って、脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボ- ル基の炭素鎖が切断されても構わな 、。
[0049] すなわち、本発明にお 、て、好ま 、高活性型 LPAとしては、例えば、前記の一般 式 (I)、 (II)または (III)にお 、て、 R1が、
[0050] [化 17]
N02
Figure imgf000017_0001
[0051] [式中、 *は不斉炭素を表し、その炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが 任意の比率で混合していてもよいものとし、他の全ての記号は前記と同じ意味を表す o ]
から選択される 1種以上の部分構造を有する脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化 水素カルボニル基であるもの等が挙げられる。
[0052] 尚、本明細書中、前記のように不斉炭素を記号「*」を用いて表記することがあるが 、該記号を付せずとも当業者によって不斉炭素が存在すると判断できる場合、該不 斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよ いものとする。
[0053] 本発明において、より好ましい高活性型 LPAとしては、例えば、前記の一般式 (I)、
(II)または（ΠΙ)にお!/、て、 が [0054] [化 18]
^Y-(CH2)p-^E -A-E2 -(CH2)q— H
\
[0055] [式中、全ての記号は前記と同じ意味を表す。 ]
であるもの等が挙げられる。このうち、特に、
[0056] [化 19]
— (CH2)p1— (T)r一 (CH2)q1— H
[0057] [式中、全ての記号は前記と同じ意味を表す。 ]
で表わされるものが好ましぐとりわけ、 Tとして
[0058] [化 20]
Figure imgf000018_0001
[0059] [式中、全ての記号は前記と同じ意味を表す。 ]
で表わされる構造を少なくとも一つは有するものが好適である。
[0060] また、本発明にお 、ては、前記の好ま 、LPAが酸ィ匕されたものも好ま U、。例え ば、 22:6— LPA、 20:4— LPA、 18:1— LPA、 18:2— LPA、 18:3— LPA、 16:1— L PA等が酸化されたものが好ましぐ例えば、 20:4— LPA、 18:1— LPA、 18:2— LP A、 18 :3— LPA等が酸ィ匕されたものがより好ましい。
[0061] これらのうち、特に R1の炭素数が 18であるものにおいては、 R1がー C H Oまたは
18 31 3 C H Oで示される脂肪族炭化水素カルボニル基であるもの、特に、 R1が 1個のヒ
18 29 3
ドロペルォキシ基で置換され、 2乃至 3個の二重結合を有する炭素数 18個の脂肪族 炭化水素カルボニル基であるものが好ましぐ具体的には、 R1が、 [0062] [化 21]
Figure imgf000019_0001
または
Figure imgf000019_0002
[0063] [式中、すべての記号は前記と同じ意味を表す。 ]である一般式 (I)、（Π)または (III) の化合物が好ましい。
[0064] また同様に、 R1がー C H 0 、—C H 0 、—C H 0 、—C H 0、または C
18 31 2 18 31 3 18 29 2 18 29 3
H Oで示される脂肪族炭化水素カルボ-ル基であるもの、特に R1が 1乃至 3個の
8 29 4
エポキシ基で置換され、 0または 1乃至 2個の二重結合を有する炭素数 18個の脂肪 族炭化水素カルボニル基であるものが好ましぐ具体的には、 R1が、 [0065] [化 22]
Figure imgf000020_0001
または
Figure imgf000020_0002
[0066] [式中、すべての記号は前記と同じ意味を表す。 ]である一般式 (1)、 （Π)または (III) の化合物も好ましい。
[0067] 本発明において、 C1 4アルキレン基としては、例えば、メチレン、エチレン、トリメチ レン、テトラメチレン基およびそれらの異性体基等が挙げられる。
[0068] 本発明において、 C2— 4ァルケ-レン基としては、例えば、エテュレン、プロべ-レ ン、ブテ-レン基およびそれらの異性体基等が挙げられる。
[0069] 本発明にお ヽて、好ま 、高活性型 LPAは、 R1の炭素鎖の長さで規定することも できる。具体的には、高活性型 LPAとして、 R1の主鎖の炭素数が 6個乃至 26個であ るもの等も好ましい。ここで、主鎖の炭素数としては、脂肪族炭化水素カルボ-ル基 におけるカルボ-ル炭素も含まれる。すなわち、 として、酸化、ニトロ化、ニトロソ化 、ニトロヒドリル化および Zまたはァミノ化された、 C6— 26アルキル基、 C6— 26ァルケ -ル基、 C6— 26アルキ-ル基、 C6— 25アルキルカルボ-ル基、 C6— 25ァルケ-ル カルボ-ル基、 C6— 25アルキ-ルカルボ-ル基等が好ましい。特に酸化されたこれ らの基が好ましい。 R1において、より好ましくは、例えば、主鎖の炭素数が 10個乃至 20個であるもの等であり、特に好ましくは、主鎖の炭素数が 16個乃至 20個であるも の等である。
[0070] 本発明にお 、て、前記の高活性型 LPAは、以下の方法によって得ることができる。
例えば、（1)化学的に合成する；（2)生体サンプル力 精製する；（3)酵素的に合成 する；等の何れかの方法によって得ることができる。
[0071] 化学的に合成する場合は、公知の方法、例えば、コンプリへンシヴ 'オーガニック'ト ランスフォーメーションズ：ァ ·ガイド ·トゥ^ ~ ·ファンクショナル ·グループ ·プレパレーシ ヨンズ，セカンド 'エディション（リチャード C.ラロック，ジョンワイリーアンドサンズ Inc, 1999) [し omprehensive Organic Transformations： A uuide to Functional uroup Preparations, 2nd Edition (Richard C. Larock, John Wiley & Sons Inc, 1999)]【こ記載 された方法等）を適宜改良し、組み合わせて用いることによって製造する力、または 前記 LPAを酸ィ匕させることによって得ることができる。 LPAを酸ィ匕させる場合は、酸 ィ匕剤を用いてもよいし、酸素と反応させてもよい。 LPAを酸化剤で処理する場合は、 LPAを含有する任意の溶媒 (例えば、水や有機溶媒 (例えば、クロ口ホルム、メタノー ル、ァセトニトリル等)等）に、適当な酸化剤（例えば、メタクロ口過安息香酸等）を添カロ し、処理すること〖こよって得ることができる。 LPAと酸素を反応させる〖こは、酸素ガスと 接触させてもよいし、空気酸化させてもよい。また、任意の溶媒中の溶存酸素と反応 させてもよい。例えば、適当な容器 (例えば、ナスフラスコ等のある程度の表面積を確 保できるガラス容器等）に LPAを吸着させて適当な温度 (例えば、室温等)で乾燥空 気気流下で保存するか、または LPAを含有する任意の溶媒 (例えば、水や有機溶媒 (例えば、クロ口ホルム、メタノール、ァセトニトリル等)等）を、任意の期間（例えば、 24 時間乃至数日間）、任意の温度 (好ましくは、室温等)でインキュベーションすることに よって得ることができる。
[0072] 生体サンプル力 の精製は、公知の方法、例えば、ゲル濾過等の方法によって得 られたフラクションをシリカゲノレカラムクロマトグラフィーもしくは逆相カラムクロマトダラ フィ一等の精製法に付すことによって行うことができる。また、これらの方法によって、 目的とする高活性型 LPAが混合物として得られた場合には、公知の精製法によって 単離することができる。例えば、シリカゲル (例えば、 Merck7734等）を担体とし、適 当な溶媒、例えば、クロ口ホルム、メタノールおよび水力もなる混合溶媒等を用いてシ リカゲルクロマトグラフィーを行うことにより単離することができる。生体サンプルとして は、例えば、血液等を好適に用いることができる。
[0073] 酵素的に合成する場合は、例えば、ミエ口ペルォキシダーゼ、酸化酵素、 12/15- リポキシゲナーゼ、 P450代謝酵素等を用いることができる。
[0074] これらの製造工程において、原料として用いる LPAは、例えば、後記の参考例に記 載するように、リゾホスファチジルコリンを酵素、例えば、ホスホリパーゼ D等を用いて 酵素的に処理することによって、またはさらに前記の公知の精製方法に付すことによ つて得ることがでさる。
[0075] 本発明において、 LPA受容体蛋白質としては、前記 LPAとの結合能を有し、かつ 、力かる受容体蛋白質を発現する細胞の細胞内にシグナルを伝達しうる受容体蛋白 質であれば、特に制限なく用いることができる。このような受容体蛋白質としては、例 えば、公知の LPA受容体蛋白質である EDG—2、 EDG— 4、 EDG—7ぉょびGPR23 等が好適に用いられるが、これらの蛋白質と実質的に同質の活性を有するか、また はこれらの蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質等も 用いることができる。尚、 EDG— 2、 EDG— 4、 EDG— 7はそれぞれ、 LPA1、 LPA2、 LPA3と称されることもある。ここで、「実質的に同質の活性を有する蛋白質」としては 、例えば、性質的に同質のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用等を有する蛋 白質等が挙げられる。従って、実質的に同質の活性を有する蛋白質としては、リガン ド結合活性やシグナル情報伝達作用等の活性が、前記の公知の受容体蛋白質、す なわち、 EDG—2、 EDG— 4、 EDG— 7および GPR23等の活性と同等（例えば、約 0. 01倍乃至約 100倍、好ましくは約 0. 5倍乃至約 20倍、より好ましくは約 0. 5倍乃至 約 2倍)である蛋白質が好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量等の量 的要素は異なって 、てもよ 、。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用等の活性 の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる力 例えば、後述するスクリーニン グ方法に従って測定することができる。「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白 質」としては、例えば、前記の公知の受容体蛋白質、すなわち、 EDG—2、 EDG— 4、 EDG— 7および GPR23等の蛋白質のアミノ酸配列と約 50%以上、好ましくは約 60 %以上、より好ましくは約 70%以上、さらに好ましくは約 80%以上、なかでも好ましく は約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する 蛋白質等が挙げられる。
[0076] 本発明において、前記の LPA受容体蛋白質は、その由来に限定されない。例えば 、ヒトゃ哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ゥサギ、ブタ、ヒッジ、ゥシ、サル 等）のあらゆる細胞 (例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄細胞 、メサンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽 細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例えば、マクロファージ、 T細胞、 B 細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球等）、巨 核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしく は間質細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞等)や血球系 の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位 (例 えば、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延 髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質等)、脊髄、下垂体、 胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化 管 (例えば、大腸、小腸等)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、 前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋等に由来する蛋白質であ つてもよく、また合成蛋白質であってもよい。
[0077] また、本発明における LPA受容体蛋白質は、前記の LPA受容体蛋白質の他、そ れらのアミノ酸配列に対し、幾つかのアミノ酸が付加、欠失および Zまたは置換等の 修飾が起こったアミノ酸配列を含有する受容体蛋白質等であってもよい。また、本発 明における LPA受容体蛋白質は、所望によって、分子内の任意の官能基 (例えば、 カルボキシル基、アミノ基、水酸基、チオール基等）が、受容体としての機能を失わな い程度に、任意の置換基によって置換されていてもよぐまた、糖鎖が結合していて ちょい。
[0078] 本発明において、前記受容体蛋白質の部分ペプチド (以下、部分ペプチドと略記 する場合がある。）としては、前記の受容体蛋白質の部分ペプチド、またはその部分 ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドであれば何れのものであつ てもよいが、好適には、前記の受容体蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出してい る部位であって、実質的に同質のリガンド結合活性を有するもの等が用いられる。前 記の公知の受容体蛋白質、すなわち、 EDG—2、 EDG— 4、 EDG—7および GPR23 等の部分ペプチドとしては、例えば、疎水性プロット解析において細胞外領域 (親水 性 (Hydrophilic)部位)であると分析された部分を含むペプチド等が挙げられる。ま た、疎水性 (Hydrophobic)部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる 。個々のドメインを個別に含むペプチドも用いることができる力 複数のドメインを同時 に含む部分のペプチドであってもよ 、。本発明にお 、て用いられる部分ペプチドの アミノ酸の数は、前記した受容体蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 20個以 上、好ましくは 50個以上、より好ましくは 100個以上であることが好ましい。ここで、「 実質的に同一のアミノ酸配列」とは、前記の受容体蛋白質の部分ペプチドのアミノ酸 配列と約 50%以上、好ましくは約 60%以上、より好ましくは約 70%以上、さらに好ま しくは約 80%以上、なかでも好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の 相同性を有するアミノ酸配列を意味する。また、「実質的に同質のリガンド結合活性」 とは、性質的に同質のリガンド結合活性を意味し、前記の受容体蛋白質のリガンド結 合活性と同様に測定することができる。
[0079] また、本発明における部分ペプチドは、前記の部分ペプチドの他、それらのアミノ酸 配列に対し、幾つかのアミノ酸が付加、欠失および/または置換等の修飾が起こつ たアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等であってもよい。また、本発明における部 分ペプチドは、所望によって、分子内の任意の官能基 (例えば、カルボキシル基、ァ ミノ基、水酸基、チオール基等)が、リガンド結合活性を失わない程度に、任意の置 換基によって置換されていてもよぐまた、糖鎖が結合していてもよい。
[0080] 本発明にお 、て、前記受容体蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、酸ま たは塩基との生理学的に許容される塩等が挙げられ、とりわけ生理学的に許容され る酸付加塩等が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン 酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン 酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、 メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が用いられる。
[0081] 本発明において、前記の LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩は、 公知の方法によって得ることができる。本発明における LPA受容体蛋白質またはそ の塩は、前記したヒトゃ哺乳動物の細胞または組織力 公知の受容体蛋白質の精製 方法によって製造することができる。また、力かる受容体蛋白質をコードする DNAを 含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。さらに、公知の 蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。 LPA受容体蛋白質を得る 方法は、例えば、国際公開第 97Z00952号パンフレット、国際公開第 96Z39436 号パンフレット、特開平 10-210993号公報、特開平 11— 18788号公報、国際公開 第 99Z29887号パンフレット、国際公開第 99/24569号パンフレット等に詳細に記 述されている。ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトゃ哺乳動物 の組織または細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液を 逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合 わせることにより精製単離することができる。本発明における部分ペプチドまたはその 塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチ ダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例 えば、固相合成法、液相合成法等を用いることができる。
