CN104334196A - 用于治疗自身免疫疾病和炎性疾病的组氨酰-tRNA合成酶 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及组合物和方法，其包含组氨酰-tRNA合成酶多肽或其他特异性封闭剂以用于治疗自身免疫疾病和其他炎性疾病，包括与Jo-1抗体相关的那些疾病。

Description

用于治疗自身免疫疾病和炎性疾病的组氨酰-tRNA合成酶
相关申请的交叉引用
本申请基于35U.S.C.§119(e)要求于2012年11月12日递交的美国申请第61/725,414号、于2012年6月4日递交的美国申请第61/655,358号，以及于2012年2月16日递交的美国申请第61/599,802号的权益，其各自通过引用整体并入本文。
关于序列表的申明
提供了与本申请相关的文本形式序列表以代替纸件副本，其通过引用并入本说明书中。含有该序列表的文本文件的名称为ATYR_110_03WO_ST25.txt。该文本文件为约258KB，创建于2013年2月15日，其通过EFS-Web电子递交。
发明背景
技术领域
本发明的实施方案总体上涉及具有改善的特性的组氨酰-tRNA合成酶多肽、包含所述HRS多肽的组合物，以及使用所述HRS多肽或组合物治疗各种炎症和自身免疫疾病的相关方法，其包括治疗抗-Jo-1抗体相关的炎症和自身免疫疾病的方法。
相关技术描述
Physiocrine通常为在高等生物的氨酰-tRNA合成酶(AARS)基因家族中发现的小型天然存在的蛋白结构域，其并非为蛋白合成中氨酰-tRNA合成酶的已知作用所必需的。直到发现Physiocrine范例，仅了解作为约20种酶的家族的氨酰-tRNA合成酶普遍表达于所有的活细胞中，以及它们在蛋白合成过程中的重要作用。然而，最近的科学发现现在表明，氨酰-tRNA合成酶具有除蛋白合成外的其他作用，并且事实上其在多细胞生物中已经演化为在组织生理和疾病中起着重要的自我平衡作用。
AARS的非经典的功能存在的证据包括已明确的序列比较，其确定了在从简单的单细胞生物演化为更复杂的生命形式期间，AARS已通过添加额外的结构域而不失去促进蛋白合成的能力演化为更复杂的结构。
与该假说一致的是，已在高等真核生物中发现了AARS的丰富多样的一系列扩展功能，且尤其是人tRNA合成酶的功能。该数据是基于直接分析单个结构域以及发现了与疾病有因果联系但不影响氨基酰化或蛋白合成活性的tRNA合成酶的基因突变，其表明这些新添加的结构域或Physiocrine对于新获得的AARS的非经典功能是极为重要的。
另外，人们越来越认识到，特定的tRNA合成酶如组氨酰-tRNA合成酶(HARS、HRS或HisRS)可自活细胞释放或分泌，并能提供具有尤其是免疫调节、趋化性和血管生成特性的重要局部作用信号。已经通过如下获得了AARS作为胞外信号转导分子的作用的直接确认：显示特定tRNA合成酶的分泌和胞外释放的研究，以及添加的包含新添加的结构域(Physiocrine)的tRNA合成酶片段而非缺少这些结构域的其他片段在一系列胞外信号转导通路中具有活性的直接证明。这些Physiocrine，包括衍生自HRS的那些，代表了研发新的治疗人类疾病的全新治疗蛋白的新的和此前未开发的机遇。
最近的研究还确定，一些tRNA合成酶包含新的遗传调控元件，包括ALU元件(Rudinger-Thirion et al.,PNAS USA.108(40):E794-E802,2011)，其提供增加的细胞类型特异性表达，或特定组织中或在特定疾病情况下特定tRNA合成酶的替代性剪接。而且，一些Physiocrine是以细胞类型特异性方式应答具体的刺激而经蛋白水解产生的。与Physiocrine的细胞类型特异性过表达和胞外释放一致的是，几种自身免疫疾病(通常称为抗-合成酶综合征)与产生针对一组确定的tRNA合成酶的抗体有关(TzioufasOrphanet(2001)1-5；Park et al.,Rheumatol.Int.31:529-532,2011)。
当免疫系统针对其自身组织起反应时就产生了自身免疫病症。通常基于涉及到单个组织或器官还是多个器官或组织来分类自身免疫疾病。全身性或系统性自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)的特征在于涉及多个器官和组织，其通常与针对基本的细胞组分的自身抗体的存在有关。其他自身免疫疾病的特征在于针对与单个器官或组织有关的抗原的自身抗体。
全身性自身免疫疾病的特征通常在于存在自身抗体。一些与特定疾病有关的自身抗体可为疾病特异性的，而其他自身抗体可能是许多自身免疫疾病共有的。例如，SLE是典型的免疫病症，其特征在于存在其他自身免疫疾病中可检测到的自身抗体，如抗-单链DNA抗体、抗-组蛋白抗体和抗-核糖(ribonuclear)颗粒(RNP)抗体，并且其特征还在于存在SLE-特异性自身抗体，如抗-双链DNA抗体。其他全身性自身免疫病症，如风湿性关节炎和(特发性)炎性肌肉疾病，特征也在于在患者血清中存在与基本的细胞核和细胞质胞内组分反应的自身抗体。对于SLE，这些自身抗体中的一些与其他自身免疫病症有关，而一些与自身免疫性肌肉炎特异性相关。
所述(特发性)炎性肌肉疾病多发性肌炎、皮肌炎和相关病症如多发性肌炎-硬皮病重叠为炎性肌肉疾病，其特征在于慢性肌肉炎症和近端肌无力。所述肌肉炎症引起肌肉压痛、肌无力，并最终导致肌肉萎缩和纤维变性，其描述于Plotz et al.,Annals of Internal Med.111:143-157,1989；和Wallace et al.,J.Musculoskelat Med.27(12)470-479,2010。也与肌肉炎症有关的是醛缩酶、肌酸激酶、转氨酶(如丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶)和乳酸脱氢酶的增加的血清水平。除肌肉的其他系统也可受到这些疾病状况的影响，引起关节炎、雷诺现象和间质性肺病。在临床上，多发性肌炎和皮肌炎的区别在于，患有皮肌炎的患者中存在特征性的皮疹。这些疾病状况中肌肉炎的差异可在一些肌肉病理学研究中被区分。
间质性肺病(ILD)包括一组异质的病症，其中在肺泡壁内或在支气管周围血管鞘、小叶间隔和脏层肋膜周围的疏松组织中发生纤维变性和炎症。已知不同形式的ILD，包括或与如下有关：除肌肉炎的各种自身免疫疾病，包括例如，过敏性肺炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)和肺出血-肾炎综合征。
炎性肌肉疾病(IMD)和间质性肺病(ILD)是可能危及生命的严重慢性自身免疫疾病，其当前护理标准包括非特异性抗炎药如可能具有很大副作用的皮质类固醇。这些疾病发作的原因还未确定，尽管在约90％患有多发性肌炎和皮肌炎的患者中可检测到自身抗体，参见Reichlin和Arnett,Arthritis and Rheum.27:1150-1156,1984。约60％的这些患者的血清在Ouchterlony免疫扩散(ID)中与牛胸腺或人脾脏提取物形成沉淀，而通过间接免疫荧光法(IIF)约80％的这些患者的血清能着染组织培养基质，如HEp-2细胞(Targoff and Reichlin,Arthritis and Rheum.28:796-803,1985；Nishikai and Reichlin,Arthritis and Rheum.23:881-888,1980；和Reichlin etal.,J.Clin.Immunol.4:40-44,1984)。在肌肉炎患者中存在许多沉淀自身抗体特异性，但每个单独抗体特异性仅在一部分患者中发生。
已经确定了许多与肌肉炎或肌肉炎重叠综合征有关的自身抗体，且在一些情况下所述抗体已被鉴定(参见美国专利第6,610,823号，Antigensassociated with polymyositis and with dermatomyositis(与多发性肌炎和皮肌炎相关的抗原))。这些包括存在于其他病症中的抗体以及疾病特异性抗体，其描述于Targoff and Reichlin,Mt.Sinai J.of Med.55:487-493,1988。
例如，已确认了一组与肌肉炎有关的自身抗体，其针对与tRNA和蛋白合成有关的胞质蛋白，尤其是氨酰-tRNA合成酶。这些包括抗-Jo-1，其针对组氨酰-tRNA合成酶，并且是与肌肉炎自身免疫病症有关的最常见的自身抗体(约20-40％的这类患者，参见Nishikai and Reichlin,ArthritisRheum.23:881-888,1980)；抗-PL-7，其针对苏氨酰-tRNA合成酶；抗-PL-12，其针对丙氨酰-tRNA合成酶；抗-OJ，其针对异亮氨酰-tRNA合成酶；抗-EJ，其针对甘氨酰-tRNA合成酶；抗-KS，其针对天冬氨酰-tRNA合成酶(通常参见，Targoff,Curr.Opin.Rheumatol.12475-481,2000)以及针对苯丙氨酸-tRNA合成酶(Betteridge et al.,Rheumat.461005-1008,2007)。一组特征性的特性通常与抗-合成酶有关(Love et al.,Medicine.70:360-374,1991)。
经常发现于患有SLE的患者中的抗-U1RNP也可发现于混合结缔组织病、包括肌肉炎的重叠综合征，或者有些情况下仅肌肉炎中。该抗体与独特地存在于U1小核核糖核蛋白(参与剪接mRNA的核RNP中的一种)上的蛋白反应。与其他疾病状况有关的自身抗体有时可发现于患有重叠综合征的患者中，如抗-Sm、抗-Ro/SSA和抗-La/SSB。抗-Ku已发现于肌肉炎-硬皮病重叠综合征和SLE中。Ku抗原是有两种多肽组分(二者均已被克隆)的DNA结合蛋白复合体。抗-Jo-1和其他抗-合成酶均为疾病特异性的。其他与肌肉炎有关的抗体为抗-PM-Scl，其存在于约5-10％的肌肉炎患者中，他们中很多患有多发性肌炎-硬皮病重叠；和抗-Mi-2，其存在于约8％的肌肉炎患者(几乎仅在皮肌炎)中。抗-Mi-2以高滴度发现于约20％的所有皮肌炎患者中，并通过仅ELISA以低滴度发现于少于5％的多发性肌炎患者中(Targoff and Reichlin,Mt.Sinai J.of Med.55:487-493,1988)。
通常，患者在相对年轻时出现炎性肌肉疾病(IMD)和间质性肺病(ILD)，并且在其他方面健康状况良好，不幸的是，在小部分的患者中疾病进展可导致重大残疾和高发病率。而且，目前还不存在特别批准用于治疗普通人群的IMD和ILD的药物。当前的护理标准是给予非特异性的抗炎和免疫调节药物如甲氨蝶呤或咪唑硫嘌呤，且如果症状没有减轻，则给予环孢霉素(Wallace et al.,J.Musculoskelat Med.27:470-479,2010)。如果长期用药，这些药物具有可能会很严重的副作用的重大风险。在严重的进行性疾病中，个体可用静脉注射免疫球蛋白(IVIG)来治疗。治疗IVIG患者的护理负担和费用很高(每位患者每月高达$10,000的治疗费用)，且大部分患者治疗失败而死亡。
因此，对改善的、具有疗效和成本效益的治疗炎性肌肉疾病和相关疾病状况的方法的需求仍远未被满足。
附图说明
图1显示了示例性HRS来源的多肽在TNBS诱导的结肠炎模型中的可能的抗炎特性。在雄性BDF-1小鼠中进行研究，12只小鼠/组；将5mg/kg的TNBS和布地奈德(Budesonide)加入水中。从TNBS处理前3天开始，每天以1或5mg/Kg的浓度通过静脉注射给予Resokine(HisRSN4；HRS(1-60))。
图2显示了全长HRS和HRS(1-506)在非还原和还原条件下的SDS-PAGE分析。凝胶图显示，全长HRS是正常和还原条件下的非共价和SS-连接的二聚体的～50:50混合物，而且相比全长蛋白，HRS(1-506)显示了明显降低的SS-连接的二聚体形成、增加的同质性和单分散性。
图3显示了通过ELISA分析的含有抗-Jo-1抗体的血清与全长HRS的竞争，其中全长野生型HisRS附着于96孔板的表面。该图显示了获自人血清样品的血清的三种稀释溶液的数据。
图4显示了通过ELISA分析的相比全长人HisRS(FL-hu HisRS)，含有抗-Jo-1抗体的血清与Resokine(HisRSN4；HRS(1-60))的竞争，其中全长野生型HisRS附着于96孔板的表面。该数据显示了，当全长组氨酰-tRNA合成酶附着于所述孔板的表面时，Resokine没有显著性竞争抗体与全长HisRS的结合，直到提供的浓度大于约1x10-7M。
图5显示了通过ELISA分析的相比全长人HisRS，含有抗-Jo-1抗体的血清与HisRSN8(HRS(1-506))的竞争，其中全长野生型人HisRS附着于96孔板的表面。该数据显示了，针对抗-Jo-1抗体，HisRSN8和全长HisRS共同具有基本上相同的竞争结合曲线。
图6显示了使用附着于所述孔板表面的基本上全长的HARS或HisRSN4(HRS(1-60))的抗-Jo-1抗体的标准滴定ELISA。该数据显示，当该分析在这些条件下运行时，在含有抗-Jo-1抗体的血清中抗体对于HisRSN4的表观滴定度与全长HisRS相当。
图7显示了用于表位作图研究的HRS剪接变体和其他HRS构建体的示意图。
图8显示了表位作图研究的结果，并展示了针对与WHEP结构域(HisRSN4；SV9；或HRS(1-60))的结合或缺少该WHEP结构域的缺失的HisRS(包含SEQ ID NO:1的氨基酸54-506)(dWHEP)构建体，一系列Jo-1阳性抗体样品的抗体选择性。
图9显示了使用全长HRS和HRS(1-506)的免疫耗竭研究的结果。该结果显示，在来自人血清样品的免疫耗竭的Jo-1抗体中，全长HARS和HRS(1-506)均为有效的，且HRS(1-506)能够清除高达99％的可检测的Jo-1抗体。
图10A显示了在他汀类诱导的肌肉炎大鼠模型中，用于评估HRS(1-506)(或ATYR1940)效果的给药策略的示意图。图10B显示了在他汀类诱导的肌肉炎的大鼠模型中，HRS(1-506)对降低肌肉肌钙蛋白水平的影响。
图11A-11B显示了在他汀类诱导的肌肉炎的大鼠模型中，HRS(1-506)对CK水平的影响。
图12显示相比未处理的大鼠，他汀类处理的大鼠的内源血清HRS水平提高了。该结果表明，内源HRS的释放可在调控肌肉炎症中起作用。
图13显示了在他汀类诱导的肌肉炎的大鼠模型中腿筋的H&E染色。这些结果表明，相比媒介物处理的和0.3mg/kg HRS(1-506)-处理的大鼠，用1mg/kg和3mg/kg HRS(1-506)处理的他汀类诱导的大鼠的肌肉退化/坏死和炎症分数降低。
图14显示了对来自以增加的HRS(1-506)量处理的他汀类诱导的大鼠的腿筋肌肉进行的RNA特性分析的结果。这些结果证明，应答他汀类处理而提高了多于5倍的所有13个基因均通过HRS(1-506)处理而降低了。
图15A显示了对来自他汀类诱导的大鼠的腿筋肌肉进行的RNA特性分析的结果，且图15B显示了用HRS(1-506)处理的他汀类诱导的大鼠的结果。
图16显示了来自他汀类诱导的大鼠的腿筋的转录特性分析。这些结果揭示了，10个糖尿病/代谢综合征相关基因和几个管家基因的表达(数据未显示)没有明显受到HRS(1-506)处理的影响。
图17显示了来自他汀类诱导的大鼠的腿筋的转录特性分析。这些结果揭示了，许多免疫细胞标记基因的表达通过HRS(1-506)处理而降低了。
图18A-18D显示了HRS(1-506)处理降低了免疫细胞标记基因ITGAL(CD11a)(图18A)、CD11b(图18B)、CD8a(图18C)、CD8b(图18D)的表达。
图19A-19C显示了HRS(1-506)处理降低了免疫细胞标记基因CD18(图19A)、CCR5(图19B)和PTPPC(CD45R)(图19C)的表达。
图20显示了来自他汀类诱导的大鼠的腿筋的转录特性分析。这些结果揭示了，许多炎症标记基因的表达通过HRS(1-506)处理而降低了。
图21A-21D显示了，HRS(1-506)处理降低了炎症标记基因IL-6(图21A)、MCP1(图21B)、IL-10(图21C)和IFN-γ(图21D)的表达。
图22-23显示了来自他汀类诱导的大鼠的腿筋的转录特性分析。这些结果揭示了，各种粘附、发展和纤维变性相关的基因的表达通过HRS(1-506)处理而改变了。
图24-25显示了来自他汀类诱导的大鼠的腿筋的转录特性分析。这些结果揭示了，各种与肌肉消耗、萎缩和肌生成相关的基因的表达通过HRS(1-506)处理而改变了。图24B显示了MMP3的结果，且图24C显示了MMP9的结果。
图26A-26B显示了HRS(1-506)在杜兴氏肌营养不良症(DMD)的mdx小鼠模型中的效果。相比媒介物对照，在用HRS(1-506)或地塞米松处理的小鼠中观察到血清CK(图26A)、AST(图26B)和LDH(图26C)的降低。
图27A-27B显示了用全长小鼠HRS(mHRS)在SJL/J小鼠中进行免疫的效果。这些小鼠在Dysferlin外显子45的3’剪接点具有171bp的框内缺失，并发展了与肌肉炎症有关的自发性肌肉疾病。该小鼠提供了人Dysferlin缺陷型肌肉疾病的遗传模型，如肢带型肌营养不良症-2B型(LGMD2B)。图27A显示了，用mHisRS经皮下免疫SJL/J小鼠产生了针对全长HisRS的强抗体应答。如图27B所示，来自用HisRS免疫的小鼠的肌肉组织显示了多个区域的细胞浸润和肌肉炎，且与该组织病理学一致，两只免疫的小鼠展现了肌肉炎的病征。
图28A-28B显示了全长HRS和HRS(1-506)的差示扫描荧光分析(DSF)。图28A显示了在pH7-7.5孵育后全长HRS有两次热转变；如箭头所示第一次转变发生在48℃，而主要转变发生在～54℃。图28B显示了组氨酸缓冲剂浓度范围内HRS(1-506)的热稳定性或解链温度。这些结果表明，组氨酸缓冲剂能够显著地稳定HRS多肽如HRS(1-506)的构象。
发明概述
本发明的实施方案部分地基于该出人意料的发现，即用例如HRS多肽或其他抗体-特异性封闭剂特异性封闭其他情况下具致病性的抗-Jo-1抗体(也称Jo-1抗体)的活性、结合或产生，可用于治疗患有炎症或自身免疫疾病的对象，并且可以防止或明显地延迟疾病进展。该发现的一个优势为，抗-Jo-1抗体的负面作用可被克服，且对对象免疫系统具有很小的或没有衰减，而产生明显降低的副作用特性。而且，该方法可广泛适用于其他疾病，包括炎性疾病和相关的病症，其中存在局部或暂时性组氨酰-tRNA合成酶不足。
因此，某些实施方案涉及治疗组合物，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的、长度约为20-90个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；和c)基本上无内毒素。在某些实施方案中，所述HRS多肽的至少20个氨基酸来自SEQ ID NO:1的第1-67位残基所限定的区。在一些实施方案中，所述HRS多肽的至少40个氨基酸来自SEQ ID NO:1的第1-67位残基所限定的区。在一些实施方案中，所述HRS多肽的至少60个氨基酸来自SEQ IDNO:1的第1-67位残基所限定的区。
还包括治疗组合物，其包含长度为至少约400个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，所述HRS多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的80个或更多个连续的氨基酸，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；和c)基本上无内毒素。在某些实施方案中，所述HRS多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的200个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的400个或更多个氨基酸。在某些实施方案中，所述HRS多肽的长度为至少约500个氨基酸。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含全长人HRS(SEQ ID NO:1)的序列。在一些实施方案中，所述HRS多肽在SEQ ID NO:1的残基505(HRS(1-505))或506(HRS(1-506))处被截短。
某些实施方案涉及治疗组合物，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的长度为至少约400个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；和c)基本上无内毒素。在一些实施方案中，所述HRS多肽的长度为至少约500个氨基酸，其与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性。在某些实施方案中，所述HRS多肽包含SEQ ID NO:1(全长人HRS)的序列。在一些实施方案中，所述HRS多肽在SEQ ID NO:1的残基505(HRS(1-505))或506(HRS(1-506))处被截短。
还包括治疗组合物，其包含长度为500-506个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，所述HRS多肽与SEQ ID NO:70(HRS(1-506))具有至少90％的同一性，并且缺少SEQ ID NO:1的第507-509位残基，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；和c)基本上无内毒素。在某些实施方案中，所述HRS多肽的长度为505-506个氨基酸，其与SEQ ID NO:70具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述HRS多肽的长度为506个氨基酸。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含SEQ IDNO:70。在一些实施方案中，所述HRS多肽基本上由SEQ ID NO:70组成。在某些实施方案中，所述HRS多肽由SEQ ID NO:70组成。在一些实施方案中，所述HRS多肽的长度为505个氨基酸。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含SEQ ID NO:70的残基2-506(HRS(2-506))。在一些实施方案中，所述HRS多肽基本上由SEQ ID NO:70的残基2-506(HRS(2-506))组成。在具体的实施方案中，所述HRS多肽由SEQ ID NO:70的残基2-506(HRS(2-506))组成。
在一些实施方案中，所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。在某些实施方案中，所述至少一个半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235和Cys455。
在一些实施方案中，在约4-40℃和pH约6.0-8.0的可比较条件下，相比SEQ ID NO:1(全长人HRS)的多肽，所述HRS多肽(例如，缺少SEQ IDNO:1的残基507-509)具有增加的生物活性、稳定性和/或同质性。在一些实施方案中，所述条件包括温度约20-25℃(室温)和pH约7.0-7.5，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。在某些实施方案中，所述条件包括温度约37℃和pH约7.0-7.5，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。
在一些实施方案中，增加的活性包括至少约10％的非经典生物活性的绝对增加。在一些实施方案中，所述非经典活性是抗炎活性或特异性结合抗-Jo-1抗体。在某些实施方案中，相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽，所述HRS多肽在还原条件下具有减少的链间二硫键形成。在某些实施方案中，相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽，所述HRS多肽具有减少的(电荷)异质性。在一些实施方案中，相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽，所述HRS多肽在溶液中具有减少的高分子量聚集体形成。在某些实施方案中，增加的同质性包括相比SEQ ID NO:1的多肽，所述HRS多肽的单分散性的至少10％的增加。在一些实施方案中，相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽，所述HRS多肽在在大肠杆菌中重组制备后具有增加的可溶性蛋白产率。
在某些实施方案中，所述HRS多肽融合至异源的融合伴侣，任选T-细胞配体。在具体的实施方案中，所述HRS多肽包含至少一种D-氨基酸。
在一些实施方案中，所述治疗组合物包含浓度范围为约0.03mM至约100mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述治疗组合物包含浓度范围为约2mM至约50mM的缓冲剂。在某些实施方案中，所述治疗组合物包含浓度范围为约40mM至约60mM的缓冲剂。在某些实施方案中，所述治疗组合物包含浓度范围为约45mM至约55mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述治疗组合物包含浓度为约50mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
在某些实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂，且其中在范围约4-40℃和pH约7.0-7.5的可比较的条件下，相比没有所述组氨酸缓冲剂的可比较组合物中对应的HRS多肽，所述HRS多肽具有增加的稳定性。
在某些实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂，且其中在范围约4-40℃和pH约6.5-7.5的可比较的条件下，相比没有所述柠檬酸盐缓冲剂的可比较组合物中对应的HRS多肽，所述HRS多肽具有增加的稳定性。
在某些实施方案中，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂，且其中在范围约4-40℃和pH约7.0-7.5的可比较的条件下，相比没有所述磷酸盐缓冲剂的可比较组合物中对应的HRS多肽，所述HRS多肽具有增加的稳定性。
在一些实施方案中，所述条件(例如，用于比较)包括温度约5℃，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。在一些实施方案中，所述条件包括温度约20-25℃(室温)，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。在某些实施方案中，所述条件包括温度约37℃，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。
在一些实施方案中，增加的稳定性包括热稳定性，其中所述HRS多肽的解链温度(Tm)比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物中相应的HRS多肽的解链温度高至少约5℃。在一些实施方案中，增加的稳定性包括热稳定性，其中所述HRS多肽的解链温度以比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物中相应的HRS多肽的速率慢至少10％的速率展开。
在某些实施方案中，在在其他情况下可比较的条件下，相比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物，所述组合物具有减少的聚集和/或沉淀。在一些实施方案中，如通过A340处的吸光度所测，聚集减少了至少约10％。在某些实施方案中，在在其他情况下可比较的条件下，相比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物，所述组合物具有减少的高分子量聚集体。
在一些实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂，且所述HRS多肽与SEQ ID NO:1的残基1-506或2-506具有至少90％的同一性，并且缺少SEQ ID NO:1的第507-509位残基。在某些实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂，且所述HRS多肽与SEQ ID NO:1的残基1-506或2-506具有至少90％的同一性，并且缺少SEQ ID NO:1的第507-509位残基。在一些实施方案中，所述HRS多肽是HRS(1-506)或HRS(2-506)。
在一些实施方案中，所述组合物包含的氯化钠(NaCl)的浓度范围为约100-300mM，任选地为约140mM-240mM，或任选地为约140mM。在某些实施方案中，所述HRS多肽与SEQ ID NO:1的残基1-506或2-506具有至少90％的同一性，并且缺少SEQ ID NO:1的第507-509位残基，任选地其中所述HRS多肽具有至少约60℃的解链温度(Tm)。在某些实施方案中，所述HRS多肽是HRS(1-506)或HRS(2-506)，任选地其中所述HRS多肽具有至少约60℃的解链温度(Tm)。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂选自：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、精氨酸、甘氨酸和甘油。在一些实施方案中，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂的浓度范围为约0.2％-5.0％。在某些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂为约1％-3％蔗糖，任选地为约2％蔗糖。在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂为约1％-3％海藻糖，任选地为约2％海藻糖。
在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。在一些实施方案中，所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20(PS20)、聚山梨醇酯40(PS40)、聚山梨醇酯60(PS60)或聚山梨醇酯80(PS80)。在某些实施方案中，所述聚山梨醇酯为PS20。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆为普朗尼克(Pluronic)F68。在一些实施方案中，所述表面活性剂存在的范围为约0.1-5.0％(w/v)。在一些实施方案中，为约0.05％(w/v)的PS20。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种抗氧化性化合物或还原剂。在一些实施方案中，所述抗氧化性化合物或还原剂选自：半胱氨酸、蛋氨酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，所述抗氧化性化合物或还原剂存在的浓度范围为约0.1-5.0mM。
在某些实施方案中，所述组合物包含一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂为乙二胺四乙酸盐(EDTA)。在一些实施方案中，所述螯合剂存在的浓度范围为约0.1-2.0mM。
在某些组合物中，所述HRS多肽存在的浓度为至少约10mg/ml。在一些组合物中，所述HRS多肽存在的浓度为至少约25mg/ml。在一些组合物中，所述HRS多肽存在的浓度为至少约50mg/ml。
在某些实施方案中，如通过A340处的吸光度所测，所述组合物具有的浑浊度小于约0.5。在一些实施方案中，A340处的吸光度是在37℃孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。在一些实施方案中，A340处的吸光度是在室温孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。在某些实施方案中，A340处的吸光度是在冻融所述组合物至少1、2、3、4或5次后测量的。
在一些实施方案中，如通过A580处的吸光度所测，所述组合物具有的乳白光小于约0.6。在一些实施方案中，A580处的吸光度是在37℃孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。在一些实施方案中，A580处的吸光度是在室温孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。在某些实施方案中，A580处的吸光度是在冻融所述组合物至少1、2、3、4或5次后测量的。
在一些实施方案中，所述组合物具有小于约3％的高分子量聚集体。在一些实施方案中，高分子量(HMW)聚集是在37℃孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。在某些实施方案中，高分子量(HMW)聚集是在室温孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。在一些实施方案中，高分子量聚集是在冻融所述组合物至少1、2、3、4或5次后测量的。
在某些实施方案中，所述HRS多肽在所述组合物中具有的解链温度(Tm)为至少约50℃。在一些实施方案中，所述HRS多肽在所述组合物中具有的解链温度(Tm)为至少约55℃。在一些实施方案中，所述HRS多肽在所述组合物中具有的解链温度(Tm)为至少约60℃。
在某些实施方案中，所述HRS多肽具有至少约90％或95％的单分散性。
在一些实施方案中，所述组合物包含约50mM L-组氨酸、约140mMNaCl、约2％海藻糖、约0.05％聚山梨醇酯20(PS20)，并且具有约7.0-7.4的pH。在一些实施方案中，所述组合物包含约50mM L-组氨酸、约140mMNaCl、约2％蔗糖、约0.05％聚山梨醇酯20(PS20)，并且具有约7.0-7.4的pH。在一些实施方案中，所述HRS多肽是HRS(1-506)或HRS(2-506)，且在所述组合物中具有的解链温度(Tm)为至少约60℃。在某些实施方案中，如通过A340处的吸光度所测，所述组合物的浑浊度小于约0.1或小于约0.05。在一些实施方案中，如通过A580处的吸光度所测，所述组合物具有的乳白光小于约0.1或小于约0.05。在某些实施方案中，所述组合物具有小于约2％或小于约1％的高分子量聚集体。
在某些实施方案中，本发明包括医用组合物，其包含与人HRS(SEQID NO:1)具有至少90％同一性的20-90个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，至少20-40个氨基酸位于人HRS(SEQ ID NO:1)的氨基酸1-67之内。在具体的实施方案中，至少一个氨基酸为D-氨基酸。在一些方面，所述多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；和c)基本上无内毒素。
在另一个实施方案中，本发明包括医用组合物，其包含HRS多肽的至少约400个氨基酸的多肽；其中所述多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；和c)基本上无内毒素。
在另一个实施方案中，本发明包括医用组合物，其包含至少约400个氨基酸的多肽；其中所述多肽：a)与人HRS(SEQ ID NO:1)具有至少80％同一性；b)纯度为至少约95％；c)聚集小于约5％；和d)基本上无内毒素。
在任何这些医用或治疗组合物的一些方面，所述多肽包含全长HRS多肽。在一些方面，所述HRS多肽在约残基505或506处被截短。在一些方面，所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。在一些方面，所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、Cys455、Cys507和Cys509。在一些方面，所述多肽包含至少一个D-氨基酸。在一些方面，所述多肽包含WHEP结构域。在一些方面，所述多肽包含与SEQID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列具有80％同一性的氨基酸序列，或列举或来源于表1-9中任一个的氨基酸序列。在一些方面，所述多肽与异源蛋白融合。在一些方面，所述异源蛋白包含T细胞配体。在一些方面，所述组合物被配制为用于经口、鼻内、肺部或肠胃外给药来递送。
在一些方面，所述医用或治疗组合物用于治疗选自以下的疾病：自身免疫疾病、炎性疾病、炎性肌肉疾病，包括(特发性)炎性肌肉疾病、多发性肌炎、皮肌炎和相关病症、多发性肌炎-硬皮病重叠、包涵体肌炎(IBM)、抗合成酶综合征、间质性肺病、关节炎、雷诺现象(Reynaud’sphenomenon)、Perrault综合征和Usher综合征。在一些方面，所述表位是被来自对象的血清中的抗体识别的免疫优势表位。在一些方面，所述HRS多肽结合人组织相容性复合体(MHC)I型或II型分子。在一些方面，所述核酸可操作地与表达调控序列偶联，且其中所述核酸的表达引起耐受性。在一些方面，所述治疗组合物包含选自脂质体、胶束、乳剂和细胞的递送载体。
在另一个实施方案中，本发明包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽能够代替所述组氨酰-tRNA合成酶的至少一种经典的或非经典的功能。在一些实施方案中，在浓度高达约5x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
在另一个实施方案中，本发明包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中所述HRS多肽能够引起耐受性。
在另一个实施方案中，本发明包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病的治疗组合物，所述组合物包含编码哺乳动物HRS多肽的重组核酸，其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中所述核酸可操作地与表达调控序列偶联，且其中所述核酸的表达引起耐受性。
在另一个实施方案中，本发明包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病的治疗组合物，所述组合物包含重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中所述核酸可操作地与表达调控序列偶联，以使得能在所述宿主细胞中表达所述HRS。
在另一个实施方案中，本发明包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病的治疗组合物，所述组合物包含抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白，其中所述抗体或结合蛋白阻止所述自身抗体结合天然的组胺酰-tRNA合成酶。
一些实施方案涉及用于治疗炎性疾病的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有至少一种非经典活性。
还包括用于治疗肌营养不良症的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有至少一种非经典活性。在一些方面，所述肌营养不良症选自：杜兴氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、埃-德氏肌营养不良症、肢-带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症和先天性肌营养不良症。
某些实施方案包括用于治疗横纹肌溶解症、肌肉萎缩、恶病质、肌肉炎症或肌肉损伤的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有至少一种非经典活性。
在另一个实施方案中，本发明包括HRS多肽在制备用于治疗炎性疾病或自身免疫疾病的药物中的应用。在另一个实施方案中，本发明包括HRS多肽在制备用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病的药物中的应用。
在任何这些治疗组合物或应用的一些方面，所述HRS多肽诱导耐受性。在一些方面，所述HRS多肽长度为约10至约60个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约60至约120个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约120至约200个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽为全长的。在一些方面，所述HRS多肽在约残基505或506处被截短。在一些方面，所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。在一些方面，所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、C224、Cys235、Cys455、Cys507和Cys509。在一些方面，所述HRS多肽包含至少一个D-氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽包含WHEP结构域。在一些方面，所述HRS多肽包含与SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，或与表D1、D3-D6或D8中的序列中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述HRS多肽与异源蛋白融合。在一些方面，所述异源蛋白包含T细胞配体。在一些方面，所述组合物被配制为用于经口、鼻内、肺部或肠胃外给药来递送。在一些方面，所述治疗组合物包含选自脂质体、胶束、乳剂和细胞的递送载体。
还包括治疗与自身抗体有关的疾病的方法，其包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，或d)抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白。
在一些方面，在出现疾病症状前，向所述对象给予所述治疗组合物。在某些方面，所述自身抗体对组氨酰-tRNA合成酶具有特异性。在一些方面，所述HRS多肽包含所述组氨酰-tRNA合成酶的至少一个被所述疾病特异性的自身抗体识别的表位。在一些方面，所述HRS多肽阻止所述自身抗体结合天然的组胺酰-tRNA合成酶。在一些方面，所述HRS多肽导致自身反应性T细胞的克隆缺失。在一些方面，所述HRS多肽导致参与自身免疫应答的T细胞的功能失活。在一些方面，所述HRS多肽导致减少的肌肉或肺部炎症。在一些方面，所述HRS多肽诱导耐受性。在一些方面，所述HRS多肽长度为约10至约60个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约60至约120个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约120至约200个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽为全长的。在一些方面，所述HRS多肽在约残基505或506处被截短。在一些方面，所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。在一些方面，所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、C455、Cys507和Cys509。在一些方面，对应于全长HRS(SEQ ID NO:1)的残基507、508和509缺失。在一些方面，所述HRS多肽包含至少一种D-氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽包含WHEP结构域。在一些方面，所述HRS多肽包含与SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，或与表D1、D3-D6或D8中的序列中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述HRS多肽与异源蛋白融合。在一些方面，所述异源蛋白包含T细胞配体。在一些方面，所述组合物被配制为用于经口、鼻内、肺部或肠胃外给药来递送.