[0082] 本発明において、高活性型 LPAの標識に用いる標識物質としては、例えば、放射 性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等を用いることができる。放射性同位元素と しては、例えば、 125ι、 131ι、 ¾、 14C、 32P等が用いられる。酵素としては、例えば、 β— ガラクトシダーゼ、 j8—ダルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネート等が用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノ ール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が用いられる。
[0083] 本発明の高活性型 LPAは、安全で低毒性であるので、スクリーニングツールとして 用!/、ることができる。
[0084] 本発明のスクリーニング方法は、（1)標識されていてもよい高活性型 LPAと、 (2) L PA受容体蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩とを用いることを特徴とする。これ らの物質を用いて、特定の機能を有する物質、例えば、 LPAが関与する疾患の予防 および Zまたは治療物質を見出す場合、それは全て本発明に包含される。本発明の スクリーニング方法は、例えば、（1) (a)標識されていてもよい高活性型 LPAと、 (b)LP A受容体蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩とを接触させた場合と、（2) (a)標識 されていてもよい高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまたは その塩、および (c)試験化合物とを接触させた場合との比較を行うことによって行われ る。ここで、本発明のスクリーニング方法に用いる LPA受容体蛋白質、その部分ぺプ チドまたはその塩は、リガンド結合活性を損なって!/、なければどのような状態のもので あってもよい。例えば、単離された状態であってもよいし、細胞に発現した状態のもの であってもよい。また、力かる細胞力も調製した膜画分の状態であってもよいし、さら には生体 (例えば、哺乳動物等)であってもよい。本発明のスクリーニング方法におい て、 LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩と、リガンドである高活性型 LPAの結合を測定する方法は、力かる LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまた はその塩の状態に応じて適宜変更することができる。例えば、単離された状態や、膜 画分の状態、または細胞に発現した状態であれば、結合アツセィを用いることができ る。また、細胞に発現した状態であれば、細胞に起こる現象 (例えば、細胞内のサイク リック AMP (cAMP)やカルシウムイオン濃度の増減、特定の蛋白質もしくはそれをコ ードする mRNAの増減、あるいは細胞外への特定の蛋白質の分泌等）を指標にする ことができる。哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ィヌ等）を用いるのであれば、かかる 生体に起こる現象を指標にすることができる。また、所望によって、生体力も摘出した 特定の組織を用いて評価を行うこともできる。例えば、気管やその他の平滑筋もしく は腸管等を用いたマグヌス試験等であってもよ 、。 [0085] 本発明において、好ましいスクリーニング方法としては、例えば、以下の [I]乃至 [I V]の方法等が挙げられる。 [I] (1) (a)標識されていてもよい高活性型 LPAと、 (b)LP A受容体蛋白質を含有する細胞とを接触させた場合と、 (2) (a)標識されて!ヽてもよ！/ヽ 高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞、および (c)試験化合物とを 接触させた場合における該細胞の細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定し比 較することを特徴とするスクリーニング方法。 [II] (l) (a)標識された高活性型 LPAと、 (b)LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩とを接触させた場合と、 (2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまたはそ の塩、および (c)試験化合物とを接触させた場合における、標識された高活性型 LPA の該 LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し 比較することを特徴とするスクリーニング方法。 [III] (l) (a)標識された高活性型 LPA と、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞とを接触させた場合と、（2) (a)標識された 高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞、および (c)試験化合物とを 接触させた場合における、標識された高活性型 LPAの該細胞に対する結合量を測 定し比較することを特徴とするスクリーニング方法。 [IV] (1) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞の膜画分とを接触させた場合と、 (2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞の膜画分、お よび (c)試験化合物とを接触させた場合における、標識された高活性型 LPAの該細 胞の膜画分に対する結合量を測定し比較することを特徴とするスクリーニング方法。 結合量の測定、すなわち結合アツセィゃ細胞内カルシウムイオン濃度の上昇活性の 測定は公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
[0086] 前記のスクリーニング方法において、 LPA受容体蛋白質を含有する細胞を用い、 細胞内カルシウムイオン濃度の上昇活性の測定を指標とする場合、まず、 LPA受容 体蛋白質を含有する細胞をマルチウヱルプレート等に培養し、所望によって新鮮な 培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換した後に、試験化合物 および Zまたは本発明の高活性型 LPA等を添加して一定時間インキュベートした後 、細胞を抽出して、カルシウムイオン濃度を定量する方法等が好適に用いられる。
[0087] 前記のスクリーニング方法にぉ 、て、 LPA受容体蛋白質を含有する細胞もしくはそ の膜画分を用いる場合、該細胞をダルタルアルデヒド、ホルマリン等で固定ィ匕して用 いてもよい。固定ィ匕の方法は公知の方法に従って行なうことができる。 LPA受容体蛋 白質を含有する細胞としては、該 LPA受容体蛋白質を発現した宿主細胞等が好適 に用いられる。ここで、宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細 胞等が好ましい。また、 LPA受容体蛋白質の発現量力スクリーニング系に適用可能 な量であれば、正常細胞を用いることも可能である。細胞膜画分としては、細胞を破 砕した後、公知の方法によって得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細 胞の破砕方法としては、 Potter~Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方 法、ワーリングブレンダーゃポリトロン（キネマティ力（Kinematica)社製）による破砕、 超音波による破砕、フレンチプレス等で加圧しながら細胞を細 ゾズルから噴出させ ること〖こよる破砕等が挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配 遠心分離法等の遠心力による分画法が好ましく用いられる。例えば、細胞破砕液を 低速（例えば、約 500rpm乃至約 3000rpm等）で短時間（例えば、約 1分乃至約 10 分等)遠心し、上清をさらに高速 (例えば、約 15000rpm乃至約 30000rpm等)で通 常約 30分乃至約 2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発 現した LPA受容体蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質等の膜成分が多く含ま れる。該 LPA受容体蛋白質を含有する細胞や膜画分中の LPA受容体蛋白質の量 は、 1細胞当たり 103乃至 108分子であることが好ましぐ 105乃至 107分子であること が好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド (すなわち、 LPAもし くは高活性型 LPA)結合活性 (比活性)が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築 が可能になるば力りでなぐ同一ロットで大量の試料を測定することが可能となる。 本発明のスクリーニング方法において得られた、 LPA受容体への結合活性を示す 化合物には、 LP A受容体のァゴニストおよびアンタゴ-ストが含まれる。 LPA受容体 への結合活性を示す化合物群から、 LPA受容体のァゴニストまたはアンタゴニストを 選別するためには、例えば、（1)化合物単独でのシグナル情報伝達作用の有無を確 認する；（2)化合物存在下、 LPAもしくは高活性型 LPAを添加した場合のシグナル 情報伝達作用の有無を確認する；等の試験を行えばよ!ヽ。シグナル情報伝達作用の 有無は、例えば、前記のように、細胞に起こる現象や組織'生体に起こる現象等を指 標にすることで確認することができる。
本発明にお 、て、標識されて!、てもよ 、高活性型 LPAを用いることを特徴とする、 LPAが関与する疾患の予防および Zまたは治療物質のスクリーニング用キットは、 (a)標識されて ヽてもよ 、高活性型 LPA、および (b)LPA受容体蛋白質を含有する細 胞またはその膜画分を中心に構成されるものである。本発明のスクリーニング用キット の例としては、例えば、次のものが挙げられる。
1.スクリーニング用試薬
(a)測定用緩衝液および洗浄用緩衝液: Hanks' Balanced Salt Solution (ギブ コ（Gibco)社製）に、 0.05%のゥシ血清アルブミン (シグマ（Sigma)社製)等を加え たもの。孔径 0.45 μ mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、あるいは用時 調製してもよい。；（b) LPA受容体蛋白質標品: LPA受容体蛋白質を発現させたチヤ ィニーズノヽムスターオーバリー（Chinese Hamster Ovary、 CHO)細胞を、 12穴 プレートに 5 X 105個 Zゥエルで継代し、 37°C、 5%CO 、 95%air
2 で 2日間培養した もの。；（c)標識された高活性型 LPA:市販の〔 〕、〔12¾、〔14C〕、〔35S〕等で標識し た高活性型 LPAを含有する溶液。 4°Cあるいは 20°Cにて保存し、用時に測定用緩 衝液にて 1 μ Μに希釈する。； (d)高活性型 LPA標準液：高活性型 LPAを 0.1 %ゥシ 血清アルブミン（シグマ（Sigma)社製）を含む PBSで ImMとなるように溶解し、—20 °Cで保存する。
2.測定法
(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した LPA受容体蛋白質発現チャイニーズノヽム スターオーバリー（Chinese Hamster Ovary、 CHO)細胞を、測定用緩衝液 lm Lで 2回洗浄した後、 490 Lの測定用緩衝液を各ゥエルに加える。； (b) 10— 3乃至 1 0— 1GMの試験化合物溶液を 5 μ L加えた後、標識された高活性型 LPAを 5 μ L加え、 室温にて 1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに 10— 3Μの高活性型 LPAを 5 Lカ卩えておく。；（c)反応液を除去し、 lmLの洗浄用緩 衝液で 3回洗浄する。細胞に結合した標識された高活性型 LPAを 0.2N NaOH-1 %SDSで溶解し、 4mLの液体シンチレーター A (和光純薬製）と混合する。（d)液体 シンチレーシヨンカウンター（ベックマン (Beckman)社製）を用いて放射活性を測定 し、 Percent Maximum Binding (PMB)を式 {PMB= [ (B— NSB) / (BO— NSB ) ] X 100}で求める。ここで、 PMBは Percent Maximum Bindingを表し、 Bは検 体をカ卩えた時の値を表し、 NSBは Non— specific Binding (非特異的結合量）を表 し、 B0は最大結合量を表す。
[0090] 本発明にお ヽて、高活性型 LPAに対する抗体は、高活性型 LPAを認識し得る抗 体であればよぐポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れであってもよ！/ヽ 。本発明の高活性型 LPAに対する抗体は、（1)本発明の高活性型 LPA、（2)高活 性型 LPAとキャリアー蛋白質との複合体、あるいは（3)アミノ基ゃカルボキシル基を 高活性型 LPA側鎖に有する誘導体とキャリアー蛋白質との複合体等を抗原として用 いて、公知の抗体もしくは抗血清の製造法に従って製造することができる。具体的な 方法について、以下に一例を示す。
[0091] 〔モノクローナル抗体の作製〕
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の高活性型 LPAは、単独で、または担体や希釈剤とともに哺乳動物に対して 投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不 完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 2乃至 6週毎に 1回ずつ、 計 2乃至 10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ゥサギ 、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ等が挙げられる力 マウスおよびラット が好ましく用いられる。また、投与部位は特に限定されず、抗体産生が可能な部位で あればよい。モノクローナル抗体産生細胞の作製は、抗原を免疫された温血動物、 例えば、マウス力も抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の 2乃至 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合さ せることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血 清中の抗体価の測定は、例えば、前記の標識された高活性型 LPAと抗血清とを反 応させたのち、抗体に結合した標識物質の活性を測定することにより行なうことができ る。骨髄腫細胞との融合操作は公知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔 ネイチヤー（Nature)、 256卷、 495頁（1975年）〕に従って行うことができる。融合を 促進するために、例えば、ポリエチレングリコール (PEG)やセンダイウィルス等、好ま しくは、 PEG等が用いられる。ここで、骨髄腫細胞としては、例えば、 NS— 1、 P3U1、 SP2Z0等が挙げられる力 P3U1が好ましい。用いられる抗体産生細胞 (脾臓細胞 )数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1： 1乃至 20 : 1程度であり、 PEG (好ましくは 、 PEGIOOO乃至 PEG6000)が 10乃至 80%程度の濃度で添カ卩され、約 20乃至 40 °C、好ましくは約 30乃至 37°Cで約 1乃至 10分間インキュベートすることにより効率よ く細胞融合を実施できる。
[0092] モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用で きるが、例えば、抗原、すなわち高活性型 LPAを直接あるいは担体とともに吸着させ た固相（例えば、マイクロプレート等）にノ、イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射 性物質や酵素等で標識した抗免疫グロブリン抗体 (細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテイン Aをカロえ、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプ 口ティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素 等で標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出 する方法等が挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる 方法に従って行なうことができる力 通常は HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ ミジン)を添加した動物細胞用培地等で行なうことができる。選別および育種用培地と しては、ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。例え ば、 1乃至 20%、好ましくは 10乃至 20%の牛胎児血清を含む RPMI— 1640培地、 1 乃至 10%の牛胎児血清を含む GIT培地 (和光純薬製)またはハイプリドーマ培養用 無血清培地 (SFM— 101、 日水製薬製)等を用いることができる。培養温度は、通常 20乃至 40°C、好ましくは約 37°Cである。培養時間は、通常 5日乃至 3週間、好ましく は 1週間乃至 2週間である。培養は、通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイ プリドーマ培養上清の抗体価は、前記の抗血清中の抗体価の測定と同様に行うこと ができる。