在一些方面，所述疾病选自：炎性肌肉疾病，包括炎性肌肉疾病、多发性肌炎、皮肌炎和相关病症、多发性肌炎-硬皮病重叠、包涵体肌炎(IBM)、抗合成酶综合征、间质性肺病、关节炎和雷诺现象，以及本文描述的其他疾病或疾病状况。在一些方面，所述表位是被来自对象的血清中的抗体识别的免疫优势表位。在一些方面，所述HRS多肽结合人组织相容性复合体(MHC)II型分子。在一些方面，所述核酸可操作地与表达调控序列偶联，且其中所述核酸的表达引起耐受性。在一些方面，所述治疗组合物选自脂质体、胶束、乳剂和细胞的递送载体。
还包括降低组织炎症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。在一些方面，所述组织选自肌肉、肺和皮肤。
一些实施方案涉及降低肌肉或肺部炎症的方法，所述方法包括向对象给予治疗组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
还包括治疗肌营养不良症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。在一些方面，所述肌营养不良症选自：杜兴氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、埃-德氏肌营养不良症、肢-带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症和先天性肌营养不良症。
一些实施方案涉及治疗横纹肌溶解症、肌肉萎缩、恶病质、肌肉炎症或肌肉损伤的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
某些实施方案包括诱导对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的耐受的方法，所述方法包括向对象给予治疗组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物导致对所述自身抗原的耐受性。
一些实施方案包括用于清除参与对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的自身免疫应答的T细胞群或亚群的方法，所述方法包括向对象给予治疗组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物导致自身反应性T细胞的克隆缺失。
还包括在参与对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的自身免疫应答的T细胞中诱导无能的方法，所述方法包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物导致参与自身免疫应答的T细胞的功能失活。
在一些实施方案中，用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病的替代疗法，包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽；或d)抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白；其中所述HRS多肽功能性补偿了所述组氨酰-tRNA合成酶不足。
还包括治疗炎性疾病或自身免疫疾病的方法，其包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含至少一种HRS多肽。
在一些方面，在浓度高达约5x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
在一些方面，所述HRS多肽长度为约10至约60个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约60至约120个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约120至约200个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约200至约400个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽长度为约400至约500个氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽为全长的。在一些方面，所述HRS多肽在约残基505或506处被截短。在一些方面，所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。在一些方面，所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、C455、Cys507和Cys509。在一些方面，所述HRS多肽包含至少一种D-氨基酸。在一些方面，所述HRS多肽包含WHEP结构域。在一些方面，所述HRS多肽包含与SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，或与表D1、D3-D6或D8中的序列中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述HRS多肽与异源蛋白融合。在一些方面，所述异源蛋白包含T细胞配体。在一些方面，所述组合物被配制为用于经口、鼻内、肺部或肠胃外给药来递送。在一些方面，所述疾病选自：炎性肌肉疾病，包括炎性肌肉疾病、多发性肌炎、皮肌炎和相关病症、多发性肌炎-硬皮病重叠、包涵体肌炎(IBM)、抗合成酶综合征、间质性肺病、关节炎和雷诺现象。在一些方面，所述表位是被来自对象的血清中的抗体识别的免疫优势表位。在一些方面，所述HRS多肽结合人组织相容性复合体(MHC)II型分子。在一些方面，所述核酸可操作地与表达调控序列偶联，且其中所述核酸的表达引起耐受性。在一些方面，所述治疗组合物包含选自脂质体、胶束、乳剂和细胞的递送载体。
还包括测定样品中HRS多肽或其片段的存在或水平的方法，其包括将所述样品与特异性结合所述HRS多肽的一种或多种结合剂接触，并检测所述结合剂是否存在，从而确定所述HRS多肽的存在或水平。
一些实施方案包括测定抗-HRS多肽抗体对特定HRS多肽的表位特异性的方法，所述方法包括将所述抗体与一种或多种HRS多肽接触，并检测是否存在结合剂，从而确定所述抗体的表位特异性。在该方法的某些方面，所述HRS多肽长度达约80个氨基酸，且包含WHEP结构域。
一些实施方案包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含至少一种HRS多肽，其中在浓度高达约1x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
在本发明的另一个方面，所述HRS多肽可用于描述患者的特性以确定其Jo-1抗体疾病负担。该特性描述使得能够将患者挑选到可从HRS多肽治疗获益的亚群中，预测可能的治疗结果，和/或确定最适合用作治疗剂的HRS多肽。
因此，某些实施方案涉及用于确定存在对HRS多肽给药具有不利的免疫应答的风险的人对象的方法，其包括：a)测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象具有针对组氨酰-tRNA合成酶或所述HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。在一些方面，如果对象血清中具有的组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度大于约2微摩尔，则可将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。在一些方面，如果对象血清中具有的组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度大于约4微摩尔，则可将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的高风险。
还包括挑选HRS多肽以治疗患有自身免疫或炎性疾病状况的人对象的方法，其包括：a)测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)挑选相比野生型组氨酰-tRNA合成酶，具有针对抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的降低的亲和力的HRS多肽。
一些实施方案涉及预测人对象的疾病进展的方法，其包括：a)测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象具有针对组氨酰-tRNA合成酶或所述HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为存在发展更严重疾病的风险。
还包括预测对象对HRS多肽给药的应答的方法，其包括：测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象没有针对组氨酰-tRNA合成酶或所述HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
在一些方面，如果对象血清中具有的组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度小于约1微摩尔，则可将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
在一些方面，如果对象血清中具有的组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度小于约0.1微摩尔，则可将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
在一些方面，如果对象血清中具有的组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度大于约0.01微摩尔，则可将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
还包括用于体外免疫吸附来自细胞外体液的抗-组氨酰-tRNA合成酶(HRS)抗体的方法，其包括：(a)提供已从对象获得的细胞外体液，将所述细胞外体液与吸附有至少一种组氨酰-tRNA合成酶多肽的生物相容性固体载体接触，从而将所述抗-HRS抗体捕获在固体载体上，和(c)将来自步骤(b)的所述细胞外体液重新输入至对象中。在一些方面，抗-HRS抗体包括抗-Jo-1抗体。
发明详述
除非另有相反的具体指示，本发明的实施将采用本领域内分子生物学和重组DNA技术的常规方法，为了说明的目的，它们中许多被描述于下文中。这类技术在文献中有完整解释。参见例如，Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2000)；DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I & II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications(P.Herdewijn,ed.,2004)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins,eds.,1985)；Nucleic Acid Hybridization:Modern Applications(Buzdin andLukyanov,eds.,2009)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins,eds.,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986)；Freshney,R.I.(2005)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,5th Ed.Hoboken NJ,John Wiley & Sons；B.Perbal,A Practical Guide to MolecularCloning(3rd Edition 2010)；Farrell,R.,RNA Methodologies:A LaboratoryGuide for Isolation and Characterization(3rd Edition2005).Poly(ethyleneglycol),Chemistry and Biological Applications,ACS,Washington,1997；Veronese,F.,and J.M.Harris,Eds.,Peptide and protein PEGylation,Advanced Drug Delivery Reviews,54(4)453-609(2002)；Zalipsky,S.,et al.,“Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols)for modification ofpolypeptides”,Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and BiomedicalApplications。提供以上讨论的出版物仅针对其在本申请递交日前的公开。不应将本文中的任何内容解释为承认本发明不能凭借在先发明而享有比这些公开更早的日期。
定义
除非另有定义，本文所用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。虽然类似于或等同于本文所述那些的任何方法和材料都可用于本发明的实施或测试中，但还是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，下面定义了下列术语。
如本文所用，冠词“a”和“an”是指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。举例来说，“元件(an element)”是指一个元件或一个以上的元件。
“约”是指相比参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
术语“无能”是指T-细胞或B-细胞应答抗原再刺激的功能性失活。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括在蛋白生物合成期间利用的20种(L)-氨基酸以及其他氨基酸，例如，4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如，(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等，其为本领域技术人员所知。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。这类修饰可包括例如，氨基酸上的化学基团和部分的取代或替换或者通过氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括例如，展示参照氨基酸的功能类似特性如电荷和电荷间距特性的有机结构。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有正电荷基团，其以与天然存在的Arg氨基酸类似的分子间隔定置，且具有与天然存在的Arg氨基酸侧链的e-氨基相同程度的移动性。模拟物还包括受限的结构，以便维持氨基酸或氨基酸功能基团的最佳间距和电荷相互作用。本领域技术人员知道或能确定什么结构能构成功能上等同的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
如本文所用，“有风险”发展疾病或不良反应的对象在用本文描述的方法治疗之前，可能或可能没有患有可检测的疾病或疾病症状，且其可能或可能没有显示出可检测的疾病或疾病症状。“有风险”表示对象具有一种或多种风险因素，其为与疾病发展相关的可测量参数，如本文所述和本领域所知。相比没有一种或多种这些风险因素的对象，具有一种或多种这些风险因素的对象具有更高的发展疾病或不良反应的可能性。
如本文所用，“自身免疫疾病”是源于和针对个体自身的组织的疾病或病症。自身免疫疾病或病症的实例，包括但不限于，炎症反应如炎性皮肤病，包括牛皮癣和皮炎(例如，特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病(如克罗恩氏症和溃疡性结肠炎)有关的应答；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球性肾炎；过敏性疾病状况如湿疹和哮喘以及其他疾病状况，包括T细胞浸润和慢性炎症反应；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷症；风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如，I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；雷诺氏综合征；自身免疫性甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；干燥综合征(Sjorgen’s syndrome)；幼发型糖尿病；和通常发现于结核病、肉状瘤病、多发性肌炎、炎性肌肉疾病、间质性肺病、肉芽肿病和血管炎中的由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟性过敏症相关的免疫应答；恶性贫血(阿狄森氏症)；包括白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于，冷球蛋白血症或库姆斯(Coombs)阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯病(Graves’disease)；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺疾病；Reiter病；僵人综合征；白塞氏(Bahcet)病；巨细胞动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。
术语“结合”是指两个分子之间的直接结合，其由于例如，共价的、静电的、疏水的和离子的和/或氢键的相互作用，包括诸如盐桥和水桥(water bridge)的相互作用。结合蛋白包括例如，抗体和抗体替代物，包括结合剂，如本文所述。
术语“克隆缺失”是指自身反应性T细胞的缺失(例如丢失或死亡)。克隆缺失主要可在胸腺或其外围或二者获得。
在整个本说明书中，除非上下文中另有要求，单词“包含(comprise/comprises/comprising)”应理解为指包括所陈述的步骤或元件或者步骤或元件的组，但不排除其他步骤或元件或者步骤或元件的组。“由…组成”是指，包括并限于短语“由…组成”后面的任何内容。因此，短语“由…组成”表示所列出的元件是必需的或强制性的，且不可有其他成分。“基本上由…组成”是指，包括所述短语后所列出的任何元件，并限于不干扰或有助于本公开内容中所列元件的指定活性或作用的其他元件。因此，短语“基本上由…组成”是指，所列元件是必需的或强制性的，但其他元件是可选的，且可以有或没有，取决于它们是否对所列元件的活性或作用有实质影响。
“连续过程”是指可通过在该过程开始的时间点施加和在该过程终点结束的持续功能来定义的过程。因此在当前语境下，连续过程的典型实例是这样的过程，其中某类体液，通常为血液以恒定流量(即，基本上不间断的流量)从患者中移除，并且还以类似的恒定流量再次输入至患者的过程。该过程被理解为与任何其他“不连续”的过程相反，其中所述体液于某个时间在一个独立的过程中从患者中移除，任选地在另一时间以分批形式储存并与吸附剂接触，并且在基本上独立于这两个第一过程下选择的另一时间再次输入至患者。
术语“无内毒素的”或“基本上无内毒素的”通常是指组合物、溶剂和/或容器，其含有最多微量(例如，对于对象没有临床上的不良生理效应的量)的内毒素，且优选为不可检测的量的内毒素。内毒素通常为与某些微生物如细菌(通常为革兰氏阴性菌)有关的毒素，尽管内毒素也可见于革兰氏阳性菌如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。最普遍的内毒素是发现于各种革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，其代表了这些细菌引起疾病的能力的主要致病性特征。人体中少量的内毒素即可引起发烧、血压降低和激活炎症和凝聚以及其他不良的生理影响。
因此，在药物生产中，通常需要从药物产品和/或药物容器中清除大多数或所有微量的内毒素，因为甚至少量即可在人体引起不良影响。为此目的可使用除热原烘箱，因为通常需要高于300℃的温度来分解大多数内毒素。例如，基于最初的包装材料如注射器或小瓶，250℃的玻璃温度结合30min保持时间通常足以获得内毒素水平的3个对数的降低。本发明还包括其他去除内毒素的方法，其包括例如，色谱法和过滤法，如本文所述和本领域所知。还包括在真核细胞如哺乳动物细胞中制备并从中分离HRS多肽的方法，以降低(如果没有消除)内毒素出现在本发明的组合物中的风险。优选为在无血清的细胞中制备并从中分离HRS多肽的方法。
可使用本领域所知的常规技术来检测内毒素。例如，利用来自鲎的血液的鲎溶解产物检测法(Limulus Ameobocyte Lysate assay)，其对检测内毒素的存在非常敏感。在该检测中，由于强大的酶级联反应放大了该反应，极低水平的LPS可引起鲎溶解物的可检测的凝聚。内毒素也可通过酶联免疫吸附检测(ELISA)来定量。处于基本上无内毒素时，内毒素水平可为小于约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mg的蛋白。通常，1ng脂多糖(LPS)对应于约1-10EU。
“表位”是指抗原或其他大分子的该部分，其能够形成与抗体(或类似的蛋白)、抗体替代物、结合剂或T细胞受体的可变区相互作用而产生结合相互作用。在抗体的情况下，该结合相互作用可表现为与CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。抗原结合可涉及CDR3或CDR3对。表位可为线性的肽序列(例如，“连续的”)，或者可由非连续的氨基酸序列组成(例如，“构象的”或“不连续的”序列，其可分别地或一起形成可识别的形状)。结合蛋白可识别一种或多种氨基酸序列；因此一个表位可限定超过一种不同的氨基酸序列。通过结合蛋白识别的表位可通过本领域技术人员熟知的肽图谱制作和序列分析技术来确定。“隐蔽表位”或“隐蔽结合位点”是蛋白序列的表位或结合位点，其在未修饰的多肽或蛋白复合体或多聚体中未暴露或基本上被保护而未被识别，但能够通过针对蛋白水解的多肽或非复合的解离多肽的结合蛋白来识别。在未修饰的多聚体多肽结构中，未暴露或仅部分暴露的氨基酸序列是可能的隐蔽表位。如果表位未暴露或仅部分暴露，那么其可能通过结合其他蛋白或因子而被包埋在所述多肽内部或掩盖于所述多肽复合体中。候选的隐蔽表位例如，可通过检查未修饰的多肽的三维结构来确认。
“表达调控序列”是指核酸或相应的氨基酸的调控序列，如启动子、前导序列、增强子、内含子、RNA或DNA结合蛋白的识别基序、多聚腺苷酸化信号、终止子、内部核糖体进入位点(IRES)、分泌信号、亚细胞定位信号等，其有能力影响宿主细胞中编码序列的转录或翻译，或者亚细胞或细胞定位。示例性表达调控序列描述于Goeddel；Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。
术语“细胞外体液”是指哺乳动物的细胞外液。实例包括血液、腹水、血浆、淋巴液、羊膜液、尿液、唾液和脑脊液。
术语“异源的”已经引入生物体(如植物、动物或原核细胞)的核酸或蛋白，或者源自另一来源或源自同一来源但位于不同(即，非天然)环境中的核酸分子(如染色体、载体或核酸构建体)。
“同源性”是指相同的或为构成保守性替换的氨基酸的百分数。可采用序列比较程序如GAP(Deveraux et al.,1984,Nucleic acids Research12,387-395)来确定同源性，其通过引用并入本文。以这种方式，通过在比对中插入空位，如通过例如GAP所用的比较算法确定的空位，可将与本文引用的序列长度类似的或大幅不同的序列进行比较。
术语“半最大有效浓度”或“EC50”是指如本文所述的试剂(例如，HRS多肽或其他试剂)的浓度，在该浓度下其经某些特定的暴露时间后诱导的应答位于基线和最大值的中间，因此分级的剂量应答曲线的EC50表示观察到50％的其最大效果时的化合物浓度。EC50也表示获得50％的体内最大效应所需的血浆浓度。类似地，“EC90”是指观察到90％的其最大效应时的试剂或组合物浓度。可从“EC50”和Hill斜率来计算“EC90”，或者其可采用本领域常规知识从数据直接确定。在一些实施方案中，抗体封闭剂的EC50小于约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500nM。在一些实施方案中，生物治疗组合物具有的EC50值为约1nM或更小。
如本文所用，本发明的“免疫原性组合物”是指在动物如哺乳动物中引起免疫应答的任何组合物。“免疫应答”是身体对外来物质的反应，并不意味着该反应的生理或病理结果，即不一定给该动物带来保护性免疫力。免疫应答可包括以下中一种或多种：(a)细胞介导的免疫应答，其包括胸腺(T细胞)应答暴露于抗原而产生淋巴细胞；和/或(b)体液免疫应答，其包括应答抗原暴露而产生血浆淋巴细胞(B细胞)，以及随后的产生抗体。
“分离的”是指材料基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随所述材料的组分。例如，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等包括从其天然细胞环境或与细胞其他组分结合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子；即，所述材料与体内物质不显著结合。
术语“调节”包括与对照相比通常以统计学上显著的或生理上显著的量“增加”、“提高”或“刺激”，以及“减少”或“降低”。通常，“增加的”、“刺激的”或“增强的”量是“统计学上显著的”量，并且可以包括增加为没有组合物(例如没有任何本发明的HRS多肽)或对照组合物时样品或测试对象所产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(如，500、1000倍)(包括其间的且大于1的所有整数和小数，如1.5、1.6、1.7、1.8等)。通常，“减少的”或“降低的”量为“统计学上显著的”量，且可以包括没有组合物(没有试剂或化合物)或对照组合物时所产生的量减少了1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括所有其间的整数。
如本文中可互换地使用，术语“可操作地连接(operably/operativelylinked)”或“可操作地偶联(operatively coupled)”是指两个或更多个核苷酸序列或序列元件以允许它们按其预期方式发挥功能的方式放置。在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子包含可操作地与编码重组蛋白的核苷酸序列连接的一个或多个DNA元件，其能够打开染色质和/或维持染色质为打开状态。在其他实施方案中，核酸分子还可包含选自以下的一个或多个DNA或RNA核苷酸序列：(a)能够增加翻译的核苷酸序列；(b)能够增加分泌重组蛋白至细胞外的核苷酸序列；(c)能够增加mRNA稳定性的核苷酸序列；和(d)能够结合反式作用因子以调节转录或翻译的核苷酸序列，其中这类核苷酸序列可操作地与编码重组蛋白的核苷酸序列连接。通常，而非必需地，所述可操作地连接的核苷酸序列为连续的，且必要时，在阅读框内。然而，尽管能够打开染色质和/或维持染色质为打开状态的可操作地连接的DNA元件通常位于编码重组蛋白的核苷酸序列的上游；其不一定与之邻近。可通过本领域熟知的重组方法来可操作地连接各种核苷酸序列，例如，采用PCR方法，通过在合适的限制位点连接或通过退火。如果不存在合适的限制位点，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸连接子或适配体。
如本文所用，“非经典的”活性通常是指：i)本发明HRS多肽具有的新的非氨基酰化生物活性，且完整的天然亲本蛋白没有在任何明显程度上具有该活性，或者ii)完整的天然全长亲本蛋白所具有的活性，其中所述HRS多肽展现出：a)相比完整的天然全长亲本蛋白，针对非经典活性具有明显更高(例如，大至少20％)的特异性活性，或者b)相比经典的胞质胞内隔室，在新的环境中展现该活性；例如，通过将该活性与完整的天然亲本蛋白具有的其他活性分开，或者在胞外环境中。
“启动子”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调控区。如本文所用，所述启动子序列在其3’末端结合于转录起始位点周围并向上游(5’方向)延伸，从而包含以高于背景可检测的水平启动转录所需的最小数目的碱基或元件。转录起始位点(通过用核酸酶S1图谱分析便利地确定)可发现于启动子序列和负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(一致序列)内。真核生物启动子通常但非总是可含有“TATA”盒和“CAT”盒。除了-10和-35一致序列，原核生物启动子还含有SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。
大量启动子，包括源自各种不同来源的组成型、可诱导的和可抑制的启动子为本领域所熟知。代表性来源包括例如，病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且来自这些来源的合适启动子易于获得，或者可基于可在线公开获得的或者例如从保藏库如ATCC以及其他商业或个人来源获得的序列通过合成制备。启动子可为单向性的(即，在一个方向上启动转录)或双向性的(即，在3’或5’方向上启动转录)。启动子的非限制性实例包括例如，T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子。可诱导启动子包括Tet系统(美国专利第5,464,758和5,814,618号)、蜕皮激素可诱导系统(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93(8):3346-3351)；T-REx TM系统(Invitrogen Carlsbad,CA)、(Stratagene,San Diego,CA)和Cre-ERT三苯氧胺可诱导重组酶系统(Indra et al.Nuc.Acid.Res.(1999)27(22):4324-4327；Nuc.Acid.Res.(2000)28(23):e99；美国专利第7,112,715号；和Kramer & Fussenegger,Methods Mol.Biol.(2005)308:123-144)，或者本领域所知的适于在期望的细胞中表达的任何启动子。
在某些实施方案中，组合物中任何给定试剂(例如，HRS多肽)的“纯度”可特别定义。例如，某些组合物可包含以下纯度的试剂：至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数，其例如但不限于，通过高效液相色谱(HPLC)测量的，HPLC是熟知的经常用于生物化学和分析化学来进行分离、鉴别和定量化合物的柱层析形式。
可互换使用的术语“多肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的类似物。因此，这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨基酸，如相应天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物的化学类似物。
本文所用术语“预后”是指预测疾病症状的可能性，包括例如，疾病的复发、加重和抗药性。本文所用术语“预测”是指对象或患者将有利地或不利地应答药物或一组药物例如HRS多肽或其他试剂的可能性。在一个实施方案中，所述预测涉及这些应答的程度。在一个实施方案中，所述预测涉及例如以特定治疗剂治疗后患者是否存活或改善并持续某段时间无疾病复发，或其可能性。本发明的预测方法可通过为任何特定患者选择最合适的治疗方式来在临床上用于做出治疗决定。本发明的预测方法在以下方面是有价值的工具：预测患者是否可能有利地应答治疗方案如给定的治疗方案，包括例如，给予给定的治疗剂或组合、外科手术干预、类固醇治疗等，或者在治疗方案后患者是否可能长期存活。
如本文所用，“患者亚群”或可替换的“对象亚群”或其语法变体是指这样的患者亚组，其特征在于具有一种或多种不同的可测量和/或可鉴别特征，该特征在其所属的较宽疾病分类范围内将患者或对象亚组区别于其他个体。这类特征包括疾病亚类、性别、生活方式、健康史、相关器官/组织、治疗史等。在一个实施方案中，患者或对象亚群由自身抗体水平来表征。
“患者应答”或可替换的“对象应答”可采用显示对患者有利的任何终点来评估，包括但不限于，(1)在某种程度上抑制疾病进展，包括减缓和完全阻止；(2)疾病发作(episode)和/或症状的数目降低；(3)病灶大小减小；(4)抑制(即，降低、减缓或完全阻止)疾病细胞浸润至邻近的周围器官和/或组织；(5)抑制(即，降低、减缓或完全阻止)疾病扩散；(6)自身免疫应答降低，其可能但不一定导致病灶的退化或消除；(7)在某种程度上缓解与病症有关的一种或多种症状；(8)增加治疗后无疾病表现的时长；和/或(9)降低治疗后给定时间点的死亡率。
术语“特异性”用于这样的情况，其中特异性结合对的一个成员对除了其特异性结合伴侣以外的分子不表现出任何明显的结合。该术语也可用于当例如，抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位具有特异性时，在这种情况下携带该抗原结合结构域的特异性结合成员将能结合各种携带该表位的抗原。
“统计学上显著的”是指该结果不可能随机发生。可通过任何本领域所知的方法来确定统计学上的显著性。通常用于测量显著性的方法包括p-值，如果零假设是真的，其为所观察的事件将会发生的频率或可能性。如果所获得的p-值小于显著性水平，那么该零假设被拒绝。在简单的情况下，显著性水平确定在p-值小于或等于0.05。
术语“可溶性”是指本文提供的抗体封闭剂溶解于液体溶剂中并形成均质溶液的特性。通常可溶性表达为浓度，通过每单位容积的溶剂的溶质质量(每kg溶剂的溶质g、每dL(100mL)的g、mg/ml等)、摩尔浓度、质量摩尔浓度、摩尔分数或其他类似的浓度描述。每量的溶剂可溶解的溶质的最大平衡量，是在特定条件(包括溶剂的温度、压力、pH和性质)下溶剂中该溶质的溶解度。在某些实施方案中，在生理pH或其他pH下测量溶解度，例如在pH5.0、pH6.0、pH7.0或pH7.4。在某些实施方案中，在水或生理缓冲液如PBS或NaCl(有或没有NaP)中测量溶解度。在具体的实施方案中，在相对较低的pH(例如，pH6.0)和相对较高的盐(例如，500mM NaCl和10mM NaP)中测量溶解度。在某些实施方案中，在生物流体(溶剂)如血液或血清中测量溶解度。在某些实施方案中，所述温度可为约室温(例如，约20、21、22、23、24、25℃)或约体温(37℃)。在某些实施方案中，HRS多肽在室温或37℃下具有的溶解度为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml。
如本文所用，“对象”包括展现症状或有展现症状的风险的任何动物，其可用本发明的HRS多肽或抗体封闭剂进行治疗或诊断。合适的对象(患者)包括实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(如猫或狗)。包括非人灵长类，和优选人患者。
“实质上”或“基本上”是指几乎全部或完全地，例如，95％或更多的某个给定量。
“治疗应答”是指基于给予的治疗应答(不论是否诱导了耐受性)改善了症状(不论是否持久)。
术语“耐受性”是指在一个其他方面基本上正常的免疫系统环境中，免疫系统对抗原(例如，自身抗原)的持久的(例如，一个月或更长)特异性降低的应答性。耐受性不同于一般的免疫抑制，其中所有的或一类中的所有如免疫应答的B细胞介导的免疫应答被降低。“耐受化”是指产生耐受性状态的过程。
如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗剂量”、“预防有效量”或“诊断有效量”是指在给药后引起期望的生物学应答所需的药物例如HRS多肽或抗体的量。类似地，术语“HRS多肽治疗”是指在患者血浆中维持高于最低有效治疗水平的HRS多肽平均稳定状态浓度的治疗。
如本文所用，“治疗(Treatment/treating)”包括对于疾病或疾病状况的症状或病理学的任何期望的效果，且甚至可包括受治疗的疾病或疾病状况的一个或多个可测量标记的最小变化或改善。“治疗”不一定表示疾病或疾病状况或其相关症状的完全根除或治愈。接受该治疗的对象为任何有需要的对象。临床上改善的示例性标记对本领域技术人员来说是显然的。
如本文所用，术语“疫苗”广义上是指可给予至动物以引起针对疫苗或共给予的抗原的保护性免疫应答的任何组合物。如本文所用，术语“保护”、“保护性免疫应答”或“保护性免疫”描述特异性识别疫苗抗原的抗体或细胞系统的发展。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指通过其可将DNA或RNA序列(例如，外来基因)引入至宿主细胞以便转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如，转录和翻译)的运载工具。载体可包括质粒、噬菌体、病毒等，并且将在下文更详细地讨论。
除非另有定义，本文所用的所有的技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。虽然类似于或等同于本文所描述的那些的任何方法、组合物、试剂、细胞都可用于本发明的实践或测试中，但本文还是描述了优选的方法和材料。本说明书引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于，专利和专利申请，通过引用整体并入本文，如同明确地、个别地指出每篇出版物或文献以引用的方式并入本文，如同得到完整叙述。本申请要求其优先权的任何专利申请也以上述出版物和文献所述的方式通过引用整体并入本文。
概述
本发明涉及研发改善的治疗组合物、诊断和治疗炎症和自身免疫疾病的方法，且在某些方面，涉及治疗炎性肌肉疾病和相关疾病和病症，包括与产生针对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体、相关蛋白和其他抗体有关的肺部疾病。
本发明还包括研发改善的治疗组合物、诊断和治疗具有第二炎性组分的疾病的方法，所述第二炎性组分额外地加剧、保持或促使疾病发展，且其可由不相关的遗传缺陷或损伤引起。
在一些方面，相比现有治疗方法，这类治疗提供改善的疗效并展现明显改善的副作用特性。
“炎症”通常是指组织对有害刺激如病原体、受损细胞(例如，伤口)和刺激物的生物学应答。术语“炎症反应”是指实现和调节炎症的具体机制，包括(仅以说明的方式)免疫细胞激活或迁移、细胞因子产生、血管舒张，包括释放细胞分裂素、纤维蛋白溶解和凝聚，以及本文描述的和本领域所知的其他类型。
慢性炎症的临床病征取决于疾病的持续时间、炎性病灶、病因和受影响的解剖学区域。(参见例如，Kumar et al.,Robbins Basic Pathology-第8版，2009Elsevier,London；Miller,LM,Pathology Lecture Notes,AtlanticVeterinary College,Charlottetown,PEI,Canada)。慢性炎症与多种病理学状况和疾病有关，包括例如，自身免疫症、过敏症、阿尔茨海默症、贫血、主动脉瓣狭窄、关节炎如风湿性关节炎和骨关节炎、癌症、充血性心力衰竭、纤维组织肌痛、纤维变性、心脏病发作、肾衰竭、狼疮、胰腺炎、中风、手术并发症、炎性肺病、炎性肠病、动脉粥样硬化、神经性病症、糖尿病、代谢性病症、肥胖症和牛皮癣，以及本文描述的和本领域所知的其他类型等。因此，HRS多肽可用于治疗或控制慢性炎症、调控任何一种或多种单个的慢性炎症反应，或治疗任何一种或多种与急性或慢性炎症有关的疾病或疾病状况。
用于评估炎症和其他疾病状况的标记和症状的标准，包括为了进行差别化诊断以及为了监测治疗如确定治疗过程中是否给予了治疗有效剂量，例如通过根据已经被接受的临床标准来确定改善，对本领域技术人员来说是显然的，并由以下教导所例示，例如，Berkow et al.,eds.,TheMerck Manual,第16版，Merck and Co.,Rahway,N.J.,1992；Goodman etal.,eds.,Goodman and Gilman’s,The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版，Pergamon Press,Inc.,Elmsford,N.Y.,(2001)；Avery’s DrugTreatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology andTherapeutics,第3版，ADIS Press,Ltd.,Williams and Wilkins,Baltimore,MD.(1987)；Ebadi,Pharmacology,Little,Brown and Co.,Boston,(1985)；Osolci al.,eds.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版，MackPublishing Co.,Easton,PA(1990)；Katzung,Basic and ClinicalPharmacology,Appleton and Lange,Norwalk,CT(1992)。
因此，一些方面包括降低组织炎症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。在一些实施方案中，所述组织选自肌肉、肺和皮肤。
某些方面包括降低与自身免疫疾病有关的肌肉或肺部炎症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
还包括治疗与自身抗体有关的疾病的方法，其包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，c)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，或d)抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白；其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位。
一些方面包括诱导针对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)抗原的耐受性的方法，所述方法包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽；其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物导致对所述自身抗原的耐受。
某些方面包括降低或清除参与对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的自身免疫应答的T细胞群或亚群的方法，所述方法包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽；其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物导致自身反应性T细胞的克隆缺失。
还包括在参与对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的自身免疫应答的T细胞中诱导无能的方法，所述方法包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽；其中所述HRS多肽包含至少一个被自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物导致参与自身免疫应答的T细胞功能失活。这些和相关的实施方案中的一些包括降低组氨酰-tRNA合成酶“自身抗原-激活的T细胞”和/或组氨酰-tRNA合成酶“自身抗原-激活的B细胞”的存在或水平的方法。
在一些实施方案中，患有与自身抗体有关的疾病的对象具有易患自身免疫疾病或病症的遗传倾向。例如，在某些实施方案中，所述对象具有MHC II型同种异型如HLA DR2、HLA DR3、HLA DR4、蛋白酪氨酸磷酸酶的突变、非受体型22(PTPN22)，以及通路的调节异常如先天免疫系统的病原体识别受体和TNF超基因家族(参见例如，Rai and Wakeland,Semin.Immunology.23:67-83,2011)，其各自与某些自身免疫病症相关。