[0093] (b)モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に 免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。このような精製法としては、 例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体 (例 えば、 DEAE等）による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相、またはプ 口ティン Aあるいはプロテイン G等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解 離させて抗体を得る特異的精製法等が挙げられる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
ポリクローナル抗体は、公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造すること ができる。例えば、免疫抗原である高活性型 LPAとキャリアー蛋白質との複合体を作 成し、前記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、かか る免疫動物力 本発明の高活性型 LPAに対する抗体を含有するものを採取して、抗 体の分離精製を行なうことによって製造することができる。哺乳動物を免疫するため に用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体において、キャリアー蛋白質の 種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハ プテンに対して抗体が効率良く作成できるものであれば、どの様なものをどの様な比 率で架橋させてもよいが、例えば、ゥシ血清アルブミン、ゥシサイログロブリン、キーホ ール 'リンペット'へモシァニン等を、重量比でハプテン 1に対し、約 0.1乃至約 20、好 ましくは約 1乃至約 5の割合でカップルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキ ャリア一のカップリングには、種々の縮合剤を用いることができる力 ダルタルアルデ ヒドゃカルポジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有 する活性エステル試薬等が好適に用いられる。縮合生成物は、単独で、または担体 や希釈剤とともに哺乳動物に対して投与される。また、投与部位は特に限定されず、 抗体産生が可能な部位であればよい。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ 、。投与は通常
2乃至 6週毎に 1回ずつ、計 2乃至 10回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、前 記の免疫された哺乳動物の血液、腹水等、好ましくは血液力 採取することができる 。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、前記の血清中の抗体価の測定と同様 にして測定することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、前記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる [0095] 本発明において、高活性型 LPAに対する抗体は、高活性型 LPAを特異的に認識 することができるので、被験液中の高活性型 LPAの定量、特にサンドイッチ免疫測定 法による定量等に使用することができる。本発明の高活性型 LPAに対する抗体は、 例えば、疾患の診断等に用いることできる。例えば、ある疾患の患者から採取した生 体サンプル (好ましくは、病変部位組織や血液等）における高活性型 LPAの量を測 定し、正常組織や健常人サンプルにおける高活性型 LPAの量と比較することで、か 力る疾患が LPAが関与する疾患である力否かを判定することができる。疾患が、 LP Aが関与する疾患であった場合は、例えば、以下に示す中和抗体や、本発明のスク リ一二ング方法もしくはスクリ一二ング用キットを用 、て得られた LPAが関与する疾患 の治療物質を投与することで、効果的に疾患を治療することができる。また、健常人 力も採取した生体サンプルであっても、高活性型 LPAの量力 通常健常人で得られ る値に比べて多いものであれば、本発明のスクリーニング方法もしくはスクリーニング 用キットを用いて得られた LPAが関与する疾患の予防物質を投与することで、 LPA が関与する疾患の発症を効果的に予防することができる。
[0096] 本発明にお 、て、高活性型 LPAに対する中和抗体とは、高活性型 LPA力LPA受 容体蛋白質に対して結合することを阻害し、かつ LPA受容体蛋白質からのシグナル 伝達機能を不活性化する抗体を意味する。従って、本発明の高活性型 LPAに対す る抗体が中和抗体である場合は、前記の目的以外に、高活性型 LPAおよび Zまた は LPA受容体の関与するシグナル伝達、例えば、 LPA受容体蛋白質を介する細胞 刺激活性 (例えば、ァラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウムイオン 濃度上昇、細胞内サイクリック AMP (cAMP)生成、細胞内サイクリック GMP (cGMP )生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c-fos の活性化、 pHの低下等を促進する活性または抑制する活性等)を不活性ィ匕すること ちでさる。
[0097] 本発明にお 、て、高活性型 LPAは、前記のスクリーニング方法や前記の抗体作成 等に用いることができる他、一般的に用いられる細胞培養用基礎培地に混合して細 胞培養用組成物として用いることができる。高活性型 LPAを含有する細胞培養用組 成物は、細胞分ィ匕制御剤としての作用を有しているため、例えば、未分化な細胞を 特定の機能を有する細胞に分化させたり（分化誘導作用）、あるいは未分化な細胞が 自律的もしくは他律的に分ィ匕する現象を抑制したり（分ィ匕抑制作用）することができる 。ここで、未分ィ匕な細胞とは、前記の LPA受容体蛋白質を発現する細胞であって、 特定の刺激によって増殖可能であり、かつ特定の刺激によって特定の機能を有する 細胞に分ィ匕可能な細胞を意味し、その由来によって限定されるものではない。細胞 の由来は、動物、特に哺乳動物であるものが好ましぐとりわけ、ヒトであることが好ま しい。例えば、胚性幹細胞、外胚葉幹細胞、中胚葉幹細胞、内胚葉幹細胞、間葉系 幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、脾幹細 胞、皮膚幹細胞、網膜幹細胞、毛包幹細胞、骨前駆細胞、脂肪前駆細胞、軟骨細 胞、毛母細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞等の細胞や、これらの細胞の 分ィ匕系譜内の細胞等といった細胞が好ましく用いられる。
[0098] 高活性型 LPAとの混合に用いられる細胞培養用基礎培地は特に限定されず、例 えば、ダルベッコの改変イーグル培地、ウイリアムズ E培地、ハムの F— 10培地、 F— 1 2培地、 RPMI - 1640培地、 MCDB153培地、 199培地等の従来より細胞培養用基 礎培地として知られている培地を使用することができる。また、細胞培養用基礎培地 には、所望によって抗生物質ゃ抗黴物質を添加することもできる。またさらに、細胞 培養用基礎培地には、さらに所望によって、血清 (例えば、ゥシ胎児血清 (FBS)、ゥ マ血清（Horse Serum)等）、インシュリン、 EGF、 FGF2、 bFGF、インターロイキン (IL)、幹細胞増殖因子（SCF)、エリスロポイエチン（EPO)、インターフェロン（IFN) 、トロンボポイエチン (TPO)、腫瘍壊死因子 (TNF)、コロニー刺激因子 (CSF)、デ キサメタゾン、 j8—リン酸グリセロール、ァスコルビン酸、 TGF— j8、 1ーメチルー 3—イソ ブチルキサンチン（1 methyl— 3— isobutylxanthine)、インドメタシン等の、それ自 体分ィ匕誘導活性を有するような添加物も適宜加えることができる。
[0099] 高活性型 LPAを含有する細胞培養用組成物を用いて細胞培養を行なう場合は、 高活性型 LPAの濃度、作用させる時間、細胞密度、その他の培養条件 (例えば、力 ルチヤーディッシュのコーティングの有無等)等は、培養する細胞の種類に応じて適 宜変更すればよ!ヽ。高活性型 LPAを含有する細胞培養用組成物によって培養した 細胞が分ィ匕した力否かの判別の方法は公知の方法で行なうことができる。例えば、培 養した細胞がそれぞれの分化段階に応じて特徴的に発現する蛋白質や mRNA等を 指標に用いて検出することが好ましい。
[0100] 高活性型 LPAを含有する細胞培養用組成物を用いて培養した細胞は、種々の用 途に用いることができる。例えば、生体から採取した未分化細胞を、高活性型 LPAを 含有する細胞培養用組成物を用いて培養し分化させることで、細胞移植用の細胞を 調製することができる。
[0101] [異性体]
本発明においては、特に指示しない限り異性体はこれを全て包含する。例えば、ァ ルキル基、アルコキシ基およびアルキレン基等には直鎖のものおよび分枝鎖のもの が含まれる。さらに、二重結合、環、縮合環における異性体 (E、 Z、シス、トランス体） 、不斉炭素の存在等による異性体 (R、 S体、《、 j8体、ェナンチォマー、ジァステレ ォマー）、旋光性を有する光学活性体 (D、 L、 d、 1体)、クロマトグラフ分離による極性 体 (高極性体、低極性体)、平衡ィ匕合物、これらの任意の割合の混合物、ラセミ混合 物は、全て本発明に含まれる。また、本発明においては、互変異性による異性体をも 全て包含する。
[0102] 本発明においては、前記したように、不斉中心となる炭素原子を、 *を付すことによ つて表示する場合がある。 *を付した炭素原子は、 R配置、 S配置である力、またはそ れらが任意の比率で混合していてもよい。また、記号「*」を付せずとも当業者によつ て不斉炭素が存在すると判断できる場合、該不斉炭素は、 R配置、 S配置であるか、 またはそれらが任意の比率で混合して 、てもよ 、ものとする。
[0103] 本発明にお 、ては、結合部位を矢印で表記する場合がある。 2以上の矢印を有す る構造は、それらの矢印が結合可能な位置に結合していればよぐその方向は限定 されない。
[0104] 本発明においては、特に断わらない限り、当業者にとって明らかなように記号
[0105] [化 23]
、、、、
[0106] は紙面の向こう側（すなわち a配置）に結合していることを表し、 [0107] [化 24]
z
[0108] は紙面の手前側（すなわち β配置）に結合して 、ることを表し、
[0109] [化 25]
Ζ
[0110] は α配置、 /3配置またはそれらの任意の比率の混合物であることを表し、
[0111] [化 26]
Ζ
[0112] は、 α配置と j8配置の任意の比率の混合物であることを表す。
[0113] [塩および溶媒和物]
本発明のスクリ一-ング方法もしくはスクリ一-ング用キットを用 、て得られる化合物
(以下、本発明によって導かれる化合物と略記する場合がある。）は、塩を形成してい てもよく、また N—ォキシド体ゃ四級アンモ-ゥム塩であってもよい。さらにこれらのィ匕 合物は、溶媒和物であってもよい。本発明によって導かれる化合物の塩としては薬理 学的に許容されるもの全てが含まれる。薬理学的に許容される塩は毒性のない、水 溶性のものが好ましい。適当な塩として、例えば、アルカリ金属（例えば、カリウム、ナ トリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等） の塩、アンモ-ゥム塩（例えば、テトラメチルアンモ -ゥム塩、テトラプチルアンモ-ゥ ム塩等）、有機アミン (例えば、トリェチルァミン、メチルァミン、ジメチルァミン、シクロ ペンチルァミン、ベンジルァミン、フエネチルァミン、ピぺリジン、モノエタノールァミン 、ジエタノールァミン、トリス（ヒドロキシメチル)メチルァミン、リジン、アルギニン、 N—メ チルー D—ダルカミン等）の塩、酸付加物塩 [例えば、無機酸塩 (例えば、塩酸塩、臭 化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等）、有機酸塩 (例えば、酢 酸塩、トリフルォロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シユウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸 塩、安息香酸塩、クェン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンス ルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、ダルコン酸塩 等)等]等が挙げられる。本発明によって導かれる化合物の N—才キシド体とは、本発 明によって導かれる化合物の窒素原子が、酸化されたものを表す。また、本発明によ つて導かれる化合物の N—才キシド体は、さらに前記の塩を形成していてもよい。本 発明によって導かれる化合物の四級アンモ-ゥム塩とは、本発明によって導かれる 化合物の窒素原子が、 基 ( 基は、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基 、置換基を有していてもよい環状基を表す。 )によって四級化されたものを表す。本発 明によって導かれる化合物の四級アンモ-ゥム塩は、さらに前記の塩、前記の N—ォ キシド体を形成していてもよい。本発明によって導かれる化合物、その塩、その N—才 キシド体、その四級アンモ-ゥム塩の適当な溶媒和物としては、例えば、水、アルコ ール系溶媒 (エタノール等)等の溶媒和物等が挙げられる。溶媒和物は非毒性かつ 水溶性であることが好ましい。本発明によって導かれる化合物は、公知の方法で前 記の塩、前記の N—ォキシド体、前記の四級アンモニゥム塩、前記の溶媒和物に変換 することができる。
[0114] 本発明の高活性型 LPAは、塩を形成していてもよぐまた溶媒和物であってもよい 。これらの塩や溶媒和物としては、前記の本発明のスクリーニング方法もしくはスクリ 一-ング用キットを用いて得られる化合物の塩や溶媒和物と同様のものが好ましく用 いられる。
[0115] [プロドラッグ]
本発明において、本発明によって導かれる化合物のプロドラッグは、生体内におい て酵素や胃酸等による反応により本発明によって導かれる化合物に変換する化合物 をいう。本発明によって導かれる化合物のプロドラッグとしては、例えば、本発明によ つて導かれる化合物がアミノ基を有する場合、該ァミノ基がァシル化、アルキル化、リ ン酸化された化合物（例えば、本発明によって導かれる化合物のァミノ基がエイコサ ノィル化、ァラ-ル化、ペンチルァミノカルボ-ル化、（ 5—メチルー 2 ォキソ—1, 3—ジ ォキソレン 4 ィル)メトキシカルボ-ル化、テトラヒドロフラ-ル化、ピロリジルメチル ィ匕、ビバロイルォキシメチル化、ァセトキシメチル化、 tert—ブチルイ匕されたィ匕合物等） ；本発明によって導かれる化合物が水酸基を有する場合、該水酸基がァシル化、ァ ルキル化、リン酸化、ホウ酸化されたィ匕合物 (例えば、本発明によって導かれる化合 物の水酸基がァセチル化、パルミトイル化、プロパノィル化、ビバロイル化、サクシ二 ル化、フマリル化、ァラニル化、ジメチルァミノメチルカルボ二ルイ匕された化合物等）； 本発明によって導かれる化合物がカルボキシ基を有する場合、該カルボキシ基がェ ステル化、アミドィ匕されたィ匕合物（例えば、本発明によって導かれる化合物のカルボ キシ基がェチルエステル化、フエ-ルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメ チルァミノメチルエステル化、ビバロイルォキシメチルエステル化、エトキシカルボ- ルォキシェチルエステル化、フタリジルエステル化、（ 5—メチルー 2 ォキソ—1, 3—ジ ォキソレン 4 ィル）メチルエステル化、シクロへキシルォキシカルボ-ルェチルエス テル化、メチルアミドィ匕されたィ匕合物等）；等が挙げられる。これらの化合物は自体公 知の方法によって製造することができる。また、本発明によって導かれる化合物のプ ロドラッグは水和物および非水和物のいずれであってもよい。また、本発明によって 導かれる化合物のプロドラッグは、廣川書店 1990年刊「医薬品の開発」第 7卷「分子 設計」 163乃至 198頁に記載されているような、生理的条件で本発明によって導かれ る化合物に変化するものであってもよい。さらに、本発明によって導かれる化合物は 同位元素 (例えば3 H、 "C、 35S、 1251等)等で標識されていてもよい。
[0116] [医薬品への適用]
本発明のスクリ一-ング方法もしくはスクリ一-ング用キットを用 、て得られる化合物
、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグは、哺乳動物（例えば、ヒト、非 ヒト動物、例えば、サル、ヒッジ、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネコ、ゥサギ、ラット、マウス等）に対 して、高活性型 LPAと LPA受容体の結合をモジュレートするので、 LPAが関与する 疾患、例えば、泌尿器系疾患、中枢性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、糖尿病 、免疫系疾患または消ィ匕器系疾患等の予防および Zまたは治療剤として用いること ができる。
[0117] 本発明のスクリ一ユング方法もしくはスクリ一ユング用キットを用 、て得られる化合物 、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグは、特に泌尿器系疾患の予防 および Zまたは治療に有用である。 LPA受容体ァゴニストは尿道を収縮させるので 尿失禁 (例えば、尿道機能の衰えからくる腹圧性尿失禁、痴呆性尿失禁、反射性尿 失禁、溢流性尿失禁、切迫性尿失禁、全尿失禁、機能性尿失禁、溢流性尿失禁等） の予防および Zまたは治療に有用であり、 LPA受容体アンタゴ-ストは尿道を弛緩 させるので尿道および前立腺の収縮を抑制し、排尿困難 (例えば、排尿開始遅延、 排尿時間延長、尿線細小、間欠排尿、二段排尿等)、尿閉、頻尿、夜間頻尿等の蓄 尿障害に、さらにはコレラなどの感染症の症状からくる排尿痛等の予防および zまた は治療に有用であり、また、尿道や前立腺を弛緩させるので前立腺肥大症の予防お よび Zまたは治療に有用である。
[0118] 「LPAが関与する疾患」とは、前記に列挙した疾患に限定されず、該疾患の形成、 増悪および Zまたは継続に LPAが関与することが知られている疾患、および LPAの 関与が今後見出される疾患を全て包含する。
[0119] また、本発明の高活性型 LPAに対する抗体、特に中和抗体は、前記の診断剤とし ての用途のほかに、高活性型 LPAおよび Zまたは LPA受容体の関与するシグナル 伝達、例えば、 LPA受容体蛋白質を介する細胞刺激活性 (例えば、ァラキドン酸遊 離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウムイオン濃度上昇、細胞内サイクリック AM P (cAMP)生成、細胞内サイクリック GMP (cGMP)生成、イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c fosの活性化、 pHの低下等を促進 する活性または抑制する活性等)を不活性ィ匕することもできるので、ヒト化抗体とする ことで、本発明のスクリ一ユング方法もしくはスクリ一ユング用キットを用 、て得られる 化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグと同様に、哺乳動物 (例 えば、ヒト、非ヒト動物、例えば、サル、ヒッジ、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネコ、ゥサギ、ラット、 マウス等）に対して、 LPAが関与する前記の疾患の予防および Zまたは治療剤とし て用いることができる。本発明の高活性型 LPAに対する抗体を医薬として用いるに は、一般的な抗体医薬の処方に準じて行えばよい。
[0120] 本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッ グを前記の目的で用いるには、通常、医薬組成物として、全身的または局所的に、 経口または非経口の形で投与される。
[0121] 投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、 通常、成人一人あたり、 1回につき、 lmgから lOOOmgの範囲で、 1日 1回力も数回経 口投与される力、または成人一人あたり、 1回につき、 lmgから lOOmgの範囲で、 1 日 1回から数回非経口投与 (好ましくは、静脈内投与)されるか、または 1日 1時間か ら 24時間の範囲で静脈内に持続投与される。
[0122] もちろん前記したように、投与量は、種々の条件によって変動するので、前記投与 量より少な 、量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
[0123] 本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッ グを投与する際には、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている自体公知の手 段に従って、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれら のプロドラッグをそのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、 内服用固形剤 (例えば、錠剤 (糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、散剤、丸剤 、顆粒剤、カプセル剤等)、内服用液剤、外用液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬 製剤とすることで、経口的または非経口的 (例えば、局所、直腸、静脈投与等）に安 全に投与することができる。力かる製剤中の本発明によって導かれる化合物の含有 量は、製剤全体の約 0. 01重量％乃至約 100重量％、好ましくは、約 0. 1重量％乃 至約 50重量％、さらに好ましくは、約 0. 5重量％乃至約 20重量％である。
[0124] これらの医薬製剤の製造に用いられる本発明によって導かれる化合物は、実質的 に純粋で単一な物質であるものに限定されず、不純物（例えば、製造工程に由来す る副生成物、溶媒、原料等、または分解物等)を、医薬品原薬として許容される範囲 であれば含有して 、てもよ 、。
[0125] これらの医薬製剤の製造に用いられる薬理学的に許容される担体としては、製剤 素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質等が挙げられ、例えば、固形剤に おける賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤、あるいは液剤における溶剤、溶解補 助剤、乳化または懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤および無痛化剤等が挙げられる。さ らに必要に応じ、通常の保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の 添加物を適宜、適量用いることもできる。
[0126] 経口投与のための内服用固形剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤 等が挙げられる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。 力かる内服用固形剤においては、ひとつまたはそれ以上の活性物質はそのまま力、 または賦形剤（例えば、ラタトース、マン-トール、グルコース、微結晶セルロース、デ ンプン、コーンスターチ、軽質無水ケィ酸等）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセ ルロース、ポリビュルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、結晶セルロース、 白糖、 D マン-トール、デキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デンプン 、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）、崩 壊剤（例えば、繊維素グリコール酸カルシウム、デンプン、カルボキシメチルセルロー ス、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、 L ヒドロキシプロピルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステア リン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等)等と混合され、常法に従って製剤化して 用いられる。また、必要によりコーティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロ ピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆して!/ヽても よいし、また 2以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物 質のカプセルを用いてもよ 、。
[0127] 経口投与のための内服用液剤としては、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、 シロップ剤、エリキシル剤等が挙げられる。力かる液剤においては、ひとつまたはそれ 以上の活性物質が、一般的に用いられる希釈剤 (例えば、精製水、エタノールまたは それらの混液等）を用いて溶解、懸濁または乳化される。該液剤はさらに、湿潤剤、 懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよ い。
[0128] 非経口投与のための注射剤は、全ての注射剤を含み、点滴剤をも包含する。例え ば、筋肉への注射剤、皮下への注射剤、皮内への注射剤、動脈内への注射剤、静 脈内への注射剤、腹腔内への注射剤、脊髄腔への注射剤、静脈内への点滴剤等が 挙げられる。また、非経口投与のための注射剤は、溶液、懸濁液、乳濁液および用 時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、ひとつま たはそれ以上の活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤と しては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、マクロゴール、植物油（例えば、ゴマ 油、トウモロコシ油、ォリーブ油等）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、 エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせ等が用いられる。該注 射剤はさらに、安定化剤（例えば、 D ソルビトール、 D マン-トール、 Lーァラニン、 ァスコルビン酸、アルブミン、イノシトール、ダルコン酸ナトリウム、チォグリコール酸ナ トリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、ァ スパラギン酸、ポリソルベート 80 (登録商標）、ポリエチレングリコール、プロピレンダリ コール、 D—マン-トール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレステ ロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム等）、乳化または懸濁 ィ匕剤（例えば、界面活性剤（例えば、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナト リウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ-ゥム、塩化べンゼトニ ゥム、モノステアリン酸グリセリン等）、親水性高分子 (例えば、ポリビュルアルコール、 ポリビュルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチノレセノレロース、ヒドロ キシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース等 )等）、無痛化剤 (例えば、ベンジルアルコール等）、等張化剤 (例えば、ブドウ糖、 D- ソルビトール、塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、 D-マン-トール等）、緩衝剤（例えば、リン 酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩等の緩衝液等）、保存剤（例えば、パラヒドロキシ 安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フエネチルアルコール 、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等）、抗酸化剤（例えば、亜硫酸塩、ァスコルビン酸、 α—ト コフエロール等）等を含んで 、てもよ 、。これらは最終工程にぉ 、て滅菌するか無菌 操作法によって製造、調製される。また、無菌の固形剤、例えば、凍結乾燥品を製造 し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使 用することもできる。凍結乾燥は、自体公知の方法によって行うことができる。一般的 には、— 25°C以下の温度で凍結後、乾燥庫内真空度を約 13. 3Pa以下に保ちなが ら、棚温を 25°C乃至 40°Cに到達するまで昇温させつつ乾燥する方法が好ま 、。
[0129] 非経口投与のためのその他の製剤としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を 含み、常法により処方される外用液剤、軟膏剤、塗布剤、吸入剤、スプレー剤、坐剤 および膣内投与のためのペッサリー等が挙げられる。スプレー剤は、一般的に用いら れる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定化剤と等張性を与えるような緩 衝剤、例えば、塩ィ匕ナトリウム、クェン酸ナトリウムあるいはクェン酸のような等張剤を 含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第 2,868,691号およ び同第 3,095,355号に詳しく記載されて 、る。
[0130] 本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッ グは、（1)該化合物の予防および Zまたは治療効果の補完および Zまたは増強、（2 )該化合物の動態，吸収改善、投与量の低減、および Zまたは（3)該化合物の副作 用の低減等の目的のために、他の薬物と組み合わせて、併用剤として投与してもよ い。また、併用する他の薬物 (以下、併用薬物と略記する場合がある。）の、（1)予防 および Zまたは治療効果の補完および Zまたは増強、（2)動態'吸収改善、投与量 の低減、および Zまたは（3)副作用の低減のために本発明によって導かれる化合物 、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを組み合わせて、併用剤として 投与してちょい。
本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッ グと併用薬物の併用剤は、 1つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与し てもよく、また別々の製剤として投与する形態をとつてもよい。この別々の製剤として 投与する場合には、同時投与および時間差による投与が含まれる。また、時間差に よる投与は、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれら のプロドラッグを先に投与し、併用薬物を後に投与してもよいし、併用薬物を先に投 与し、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロ ドラッグを後に投与しても力まわず、それぞれの投与方法は同じでも異なっていても よい。本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロ ドラッグと併用薬物の併用剤により、予防および Zまたは治療効果を奏する疾患は特 に限定されず、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれ らのプロドラッグの予防および zまたは治療効果を補完および zまたは増強する疾 患であるか、または併用薬物の予防および Zまたは治療効果を補完および Zまたは 増強する疾患であればよい。本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和 物、またはそれらのプロドラッグと併用薬物の併用剤における本発明によって導かれ る化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグと併用薬物の重量比 は特に限定されない。また、併用薬物は、低分子化合物に限定されず、高分子のタ ンパク、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（DNA、 RNA、遺伝子）、アンチセンス、デコイ 、抗体、またはワクチン等であってもよい。併用薬物の投与量は、臨床上用いられて いる用量を基準として適宜選択することができる。また、本発明によって導かれる化 合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグと併用薬物の配合比は、 投与対象の年齢および体重、投与方法、投与時間、対象疾患、症状、組み合わせな どにより適宜選択することができる。例えば、本発明によって導かれる化合物、その塩
、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグ 1重量部に対し、併用薬物を 0. 01重量 部乃至 100重量部用いればよい。併用薬物は、以下に示す同種群および異種群か ら任意に 1種以上を任意の割合で、適宜組み合わせて投与してもよ 、。
[0132] 本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッ グの予防および Zまたは治療効果を補完および Zまたは増強する併用薬物には、 前記したメカニズムに基づいて、現在までに見出されているものだけでなく今後見出 されるものも含まれる。本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、また はそれらのプロドラッグには、前記したように LPA受容体ァゴニストや LPA受容体ァ ンタゴ-ストが含まれるが、これらと併用し得る併用薬物としては、例えば以下に示す もの等が挙げられる。