一些方面包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病的替代疗法，包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，或d)抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白；其中所述HRS多肽在功能上补偿所述组氨酰-tRNA合成酶的不足。
在一些替代疗法中，所述组氨酰-tRNA合成酶缺乏是由抗-Jo-1抗体的存在引起的。在该替代疗法的某些方面，所述组氨酰-tRNA合成酶不足是由内源组氨酰-tRNA合成酶中的突变引起的，其调节内源组氨酰-tRNA合成酶的活性、表达或细胞分布。在某些方面，所述组氨酰-tRNA合成酶不足与Perrault综合征或Usher综合征有关。在一些方面，所述组氨酰-tRNA合成酶不足与组织内或者受伤或炎症位点处的组氨酰-tRNA合成酶局部产生不足有关。在某些方面，所述组氨酰-tRNA合成酶不足与横纹肌溶解症、恶病质和/或肌肉损伤中的一种或多种有关。
如本文所用，术语“耐受性”是指在哺乳动物尤其是人中对特定抗原的免疫应答的持久降低或缺乏。耐受性不同于一般的免疫抑制，其中免疫应答的所有的或所有具体类型的免疫细胞如B细胞介导的免疫应答被降低或消除。耐受性的发展可通过以单个或连续剂量的治疗性HRS多肽给药后宿主对象血清中针对HRS多肽的抗体浓度的缺少或降低来常规监测。耐受性的发展通常会足以降低患者中自身免疫疾病的症状，例如，患者可能会足够改善从而在缺乏或存在减少量的常规免疫抑制剂例如皮质类固醇下维持正常活性。
在这些方法或组合物的任一种中，通常耐受性为持久的，也即其具有的持续时间为约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月或更长。耐受性可导致选择性B-细胞无能或T-细胞无能或者二者。
在这些方法、治疗和治疗组合物的任一种中，术语“与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病”是指其中针对组氨酰-tRNA合成酶的抗体被检测到或可检测到的任何疾病或病症，而不管是否也检测到其他自身抗体，或认为其在疾病进展或缘由中起作用。检测患者样品中的抗体的方法可采用任何标准程序来实施，包括例如通过RIA、ELISA、通过免疫沉淀反应、通过组织或细胞(包括转染的细胞)染色、抗原微阵列、质谱分析、特异性中和分析或本领域所知的用于鉴别期望的抗原特异性的众多其他方法中的一种。在一些方面，抗体特异性可通过确定抗体选择性结合不同的剪接变体和截短的或蛋白水解形式的组氨酰-tRNA合成酶的能力来进一步表征。针对组氨酰-tRNA合成酶的相对熟知的人自身抗体包括例如，针对Jo-1的抗体。
在一些实施方案中，所述HRS多肽包含来自组氨酰-tRNA合成酶的表位，其特异性地与针对组氨酰-tRNA合成酶的疾病相关的自身抗体交叉反应。在本文要求保护的任何方法和组合物的一些实施方案中，所述HRS多肽包含来自组氨酰-tRNA合成酶的表位，其特异性地与针对组氨酰-tRNA合成酶的疾病相关的自身反应性T细胞交叉反应。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含特异性地与针对另一种tRNA合成酶的疾病相关的自身抗体或非tRNA合成酶自身抗体交叉反应的表位。
在一些实施方案中，所述HRS多肽包含被来自患者血清的大多数抗体特异性识别的免疫优势表位，所述患者患有与针对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体有关的疾病。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含被来自患者血清的大多数自身反应性T细胞特异性识别的免疫优势表位，所述患者患有与针对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体有关的疾病。
在一些实施方案中，所述表位被包含于所述HRS多肽的WHEP结构域(SEQ ID NO:1的约氨基酸1-43)；所述氨基酰化结构域(SEQ ID NO:1的约氨基酸54-398)；或所述反密码子结合结构域(SEQ ID NO:1的约氨基酸406-501)或它们的任何组合内。
在一些实施方案中，所述HRS多肽不包含特异性地与针对组氨酰-tRNA合成酶的疾病相关的自身抗体交叉反应的表位。在一些实施方案中，在浓度高达约1x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。在一些实施方案中，在浓度高达约5x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。在一些实施方案中，在浓度高达约1x10-6M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
因此，在一些实施方案中，如在竞争性ELISA中所测，相比野生型组氨酰-tRNA合成酶(SEQ ID NO:1)，所述HRS多肽具有更低的对疾病相关的自身抗体的亲和力。在一些实施方案中，相比疾病相关的自身抗体对野生型人(SEQ ID NO:1)的亲和力，所述HRS多肽具有的对疾病相关的自身抗体的表观亲和力至少要小约10倍、或至少小约20倍、或至少小约50倍、或至少小约100倍。在一些方面，针对组氨酰-tRNA合成酶的所述自身抗体是针对Jo-1抗原。
与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病(以及与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病)的实例，包括但不限于，自身免疫疾病、炎性疾病和炎性肌肉疾病，包括炎性肌肉疾病、多发性肌炎、他汀类诱导的肌肉疾病、皮肌炎、间质性肺病(和其他肺纤维变性疾病状况)和相关病症，如多发性肌炎-硬皮病重叠和包涵体肌炎(IBM)以及如在抗合成酶综合征中发现的疾病状况，包括例如间质性肺病、关节炎、食管蠕动障碍、心血管疾病和其他血管临床表现如雷诺现象；与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病的其他实例包括导致活性组氨酰-tRNA合成酶不足的遗传疾病，包括Usher综合征和Perrault综合征。组氨酰-tRNA合成酶不足的疾病的其他实例包括与组织中或受伤或炎症位点处组氨酰-tRNA合成酶局部产生不足相关的炎性疾病和病症。在某些方面，所述组氨酰-tRNA合成酶不足与横纹肌溶解症、恶病质和/或肌肉损伤中的一种或多种有关。
在某些实施方案中，通过封闭抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的结合、作用或产生，本文描述的组合物和方法可用于治疗众多与抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体、其他自身抗体有关的自身免疫和炎性疾病与病症，以及与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病。
此外，给予本发明的HRS多肽，通过恢复组氨酰-tRNA合成酶的浓度(在不存在抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体下)可调节局部炎症反应，其可有效治疗众多炎性疾病和病症，以及其中炎症为原发性疾病例如患有肌营养不良症情况下而继发引起的疾病。
某些实施方案包括治疗肌肉炎的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。在一些实施方案中，所述肌肉炎是多发性肌炎。在一些实施方案中，所述肌肉炎是皮肌炎。
一些实施方案包括治疗包涵体肌炎(IBM)的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
还包括治疗青少年肌肉炎的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
某些实施方案包括治疗他汀类诱导的肌肉疾病的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。在一些实施方案中，所述他汀类为西立伐他汀。
一些实施方案包括治疗间质性肺病(ILD)的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
某些实施方案包括治疗Usher综合征的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。某些实施方案包括治疗1型Usher综合征的方法。一些实施方案包括治疗2型Usher综合征的方法。某些实施方案包括治疗3型Usher综合征的方法。
一些实施方案包括治疗Perrault综合征(PS)的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
还包括治疗肌营养不良症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。在一些方面，所述肌营养不良症选自：杜兴氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、埃-德氏肌营养不良症、肢-带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症和先天性肌营养不良症。
还包括治疗恶病质的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
还包括治疗横纹肌溶解症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：i)HRS多肽，ii)编码异源HRS多肽的重组核酸，或iii)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
某些示例性炎症或自身免疫病症在下文有更为详细地描述。
多发性肌炎影响身体两侧的骨骼肌(与运动有关)。其很少见于低于18岁年龄的人；大多数情况发病于31-60岁年龄的人群。除了以上所列的症状，进行性肌无力导致以下方面的困难：吞咽、说话、从坐着的位置起来、爬楼梯、举物或够到头顶处。患有多发性肌炎的人也可能经历关节炎、呼吸短促和心律失常。
皮肌炎的特征在于进行性肌无力之前或同时的皮疹。皮疹呈斑片状，具有紫色或红色斑点，其典型地发病于眼皮和用于扩展或伸直关节包括指关节、肘、膝和脚趾的肌肉上。红色的皮疹也可能出现在脸部、颈部、肩部、胸部上方、背部和其他位置，并有可能在受影响区域发生肿胀。有时发生皮疹而无明显肌受累。患皮肌炎的成人可能经历体重减轻或轻度发热、具肺部炎症并对光敏感。成人皮肌炎，不像多发性肌炎，可伴随乳腺、肺、女性生殖器或肠的肿瘤。患皮肌炎的儿童和成人可能发生钙沉积，其表现为皮肤下或肌肉中的硬肿块(称为钙质沉着症)。钙质沉着症最常发生在发病后1-3年，但可能会在许多年后发生。相比成人中发生的皮肌炎，这些沉积更长见于儿童皮肌炎中。皮肌炎可能与胶原-血管病或自身免疫疾病相关。
在一些多发性肌炎和皮肌炎的情况下，随着疾病的发展远端肌肉(远离身体躯干，如那些在前臂及脚踝和手腕周围的肌肉)可能会受到影响。多发性肌炎和皮肌炎可能与胶原血管病或自身免疫疾病相关。多发性肌炎也可能与感染性病症相关。
包涵体肌炎(IBM)的特征在于进行性肌无力和萎缩。肌无力的发病通常是渐进的(几个月或几年)并影响近端和远端肌肉。肌无力可能会仅影响身体的一侧。称为空泡的小孔有时在受影响的肌肉纤维的细胞中可见。摔倒和绊倒通常是IBM的第一明显症状。对于某些人来说，病症开始于手腕和手指乏力而造成难以捏、扣和抓住物体。还可能存在手腕和手指肌肉乏力及前臂肌肉和腿上的股四头肌的肌肉萎缩(变瘦或肌肉体积减小)。吞咽困难发生于约一半的IBM病例。该疾病的症状通常开始于50岁以后，尽管该疾病可能更早发生。不像多发性肌炎和皮肌炎，IBM发病在男性中比在女性中更频繁。
青少年肌肉炎与成人皮肌炎和多发性肌炎有些相似性。其通常影响2-15岁的儿童，症状包括近端肌无力和炎症、水肿(身体组织内的流体异常聚集而引起水肿)、肌肉疼痛、疲劳、皮疹、腹痛、发热和挛缩(由肌肉肌腱炎症引起的肌肉或关节周围肌腱的慢性缩短，其妨碍关节的自由运动)。患青少年肌肉炎的儿童也可能有吞咽和呼吸的困难，且心脏也可能受影响。约20％-30％患青少年皮肌炎的儿童发展了钙质沉着症。受影响的儿童可能不会显示高于正常水平的血液中肌肉酶肌酸激酶，但具有高于正常水平的其他肌肉酶。
他汀类诱导的肌肉疾病与长期使用他汀类有关，他汀类通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)起作用。这些药物通常具有良好的耐受性并被描述为肌肉毒性的诱发剂。最近以来，有报道称甚至停药后患者的他汀类肌肉疾病还在持续，其被假设为有自身免疫性原因。他汀类在减少冠心病和冠状动脉粥样硬化进展上的好处无可争议。然而，相关的并发症可危及生命。在美国有超过3800万人目前估计在服用他汀类，而这些人多达中7％(＞260万)的人预测会发展肌肉症状，且其中达0.5％(＞19万)可能会继续发展危及生命的肌肉疾病。
所有的他汀类均可导致肌肉问题并且风险随着其亲脂性、降低胆固醇的效能和剂量的增加而增加。西立伐他汀尤其已被确定为具有较高风险，且它已经退出美国市场。在其余的他汀类中，阿托伐他汀和辛伐他汀具有较高的肌肉毒性率。其他非他汀类降脂药剂如烟酸和贝特类(fibrate)也有引起肌肉问题的风险，特别是当结合他汀类时。虽然不可能预测什么样的患者会有他汀类诱导的肌肉问题，现有的肌肉问题可能是一个危险因素，且应在开始他汀类治疗时加以考虑。如果患者可能是遗传肌肉疾病的携带者，则与家族肌肉疾病史相关，因为其可能由于他汀类治疗增加的压力而显现。其他风险因素可包括：年龄超过80岁、低体重、性别为女性、甲状腺功能减退症、某些遗传缺陷和亚洲血统，以及某些药物的同时使用，包括钙通道阻滞剂、大环内酯类抗生素、奥美拉唑、胺碘酮、唑类抗真菌药、组胺H2受体拮抗剂、奈法唑酮，环孢菌素、HIV蛋白酶抑制剂、华法林和葡萄柚汁。
他汀类造成的最常见症状是肌肉疼痛或肌痛症，且其发生于约7％的他汀类使用者。肌痛症可为轻微至严重的任何层次，并往往由于肌肉活动而恶化。如果症状是可以容忍的且他汀类治疗效果明显，例如，在高胆固醇血症和近期心肌梗塞的患者中，持续他汀类治疗可能是合适的。
开始他汀类治疗之前，指导他汀类治疗的组织并不一律推荐基线肌酸激酶(CK)水平，但如果以后发展肌肉症状，CK水平可提供非常有用的信息。肌无力也可能发生，其特征是易疲倦并结合有疼痛和CK升高。像大多数肌肉疾病一样，所述无力在近端最明显。极少发生的横纹肌溶解症也伴随他汀类治疗发生；这些是不太常见的但可能是致命的。通过肌肉组织学可看到的最典型的他汀类肌肉疾病变化为，细胞色素氧化酶阴性纤维、脂肪含量增加和破碎红纤维。自身免疫性坏死性肌肉疾病是一种罕见的他汀类肌肉疾病。在这些患者中，他汀类停药，甚至在停药几个月后并没有转变为恢复。患者有主要为近端的常常为无痛的无力。
诊断是基于个人的病史、体检和肌肉强度检测的结果，以及显示各种肌酶和自身抗体水平升高的血液样本进行。诊断工具包括，用于记录在收缩和休息时控制肌肉的电活动的肌电图、用于查找肌肉炎症的超声，以及用于显示异常肌肉和评估肌肉疾病的磁共振成像。可通过对慢性炎症、肌纤维的死亡、血管畸形或IBM诊断特异性的改变的显微镜检查来进行肌肉活检。皮肤活检可显示皮肌炎患者皮肤层的变化。
间质性肺病(ILD)是包括多于130种病症的一大类肺病，其特征在于疤痕形成(即，“纤维变性”)和/或肺部炎症。ILD占肺病专家所见病例的15％。间质性肺病(ILD)可发展自从其他疾病到环境因素的各种来源。一些已知的ILD原因包括：结缔组织或自身免疫疾病，包括例如，硬皮病/进行性系统性硬化症、狼疮(系统性红斑狼疮)、风湿性关节炎和多发性肌炎/皮肌炎；职业和环境暴露，包括例如，暴露于粉尘和某些气体、有毒物、化疗和放射治疗。
在ILD中，肺组织发生炎症和/或出现疤痕。肺的间隙包括在小血管和肺泡(气囊)内部和周围的区域，其为氧气和二氧化碳发生交换的地方。该间隙的炎症和疤痕形成破坏该组织并导致肺部从空气中获取氧气的能力下降。
ILD的进展在疾病之间和患者之间各不相同。因为间质性肺病扰乱了氧气和二氧化碳在肺部的运输，其症状通常表现为呼吸问题。两种最常见的ILD症状是运动呼吸急促和无痰干咳。
Usher综合征是影响听力和视力的最常见的疾病状况。Usher综合征主要症状是丧失听力和视网膜色素变性(RP)。RP通过视网膜的进行性变性导致夜盲和周边视觉(侧视觉)丧失。随着RP的进展，视野缩小到仅保留有中央视力。许多Usher综合征患者也有严重的平衡问题。所有耳聋儿童的约3％-6％和另外听觉困难儿童的3-6％患有Usher综合征。在发达国家如美国，每10万新生儿中约有4名婴儿患有Usher综合征。Usher综合征作为常染色体的隐性性状而遗传。数个基因位点已确认与Usher综合征有关，包括组氨酰-tRNA合成酶(Puffenberger et al.,(2012)PLoSONE7(1)e28936doi:10.1371/journal.pone.0028936)。
Usher综合征有3种临床类型：1型、2型和3型。在美国最常见的类型为1型和2型。总体上它们占所有患Usher综合征儿童病例的约90％-95％。
患1型Usher综合征的儿童在出生时就深度耳聋，并有严重的平衡问题。由于与1型Usher综合征有关的平衡问题，患该病症的儿童在没有支持时坐下缓慢且通常在18个月大以前没法独立行走。这些儿童通常在幼儿期，几乎总是在他们到10岁时开始发生视力问题。视力问题最常开始于夜间视物困难，但往往进展迅速直到人完全失明。
患2型Usher综合征的儿童出生时有中度至严重的失聪和正常的平衡。尽管听力丧失的严重性不同，大多数这些孩子可受惠于助听器，并可以进行口头交际。2型Usher综合征的视觉问题往往进展比1型慢，RP发作往往不明显，一直到青少年。
患3型Usher综合征的儿童出生时有正常的听力。尽管大多数患该病症的儿童具有正常至接近正常的平衡，一些人后来可能发生平衡问题。听力和视力随时间而恶化，但即使在同一个家庭，它们下降的速度可因人而异。3型Usher综合征患者可到青少年时期发生听力丧失，且通常他或她到中年至晚年需要助听器。夜盲症通常在青春期期间的某个时间开始发生。盲点到青少年晚期至成年早期以及到中年出现，该人通常是法定盲人。
Perrault综合征的特征在于女性卵巢发育不全与感官神经性听力障碍的关联，并且在某些对象中为神经系统异常，包括进行性小脑共济失调和智力缺陷。Perrault综合征的确切患病率是未知的且很可能诊断不足，尤其是在性腺功能减退症不是一个特征且该综合征仍然未发现的男性中。患感官神经性耳聋的女性呈现青春期延迟后的平均诊断年龄为22岁。在所有报告的病例中除了一例以外均可见到听力缺陷(平均诊断年龄为8岁)。听力丧失总是感官神经性和双侧的，但即使来自同一个家庭的受影响患者其严重程度也不一样(从轻微到深度)。卵巢发育不全已在所有女性病例中有报道，但在男性中没有检测到性腺缺陷。闭经一般为原发性的，但继发性闭经也有报道。延迟生长(身高低于第三百分位数)在一半的有记录的病例中有报道。神经系统异常的准确频率是未知的，但已报道有9位女性和2位男性(16-37岁大)没有神经系统异常。神经系统病征是进行性的且一般出现在生命晚期，然而，行走延迟或早期频繁跌倒已在年轻的PS患者中观察到。常见的神经系统病征是共济失调、运动障碍、眼外肌运动受限和多发性神经疾病。伴有脊柱侧弯的某些病例也有报道。PS的传递是常染色体隐性的，且线粒体组氨酰tRNA合成酶中的突变最近被确定为能导致与Perrault综合征相关的卵巢发育不全和感官神经性听力丧失(Pierce et al.,(2011)PNAS USA.108(16)6543-6548)。
肌营养不良症是指一组遗传病症，其中力量和肌肉体积逐渐减小。所有肌营养不良症的标志为肌无力，其由于在一个或多个肌肉特异性基因中的原发性基因缺陷所引起。此外，肌营养不良症通常具有可变的炎性组分，其引起肌肉炎症并最终促使肌肉组织变性。至少9种肌营养不良症被普遍了解。
杜兴氏肌营养不良症(DMD)：DMD影响年幼的男孩，导致进行性肌无力，通常开始于腿部。其为最严重形式的肌营养不良症。在美国3,500个男性新生儿中约有1个出现DMD，且影响到约8,000个男孩和年轻男士。在极少女性携带者中有较轻微形式出现。
DMD是由编码抗肌萎缩蛋白的基因的突变引起，其为一种在抗肌萎缩蛋白相关的糖蛋白复合物(DGC)中起作用的亚肌纤维膜蛋白，阻止功能蛋白的生产。抗肌萎缩蛋白的量与疾病的严重性相关(即，存在的抗肌萎缩蛋白越少，其表型越严重)。DGC复合体连接细胞内细胞骨架与细胞外基质。DGC集中在肌节的Z线并使得力传递穿过肌肉纤维。破坏这一环节导致膜不稳定，其最终导致肌纤维膜的破裂。细胞外钙离子涌入改变了分子过程如肌肉收缩，并激活蛋白水解酶活性。受影响的肌肉纤维坏死或凋亡，并释放促有丝分裂的化学诱导物，其引发炎症过程。变性和再生循环最终导致不可逆的肌肉萎缩并被纤维和脂肪组织替代。
患有杜兴氏肌营养不良症的男孩通常在成为学龄前儿童时开始表现症状。腿首先受到影响，造成行走困难，并导致平衡问题。大多数患者走路比预期晚3-6个月且奔跑有困难。挛缩(永久性的肌肉收紧)通常开始于5或6岁，在小腿肌肉处最严重。在该阶段开始频繁发生跌倒和骨折。爬楼梯和无协助的上升可能到9或10岁时成为不可能的，而大多数男孩使用轮椅移动直到12岁。在这个年龄左右的躯干肌肉弱化往往导致脊柱侧弯(侧向脊柱弯曲)和驼背(前后弯曲)。
DMD一个最严重的无力是隔膜无力，其为腹腔顶部完成呼吸和咳嗽的主要工作的肌肉薄片。隔膜无力导致降低的活力和耐力，且因不能有效咳嗽而增加肺部感染。患DMD的年轻人可以活到20多岁和以上，前提是有机械通气辅助和良好的呼吸卫生。
在一些实施方案中，患DMD的对象具有一个或多个以下特征：阳性高尔斯病征(Gower’s sign)、下肢肌肉反射性损伤、血液中高水平的肌酸激酶(CPK-MM)、Xp21基因中的遗传错误，或者例如通过肌肉活检测量的抗肌萎缩蛋白水平降低或不存在。
HRS组合物可单独或与其他疗法结合用于治疗DMD，如反义寡核苷酸(例如，外显子跳跃疗法如Eteplirsen)、糖皮质激素、β2-受体激动剂、物理治疗、呼吸支持、干细胞治疗和基因替代疗法。在一些实施方案中，给予HRS多肽导致在6分钟步行测试中具有统计上显著的改善。
贝克氏肌营养不良症(BMD)：BMD在相比DMD更轻微的过程后影响较大的男孩和年轻男士。3万个男性新生儿中约1个发生BMD。贝克氏肌营养不良症是杜兴氏肌营养不良症的更低严重性的变体，其由截短的但具部分功能形式的抗肌萎缩蛋白的产生而引起。
BMD的症状通常出现在童年后期至成年早期。尽管症状的进展可与DMD的症状并行，其症状通常更轻微且过程更具变化。可能发生脊柱侧弯，但通常更轻微且进展更缓慢。心肌病(心脏肌肉疾病)更经常发生在BMD中。问题可能包括心跳不规则(心律失常)和充血性心力衰竭。症状可包括疲劳、气短、胸痛和头晕。呼吸无力也有发生，并可能导致需要机械通气。
埃-德氏肌营养不良症(EDMD)：EDMD影响年轻男孩，导致挛缩和小腿无力、肩膀和手臂上无力，以及电脉冲通过心脏以使其跳动的方式上出现的问题(心脏传导缺陷)。有3种埃-德氏肌营养不良症亚型，由它们的遗传模式来区别：X-连锁、常染色体显性和常染色体隐性。X-连锁的形式是最常见的。每种类型的患病率和症状不同。这种疾病是由LMNA基因，或更常见的是EMD基因的突变引起。这两个基因编码核被膜的蛋白成分。
EDMD通常开始于儿童早期，经常在肌无力之前伴随有挛缩。起初无力影响到肩和上臂，随之影响小腿肌肉，导致足下垂。患EDMD的大多数男人可活到中年，尽管如果不用起搏器治疗，心脏节律缺陷(心脏传导阻滞)可能致命。
肢-带型肌营养不良症(LGMD)：LGMD开始于童年后期至成年早期并影响男性和女性，造成臀部和肩部周围肌肉无力。它是最具变化的肌营养不良症，且这种病的几种不同形式目前已被了解。许多疑似患LGMD的人可能在过去被误诊，因此该病的患病率是很难估计。在美国的受影响的人数可能为小几千。
尽管有至少半打基因引起各种类型的LGMD，LGMD的2种主要临床类型通常是公认的。一种严重的童年形式看起来类似于DMD，但作为常染色体隐性性状而遗传。
肢带型肌营养不良症2B型(LGMD2B)是Dysferlin基因中的失去功能的突变所造成。Dysferlin主要在骨骼肌和心肌中表达，但也在单核细胞、巨噬细胞和其他组织中表达，其中它被定位于细胞质小泡和细胞膜。Dysferlin似乎参与膜融合和转运以及修复过程。LGMD2B是迟发性(青少年/年轻成人)肌肉疾病，其特征是进行性对称肌无力，尤其是侵袭性免疫/炎症病理。肌肉活检通常表现出明显的炎症细胞浸润，主要由巨噬细胞/巨噬细胞活化标志物(HLA-DR，HLA-ABC，CD86)、CD8+细胞毒性T细胞和CD4+T细胞，以及肌纤维变性/再生组成。
LGMD的成人发病症状症通常出现在人十几岁或二十几岁时，且其标志为进行性无力和最靠近躯干处肌肉的萎缩。可能发生挛缩，且行走能力通常在发病后约20年失去。患LGMD的有些人发生呼吸无力而需要使用呼吸机。可能在一定程度上缩短寿命。(常染色体显性形式通常发生在生命后期且进展相对缓慢。)
面肩肱型肌营养不良症(FSH)：FSH也称Landouzy-Dejerine病，开始于童年后期至成年早期并影响男性和女性，造成面部、肩部和上臂肌肉无力。臀部和腿部也可受影响。在美国每2万人中约1人出现FSH，且影响到约13,000人。
甚至在同一个家庭的成员中，FSH的严重性和发病年龄也不同。症状通常开始于十几岁或二十出头，尽管婴儿或儿童期也可能发病。症状往往在那些更早发病的人中更严重。这种疾病以身体受疾病影响最严重的部位命名：脸部(面)、肩(肩胛)和上臂(肱骨)的肌肉。臀部和腿部可能一样会受到影响。患FSH的儿童经常发生部分或完全耳聋。
FSHD需要有两个缺陷，第一个是D4Z4重复的缺失，而第二个是DUX4基因的“毒性功能获得”。第一个引起注意的症状往往是难以将物体提升到肩膀以上。一边的无力可能比另一边更大。肩部无力也使肩胛骨向后伸，称为翼状肩胛。
强直性肌营养不良：强直性肌营养不良也称Steinert病，影响男性和女性，导致首先见于脸部、足部和手部的普遍无力。它伴随有无法放松受影响的肌肉(肌强直)。症状可能从出生开始到成人期。强直性肌营养不良症1型(DM1)是最常见形式肌的营养不良症，在美国影响了超过3万人。其源于DMPK(强直性肌营养不良蛋白激酶)基因DNA序列的短(CTG)重复的扩增。强直性肌营养不良症2型(DM2)要少见得多，其源于ZNF9(锌指蛋白9)基因的CCTG重复的扩增。
强直性肌营养不良的症状包括面部无力和下巴松弛、眼睑下垂(上眼睑下垂症)及前臂和小腿肌肉萎缩。患有该肌营养不良症的人难以放松其抓握，尤其是如果物体是冷的时。强直性肌营养不良影响心脏肌肉而导致心律失常和心脏传导阻滞，并影响消化系统的肌肉而导致运动病症和便秘。身体的其他系统也受到影响：强直性肌营养不良可能导致白内障、视网膜变性、低智商、前额秃头、皮肤病、睾丸萎缩、睡眠呼吸暂停和胰岛素抵抗。由于其减少的动力，通常对睡眠的需要和欲望增加。严重残疾在发病20年内影响患有这种类型的营养不良的大多数人，尽管大多数人即使在生命的晚期也不需要轮椅。HRS组合物可用于治疗强直性肌营养不良，例如，通过减少与肌肉组织相关的炎症，包括骨骼肌(例如，股四头肌肌肉)和/或心脏组织以及其他组织。
眼咽型肌营养不良症(OPMD)：OPMD影响两种性别的成人，导致眼肌和喉部无力。其最常见于魁北克的法裔加拿大家庭和美国西南部的西班牙裔美国人家庭。
OPMD通常开始于一个人的30或40多岁，伴有控制眼睛和喉部肌肉的无力。症状包括眼睑下垂、吞咽困难(吞咽障碍)，且无力发展到脸部、颈部和偶尔上肢的其他肌肉。吞咽困难可能会引起吸入或将食物或唾液引入气管。随之可能引发肺炎。
远端型肌营养不良症(DD)：DD开始于中年或更晚，导致手脚的肌肉无力。在瑞典最常见，而在世界其他地区罕见。DD通常开始于20或30多岁，伴有手、前臂和小腿无力。精细运动如打字或紧固钮扣的困难可能是第一症状。症状发展缓慢，通常该疾病不影响寿命。
先天性肌营养不良症(CMD)：CMD从出生就呈现，其导致普遍无力且通常发展缓慢。一种称为福山型CMD的亚型也涉及精神发育迟滞。二者均很少见；福山型CMD在日本更常见。
CMD从出生时的标志即为严重肌无力，婴儿表现得“很懒散”而很少很少主动运动。尽管如此，患CMD的儿童可在有或没有一些辅助设备下学会走路，并生活到年轻的成人或更长。相反，患福山型CMD的人很少能行走，且患有严重的精神发育迟滞。大多数患有该类CMD的儿童死于童年。
恶病质：恶病质(或消耗综合征)通常特征在于体重减轻、肌肉萎缩、疲劳、无力和一些没有主观减肥愿望的人中的明显食欲丧失。恶病质的正式定义是失去无法在营养上逆转的体重。即使受影响的患者消耗更多热量，瘦体重仍然失去，这表明存在原发性病理。
患有以下疾病的患者经历了恶病质：癌症、AIDS、慢性阻塞性肺病、多发性硬化症、充血性心力衰竭、结核病、家族性淀粉样多发性神经病、汞中毒(肢端痛)和激素缺乏以及其他疾病。
恶病质也可以是各种潜在病症的症状，包括癌症、代谢性酸中毒(即，蛋白质合成减少和蛋白质分解代谢增加)、某些传染病(例如，结核病、AIDS)、慢性胰腺炎、自身免疫病症或安非他明成瘾。恶病质削弱患者身体为由于食欲不振、乏力和贫血产生的静止状态，且通常对标准治疗的响应较差。
所有癌症患者的约50％患有恶病质。患有上消化道癌和胰腺癌的患者具有最高的发展恶病质症状的频率。除了增加的发病率和死亡率，加重化疗的副作用，并降低生活质量，恶病质被认为是癌症患者大比例死亡(22％-40％的患者)的直接原因。癌症恶病质症状包括进行性体重减轻和脂肪组织和骨骼肌的主体(host)储备消耗。传统的治疗方法包括使用食欲刺激剂、5-HT3拮抗剂、营养补充剂和COX-2抑制剂。
尽管对恶病质的致病机理了解很少，预计其涉及多种生物学路径，包括促炎性细胞因子如TNF-α、神经内分泌激素、IGF-1和肿瘤特异性因子如蛋白水解诱导因子。
因此，HRS组合物可用于治疗恶病质和任何其相关的、潜在的或继发性病症或并发症。HRS组合物可单独地或与其他治疗剂组合使用，如组合有高蛋白、亮氨酸和鱼油、抗氧化剂、孕激素(醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮)和抗环氧酶-2药物、食欲刺激剂和5-HT3拮抗剂等的饮食补充剂。
横纹肌溶解症：横纹肌溶解症是骨骼肌组织中的肌纤维被降解。降解产物被释放至血液中，且这些产物中的某些物质如肌红蛋白对肾脏有害且可引起肾衰竭。
症状包括肌肉痛、呕吐、意识模糊、昏迷或不正常的心率和节律，且其严重性通常取决于肌肉损伤的程度以及肾衰竭是否发展。对肾脏的损伤可能会导致尿液产生减少或无尿，通常在肌肉损伤开始后约12-24小时。受损肌肉的肿胀可导致间隔综合征或压迫周围组织如相同筋膜间隙中的神经和血管，并导致受影响的身体部位的血液损失和损害(例如，功能丧失)。这种并发症的症状包括受影响的肢体疼痛或感觉减退。其它并发症包括弥散性血管内凝血(DIC)，一种可能会导致无法控制的出血的血液凝结的严重破坏。
起初的肌肉损伤可源于例如，物理因素(例如挤压损伤、剧烈运动)、改变血液供应(例如，动脉血栓形成、栓塞)、代谢改变(例如，高血糖高渗状态、高和低钠血症、低钾血症、低钙血症、低磷血症、酮症酸中毒、甲状腺机能减退)、改变体温(高温、低温)、药物和毒素(例如，他汀类、抗精神病药物、神经肌肉封闭剂、利尿剂、重金属、铁杉、昆虫或蛇的毒液)、药物滥用(例如、酒精、安非他明、可卡因、海洛因、氯胺酮、LDS、MDMA)、感染(例如柯萨奇病毒、流感A病毒、流感B病毒、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒、原发性艾滋病毒感染、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、疱疹病毒、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、沙门氏菌)和自身免疫性肌肉损伤(例如、多发性肌炎、皮肌炎)。另外，某些遗传性疾病状况增加横纹肌溶解症的风险，包括糖酵解和肝糖分解缺陷(例如，麦卡德尔病、磷酸果糖激酶缺乏症、糖原贮积病VIII、IX、X和XI)、脂质代谢缺陷(例如，肉碱棕榈酰转移酶I和II缺乏症、酰基CoA脱氢酶亚型缺乏症(例如，LCAD、SCAD、MCAD、VLCAD、3-羟酰基辅酶A脱氢酶缺乏症)、硫解酶缺乏症)、线粒体肌肉疾病(例如琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶和辅酶Q10缺乏症)和其他疾病如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症和肌营养不良症。
横纹肌溶解症通常是通过验血和验尿来诊断，并且可以通过异常升高或增加的肌酐和尿素水平、下降的排尿量或尿红棕色变色来显示。主要治疗方法包括静脉输液、透析和血液滤过。
因此，HRS组合物可用于治疗横纹肌溶解症和任何其相关的继发性或潜在病症或并发症。HRS组合物可单独地或组合其他治疗方法使用，包括旨在治疗休克和保护肾功能的那些。示例性疗法包括给予静脉液体，通常为等渗盐水(0.9％重量每体积氯化钠溶液)，以及肾脏替代疗法(RRT)如血液透析、连续血液滤过和腹膜透析。
更通常地，本文描述的HRS多肽能够降低炎性反应，如通过降低免疫细胞迁移或浸润至选择的组织、增加抗炎症细胞因子的产生，或者降低促炎性细胞因子的产生或活性以及其他机制。
因此，本发明的HRS多肽可用于调节急性炎症、慢性炎症或二者。某些实施方案涉及增加急性炎症或急性炎症反应，而某些实施方案涉及增加慢性炎症或慢性炎症反应。根据对象的需要，某些实施方案涉及降低急性炎症或炎症反应，而某些实施方案涉及降低慢性炎症或慢性炎症反应。
急性炎症涉及身体对推测有害的刺激物的初始响应，并且涉及从血液移动到受伤组织的血浆和白细胞的增加。这是个短期过程，通常在几分钟或几小时内开始并且在清除了该伤害性刺激物后结束。急性炎症的特征可能为以下任何一种或多种：发红、增加的发热、肿胀、疼痛和功能的丧失。发红和发热的主要原因是增加的血流量以身体核心温度流向发炎部位，肿胀是体液积累造成的，疼痛通常是由于刺激神经末梢的化学物质的释放，而功能丧失有多方面的原因。
急性炎症反应主要是由局部免疫细胞引起，如驻留型巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、库普弗(Kuppfer)细胞和T细胞。在感染、烧伤或其他损伤发生时，这些细胞通过激活和释放炎症介质导致炎症临床病征，如血管活性胺和类花生酸。血管舒张和其产生的血流量的增加导致发红和发热增加。血管渗透性增加导致血浆蛋白渗出或渗漏而流入组织产生肿胀。某些释放的介质如缓激肽增加对疼痛的敏感性，并改变血管以允许白细胞如中性粒细胞的迁移或外渗，其通常是沿着局部免疫细胞产生的趋化梯度迁移。
急性炎症反应还包括一个或多个非细胞的生化级联系统，由预先形成的血浆蛋白调节组成，其并行作用以引起和扩散炎症反应。这些系统包括补体系统，其主要由细菌激活，以及凝血和纤维蛋白溶解系统，其主要由坏死来激活，如由某些感染、烧伤或其他外伤引起的组织损伤类型。因此，HRS多肽可用于调节急性炎症，或任何一个或多个单个的急性炎症反应。
慢性炎症是延长和延迟的炎症反应，其特征在于炎症部位存在的细胞类型的进行性转变，且常常导致同时或几乎同时的炎症过程组织的破坏和愈合。在细胞水平上，慢性炎症反应涉及多种免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和成纤维细胞，但与主要是由中性粒细胞介导的急性炎症不同，慢性炎症主要由单核细胞如单核细胞和淋巴细胞介导。慢性炎症还涉及多种炎症介质，如IFN-γ和其他细胞因子、生长因子、活性氧类和水解酶。慢性炎症可能持续数月或数年，并可能导致不希望的组织破坏和纤维变性。
慢性炎症的临床病征取决于疾病的持续时间、炎性病灶、病因和受影响的解剖学区域，(参见例如，Kumar et al.,Robbins Basic Pathology-SiAEd.,2009Elsevier,London；Miller,LM,Pathology Lecture Notes,AtlanticVeterinary College,Charlottetown,PEI,Canada)。慢性炎症与多种病理学疾病状况或疾病有关，包括例如，过敏症、阿尔茨海默症、贫血、主动脉瓣狭窄、关节炎如风湿性关节炎和骨关节炎、癌症、充血性心力衰竭、纤维组织肌痛、纤维变性、心脏病发作、肾衰竭、狼疮、胰腺炎、中风、手术并发症、炎性肺病、炎性肠病、动脉粥样硬化和牛皮癣，以及本文描述的和本领域所知的其他类型。因此，HRS多肽可用于治疗或控制慢性炎症、调控任何一种或多种单个的慢性炎症反应，或治疗任何一种或多种与慢性炎症有关的疾病或疾病状况。
HRS多肽也可调节增生性炎症，这个炎症过程的特征为组织细胞数的增加。这些可包括皮肤病症如牛皮癣、皮脂溢出或湿疹，或者也可认为是涉及癌症和异常生长，尤其是鉴于基于记录甚至更低级的慢性炎症的更有效分子方法积累的证据。
在某些实施方案中，HRS多肽可在细胞水平上调节炎症反应，如通过调节参与炎症的各种细胞的激活、炎性分子分泌(例如，细胞因子或激肽分泌)、增殖、活性、迁移或粘附。这类细胞的实例包括，免疫细胞和血管细胞。免疫细胞包括例如，粒细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、淋巴细胞如B-细胞、杀伤性T-细胞(即，CD8+T-细胞)、辅助性T-细胞(即，CD4+T-细胞，包括Tl和T2细胞)、自然杀伤细胞、γδT-细胞、树突状细胞和肥大细胞。血管细胞的实例包括，平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。还包括调节与一种或多种免疫细胞或血管细胞有关的炎症状况，包括中性粒细胞介导的、巨噬细胞介导的和淋巴细胞介导的炎症状况的方法。
在某些实施方案中，HRS多肽调节局部炎症、系统性炎症或二者。在某些实施方案中，HRS多肽可降低或维持(即，防止进一步增加)局部炎症或局部炎症反应。在某些实施方案中，根据对象的需要，HRS多肽可增加局部炎症或局部炎症反应。在某些实施方案中，HRS多肽可降低或维持(即，防止进一步增加)系统性炎症或系统性炎症反应。在某些实施方案中，根据对象的需要，HRS多肽可增加系统性炎症或系统性炎症反应。
在某些实施方案中，炎症或炎症反应的调节可能与一种或多种组织或器官有关。这类组织或器官的非限制性实例包括，皮肤(例如，真皮、表皮、皮下层)、毛囊、神经系统(例如，脑、脊髓、周围神经)、听觉系统或平衡器官(例如，内耳、中耳、外耳)、呼吸系统(例如，鼻、气管、肺)、胃食管组织、消化系统(例如，口、食道、胃、小肠、大肠、直肠)、血管系统(例如，心脏、血管和动脉)、肝、胆囊、淋巴/免疫系统(例如，淋巴结、淋巴滤泡、脾脏、胸腺、骨髓)、泌尿生殖系统(例如，肾脏、输尿管、膀胱、尿道、宫颈、输卵管、卵巢、子宫、外阴、前列腺、尿道球腺、附睾、前列腺、精囊、睾丸)、肌肉骨骼系统(例如，骨骼肌、平滑肌、骨、软骨、肌腱、韧带)、脂肪组织、乳腺和内分泌系统(例如，下丘脑、垂体、甲状腺、胰腺、肾上腺)。因此，HRS多肽可用于调节与任何这些组织或器官有关的炎症，如治疗与这些组织或器官的炎症有关的疾病状况或疾病。
如上所述，某些实施方案可使用HRS多肽来降低或控制(即，防止进一步增加)与特定组织或器官有关的炎症或炎症反应。包括与皮肤有关的炎症反应和疾病状况，包括与皮肤的真皮、表皮和皮下层有关的炎症、感染和癌症。与皮肤有关的炎症状况的实例，包括但不限于，皮炎如牛皮癣、刺激性皮炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎(湿疹)、过敏性接触性皮炎、热诱导的皮炎、药物诱导的皮炎、出汗障碍皮炎、荨麻疹、自身免疫性皮炎、皮肤癌如黑素瘤和大疱性皮炎。还包括细菌、病毒和寄生虫感染、多形性红斑、结节性红斑、环状肉芽肿、毒橡树/毒藤和中毒性表皮坏死松解症。
某些实施方案涉及降低与神经系统有关的炎症反应和疾病状况，包括与中枢神经系统的大脑和脊髓、周围神经系统和脑膜有关的炎症、感染和癌症。炎症介质包括补体、黏附分子、环氧合酶及其产物和细胞因子的表达在实验和临床神经退行性疾病中增加，且在实验动物的干预研究表明，这些因子中的几种直接与神经损伤相关。例如，特定细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)，已知与急性神经退行性疾病如中风和头部损伤密切相关。
与神经系统有关的炎症状况的实例，包括但不限于，脑膜炎(即，覆盖大脑和脊髓的保护膜的炎症)、脊髓炎、脑脊髓炎(例如，肌痛脑脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、播散性脑脊髓炎或多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎)、蛛网膜炎(即，蛛网膜——环绕并保护中枢神经系统的神经的一种膜的炎症)、肉芽肿、药物引起的炎症或脑膜炎、神经退行性疾病如阿尔茨海默症、中风、HIV相关痴呆、Sly综合征、CMT、视网膜病变、感官性听力损失、脊髓性肌萎缩、ALS脑炎如病毒性脑炎和细菌性脑炎、寄生虫感染、炎性脱髓鞘性病症和自身免疫病症如CD8+T细胞-介导的CNS自身免疫疾病。其他的例子包括帕金森氏病、重症肌无力、运动神经病、格林-巴利(Guillain-Barre)综合征、自身免疫性神经病、朗-伊二氏肌无力综合征、副肿瘤性神经系统疾病、副肿瘤性小脑萎缩、非副肿瘤僵人综合征、进行性小脑萎缩、拉斯姆森(Rasmussen)脑炎、肌萎缩侧索硬化症、西德纳姆(Sydeham)舞蹈症、抽动秽语综合征、自身免疫性多内分泌病、免疫异常神经疾病、后天神经性肌强直、多发性关节挛缩症、视神经炎和僵人综合征。
如上所述，还包括与神经系统感染有关的炎症。与神经系统炎症有关的细菌感染的具体实例，包括但不限于，链球菌感染如B组链球菌(例如，亚型III)和肺炎链球菌(例如，血清型6、9、14、18和23)、大肠杆菌(例如，携带Kl抗原)、单核细胞增生李斯特菌(例如，IVb血清型)、奈瑟氏球菌感染如脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎双球菌)、金黄色葡萄球菌感染、流感嗜血杆菌感染如B型流感杆菌、肺炎克雷伯菌和分枝结核杆菌。还包括金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性细菌的感染，主要与头骨损伤有关，其使在鼻腔内的细菌有可能进入脑膜空间，或具有脑室分流或相关设备(例如，体外脑室引流、Ommaya储液囊)的人中。与神经系统炎症有关的病毒感染的具体实例，包括但不限于，肠道病毒、单纯疱疹病毒1型和2型、嗜人T-淋巴细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒(水痘和带状疱疹)、腮腺炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)。脑膜炎也可能源自螺旋菌感染如苍白密螺旋体(梅毒)和伯氏疏螺旋体(莱姆病)、寄生虫如疟疾(例如，脑型疟疾)、真菌如新型隐球菌和阿米巴如福氏耐格里变形虫。
脑膜炎或其他形式的神经系统炎症也可与以下方面有关：癌症扩散到脑膜(恶性脑膜炎)、某些药物如非甾体抗炎药物、抗生素和静脉注射免疫球蛋白、肉状瘤病(或神经肉状瘤病)、结缔组织病症如系统性红斑狼疮，以及某些形式的血管炎(血管壁的炎症状况)如Beliefs病。表皮样囊肿和皮样囊肿可通过释放刺激性物质进入蛛网膜下腔而导致脑膜炎。因此，HRS多肽可用于治疗或控制这些疾病状况中的任何一种或多种。
某些实施方案涉及降低与听觉系统或平衡器官如内耳、中耳和外耳有关的炎症反应和疾病状况。与听觉系统或平衡器官有关的炎症状况的实例，包括但不限于，外耳炎(例如，耳部感染)；中耳炎，这可能会导致液体积聚在正常情况下空气填充的空间和相关的传导性耳聋；迷路炎，一种内耳感染或引起头晕(眩晕)和耳聋的炎症；前庭神经元炎，一种前庭神经感染，通常是病毒，其导致眩晕；以及耳蜗神经元炎，一种耳蜗神经感染，通常是病毒，其导致突发性耳聋但无眩晕。由于听力丧失而接受人工耳蜗植入的人在肺炎球菌脑膜炎及其相关的炎症方面的风险增加。
某些实施方案涉及降低与呼吸系统有关的炎症反应和疾病状况，包括与鼻子、气管和肺部有关的炎症、感染和癌症。与呼吸系统有关的炎症状况的实例，包括但不限于，炎性肺病、变应性哮喘、非变应性哮喘、过敏性哮喘、变应性支气管IgE-介导的哮喘、支气管哮喘、特发性哮喘、真气喘(true asthma)、由病理生理扰乱引起的内因性哮喘、环境因素引起的外因性哮喘、未知的或不明显原因引起的特发性哮喘，非变应性哮喘、支气管哮喘、肺气肿性哮喘、运动引起的哮喘、过敏原引起的哮喘、冷空气引起的哮喘、职业性哮喘、由细菌、真菌、原生动物或病毒感染引起的感染性哮喘、非过敏性哮喘、早期哮喘、婴儿喘鸣综合征(wheezyinfant syndrome)和支气管炎、慢性或急性支气管痉挛、慢性支气管炎、小气道阻塞和肺气肿。其他实例包括阻塞性或炎性气道疾病如慢性嗜酸细胞性肺炎、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、包括慢性支气管炎、肺气肿的COPD或与COPD相关或不相关的呼吸困难、特征为不可逆的进行性气道阻塞的COPD，以及成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。
与肺部炎症相关的疾病状况的其他实例，包括其他药物治疗后的气道高反应性加重相关的疾病状况、与肺动脉高压有关的气道疾病、支气管炎如急性支气管炎、急性喉气管支气管炎、花生仁吸入性支气管炎、卡他性支气管炎、格鲁布性支气管炎(croupus bronchitis)、干性支气管炎、感染性哮喘性支气管炎、增生性支气管炎、金黄色葡萄球菌或链球菌支气管炎和水泡性支气管炎、急性肺损伤和支气管扩张如圆筒状支气管扩张、囊状支气管扩张、梭形支气管扩张、细支气管扩张、囊性支气管扩张、干性支气管扩张和滤泡性支气管扩张。
COPD具体是指阻碍气流并使得受影响个体正常呼吸的难度逐渐增加的一组肺病。肺气肿和慢性支气管炎是该组COPD疾病中的两种主要疾病状况，但COPD也指由慢性哮喘性支气管炎造成的损害以及本领域所知的其他疾病状况。在大多数情况下，对气流的破坏最终会干扰肺部氧气和二氧化碳的交换。标准的治疗主要集中在控制症状和减少进一步损伤。
肺气肿代表COPD的一个方面。肺气肿导致脆弱的肺泡壁内的炎症，这可能会破坏一些壁和弹性纤维，使小气道在呼气后塌陷并减少气流流出肺部。肺气肿的病征和症状包括，例如气短，尤其是在身体活动期间，喘鸣和胸闷。
慢性支气管炎代表COPD的另一个方面。慢性支气管炎的特征在于持续的咳嗽，并导致炎症和支气管狭窄。该疾病状况也导致粘液产生增加，其可进一步阻塞狭窄的支气管。慢性支气管炎主要发生在吸烟者，且通常定义为在连续两年中至少一年有3个月持续咳嗽。慢性支气管炎的病征和症状包括，例如在早晨的第一件事是必须清理喉咙，尤其是吸烟者，慢性咳嗽产生黄痰，在后期阶段呼吸急促和反复的呼吸道感染。如上所述，COPD主要是指由于两种以上所述的慢性肺部疾病状况引起的肺部障碍。然而，许多COPD患者同时患有这两种疾病状况。
慢性哮喘性支气管炎代表COPD的另一个方面，其特征通常在于慢性支气管炎结合有哮喘(支气管炎痉挛)。当发炎和感染的分泌物刺激气道中的平滑肌时就可能发生哮喘。其症状类似于慢性支气管炎的症状，但还包括间歇性或甚至每天的喘鸣发作。
在某些实施方案中，COPD也可能有自身免疫性组分。例如，严重肺气肿患者的肺部和外周血T细胞在体外用弹性肽刺激后分泌Thl细胞因子和趋化因子，且相比对照这些患者具有增加的抗-弹性蛋白抗体(参见Goswami et al,The Journal of Immunology.178:130.41,2007)。同样，COPD患者中普遍具有对肺上皮细胞具亲和性并可能介导细胞毒性的IgG自身抗体(参见Feghali-Bostwick et al.,Am J Respir Crit Care Med.177:156-63,2008)。由于自体反应性免疫应答在该疾病的病因学中可能很重要，包括例如，对自身抗原如弹性蛋白的自身反应性应答，在COPD中可能起着作用，使用AARS多肽使免疫细胞对这些抗原脱敏可降低肺部炎症。
如上所述，某些实施方案涉及使用HRS多肽使免疫细胞对选定的抗原，包括自身抗原和外来抗原、刺激物、过敏原或与肺部炎症有关的感染性病原体脱敏。通过使这些免疫细胞对选定的抗原脱敏，HRS多肽可减少这些细胞迁移或募集至肺部，从而降低炎症。免疫细胞的实例，包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。抗原的实例，包括但不限于，烟如香烟烟雾、空气污染、烟气如焊接烟气、粉尘包括二氧化硅粉尘和工作场所粉尘如煤矿和金矿发现的那些粉尘、化学物质如镉和异氰酸酯。还包括已知的过敏和感染源(infectious agent)，如细菌和病毒或抗原，包括脂多糖(LPS)，其可能会加剧敏感个体中的COPD。
某些实施方案涉及降低胃肠系统相关的炎症反应和疾病状况，包括与口、食管、胃部、小肠、大肠和直肠有关的炎症、感染和癌症。如本文所用，“胃肠炎症”是指胃肠道粘膜层的炎症，且包括急性和慢性炎症状况。急性炎症通常特征在于短时发作和中性粒细胞的浸润或流入。慢性炎症通常特征在于相对较长时期的发作和单核细胞的浸润或流入。慢性炎症通常特征还在于周期性的自发缓解和自发发生。
“胃肠道的粘膜层”是指包括肠(包括小肠和大肠)、直肠、胃内层、口腔等的粘膜。“慢性胃肠道炎症”是指特征在于相对较长时期的发作的胃肠道粘膜炎症，其持续时间长(例如，从几天、几周、几月或几年长达对象的一生)，且通常与单核细胞的浸润和流入有关，且可能进一步与周期性的自发缓解和自发发生有关。具有这类慢性炎症的“慢性胃肠道炎症状况”(也称为“慢性胃肠道炎性疾病”)，包括但不限于，炎性肠病(IBD)、环境损伤(例如，与治疗方案如化疗、放射疗法等有关的胃肠炎症)引起的结肠炎、诸如慢性肉芽肿病的疾病状况中的结肠炎(参见例如，Schappi et al,Arch Dis Child.84:147-151,2001)、腹腔疾病、乳糜泻(即，其中肠内层因响应摄入称为麸质的蛋白而发炎的遗传性疾病)、食物过敏症、胃炎、感染性胃炎或小肠结肠炎(例如，幽门螺杆菌感染的慢性活动性胃炎)和感染源引起的其他形式的胃肠炎症以及其他类似疾病状况。
如本文所用，“炎性肠病”或“IBD”是指特征为肠道的全部或部分炎症的各种疾病。炎性肠病的实例包括但不限于，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。术语IBD包括：假膜性结肠炎、出血性结肠炎、溶血性尿毒症综合征结肠炎、胶原性结肠炎、缺血性结肠炎、放射性结肠炎、药物和化学诱导的结肠炎、改道性结肠炎、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、结肠过敏综合征和克罗恩氏症；以及克罗恩氏病中的所有亚型，包括主动性、难治的和肛瘘性克罗恩氏症。因此，HRS多肽可用于治疗或控制这些疾病状况中的任何一种或多种。
某些实施方案涉及降低与血管系统或血管炎症有关的炎症反应和疾病状况，如与血管和心脏有关的炎症。与血管系统有关的炎症状况的实例，包括但不限于，心肌炎、心包炎、闭塞性疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、血栓症、自身免疫性肠下垂、心脏肌肉疾病、川崎病、幼年特发性关节炎、韦格纳肉芽肿、高安氏(Takayasu)关节炎、川崎综合征、抗-因子VIII自身免疫疾病、坏死性小血管炎、显微镜下多血管炎、Churg-Strauss综合征、微量-免疫(pauci-immne)局灶坏死性肾小球性肾炎、新月体性肾小球性肾炎、抗磷脂综合征、抗体诱导的心力衰竭、血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、查加斯氏(Chagas)病中的心脏自身免疫和抗-辅助性T淋巴细胞自身免疫。还包括心内膜炎或小簇细菌通过血流传播的心脏瓣膜感染、静脉炎或血管炎、一种或多种静脉的炎症和血栓性静脉炎、血栓相关的静脉炎。血栓性静脉炎可能在不同位置反复发生，其即被称为迁移性血栓性静脉炎或游走性血栓性静脉炎。静脉炎可能与各种原因有关，如细菌感染、暴露于化学制剂如刺激性或发泡剂溶液、来自经皮穿刺的物理损伤如插入期间套管进入静脉的移动、药物如西乐葆、奥氮平、抗抑郁药等以及酗酒。某些实施方案可涉及治疗或控制由以下一种或多种疾病引起的心脏炎症：急性风湿热、先天性弓形虫病、肠病毒产前感染、莱姆病和风湿热。
某些实施方案涉及降低与肝脏或胆囊有关的炎症反应和疾病状况，包括急性和慢性肝炎以及急性和慢性胆囊炎。与肝脏和胆囊有关的炎症状况的实例，包括但不限于，自身免疫性肝炎、病毒性肝炎(例如，肝炎A病毒、肝炎B病毒、肝炎C病毒、肝炎D病毒、肝炎E病毒、单核细胞增多症、风疹、爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒)、引起肝炎的其他原因如严重的细菌感染、阿米巴感染、药物(例如，阿戈美拉汀、别嘌呤醇、阿米替林、胺碘酮、咪唑硫嘌呤(asathioprine)、扑热息痛、氟烷、布洛芬、吲哚美辛、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、酮康唑、氯雷他定、甲氨蝶呤、甲基多巴、米诺环素、硝苯地平、呋喃妥因、苯妥英、丙戊酸、曲格列酮、齐多夫定)、毒素(例如，酒精、真菌毒素)和代谢性病症(例如、威尔逊氏病，一种身体铜代谢病症；血色病，身体铁代谢的病症；非酒精性脂肪性肝炎，α1-抗胰蛋白酶缺乏症)。其他的例子包括非酒精性脂肪肝病、肝硬化如原发性胆汁性肝硬化、阻塞性黄疸、缺血性肝炎和胆囊疾病。
某些实施方案涉及降低与淋巴/免疫系统有关的炎症反应和疾病状况。淋巴/免疫系统相关的炎症状况的实例，除了自身免疫性溶血性贫血及各种淋巴结病以外，还包括但不限于，自身免疫性疾病如查加斯病、慢性阻塞性肺病(COPD)、克罗恩氏症、皮肌炎、糖尿病I型、子宫内膜异位症、Goodpasture综合征、Graves病、格林-巴利综合征、桥本病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、(特发性)血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性结缔组织病、硬斑病、重症肌无力、发作性嗜睡病、神经性肌强直、寻常性天疱疮、恶性贫血、牛皮癣、银屑病关节炎、脊髓灰质炎、原发性胆汁性肝硬化、风湿性关节炎、精神分裂症、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
还包括与移植物、组织、细胞或器官的移植有关的免疫相关炎性疾病状况，如移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、过急性移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主病。在某些实施方案中，AARS多肽可在组织移除前或期间给予至移植物供体。在某些实施方案中，HRS多肽可在移植治疗之前、期间和/或之后给予至移植物受体以降低移植治疗的炎症相关并发症。移植治疗的实例包括骨髓、干细胞、外周血、肝、肺、心脏、皮肤和肾脏，以及本领域已知的其他移植物。其他实例包括与过敏症有关的炎症状况，如哮喘、荨麻疹、风疹、花粉过敏、尘螨过敏、毒液过敏、化妆品过敏、乳胶过敏、化学过敏、药物过敏、昆虫叮咬过敏、动物皮屑过敏、带刺的植物过敏、毒藤过敏和食物过敏。
某些实施方案涉及降低与泌尿生殖系统有关的炎症反应和疾病状况。与泌尿生殖系统有关的炎症状况的实例，包括但不限于，输尿管、膀胱、尿道、宫颈、输卵管、卵巢、子宫、外阴、前列腺、尿道球腺、附睾、前列腺、精囊、睾丸或肾脏。还包括自身免疫性间质性肾炎、肾脓肿(肾内或肾外)、急性前列腺炎、血尿、尿道炎(例如，衣原体和其他性传播疾病)、盆腔炎性疾病(PID)和前列腺脓肿。还包括与以下一种或多种有关的肾炎：肾小球性肾炎、狼疮肾炎、肾病、痛风、毒物或化学品(例如，醚、硫酸铊)、某些药物(例如，吡罗昔康、Candyl、吡罗昔康凝胶、Fensaid、吡罗(pirox))、赫尔曼综合征、黄热病、免疫复合物疾病、伤寒热、尿道狭窄、肾结核病和链球菌感染后肾小球性肾炎。
某些实施方案涉及降低与骨骼肌肉系统有关的炎症反应和疾病状况。骨骼肌肉系统相关的炎症状况的实例，包括但不限于，关节炎如风湿性关节炎和银屑病关节炎、强直性脊柱炎、自身免疫性肌肉炎、原发性干燥综合征、平滑肌自身免疫性疾病、肌肉炎、多发性肌炎、肌腱炎、韧带炎、软骨炎、关节炎、滑膜炎、腕管综合征、慢性肌肉炎和骨炎，包括与骨质疏松症和骨关节炎相关的骨炎。还包括提策氏(Tietze)综合征(一种肋胸骨、胸锁骨或肋软骨关节的良性的、疼痛的非化脓性局部肿胀)、肋软骨炎、胸骨肌综合征、剑突痛、自发性胸锁关节半脱位、胸肋锁关节骨质增生、纤维组织肌痛、肩部肌腱炎或滑囊炎、痛风关节炎、风湿性多肌痛、红斑狼疮、骨刺、骨折如应力性骨折、恶病质、肌肉减少、肌无力、肌肉萎缩疾病、肌肉损伤、肌痛、散发性包涵体肌肉疾病、遗传性包涵体肌肉疾病和肌聚糖不足。还包括肌营养不良症(例如DMD)、肌强直营养不良症、横纹肌溶解症及本文描述的其他肌肉炎性疾病。
某些实施方案涉及降低与内分泌系统有关的炎症反应和疾病状况。内分泌系统相关炎症状况的实例，包括但不限于，与下丘脑、垂体、甲状腺、胰腺或肾上腺有关的炎症、感染或癌症、腺性疾病如胰腺疾病、糖尿病如I型糖尿病、甲状腺疾病、Graves病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、(特发性)粘液性水肿、卵巢自身免疫、自身免疫性抗精子不育症、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺体综合征。
某些实施方案涉及降低与脂肪组织有关的炎症反应和疾病状况，脂肪组织是调节生理和病理过程包括免疫炎症以及与脂肪营养不良、核纤层蛋白病、川崎病、幼年特发性关节炎、溶酶体贮积病和黏多糖贮积病有关的炎症状态的积极参与者。
巨噬细胞是脂肪组织的成分且积极参与其活动。此外，淋巴细胞和脂肪细胞之间的交叉串扰可导致免疫调节。脂肪组织产生和释放多种促炎和抗炎因子，包括脂肪细胞因子瘦素、脂联素、抵抗素和内脂素，以及细胞因子和趋化因子如TNF-α、IL-6、单核细胞趋化蛋白1等。由脂肪组织产生的促炎性分子已知为胰岛素抵抗发展和与肥胖症有关的心血管疾病风险增加的积极参与者。相反，降低的瘦素水平可能更易导致由于在营养不良的个体中T-细胞响应降低而引起的感染的易感性增加。已在多种炎症状况中观察到改变的脂肪因子水平(参见例如，Fantuzzi,JAllergy Clin Immunol.115:911-19,2005；和Berg et al,Circulation Research.96:939,2005)。
HRS多肽也可用于治疗或控制与过敏症有关的炎症。这类疾病状况的实例包括，I型过敏症、Ⅱ型过敏症型、Ⅲ型过敏症、IV型过敏症、即发性过敏症、抗体介导的过敏症、免疫复合物介导的过敏症、T-淋巴细胞介导的过敏症和迟发型过敏症。
HRS多肽也可用于治疗或控制自身炎症状况。自身炎症状况的实例包括，家族性地中海热、TNF受体相关的周期综合征(TRAPS)、高IgD综合征(HIDS)、CIASI-相关的疾病如Muckle-Wells综合征、家族性寒冷自身炎症综合征和新生儿发病的多系统炎性疾病、PAPA综合征(化脓性无菌性关节炎、坏疽性脓皮病、痤疮)和Blau综合征。
HRS多肽可用于治疗或控制与各种癌症有关的炎症。这类癌症的实例，包括但不限于，前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、脑癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、骨癌、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤和非霍奇金淋巴瘤。
如上所述，某些实施方案可使用HRS多肽调节系统性炎症如降低或控制系统性炎症。在某些实施方案中，系统性炎症可能与系统性炎症反应综合征(SIRS)有关，其为具有多种可能原因的全身性炎症状况。SIRS可根据常规诊断技术来表征或鉴别。一个非限制性实例为，SIRS可通过以下中的两种或更多种的存在来鉴别：(i)体温小于36℃或大于38℃，(ii)心率为每分钟跳动大于90次，(iii)呼吸急促(高呼吸率)，每分钟大于20次呼吸；或二氧化碳的动脉分压小于4.3kPa(32mmHg)，和(iv)白细胞计数小于4000个细胞/mm3(4x109个细胞/L)或大于12,000个细胞/mm3(12x109个细胞/L)；或存在大于10％的未成熟的中性粒细胞(带型)。
SIRS广义上分为感染性或非感染性的。最通常的是，感染性SIRS与败血症有关，其为一种组合有已知的或疑似感染的全身性炎症状态，其包括菌血症、病毒血症、寄生虫血症和中毒性休克综合征。败血症与多种感染源有关，包括但不限于，细菌如无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、单核细胞增生李斯特菌、凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、克雷伯氏杆菌属、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠杆菌属、无乳链球菌(S.agalactiae)、沙雷氏菌属、不动杆菌属、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、沙门氏菌属和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)；病毒如风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和水痘病毒；寄生虫如在疟疾感染如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、锥虫病和丝虫病中；和真菌如念珠菌属、曲霉属、组织胞浆菌属、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)和卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)。在某些情况下，在肺部(例如，肺炎)、膀胱和肾(例如，尿路感染)、皮肤(例如，蜂窝组织炎)、腹部(例如，阑尾炎)和其他区域(例如，脑膜炎)的感染可以扩散并导致脓毒症。HRS多肽可用于调节与这些感染源中的任一个有关的炎症，而无论是否存在败血症。
非感染性SIRS可能与创伤、烧伤、胰腺炎、缺血、出血、手术并发症、肾上腺功能不全、肺栓塞、主动脉瘤、心包填塞、过敏反应和药物过量等有关。SIRS通常并发有一种或多种器官或器官系统(包括本文所述那些)的衰竭。具体实例包括急性肺损伤、急性肾损伤、休克和多器官功能障碍综合征等。通常，SIRS是通过聚焦于潜在问题来处理(例如，充足的体液替代减少的血容量、针对胰腺炎的IVF/NPO、针对过敏反应的肾上腺素/类固醇/苯那君)。在某些情况下，硒、谷氨酸盐和二十碳五烯酸显示对改善SIRS症状有效，且抗氧化剂如维生素E可能也有帮助。因此，HRS多肽可单独或与其他疗法结合而用于治疗或控制SIRS和SIRS并发症。
系统性炎症也可能与“细胞因子风暴”有关，其为一种由细胞因子和免疫细胞之间的正反馈回路引起的危险免疫反应，导致各种细胞因子水平高度提升。在某些情况下，细胞因子风暴(高细胞因子血症)包括系统性释放多种已知的炎症介质如细胞因子、氧自由基和凝血因子。包括升高的促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6，以及抗炎症细胞因子如IL-10和IL-1受体拮抗剂的水平。细胞因子风暴可发生于许多感染性和非感染性疾病中，包括移植物抗宿主病(GVHD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症、禽流感、天花和SIRS。细胞因子风暴也可能由某些药物引起。治疗包括OX40IG，其降低T-细胞响应，ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、糖皮质激素、吉非罗齐、自由基清除剂和TNF-α阻滞剂。因此，HRS多肽可单独或与其他疗法结合而用于治疗或控制细胞因子风暴。
某些实施方案可使用HRS多肽降低以下炎症中的任何一种或多种：肉芽肿性炎症、纤维蛋白性炎症、化脓性炎症、浆液性炎症或溃疡性炎症。肉芽肿性炎症特征在于形成肉芽肿，通常源于对感染源如结核病、麻风病和梅毒的响应。纤维蛋白性炎症源于血管渗透性大大增加，其允许纤维蛋白穿过血管。如果存在合适的促凝血刺激如癌症细胞，纤维蛋白渗出物即被沉积。这个过程在浆膜腔中常见，其中可在浆膜之间发生纤维蛋白渗出物转化为瘢痕，限制它们的功能。化脓性炎症源于大量脓液的形成，其由中性粒细胞、死细胞和体液组成。化脓性细菌如葡萄球菌的感染为这类炎症所特有。由周围组织包围的大的局部聚集的脓液称为脓肿。浆液性炎症特征在于非粘性浆液大量渗出，其通常由浆膜的间皮细胞产生，但也可能源于血浆。这种类型的炎症的例子包括皮肤起水泡。溃疡性炎症，其通常发生在上皮细胞附近，导致来自表面的组织坏死性损失，从而暴露出下层组织。上皮细胞的后续挖除称为溃疡。
HRS多肽也可用于治疗物理性损伤或伤口。实例为擦伤、擦伤、割伤、刺伤、撕裂伤、冲击伤、震荡、挫伤、热烧伤、冻伤、化学灼伤、晒伤、坏疽、坏死、干燥、辐射烧伤、放射性烧伤、烟雾吸入、肌肉撕裂、肌肉拉伤、肌腱撕裂、肌腱拉伤、韧带拉伤、韧带撕裂、伸展过度、软骨撕裂、骨折、神经痛、溃疡和射击或其他创伤。
HRS多肽也可用于治疗或控制特发性炎症或原因不明的炎症。还包括联合治疗，其中给予一种或多种AARS多肽或组合一种或多种用于本文描述的任何炎性疾病或疾病状况的其他疗法，包括那些常用的和本领域所知的治疗。联合治疗的实例包括使用标准抗炎剂如非甾体类抗炎药物(NSAID)、免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)和类固醇(例如，糖皮质激素)、抗感染剂如抗生素和抗病毒剂、抗氧化剂、细胞因子、化学治疗剂和其他抗癌症治疗方法，以及免疫抑制疗法。
在一些实施方案中，本发明总体上涉及使用与生物相容性固体载体结合的HRS多肽促进体外清除内源性抗体的方法和组合物。
通过使用固定的抗原的体外免疫吸附来特异性清除循环的抗体已经为众多研究者描述。一般参见et al.,(2011)J Clin Apher.(6):347-55；Müller et al.,(2012)Dermatology.224(3):224-7；Koziolek et al.,(2012)JNeuroinflammation.9(1):80；Bontadi et al.,(2012)J Clin Apher.doi:10.1002/jca.21229；Westermann et al.,(2012)J Dermatol.39(2):168-71。而且，作为可行的用于特异性清除循环的抗体的系统，该方法已成功商业化，实例为德国Fresenius,St.Wendel以商标出售的以及德国Kaneka,Wiesbaden以商标出售的免疫吸附柱。
在体外免疫吸附中，使用内源抗体特异性的免疫吸附柱在体外清除循环抗体。将来自患者的血液连续地或间断地抽出，分为其细胞组分和血浆，而血浆被灌注而通过免疫吸附材料以便清除所述抗体。然后分开地或同时地将血液的处理后的血浆和细胞组分重新输入至患者。在一些实施方案中，可在实施根据本发明的体外免疫吸附后立即给予HRS多肽。
因此，某些实施方案涉及从细胞外体液中体外免疫吸附出抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的方法，包括以下步骤：(a)提供已从对象获得的细胞外体液，(b)用吸附有至少一种HRS多肽的生物相容性固体载体接触所述细胞外体液，从而捕获所述抗-HRS抗体，和(c)将来自步骤(b)的细胞外体液重新输入至所述对象。
还包括用于从对象的体液中清除抗-HRS抗体的免疫吸附组合物，其包含吸附有至少一种HRS多肽的生物相容性固体载体。
通常，在任何这些免疫吸附方法和组合物中，采用本领域技术人员熟知的方法和系统在无菌条件下获得、处理和重新输入所述体液。例如，通过引入例如外周血管中的、经合适的导管与含有生物相容性固体载体的容器连接的针来抽取血液，并通过与插入另一血管的针连接的输入管来重新输入至患者。在要从对象中抽出大体积血液的情况下，血液可从例如锁骨下静脉抽出。
在能促进抗体与结合至载体的HRS多肽之间的结合的条件下，将血液或血浆与生物相容性固体载体接触。用于体外吸附的合适柱和输注系统可商购自例如，德国Fresenius,St.Wendel。通常使用35℃至约40℃的接触温度。接触时间通常为约1至约6小时。然后收集血液或血浆的未结合部分用于重新引入患者，或者其可在连续的基础下直接重新引入患者。所述对象的Jo-1抗体滴度可在该过程之前和/或之后通过免疫分析监测，以监测该过程的效率。
任选地，当从身体抽出血液时可加入抗凝物质如柠檬酸钠、肝素或葡聚糖，以防止血液凝聚。葡聚糖降低血液粘度，并结合盐的加入以确保增加血细胞和血小板之间的距离。这样的抗凝剂可以足以使得血液不凝聚的数量添加。在将处理过的血液回输到对象之前，可用合适量的肝素酶、鱼精蛋白和/或维生素K等来降低例如肝素的抗凝效果。
为了减少栓塞的风险，可以采取预防措施，以避免吸附介质颗粒在回输后进入患者中。因此，通常在吸附介质容器下游采用粒子捕获装置以从体液的剩余液中清除任何残留的颗粒，再使其返回到患者中。粒子捕获装置可为具有开口的过滤器或网格，所述开口的大小能够保留吸附介质的任何颗粒物质，同时让体液的未吸附的实体通过。体外血液灌注可以连续进行，或可选择地，可从患者抽出不连续量的血液，并在完成上述处理后将血液处理过的血浆和细胞成分返还至患者。
众多材料可适合用作生物相容性固体载体，以用于任何这些免疫吸附方法和组合物中，且理想地，载体基质应具有机械强度、足够的亲水性以防止非特异性结合蛋白、稳定性和与血液和其他水溶液相容。合适的生物相容性基质材料包括例如，各种形式(包括珠子、纤维状、片状或中空纤维)的合成和天然的聚合物、多糖、聚酰胺、玻璃珠、微粒硅胶、多孔玻璃、硅胶、树脂、合成基质(包括丙烯酰胺衍生物、甲基丙烯酰胺衍生物或聚苯乙烯衍生物等)。
示例性聚合物包括天然和合成的多糖以及其他基于糖类的聚合物，包括琼脂、藻酸盐、卡拉胶、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐胶、刺槐豆胶、黄原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋白、葡聚糖、淀粉、肝素、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素。合成有机聚合物和产生聚合物的单体，包括丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚乙烯化合物、聚烯烃及其取代的衍生物，以及包含多于一个这样的聚合物功能的共聚物及其取代衍生物；以及它们的混合物。
在任何这些体外的方法和组合物中，所述HRS多肽通常共价地结合至生物相容性固体载体，且用于结合蛋白如所述HRS多肽的标准方法为本领域技术人员熟知(参见例如Affinity Chromatography,Principles andMethods(Pharmacla-LKB),Dean,P.G.,et al.,eds.,1985,AffinityChromatography:A practical approach,IRL Press,Oxford,and Scouten,W.H.,1981,Affinity Chromatography,Wiley Intersclence,New York),“Immobilized Affinity Ligand Techniques”,Hermanson et al.,AcademicPress,Inc.,San Diego,1992)。所述生物相容性固体载体可被衍生化(激活)以形成可与所述HRS多肽内的一个或多个化学官能团反应的反应性物质，从而形成化学共价键以将所述HRS多肽连接至生物相容性固体载体。因此，含有羟基、氨基、酰胺、羧基或巯基的物质可使用各种活化性化学物质来激活或衍生化，例如，化学物质如溴化氰、二乙烯基砜、环氧氯丙烷、bisepoxyrane、二溴丙醇、戊二醛、碳化二亚胺、酸酐、酰肼、高碘酸盐、苯醌、三嗪、甲苯磺酸盐、三氟乙烷磺酸酯(tresylate)和/或重氮离子等。
用于任何这些方法和组合物的具体示例性活化的生物相容性固体载体包括例如，CNBr-琼脂糖、纤维素如CNBr-活化的琼脂糖4B(Amersham)或环氧活化的琼脂(Sigma)。可使用生物相容性间隔物(像例如，NHS-活化的琼脂糖4Fast Flow)或没有其的载体(例如，CNBr-活化的琼脂糖4B)，且其可商购获得，并且使这类材料与HRS多肽结合的方法为本领域熟知且可基于生产商的指导通过常规实验进行优化。
用于任何这些体外的方法和组合物的合适的HRS多肽包括表1-9所列举的或从其衍生的，或者SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182的HRS多肽中的任一多肽，其中所述HRS多肽包含被抗-Jo-1抗体识别的至少一个表位。在一些实施方案中，所述HRS多肽选自：全长HRS、HRS(1-506)、HRS(2-506)和HRS(1-60)。
组氨酰-tRNA合成酶-衍生的多肽
本发明的实施方案总体上涉及组氨酰-tRNA合成酶衍生的多肽(HRS多肽)的应用，例如，作为抗炎剂、抗体封闭剂和/或免疫调节剂或替换蛋白。组氨酰tRNA合成酶属于II类tRNA合成酶家族，其具有三个高度保守的序列基序。I类和II类tRNA合成酶被广泛认为负责氨基酸在2步反应中特异性结合其同源tRNA：氨基酸(AA)首先被ATP活化而形成AA-AMP，然后转移到tRNA受体末端。胞浆全长组氨酰-tRNA合成酶通常作为胞浆同源二聚体或选择性剪接的线粒体形态存在。
最近已经确定，真核生物组氨酰-tRNA合成酶的一些生物片段或选择性剪接的亚型(Physiocrine或HRS多肽)，或在某些环境下完整的合成酶，能调节某些细胞信号转导途径或具有抗炎特性。这些活性不同于在蛋白合成中tRNA合成酶的经典作用，其在本文中统称为“非经典活性”。这些Physiocrine可通过选择性剪接或蛋白水解天然产生，且能以细胞自主方式(即在宿主细胞内)或非细胞自主方式(即在宿主细胞外)起作用，以调节各种自我平衡机制。例如，如本发明所提供的，HRS多肽如组氨酰-tRNA合成酶的N-末端片段(例如，HRS(1-48),HRS(1-60))尤其能够通过阻止炎症细胞移动至体内活动性炎症位点而发出抗炎信号。此外，相比全长HRS多肽序列，某些突变或缺失(例如，HRS(1-506))赋予了相比野生型组氨酰-tRNA合成酶增加的活性和/或改善的药物特性、稳定性和/或同质性。某些示例性HRS多肽的序列提供于表D1中。
许多天然存在的组氨酰-tRNA合成酶单核苷酸多态性(SNP)和天然存在的人基因变体已经完成了测序，且本领域已知其为至少部分功能上可互换的。一些这类组氨酰-tRNA合成酶变体(即，代表性组氨酰-tRNA合成酶SNP)如表D2所示。
此外，人基因的同系物和直系同源物存在于其他物种内，其列举于表D3中，因此，在SNP或其他天然存在的同系物中选择天然存在的氨基酸或核苷酸变体以替换表D1、D4-D6或D8中列举的任何人HRS多肽序列，这应该是常规操作。
因此，在本发明的任何方法、诊断组合物、治疗组合物和试剂盒中，术语“HRS多肽”、“HRS蛋白”或“HRS蛋白片段”包括所有天然存在的和合成形式的所述组氨酰-tRNA合成酶，其包含至少一个表位，所述表位与来自针对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体有关的疾病的自身抗体或自身反应性T细胞特异性交叉反应，或具有非经典活性。这类HRS多肽包括全长人蛋白和表D1中列举的全长蛋白衍生的HRS肽，以及天然存在的和其他变体，例如，表D2-D9中公开的或其衍生的那些。在一些实施方案中，术语HRS多肽是指衍生自人组氨酰-tRNA合成酶(表D1中的SEQID NO:1)的长度为约50至约250个氨基酸的多肽序列。
在一些实施方案中，在浓度高达约1x10-7M至5x10-7M或更高浓度的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与野生型组氨酰-tRNA合成酶的结合。因此，在一些实施方案中，如在竞争性ELISA中所测，相比野生型组氨酰-tRNA合成酶(SEQ ID NO:1)，所述HRS多肽具有更低的对疾病相关的自身抗体的亲和力。在一些实施方案中，相比疾病相关的自身抗体对野生型人(SEQ ID NO:1)的亲和力，所述HRS多肽对疾病相关的自身抗体的表观亲和力至少要小约10倍，或至少小约20倍，或至少小约50倍，或至少小约100倍。
修饰的和变体HRS多肽
因此，所有这类组氨酰-tRNA合成酶的同系物、直系同源物和天然存在的或合成的亚型(例如，表D1-D9中列举的或由其衍生的任何蛋白或其对应的核酸)均包括在本发明的任何方法、试剂盒和组合物中。在一些方面，这类HRS多肽保留有至少一个表位，所述表位与来自患有针对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体相关的疾病的对象的自身抗体或自身反应性T细胞特异性交叉反应，和/或具有非经典活性。所述HRS多肽可为其天然形式，即，如同它们在不同物种中天然出现的不同变体，其可看作人组胺酰-tRNA合成酶的功能等同的变体，或者它们可为其功能等同的天然衍生物，其氨基酸序列可以不同，例如，通过截短(例如，从N-或C-末端或两者)或其他的氨基酸缺失、添加、插入、替换或翻译后修饰。天然存在的化学衍生物，包括任何HRS多肽的翻译后修饰和降解产物，也特别地包括在本发明的任何方法和组合物中，包括例如，HRS多肽的焦谷氨酰化、异天冬氨酰化、蛋白水解的、磷酸化、糖基化、氧化、异构化和脱氨基的变体。HRS多肽也可由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸组成，如本文所述。
除了仅由天然存在的氨基酸组成的肽，还提供了模拟肽或肽类似物。肽类似物通常用于制药工业，作为具有与模板肽的那些类似的特性的非肽药物。这些非肽化合物类型被称为“肽模拟物”或“模拟肽”(Luthman,etal.,A Textbook of Drug Design and Development,14:386-406,2nd Ed.,Harwood Academic Publishers(1996)；Joachim Grante,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:1699-1720(1994)；Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15:29(1986)；Veber and Freidinger TINS,p.392(1985)；和Evans,et al.,J.Med.Chem.30:229(1987))。模拟肽是模拟了肽的生物活性但在化学特性上不再是肽的分子。模拟肽化合物为本领域所知，且描述于例如，美国专利第6,245,886号。在某些实施方案中，HRS多肽可部分地或全部由D-氨基酸组成，例如，以提高对体内蛋白降解的抗性(参见例如，Wade et al.,PNASUSA.87:4761-4765,1990；Hayry et al.,FASEB Journal.9:1336-44,1995；Van Regenmortel and Muller,Curr.Opin.Biotechol.9:377-82,1998；Navabet al.,Circulation.105:290-292,2002；Tugyi et al.,PNAS USA.102:412-418,2005；和美国申请第2004/00086988号；关于逆反-D-肽(retro-inverso-D-peptide)，也参见Taylor et al.,Biochemistry.49:3261-72,2010；以及关于能产生具有增加的D-氨基酸的重组蛋白的修饰的细菌核糖体，也参见Dedkova et al.,Biochemistry.45:15541-51,2006)。
合成修饰蛋白或肽的序列且同时保留其有用活性为本领域所知，并且这可使用本领域的标准技术和广泛描述于文献中的技术来实现，例如，核酸的随机或定点诱变、切割和连接，或者通过氨基酸或多肽链的化合合成或修饰。类似地，解决和/或减轻使用HRS多肽或其变体可能产生的免疫原性问题，这也属于本领域技术范围内，例如，通过使用自动化计算机识别程序来鉴别可能的T细胞表位，以及定向演化方法，以确定出更少免疫原性的形式。
如上所述，本发明的实施方案包括组氨酰-tRNA合成酶的所有同系物、直系同源物和天然存在的亚型(例如，表D1-D9中列举的或由其衍生的任何蛋白或其对应的核酸)，以及这些HRS参考多肽的“变体”。所述多肽“变体”是指通过添加、缺失和/或替换至少一个氨基酸残基而不同于参考HRS多肽的多肽，且其通常保留(例如，模拟)或调节(例如，拮抗)参考HRS多肽的一种或多种非经典活性。变体还包括通过添加、缺失和/或替换至少一个氨基酸残基进行修饰而具有提高的稳定性或其他药物特性的多肽。
在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个可能具有保守性或非保守性的替换而不同于参考多肽，如本文所述和本领域所知。在某些实施方案中，所述多肽变体包含保守性替换，就此而言，本领域熟知一些氨基酸可改变为具有广泛类似特性的其他氨基酸而不改变所述多肽的活性特性。
可用于本发明的任何方法和组合物的HRS多肽变体的具体实例，包括全长HRS多肽或其截短的变体或剪接变体(例如，表D1-D9中列举的或由其衍生的任何蛋白)，其i)保留有可检测的非经典活性，和/或保留有与来自患有针对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体相关的疾病的对象的自身抗体或自身反应性T细胞特异性交叉反应的至少一个表位，和ii)具有一个或多个另外的氨基酸插入、替换、缺失和/或截短。在某些实施方案中，多肽变体包含与HRS参考多肽的相应序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更高序列同一性或相似性的氨基酸序列，如本文所述(例如，SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182，或表D1-D9中列举的或由其衍生的任何蛋白)，并基本上保留了参考多肽的非经典活性。还包括通过添加、缺失或替换1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60,70、80、90、100、110、120、130、140、150或更多个氨基酸而不同于参考HRS序列但保留参考HRS多肽的特性的序列。在某些实施方案中，在HRS参考多肽的C-末端和/或N-末端发生氨基酸添加或缺失。在某些实施方案中，所述氨基酸添加包括接近HRS参考多肽的C-末端和/或N-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个野生型残基(即来自相应的全长HRS多肽)。
在一些实施方案中，所述HRS多肽包含全长组氨酰-tRNA合成酶的约50-250个氨基酸的多肽片段，其包含、由或基本上由SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中一个或多个序列表示的HRS多肽序列，或者表D1-D9中列举的或由其衍生的任何蛋白的氨基酸组成。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含、由或基本上由SEQ IDNO:1的残基1-141、1-408、1-113或1-60组成。在一些方面，所述HRS多肽为包含、由或基本上由SEQ ID NO:1的残基1-60+175-509、1-60+211-509或1-60+101-509组成的剪接变体。在具体的方面，所述HRS多肽包含、由或基本上由SEQ ID NO:1的残基1-48或1-506组成。
在某些实施方案中，本发明的HRS多肽包含全长HRS多肽的最小活性片段，其能够调节体内的抗炎活性或具有抗体或自身反应性T细胞抑制活性。在一些方面，这类最小活性片段包含或基本上由WHEP结构域(即，SEQ ID NO:1的约氨基酸1-43)组成。在一些方面，所述最小活性片段包含或基本上由氨基酰化结构域(即，SEQ ID NO:1的约氨基酸54-398)组成。在一些方面，所述最小活性片段包含或基本上由反密码子结合结构域(即，SEQ ID NO:1的约氨基酸406-501)组成。其他示例性活性片段如以下表D4所示。
在某些实施方案中，这类最小活性片段可包含连接最小结构域与异源蛋白或剪接变体的柔性连接子的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或所有29个氨基酸。
不希望受到任一理论的束缚，某些HRS多肽中WHEP结构域的独特方向或构象可有助于提高在这些蛋白中观察到的非经典的和/或抗体抑制活性。
如本文所用，叙述“序列同一性”或例如包含“与…具有50％同一性的序列”，是指基于核苷酸对核苷酸或基于氨基酸对氨基酸在比较窗中，序列的相同程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过下列步骤计算：在比较窗中比较两个最佳对齐的序列，确定两个序列中出现相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数，从而得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗中的总位置数(即窗大小)，并将结果乘以100而得到序列同一性百分数。
用于描述两个或多个多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“实质上的同一性”。“参考序列”为至少12个但经常为15-18个且通常至少25个单体单元(包括核苷酸和氨基酸残基)的长度。因为两个多肽中的每个可包括：(1)两个多肽之间相似的序列(即，仅全部多肽序列的一部分)，和(2)两个多肽之间不同的序列，通常通过在“比较窗”中比较两个多肽的序列来进行两个(或多个)多肽之间的序列比较，以确定和比较具有序列相似性的局部区域。“比较窗”是指至少6个，通常约50至约100个，更通常约100至约150个连续位置的概念性片段，其中在两个序列进行最佳对齐后，将序列与具有相同的连续位置数目的参考序列比较。对于两个序列的最佳对齐，相比参考序列(其不包含添加或缺失)，比较窗可包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。用于比对比较窗的序列最佳对齐可通过算法的计算机实现(Wisconsin Genetics软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过目测来进行，且通过任何所选的不同方法产生最佳比对(即，在比较窗中产生最高百分比的同源性)。也可参见BLAST程序家族，例如，Altschul et al.,1997,Nucl.Acids Res.25:3389所公开的。序列分析的详细讨论可参见Ausubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology,”John Wiley & SonsInc,1994-1998，第15章19.3单元。
序列之间的序列相似性或序列同一性(在本文中该术语可互换使用)的计算可按如下进行。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，可比对序列用于最佳比较目的(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两者中引入空位用于最佳对齐，并可为比较目的忽略掉非同源序列)。在某些实施方案中，为比较目的，比对的参考序列长度为至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、60％，且甚至更优选至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这两个分子在该位置处为相同的。
两个序列之间的同一性百分比与两个序列共有的相同位置的数目呈函数关系，考虑了用于两个序列的最佳对齐而必需引入的空位数和每个空位的长度。
可使用数学算法来实现两个序列之间的序列比较和同一性百分比确定。在一些实施方案中，使用Needleman和Wunsch,(1970,J.Mol.Biol.48:444-453)算法来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法被整合至GCG软件包的GAP程序中，其采用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，且长度权重为1、2、3、4、5或6。在又一个优选实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，其采用NWSgapdna.CMP矩阵，且空位权重为40、50、60、70或80，且长度权重为1、2、3、4、5或6。另一个示例性参数组包括Blossum62打分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，且移码的空位罚分为5。也可采用E.Meyers和W.Miller(1989,Cabios,4:11-17)的算法来确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比，其已经整合至ALIGN程序(2.0版)，其采用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，且空位罚分为4。
本文描述的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”来对公共数据库进行查询，例如，用于确定其他家族成员或相关序列。可采用Altschul,et al.,(1990,J.Mol.Biol,215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行该查找。可采用NBLAST程序来进行BLAST核苷酸查找，分数＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可采用XBLAST程序来进行BLAST蛋白查找，分数＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的有空位对齐，可使用Gapped BLAST，如Altschul et al.(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中所描述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在某些实施方案中，多肽变体与相应的HRS参考序列的差异为至少1％，但小于20％、15％、10％或5％的残基。如果该比较需要比对，则应该针对最大相似性来比对所述序列。源于缺失或插入或错配的“环出(Looped out)”序列被认为是不同的。该不同合适地为在非必需的残基或保守性替换处的差异或改变。在某些实施方案中，HRS多肽变体的分子量与HRS参考多肽的差异为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更高。