[0133] LPA受容体ァゴニストの泌尿器系疾患に対する予防および Zまたは治療効果の 補完および Zまたは増強のための他の薬物としては、他の泌尿器疾患治療薬、例え ば、 a 1ァゴニスト、 β 2ァゴニスト、抗コリン薬等が挙げられる。 (X 1ァゴニストとしては 、例えば、塩酸ミドドリン等が挙げられる。 β 2ァゴ-ストとしては、例えば、塩酸クレン ブテロール等が挙げられる。抗コリン薬としては、例えば、塩酸ォキシプチニン、塩ィ匕 ベタネコール、塩酸プロピベリン、臭化プロパンテリン、臭化メチルべナクチジゥム、 臭化ブチルスコポラミン、酒石酸トルテロジン、塩化トロスピウム、 Ζ— 338、 UK— 112 166— 04、 KRP— 197、ダリフエナシン、 YM— 905等が挙げられる。
[0134] LPA受容体アンタゴニストの泌尿器系疾患に対する予防および Zまたは治療効果 の補完および Zまたは増強のための他の薬物としては、他の泌尿器疾患治療薬、例 えば、 a 1アンタゴ-スト、抗コリン薬、 5 α—リダクターゼ阻害薬、および Ζまたは抗ァ ンドロゲン薬等が挙げられる。 α 1アンタゴ-ストとしては、例えば、塩酸テラゾシン、 塩酸ブナゾシン、ゥラピジル、塩酸タムスロシン、メシル酸ドキサゾシン、塩酸プラゾシ ン、インドラミン、ナフトビジル、塩酸ァノレフゾシン、 AIO-8507L,シロドシン等が挙 げられる。抗コリン薬としては、例えば、塩酸ォキシプチニン、塩ィ匕べタネコール、塩 酸プロピベリン、臭化プロパンテリン、臭ィ匕メチルべナクチジゥム、臭化ブチルスコポ ラミン、酒石酸トルテロジン、塩化トロスピウム、 Z— 338、 UK— 112166— 04、 KRP— 1 97、ダリフエナシン、 YM— 905等が挙げられる。ただし、抗コリン薬は前立腺肥大を 伴わない場合にのみ用いられる。主として前立腺肥大を伴わない場合の頻尿、尿失 禁の治療に用いられる。 5 α—リダクターゼ阻害薬としては、例えば、フィナステリド、 G ト 998745等が挙げられる。抗アンドロゲン薬としては、例えば、ォキセンドロン、酢 酸ォサテロン、ビカルタミド等が挙げられる。
[0135] 本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッ グと併用薬物とを組み合わせることにより、（1)本発明によって導かれる化合物、その 塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグまたは併用薬物を単独で投与する場 合に比べて、その投与量を軽減することができる、（2)患者の症状 (軽症、重症など） に応じて、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらの プロドラッグと併用薬物を選択することができる、（3)本発明によって導かれる化合物
、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグと作用機序が異なる併用薬物 を選択することにより、長期間安全に使用できるので治療期間を長く設定することもで きる、（4)本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらの プロドラッグと作用機序が異なる併用薬物を選択することにより、治療効果の持続を 図ることができる、（5)本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、また はそれらのプロドラッグと併用薬物とを併用することにより、相乗効果が得られる、等 の優れた効果を得ることができる。
[0136] 以下、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプ ロドラッグと併用薬物を併用して使用することを「本発明の併用剤」と称する。本発明 の併用剤の使用に際しては、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和 物、またはそれらのプロドラッグと併用薬物の投与時期は限定されず、本発明によつ て導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグまたはその 医薬組成物と併用薬物またはその医薬組成物とを、投与対象に対し、同時に投与し てもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬物の投与量は、臨床上用いられ ている投与量に準ずればよぐ投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適 宜選択することができる。本発明の併用剤の投与形態は、特に限定されず、生体内 で、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロド ラッグと併用薬物とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例え ば、（1)本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプ ロドラッグと併用薬物とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（2)本発明 によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグと併用 薬物とを別々に製剤化して得られる 2種の製剤の同一投与経路での同時投与、（3) 本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッ グと併用薬物とを別々に製剤化して得られる 2種の製剤の同一投与経路での時間差 をおいての投与、（4)本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、また はそれらのプロドラッグと併用薬物とを別々に製剤化して得られる 2種の製剤の異な る投与経路での同時投与、（5)本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒 和物、またはそれらのプロドラッグと併用薬物とを別々に製剤化して得られる 2種の製 剤の異なる投与経路での時間差をお 、ての投与 (例えば、本発明によって導かれる 化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグ;併用薬物の順序での 投与、あるいは逆の順序での投与)等が挙げられる。
[0137] 本発明の併用剤を投与する際には、医薬製剤の製造法で一般的に用いられてい る自体公知の手段に従って、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和 物、またはそれらのプロドラッグおよび Zまたは併用薬物をそのまま、あるいは薬理学 的に許容される担体と混合して、例えば、内服用固形剤 (例えば、錠剤 (糖衣錠、フィ ルムコーティング錠を含む)、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤等)、内服用液剤、外 用液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等の医薬製剤とすることで、経口的または非経口的（ 例えば、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。
[0138] これらの医薬製剤の製造に用いられる薬理学的に許容される担体としては、製剤 素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質等が挙げられ、例えば、固形剤に おける賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤、あるいは液剤における溶剤、溶解補 助剤、乳化または懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤および無痛化剤等が挙げられる。さ らに必要に応じ、通常の保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の 添加物を適宜、適量用いることもできる。
賦形剤としては、例えば、ラタトース、マン-トール、グルコース、微結晶セルロース 、デンプン、コーンスターチ、軽質無水ケィ酸等が挙げられる。結合剤としては、例え ば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネ シゥム、結晶セルロース、 白糖、 D マン-トール、デキストリン、ヒドロキシプロピルメ チルセルロース、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセ ルロースナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、繊維素グリコール酸力 ルシゥム、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカル シゥム、カルボキシメチルスターチナトリウム、 Lーヒドロキシプロピルセルロース等が挙 げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシゥ ム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。溶剤としては、例えば、注射用蒸留水、生 理食塩水、マクロゴール、植物油（例えば、ゴマ油、トウモロコシ油、ォリーブ油等）、 プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等お よびそれらの組み合わせ等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、 D ソルビトー ル、 D マン-トール、 Lーァラニン、ァスコルビン酸、アルブミン、イノシトール、ダルコ ン酸ナトリウム、チォグリコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が挙 げられる。溶解補助剤としては、例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸、ポリソルベー ト 80 (登録商標）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D マン-トール、 安息香酸ベンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミ ン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム等が挙げられる。乳化または懸濁化剤としては 、例えば、界面活性剤（例えば、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウ ム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ-ゥム、塩化べンゼトニゥム 、モノステアリン酸グリセリン等）、親水性高分子 (例えば、ポリビュルアルコール、ポリ ビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキ シメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース等） 等）が挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。 等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、 D-ソルビトール、塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、 D マン-トール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩 、クェン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。保存剤としては、例えば、パラヒドロキシ安 息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フエネチルアルコール、 デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、ァ スコルビン酸、 α—トコフエロール等が挙げられる。
[0140] 本発明の併用剤における本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物 、またはそれらのプロドラッグの配合比は、製剤の形態によって相違するが、通常製 剤全体に対して約 0. 01重量％乃至約 100重量％、好ましくは、約 0. 1重量％乃至 約 50重量％、さらに好ましくは、約 0. 5重量％乃至約 20重量％である。本発明の併 用剤における併用薬物の配合比は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全 体に対して約 0. 01重量％乃至約 100重量％、好ましくは、約 0. 1重量％乃至約 50 重量％、さらに好ましくは、約 0. 5重量％乃至約 20重量％である。本発明の併用剤 における担体等の添加剤の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤 全体に対して約 1重量％乃至約 99. 99重量％、好ましくは、約 10重量％乃至約 90 重量％程度である。また、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、 またはそれらのプロドラッグと併用薬物をそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の 含有量で構わない。
[0141] これらの製剤は常法 (例えば日本薬局方記載の方法など）に従って調製される。例 えば、錠剤は、医薬品をそのまま、または賦形剤、結合剤、崩壊剤もしくはその他の 適当な添加剤を加えて均等に混和したものを適当な方法で顆粒とし、滑沢剤等を加 えて圧縮成型するか、医薬品をそのまま、または賦形剤、結合剤、崩壊剤もしくはそ の他の適当な添加剤を加えて均等に混和したものを直接圧縮成型して製造するか、 または予め製造した顆粒にそのまま、もしくは適当な添加剤を加えて均等に混合した 後、圧縮成型することで製造することができる。かかる錠剤は、必要に応じて着色剤、 矯味剤等を加えることもできる。また、適当なコーティング剤で剤皮を施すこともできる
。注射剤は、医薬品の一定量を、水性溶剤の場合は、注射用水、生理食塩水、リン ゲル液等、非水性溶剤の場合は、通常植物油等に溶解、懸濁もしくは乳化して一定 量とするか、または医薬品の一定量を、注射用容器に密封して製造することができる 。経口投与用の製剤に用いられる担体としては、例えば、デンプン、マンニット、結晶 セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等の製剤分野において常用され ている物質が用いられる。注射用の製剤に用いられる担体としては、例えば、蒸留水 、生理食塩水、グルコース溶液、輸液剤等が用いられる。その他、製剤一般に用いら れる添加剤を適宜添加することもできる。
[0142] 本発明の併用剤の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間 等により異なるが、通常、本発明によって導かれる化合物および併用薬物として、そ れぞれ成人一人あたり、 1回につさ、 0. lmg力ら lOOOmgの範囲で、 1日 1回力ら数 回経口投与されるか、または成人一人あたり、 1回につき、 0. lmgから lOOmgの範 囲で、 1日 1回力 数回非経口投与 (好ましくは、静脈内投与)されるか、または 1日 1 時間から 24時間の範囲で静脈内に持続投与される。
[0143] もちろん前記したように、投与量は、種々の条件によって変動するので、前記投与 量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。併用薬 物は、副作用が問題とならない範囲で、かつ本発明の目的が達成できる限り、どのよ うな量を設定することも可能である。併用薬物としての一日投与量は、症状の程度、 投与対象の年齢、性別、体重、感受性差、投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調 剤、種類、有効成分の種類などによって異なり、特に限定されない。
[0144] 本発明の併用剤を投与するに際しては、同時期に投与してもよいが、併用薬物を 先に投与した後、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそ れらのプロドラッグを投与してもよいし、本発明によって導かれる化合物、その塩、そ の溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを先に投与し、その後で併用薬物を投与し てもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与 方法により異なるが、例えば、併用薬物を先に投与する場合、併用薬物を投与した 後 1分乃至 3日以内、好ましくは 10分乃至 1日以内、より好ましくは 15分乃至 1時間 以内に本発明によって導かれる化合物を投与する方法等が挙げられる。本発明によ つて導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを先に投 与する場合、本発明によって導かれる化合物、その塩、その溶媒和物、またはそれら のプロドラッグを投与した後、 1分乃至 1日以内、好ましくは 10分乃至 6時間以内、よ り好ましくは 15分乃至 1時間以内に併用薬物を投与する方法等が挙げられる。 [薬理活性]
本発明のスクリーニング方法として、例えば、以下に示す方法が挙げられる。以下 に示すスクリーニング方法により LPA受容体のァゴ-ストもしくはアンタゴニストを見 出すことができる。以下に例示する方法は LPA受容体として EDG— 2を用いたもので あるが、他の LPA受容体も同様に用いてもよい。
[EDG— 2ァゴ-スト活性およびアンタゴ-スト活性の評価]
EDG-2に対する作用は、例えば、以下に示す実験により評価できる。
[0145] ヒト EDG— 2遺伝子を過剰発現させたチャイニーズノヽムスターオーバリー（Chinese
Hamster Ovary, CHO)細胞を用いて該受容体のァゴ-ストおよびアンタゴニス トの活性の評価が可能である。