还包括HRS参考多肽的生物活性“片段”，即HRS蛋白片段的生物活性片段。代表性的生物活性片段通常参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可为特异性结合相互作用或酶促相互作用。分子间相互作用可为，HRS多肽和细胞结合伴侣如细胞受体或参与所述HRS多肽的非经典活性的其他宿主分子之间的相互作用。
HRS参考多肽的生物活性片段可为这样的多肽片段，其为本文描述的HRS参考多肽中任一个所示的氨基酸序列的例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、38、359、360、361、362、363、364、365、380、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508个或更多个连续的或非连续的氨基酸，包括其间的所有整数(例如，101、102、103)和范围(例如，50-100、50-150、50-200)。在某些实施方案中，生物活性片段包含非经典活性相关的序列、结构域或基序。在某些实施方案中，任何HRS参考多肽的C-末端或N-末端区可被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500个或更多个氨基酸，或者被截短约10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500个或更多个氨基酸，包括其间的所有整数和范围(例如，101、102、103、104、105)，只要该截短的HRS多肽保留了参考多肽的非经典活性。某些示例性截短的HRS多肽如以下表D5所示。
通常，生物活性片段具有不小于约1％、10％、25％或50％的其所源自的生物活性(即，非经典活性)HRS参考多肽的活性。用于测量这类非经典活性的示例性方法描述于实施例中。
在一些实施方案中，HRS蛋白、其变体和生物活性片段以如下的亲和力结合一个或多个细胞结合伴侣：至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、100或150nM。在一些实施方案中，HRS蛋白片段对选定的细胞结合伴侣，尤其是参与非经典活性的结合伴侣的结合亲和力可为相应的全长HRS多肽或特定的选择性剪接的HRS多肽变体的至少约1.5x、2x、2.5x、3x、3.5x、4x、4.5x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、200x、300x、400x、500x、600x、700x、800x、900x、1000x或更多倍(包括其间的所有整数)大。
如上所述，HRS多肽可用各种方式进行改变，包括氨基酸替换、缺失、截短和插入。这类操作的方法通常为本领域所知。例如，HRS参考多肽的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变来制备。诱变和核苷酸序列改变的方法为本领域熟知。参见例如，Kunkel(1985,PNAS USA.82:488-492),Kunkel et al.,(1987,Methods in Enzymol,154:367-382),美国专利第4,873,192号,Watson,J.D.et al.,(“Molecular Biology of the Gene”,第4版,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)以及其中所引用的文献。关于不影响目标蛋白的生物活性的合适氨基酸替换的指导可参见Dayhoff et al.,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模式。
相比参考HRS氨基酸残基，具有生物活性的截短的和/或HRS多肽变体可在沿其序列的各种位置含有保守氨基酸替换，且这类额外的替换可进一步提高具有改变的半胱氨酸含量的HRS多肽的活性或稳定性。“保守氨基酸替换”即其中的氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义，其通常可分为以下亚类：
酸性的：该残基由于在生理pH下失去H离子而带负电荷，且该残基被水溶液吸引，从而当肽在生理pH于水介质中时，寻找包含该残基的肽的构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性的：该残基由于在生理pH下或其1或2个pH单位内(例如，组氨酸)结合H离子而带正电荷，且该残基被水溶液吸引，从而当肽在生理pH于水介质中时，寻找包含该残基的肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
带电荷的：该残基在生理pH下带电荷，因此，包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
疏水的：该残基在生理pH下不带电荷，且该残基被水溶液排斥，从而当肽在水介质中时，寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性/极性的：该残基在生理pH下不带电荷，但该残基不被水溶液排斥充分，从而当肽在水介质中时，其寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
本说明书还将某些氨基酸表征为“小”氨基酸，因为它们的侧链不够大，甚至缺少极性基团来赋予疏水性。除了脯氨酸以外，“小”氨基酸为当侧链上具有至少一个极性基团时具有4个或更少碳原子，而没有极性基团时具有3个或更少碳原子的氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。由于其已知的对肽链二级结构的效应，基因编码的二级氨基酸脯氨酸为特殊情况。脯氨酸的结构与所有其他天然存在的氨基酸的不同在于，其侧链结合至α-氨基的氮以及α-碳上。一些氨基酸相似性矩阵为本领域所知(参见例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵，其公开于例如Dayhoff et al.,1978,A model of evolutionary change inproteins)。然而，M.O.Dayhoff,(ed.),Atlas of protein sequence and structure,Vol.5,pp.345-358,National Biomedical Research Foundation,WashingtonDC；和Gonnet et al.,(Science,256:14430-1445,1992)中的用于确定距离关系的矩阵，在与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸相同的基团中包含有脯氨酸。因此，为本发明的目的，脯氨酸被归类为“小”氨基酸。
用于分类为极性或非极性所需的吸引或排斥程度为任意的，因此，本发明具体包括的氨基酸已被归类为一类或另一类。大多数没有特别命名的氨基酸可基于已知的行为来分类。
氨基酸残基可进一步细分为环状的或非环状的，以及芳香族的或非芳香族的、针对残基侧链取代基的不言自明的分类，以及小或大的氨基酸。如果其总共含有4个碳原子或更少(包括羧基碳，前提是存在另一个极性取代基)，则该残基被认为是小的残基；如果不存在则为3个或更少的碳原子。当然，小残基总是非芳香族的。根据其结构特性，氨基酸残基可分为两类或更多类。对于天然存在的蛋白氨基酸，根据该方案的亚类如表A所示。
表A:氨基酸亚类
保守氨基酸替换还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸和蛋氨酸。例如，以下预期是合理的：用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸，或者用结构相关的氨基酸进行类似的氨基酸替换，不会对所得的多肽变体的特性产生重要影响。是否氨基酸改变产生了功能性的截短的和/或HRS多肽变体可通过分析其非经典活性容易地确定，如本文所述。保守性替换如表B的示例性替换标题下所示。本发明保护范围内的氨基酸替换通常通过选择其对维持以下特性没有明显不同的替换来实施：(a)在替换区域的肽骨架的结构，(b)分子的靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链体积，或(d)生物功能。引入替换后，针对生物活性筛选变体。
表B:示例性氨基酸替换
可选择地，可基于侧链的一致性将进行保守性替换的类似氨基酸分为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，其均具有带电荷的侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；且第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸，如Zubay,G.,Biochemistry,第3版,Wm.C.Brown Publishers(1993)所描述。
人HRS WHEP结构域的NMR结构已经被确定(参见Nameki et al.,Accession1X59_A)。而且，全长人HRS的晶体结构和HRS的内部催化性结构域缺失突变体(HRSΔCD)也已确定(参见Xu et al.,Structure.20:1470-7,2012；和美国申请第61/674,639号)。结合HRS的一级氨基酸序列，这些蛋白的详细物理描述提供了对该蛋白中特定氨基酸所起作用的精确了解。因而本领域技术人员可利用这些信息来确定结构上保守的结构域、连接区、二级结构如α-螺旋、表面或溶剂暴露的氨基酸、未暴露的或内部区域、催化位点和配体相互作用表面，以及其他结构特征。接着这些人可利用这些和其他信息来容易地改造保留或提高了目标非经典活性的HRS变体，例如，通过保留或改变这些和其他结构特征内部或附近的氨基酸残基的特征，如相比野生型残基，通过保留或改变所选择的氨基酸侧链的极性、亲水指数、电荷、大小和/或定位(即向内、向外)(参见例如，Zaiwara et al.,Mol Biotechnol.51:67-102,2012；Perona和Hadd,Biochemistry.51:8705-29,2012；Morin et al.,Trends Biotechol.29:159-66,2011；Collins et al.,Annu.Rev.Biophys.40:81-98,2011；和美国申请第61/674,639号)。
因此，在截短的和/或HRS多肽变体中的预测的非必需氨基酸残基，通常被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换。可选择地，例如可通过饱和诱变沿着HRS编码序列全部或部分随机引入突变，并可针对亲本多肽的活性来筛选所得的突变体，以确定保留该活性的突变体。对编码序列进行诱变后，可将编码的肽进行重组表达并可确定该肽的活性。“非必需的”氨基酸残基是可从实施方案多肽的参考序列改变而来且没有消除或实质上改变一种或多种其非经典活性的残基。合适地，该改变没有实质上消除这些活性中的一种，例如，所述活性为参考HRS序列的至少20％、40％、60％、70％或80％、100％、500％或1000％或更高。“必需”氨基酸残基是当HRS多肽的参考序列改变时，导致消除的亲本分子的活性使得存在小于20％的参考活性的残基，例如，这类必需氨基酸残基包括那些在不同物种的HRS多肽中保守的残基，包括那些在来自各种来源的HRS多肽的活性结合位点或基序中保守的序列。
确定抗炎活性的检测，包括体外基于细胞释放的细胞因子的常规测量，且本领域中已很好地建立了动物研究(参见例如，Wittmann et al.,J VisExp.(65):e4203.doi:10.3791/4203,2012；Feldman et al.,Mol Cell.47:585-95,2012；Clutterbuck et al.,J Proteomics.74:704-15,2011,Giddingsand Maitra,J Biomol Screen.15:1204-10,2010；Wijnhoven et al.,GlycoconjJ.25:177-85,2008；和Frow et al.,Med Res Rev.24:276-98,2004)，且可容易地用于描述和优化抗炎活性。至少一个示例性体内实验系统描述于随后的实施例中。
某些HRS多肽可具有一个或多个半胱氨酸替换，其中一个或多个天然存在的(非-半胱氨酸)残基被半胱氨酸替换，例如，以改变稳定性或pK特性、促进PEG分子的基于硫醇的结合等。在一些实施方案中，半胱氨酸替换靠近所述HRS多肽的N-末端和/或C-末端(例如，SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182)或HRS多肽的其他表面暴露区。具体实施方案包括其中相对于SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列的N-末端和/或C-末端，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸残基中的一个或多个残基被半胱氨酸残基替换。在一些实施方案中，可通过产生N或C-末端融合蛋白来将半胱氨酸残基添加至所述HRS多肽。这类融合蛋白可为任何长度，但通常长度为约1-5或约5-10、约10-20或约20-30个氨基酸。在一些实施方案中，优选融合至C-末端。
基于所述HRS多肽HRS(1-60)，这类半胱氨酸修饰的蛋白的具体示例性实施方案如表D6中所示。该方法可直接适用于表D5的HRS多肽和其他本文描述的HRS多肽。
在一些实施方案中，所述HRS多肽中半胱氨酸残基的插入或替换，可结合消除其他表面暴露的半胱氨酸残基。因此，在一些实施方案中，所述HRS多肽可包含在Cys83、Cys174、Cys191、Cys196、Cys224、Cys235、Cys379、Cys455、Cys507和/或Cys509(如SEQ ID NO:1所定义)处的一个或多个替换和/或缺失，例如，以消除天然存在的半胱氨酸残基。
具体实施方案包括SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一个或其变体，其具有Cys83、Cys174、Cys191、Cys196、Cys224、Cys235、Cys379、Cys455中任何一个或多个的突变或缺失，或缺失Cys507和Cys509，例如，通过缺失C-末端的3个氨基酸(Δ507-509)。在这些位置的示例性突变包括，例如，半胱氨酸突变为丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甘氨酸。在某些实施方案中，针对特定半胱氨酸替换的氨基酸残基可选自来自其他物种和生物体的HRS直系同源物中发现的天然存在的替换。这类的示例性替换如表D7所示。
在一些实施方案中，基于其表面暴露确定或选择了经挑选用于诱变的天然存在的半胱氨酸残基。因此，在某些方面，选择用于替换的半胱氨酸残基选自Cys224、Cys235、Cys507和Cys509。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的最后3个(C-末端)残基被缺失以便缺失残基507-509。在一些实施方案中，所述半胱氨酸被选择用于突变或删除，以便消除分子内半胱氨酸对，例如，Cys174和Cys191。
用于降低表面暴露的半胱氨酸残基的所需半胱氨酸突变/替换(以黑体下划线显示)的其他具体实例包括以下表D8中所列举的那些。
在一些实施方案中，这类半胱氨酸替换的突变体被修饰以在确定的表面暴露位置改造入、插入或以其他方式引入新的表面暴露的半胱氨酸残基，其中所述引入的残基没有大幅干扰所述HRS多肽的非经典活性。具体实例包括例如，在任何上述的减少了半胱氨酸的HRS多肽的N-或C-末端插入(或重新插回)另外的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，插入这类N-或C-末端表面暴露的半胱氨酸，涉及重新插入全长人HRS的最后1个、最后2个或最后3个天然存在的C-末端氨基酸至HRS多肽的减少了半胱氨酸的变体，例如，重新插入所有或部分的序列CIC(Cys IleCys)。示例性减少了半胱氨酸的突变体包括，例如，SEQ ID NO:1-106、131-133、137-143、178、180、182、184或186-195的HRS多肽的任一多肽，或者表D1-D9中所列举的或由其衍生的任何HRS多肽中的残基Cys174、Cys191、Cys224和Cys235处的突变(或缺失)的任何组合，和/或Cys507和Cys509(基于全长人HRS(SEQ ID NO:1)的编号)的缺失或替换。
在各种实施方案中，本发明包括，HRS多肽借助替换任选地包含功能基团的非天然存在的氨基酸的在任何氨基酸位置进行的修饰。非天然氨基酸可在以下位置处插入或替换：例如相对于SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列(或表D1-D9中列举的或由其衍生的任何HRS多肽)的N-末端和/或C-末端的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸内的一个或多个残基；SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列(或表D1-D9中列举的或由其衍生的任何HRS多肽)的N-末端和/或C-末端；或者如本文所述的溶剂可接近的表面氨基酸残基。
在具体的实施方案中，非天然存在的氨基酸，包括但不限于，除了硒代半胱氨酸和以下20种基因编码的α-氨基酸以外的任何氨基酸、修饰的氨基酸或氨基酸类似物：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。α-氨基酸的通用结构以如下通式表示：
非天然氨基酸通常为具有以上通式的任何结构，其中R基为除了在20种天然氨基酸中使用的基团以外的任何取代基。关于20个天然氨基酸的结构，参见例如，生物化学教材如的Biochemistry，L.Stryer，第3版，1988,Freeman and Company,New York。应注意，本文公开的非天然氨基酸可为除了以上20种α-氨基酸以外的天然存在的化合物。由于本文公开的非天然氨基酸通常仅在侧链上不同于天然氨基酸，非天然氨基酸与其他氨基酸如天然或非天然的氨基酸，以在天然存在的蛋白中形成酰胺键的相同方式形成酰胺键。然而，所述非天然氨基酸具有不同于天然氨基酸的侧链基团。例如，上述通式中的R任选地包含烷基-、芳基-、芳基卤、乙烯基卤、烷基卤、乙酰基、酮、氮丙啶、腈、硝基、卤化物、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醚、环氧化物、砜、硼酸、硼酸酯、硼烷、苯硼酸、硫醇、硒基-、磺酰基、硼砂(borate)、硼酸盐(boronate)、磷、膦酰基、磷化氢、杂环的、吡啶基、萘基、二苯甲酮、约束环如环辛炔、硫代酯、烯酮(enone)、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基、羧酸、α-酮羧酸、α或β不饱和酸和酰胺、乙醛酰酰胺或有机硅烷等，或它们的任何组合。
非天然氨基酸的具体实例，包括但不限于，对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、β-O-GlcNAc-L-丝氨酸、三-O-乙酰基-GalNAc-α-苏氨酸、α-GalNAc-L-苏氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酸丝氨酸、膦酸酪氨酸、对碘代-苯丙氨酸、对溴代苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、以下或本文其他地方列举的那些等。
因此，可选择非天然存在的氨基酸，其含有与异源部分例如PEG部分的任何优选官能团形成共价键的官能团。一旦选择非天然氨基酸后，即可从供应商购买或进行化学合成。可将任何数目的非天然氨基酸整合至靶分子中，且可根据要连接的水溶性聚合物例如PEG部分的数目来改变。所述部分可连接至所有或仅一些非天然氨基酸上。而且，可根据所需的结果，将相同或不同的非天然氨基酸整合至HRS多肽。在某些实施方案中，将约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个非天然氨基酸整合至HRS多肽，其中任何氨基酸或所有氨基酸均可连接至含有所需官能团的异源部分。
本发明的某些实施方案也包括修饰的HRS多肽的应用，包括提高HRS多肽期望的特性的修饰，如本文所述。本发明的HRS多肽的修饰包括在一个或多个组成型氨基酸的化学和/或酶促衍生，包括侧链修饰、骨架修饰及N-和C-末端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和结合融合蛋白、碳水化合物或脂质部分、辅因子、D-氨基酸的替换等。示例性修饰还包括HRS多肽的PEG化(参见例如，Veronese and Harris,Advanced Drug Delivery Reviews54:453-456,2002；和Pasut et al.,ExpertOpinion.Ther.Patents14(6)859-894 2004,二者均通过引用并入本文)。在一些实施方案中，这类PEG化的HRS多肽包含增加或消除内源半胱氨酸的突变，从而能够通过外源或内源半胱氨酸或者其他残基进行选择性连接。
PEG是在水和许多有机溶剂中具有溶解性、缺少毒性且缺少免疫原性的熟知聚合物。同样清楚的是，其无色、无味和化学稳定。由于这些和其它原因，PEG被选为用于连接的优选聚合物，但其选用仅是为了说明的目的而非限制。类似的产品可用其他水溶性聚合物获得，包括但不限于：聚乙烯醇、其他聚(烯化氧)如聚(丙二醇)等、聚(氧乙基化多元醇)如聚(氧乙基化甘油)等、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-l,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐和聚氨基酸。本领域技术人员能够基于期望的剂量、循环时间、蛋白水解抗性和其他考虑选择所需的聚合物。
尤其是，众多PEG衍生物均可获得并适合用于制备PEG-缀合物。例如，以商标系列出售的NOF集团公司的PEG试剂提供了许多PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇和活性PEG衍生物如甲氧基-PEG胺、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯和羧酸，用于通过各种方法连接至AARS多肽的N-末端、C末端或任何内部氨基酸。Nektar Therapeutics公司的先进PEG化技术也提供了不同的PEG-偶联技术，从而可能提高基于HRS多肽的治疗剂的安全性和效力。
专利、公开的专利申请和相关出版物也将为阅读本公开的本领域技术人员提供大量可能的PEG-偶联技术和PEG衍生物。参见例如，美国专利第6,436,386、5,932,462、5,900,461、5,824,784和4,904,584号；其内容通过引用整体并入本文，描述这类技术和衍生物及其制备方法。
在某些方面，也可利用化学选择连接技术来修饰本发明的HRS多肽，如通过以点特异性和受控的方式来连接聚合物。这种技术通常依赖于通过化学或重组方法以及随后的用携带互补连接子的聚合物进行修饰将化学选择性的锚定物掺入蛋白骨架中。结果，装配过程和产生的蛋白-聚合物缀合物的共价结构可以被控制，使得能够合理优化药物性质，如效力和药代动力学特性(参见例如，Kochendoerfer,Current Opinion in ChemicalBiology9:555-560,2005)。
在其他实施方案中，还包括HRS多肽与其他蛋白的融合蛋白，且这些融合蛋白可调节所述HRS多肽的生物活性、分泌、抗原性、靶向、生物学寿命、透过细胞膜的能力，或血脑屏障，或药代动力学特性。提高药代动力学特性的融合蛋白(“PK调节物”)的实例包括但不限于，与人白蛋白(Osborn et al.:Eur.J.Pharmacol.456(1-3):149-158,(2002))、抗体Fc结构域、聚Glu或聚Asp序列和转铁蛋白的融合物。另外，与由氨基酸Pro、Ala和Ser(‘PAS化’)组成的构象混乱多肽序列或羟乙基淀粉(以商标出售)的融合提供了增加所述HRS多肽的水动力学体积的简单方法。这种额外延伸采用体积大的随机结构，其明显增加了所得融合蛋白的大小。通过这种方式，通常经由肾脏过滤的小HRS多肽的快速清除被减缓了几个数量级。此外，已经表明，使用Ig G融合蛋白能够使一些融合蛋白透过血脑屏障(Fu et al.,(2010)Brain Res.1352:208-13)。
调节所述HRS多肽的抗原性或免疫调节特性的融合蛋白的实例，包括与T细胞结合配体包括例如，MHC的I型和II型蛋白、b-2微球蛋白、LFA-3部分、重链Fc区部分及其缀合物和衍生物的融合物；这类融合蛋白的实例描述于例如，EP1 964 854、美国专利第5,468,481、5,130,297、5,635,363、6,451,314号和US2009/0280135。
此外，在一些实施方案中，所述HRS多肽可包括源自其他充分表征的分泌蛋白的合成的或天然存在的分泌信号序列。在一些实施方案中，这类蛋白可通过蛋白水解切割来处理以在原位形成所述HRS多肽。在一些实施方案中，所述HRS多肽可包含异源的蛋白水解切割位点，以便能够在细胞内或细胞间的位置处原位表达和产生所述HRS多肽。其他融合蛋白还可包括例如，HRS多肽与泛素蛋白的融合物，以提供新的N-末端氨基酸，或使用分泌信号介导所述HRS多肽高水平分泌至胞外介质中，或使用N或C-末端表位标签以改善纯化或检测。
在某些方面，可利用非天然氨基酸修饰(例如，增加)HRS多肽的选定的非经典活性，或改变该蛋白在体内或体外的半衰期。非天然氨基酸也可用于促进(选择性)HRS蛋白的化学修饰(例如，PEG化)，如本文其他地方所述。例如，一些非天然氨基酸允许聚合物如PEG选择性结合给定的蛋白，从而改善其药代动力学特性。
氨基酸类似物和模拟物的具体实例可参见，例如，Roberts andVellaccio,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Eds.Gross andMeinhofer,Vol.5,p.341,Academic Press,Inc.,New York,N.Y.(1983)，其整卷通过引用并入本文。其他实例包括全烷基化氨基酸，尤其是全甲基化氨基酸。参见例如，Combinatorial Chemistry,Eds.Wilson and Czarnik,Ch.11,p.235,John Wiley & Sons Inc.,New York,N.Y.(1997)，其整本书的内容通过引用并入本文。其他实例包括酰胺部分(且因此，所得肽的酰胺骨架)被例如糖环、类固醇、苯二氮卓或碳环取代的氨基酸。参见例如，Burger’sMedicinal Chemistry and Drug Discovery,Ed.Manfred E.Wolff,Ch.15,pp.619-620,John Wiley & Sons Inc.,New York,N.Y.(1995)，其整本书的内容通过引用并入本文。合成肽、多肽、模拟肽和蛋白的方法为本领域熟知(参见例如，美国专利第5,420,109号；M.Bodanzsky,Principles of PeptideSynthesis(第1版和第2版.),Springer-Verlag,New York,N.Y.(1984&1993),参见第7章；Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis,(第2版),Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.(1984)，其各自通过引用并入本文)。因此，本发明的HRS多肽可由天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物组成。
在某些实施方案中，本文描述的修饰的或HRS多肽变体例如，具有减少的半胱氨酸含量的HRS多肽，相比未修饰的或非HRS多肽变体(例如，野生型全长人HRS(SEQ ID NO:1)、具有野生型半胱氨酸残基的相应的HRS片段或序列)，在相同或在其他情况下可比较的条件下具有改变的(例如，提高的、增加的、降低的、减少的)生物化学、物理和/或药代动力学特性。在一些实施方案中，具有改变的生物化学、物理和/或药代动力学特性的所述修饰的或HRS多肽变体具有Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、Cys455、Cys507和Cys509中任何一个或多个的突变(例如，缺失、替换)，如本文所述。在具体的实施方案中，所述修饰的或HRS多肽变体具有Cys507和Cys509的突变，例如，残基507-509的缺失(Δ507-509)。一些修饰的或HRS多肽变体包含SEQ ID NO:1(或其变体)的残基1-506或2-506，但缺少SEQ ID NO:1的残基507-509(也称为HRS(1-506)、HRS(2-506))，且任选地相对于全长人HRS(SEQ ID NO:1)，具有提高的生物化学、物理和/或药代动力学特性。
生物化学、物理和药代动力学特性的实例，包括但不限于，绝对生物活性(例如，非经典活性)、稳定性(例如，半衰期、动力学和热稳定性、功能稳定性、氧化敏感性)、在溶液中的澄清度(例如，浑浊度、乳白光)、在溶液中的聚集体形成、在溶液中的同质性或单分散性(例如，单体/二聚体或单体/低聚物形式的改变的比例，链间二硫键形成的水平改变)、免疫原性、交叉反应性、非特异性结合、在细菌如大肠杆菌中改善的表达(例如减少的内毒素污染、改善的同质性、改善的电荷同质性)、可溶性蛋白提高的产量、减少的内毒素结合、在溶液中的降解程度、生物利用度(吸收的药物的分数)、组织分布、分布容积(被静脉注射并在血浆和周围组织之间达到平衡后，药物立即在其中分布的表观体积)、浓度(药物在血浆中的初始和稳态浓度)、消除速率常数(药物从体内清除的速率)、消除速率(平衡消除需要的输注速率)、曲线下面积(AUC；单次剂量或处于稳定状态后浓度-时间曲线的积分)、清除率(每单位时间被清除了药物的血浆体积)、Cmax(口服给药后药物的血浆峰值浓度)、tmax(到达Cmax的时间)、Cmin(下一个剂量给药前，药物到达的最低浓度)和波动(稳定状态的给药间隔之内的峰谷波动)。
在一些实施方案中，相比相应未修饰的或非HRS多肽变体，所述修饰的或HRS多肽变体在给予至哺乳动物后具有的血浆或血清药代动力学AUC特性为至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍大，或者大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些方面，获得了这些改善的特性而没有明显改变所述变体或修饰的HRS多肽的二级结构和/或降低其非经典生物活性。的确，一些变体或修饰的HRS多肽具有提高的非经典生物活性。例如，在一些实施方案中，相对于未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在可比较的条件下具有提高的(例如，绝对的)生物活性。示例性活性包括本文描述的任何非经典活性，如抗炎活性和结合抗-Jo-1抗体或其他细胞结合剂的能力。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下所述修饰的或HRS多肽变体具有的生物活性为至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍大，或者大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，相比全长未修饰蛋白(SEQ ID NO:1)，所述修饰的或HRS多肽变体在ELISA分析中针对结合Jo-1抗体具有更低的IC50(即，更高的结合亲和力)。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下所述修饰的或HRS多肽变体在Jo-1竞争性ELISA中具有的IC50要低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实施方案中，所述修饰的或HRS多肽变体在Jo-1竞争性ELISA中具有的IC50为小于约0.2nM、小于约0.18nM、小于约0.16nM或者小于或等于约0.15nM。
在某些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，所述修饰的或HRS多肽变体具有增加的“稳定性”(例如，通过半衰期、蛋白降解速率的测量)，其为至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍大，或者大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在具体的实施方案中，在给定的条件组(例如，温度、pH)下，修饰的或HRS多肽变体具有的半衰期为至少约30min、约1h、约2h、约3h、约4h、约5h、约6h、约12h、约18h、约24h、约36h、约48h、约60h、约72h、约84h、约96h、约120h、约144h、约168h、约192h、约216h或更长、约240h或更长，或者其间的任何介于中间的半衰期或范围。
在一些实施方案中，HRS多肽的“稳定性”包括其“功能稳定性”，或者在给定条件组下至少一种生物活性随时间降低的速率。示例性生物活性包括任何一种或多种本文描述的非经典活性，且保留了与来自针对人HRS的自身抗体相关的疾病的自身抗体或自身反应性T细胞特异性交叉反应的至少一个表位。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，修饰的或HRS多肽变体的生物活性降低的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，HRS多肽的“稳定性”包括其“动力学稳定性”或“热稳定性”，包括在给定的条件组下其随时间展开的速率。动力学稳定的蛋白比动力学不稳定的蛋白展开得更慢。在动力学稳定的蛋白中，展开需要大的自由能障碍，且影响稳定性的因素为对于展开途径第一关键步骤的折叠(Gf)和过渡态(Gts)的相对自由能。如果展开的蛋白快速经历一些永久改变如聚集或蛋白水解降解，则所述蛋白会不可逆变性。在具体的实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，修饰的或HRS多肽变体展开的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体的解链温度，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，所述修饰的或HRS多肽变体具有的解链温度(Tm)要高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，所述修饰的或HRS多肽变体具有的解链温度(Tm)要高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。解链温度例如，可通过差示扫描荧光分析(DSF)来测量。
在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在溶液中具有改善的或提高的同质性或单分散性(例如，单体/寡聚体的比率、二聚体/寡聚体的比率、单体/二聚体的比率、二聚体/单体的比率、在还原条件下链间二硫键形成的比率、表观分子量的分布，包括通过SDS-PAGE或HPLC分析检测的降低的高分子量或低分子量峰)。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，修饰的或HRS多肽变体的同质性或单分散性增加为约至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者增加了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在具体的实施方案中，相比具有Cys507/Cys509中一个或两个的相应HRS多肽(例如，SEQ ID NO:1)，具有C-末端半胱氨酸残基Cys507和Cys509的缺失(Δ507-509)或替换的HRS多肽在溶液中具有增加的同质性(例如，单体/寡聚体的比率)。不希望被任何理论束缚，全长人HRS通过C-末端半胱氨酸残基Cys507/Cys509寡聚化，且这些半胱氨酸残基中一个或两个的替换或缺失能够增加所述HRS多肽在溶液(例如，生理缓冲液、药物/治疗组合物、生物流体如血液或血浆)中的同质性。在具体的实施方案中，所述HRS多肽变体为HRS(1-506)(SEQ ID NO:70)或HRS(2-506)。单体在溶液中增加的同质性也可导致例如，增加的生物活性、稳定性和其他本文描述的特性。
在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在溶液中具有降低的浑浊度(例如，形成颗粒或纤维的程度)。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，修饰的或HRS多肽变体的浑浊度降低约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者降低约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。浑浊度例如，可通过A340处的吸光度来测量。
在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在溶液中具有降低的乳白光。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，修饰的或HRS多肽变体的乳白光降低至少约至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。乳白光例如，可通过A580处的吸光度测量。
在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在溶液中具有降低的聚集体(例如，高分子量聚集体、低分子量聚集体)。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的在其他情况下或可比较的条件下，修饰的或HRS多肽变体的聚集体形成降低了约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者降低了约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。聚集例如，可通过尺寸排阻HPLC或SDS-PAGE分析来测量。较高水平的聚集也可通过浑浊度测量来监测，如本文所述。
在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在大肠杆菌中具有提高的产率。在一些实施方案中，相比在相同的或在其他情况下可比较的条件下产生的未修饰的或非HRS多肽变体，产率提高为至少约1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者提高了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在从大肠杆菌表达和纯化后具有增加的纯度和/或降低的内毒素含量。在一些实施方案中，相比在相同的或在其他情况下可比较的条件下产生的未修饰的或非HRS多肽变体，所述内毒素水平降低至少约1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者降低了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，修饰的或HRS多肽变体在溶液中具有降低的片段化。在一些实施方案中，相比未修饰的或非HRS多肽变体，在相同的或在其他情况下可比较的条件下，修饰的或HRS多肽变体的片段化程度降低约至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者降低了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。片段化例如，可通过SDS-PAGE分析和尺寸排阻HPLC来测量。
用于测量本文描述的任何生物化学、物理和/或药代动力学特性的示例性条件包括，“生理条件”如～20-40℃的温度范围、～1的大气压和pH～6-8。条件的一般性实例包括但不限于，给予至哺乳动物后的体内条件、生物流体(例如，血液、血清、组织培养液)中的体外或溶液条件，以及生理缓冲液或药物/治疗组合物中的体外或溶液条件。示例性药物/治疗组合物描述于本文其他地方。在一些实施方案中，所述条件包括温度约-80、-60、-40、-20、-10、-5、-4、-3、-20、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100℃，包括其间的所有整数和范围。在一些实施方案中，所述条件包括pH为约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，包括其间的所有整数和范围。
本文描述的药代动力学、生物化学、和/或物理特性可在任何给定条件或改变的条件(例如，增加的温度)下测量约0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24h，或者约0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或24周，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月左右。在一些实施方案中，在冻融组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次以后，测量药代动力学、生物化学和/或物理特性。
HRS多核苷酸
某些实施方案涉及编码HRS多肽(包括其截短形式和/或变体)的多核苷酸以及包含该多核苷酸的组合物。在这些应用中，这些实施方案可用于重组产生所需的HRS多肽或其变体，或者在选定的细胞或对象中表达所述HRS多肽。代表性编码天然HRS多肽的天然存在的核苷酸序列包括例如，基因库登录号AK000498.1和U18937.1。
如本文所用，术语“DNA”和“多核苷酸”和“核酸”是指已经自特定物种的总基因组DNA分离出来的DNA分子。因此，编码多肽的DNA片段是指这样的DNA片段，其含有一个或多个已经基本上自获取该DNA片段的物种的总基因组DNA分离出来或纯化出来的编码序列。术语“DNA片段”和“多核苷酸”包括DNA片段和该片段的更小片段以及重组载体，包括例如，质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。
本领域技术人员应理解，本发明的多核苷酸序列可包括基因组序列、基因组外的和质粒编码的序列以及更小的改造的基因片段，其表达或可能适于表达蛋白、多肽、肽等。这类片段可为天然分离的或通过人工合成修饰的。
多核苷酸可为单链的(编码的或反义的)或双链的，且可为DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。其他编码的或非编码序列可以，但不必需存在于本发明的多核苷酸中，且多核苷酸可以，但不必需连接至其他分子和/或载体材料。
多核苷酸可包含天然序列(即，编码HRS多肽或其部分的内源序列)，或者可包含该序列的变体或生物功能等效物。多核苷酸变体可包含一个或多个替换、添加、缺失和/或插入，如下文进一步描述的，优选地使得相比未修饰的多肽，编码的多肽的炎症反应调节活性没有大幅降低。对编码的多肽的炎症反应调节活性的影响通常可按本文所述进行评估。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含各种长度的与HRS多肽相同或互补的序列连续节段(stretch)，其中所述分离的多核苷酸编码如本文所述的截短的HRS多肽。
本领域技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的HRS多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些可能与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，由于密码子使用不同而不同的多核苷酸特别地包括在本发明中，例如，针对人、酵母或细菌密码子选择而优化的多核苷酸。
因此，多个多核苷酸可编码本发明的HRS多肽。而且，可为多种原因而操作所述多核苷酸序列。实例包括但不限于，掺入优选的密码子以提高所述多核苷酸在各种生物体中的表达(通常参见，Nakamura et al.,Nuc.Acid.Res.28(1):292,2000)。此外，可掺入沉默突变以便引入或消除限制位点、降低CpG二核苷酸基序的密度(参见例如，Kameda et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.349(4):1269-1277,2006)，或者降低单链序列形成茎环结构的能力(参见例如，Zuker M.,Nucl.Acid Res.31(13):3406-3415,2003)。此外，可通过在起始密码子处包含Kozak共有序列[即，(a/g)cc(a/g)ccATGg；SEQ ID NO:130]来进一步优化哺乳动物的表达。可用于该目的的Kozak共有序列为本领域所知(Mantyh et al.PNAS.92:2662-2666,1995；Mantyh et al.,Prot.Exp.& Purif.6,124,1995)。示例性密码子优化的多核苷酸序列提供于以下的表D9中。
其他编码或非编码序列可以，但不必需，存在于本发明的多核苷酸中，且多核苷酸可以，但不必需，连接至其他分子和/或载体材料。因此，本发明的多核苷酸，无论其编码序列的长度如何，可组合并可操作地偶联至其他DNA或RNA序列如表达调控序列，包括例如，启动子、多聚腺苷酸化信号。另外，所述多核苷酸还可包含限制酶位点、多克隆位点、其他编码片段等，从而其整个长度可有很大的变化。
因此本发明包括，可使用几乎任何长度的多核苷酸片段；其总长度优选受限于制备便利性和预期重组DNA方案中的使用。包括以下多核苷酸：其长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、41、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、270、280、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000个或更多个(包括其间的所有整数)碱基，包括HRS参考多核苷酸(例如，碱基数X-Y，其中X为约1-3000或更多，且Y为约10-3000或更多)的任何部分或片段(例如，长度大于约6、7、8、9或10个核苷酸)，或者其互补物。
本发明的实施方案还包括编码所述HRS多肽的参考多核苷酸序列的“变体”。相比参考多核苷酸，多核苷酸“变体”可包含一个或多个替换、添加、缺失和/或插入。通常，HRS多肽参考多核苷酸序列的变体可与该特定核苷酸序列(如例如，SEQ ID NO:24-38、40、42、72-73、173-175或183-189)具有至少约30％、40％50％、55％、60％、65％、70％，通常至少约75％、80％、85％，合适地约90％-95％或更高，以及更合适地约98％或更高的序列同一性，其通过本文其他地方描述的序列比对程序采用默认参数测定。在某些实施方案中，变体与参考序列的差异可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、41、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100个(包括其间的所有整数)或更多个碱基。在某些实施方案中，诸如当所述多核苷酸变体编码具有非经典活性的HRS多肽时，相比未修饰的多肽，所述编码的HRS多肽的所需活性未大幅降低。对所述编码的多肽活性的影响通常可按本文所述进行评估，包括例如，本文描述的方法。在一些实施方案中，所述变体可改变所述HRS多肽的聚集状态，例如，以提供在不同实施方案中主要以单体、二聚体或多聚体存在的HRS多肽。
某些实施方案包括与参考HRS多核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:24-38、40、42、72-73、173-175或183-189中任一序列)或其互补物在下述严格条件下杂交的多核苷酸。如本文所用，术语“在低严格、中等严格、高严格或极严格条件下杂交”，描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可参见，Ausubel et al.,(1998，同上)的第6.3.1至6.3.6部分。水性和非水性方法在该参考文献中进行了介绍，且都可以使用。
本文提到低严格条件包括且包含对于42℃下杂交，至少约1％v/v到至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1M到至少约2M的盐，以及对于42℃下洗涤，至少约1M到至少约2M的盐。低严格条件还可以包括对于65℃下杂交，1％的牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)和7％SDS，以及对于室温下洗涤，(i)2×SSC、0.1％SDS，或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)和5％SDS。低严格条件的一个实施方案包括约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后至少于50℃(对于低严格条件，洗涤温度可以升高到55℃)下，在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次。
中等严格条件包括且包含对于42℃下杂交，至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M的盐，以及对于55℃下洗涤，至少约0.1M到至少约0.2M的盐。中等严格条件还可以包括对于65℃下杂交，1％的牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS，以及对于60-65℃下洗涤，(i)2×SSC、0.1％SDS，或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)、5％SDS。中等严格条件的一个实施方案包括约45℃下在6×SSC中杂交，然后于60℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤一次或多次。高严格条件包括且包含对于42℃下杂交，至少约31％v/v到至少约50％v/v的甲酰胺和至少约0.01M到至少约0.15M的盐，以及对于55℃下洗涤，约0.01M到约0.02M的盐。
高严格条件还可以包括对于65℃下杂交，1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS，以及对于超过65℃的温度下的洗涤，(i)0.2×SSC、0.1％SDS，或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)、1％SDS。高严格条件的一个实施方案包括约45℃下在6×SSC中杂交，然后于65℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。极严格条件的一个实施方案包括65℃下在0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，然后于65℃下在0.2×SSC、1％SDS中洗涤一次或多次。
其他严格条件是本领域众所周知的，且本领域技术人员应认识到，可以操控不同因素以优化杂交的特异性。对最后洗涤的严格性的优化能够用来确保高度杂交。详细的实例参见，Ausubel et al.(同上)的第2.10.1至2.10.16页，以及Sambrook et al.(1989,同上)的第1.101至1.104部分。尽管严格洗涤一般在约42℃-68℃的温度下进行，但本领域技术人员应理解，其他温度也可以适用于严格条件。发生最大杂交率的温度一般比形成DNA-DNA杂合体的Tm低约20℃-25℃。本领域内众所周知，Tm是熔解温度，或两个互补多核苷酸序列解离的温度。Tm值的估算方法是本领域内众所周知的(参见Ausubel et al.,同上，第2.10.8页)。
通常，完全匹配的DNA双链体的Tm可通过下列公式预测近似值：Tm＝81.5+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)–(600/长度)，其中，M是Na+浓度，优选在0.01摩尔至0.4摩尔的范围内；％G+C是鸟嘌呤核苷和胞嘧啶碱基的总和占总碱基数的百分比，范围在30％-75％G+C内；％甲酰胺是甲酰胺体积浓度的百分比；长度是所述DNA双链体中碱基对的数量。随机错配碱基对的数量每增加1％，双链DNA的Tm约降低1℃。对于高严格性，洗涤一般在Tm-15℃下进行，或对于中度严格性，在Tm-30℃下进行。
在杂交方案的一个实例中，使含有被固定的DNA的膜(如硝酸纤维素膜或尼龙膜)于42℃在含有标记的探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液(0.1％聚蔗糖、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％SDS和200mg/mL变性鲑鱼精DNA)中，杂交过夜。然后，对所述膜进行两次连续的中等严格洗涤(即2×SSC、0.1％SDS，45℃下15分钟，然后2×SSC、0.1％SDS，50℃下15分钟)，接着进行两次连续的较高严格洗涤(即0.2×SSC、0.1％SDS，55℃下12分钟，然后，0.2×SSC和0.1％SDS溶液，65-68℃下12分钟)。
HRS多肽的制备
本发明多肽可采用本领域技术人员已知的任何合适方案制备，例如通过采用标准的固相肽合成技术(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))，或者通过重组技术使用遗传改造的宿主来制备。蛋白质合成可以使用人工技术或通过自动化进行。可以使用例如AppliedBiosystems431A多肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动化合成。可选择地，可单独化学合成各种片段，然后用化学方法组合以产生期望的分子。
也可通过众所周知的技术在合适的宿主细胞中表达编码目标HRS多肽的DNA序列来制备HRS多肽。可通过已有的标准方法来合成制备编码所述HRS多肽的多核苷酸序列，例如，Beaucage et al.(1981)Tetrahedron Letters22:1859-1869中描述的亚磷酰胺法，或者Matthes et al.(1984)EMBO Journal3:801-805中描述的方法。根据亚磷酰胺法，在例如自动化DNA合成仪上合成寡核苷酸，并纯化、双链化和连接以形成合成的DNA构建体。可选择地，可使用标准的重组分子生物技术来构建所述DNA构建体，包括限制性酶介导的克隆和基于PCR的基因扩增。
所述多核苷酸序列也可为混合基因组、cDNA和合成来源。例如，编码前导肽的基因组或cDNA序列可连接至编码所述HRS多肽的基因组或cDNA序列，然后可通过在某个位点插入编码所需的氨基酸序列的合成寡核苷酸或者通过使用合适寡核苷酸的PCR来修饰所述DNA序列。在一些实施方案中，可在所述编码序列之前包含信号序列。该序列编码编码序列N端的信号肽，所述信号肽与宿主细胞沟通以引导所述多肽至细胞表面或使所述多肽分泌至介质中。通常在该蛋白离开细胞以前，所述信号肽被宿主细胞切割。可在原核细胞和真核细胞的多种蛋白中发现信号肽。
多种表达载体/宿主系统是已知的，并可用于容纳和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于，用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)转化的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，包括用病毒、质粒、附加型或整合型表达载体转化的哺乳动物细胞和更具体的人类细胞系统。
这类表达载体可包含表达调控序列，包括例如，增强子、启动子、5’和3’非翻译区，其与宿主细胞的蛋白相互作用以进行转录和翻译。这些元件在其强度和特异性方面可能不同。根据所用的载体系统和宿主，可使用任何数目的合适转录和翻译元件，包括组成型和可诱导启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用可诱导启动子，如pBluescript噬菌粒(Stratagene，La Jolla，加利福尼亚州)或pSPORT1质粒(GIBCO BRL马里兰州盖瑟斯堡)的杂合LacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，一般优选来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果必需产生含有编码多肽的序列的多份拷贝的细胞系，基于SV40或EBV的载体可有利地与适当的选择标记一起使用。
某些实施方案可使用基于大肠杆菌的表达系统(参见例如，StructuralGenomics Consortium et al.,Nature Methods.5:135-146,2008)。这些和相关的实施方案可部分地或全部依靠非连接依赖性克隆(LIC)来产生合适的表达载体。在具体的实施方案中，可通过T7RNA聚合酶(例如，pET载体系列)来控制蛋白表达。这些和相关的实施方案可利用表达宿主菌株BL21(DE3)，其为一种支持T7-介导的表达并且缺乏Lon和ompT蛋白酶以提高靶蛋白稳定性的BL21的λDE3溶原菌。还包括携带编码很少被用于大肠杆菌中的tRNA的质粒的表达宿主菌株，如ROSETTATM(DE3)和Rosetta2(DE3)菌株。在一些实施方案中，也可使用其他大肠杆菌菌株，包括其他大肠杆菌K-12菌株如W3110(F-λ-IN(rrnD-rrnE)1rph-1)，其可导致在发酵期间的翻译后修饰水平降低。也可使用以商标出售的核酸酶试剂和蛋白提取试剂来改善细胞溶解和样品处理。对于细胞培养，自动诱导培养基可提高许多表达系统包括高通量表达系统的效率。这类培养基(例如，OVERNIGHT EXPRESSTM自动诱导系统)通过代谢转换(metabolic shift)来逐渐启动蛋白表达而无需添加人工诱导剂如IPTG。
具体实施方案使用六组氨酸标签或其他亲和或纯化标签，然后进行固定化金属亲和层析(IMAC)纯化或相关技术。然而，在某些方面，临床级的蛋白可分离自大肠杆菌包涵体，其没有或没有使用亲和标签(参见例如，Shimp et al.,Protein Expr Purif.50:58-67,2006)。作为另外的实例，某些实施方案可使用冷休克诱导的大肠杆菌高产率生产系统，因为在大肠杆菌中于低温下的蛋白过表达提高其可溶性和稳定性(参见例如，Qing etal.,Nature Biotechnology.22:877-882,2004)。
还包括高密度的细菌发酵系统。例如，高细胞密度培养富氧罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)允许以超过150g/L的细胞密度产生蛋白，且重组蛋白以超过10g/L的滴度表达。在酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中可使用许多含有组成型或可诱导启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。关于其综述可参见，Ausubel et al.(同上)和Grant et al.,Methods Enzymol.153:516-544(1987)。还包括毕赤酵母(Pichia pandoris)表达系统(参见例如，Li et al.,Nature Biotechnology.24,210–215,2006；和Hamilton et al.,Science,301:1244,2003)。某些实施方案包括经改造以选择性对蛋白糖基化的酵母系统，包括具有人源化N-糖基化途径的酵母系统等(参见例如，Hamilton et al.,Science.313:1441-1443,2006；Wildt etal.,Nature Reviews Microbiol.3:119-28,2005；和Gerngross et al.,Nature-Biotechnology.22:1409-1414,2004；美国专利第7,629,163、7,326,681和7,029,872号)。仅以示例的方式，重组酵母培养物可生长于大培养三角瓶(Fernbach Flask)或15L、50L、100L和200L发酵罐等中。
在使用植物表达载体的情况下，编码多肽的序列的表达可通过任何数目的启动子来驱动。例如，病毒启动子如CaMV的35S和19S启动子，可单独或结合来自TMV的Ω前导序列使用(Takamatsu,EMBO J.6:307-311(1987))。可选择地，可使用植物启动子如RUBISCO小亚基或热休克启动子(Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671-1680(1984)；Broglie et al.,Science224:838-843(1984)；和Winter et al.,Results Probl.Cell Differ.17:85-105(1991))。可通过直接DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体引入植物细胞中。这类技术描述于许多可普遍获取的综述中(参见例如，Hobbs in McGraw Hill,Yearbook of Science and Technology,pp.191-196(1992))。
也可使用昆虫系统表达目标多肽。例如，在一个这样的系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)细胞中表达外来基因。编码所述多肽的序列可被克隆至所述病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入编码所述多肽的序列会使得多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白的重组病毒。然后可将所述重组病毒用于感染，例如，可表达目标多肽的草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞(Engelhard et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:3224-3227(1994))。还包括杆状病毒表达系统，包括那些利用SF9、SF21和T.ni细胞的系统(参见例如，Murphy and Piwnica‐Worms,Curr Protoc Protein Sci.Chapter5:Unit5.4,2001)。昆虫系统可提供类似于哺乳动物系统的翻译后修饰。
在哺乳动物宿主细胞中，许多表达系统为本领域熟知且可商业获得的。示例性哺乳动物载体系统包括例如，来自Invitrogen的pCEP4、pREP4和pREP7、来自Crucell的PerC6系统和基于慢病毒的系统如来自Invitrogen的pLP1等。例如，在将腺病毒用作表达载体的情况下，编码目标多肽的序列可连接至由晚期启动子和三联体前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体。在病毒基因组的非必需E1或E3区的插入可用于获得能够在被感染的宿主细胞中表达所述多肽的活病毒(Logan & Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3655-3659,1984)。此外，转录增强子如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子可用于提高在哺乳动物宿主细胞中的表达。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括，SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2)；狗肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL3A,ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.,PNASUSA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如NSO和Sp2/0。关于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp.255-268。一些优选的哺乳动物细胞表达系统包括基于CHO和HEK293-细胞的表达系统。哺乳动物表达系统可利用贴附于例如方瓶(T-flask)、滚瓶或细胞工厂中的细胞系，或者例如在1L和5L转瓶、5L、14L、40L、100L和200L搅拌罐生物反应器或20/50L和100/200LWAVE生物反应器以及本领域所知的其他容器中的悬浮培养物。
还包括无细胞蛋白表达的方法。这些和相关的实施方案通常利用纯化的RNA聚合酶、核糖体、tRNA和核糖核苷酸。这类试剂可例如通过从细胞中或从基于细胞的表达系统中提取来制备。
此外，可针对其调节插入序列的表达或以所需方式处理表达的蛋白的能力来挑选宿主细胞菌株。所述多肽的这类修饰包括但不限于，翻译后修饰如乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化或插入非天然存在的氨基酸(通常参见，美国专利第US7,939,496、US7,816,320、US7,947,473、US7,883,866、US7838,265、US7,829,310、US7,820,766、US7,820,766、US7,7737,226、US7,736,872、US7,638,299、US7,632,924和US7,230,068号)。切割“前蛋白”形式蛋白的翻译后处理也可用于促进正确的插入、折叠和/或功能。可以挑选不同的宿主细胞以确保外来蛋白的正确修饰和处理，如除细菌细胞外，酵母、CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138，其具有或甚至缺乏针对这类翻译后活性的特定细胞机构和特征机制。
可根据多种本领域所知的技术来纯化和表征重组细胞产生的所述HRS多肽。用于进行蛋白纯化和分析蛋白纯度的示例性系统包括，快速蛋白液相色谱(FPLC)(例如，AKTA和Bio-Rad FPLC系统)、高压液相色谱(HPLC)(例如，Beckman和Waters HPLC)。用于纯化的示例性化学方法包括，离子交换层析(例如，Q、S)、尺寸排阻层析、盐梯度、亲和纯化(例如，Ni、Co、FLAG、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白A/G)、凝胶过滤、逆相、陶瓷离子交换层析和疏水相互作用柱(HIC)以及本领域所知的其他方法。一些示例性方法也公开于实施例部分中。
重组载体和多核苷酸
本发明另一个实施方案提供了重组多核苷酸、重组载体和重组病毒载体，其含有序列包含编码任何本文公开的HRS多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
还包括，包含编码HRS多肽的修饰的和改进的mRNA的制剂，所述HRS多肽能够降低引入其的细胞群的固有免疫活性，从而增加在该细胞群中产生蛋白的效率。这类修饰的mRNA包括例如，5’Cap1结构和长度约为160个核苷酸的多聚A尾，且其任选地配制为液体制剂如脂质体、脂质体复合物(lipoplexe)或脂质纳米颗粒，其描述于例如，美国申请公开第2012/0251618号和国际申请第PCT/US2011/046861和PCT/US2011/054636号，其内容通过引用整体并入本文。
适用于表达本发明的HRS多肽的重组载体的选择、将表达所述HRS多肽的核酸序列插入至载体中的方法，以及将所述重组载体递送至目标细胞的方法，均属于本领域技术范围内。参见例如，Tuschl,T.(2002),Nat.Biotechnol,20:446-448；Brummelkamp T R et al.(2002),Science296:550-553；Miyagishi M et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison PJ et al.(2002),Genes Dev.16:948-958；Lee N S et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505；Paul C P et al.(2002),Nat.Biotechnol.20:505-508,Conese et al.,Gene Therapy11:1735-1742(2004)，和Fjord-Larsen et al.,(2005)Exp Neurol195:49-60，其全部公开的内容通过引用整体并入本文。
代表性可商购获得的重组表达载体包括例如，来自Invitrogen的pREP4、pCEP4、pREP7和pcDNA3.1以及pcDNATM5/FRT，和来自Stratagene的pBK-CMV和pExchange-6核心载体。代表性可商购获得的病毒表达载体包括但不限于，基于腺病毒的系统如可获自Crucell,Inc.的Per.C6系统、基于慢病毒的系统如来自Invitrogen的pLP1，和逆转录病毒载体如来自Stratagene(US)的逆转录病毒载体pFB-ERV和pCFB-EGSH。
通常，可使用能够接受要表达的所述HRS多肽的编码序列的任何重组体或病毒载体，例如，源自腺病毒(AV)的载体；腺相关的病毒(AAV)；逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、棒状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒；乳头瘤病毒(美国专利第6,399,383,&7,205,126号)等。还可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原将载体假型化(pseudotyping)来修饰所述病毒载体的趋向性。例如，本发明的AAV载体可用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病毒、埃博拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白进行假型化。非感染性假病毒粒子例如，乳头瘤病毒的假病毒粒子，也可用于使得基因有效地递送至粘膜(美国专利第7,205,126号，Peng et al.,Gene Ther.2010Jul29，电子发布)。
在一些方面，可将源自AV和AAV的病毒载体用于本发明。用于表达本发明的HRS多肽的合适AAV载体、构建重组AAV载体的方法，以及将该载体递送至靶细胞的方法，描述于Samulski R et al.(1987),J.Virol.61:3096-3101；Fisher K J et al.(1996),J.Virol.,70:520-532；Samulski R etal.(1989),J.Virol.63:3822-3826；美国专利第5,252,479号；美国专利第5,139,941号；国际专利申请第WO94/13788号；和国际专利申请第WO93/24641号；其全部公开内容通过引用并入本文。
通常，所述重组载体和重组病毒载体包括指导本发明的多核苷酸在各种系统中(体外和体内)表达的表达调控序列。例如，一组调控元件将指导在某些哺乳动物细胞或组织中的表达，且另一组调控元件将指导在细菌细胞中的表达，而第三组调控元件将指导在杆状病毒系统中的表达。一些载体为含有用于在多于一种系统中表达所需的调控元件的杂合载体。含有这些不同的调控系统的载体为可商购获得的，且本领域技术人员能容易地将本发明的多核苷酸克隆至这类载体中。
在一些情况下，所述多核苷酸或载体将具有用于在众多类型细胞中表达所述HRS多肽的启动子。在其他情况下，所述载体将具有组织特异性启动子。例如，所述启动子仅指导在免疫细胞、肌肉细胞中的表达。在一些方面，本发明的载体包含这样的多核苷酸，其核苷酸序列编码SEQID NO:1-23、39、41、43,70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列的HRS多肽。
可将重组多核苷酸和载体直接给予至患者或者结合适当的递送试剂给药，包括Minis Transit LT1亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子化合物(例如，聚赖氨酸)或脂质体。适用于本发明的重组病毒载体的选择、将表达所述HRS多肽的核酸序列插入所述载体的方法，以及将病毒载体递送至目标细胞的方法，均属于本领域技术范围内。参见例如，Dornburg R(1995),Gene Therap.2:301-310；Eglitis M A(1988),Biotechniques6:608-614；Miller A D(1990),Hum Gene Therap.1:5-14；和Anderson W F(1998),Nature392:25-30，其全部公开内容通过引用并入本文。
宿主细胞
一些实施方案包括用本文描述的载体或多核苷酸转化的宿主细胞。在一些方面，本文描述的HRS多肽由宿主细胞表达，以便产生或制备所述HRS多肽。这类宿主细胞包括细菌、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
在一些方面，所述宿主细胞可用于通过细胞疗法来表达和递送HRS多肽。因此，某些方面包括治疗自身免疫疾病或炎性疾病或病症的细胞疗法，其包括给予表达或能表达本发明的HRS多肽的宿主细胞。在某些方面，所述疾病或病症选自炎性肌肉疾病，包括例如，多发性肌炎、皮肌炎、多发性肌炎-硬皮病重叠、间质性肺病、过敏性肺炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿、Goodpasture综合征、哮喘、肌营养不良症、恶病质和横纹肌溶解症以及本文描述的其他疾病。
细胞疗法涉及给予已经在身体外部选定、繁殖和进行药学处理或改变(例如，遗传修饰)的细胞(Bordignon,C.et al,Cell Therapy:Achievements and Perspectives(1999),Haematologica,84,pp.1110-1149)。这类宿主细胞包括例如，初始细胞，包括肌肉细胞、PBMC、巨噬细胞和干细胞，其已经被遗传修饰以表达本发明的HRS多肽。细胞疗法的目的是替换、修复或提高受损组织或器官的生物功能(Bordignon,C.et al,(1999),Haematologica,84,pp.1110-1149)。
在这类方法的某些方面，所述宿主细胞分泌所述HRS多肽，从而在植入了宿主细胞的组织或器官内提供持久来源的所述HRS多肽。
其他治疗剂
在一些实施方案中，本文描述的组合物和方法可使用抗体、抗体片段或非HRS多肽结合蛋白以封闭抗-组氨酰-tRNA合成酶自身抗体的活性。在一些方面，所述抗体或结合蛋白针对自身抗体的抗原结合结构域，即所述抗体代表抗-独特型抗体，从而选择性封闭自身抗体的活性。因此，这类结合剂可用于诊断、治疗或预防由针对与自身免疫疾病相关的组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体介导的疾病、病症或其他疾病状况。
术语“抗体”描述的是天然的或者部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语还包括具有结合结构域的任何多肽或蛋白，所述结合结构域为抗原结合结构域，或与之同源。该术语还包括，使用任何本文公开的或要求保护的方法确定、克隆或选择的CDR移植抗体，包括双特异性抗体和人源化的抗体，其中一个或多个CDR源自从B细胞获得的抗体。
“天然Ig G抗体”和“天然Ig G免疫球蛋白”通常为约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。在一些情况下，每条轻链通过一个共价的二硫键连接至重链，而二硫键连接数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间存在差异。每条重链和轻链也具有规律间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(“VH”)，其后为多个恒定结构域(“CH”)。每条轻链在一端具有可变结构域(“VL”)，而恒定结构域(“CL”)在其另一端；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，而轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据认为，特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“可变结构域”是指在家族成员之间(即，不同同种型或不同物种之间)序列存在广泛不同的蛋白结构域。针对抗体，术语“可变结构域”是指抗体的可变结构域，其用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。然而，该可变性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域中。其集中于轻链和重链可变结构域均含有的称为高变区的3个片段中。可变结构域的更为高度保守部分称为“框架区”或“FR”。未被修饰的重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用β-折叠构象，由3个高变区连接，其形成连接和在有些情况下形成部分的β-折叠结构的环。通过FR使得每条链的高变区紧密靠近在一起，并与来自其他链的高变区一起促进抗体的抗原-结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991),第647-669页)。所述恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出不同的效应功能，如抗体参与到抗体依赖性细胞毒性。
用于本文中时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。所述高变区包含来自3个“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，其以互补的方式直接与抗原结合，且分别被称为CDR1、CDR2和CDR3。
在轻链可变结构域中，所述CDR对应于约残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)；而在重链可变结构域中，所述CDR对应于约残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变结构域的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.,Mol.Biol.196:901-917(1987))。
如本文所用，“可变框架区”或“VFR”是指形成可接触抗原的抗原结合口袋和/或凹槽的部分的框架残基。在一些实施方案中，所述框架残基形成作为抗原结合口袋或凹槽的部分的环。所述环中的氨基酸残基可以接触或不接触抗原。在一个实施方案中，VFR的环氨基酸通过检测抗体、抗体重链或抗体轻链的三维结构来确定。可分析所述三维结构的溶剂可接近的氨基酸位置，因为这类位置很可能形成环和/或提供在抗体可变结构域中的抗原接触。一些溶剂可接近的位置可容纳氨基酸序列多样性，而其他位置(例如，结构性位置)的多样化程度较低。抗体可变结构域的三维结构可源自晶体结构或蛋白建模。在一些实施方案中，所述VFR包含、基本上由或由对应于重链可变结构域的氨基酸位置71-78的氨基酸位置组成，这些位置根据Kabat et al.,1991而定义。在一些实施方案中，VFR形成位于CDRH2和CDRH3之间的框架区3的部分。优选地，VFR形成位置良好的环，从而使得能够接触靶抗原或形成抗原结合口袋的一部分。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同类型。有5种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域(Fc)分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构象为众所周知的。基于其恒定结构域的氨基酸序列，源自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归属两个明显不同的类型之一，称为“κ”(kappa)和“λ”(lambda)。
术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本发明中可互换使用，指保留有特异性结合抗原的能力的一种或多种抗体片段(参见例如，Holliger et al.,NatureBiotech.23(9):1126-1129(2005))。包括于但不限于术语抗体的“抗原结合部分”的抗体片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Wardet al.,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码，可以采用重组方法通过合成连接子将其连接起来，使其成为单个的蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird et al.(1988)Science242:423-426；和Huston et al.(1988)PNAS USA.85:5879-5883；和Osbourn et al.(1998)Nat.Biotechnol.16:778)。这类单链抗体也试图包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。特定scFv的任何VH和VL序列可连接至人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列，以便产生编码完整IgG分子或其他同种型的表达载体。VH和VL也可用于采用蛋白质化学或重组DNA技术产生免疫球蛋白的Fab、Fv或其他片段。还包括其他形式的单链抗体如双体抗体。
可通过用蛋白酶如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理免疫球蛋白(单克隆抗体)来产生“F(ab’)2”和“Fab’”部分，其包括通过消化靠近两条H链中每一条中的铰链区之间存在的二硫键的免疫球蛋白而产生的抗体片段。例如，木瓜蛋白酶切割了在两条H链中每一条中的铰链区之间存在的二硫键上游的IgG，从而产生两条同源的抗体片段，其中由VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)组成的L链，以及由VH(H链可变区)和CHγ1(H链的恒定区中的γ1区)组成的H链片段，在其C末端区通过二硫键连接。这两条同源抗体片段的每一条被称为Fab’。木瓜蛋白酶切割了在两条H链中每一条中的铰链区之间存在的二硫键下游的IgG，以产生稍微大于上述两条Fab’在铰链区连接的片段的抗体片段。该抗体片段称为F(ab’)2。
该Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段通过在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段。本文将这样的Fab’指定为Fab’-SH，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离的硫醇基。F(ab’)2抗体片段起初被制备为其间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是最小抗体片段，其含有完整的抗原-识别和抗原-结合位点。该区由紧密地非共价结合的一条重链和一条轻链可变结构域二聚体组成。正是在该构象中，每个可变结构域的3个高变区互相作用以限定在VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。总体上，所述6个高变区赋予了该抗体抗原-结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或包含仅3个抗原特异性的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管具有比完整的结合位点更低的亲和力。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链上。在一些实施方案中，所述Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽连接子，其使得sFv能形成用于结合抗原的所需结构。关于sFv分子的综述，参见例如，Pluckthun in The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
如本文所用，“天然的”或“天然存在的”抗体或抗体可变结构域是指这样的抗体或抗体可变结构域，其具有自非合成来源如生殖细胞系序列或离体获得的分化的抗原特异性B细胞或其相应的杂交瘤细胞系或动物的血清确定的抗体或抗体可变结构域序列。这些抗体可包括任何类型的免疫应答(天然的或者其他情况下诱导的)中产生的抗体。天然的抗体包含构成或编码这些抗体的氨基酸序列和核苷酸序列，例如，Kabat数据库中确定的那些。
抗体可以通过本领域普通技术人员已知的各种技术中的任何一种进行制备。参见例如，Harlow and Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory,1988。目标多肽特异性的单克隆抗体可以，例如使用Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.6:511-519,1976的技术及其改进技术进行制备。还包括利用转基因动物如小鼠来表达人抗体的方法。参见例如，Neuberger et al.,Nature Biotechnology14:826,1996；Lonberget al.,Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101,1994；和Lonberg et al.,Internal Review of Immunology13:65-93,1995。具体实例包括的平台(参见例如，美国专利第6,596,541号)。也可通过利用噬菌体展示文库或酵母展示文库来产生或鉴定抗体(参见例如，美国专利第7,244,592号；Chao et al.,Nature Protocols.1:755-768,2006)。可利用的文库的非限制性实例包括，克隆的或合成的文库，如人组合抗体文库(HuCAL)，其中人抗体库(repertoire)的结构多样性通过7个重链和7个轻链可变区基因来代表。这些基因的组合在主文库中产生了49个框架。通过在这些框架上叠加高度可变的基因盒(CDR＝互补决定区)，可产生大量的人抗体库。还包括用编码轻链可变区、重链CDR-3的人供体来源的片段、编码重链CDR-1中的多样性的合成DNA、编码重链CDR-2中的多样性的合成DNA设计的人文库。其他适用的文库对本领域技术人员来说是显而易见的。
根据另一个方面，本发明还提供了抗体替代物或其他结合剂，如表现出对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体的结合特异性的可溶性受体、纤连蛋白(adnectin)、肽、肽模拟物、适体等，以及使用其的组合物和方法。结合剂可用于本文描述的任何治疗方法和组合物中。基于生物的结合剂如纤连蛋白、可溶性受体、高亲和性多聚体(avimer)和三活菌素(trinectin)尤其有用。
在某些实施方案中，这类结合剂可有效地用于封闭针对组氨酰-tRNA合成酶的与自身免疫疾病相关的自身抗体。因此，这类结合剂可用于诊断、治疗或预防由针对组氨酰-tRNA合成酶的与自身免疫疾病相关的自身抗体介导的疾病、病症或其他疾病状况，如通过部分或全部地拮抗或激活其活性。
如上所述，“肽”被包括为结合剂。术语肽通常是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的类似物。在某些实施方案中，术语“肽”是指相对短的多肽，包括这样的肽，其由约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸组成，包括其间所有的整数和范围(例如，5-10,8-12,10-15)，并与一种或多种针对组氨酰-tRNA合成酶的与自身免疫疾病相关的自身抗体相互作用。肽可由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸组成，如本文所述.