[0146] EDG—2発現細胞は、 10%FBS (ゥシ胎児血清）、ペニシリン Zストレプトマイシン、 ブラスチサイジン（5 μ g/mL)含有 Ham' sF12培地（ギブコ（Gibco)社製）を用い て培養する。まず、 Fura2-AM (ドージンドー（Dojindo)社製）を細胞内へ取り込ま せるため、細胞を Fura2— AM溶液 [10%FBS、 HEPES緩衝液（20mM、 pH7. 4) 、プロべネシド（2. 5mM、 Sigma社製、 No. P— 8761)含有 Ham， sF 12培地] (5 M)で、 37°Cで 60分間インキュベーションし、 HEPES緩衝液（20mM、 pH7. 4)お よびプロべネシド（2. 5mM)を含む Hanks液で 1回洗浄し、同 Hanks液に浸す。引 き続き、以下の (i)または (ii)の方法に従って評価を行うことが可能である。
(i)アンタゴ-スト活性の評価
蛍光ドラッグスクリーニングシステム (浜松ホトニタス社製）にプレートをセットし、 30 秒間無刺激で測定し、被験化合物の溶液を加える。 5分後に高活性型 LPA (終濃度 ： ΙΟΟηΜ)を加え、添加前後の細胞内カルシウムイオン濃度を 3秒間隔で測定する（ 励起波長 340nmおよび 380nm、蛍光波長 500nm)。化合物は DMSOに溶解し、 終濃度が InM乃至 10 Mになるように添加する。 EDG— 2拮抗活性は、化合物を 含まない DMSOを添カ卩したゥエルでの高活性型 LPAによるピーク値をコントロール 値 (A)とし、化合物で処理した細胞での高活性型 LPA添加前の値から添加後の値 の差 (B)とを比較し、式 {抑制率 (％) = ( (A— B) ZA) X 100}を用いて抑制率 (％) を算出することができる。尚、 IC 値は、抑制率 50%を示す被験化合物の濃度として 算出できる。
(ϋ)ァゴニスト活性の測定
前記の蛍光ドラッグスクリーニングシステムにプレートをセットし、 30秒間無刺激で 測定し、被験化合物の溶液を添加する。評価化合物は、 DMSO等に溶解し、終濃 度が 0. InM乃至 Mの範囲で DMSO溶液が最終的に 1Z1000濃度になるよ うに添加する。添加前後の細胞内 Ca2+濃度 (Fura2— Ca2+蛍光）を 3秒間隔で測定 する（励起波長 340nmおよび 380nm、蛍光波長 500nm)。
[0147] ァゴ-スト活性は被験化合物の代わりに DMSOを添カ卩したゥエルでの LPA (例え ば、 18 : 3— LPA等）や高活性型 LPA刺激でのピーク値をコントロール値 (A)とし、被 験化合物の添加前の値から添加後の蛍光比の上昇値 (B)とを比較し、細胞内 Ca2+ 濃度上昇率を、式 {上昇率 (％) = (B/A) X 100}を用いて算出することができる。 被験化合物の各濃度での上昇率を求め EC 値を算出する。
50
発明の効果
[0148] 本発明によって、 LPAが関与する疾患の予防および Zまたは治療物質を効率的に 得ることができる。本発明のスクリーニング方法は、 LPAをリガンドとして用いた従来 の方法とは異なり、各種疾患の原因物質となる高活性型 LPAをリガンドに用いている ため、より疾患時の生体環境を反映したスクリーニング方法である。
図面の簡単な説明
[0149] [図 1]1ーリノレノィル（18 : 3)— LPAおよびそれを酸ィ匕することで得られた高活性型 L PAの質量分析スペクトルデータを示す。
発明を実施するための最良の形態
[0150] 以下に、参考例および実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではな い。また、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
[0151] LPAが酸ィ匕を受けることにより、高活性型 LPAとして機能することは、例えば、以下 の実験によって証明された。
[0152] 全体の操作は、基本的な生物学的手法に基づき、常法となっている方法を活用し た。また、本発明の測定方法は、以下のように、本発明によって導かれる化合物、そ の塩、その溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを評価するために、測定精度の向 上および Zまたは測定感度の改良を加えたものである。以下に詳細な実験方法を示 した。
[0153] 参考例 1
(2S)— 2—ヒドロキシ— 3— (ホスホノォキシ）プロピル (9Z, 12Z, 15Z)— 9, 12, 15— ォクタデカトリエノアート（以下、 1ーリノレノィル（18:3) -LPAと略記する。 )
[0154] [化 27]
Figure imgf000052_0001
[0155] の調製
(i)ホスホリパーゼ A (PLA )による 18:3—ホスファチジルコリン（PC)からの 18:3—
2 2
リゾホスファチジルコリン（LPC)の調製
18:3-PC(Avanti, 850395C)を、ジェチルエーテルおよびメタノールの混合溶媒（ ジェチルエーテル：メタノール =85: 15)で 50mg/mLに再溶解し、スターラーで激 しく攪拌しつつ、 PLA (Sigma, P-9279) (400U/mL in lOmM Tris— HCl(pH7
2
.4))を、 18:3— PC lmgあたり 0.48Uの PLAの割合でカ卩えた（final 2.4U PL
2
A Zmg 18: 3— PC)。反応溶液の溶媒をエバポレータで完全に除き、残渣をクロ口
2
ホルムに溶解し、遠沈管に分注して遠心（1200rpm、 3min、室温）し、上清を回収し た後、溶媒をエバポレータで完全に除いた。残渣をメタノールに溶解し、その 20倍量 のジェチルエーテルを加えて室温で攪拌し、遠心（同）により 18:3— LPCを沈殿させ た。
[0156] (ii)ホスホリパーゼ D(PLD)による 18:3— LPCからの 18:3—リゾホスファチジン酸（ LPA)の調製
18:3-LPC(0.60g)を反応溶媒（40mL、 5mM フッ化ナトリウム、 200mM Tri s-HCl(pH7.4))に溶解させた。スターラーで激しく攪拌しながら、 PLD(1000U/ mL) (Sigma, P-8023)を終濃度 333UZmLとなるように反応溶液に加えた。室温で 終夜反応させ、 LPCの完全な分解を TLCで確認した。反応溶液を 6N塩酸にて pH2 乃至 3付近に調整した後、クロ口ホルムで数回抽出し、各有機層を 28%アンモニア水 にて中和した。 TLCで水層に LPAの残存がないことを確認し、有機層をあわせて減 圧下濃縮した。濃縮した LPAをクロ口ホルムおよびメタノールの混合溶媒 (クロ口ホル ム：メタノール =70 :30)に溶解し、シリカゲルカラム（ヮコ一ゲル C— 200)に力けて部 分精製を行なった。その後、逆相カラム (C18)を用いた HPLC法により以下の物性 値を有する表題の 1—リノレノィル (18:3) LPAを得た。
<TLCデータ >
TLC:Rf 0.54 (クロ口ホルム：メタノール：水 =65 :35 :5)；
く NMRデータ〉
NMR(DMSO-d )： δ 0.91(t, J=7.5Hz, 3H, CI), 1.28(m, 8H, C12, C13, C14,
6
C15), 1.50(m, 2H, C16), 2.03(m, 4H, C2, Cll), 2.27(t, J=7.5Hz, 2H, CI 7), 2.76(t, J=6.0Hz, 4H, C5, C8), 3.67(m, 3H, C20, C21), 3.92(m, 2H, C19), 5.31(m, 6H, C3, C4, C6, C7, C9, C10)。
¾細
1—リノレノィル（18 : 3) LPAを用いた高活性型 LPAの調製
参考例 1で得られた 1ーリノレノィル (18:3) -LPA ( 1. Omg)を含むァセトニトリルと メタノールの混合溶媒 (ァセトニトリル:メタノール =1:2) (0.9mL)に、メタクロ口過安 息香酸 (4.2mg)を含むァセトニトリルとメタノールの混合溶媒 (ァセトニトリル:メタノ ール =1:2) (0. lmL)をカ卩えて撹拌し、室温で 16時間静置し、濃縮した。得られた 残渣をクロ口ホルムとメタノールの混合溶媒（クロ口ホルム：メタノール =9.7:1) (1.6 mL)に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Sep— Pak Vac Silica 6cc(5 OOmg)、クロ口ホルム：メタノール =1:0乃至 0:1)にて精製し、以下の物性値を有す る高活性型 LPAを得た。
<マススペクトルデータ >
0—18:5— LPA HRMS(Q-TOF-ESI Neg.)(m/z)： [M-H]" calcd for C H O P
3 21 32 10
475.1733, found 475.1756;0—18:4— LPA HRMS(Q- TOF- ESI Neg.)(m/z)：
3
[M-H]" calcd for C H O P 477.1890, found 477.1911 ;0—18 : 3— LPA HRMS ((QQ--TTOOFF--EESSII NNeegg..))((mm//zz)) :: [[MM--HH]]" ccaallccdd ffoorr CC HH O0 PP 447799..22004466,, ffoouunndd 447799..22003333 ;;00
2211 3366 1100
——1188 :: 33—— LLPPAA HHRRMMSS((QQ-—TTOOFF-—EESSII NNeegg..))((mm//zz)) :: [[MM-—HH]]"— ccaallccdd ffoorr CC HH OO PP
44 2211 3366 1111
449955..11999955,, ffoouunndd 449955..11999966 ;;00——1188 :: 22—— LLPPAA HHRRMMSS((QQ-- TTOOFF-- EESSII NNeegg..))((mm//zz))：：
44
[[MM--HH]]"" ccaallccdd ffoorr CC HH OO PP 449977..22115522,, ffoouunndd 449977..22114488。。
2211 3388 1111
[[00115588]] 実実施施例例 11——11
11——リリノノレレオオイイルル（（1188 :: 22)) LLPPAAをを用用いいたた高高活活性性型型 LLPPAAのの調調製製
11——リリノノレレノノィィルル（（1188 :: 33))—— LLPPAAのの代代わわりりにに DD (( ++ ))——ssnn—— 11 OO——リリノノレレオオイイルルーーググリリセセリリルル —— 33 ホホススフフェェーートト ''ナナトトリリウウムム塩塩（（eecchheeoonn,, LL--00118822))をを用用いいてて実実施施例例 11とと同同様様のの操操作作をを行行 いい、、以以下下のの物物性性値値をを有有すするる高高活活性性型型 ^^(( ((2233))——22——ヒヒドドロロキキシシーー33——[[88——{{ ((2211^^、、 33SS)) 33—— [[ (( ((22RR、、 33SS))—— 33 ペペンンチチルルーー 22——才才キキシシララ --ルル))メメチチルル ]]ーー22 ォォキキシシララ--ルル }}ォォククタタ
Figure imgf000054_0001
[[00115599]] [[化化 2288]]
Figure imgf000054_0002
[0160] 、（2S)— 2—ヒドロキシー 3— [8— { (2S、 3R)— 3— [ ( (2S、 3R)—3—ペンチルー 2—ォキ シラニル)メチル] ォキシラ-ル }オタタノィルォキシ]プロピルリン酸
[0161] [化 29]
Figure imgf000054_0003
[0162] 、（2S)— 2—ヒドロキシー 3— [8— { (2R、 3S)— 3— [ ( (2S、 3R)—3—ペンチルー 2—ォキ シラニル)メチル] ォキシラ-ル }オタタノィルォキシ]プロピルリン酸 [0163] [化 30]
Figure imgf000055_0001
[0164] 、および Zまたは（2S)— 2—ヒドロキシー 3— [8— { (2S、 3R)— 3— [ ( (2R、 3S)— 3—ぺ ンチルー 2—ォキシラエル)メチル ]—2—ォキシラ-ル }オタタノィルォキシ]プロピルリン 酸
[0165] [化 31]
Figure imgf000055_0002
[0166] )を得た。
<マススペクトルデータ >
HRMS(Q-Tof-ESI Neg.)(m/z)： [M- H]— calcd for C H O P 465.2254, found
21 38 9
465.2288 ;HRMSMS(Q-Tof-ESI Neg.)(m/z) : [M— H]—— C H O P 311.2368, [M— H]—
3 7 5
— C H O P-H O 293.2284, [M— H]—— C H O 171.0207, [M— H]—— C H O— H O
3 7 5 2 18 30 3 18 30 3 2
153.0045 ;
く NMRデータ〉
NMR (deuterium oxide)： δ 0.8(t, J=7.2Hz, 3H), 1.2— 1.6(m, 20H), 1.6(dt, J=15.0, 7.5Hz, 0.5H), 1.8(t, J=6.4Hz, IH), 2.0(td, J=14.9, 5.0Hz, 0.5H), 2.3(t, J=7.5Hz, IH), 3.1— 3.2(m, 2H), 3.2— 3.3(m, 2H), 3.7— 3.9(m, 2H), 4.0(m, IH), 4.1(dd, J=11.5, 6.6Hz, IH), 4.1(dd, J=11.5, 3.7Hz, 1H)。
[0167] ¾施例 i-2
1 ァラキドノィル (20： 4) LPAを用いた高活性型 LPAの調製
1—リノレノィル（18 : 3)— LPAの代わりに D ( + )—sn— 1 O ァラキドノィルーグリセリ ルー 3 ホスフェート 'ナトリウム塩（echeon, L-0204)を用いて実施例 1と同様の操作を 行い、以下の物性値を有する高活性型 LPAを得た。
<マススペクトルデータ >
O—20:4— LPA HRMS(Q-Tof-ESI Neg.)(m/z)： [M- H]— calcd for C H OP
1 23 38 8
473.2304, found 473.2289 ;0—20:4— LPA HRMS(Q— Tof— ESI Neg.)(m/z) : [M— H
2
]— calcd for C H O P 489.2253, found 489.2218 ;0—20:6— LPA HRMS
23 38 9 3
(Q-Tof-ESI Neg.)(m/z):[M-H]" calcd for C H O P 501.1890, found 501.1871 ;0
23 34 10 3
—20:5— LPA HRMS(Q- Tof- ESI Neg.)(m/z) : [M-H]— calcd for C H O P
23 36 10
503.2046, found 503.2010 ;0—20:4— LPA HRMS(Q- Tof- ESI Neg.)(m/z) : [M-H
3
]— calcd for C H O P 505.2203, found 505.2168 ;0—20: 5— LPA HRMS
23 38 10 4
(Q-Tof-ESI Neg.)(m/z):[M-H]" calcd for C H O P 519.1995, found 519.1980;O
23 36 11 4
—20:4— LPA HRMS(Q- Tof- ESI Neg.)(m/z) : [M-H]— calcd for C H O P
23 38 11
521.2152, found 521.2133;0—20:5— LPA HRMS(Q— Tof— ESI Neg.)(m/z) : [M-H
5
]— calcd for C H O P 535.1944, found 535.1973; O—20:4— LPA HRMS
23 36 12 5
(Q-Tof-ESI Neg.)(m/z):[M-H]" calcd for C H O P 537.2101, found 537.2099。
23 38 12
¾細12
質量分析による比較
実施例 1で得られた高活性型 LPAが、参考例 1で得られた 1-リノレノィル（18： 3)- LPAとは異なるものであることを質量分析により確認した。以下に測定条件および方 法を示す。
<材料 >
シリカゲルカラム： Develosil60— 5(2. Omm X 150mm) (Nomura Chemical Co.,LTD.)
プレカラム： 1.5mm X 10mmガードカラム（Nomura Chemical Co.,LTD.) く調製試薬〉
HPLC用溶出バッファー
(1)バッファー A:
0. 1%ギ酸アンモ-ゥム (pH6.4)/ァセトニトリル メタノール混合溶媒 (ァセトニトリ ル：メタノール =2:1)
(2)バッファー B:
0. 1%ギ酸アンモ -ゥム（pH6.4) Zメタノール一水混合溶媒 (メタノール：水 = 2:1) <使用機器 >
(1) HPLC (Waters, Alliance2795)
(2) Q— TOF質量分析装置（Micromass, Q-TOF Ultima API)
<方法 >
( 1 ) LCZESI— TOF— MSによる 1—リノレノィル（18:3)— LPAの検出
前記機種を用いて，以下の HPLCおよび質量分析装置の設定にて測定を行った。
ESI-MS Negative Ion Mode
[Sourse]
Capillary: 2.9;Cone:40;RF Lensl : 50.0; Sourse Temp (°C) : 100; Desol vation Temp (°C)： 200； Cone Gas Flow(L/Hr) : 50;Desolvation Gas F low(L/Hr) :800
[MS]
LM Resolution: 10.0;HM Resolution: 10.0; Collision Energy: 5.0 [MS2]
TOF(kV) :9. 10;MCP:2000
[LC]
HPLC Gradient:括弧 []内はバッファー Aとバッファー Bの比率（％)を示す。
0min[100:0] ;5min[ 100:0] ;20min[70: 30] ;30min [70:30] ;35min[ 100: 0]
Flow Rate:0.2 L/ min
Injection Vol.
Figure imgf000057_0001
1—リノレノィル（18 :3)—LPA)
( 2) LCZESI— TOF— MSによる高活性型 LPAの検出
実施例 1で得られた高活性型 LPA (2 L)をァセトニトリルとメタノールの混合溶媒（ ァセトニトリル:メタノール =1:2)にて 500倍希釈し、前記機種を用いて、以下の質量 分析装置の設定にてダイレクトインジェクションにて測定を行った。 ESI— MS Negative Ion Mode
[Sourse]
Capillary: 2. 9 ;Cone :40 ;RF Lensl : 50. 0 ; Sourse Temp (°C) : 100 ; Desol vation Temp (°C)： 200； Cone Gas Flow(L/Hr) : 50 ;Desolvation Gas F low(L/Hr) : 800
[MS]
LM Resolution: 15. 0 ;HM Resolution : 15. 0 ; Collision Energy: 5. 0 [MS2]
TOF (kV) : 9. 10 ;MCP : 2000
<結果 >
参考例 1で得られた 1ーリノレノィル (18 : 3) LPAと実施例 1で得られた高活性型 LP Aは、質量分析で異なるスペクトルチャート（図 1)を示した。
施例 3
薬理活性の確認および LPAとの活性比較
(1) [Ca2+]iアツセィ系による評価
ヒト EDG— 2遺伝子を過剰発現させたチャイニーズノヽムスターオーバリー（Chinese Hamster Ovary, CHO)細胞を用いて該受容体のァゴニスト活性の評価を行な つた。 EDG— 2発現細胞は、 10%FBS (ゥシ胎児血清）、ペニシリン Zストレプトマイ シン、ブラスチサイジン（5 μ g/mL)含有 Ham' sF12培地（Gibco BRL)を用いて培 養した。まず、 Fura2— AM (Dojindo)を細胞内へ取り込ませるため、細胞を Fura2— AM溶液 [10%FBS、 HEPES緩衝液（20mM、 pH7. 4)、プロべネシド（2. 5mM) (Sigma, P- 8761)含有 Ham，sF 12培地] (5 /z M)で、 37°Cで 60分間インキュベーシ ヨンし、 HEPES緩衝液（20mM、 pH7. 4)およびプロべネシド（2. 5mM)を含む Ha nks液で 1回洗浄し、同 Hanks液に浸した。蛍光ドラッグスクリーニングシステム（浜松 ホトニタス社製）にプレートをセットし、 30秒間無刺激で測定し、実施例 1で得られた 高活性型 LPAを含む溶液を添加した。 LPAは生理食塩水に溶解し、終濃度が 0. 1 nM乃至 10 Mの範囲で添カ卩した。添加前後の細胞内 Ca2+濃度（Fura2— Ca2+蛍 光）を 3秒間隔で測定した (励起波長 340nmおよび 380nm、蛍光波長 500nm)。 <結果 >
実施例 1で得られた高活性型 LPAは、 EDG— 2発現細胞における細胞内カルシウム イオン濃度の上昇作用を有することが判った。
(2)ラット摘出尿道を用いた収縮測定系による評価
雌性または雄性 CD (SD) IGSラット（日本チヤ一ルスリバ一、使用時 8乃至 9週齢） を頭部打撲法および頸動静脈切断により放血致死させた後、恥骨下の尿道を注意 深く摘出し、速やかに Krebs— Henseleit液（112mM NaCl、 5. 9mM KC1、 2. 0 mM CaCl
2、 1. 2mM MgCl
2、 1. 2mM NaH PO
2 4、 25. OmM NaHCO
3、 11
. 5mM Glucose)に浸した。摘出した標本力 尿道部分を切り取り、切開し平板状 にしたあと、輪走筋と平行に切断し、幅 2乃至 3mm、長さ 3乃至 4mmの短冊標本を 一匹当たり 2乃至 3個作製した。
[0170] 作製した標本を Krebs— Henseleit液（37 ± 1°C、混合ガス [95%0 + 5%CO ]を
2 2 通気）を充たしたマグヌス管内（容量： 10mL)に懸垂した。約 0. 5gの張力負荷を与 え 60分間安定させたあと、 Force displacement transducer (日本光電、 FDピッ クアップ TB— 61 IT)力 ひずみ圧アンプ（日本光電、 AP— 621G)を介してレコーダ 一（GRAPHTEC CORP.、リニアコーダ WR3320)上に収縮運動を記録した。
[0171] コントロールの収縮反応は、高濃度 KC1液 (Krebs— Henseleitの NaClを全て KC1 に置換したもの）で刺激することにより得た。実施例 実施例 1 1または実施例 1 2 で得られた高活性型 LPAを含む溶液を添加し、尿道収縮の用量依存性を測定した
<結果 >
実施例 実施例 1-1および実施例 1—2で得られた高活性型 LPAは、用量依存的 にラット摘出尿道を収縮させることが判った。
(3)ウレタン麻酔下ラット尿道内圧上昇測定系
雄性 CD (SD) IGSラット（日本チヤ一ルスリバ一、使用時 8乃至 9週齢)をウレタン（ 1. 2gZkg)の皮下投与により麻酔した。頸部正中切開後、薬液投与用の頸静脈力 テーテル、血圧測定用の動脈カテーテルを挿入した。次に下腹部正中切開し、恥骨 下で尿道を結紮した。尿道カテーテルを膀胱頂部を切開して尿道内へ挿入し、膀胱 頸部で結紮固定した。尿道カテーテルの他端を圧トランスデューサ一に接続して尿 道内圧を測定した。尿道内圧を 20mmHg付近に合わせて静止させ、安定するまで 静置した (約 20分)。その後、実施例 実施例 1 1または実施例 1 2で得られた高 活性型 LPAまたはそれらを製造する原料として用いた LPAを静脈内投与し、尿道内 圧上昇作用を評価した。
<結果 >
ウレタン麻酔下ラット尿道内圧上昇測定系を用いて、 LPAと高活性型 LPAとの活性 を比較した結果、高活性型 LPAは LPAに比べて強 ヽ尿道内圧の上昇活性を示した 。例えば、参考例 1で得られた 1ーリノレノィル（18 : 3)— LPAと、実施例 1で得られた 高活性型 LPAとを比較した結果、 0. 3mgZkg、 i. v.の投与量において、高活性型 LPAは、 1ーリノレノィル（18 : 3)— LPAに比して、少なくとも 1. 5乃至 2倍の尿道内圧 の上昇を認めた。また同様に 1 リノレオイル（18 : 2)— LPAと、実施例 1 1で得られ た高活性型 LPAとを比較した結果、 0. 3mgZkg、 i. v.の投与量においては、 1—リ ノレオイル（18 : 2)— LPAが 0. 6mmHgの尿道内圧の上昇を示したのに対し、実施 例 1—1で得られた高活性型 LPAは 5. 4mmHgの尿道内圧の上昇を示した。さら〖こ 1 . Omg/kg, i. v.の投与量においては、 1—リノレオイル（18 : 2)— LPAが 0. 8mmH gの尿道内圧の上昇を示したのに対し、実施例 1 1で得られた高活性型 LPAは 8. 5 mmHgの尿道内圧の上昇を示した。
[0172] ¾細14
(2S)— 2—ヒドロキシ— 3— [ (9Z)— 9—才クタデセノィルォキシ]プロピルリン酸'ニナトリ ゥム塩 (以下、ォレオイル（18 : 1) -LPAと略記する。 )
[0173] [化 32]
Figure imgf000060_0001
を用いた高活性型 LPAの調製 ォレオイル（18 : 1)— LPA (Sigma, L-7260) (12. 2mg)を含むァセトニトリルとメタノ ールの混合溶媒 (ァセトニトリル:メタノール = 1 : 2) (9. 36mL)に、メタクロ口過安息 香酸（31. 3mg)を含むァセトニトリルとメタノールの混合溶媒 (ァセトニトリル:メタノー ル = 1 : 2) (1. 16mL)をカ卩えて撹拌し、室温で 38時間静置し、濃縮した。得られた 残渣をクロ口ホルム（0. 6mL)に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Sep— Pa k Vac Silica 6cc (500mg)、クロ口ホルム：メタノール = 1 : 0乃至 0 : 1)にて精製し 、以下の物性値を有する高活性型 LPA ( (2S)—2—ヒドロキシー 3—[8—(3—才クチルー 2—ォキシラニル)オタタノィルォキシ]プロピルリン酸'ニナトリウム塩
[0175] [化 33]
Figure imgf000061_0001
[0176] (2S)— 2—ヒドロキシー 3— (10—ヒドロキシー 8—ォクタデセノィルォキシ）プロピルリン 酸'ニナトリウム塩
[0177] [化 34]
Figure imgf000061_0002
[0178] 、および Zまたは（2S)— 2—ヒドロキシー 3— (9—ヒドロキシー 10—才クタデセノィルォキ シ）プロピルリン酸'ニナトリウム塩 [0179] [化 35]
Figure imgf000062_0001
[0180] ) (11. 3mg)を得た。
<マススペクトルデータ >
HRMS(Q-TOF-ESI Neg.)(m/z)： [M-H]" calcd for C H O P 451.2461, found
21 40 8
451.2398 ;
HRMSMS(Q— TOF— ESI Neg.)(m/z) : [M— H]—— C H O P 297.2430, [M— H]—— C H O
3 7 5 3 7 5
P-H O 279.2334, [M- H]— - C H O 171.0090, [M- H]— - C H O— H O 152.9979。
2 18 32 2 18 32 2 2
[0181] 実施例 5
1—リノレオイル（18 : 2) LPAを用いた高活性型 LPAの調製
D ( + )—sn— l—O—リノレオイルーグリセリル 3—ホスフェート ·ナトリウム塩（echeon, L-0182) (2. Omg)を含むギ酸アンモ-ゥム水溶液 (1. 8mL、 10mM、 pH9. 0)に、 Soybean lipoxygenase (50000UZmL)を含むギ酸アンモ-ゥム水溶液 (1. Om L、 10mM、 pH9. 0)を加えて撹拌し、室温にて 6時間静置することにより、以下の物 性値を有する高活性型 LPA( (2S)— 2—ヒドロキシー 3—（9ーヒドロペルォキシ 10, 12 ーォクタデカジエノィルォキシ）プロピルリン酸
[0182] [化 36]
Figure imgf000062_0002
[0183] ( 10—ヒドロペルォキシ 8, 12—才クタデカジエノィルォキ [0184] [化 37]
Figure imgf000063_0001
[0185] ( 12—ヒドロペルォキシ 9, 13—才クタデカジエノィルォキ
[0186]
Figure imgf000063_0002
、および Zまたは（2S)— 2—ヒドロキシー 3—（ 13—ヒドロペルォキシ 9, 11ーォクタデカ
[0188] [化 39]
Figure imgf000063_0003
[0189] )を得た。
<マススペクトルデータ >
HRMS(Q- Tof- ESI Neg.)(m/z)： [M-H]" calcd for C H O P 465.2254, found
21 38 9
465.2253 ;
HRMSMS(Q— Tof— ESI Neg.)(m/z) : [M— H]—— C H 0 P— H 0 293.2256, [M— H]—— C H
3 7 5 2 18
0 171.0233, [M-H]"-C H 0— H 0 153.0066。
[0190] 実施例 5- 1—リノレノィル（18： 3)一 LPAを用いた高活性型 LPAの調製
D ( + )—sn— l—O—リノレオイルーグリセリル一 3—ホスフェート ·ナトリウム塩の代わりに D ( + )—sn— 1一 O—リノレノィルーグリセリル一 3—ホスフェート 'ナトリウム塩（echeon, L-0183)を用いて実施例 5と同様の操作を行い、以下の物性値を有する高活性型 L PA ( (2S)— 2—ヒドロキシー 3— (9—ヒドロペルォキシ一 10， 12, 15—ォクタデカトリエノ ィルォキシ）プロピルリン酸
[0191] [化 40]
Figure imgf000064_0001
[0192] 、（2S)— 2—ヒドロキシー 3- (10—ヒドロペルォキシ一 8, 12, 15—ォクタデカトリエノィル ォキシ）プロピルリン酸
[0193] [化 41]
Figure imgf000064_0002
[0194] 、（2S)— 2—ヒドロキシー 3_ (12—ヒドロペルォキシ一 9， 13, 15—ォクタデカトリエノィル ォキシ）プロピルリン酸
[0195] [化
Figure imgf000064_0003
[0196] 、（2S)— 2—ヒドロキシー 3— (13—ヒドロペルォキシ一 9， 11， 15—ォクタデカトリエノィル ォキシ）プロピルリン酸
[0197] [化 43]
Figure imgf000065_0001
[0198] 、（2S)— 2—ヒドロキシー 3— (15—ヒドロペルォキシ 9, 12, 16—ォクタデカトリエノィル ォキシ）プロピルリン酸
[0199] [化 44]
Figure imgf000065_0002
[0200] 、および/または（2S)— 2—ヒドロキシー 3— (16—ヒドロペルォキシ 9， 12, 14ーォクタ デカトリェ
[0201] [化 45]
Figure imgf000065_0003
[0202] )を得た。
<マススぺクトノレデータ >
HRMS(Q- Tof- ESI Neg.)(m/z)： [M- ΗΓ calcd for C H O P 463.2097, found
21 36 9
463.2090； HRMSMS(Q-Tof-ESI Neg.)(m/z) : [M— H]—— C H O P— H O 291.2151
3 7 5 2
[M-H]"-C H O 171.0269, [M- H]— - C H O - H O 153.0096。
[0203] 実施例 6 正常動物の血漿中における高活性型 LPAの検出
(i)採血
正常ラット (Crj： CD (SD) IGS (雄性、日本チヤ一ルス ·リバ一より購入)使用時 10 週齢)を 24時間以上絶食した後に、保定器を使用して頸部静脈力 へノ^ン加採血 を行なった。
(ii)血漿の調製
20mgZmLの 2, 6—ジー tーブチルー 4—ヒドロキシトルエンを含有するエタノール溶 液と、 2mgZmLのァスコルビン酸を含有する生理食塩水溶液とを 50 Lずつ加え たガラス試験管に、採取した血液または生理食塩水を 1. OmL加え、 5秒間攪拌のの ち直ちにメタノール（2. 5mL)および酢酸 (60 L)をカ卩え、室温で 2分間攪拌した。 さら〖こ、クロ口ホルム（1. 25mL)を加え、室温で 1分間攪拌し、 10分間静置した。ま たさらに、クロ口ホルム（1. 25mL)をカ卩え、室温で 30秒間撹拌し、飽和食塩水（1. 2 5mL)をカ卩え、 1分間撹拌した後に、 4°Cで 10分間遠心分離した。クロ口ホルム層を 分取した後、水層にクロ口ホルム（1. 25mL)をカ卩え、 1分間撹拌した後に、 4°Cで 10 分間遠心分離した。得られたクロ口ホルム層を先に分取したクロ口ホルム層とあわせ、 窒素気流下、室温で 80分間乾燥した。乾燥後、窒素雰囲気下にて lOOmMのリン酸 二水素ナトリウムを含有する 70%メタノール水溶液（200 L)に溶解し、 5分間遠心 分離後、上清を分析容器にとり、分析用サンプルとした。
(iii)質量分析装置による測定
分析用サンプルを質量分析により測定した。以下に測定条件および方法を示す。 <材料 >
シリカゲルカラム： Atlantis dC18, 3 μ ΐη (2. 1mm X 50mm) (Waters Co., LTD) プレカラム： Atlantis dC18、 3 μ ΐη (2. 1mm X 10mm) (Waters Co., LTD) く調製試薬〉
HPLC用溶出バッファー
( 1)バッファー A :
10mM ギ酸アンモ-ゥム（pH6. 4)水溶液
(2)バッファー B : 10mM ギ酸アンモ-ゥム（pH6.4)メタノール溶液
<使用機器 >
(1) HPLC (Hewlett Packard, HP1100)
(2)タンデム質量分析装置（Micromass, Quattro micro API)
<方法 > i八へ
前記機種を用いて、以下の HPLCおよび質量分析装置の設定にて測定を行った。
ESI-MS Negative Ion Mode
[soursej
Polarity： ES-； Capillary (kV)： 2. 5 ; Extractor (V) :2 ;RF Lens (V) :0;Sours e Temp (°C) : 120 ; Desolvation Temp (°C) : 350; Cone Gas Flow(L/Hr) :59;Desolvation Gas Flow (L/Hr) :610
[MS]
LM1 Resolution :15; HM 1 Resolution :15; Ion Energyl :0. 5; Entrance: -3;Exit:l;LM2 Resolution: 15 ;HM2 Resolution: 15 ;Ion Energy2:3; Multiplier (V) :650; Syringe Pump Flow ( μ L/ min) : 10 ; Gas Cell Piran i Pressure (mbar) :2. 86E— 03
[MSMS]
Cycle time (sees) : 1. 760; Inter Channel delay (sees) :0. 02;Retention window (mins) :0. 000 to 35. 000; Ionization mode： ES—； Data type： M RM data
[表 1]
Chan Seaction Dwe ί 1 (se s) Cone Volt. Col Energy
1 0.20 34.0 0
Ϊ 0.20 34.0 22.0
3 0.20 34,0 22.0
4 0.20 34.0 22.0
5 447.21 > 153.00 0.20 34.0 22.0
8 4 ^ J 1 110 0.20 34.0 22.0
7 0.20 34.0 22.0
8 45 .24 > 153.00 0.20 34.0 22.0
9 471.21 > 153.00 0.20 34.0 22,0
10 0.20 34.0 22.0
11 489.23 > 153.00 0.20 34.0 0 [0205] [LC]
HPLC Gradient:括弧 []内はバッファー Aとバッファー Bの比率（％)を示す。
0— lmin[ 70:30] ;15min[0: 100] ;30min[0: 100] ;30. lmin[70:30] ;35mi n[70:30]
Flow Rate:0.2 L/ mm
Injection Vol. : 20^ L
Column Temp (°C)： 25
<結果 >
測定値を MassLynx解析ソフト（Waters)を用い、イオン化シグナルのクロマトチヤ一 トのピーク面積 (Area Abs)を計算した。以下の表に結果を示す。
[0206] [表 2]
Figure imgf000068_0001
[0207] 酸化体は本分析条件にて特異的にかつ非酸化体と分離され、タンデムマススぺタト ル装置にて検出された。例えば、 20:4—1^八に酸素1原子がっぃたもの（11172： 473.23)は、 blankでは検出限界以下（BQL)であった力 正常ラットの血漿中では、 113のピーク面積を示した。
産業上の利用可能性
[0208] 本発明は、以下に示すように医療分野への適用が可能である。
[0209] 本発明によって、 LPAが関与する疾患の予防および Zまたは治療物質を効率的に 得ることができる。本発明のスクリーニング方法は、 LPAを用いた従来の方法とは異 なり、各種疾患の原因物質となる高活性型 LPAをリガンドに用いているので、より生 体環境を反映したスクリーニング方法である。本発明のスクリーニング方法によって得 られた物質は、医薬品として適用することができる。

Claims