除了仅由天然存在的氨基酸组成的肽，还提供了模拟肽或肽类似物。肽类似物在医药行业中通常被用作具有与模板肽的那些类似的特性的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“模拟肽”(Luthman,et al.,A Textbook of Drug Design and Development,14:386-406,2nd Ed.,Harwood Academic Publishers(1996)；Joachim Grante,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:1699-1720(1994)；Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15:29(1986)；Veber and Freidinger TINS,p.392(1985)；和Evans,et al.,J.Med.Chem.30:229(1987))。模拟肽是模仿肽的生物活性的分子但其在化学特性上不再是肽。模拟肽化合物为本领域所知，且描述于例如，美国专利第6,245,886号。
本发明还包括类肽。肽的类肽衍生物代表修饰的肽的另一种形式，其保留了关于生物活性的重要结构决定子(determinant)，但消除了肽键，从而赋予了对蛋白水解的抗性(Simon,et al.,PNAS USA.89:9367-9371,1992)。类肽为N-取代的甘氨酸的寡聚体。许多N-烷基已经被描述，其各自对应于天然氨基酸的侧链。本发明的模拟肽包括其中至少一个氨基酸、一些氨基酸或所有氨基酸残基被相应的N-取代甘氨酸替换的化合物。类肽文库描述于，例如美国专利第5,811,387号。
适体也作为结合剂包括在本文中(参见例如，Ellington et al.,Nature.346,818-22,1990；和Tuerk et al.,Science.249,505-10,1990)。适体的实例包括核酸适体(例如DNA适体、RNA适体)和肽适体。核酸适体一般是指通过重复数轮的体外筛选或等效方法如SELEX(指数富集的配体系统进化)而改造，以与各种分子靶标如小分子、蛋白质、核酸甚至细胞、组织和生物体结合的核酸种类。参见例如，美国专利第6,376,190；和6,387,620号。因此，本文包括与本文所述AARS多肽和/或其细胞结合伴侣结合的核酸适体。
肽适体通常包括连接到蛋白支架两端的可变肽环，其为一种通常使所述肽适体的结合亲和力增加到与抗体的结合亲和力相当水平的双结构限制(例如在纳摩尔范围)。在某些实施方案中，可变环的长度可以由约10-20个氨基酸(包括其间的所有整数)组成，且其骨架可以包括具有良好的溶解性和压实性(campacity)的任何蛋白质。某些示例性实施方案可以利用细菌蛋白的硫氧还蛋白-A(Thioredoxin-A)作为骨架蛋白，可变环插入还原活性位点(野生型蛋白质中的-Cys-Gly-Pro-Cys-环)，两个半胱氨酸侧链能够形成一个二硫键。确定肽适体的方法描述于例如，美国申请第2003/0108532号。因此，包括与本文所述AARS多肽和/或其细胞结合伴侣结合的肽适体。可以使用本领域内已知的不同系统进行肽适体选择，包括酵母双杂交系统。
还包括特异性结合本发明AARS蛋白片段的ADNECTINSTM、AVIMERSTM、Anaphone和Anticalin。ADNECTINSTM是指一类源自人纤连蛋白(一种天然下结合其他蛋白的丰富的胞外蛋白)的靶向生物制剂。参见例如，美国申请第2007/0082365、2008/0139791和2008/0220049号。ADNECTINSTM通常由天然的纤连蛋白骨架以及人纤连蛋白特定部分的多个靶向结构域组成。所述靶向结构域可被改造以使ADNECTINTM能够特异性识别针对组氨酰-tRNA合成酶的与自身免疫疾病相关的自身抗体。
AVIMERSTM是指使用体外外显子重排和噬菌体展示来改造的多聚结合蛋白或肽。相比单个表位免疫球蛋白结构域，多个结合结构域被连接而产生了更大的亲和力和特异性。参见例如，Silverman et al.,NatureBiotechnology.23:1556-1561,2005；美国专利第7,166,697号；和美国申请第2004/0175756、2005/0048512、2005/0053973、2005/0089932和2005/0221384号。
还包括设计的锚重复蛋白(DARPin)，其包括一类能在药物发现和药物研发中提供超过抗体的靶向结合优势的非免疫球蛋白。除了其他应用，由于其良好的分子特性，包括小的尺寸和高稳定性，DARPin理想地适用于体内成像或者毒素或其他治疗性荷载的递送。在细菌中的低成本生产和许多靶标-特异性DARPin的快速产生使得DARPin法可用于药物发现。另外，DARPin可容易地以多特异性形式生产，提供了效应DARPin靶向特定器官或用由几个DARPin组成的一个分子靶向多个受体的可能性。参见例如，Stumpp et al.,Curr Opin Drug Discov Devel.10:153-159,2007；美国申请第2009/0082274号；和PCT/EP2001/10454号。
某些实施方案包括“单体”，其通常利用人纤连蛋白的第10纤连蛋白III型结构域(FNfn10)作为骨架展示用于靶标结合的多个表面环。FNfn10是具有类似于免疫球蛋白折叠的β-夹层结构的小(94个残基)蛋白。其高度稳定而没有二硫键或金属离子，且其可在细菌中高水平地以正确的折叠形式表达。FNfn10骨架基本上与任何展示技术相容。参见例如，Batoriet al.,Protein Eng.15:1015-20,2002；和Wojcik et al.,Nat Struct Mol Biol.,2010；以及美国专利第6,673,901号。
Anticalin是指一类抗体模拟物，其通常从人脂质运载蛋白合成，所述人脂质运载蛋白为具有由结构上刚性的框架支持的高变环区的结合蛋白家族。参见例如，美国申请第2006/0058510号。Anticalin具有的大小通常为约20kDa。Anticalin的特征可在于由8条逆平行的β-链(稳定的β-桶骨架)形成的桶状结构，所述8条链通过4个肽环和一条附着的α-螺旋成对地连接。在某些方面，在一个或多个高变环区中产生构象差异以实现特异性结合。参见例如，Skerra,FEBS J.275:2677-83,2008，其通过引用并入本文。
治疗组合物、药物制剂、给药和试剂盒
本发明的实施方案包括用于治疗炎性疾病、肌营养不良症、横纹肌溶解症、恶病质和本文描述的其他疾病的治疗或药物组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有一种或多种非经典活性。
还包括用于治疗自身免疫疾病的治疗或药物组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有一种或多种非经典活性。
一些实施方案涉及用于治疗自身免疫疾病、炎性疾病、肌营养不良症、横纹肌溶解症、恶病质和本文描述的其他疾病的治疗或药物组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽包含与来自针对组氨酰-tRNA合成酶的自身抗体相关疾病的自身抗体或自身反应性T细胞特异性交叉反应的至少一个表位，和/或具有一种或多种非经典活性。在某些实施方案中，所述HRS多肽包含所述组氨酰-tRNA合成酶的至少一个Th表位。
一些实施方案包括用于治疗自身免疫疾病、炎性疾病、肌营养不良症、横纹肌溶解症、恶病质和本文描述的其他疾病的治疗或药物组合物，其包含编码哺乳动物HRS多肽的重组核酸，其中所述HRS多肽包含所述组氨酰-tRNA合成酶的至少一个表位和/或具有一种或多种非经典活性，且其中所述核酸可操作地与表达调控序列偶联以使得能在细胞中表达所述HRS。
某些实施方案包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体相关的疾病的治疗或药物组合物，其包含重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达包含所述组氨酰-tRNA合成酶的至少一个表位的至少一种异源HRS多肽，且其中所述核酸可操作地与表达调控序列偶联以使得能在细胞中表达所述HRS。还包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶不足有关的疾病的治疗或药物组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽能够代替所述组氨酰-tRNA合成酶的至少一种经典的或非经典的功能。
一些实施方案包括用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病的治疗或药物组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽在浓度达约1x10-7M的竞争性ELISA中，不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
一些实施方案包括治疗或药物组合物，其促进、优化或延长所述HRS多肽的稳定性、同质性、单分散性或活性。
本发明还包括医用的、治疗的或药物组合物，其包含HRS多肽的至少约400个氨基酸的多肽；其中所述多肽：
a)纯度为至少约95％；
b)聚集小于约5％；和
c)基本上无内毒素。
在另一个实施方案中，所述医用的、治疗的或药物组合物包含约40-80个氨基酸的HRS多肽；其中所述多肽：
a)纯度至少为约95％；
b)聚集小于约5％；和
c)基本上无内毒素。
还包括所述HRS多肽在制备用于治疗自身免疫疾病的药物中的新的医疗用途。
在任何这些治疗组合物和应用中，所述组合物可配制于药学上可接受的、生理上可接受的和/或药物级溶液中用于单独或组合其他一种或多种治疗形式给予至细胞、对象或动物。还应理解，如需要，本发明的组合物也可组合其他试剂如其他蛋白或多肽或药物活性剂给药。在该情况下，“组合给药”包括(1)相同单一剂量形式的一部分；和(2)单独给药，但作为同样的治疗处理计划或方案的一部分，通常但不一定在同一天给药。
在一些实施方案中，所述组合物包含2种或更多种HRS多肽的混合物。在某些方面，所述组合物可包含约2至约50种，或约2至约25种，或约2至约15种，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种本文描述的HRS多肽。
包含治疗剂量的HRS多肽的治疗或药物组合物，其包括本文描述的组氨酰-tRNA合成酶的任何一种或多种同系物、直系同源物、变体、片段、修饰的多肽和/或天然存在的同种型(例如，SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列，或者列举于表D1-D9中或衍生自其的HRS多肽或核酸中的任一种)。
在一些实施方案中，在浓度达约1x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽没有明显竞争疾病相关自身抗体与野生型组氨酰-tRNA合成酶的结合。因此，在一些实施方案中，如在竞争性ELISA中所测，相比野生型组氨酰-tRNA合成酶(SEQ ID NO:1)，所述HRS多肽与疾病相关自身抗体的亲和力更低。在一些实施方案中，相比疾病相关的自身抗体与野生型人(SEQ ID NO:1)的亲和力，所述HRS多肽具有的对疾病相关的自身抗体的表观亲和力要低至少约10倍，或低至少约20倍，或低至少约50倍，或低至少约100倍。
对于药物生产，所述HRS多肽组合物通常基本无内毒素。内毒素是与某些细菌通常为革兰氏阴性菌有关的毒素，尽管内毒素可发现于革兰氏阳性菌，如单核细胞增生李斯特菌。最普遍的内毒素为发现于各种革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，且其代表了这些细菌导致疾病的能力中的主要致病特征。在人体中少量的内毒素即可导致发烧、血压降低以及炎症和凝聚的激活，以及其他不良生理作用。
可使用本领域所知的常规技术检测内毒素。例如，利用鲎血液的鲎溶解产物检测法，其为检测内毒素存在的非常灵敏的检测法。在该检测中，由于强大的酶级联放大了该反应，很低水平的LPS可引起可检测的鲎溶解物凝聚。也可通过酶联免疫吸附检测(ELISA)来定量内毒素。
基本上无内毒素时，内毒素水平可为约或小于约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mg的蛋白。通常，1ng脂多糖(LPS)对应于约1-10EU。
在某些实施方案中，组合物具有的内毒素含量为：约或小于约10EU/mg的HRS多肽、约或小于约9EU/mg的HRS多肽、约或小于约8EU/mg的HRS多肽、约或小于约7EU/mg的HRS多肽、约或小于约6EU/mg的HRS多肽、约或小于约5EU/mg的HRS多肽、约或小于约4EU/mg的HRS多肽、约或小于约3EU/mg的HRS多肽、约或小于约2EU/mg的HRS多肽，、约或小于约1EU/mg的HRS多肽、约或小于约1EU/mg的HRS多肽、约或小于约0.1EU/mg的HRS多肽、约或小于约0.1EU/mg的HRS多肽，或者约或小于约0.01EU/mg的HRS多肽。在某些实施方案中，如上所述，组合物基于wt/wt蛋白，为至少约95％、96％、97％或98％无内毒素的、至少约99％无内毒素的、至少约99.5％无内毒素的或至少约99.99％无内毒素的。
在一些实施方案中，组合物包含一种或多种pH缓冲试剂即缓冲剂。示例性缓冲剂，包括组氨酸(例如，L-组氨酸、D-组氨酸)、柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸钠、柠檬酸及其混合物)和磷酸盐缓冲剂(例如，磷酸钠、磷酸盐缓冲液(PBS))。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约0.3mM至约100mM，或约0.3mM至约95mM，或约0.3mM至约90mM，或约0.3mM至约85mM，或约0.3mM至约80mM，或约0.3mM至约75mM，或约0.3mM至约70mM，或约0.3mM至约65mM，或约0.3mM至约60mM，或约0.3mM至约55mM，或约0.3mM至约50mM，或约0.3mM至约45mM，或约0.3mM至约40mM，或约0.3mM至约35mM，或约0.3mM至约30mM，或约0.3mM至约25mM，或约0.3mM至约20mM，或约0.3mM至约15mM，或约0.3mM至约10mM，或约0.3mM至约5mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约1mM至约100mM，或约1mM至约95mM，或约1mM至约90mM，或约1mM至约85mM，或约1mM至约80mM，或约1mM至约75mM，或约1mM至约70mM，或约1mM至约65mM，或约1mM至约60mM，或约1mM至约55mM，或约1mM至约50mM，或约1mM至约45mM，或约1mM至约40mM，或约1mM至约35mM，或约1mM至约30mM，或约1mM至约25mM，或约1mM至约20mM，或约1mM至约15mM，或约1mM至约10mM，或约1mM至约5mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约2mM至约100mM，或约2mM至约95mM，或约2mM至约90mM，或约2mM至约85mM，或约2mM至约80mM，或约2mM至约75mM，或约2mM至约70mM，或约2mM至约65mM，或约2mM至约60mM，或约2mM至约55mM，或约2mM至约50mM，或约2mM至约45mM，或约2mM至约40mM，或约2mM至约35mM，或约2mM至约30mM，或约2mM至约25mM，或约2mM至约20mM，或约2mM至约15mM，或约2mM至约10mM，或约2mM至约5mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约5mM至约100mM，或约5mM至约95mM，或约5mM至约90mM，或约5mM至约85mM，或约5mM至约80mM，或约5mM至约75mM，或约5mM至约70mM，或约5mM至约65mM，或约5mM至约60mM，或约5mM至约55mM，或约5mM至约50mM，或约5mM至约45mM，或约5mM至约40mM，或约5mM至约35mM，或约5mM至约30mM，或约5mM至约25mM，或约5mM至约20mM，或约5mM至约15mM，或约5mM至约10mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约10mM至约100mM，或约10mM至约95mM，或约10mM至约90mM，或约10mM至约85mM，或约10mM至约80mM，或约10mM至约75mM，或约10mM至约70mM，或约10mM至约65mM，或约10mM至约60mM，或约10mM至约55mM，或约10mM至约50mM，或约10mM至约45mM，或约10mM至约40mM，或约10mM至约35mM，或约10mM至约30mM，或约10mM至约25mM，或约10mM至约20mM，或约10mM至约15mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约15mM至约100mM，或约15mM至约95mM，或约15mM至约90mM，或约15mM至约85mM，或约15mM至约80mM，或约15mM至约75mM，或约15mM至约70mM，或约15mM至约65mM，或约15mM至约60mM，或约15mM至约55mM，或约15mM至约50mM，或约15mM至约45mM，或约15mM至约40mM，或约15mM至约35mM，或约15mM至约30mM，或约15mM至约25mM，或约15mM至约20mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约20mM至约100mM，或约20mM至约95mM，或约20mM至约90mM，或约20mM至约85mM，或约20mM至约80mM，或约20mM至约75mM，或约20mM至约70mM，或约20mM至约65mM，或约20mM至约60mM，或约20mM至约55mM，或约20mM至约50mM，或约20mM至约45mM，或约20mM至约40mM，或约20mM至约35mM，或约20mM至约30mM，或约20mM至约25mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约25mM至约100mM，或约25mM至约95mM，或约25mM至约90mM，或约25mM至约85mM，或约25mM至约80mM，或约25mM至约75mM，或约25mM至约70mM，或约25mM至约65mM，或约25mM至约60mM，或约25mM至约55mM，或约25mM至约50mM，或约25mM至约45mM，或约25mM至约40mM，或约25mM至约35mM，或约25mM至约30mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约30mM至约100mM，或约30mM至约95mM，或约30mM至约90mM，或约30mM至约85mM，或约30mM至约80mM，或约30mM至约75mM，或约30mM至约70mM，或约30mM至约65mM，或约30mM至约60mM，或约30mM至约55mM，或约30mM至约50mM，或约30mM至约45mM，或约30mM至约40mM，或约30mM至约35mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约35mM至约100mM，或约35mM至约95mM，或约35mM至约90mM，或约35mM至约85mM，或约35mM至约80mM，或约35mM至约75mM，或约35mM至约70mM，或约35mM至约65mM，或约35mM至约60mM，或约35mM至约55mM，或约35mM至约50mM，或约35mM至约45mM，或约35mM至约40mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约40mM至约100mM，或约40mM至约95mM，或约40mM至约90mM，或约40mM至约85mM，或约40mM至约80mM，或约40mM至约75mM，或约40mM至约70mM，或约40mM至约65mM，或约40mM至约60mM，或约40mM至约55mM，或约40mM至约50mM，或约40mM至约45mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约45mM至约100mM，或约45mM至约95mM，或约45mM至约90mM，或约45mM至约85mM，或约45mM至约80mM，或约45mM至约75mM，或约45mM至约70mM，或约45mM至约65mM，或约45mM至约60mM，或约45mM至约55mM，或约45mM至约50mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约50mM至约100mM，或约50mM至约95mM，或约50mM至约90mM，或约50mM至约85mM，或约50mM至约80mM，或约50mM至约75mM，或约50mM至约70mM，或约50mM至约65mM，或约50mM至约60mM，或约50mM至约55mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约55mM至约100mM，或约55mM至约95mM，或约55mM至约90mM，或约55mM至约85mM，或约55mM至约80mM，或约55mM至约75mM，或约55mM至约70mM，或约55mM至约65mM，或约55mM至约60mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约60mM至约100mM，或约60mM至约95mM，或约60mM至约90mM，或约60mM至约85mM，或约60mM至约80mM，或约60mM至约75mM，或约60mM至约70mM，或约60mM至约65mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约65mM至约100mM，或约65mM至约95mM，或约65mM至约90mM，或约65mM至约85mM，或约65mM至约80mM，或约65mM至约75mM，或约65mM至约70mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约70mM至约100mM，或约70mM至约95mM，或约70mM至约90mM，或约70mM至约85mM，或约70mM至约80mM，或约70mM至约75mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约75mM至约100mM，或约75mM至约95mM，或约75mM至约90mM，或约75mM至约85mM，或约75mM至约80mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约80mM至约100mM，或约80mM至约95mM，或约80mM至约90mM，或约80mM至约85mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约85mM至约100mM，或约85mM至约95mM，或约85mM至约90mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约90mM至约100mM，或约90mM至约95mM，或约95mM至约100mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂以如下范围的浓度存在：约40-60、41-60、42-60、43-60、44-60、45-60、46-60、47-60、48-60、49-60、50-60、51-60、52-60、53-60、54-60、55-60、56-60、57-60、58-60、59-60mM，或约40-59、41-59、42-59、43-59、44-59、45-59、46-59、47-59、48-59、49-59、50-59、51-59、52-59、53-59、54-59、55-59、56-59、57-59、58-59mM，或约40-58、41-58、42-58、43-58、44-58、45-58、46-58、47-58、48-58、49-58、50-58、51-58、52-58、53-58、54-58、55-58、56-58、57-58mM，或约40-57、41-57、42-57、43-57、44-57、45-57、46-57、47-57、48-57、49-57、50-57、51-57、52-57、53-57、54-57、55-57、56-57mM，或约40-56、41-56、42-56、43-56、44-56、45-56、46-56、47-56、48-56、49-56、50-56、51-56、52-56、53-56、54-56、55-56mM，或约40-55、41-55、42-55、43-55、44-55、45-55、46-55、47-55、48-55、49-55、50-55、51-55、52-55、53-55、54-55mM，或约40-54、41-54、42-54、43-54、44-54、45-54、46-54、47-54、48-54、49-54、50-54、51-54、52-54、53-54mM，或约40-53、41-53、42-53、43-53、44-53、45-53、46-53、47-53、48-53、49-53、50-53、51-53、52-53mM，或约40-52、41-52、42-52、43-52、44-52、45-52、46-52、47-52、48-52、49-52、50-52、51-52mM，或约40-51、41-51、42-51、43-51、44-51、45-51、46-51、47-51、48-51、49-51、50-51mM，或约40-50、41-50、42-50、43-50、44-50、45-50、46-50、47-50、48-50、49-50mM，或约40-49、41-49、42-49、43-49、44-49、45-49、46-49、47-49、48-49mM，或约40-48、41-48、42-48、43-48、44-48、45-48、46-48、47-48mM，或约40-47、41-47、42-47、43-47、44-47、45-47、46-47mM，或约40-46、41-46、42-46、43-46、44-46、45-46mM，或约40-45、41-45、42-45、43-45、44-45mM，或约40-44、41-44、42-44、43-44mM，或约40-43、41-43、42-43mM，或约40-42、41-42mM，或约40-42mM。
在一些实施方案中，所述组合物包含具有以下浓度的缓冲剂：约0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mM，包括其间的所有范围。
在一些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的组合物，所述缓冲剂的存在改变(例如，提高、增加、降低、减少)所述HRS多肽的一种或多种生物化学、物理和/或药代动力学特性。
例如，在某些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽具有增加的生物活性。示例性活性包括本文描述的任何非经典活性如抗炎活性和其他生物活性，包括抗体结合(例如，结合抗-Jo-1抗体)。在一些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，所述缓冲剂中的HRS多肽具有的生物活性要大至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在具体的方面，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
在某些实施方案中，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽具有增加的“稳定性”(例如，通过半衰期所测)，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要大至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在具体的方面，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
在一些实施方案中，所述HRS多肽的“稳定性”包括其“功能稳定性”，或者所述HRS多肽的至少一种生物活性在给定的条件组下随时间降低的速率。示例性生物活性包括本文描述的经典的或非经典活性的任何一种或多种，包括例如，保留了与抗-Jo-1抗体特异性交叉反应的至少一个表位。在一些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽的生物活性降低的速率要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在具体的方面，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
在某些实施方案中，所述HRS多肽的“稳定性”包括其“动力学稳定性”或“热稳定性”，包括其在给定的条件组下随时间解折叠、聚集或沉淀的速率。在某些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽解折叠、聚集或沉淀的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽解折叠、聚集或沉淀的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽的解链温度，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽具有的解链温度(Tm)要大至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在一些实施方案中，相比在没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽具有的熔解温度(Tm)要高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。在具体的方面，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
在一些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述缓冲剂存在下所述HRS多肽具有提高的或增加的同质性或单分散性(例如，单体/寡聚体的比率、二聚体/寡聚体的比率、单体/二聚体的比率、二聚体/单体的比率、在还原条件下链间形成二硫键的比率、表观分子量分布，包括降低的高分子量和/或低分子量峰，如通过SDS-PAGE或HPLC分析所测的)。在一些实施方案中，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，所述HRS多肽在所述缓冲剂中的同质性或单分散性增加为至少约至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍大，或者增加了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在具体的方面，所述缓冲剂是pH范围为约pH7.0至约pH7.5的组氨酸缓冲剂，或者pH范围为约pH7.5至约pH6.5的柠檬酸盐缓冲剂。
在某些实施方案中，所述HRS多肽组合物在组氨酸或柠檬酸盐缓冲剂存在下具有通过SE-HPLC分析测量的降低的高分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些方面，于37℃储存2天后，通过SE-HPLC分析测得所述HRS组合物具有的高分子量峰含量小于主峰的约2％。在一些方面，于37℃储存2天后，所述HRS组合物具有的高分子量峰含量小于主峰的约1％。
在某些实施方案中，所述HRS多肽组合物在所述组氨酸或柠檬酸盐缓冲剂存在下具有降低的通过SE-HPLC分析测量的低分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者要低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，所述HRS多肽组合物在所述组氨酸或柠檬酸盐缓冲剂存在下具有降低的浑浊度(A340)，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有该缓冲剂或具有不同缓冲剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些方面，所述HRS组合物包含约pH7.0-7.5的组氨酸缓冲剂，且于37℃储存2天后具有小于约0.5的浑浊度(A340)。在具体的方面，所述HRS组合物于37℃储存2天后具有的浑浊度(A340)小于约0.05。在一些方面，所述HRS组合物包含约pH7.0-7.5的柠檬酸盐缓冲剂，且于37℃储存2天后其具有的浑浊度(A340)小于约0.5。在具体的方面，所述HRS组合物于37℃储存2天后具有的浑浊度(A340)小于约0.05。
在某些实施方案中，所述组合物(例如，在所述缓冲试剂或缓冲剂存在下)的pH为约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或约8.0。在一些实施方案中，所述组合物的pH范围为：约6.0-6.1、6.0-6.2、6.0-6.3、6.0-6.4、6.0-6.5、6.0-6.6、6.0-6.7、6.0-6.8、6.0-6.9、6.0-7.0、6.0-7.1、6.0-7.2、6.0-7.3、6.0-7.4、6.0-7.5、6.0-7.6、6.0-7.7、6.0-7.8、6.0-7.9、6.0-8.0，或者约6.5-6.6、6.5-6.7、6.5-6.8、6.5-6.9、6.5-7.0、6.5-7.1、6.5-7.2、6.5-7.3、6.5-7.4、6.5-7.5、6.5-7.6、6.5-7.7、6.5-7.8、6.5-7.9、6.5-8.0，或者约7.0-7.1、7.0-7.2、7.0-7.3、7.0-7.4、7.0-7.5、7.0-7.6、7.0-7.7、7.0-7.8、7.0-7.9、7.0-8.0，或者约7.2-7.3、7.2-7.4、7.2-7.5、7.2-7.6、7.2-7.7、7.2-7.8、7.2-7.9、7.2-8.0，或者约7.4-7.5、7.4-7.6、7.4-7.7、7.4-7.8、7.4-7.9、7.4-8.0，或者约7.5-7.6、7.5-7.7、7.5-7.8、7.5-7.9、7.5-8.0，或者约7.6-7.7、7.6-7.8、7.6-7.9或7.6-8.0。
在一些实施方案中，相比具有的pH在以上范围之外的组合物，所述组合物或缓冲剂的pH改变(例如，提高、增加、降低、减少)所述HRS多肽的一种或多种生物化学、物理和/或药代动力学特性。在具体的实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸，且所述组合物的pH范围为约7.0-7.5。在其他实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂，且所述组合物的pH范围为约6.5-7.5。在其他实施方案中，所述缓冲剂是磷酸钠缓冲剂，且所述组合物的pH范围为约7.0-7.5。
例如，在某些实施方案中，包含(a)组氨酸缓冲剂和pH约7.0-7.5，(b)柠檬酸盐缓冲剂和pH约6.5-7.5，或(c)磷酸盐缓冲剂和pH约7.0-7.5的组合物中的所述HRS多肽，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物具有增加的生物活性。示例性活性包括任何本文描述的非经典活性如抗炎活性和其他生物活性，包括抗体结合(例如，结合抗-Jo-1抗体)。在一些实施方案中，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽，所述HRS多肽具有的生物活性为至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍大，或者大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，包含(a)组氨酸缓冲剂和pH约7.0-7.5，(b)柠檬酸盐缓冲剂和pH约6.5-7.5，或(c)磷酸盐缓冲剂和pH约7.0-7.5的组合物中的所述HRS多肽，具有增加的“稳定性”(例如，如通过半衰期所测的)，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽，其为至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍大，或者大至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，所述HRS多肽的“稳定性”包括其“功能稳定性”，或者所述HRS多肽的至少一种生物活性在给定的条件组下随时间降低的速率。示例性生物活性包括任何一种或多种本文描述的经典的或非经典活性，包括例如，保留了与抗-Jo-1抗体特异性交叉反应的至少一个表位。在一些实施方案中，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽，所述HRS多肽的生物活性降低的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，所述HRS多肽的“稳定性”包括其“动力学稳定性”或“热稳定性”，包括在给定的条件组下随时间解折叠的速率。在某些实施方案中，相比具有的pH在所述范围之外的可比较的组合物中的相应的HRS多肽，所述HRS多肽解折叠的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实施方案中，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽的解链温度，所述HRS多肽具有的熔解温度(Tm)要大至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在一些实施方案中，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽，所述HRS多肽具有的解链温度(Tm)要高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。
在一些实施方案中，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中相应的HRS多肽，所述HRS多肽具有改善的或提高的同质性或单分散性(例如，单体/寡聚体的比率、二聚体/寡聚体的比率、单体/二聚体的比率、二聚体/单体的比率、在还原条件下链间二硫键形成的比率、表观分子量的分布，例如通过SDS-PAGE或HPLC分析检测的降低的高分子量或低分子量峰)。在一些实施方案中，相比具有的pH于上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中相应的HRS多肽，所述HRS多肽的同质性或单分散性增加为至少约至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者增加了至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，在上述(a)、(b)或(c)的pH范围内的所述HRS多肽组合物具有通过SE-HPLC分析测量的降低的高分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比具有的pH在上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，在上述(a)、(b)或(c)的pH范围内的所述HRS多肽组合物具有通过SE-HPLC分析测量的降低的低分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比具有的pH在上述(a)、(b)或(c)中所述范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，在上述(a)、(b)或(c)的pH范围内的所述HRS多肽组合物具有降低的浑浊度(A340)，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比具有的pH在上述(a)、(b)或(c)所述的pH范围之外的可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，组合物具有确定的离子强度，例如，确定的氯化钠(NaCl)或其他盐的浓度。例如，组合物可具有约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400mM NaCl或其他盐，包括其间的所有整数和范围。在一些实施方案中，组合物具有约50-300、100-300、150-300、200-300、250-300、50-250、100-250、150-250、200-250、50-200、100-200、150-200、50-150、100-150或50-100mM NaCl或其他盐。在某些实施方案中，所述组合物具有高盐浓度，例如，约或≥约140mM NaCl、约或≥约280mM NaCl。
在一些实施方案中，相比没有NaCl的组合物，或相比具有的NaCl浓度在上述量或范围以外的组合物，以这些浓度或范围的任何一种或多种存在的NaCl改变(例如，提高、增加、降低、减少)所述HRS多肽的一种或多种生物化学、物理和/或药代动力学特性。在某些实施方案中，相比没有确定浓度的NaCl的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在确定浓度的NaCl存在下所述HRS多肽解折叠、聚集或沉淀的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有NaCl或具有的NaCl浓度在上述量或范围以外的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在NaCl存在下所述HRS多肽解折叠、聚集或沉淀的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，相比没有确定浓度的NaCl的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽的解链温度，在确定浓度的NaCl存在下所述HRS多肽具有的解链温度(Tm)要高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在一些实施方案中，相比没有确定浓度的NaCl或具有的NaCl浓度在上述量或范围以外的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在确定浓度的NaCl存在下所述HRS多肽具有的熔解温度(Tm)要高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。在某些实施方案中，所述组合物还包含以上所述的缓冲剂。在具体的实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。在其他实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。
在某些实施方案中，所述HRS多肽组合物具有的NaCl浓度约140mM至约240mM，且具有通过SE-HPLC分析测量的降低的高分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有NaCl的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些方面，所述HRS组合物包含约140mM至约280mM NaCl、pH约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂，且于37℃储存2天后通过SE-HPLC分析测得其具有的高分子量峰含量小于主峰的约2％。在特定的方面，于37℃储存2天后所述HRS组合物具有的高分子量峰含量小于主峰的约1％。
在某些实施方案中，所述HRS多肽组合物具有浓度为约140mM至约240mM的NaCl，且具有通过SE-HPLC分析测量的降低的低分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有NaCl或具有的NaCl浓度在约140mM至约240mM以外的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，所述HRS多肽组合物具有范围约140mM至约240mM的NaCl浓度，且具有降低的浑浊度(A340)，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有NaCl或具有的NaCl浓度在约140mM至约240mM以外的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些方面，所述HRS组合物包含约140mM至约280mM NaCl、具有的pH为约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂，且于37℃储存2天后其具有的浑浊度(A340)小于约0.5。在特定的方面，所述HRS组合物于37℃储存2天后其具有的浑浊度(A340)小于约0.05。
在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。示例性赋形剂包括但不限于，蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、精氨酸、甘氨酸和甘油。在某些实施方案中，所述赋形剂存在的浓度为：约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％或10％(w/v)，包括其间的所有范围。在一些实施方案中，所述赋形剂存在的范围为：约0.1％-5.0％、0.1％-4.5％、0.1％-4.0％、0.1％-3.5％、0.1％-3.0％、0.1％-2.5％、0.1％-2.0％、0.1％-1.5％、0.1％-1.0％、0.1％-0.5％(w/v)，或者范围为：约0.2％-5.0％、0.2％-4.5％、0.2％-4.0％.0.2％-3.5％、0.2％-3.0％、0.2％-2.5％、0.2％-2.0％、0.2％-1.5％、0.2％-1.0％、0.2％-0.5％(w/v)，或者范围为：约0.5％-5.0％、0.5％-4.5％、0.5％-4.0％.0.5％-3.5％、0.5％-3.0％、0.5％-2.5％、0.5％-2.0％、0.5％-1.5％、0.5％-1.0％(w/v)，或者范围为：约1.0％-5.0％、1.0％-4.5％、1.0％-4.0％.1.0％-3.5％、1.0％-3.0％、1.0％-2.5％、1.0％-2.0％、1.0％-1.5％(w/v)，或者范围为：约1.5％-5.0％、1.5％-4.5％、1.5％-4.0％.1.5％-3.5％、1.5％-3.0％、1.5％-2.5％、1.5％-2.0％(w/v)，或者范围为：约2.0％-5.0％、2.0％-4.5％、2.0％-4.0％、2.0％-3.5％、2.0％-3.0％、2.0％-2.5％(w/v)，或者范围为：约2.5.0％-5.0％、2.5％-4.5％、2.5％-4.0％.2.5％-3.5％、2.5％-3.0％(w/v)，或者范围为：约3.0％-5.0％、3.0％-4.5％、3.0％-4.0％.3.0％-3.5％(w/v)，或者范围为：约3.5％-5.0％、3.5％-4.5％、3.5％-4.0％(w/v)，或者范围为：约4.0％-5.0％、4.0％-4.5％或4.5％-5.0％(w/v)。在一些实施方案中，所述赋形剂存在的浓度为约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400mM，包括其间的所有范围。在一些实施方案中，所述赋形剂以如下范围的浓度存在：约50-400、100-400、150-400、200-400、250-400、300-400、350-400、50-350、100-350、150-350、200-350、250-350、300-350、50-300、100-300、150-300、200-300、250-300、50-250、100-250、150-250、200-250、50-200、100-200、150-200、50-150、100-150或50-100mM。
在一些实施方案中，相比没有所述赋形剂的组合物，或者相比具有的赋形剂浓度在上述量或范围之外的组合物，一种或多种赋形剂的存在改变(例如，提高、增加、降低、减少)所述HRS多肽的一种或多种生物化学、物理和/或药代动力学特性。在某些实施方案中，相比没有所述赋形剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述赋形剂存在下所述HRS多肽解折叠的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实施方案中，相比没有所述赋形剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽的解链温度，在所述赋形剂存在下所述HRS多肽具有的解链温度(Tm)要高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在一些实施方案中，相比没有所述赋形剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述赋形剂存在下所述HRS多肽具有的熔解温度(Tm)要高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。在某些实施方案中，所述组合物还包含如上所述的缓冲剂，以及任选地具有如上所述的确定浓度的NaCl。在具体的实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。在其他实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。
在某些实施方案中，组合物包含一种或多种表面活性剂。示例性表面活性剂，包括但不限于，聚山梨醇酯和泊洛沙姆。聚山梨醇酯是源自PEG化山梨聚糖(山梨醇衍生物)的油性液体，其被用脂肪酸酯化。一些聚山梨醇酯以商标名AlkestTM、CanarcelTM和TweenTM出售。示例性聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单硬脂酸酯)和聚山梨醇酯80(聚氧乙烯(20)山梨醇单油酸酯)。泊洛沙姆是非离子型三嵌段共聚物，其包含侧面连接有两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中心疏水链。一些泊洛沙姆以商标名SynperonicsTM、PluronicsTM和KolliphorTM出售。在某些实施方案中，所述表面活性剂存在的浓度为：约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3.0％(w/v)，包括其间的所有范围。在一些实施方案中，所述表面活性剂存在的范围为：约0.01％-3.0％、0.01％-2.5％、0.01％-2.0％、0.01％-1.5％、0.01％-1.0％、0.01％-1.5％、0.01％-1.0％、0.01％-0.5％、0.01％-0.1％(w/v)，或者范围为：约0.05％-3.0％、0.05％-2.5％、0.05％-2.0％、0.05％-1.5％、0.05％-1.0、0.05％-1.5％、0.05％-1.0％、0.05％-0.5％、0.05％-0.1％(w/v)，或者范围为：约0.1％-3.0％、0.1％-2.5％、0.1％-2.0％、0.1％-1.5％、0.1％-1.0％、0.1％-1.5％、0.1％-1.0％、0.1％-0.5％(w/v)，或者范围为：约0.5％-3.0％、0.5％-2.5％、0.5％-2.0％、0.5％-1.5％、0.5％-1.0％、0.5％-1.5％、0.5％-1.0％(w/v)，或者范围为：约1.0％-3.0％、1.0％-2.5％、1.0％-2.0％、1.0％-1.5％(w/v)，或者范围为：约1.5％-3.0％、1.5％-2.5％、1.5％-2.0％(w/v)，或者范围为：约2.0％-3.0％、2.0％-2.5％(w/v)，或者范围为：约2.5％-3.0％(w/v)。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯20(PS20)。在某些实施方案中，所述表面活性剂为泊洛沙姆普朗尼克F68。
在一些实施方案中，相比没有所述表面活性剂的组合物，或者相比具有的表面活性剂浓度在上述量或范围之外的组合物，一种或多种表面活性剂的存在改变(例如，提高、增加、降低、减少)所述HRS多肽的一种或多种生物化学、物理和/或药代动力学特性。在某些实施方案中，相比没有所述表面活性剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述表面活性剂存在下所述HRS多肽解折叠、聚集或沉淀的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有所述表面活性剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述表面活性剂存在下所述HRS多肽解折叠、聚集或沉淀的速率要慢至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍，或者慢至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，相比没有所述表面活性剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽的解链温度，在所述表面活性剂存在下所述HRS多肽具有的解链温度(Tm)要高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在一些实施方案中，相比没有所述表面活性剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，在所述表面活性剂存在下所述HRS多肽具有的解链温度(Tm)要高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。在某些实施方案中，所述组合物还包含如上所述的缓冲剂，并且任选地具有如上所述的确定浓度的NaCl，且任选地包含一种或多种如上所述的表面活性剂。在具体的实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。在其他实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。
在某些实施方案中，在所述表面活性剂存在下所述HRS多肽组合物具有通过SE-HPLC分析测量的降低的高分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有所述表面活性剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些方面，所述HRS组合物包含PS20、具有的pH为约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂和约140mM NaCl，且于37℃储存7天后通过SE-HPLC分析测得其具有的高分子量峰含量小于主峰的约1％。在一些方面，所述HRS组合物于37℃储存7天后其具有的高分子量峰含量小于主峰的约0.5％。
在一些方面，所述HRS组合物包含PS80、具有的pH为约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂和约140mM NaCl，且于37℃储存7天后通过SE-HPLC分析测得其具有的高分子量峰含量小于主峰的约2％。在一些方面，所述HRS组合物于37℃储存7天后其具有的高分子量峰含量小于主峰的约0.5％。
在一些方面，所述HRS组合物包含普朗尼克F68、具有的pH为约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂和约140mM NaCl，且于37℃储存7天后通过SE-HPLC分析测得其具有的高分子量峰含量小于主峰的约1％。在一些方面，所述HRS组合物于37℃储存7天后其具有的高分子量峰含量小于主峰的约0.5％。