請求の範囲 [1] 標識されて 、てもよ 、高活性型 LPAを用いることを特徴とする、 LPAが関与する疾 患の予防および Zまたは治療物質のスクリーニング方法。 [2] 高活性型 LPAが、以下の一般式 (1)、（II)または (ΙΠ)
[化 1]
Figure imgf000070_0001
[式中、 R1は、酸化、ニトロ化、ニトロソ化、ニトロヒドリルイ匕および/またはァミノ化され た脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボ二ル基を表す。ただし、不斉炭 素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいもの とする。 ]で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物である請求の範囲 1記 載の方法。
R1の主鎖の炭素数力 6乃至 26である請求の範囲 2記載の方法。
R1が、以下の Q群から選択される 1種以上の部分構造を有する脂肪族炭化水素基 もしくは脂肪族炭化水素カルボニル基であって、 Q群が、
[化 2]
Figure imgf000070_0002
[式中、矢印は結合部位を表し、 Gは、
[化 3]
Figure imgf000071_0001
(式中、矢印は結合部位を表す。）または水素原子を表す。ただし、不斉炭素は、 R 配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいものとする。 ]からなる群である請求の範囲 2記載の方法。
R1が、
[化 4]
-Y-(CH2)p- E -A-E2 j-(CH2)q -H
[式中、矢印は結合部位を表し、 Yはカルボ-ル基またはメチレン基を表し、 pおよび qはそれぞれ独立して 0または 1乃至 7の整数を表し、 E1および E2はそれぞれ独立し て、 C1 4アルキレン基、 C2— 4ァルケ-レン基または結合手を表し、 Aは、結合手、
[化 5] 、
Figure imgf000071_0002
(式中、矢印は結合部位を表し、 Gは請求の範囲 4の記載と同じ意味を表す。ただし 、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していて もよいものとする。）を表し、 nは 1乃至 6の整数を表し、 nが 2以上の場合、
Figure imgf000071_0003
E2および Aはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。但し、 R1中、少なくとも 1つの A は、
[化 6]
Figure imgf000072_0001
(式中、矢印は結合部位を表し、 Gは請求の範囲 4の記載と同じ意味を表す。ただし 、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していて もよいものとする。）を表すものとする。 ]である請求の範囲 4記載の方法。
R1が、
[化 7]
— (CH2)p1— (T)r_(CH2)q1— H
[式中、矢印は結合部位を表し、 Yはカルボ-ル基またはメチレン基を表し、 piおよ び qlはそれぞれ独立して 1乃至 7の整数を表し、 Tは、
[化 8]
Figure imgf000072_0002
(式中、矢印は結合部位を表す。ただし、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、また はそれらが任意の比率で混合していてもよいものとする。）を表し、 rは 1乃至 5の整数 を表し、 rが 2以上の場合、複数の Tはそれぞれ同じでも異なっていてもよい。但し、 R 1中、少なくとも 1つの Tは、
[化 9]
Figure imgf000072_0003
(式中、矢印は結合部位を表す。ただし、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、また はそれらが任意の比率で混合していてもよいものとする。）を表すものとする。 ]である 請求の範囲 5記載の方法。 [7] R1が、 1個のヒドロペルォキシ基で置換され、 2乃至 3個の二重結合を有する炭素 数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である請求の範囲 6記載の方法。
[8] R1が、
Figure imgf000073_0001
または
Figure imgf000073_0002
[式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合し ていてもよいものとする。 ]である請求の範囲 7記載の方法。
R1が、 1乃至 3個のエポキシ基で置換され、 0または 1乃至 2個の二重結合を有する 炭素数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である請求の範囲 6記載の方法。
[10]
Figure imgf000074_0001
[式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合し て!、てもよ 、ものとする。 ]である請求の範囲 9記載の方法。
[11] LPAが関与する疾患が、泌尿器系疾患、中枢性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、 癌、糖尿病、免疫系疾患または消化器系疾患である請求の範囲 1記載の方法。
[12] 泌尿器系疾患が、排尿障害である請求の範囲 11記載の方法。
[13] 標識されていてもよい高活性型 LPAを用いることを特徴とする、 LPAが関与する疾 患の予防および zまたは治療物質のスクリーニング用キット。
[14] 請求の範囲 1記載の方法および Zまたは請求の範囲 13記載のキットを用いて得ら れた化合物、その塩、その溶媒和物またはそれらのプロドラッグを含有してなる泌尿 器系疾患、中枢性疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、糖尿病、免疫系疾患または 消化器系疾患の予防および Zまたは治療剤。
[15] 排尿障害の予防および Zまたは治療剤である請求の範囲 14記載の剤。
[16] 請求の範囲 1記載の方法および Zまたは請求の範囲 13記載のキットを用いて得ら れた化合物、その塩、その溶媒和物またはそれらのプロドラッグと、 a 1拮抗薬、抗コ リン薬、 5ひ—リダクターゼ阻害薬および抗アンドロゲン薬力 選択される 1種以上とを 組み合わせてなる排尿障害の予防および Zまたは治療剤。
[17] (1)標識されていてもよい高活性型 LPAと、（2) LPA受容体蛋白質、その部分べ プチドまたはその塩とを用いることを特徴とする請求の範囲 1記載の方法。
[18] LP A受容体力 EDG— 2、 EDG— 4、 EDG— 7または GPR23である請求の範囲 17 記載の方法。
[19] (1) (a)標識されていてもよい高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細 胞とを接触させた場合と、（2) (a)標識されていてもよい高活性型 LPAと、（b)LPA受 容体蛋白質を含有する細胞および (c)試験化合物とを接触させた場合における該細 胞の細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定し、比較することを特徴とする、請 求の範囲 17記載の方法。
[20] (1) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまた はその塩とを接触させた場合と、（2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体 蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および (c)試験化合物とを接触させた場合に おける、標識された高活性型 LPAの該 LPA受容体蛋白質、その部分ペプチドまた はその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、請求の範囲 17記載 の方法。
[21] (1) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞とを接 触させた場合と、（2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有 する細胞および (c)試験化合物とを接触させた場合における、標識された高活性型 L PAの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、請求の範囲 17記 載の方法。
[22] (1) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質を含有する細胞の膜画 分とを接触させた場合と、（2) (a)標識された高活性型 LPAと、（b)LPA受容体蛋白質 を含有する細胞の膜画分および (c)試験化合物とを接触させた場合における、標識さ れた高活性型 LPAの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特 徴とする、請求の範囲 17記載の方法。
[23] 高活性型 LPAに対する抗体。
[24] LPA受容体のシグナル伝達を不活性ィ匕する中和抗体である請求の範囲 23記載の 抗体。
[25] 請求の範囲 23記載の抗体を含有してなる LPAが関与する疾患の診断薬。
[26] 請求の範囲 17記載のスクリーニング方法を用いて化合物を選別する工程を含むこ とを特徴とする、 LPAが関与する疾患の予防および Zまたは治療物質の製造方法。
[27] 化学的または酵素的に合成した、一般式 (1)、（Π)または (III)
[化 12]
H2C-0-R1 H2C— OH H2C-0-R1
I 一 I 一 I
HO-C-H O R1— O-C-H O H-C-O^ ふ O
I II I II I
H2C-0— P-OH H2C-0-P-OH H2C— O X OH
I I OH OH
( I ) ( I I ) ( I I I )
[式中、 R1は、酸化、ニトロ化、ニトロソ化、ニトロヒドリルイ匕および/またはァミノ化され た脂肪族炭化水素基もしくは脂肪族炭化水素カルボ二ル基を表す。ただし、不斉炭 素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合していてもよいもの とする。 ]で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物。
[28] R1が、 1個のヒドロペルォキシ基で置換され、 2乃至 3個の二重結合を有する炭素 数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である請求の範囲 27記載の化合物。
[29] R1が、
[化 13]
Figure imgf000077_0001
[式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置である力、またはそれらが任意の比率で混合し て!、てもよ 、ものとする。 ]である請求の範囲 28記載の化合物。
[30] R1が、 1乃至 3個のエポキシ基で置換され、 0または 1乃至 2個の二重結合を有する 炭素数 18個の脂肪族炭化水素カルボニル基である請求の範囲 27記載の化合物。
[31] R1が、
[化 14]
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000078_0002
[式中、不斉炭素は、 R配置、 S配置であるか、またはそれらが任意の比率で混合し てレ、てもよレ、ものとする。 ]である請求の範囲 30記載の化合物。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007140434A2 (en) 2006-05-31 2007-12-06 Lpath, Inc. Immune-derived moieties reactive against lysophosphatidic acid
US20120014944A1 (en) * 2006-05-31 2012-01-19 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
US8158124B2 (en) 2007-05-30 2012-04-17 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
US8796429B2 (en) 2006-05-31 2014-08-05 Lpath, Inc. Bioactive lipid derivatives, and methods of making and using same
JP2015049050A (ja) * 2013-08-29 2015-03-16 花王株式会社 排尿障害のバイオマーカー
AU2012202713B2 (en) * 2006-05-31 2015-04-09 Lpath, Inc. Immune-derived moieties reactive against lysophosphatidic acid
US9163091B2 (en) * 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
US9274129B2 (en) 2006-05-31 2016-03-01 Lpath, Inc. Methods and reagents for detecting bioactive lipids

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110064744A1 (en) * 2007-05-30 2011-03-17 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
KR20140067048A (ko) 2011-08-15 2014-06-03 인터뮨, 인크. 라이소포스파티드산 수용체 길항제

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6380177B1 (en) * 1999-06-25 2002-04-30 Atairgin Technologies, Inc. LPA analogs as agonists of the Edg2 LPA receptor
WO2003007991A1 (fr) * 2001-07-17 2003-01-30 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Regulateurs de la secretion de suc pancreatique comprenant un agent de regulation du recepteur a lpa
JP2003294725A (ja) * 2002-03-29 2003-10-15 Sumitomo Chem Co Ltd スクリーニング方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6380177B1 (en) * 1999-06-25 2002-04-30 Atairgin Technologies, Inc. LPA analogs as agonists of the Edg2 LPA receptor
WO2003007991A1 (fr) * 2001-07-17 2003-01-30 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Regulateurs de la secretion de suc pancreatique comprenant un agent de regulation du recepteur a lpa
JP2003294725A (ja) * 2002-03-29 2003-10-15 Sumitomo Chem Co Ltd スクリーニング方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BANDOH K ET AL: "Lysophosphatidic acid (LPA) receptors of the EDG family are differentially activated by LPA species. Structure-activity relationship of cloned LPA receptors", FEBS LETTERS, vol. 478, 28 July 2000 (2000-07-28), pages 159 - 165, XP004337426 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8796429B2 (en) 2006-05-31 2014-08-05 Lpath, Inc. Bioactive lipid derivatives, and methods of making and using same
US20080145360A1 (en) * 2006-05-31 2008-06-19 Sabbadini Roger A Immune-Derived Moieties Reactive Against Lysophosphatidic Acid
EP2029626A2 (en) * 2006-05-31 2009-03-04 Lpath, Inc. Immune-derived moieties reactive against lysophosphatidic acid
EP2029626A4 (en) * 2006-05-31 2010-07-21 Lpath Inc GROUPS DERIVED FROM THE IMMUNE SYSTEM WITH REACTIVITY TO LYSOPHOSPHACIDIC ACID
US20120014944A1 (en) * 2006-05-31 2012-01-19 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
WO2007140434A2 (en) 2006-05-31 2007-12-06 Lpath, Inc. Immune-derived moieties reactive against lysophosphatidic acid
AU2012202713B2 (en) * 2006-05-31 2015-04-09 Lpath, Inc. Immune-derived moieties reactive against lysophosphatidic acid
US9217749B2 (en) * 2006-05-31 2015-12-22 Lpath, Inc. Immune-derived moieties reactive against lysophosphatidic acid
US9274130B2 (en) * 2006-05-31 2016-03-01 Lpath, Inc. Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
US9274129B2 (en) 2006-05-31 2016-03-01 Lpath, Inc. Methods and reagents for detecting bioactive lipids
US8158124B2 (en) 2007-05-30 2012-04-17 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
US9163091B2 (en) * 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
JP2015049050A (ja) * 2013-08-29 2015-03-16 花王株式会社 排尿障害のバイオマーカー

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