在某些实施方案中，在所述表面活性剂存在下所述HRS多肽组合物具有通过SE-HPLC分析测量的降低的低分子量峰，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有所述表面活性剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在某些实施方案中，所述表面活性剂中的所述HRS多肽组合物具有降低的浑浊度(A340)，当于约5℃或约室温(例如，～20-25℃)或约37℃孵育约或至少约3小时，或者约或至少约3天，或者约或至少约7天时，相比没有所述表面活性剂的其他相同或可比较的组合物中的相应HRS多肽，其要低至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，或者低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些方面，所述HRS组合物包含PS20、具有的pH为约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂和约140mM NaCl，且于37℃储存7天后其具有的浑浊度(A340)小于约0.5。在一些方面，所述HRS组合物于37℃储存7天后具有的浑浊度(A340)小于约0.2。
在一些方面，所述HRS组合物包含PS80、具有的pH为约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂和约140mM NaCl，且于37℃储存7天后具有的浑浊度(A340)小于约0.5。在一些方面，所述HRS组合物于37℃储存7天后具有的浑浊度(A340)小于约0.2。
在一些方面，所述HRS组合物包含普朗尼克F68、具有的pH为约7.0-7.5的组氨酸缓冲剂和约140mM NaCl，且于37℃储存7天后其具有的浑浊度(A340)小于约0.5。在一些方面，所述HRS组合物于37℃储存7天后具有的浑浊度(A340)小于约0.2。
在某些实施方案中，组合物包含一种或多种抗氧化性化合物。示例性抗氧化剂包括但不限于，半胱氨酸、蛋氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽、维生素E、胡萝卜素、泛醌和抗坏血酸。在一些实施方案中，所述抗氧化性化合物存在的浓度为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10mM，包括其间的所有范围。在一些实施方案中，所述抗氧化剂化合物以如下范围的浓度存在：约0.1-5.0、0.1-4.5、0.1-4.0.0.1-3.5、0.1-3.0、0.1-2.5、0.1-2.0、0.1-1.5、0.1-1.0、0.1-0.5mM，或者浓度范围为约0.2-5.0、0.2-4.5、0.2-4.0.0.2-3.5、0.2-3.0、0.2-2.5、0.2-2.0、0.2-1.5、0.2-1.0、0.2-0.5mM，或者浓度范围为约0.5-5.0、0.5-4.5、0.5-4.0.0.5-3.5、0.5-3.0、0.5-2.5、0.5-2.0、0.5-1.5、0.5-1.0mM，或者浓度范围为约1.0-5.0、1.0-4.5、1.0-4.0.1.0-3.5、1.0-3.0、1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5mM，或者浓度范围为约1.5-5.0、1.5-4.5、1.5-4.0.1.5-3.5、1.5-3.0、1.5-2.5、1.5-2.0mM，或者浓度范围为约2.0-5.0、2.0-4.5、2.0-4.0.2.0-3.5、2.0-3.0、2.0-2.5mM，或者浓度范围为约2.5.0-5.0、2.5-4.5、2.5-4.0.2.5-3.5、2.5-3.0mM，或者浓度范围为约3.0-5.0、3.0-4.5、3.0-4.0.3.0-3.5mM，或者浓度范围为约3.5-5.0、3.5-4.5、3.5-4.0mM，或者浓度范围为约4.0-5.0、4.0-4.5或4.5-5.0mM。
在一些实施方案中，所述组合物包含螯合剂。示例性螯合剂，包括但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)。在某些实施方案中，所述螯合剂存在的浓度为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0mM，包括其间的所有范围。在一些实施方案中，所述螯合剂以如下范围的浓度存在：约0.1-5.0、0.1-4.5、0.1-4.0.0.1-3.5、0.1-3.0、0.1-2.5、0.1-2.0、0.1-1.5、0.1-1.0、0.1-0.5mM，或者浓度范围为约0.2-5.0、0.2-4.5、0.2-4.0.0.2-3.5、0.2-3.0、0.2-2.5、0.2-2.0、0.2-1.5、0.2-1.0、0.2-0.5mM，或者浓度范围为约0.5-5.0、0.5-4.5、0.5-4.0.0.5-3.5、0.5-3.0、0.5-2.5、0.5-2.0、0.5-1.5、0.5-1.0mM，或者浓度范围为约1.0-5.0、1.0-4.5、1.0-4.0.1.0-3.5、1.0-3.0、1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5mM，或者浓度范围为约1.5-5.0、1.5-4.5、1.5-4.0.1.5-3.5、1.5-3.0、1.5-2.5、1.5-2.0mM，或者浓度范围为约2.0-5.0、2.0-4.5、2.0-4.0.2.0-3.5、2.0-3.0、2.0-2.5mM，或者浓度范围为约2.5.0-5.0、2.5-4.5、2.5-4.0.2.5-3.5、2.5-3.0mM，或者浓度范围为约3.0-5.0、3.0-4.5、3.0-4.0.3.0-3.5mM，或者浓度范围为约3.5-5.0、3.5-4.5、3.5-4.0mM，或者浓度范围为约4.0-5.0、4.0-4.5或4.5-5.0mM。
在一些实施方案中，组合物和/或其中包含的所述HRS多肽特征在于，一种或多种绝对的物理特性如高分子量聚集(或聚集体形成)的程度、外观或澄清度(例如，浑浊度、乳白光)、同质性或单分散性的程度、溶解度、蛋白纯度、熔解温度、蛋白浓度和/或蛋白片段化的程度。
在某些方面，相对于存在的蛋白总量，组合物具有的聚集体含量为约或小于约10％，或者在一些实施方案中，组合物具有的聚集体含量为约或小于约9％、8％、7％、6％或5％，或者在某些方面，组合物具有的聚集体含量为约或小于约4％、3％或2％，或者在具体方面，组合物具有的聚集体含量为约或小于约1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％。在一些实施方案中，所述聚集体含量为高分子量的聚集体含量。高分子量的聚集体含量可通过各种分析技术来确定，包括例如，尺寸排阻层析(SE-HPLC)、动态光散射、SDS-PAGE分析和分析性超速离心。
在一些方面，组合物的外观是清澈的且缺乏明显的颗粒或纤维形成。组合物的澄清度可通过例如浑浊度、乳白光或两者来表征。浑浊度可通过A340处的吸光度测量，而乳白光可通过A580处的吸光度测量。在一些实施方案中，如通过A340处的吸光度所测，组合物的浑浊度为约或小于约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.09、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。在某些实施方案中，如通过在A580处的吸光度所测，组合物的乳白光为约或小于约1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.09、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。
在一些方面，组合物包含基本上均质或单分散性的一种或多种HRS多肽，意味着当例如通过尺寸排阻层析(SE-HPLC)、动态光散射、SDS-PAGE或分析性超速离心进行评估时，所述HRS多肽组合物基本上(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大)以一种表观分子量形式存在。在一些方面，所述HRS多肽基本上作为单体存在。在某些方面，所述HRS多肽基本上作为二聚体存在。在一些方面，这类组合物可包含DTT或其他合适的还原剂以降低二硫键的形成。
在某些实施方案中，所述HRS多肽具有的溶解度适合于特定给药形式，如静脉内给药、皮下给药等。合适的溶解度的实例包括约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8或9mg/ml，或者约或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24mg/ml，或者约或至少约25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49mg/ml，或者约或至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60mg/ml。
在一些方面，组合物具有的基于蛋白(例如，HRS多肽相对于其他细胞蛋白)的纯度为约或至少约90％，或者在某些方面，其具有的基于蛋白的纯度为约或至少约95％、96％、97％或98％，或者在某些方面，其具有的基于蛋白的纯度为约或至少约99％或99.5％。可通过本领域所知的任何常规分析方法来测定纯度。
在一些方面，所述HRS多肽在给定的组合物中具有确定的稳定性，其以例如解链温度(Tm)来表征。在一些方面，所述HRS多肽在组合物中具有的Tm为约或至少约45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃。在某些方面，所述HRS多肽在组合物中具有的Tm范围为：约45-70、46-70、47-70、48-70、49-70、50-70、51-70、52-70、53-70、54-70、55-70、56-70、57-70、58-70、59-70、60-70、61-70、62-70、63-70、64-70、65-70、66-70、67-70、68-70或69-70℃，或者范围为：约45-69、46-69、47-69、48-69、49-69、50-69、51-69、52-69、53-69、54-69、55-69、56-69、57-69、58-69、59-69、60-69、61-69、62-69、63-69、64-69、65-69、66-69、67-69、68-69℃，或者范围为：约45-68、46-68、47-68、48-68、49-68、50-68、51-68、52-68、53-68、54-68、55-68、56-68、57-68、58-68、59-68、60-68、61-68、62-68、63-68、64-68、65-68、66-68、67-68℃，或者范围为：约45-67、46-67、47-67、48-67、49-67、50-67、51-67、52-67、53-67、54-67、55-67、56-67、57-67、58-67、59-67、60-67、61-67、62-67、63-67、64-67、65-67、66-67℃，或者范围为：约45-66、46-66、47-66、48-66、49-66、50-66、51-66、52-66、53-66、54-66、55-66、56-66、57-66、58-66、59-66、60-66、61-66、62-66、63-66、64-66、65-66℃，或者范围为：约45-65、46-65、47-65、48-65、49-65、50-65、51-65、52-65、53-65、54-65、55-65、56-65、57-65、58-65、59-65、60-65、61-65、62-65、63-65、64-65℃，或者范围为：约45-64、46-64、47-64、48-64、49-64、50-64、51-64、52-64、53-64、54-64、55-64、56-64、57-64、58-64、59-64、60-64、61-64、62-64、63-64℃，或者范围为：约45-63、46-63、47-63、48-63、49-63、50-63、51-63、52-63、53-63、54-63、55-63、56-63、57-63、58-63、59-63、60-63、61-63、62-63℃，或者范围为：约45-62、46-62、47-62、48-62、49-62、50-62、51-62、52-62、53-62、54-62、55-62、56-62、57-62、58-62、59-62、60-62、61-62℃，或者范围为：约45-61、46-61、47-61、48-61、49-61、50-61、51-61、52-61、53-61、54-61、55-61、56-61、57-61、58-61、59-61、60-61℃，或者范围为：约45-60、46-60、47-60、48-60、49-60、50-60、51-60、52-60、53-60、54-60、55-60、56-60、57-60、58-60、59-60℃，或者范围为：约45-59、46-59、47-59、48-59、49-59、50-59、51-59、52-59、53-59、54-59、55-59、56-59、57-59、58-59℃，或者范围为：约45-58、46-58、47-58、48-58、49-58、50-58、51-58、52-58、53-58、54-58、55-58、56-58、57-58℃，或者范围为：约45-57、46-57、47-57、48-57、49-57、50-57、51-57、52-57、53-57、54-57、55-57、56-57℃，或者范围为：约45-56、46-56、47-56、48-56、49-56、50-56、51-56、52-56、53-56、54-56、55-56℃，或者范围为：约45-55、46-55、47-55、48-55、49-55、50-55、51-55、52-55、53-55、54-55℃，或者范围为：约45-54、46-54、47-54、48-54、49-54、50-54、51-54、52-54、53-54℃，或者范围为：约45-53、46-53、47-53、48-53、49-53、50-53、51-53、52-53℃，或者范围为：约45-52、46-52、47-52、48-52、49-52、50-52、51-52℃，或者范围为：约45-51、46-51、47-51、48-51、49-51、50-51℃，或者范围为：约45-50、46-50、47-50、48-50、49-50℃，或者范围为：约45-49、46-49、47-49、48-49℃，或者范围为：约45-48、46-48、47-48、45-47、46-47或45-46℃。可通过各种分析方法，包括例如差示扫描荧光分析(DSF)来确定解链温度。
在一些方面，所述HRS多肽以确定的蛋白浓度存在于组合物中。例如，某些组合物具有的所述HRS多肽的浓度为：约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/ml。一些组合物具有的所述HRS多肽的浓度范围为：约5-100、10-100、15-100、20-100、25-100、30-100、35-100、40-100、45-100、50-100、55-100、60-100、70-100、80-100、90-100mg/ml，或者为约5-90、10-90、15-90、20-90、25-90、30-90、35-90、40-90、45-90、50-90、55-90、60-90、70-90、80-90mg/ml，或者为约5-80、10-80、15-80、20-80、25-80、30-80、35-80、40-80、45-80、50-80、55-80、60-80、70-80mg/ml，或者为约5-70、10-70、15-70、20-70、25-70、30-70、35-70、40-70、45-70、50-70、55-70、60-70mg/ml，或者为约5-60、10-60、15-60、20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60mg/ml，或者为约5-50、10-50、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50mg/ml，或者为约5-45、10-45、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45mg/ml，或者为约5-40、10-40、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40mg/ml，或者为约5-35、10-35、15-35、20-35、25-35、30-35mg/ml，或者为约5-30、10-30、15-30、20-30、25-30mg/ml，或者为约5-25、10-25、15-25、20-25、5-20、10-20、15-20、5-15、10-15或5-10mg/ml的蛋白。
在某些方面，相对于存在的蛋白的总量，组合物具有的蛋白片段化程度为小于约10％；或者在一些实施方案中，组合物具有的蛋白片段化程度为小于约9％、8％、7％、6％或5％；或者在某些方面，组合物具有的蛋白片段化程度为小于约4％、3％或2％；或者在特定方面，组合物具有的蛋白片段化程度为小于约1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％。可通过各种分析技术测量蛋白片段化，包括例如，尺寸排阻层析、SDS-PAGE分析和分析性超速离心。
在具体的实施方案中，所述治疗组合物包含任选地浓度为至少约10-50mg/ml的至少一种基本上纯的HRS多肽、约40-50mM组氨酸(例如，L-组氨酸)、约140-240mM NaCl、约1-2％海藻糖、约0.20-0.05％聚山梨醇酯20(PS20)，其具有的pH约7.0-7.5且基本上无内毒素。在一些方面，所述治疗组合物的特征在于，在37℃储存7天后通过SE-HPLC分析测得其高分子量峰含量小于主峰的约1％。在一些方面，所述治疗组合物于37℃储存7天后通过SE-HPLC分析测得其具有的高分子量峰含量小于主峰的约0.5％。在一些方面，所述治疗组合物的特征在于，于37℃储存7天后其具有的浑浊度(A340)小于约0.5。在一些方面，所述治疗组合物于37℃储存7天后具有的浑浊度(A340)小于约0.2。
在其他实施方案中，所述组合物包含任选地浓度为至少约10-50mg/ml的至少一种基本上纯的HRS多肽、约40-50mM组氨酸(例如，L-组氨酸)、约140-240mM NaCl、约1-2％蔗糖、约0.01-0.05％聚山梨醇酯20(PS20)，其具有pH约7.3且基本上无内毒素。在一些方面，所述治疗组合物的特征在于，在37℃储存7天后通过SE-HPLC分析测得其高分子量峰含量小于主峰的约1％。在一些方面，于37℃储存7天后，通过SE-HPLC分析测得所述治疗组合物具有的高分子量峰含量小于主峰的约0.5％。在一些方面，所述治疗组合物的特征在于，于37℃储存7天后其具有的浑浊度(A340)小于约0.5。在一些方面，于37℃储存7天后，所述治疗组合物具有的浑浊度(A340)小于约0.2。
在某些实施方案中，所述HRS多肽包含、由或基本上由SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列或者列举于或衍生自表1-9的任一序列的HRS多肽(包括它们的变体)组成。在一些实施方案中，所述HRS多肽是HRS(1-506)或HRS(2-506)或其变体，且在所述组合物具有的Tm为至少约58、59、60或61℃。
本文描述的HRS多肽组合物的生物化学、物理和/或药代动力学特性可在任何确定的条件组如温度、pH或其他条件下表征，且任选地在任何给定的时间或在一段时间内表征。例如，在某些实施方案中，这类特性在以下温度下表征：约-80、-60、-40、-20、-10、-5、-4、-3、-20、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100℃，包括期间的所有整数和范围。在一些实施方案中，这类特性在约室温(例如，20-25℃)下表征。这类特性也可在一段时间内表征，例如，在以下时间内：约0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者约0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或24周，或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月左右。在一些实施方案中，这类特性可在将所述组合物冻融至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次以后进行表征。
药物组合物可包含HRS多肽的药学上可接受的盐。关于合适的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(Wiley-VCH,2002)。合适的碱盐由形成无毒性盐的碱形成。代表性实例包括铝、精氨酸、苄星青霉素、钙、胆碱、二乙胺、二醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、醇胺、钾、钠、氨丁三醇和锌的盐。也可形成酸和碱的半盐，例如，半硫酸盐和半钙盐。用于本发明中的适于肠胃外给药的组合物可包含药学活性成分的无菌水溶液和/或悬浮液，优选其与受体的血液等渗，通常使用氯化钠、甘油、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。适于形成药学上可接受的酸加成盐的有机酸包括，例如而不限于，乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、草酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、烷基磺酸(例如、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸等)、芳基磺酸(例如、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸等)、4-甲基二环(2.2.2)-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等。
在具体的实施方案中，所述载体可包括水。在一些实施方案中，所述载体可为盐的水溶液，例如，含水的生理浓度的钠、钾、钙、镁，以及生理pH的氯化物。在一些实施方案中，所述载体可为水，且该制剂还可包含NaCl。在一些实施方案中，所述制剂可为等渗的。在一些实施方案中，所述制剂可为低渗的。在其他实施方案中，所述制剂可为高渗的。在一些实施方案中，所述制剂可为等渗压的。在一些实施方案中，所述制剂基本上无聚合物(例如，形成凝胶的聚合物、聚合物粘性增强剂等)。在一些实施方案中，所述制剂基本上无粘性增强剂(例如，羧甲基纤维素、聚阴离子聚合物等)。在一些实施方案中，所述制剂基本上无形成凝胶的聚合物。在一些实施方案中，所述制剂的粘度与含有相同浓度的HRS多肽(或其药学上可接受的盐)的盐溶液的粘度大约相同。
在本发明的药物组合物中，配制药学上可接受的赋形剂和载体溶液为本领域技术人员熟知，如同将本文描述的特定组合物用于各种治疗方案的合适的给药和治疗方案，包括例如，经口、肠胃外、静脉内、鼻内和肌肉内给药和配制的研发。
在某些应用中，本文公开的药物组合物可经口给药而递送至对象。因此，这些组合物可与惰性稀释剂或与可吸收食用的载体一起配制，或者它们可被包封于硬或软壳明胶胶囊中，或者它们可被压制成片剂，或者它们可直接掺入至膳食中。
适于递送HRS多肽的药物组合物及其制备方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这类组合物及其制备方法可参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,第19版(Mack Publishing Company,1995)。
可通过医药领域中任何合适的已知方法给予治疗剂量的HRS多肽，包括例如，经口、直肠、鼻内、肠胃外给药，包括玻璃体内、结膜下、眼球筋膜囊下、眼球后、脉络膜上腔静脉、动脉内、腹膜内、鞘膜内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、局部和皮下。肠胃外给药的合适装置包括针型(包括微针)注射器、无针注射器和输注技术。
肠胃外制剂通常为含水溶液，其可包含赋形剂如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3-9)，但对于某些应用，其可能更适合配制为无菌非含水溶液或干燥形式，以与合适的载体如无菌、基本上无热原或无热原的水一起使用。使用本领域技术人员熟知的标准制药技术可很容易地实现在无菌条件下制备肠胃外制剂，例如通过冻干法。
用于肠胃外给药的制剂可配制为即时释放和/或缓释制剂。缓释组合物包括延迟的、调整的、脉冲的、受控的、靶向的和程序化的释放。因此，HRS多肽可配制为悬浮液或固体、半固体或触变性液体，用于作为植入式储库(depot)给药以提供缓释的HRS多肽。这类制剂的实例包括但不限于，包含装载有药物的聚(DL-乳酸-乙醇酸共聚物)(PGLA)、聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)(PLG)或聚(丙交酯)(PLA)层状泡囊或微粒、水凝胶的药物涂层支架和半固体和悬浮液(Hoffman AS:Ann.N.Y.Acad.Sci.944:62-73(2001))、聚氨基酸纳米颗粒系统，如Flamel Technologies公司研发的Medusa系统、非含水凝胶系统如Atrix公司研发的Atrigel和Durect公司研发的SABER(蔗糖乙酸异丁酸酯缓释(Sucrose Acetate IsobutyrateExtended Release))，以及基于脂质的系统如SkyePharma研发的DepoFoam。
如上所述，活性化合物溶液作为游离碱或药学上可接受的盐可在水中与表面活性剂如羟丙基纤维素、聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)或普朗尼克F68恰当混合而制备。也可在甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物以及在油中制备分散剂。在储存和应用的常规条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂和用于即时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，特别地通过引用整体并入本文)。在所有情况下，所述形式应为无菌的，且其流动性应达到易于注射的程度。在生产和储存条件下其应为稳定的，且应保藏为防止微生物如细菌和真菌的污染行为。所述载体可包括溶剂或分散媒介，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和/或植物油。可维持恰当的流动性，例如，通过使用涂层如卵磷脂、通过在分散剂情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如，尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等来促进防止微生物作用。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。所述可注射组合物的延迟吸收可通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂例如，单硬脂酸铝和明胶来实现。
对于在水溶液中的肠胃外给药，例如，如需要，所述溶液应恰当地缓冲，且首先用足够的盐水或葡萄糖使得所述液体稀释剂为等渗的。这些具体的水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就这方面而言，鉴于本发明公开，可使用的无菌含水媒介为本领域技术人员所知。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗的NaCl溶液中，并添加至1000ml的皮下输液流体或在推荐的输注位点注射(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,第15版,pp.1035-1038和1570-1580)。根据受治疗的对象的状况，需要发生一些剂量上的变化。负责给药的人在任何事件中都应该确定用于单个对象的恰当剂量。而且，对于对人给药，制剂应满足FDA管理局的生物制品标准对无菌性、产热原性和一般安全性和纯度标准的要求。
无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需的量与以上列举的各种其他成分一起掺入至恰当的溶剂中来制备，如果需要，随后进行过滤除菌。通常，分散液是通过将各种无菌的活性成分掺入至含有基本分散媒介和所需的以上列举的其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生所述活性成分和来自此前的其无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。
本文公开的组合物可以中性或盐的形式配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(以蛋白的游离氨基形成)，且其以无机酸形成，例如，盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。以游离羧基形成的盐也可源自无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，以及有机碱如异丙基胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。配制后，溶液应以与剂量制剂相容的方式和治疗有效量给药。所述制剂容易以各种剂量形式如可注射溶液、药物释放胶囊等给药。
如本文所用，“载体”包括任何和所有的溶剂、分散媒介、载体、衣料、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、赋形剂、离子强度改性剂、表面活性剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。将这类媒介和试剂用于药物活性物质为本领域所熟知。除了在任何常规媒介或试剂与所述活性成分不相容的情况下，本文包括将其用于所述治疗组合物中。补充的活性成分也可掺入至所述组合物中。
词语“药学上可接受的”是指当给予至人时，不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。配制包含蛋白作为活性成分的含水组合物为本领域所熟知。通常，这类组合物被配制为可注射的液体溶液或悬浮液；也可制备为适于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。所述制剂也可被乳化。
配制制剂的方法为本领域所熟知且公开于例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第19版(1995)。本文提供的组合物和试剂可按照本发明的方法以任何治疗有效的给药方案给药。选择给药量和频率以确立所述试剂的有效水平而无有害作用。本发明化合物的有效量取决于给药途径、受治疗的温血动物类型和具体考虑的温血动物的身体特征。医学领域的熟练从业者熟悉这些因素和它们与确定该剂量之间关系。可对该给药量和方法进行调整以获得最佳效力，但应根据诸如体重、饮食、同时用药情况的因素以及医药领域技术人员应考虑的其他因素。
在某些实施方案中，所述药物组合物可通过鼻内喷雾、吸入和/或其他气溶胶递送载体来递送。通过鼻用气溶胶喷雾剂来直接将基因、多核苷酸和肽组合物递送至肺部的方法已经描述于例如，美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号(各自特别地通过引用整体并入本文)。同样，采用鼻内微粒树脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利第5,725,871号，特别地通过引用整体并入本文)递送药物也为医药领域所熟知。同样，以聚四氟乙烯载体基质的形式进行穿透粘膜的药物递送，描述于美国专利第5,780,045号(特别地通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，所述递送可采用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等来进行，以将本发明的组合物引入至合适的宿主细胞。尤其是，本发明的组合物可配制为包封于脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中进行递送。这类递送载体的配制和应用可采用已知的和常规技术来实施。
在某些实施方案中，本文提供的试剂可附着于药学上可接受的固体基底，包括生物相容性和生物可降解的基底如聚合物和基质。这类固体基底的实例，包括但不限于，聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)和LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、聚-D-(-)-3-羟基丁酸、胶原、金属、羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、生物陶瓷材料和纯化的蛋白。
在一个具体实施方案中，所述固体基底包含生物可降解的聚合物如以商标名出售的聚合物(QLT,Inc.,Vancouver,B.C.)。药物递送系统由溶解于生物相容性载体中的生物可降解的聚合物组成。可在生产时将药物混合至该液体递送系统中，或者根据产品可由医生在应用时后来加入。当所述液体产品被通过小的计量针注射至皮下空间或通过套管放入可接近的组织位点时，组织流体中的水使得聚合物沉淀并捕获固体植入物中的药物。然后，当聚合物基质随时间而生物降解时，包封于植入物内的药物以受控的方式释放。
在具体的实施方案中，当经口或静脉内给药时，试剂给予的HRS组合物的量范围通常为约0.1-100mg/kg/天的剂量，且通常为约0.1-10mg/kg。在具体的实施方案中，剂量为1mg/kg或5.0mg/kg。对于人，所用的每日剂量范围可为：约0.1mg/kg-0.5mg/kg、约1mg/kg-5mg/kg、约5mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-20mg/kg、约20mg/kg-30mg/kg、约30mg/kg-50mg/kg，以及约50mg/kg-100mg/kg/24小时。
在某些实施方案中，组合物或试剂以0.1-10mg/kg或0.5-15mg/kg的单一剂量给药。在其他实施方案中，组合物或试剂用于给药的剂量为：0.1-1mg/kg/天、0.5-2mg/kg/天，或5-20mg/kg/天，或约20-80mg/kg/天，或约80-150mg/kg/天。
在各种实施方案中，所述剂量为：约50-2500mg/天、100-2500mg/天、300-1800mg/天或500-1800mg/天。在一个实施方案中，所述剂量为约100-600mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量为约300-1200mg/天。在具体的实施方案中，所述组合物或试剂用于给药的剂量为：100mg/天、240mg/天、300mg/天、600mg/天、1000mg/天、1200mg/天或1800mg/天，每天一个或多个剂量(即，其中组合的剂量达到所需的每日剂量)。在相关的实施方案中，剂量为200mg每天两次、300mg每天两次、400mg每天两次、500mg每天两次、600mg每天两次或700mg每天两次、800mg每天两次、900mg每天两次，或1000mg每天两次。在各种实施方案中，所述组合物或试剂以单次给药或重复剂量给药。起始剂量和随后剂量可相同或不同。
在一些实施方案中，给药的总剂量可为：约0.001mg、约0.005mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、0.5mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约500mg、1,000mg、约2,000mg、约3,000mg、约4,000mg、约5,000mg、约6,000mg、约7,000mg、约8,000mg、约9,000mg、约10,000mg/给药间隔(例如，每24小时)。在一些实施方案中，所述给药间隔可为每天一次、两天一次、3天一次、4天一次、5天一次、每周一次或两周一次。对于几天或更长时间内的重复给药，根据疾病状态，保持治疗直到疾病症状发生了期望的抑制。通过常规方法和分析以及基于医生或其他本领域技术人员已知的标准可便利地监测这些和其他治疗(例如，离体治疗)的进展。
应进一步理解，对于缓释递送装置和组合物，根据该缓释系统的释放特性，包含在该递送系统中的HRS的总剂量应相应地更大。因此，旨在于5天时间内递送HRS多肽的缓释组合物或装置通常包含至少约5-10倍的HRS多肽的每日剂量；旨在于365天时间内递送HRS多肽的缓释组合物或装置通常包含至少约400-800倍的HRS多肽的每日剂量(当采用缓释系统给药时，取决于所述HRS多肽的稳定性和生物利用度)。
在某些实施方案中，组合物或试剂经静脉内给药，例如，通过在例如约10min-90min的时间内输注。在其他相关的实施方案中，组合物或试剂通过连续输注给药，例如，在一段时间内的剂量为约0.1-约10mg/kg/hr。尽管时间可以变化，在某些实施方案中，时间可为：约10min至约24hr或约10min至约3天。
在具体的实施方案中，有效量或治疗有效量是足以实现所述组合物或试剂在对象血浆中的总浓度的Cmax为约0.1μg/ml至约20μg/ml或约0.3μg/ml至约20μg/ml的量。在某些实施方案中，经口剂量为足以实现血浆浓度(Cmax)为约0.1μg/ml至约5μg/ml或约0.3μg/ml至约3μg/ml的量。在某些实施方案中，静脉内剂量为足以实现血浆浓度(Cmax)为约1μg/ml至约10μg/ml或约2μg/ml至约6μg/ml的量。在相关的实施方案中，对象血浆中试剂的总浓度具有小于约20μg/ml的平均谷浓度和/或小于约20μg/ml的稳态浓度。在又一个实施方案中，对象血浆中试剂的总浓度具有小于约10μg/ml的平均谷浓度和/或小于约10μg/ml的稳态浓度。
在又一个实施方案中，对象血浆中试剂的总浓度具有约1ng/ml至约10μg/ml的平均谷浓度和/或约1ng/ml至约10μg/ml的稳态浓度。在一个实施方案中，对象血浆中试剂的总浓度具有约0.3μg/ml至约3μg/ml的平均谷浓度和/或约0.3μg/ml至约3μg/ml的稳态浓度。
在具体的实施方案中，组合物或试剂以足够实现在哺乳动物中血浆浓度具有约1ng/ml至约10μg/ml的平均谷浓度和/或约1ng/ml至约10μg/ml的稳态浓度的量给药。在相关的实施方案中，所述试剂在哺乳动物血浆中的总浓度具有约0.3μg/ml至约3μg/ml的平均谷浓度和/或约0.3μg/ml至约3μg/ml的稳态浓度。
在本发明的具体实施方案中，组合物或试剂的有效量，或者组合物或试剂的血浆浓度达到或维持，例如至少15min、至少30min、至少45min、至少60min、至少90min、至少2hr、至少3hr、至少4hr、至少8hr、至少12hr、至少24hr、至少48hr、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少1年、至少2年或大于2年。
在某些实施方案中，用于给药的多肽量通常的范围为约0.1mg/kg至约15mg/kg或者至约15mg/kg至约50mg/kg患者体重。根据疾病的类型和严重性，约0.1μg/kg至约0.1mg/kg至约50mg/kg体重(例如，约0.1-15mg/kg/剂量)的多肽可为向患者给药的起始候选剂量，无论是例如，通过一次或多次的单独给药，还是通过连续输注。例如，给药方案可包括给予约4mg/kg的起始负荷剂量，然后给予每周维持剂量为约2mg/kg的所述多肽，或者为负荷剂量的约一半。然而，也可采用其他给药方案。通常每日剂量范围可为约0.1mg/kg至约20mg/kg至100mg/kg或更高，这取决于以上提到的因素。对于几天或更长时间内的重复给药，根据疾病状况，保持治疗直到疾病症状发生了期望的抑制。在具体的实施方案中，所述有效剂量实现了本文描述的组合物或试剂的血浆水平或平均谷浓度。这些可采用常规程序容易地确定。
在具体的实施方案中，所述有效剂量实现了本文描述的组合物或试剂的血浆水平或平均谷浓度。这些可采用常规程序容易地确定。
在一些实施方案中，所述组合物还可包含一种或多种佐剂，例如，当使用治疗性免疫原性组合物作为疫苗时。佐剂是非特异性地促进或增强免疫应答(例如，由CTL和辅助T(TH)细胞针对抗原介导的免疫应答)的物质，因而其被认为可用于本发明的治疗组合物。合适的佐剂，包括但不限于，1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或衍生自鞭毛蛋白的TLR5配体、FLT3配体、GM-C SF、IC30、IC31、咪喹莫特(ALDARA)、ImuFact IMP321、干扰素-α或-β或其PEG化衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOM、Juvlmmune、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、Montanide IMS1312、Montanide ISA206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、油包水和水包油型乳剂、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒颗粒和其他病毒样粒子、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂素的Aquila’sQS21刺激子、分枝杆菌提取物和合成的细菌细胞壁模拟物，以及其他受专利保护的佐剂如Ribi’s Detox、Quil或Superfos。优选佐剂如弗氏佐剂或GM-CSF。几种对树突状细胞具有特异性的免疫学佐剂(例如，MF59)及其制备此前已有描述(Dupuis M et al.1998；Allison1998)。也可使用细胞因子。几种细胞因子与如下直接相关：影响树突状细胞迁移至淋巴组织(例如，TNF-α)、加速树突状细胞成熟为针对T-淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利第5,849,589号，特别地通过引用整体并入本文)，且作为免疫佐剂起作用(例如，IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.1996)。
CpG免疫刺激性寡核苷酸也已经报道能促进在疫苗环境下的佐剂效果。不受理论的束缚，CpG寡核苷酸通过Toll-样受体(TLR)(主要为TLR9)激活先天性(非适应性)免疫系统而发挥作用。CpG诱导的TLR9激活促进了抗原特异性体液和细胞的响应，其针对多种抗原包括肽或蛋白抗原、活的或杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体的细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖缀合物。更重要的是，甚至在没有CD4辅助性T-细胞下，其促进树突状细胞成熟和分化，引起增强的TH1细胞活化和强细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)产生。甚至在通常促进TH2免疫偏倚的疫苗佐剂如明矾或不完全弗氏(Freund)佐剂(IFA)存在下，由TLR9激活诱导的TH1免疫偏倚仍被维持。当与其他佐剂一起配制或给药时，或者在制剂如微粒、纳米颗粒、脂质乳剂或类似制剂中，CpG寡核苷酸显示甚至更大的佐剂活性，当抗原相对弱时，尤其需要其来诱导强的响应。它们还促进免疫应答并使得抗原剂量降低约两个数量级，在一些实验中其具有与没有CpG的全剂量疫苗相当的抗体响应(Arthur M.Krieg,Nature Reviews,Drug Discovery,5,JUNE2006,471-484)。美国专利第6,406,705B1描述了组合应用CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原以诱导抗原特异性免疫应答。可商购的CpG TLR9拮抗剂为Mologen公司的dSLIM(双茎环免疫调节剂)(Berlin,Germany)，其为本发明的药物组合物的优选组分。也可使用其他TLR结合分子如结合RNA的TLR7、TLR8和/或TLR9。
其他有用的佐剂的实例，包括但不限于，化学修饰的CpG(例如，CpR,Idera)、Poly(I:C)如AmpliGen、非-CpG的细菌DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉菲尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4和SC58175，其可起治疗作用和/或作为佐剂。可用于本发明情况下的佐剂和添加剂的量和浓度可由本领域技术人员容易地确定而无需过多的实验。
组合治疗
本发明还包括组合治疗，其包括向患者给予治疗剂量的HRS多肽或抗体封闭试剂，并组合第二活性剂或装置或程序，以用于治疗自身免疫疾病、炎性疾病、肌营养不良症、横纹肌溶解症、恶病质和本文描述的其他疾病。在这种情况下“组合给药”是指：(1)相同的单一剂量形式的一部分；(2)单独给药(通常但不一定在同一天)，但作为相同的治疗计划或方案的一部分。
在这些组合治疗的某些方面，所述第二活性试剂选自：一种或多种抗-组胺、一种或多种抗炎剂、一种或多种抗肿瘤剂、一种或多种免疫抑制剂、一种或多种抗病毒剂、一种或多种抑制B细胞、阻止B细胞分化或激活记忆B细胞的试剂，或者一种或多种抗氧化剂。可与本发明的HRS多肽组合应用的药剂或治疗剂，包括但不限于，在美国专利第4,474,451号的第4-6栏和美国专利第4,327,725号的7-8栏中公开的那些。
抗组胺的实例包括但不限于，氯雷他定(Loradatine)、羟嗪、苯海拉明、氯苯那敏、溴苯那敏、赛庚啶、特非那定、氯马斯汀、苯丙烯啶、卡比沙明、二苯拉林、苯茚胺、阿扎他定、曲比那敏、右氯苯那敏、右溴苯那敏、甲地嗪、和三甲丙咪嗪(trimprazine)抗敏安、苯吡胺、吡拉明、氯环嗪(chiorcyclizine)、松齐拉敏，以及它们的衍生物。
抗肿瘤剂的实例包括但不限于，抗生物及其类似物(例如，阿克那霉素、放线菌素f1、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、6-重氮-5-氧代-L正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、伊达比星、美诺立尔、丝裂霉素、麦考酚酸，诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、吡柔比星、普卡霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、净司他丁、佐柔比星)；抗代谢物(例如，叶酸类似物(例如，二甲叶酸(denopterin)、伊达曲沙(edatrexate)、甲氨蝶呤、吡曲克辛、叠罗呤、三甲曲沙)；嘌呤类似物(例如，克拉屈滨、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(例如，环胞苷、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、乙嘧替氟、依诺他滨、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、替加氟(tagafur))。
抗炎剂的实例包括但不限于，甾体类抗炎剂和非-甾体类抗炎剂。示例性甾体类抗炎剂包括乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松、阿尔孕酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质脂酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德(desonide)、去羟米松、地塞米松、双氟拉松、双氟可龙、双氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟氢松醋酸酯、氟可汀丁酯、氟可龙、氟米龙、醋酸氟培龙、醋酸氟泼尼定、氟泼尼龙、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、福莫可他(formocortal)、哈西奈德、丙酸乌倍他索、卤米松、醋酸卤泼尼松、氢可他酯、氢化可的松、依碳酸氯替泼诺、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙、二乙基氨基醋酸泼尼松龙25、磷酸钠泼尼松龙、强的松、泼尼松龙戊酸酯(prednival)、泼尼立定、利美索龙、替可的松、去炎松、醋酸曲安奈德、苯曲安缩松(triamcinolonebenetonide)和己曲安缩松(triamcinolone hexacetonide)。
示例性非-甾体类抗炎剂包括氨基芳基羧酸衍生物(例如，苯乙氨茴酸(enfenamic acid)、依托芬那酯、氟芬那酸、异尼辛、甲氯芬那酸、甲灭酸、尼氟灭酸、他尼氟酯、特罗芬那酯(terofenamate)、托芬那酸)；芳基乙酸衍生物(例如，醋氯芬酸、阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、呱氨托美丁、溴芬酸、丁苯羟酸、桂美辛、氯吡酸、双氯芬酸钠、依托度酸、联苯乙酸、芬克洛酸、芬替酸、葡美辛、异丁芬酸、吲哚美辛、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、甲嗪酸、莫苯唑酸(mofezolac)、oxametacine、吡拉唑酸(pirazolac)、丙谷美辛、舒林酸、噻拉米特、托美丁、tropesin、佐美酸(zomepirac))；芳基丁酸衍生物(例如，丁丙二苯肼(bumadizon)、布替布芬(butibufen)、芬布芬(fenbufen)、联苯丁酸)；芳基羧酸(例如，环氯茚酸、酮咯酸、替诺立定(tinoridine))；芳基丙酸衍生物(例如，阿明洛芬、苯恶洛芬、柏莫洛芬、布氯酸、卡洛芬、非诺洛芬、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生(ibuproxam)、吲哚布洛芬、酮洛芬、氯索洛芬、萘普生、恶丙嗪、piketoprolen、吡洛芬、普拉洛芬、丙替嗪酸、舒洛芬、噻洛芬酸、希莫洛芬(ximoprofen)、扎托洛芬(zaltoprofen))；吡唑(例如，双苯咪唑、依匹唑)；吡唑酮(例如，阿扎丙宗、苄哌立隆(benzpiperylon)、菲普拉宗、莫非保松、吗拉宗、羟基保泰松、保泰松、哌布宗(pipebuzone)、异丙安替比林(propyphenazone)、雷米那酮、琥保松、噻唑丁炎酮)；水杨酸衍生物(例如，醋氨沙洛、阿司匹林、贝诺酯、溴水杨醇、乙酰水杨酸钙、二氟尼柳、依特柳酯、芬度柳、龙胆酸、水杨酸乙二醇酯、水杨酸咪唑、赖氨酸乙酰水杨酸、美沙拉嗪、水杨酸吗啉、1-萘基水杨酸、奥沙拉嗪、帕沙米特、乙酰水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、乙酰水杨酰胺、邻乙酸水杨酰胺、水杨酰硫酸酯、水杨酰水杨酸、柳氮磺胺吡啶)；噻嗪甲酰胺(例如，安吡昔康、屈恶昔康、伊索昔康、氯诺昔康，吡罗昔康、替诺昔康)；ε-乙酰氨基己酸、s-腺苷蛋氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗(emorfazone)、非普地醇、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥沙西罗、瑞尼托林(paranyline)、哌立索唑(perisoxal)、普罗喹宗(proquazone)、过氧化物歧化酶、替尼达普(tenidap)和齐留通(zileuton)。
免疫抑制剂的实例，包括但不限于，2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利第4,665,077号)；咪唑硫嘌呤；环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利第4,120,649号所描述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗-独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如糖皮质类固醇，例如强的松、甲基强的松龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体，抗肿瘤坏死因子-α抗体、抗肿瘤坏死因子-43抗体、抗-白细胞介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异源抗-淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，优选抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶性肽(WO90/08187，公开日为1990年7月26日)；链激酶；TGF-β；链球菌脱氧核糖核酸酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T-细胞受体(Cohen et al.,美国专利第5,114,721号)；T-细胞受体片段(Offner et al.,Science,251:430-432(1991)；WO90/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；和WO91/01133)；和T细胞受体抗体(EP340,109)如T10139；抗-CD19抗体，如Hekman et al.Cancer Immunol.Immunother.32:364-372(1991)和Vlasveld et al.Cancer Immunol.Immunother.40:37-47(1995)中所描述；Kiesel et al.Leukemia Research II,12:1119(1987)中的B4抗体；抗-CD22抗体，包括epratuzmab；抗-BLyS(CD257)抗体，包括贝利木单抗(benalysta)；抗-CD20抗体，包括Ocrelizumab、利妥昔单抗和奥法木单抗。“利妥昔单抗”或是指针对CD20抗原的遗传改造的嵌合鼠/人单克隆抗体，且在美国专利第5,736,137号中被命名为“C2B8”。所述抗体是含有鼠轻链和重链可变区序列和人恒定区序列的IgG1κ免疫球蛋白。利妥昔单抗具有的针对CD20抗原的结合亲和力为约8.0nM。
抗病毒剂的实例包括，干扰素γ、齐多夫定、盐酸金刚烷胺、利巴韦林、阿昔洛韦、伐昔洛韦、双脱氧胞苷、膦甲酸、更昔洛韦和它们的衍生物。
抑制B细胞、阻止B细胞分化或记忆B细胞激活的试剂的实例包括，抗-CD19抗体，抗-CD22抗体，包括epratuzmab；抗-BLyS(CD257)抗体，包括贝利木单抗(benalysta)；抗-CD20抗体，包括Ocrelizumab、利妥昔单抗、奥法木单抗，以及“利妥昔单抗(Rituximab)”或
抗氧化剂的实例包括抗坏血酸盐、α-维生素E、甘露醇、还原的谷胱甘肽、各种类胡萝卜素、半胱氨酸、尿酸、牛磺酸、酪氨酸、超氧化物歧化酶、叶黄素、玉米黄素、隐黄质(cryotpxanthin)、虾青素、番茄红素、N-乙酰-半胱氨酸、肌肽、γ-谷氨酰半胱氨酸、槲皮素、乳铁蛋白、二氢硫辛酸、柠檬酸、银杏提取物、茶叶儿茶素、越桔提取物、维生素E或维生素E的酯、视黄醇棕榈酸酯和它们的衍生物。其他治疗剂包括角鲨胺、碳酸酐酶抑制剂、α-2肾上腺素受体激动剂、抗寄生虫剂、抗真菌剂和它们的衍生物。
优选地，所述HRS多肽可按固定的每日剂量给药，而其他活性剂根据需要用药。当所述HRS多肽作为辅助治疗与第二活性剂一起给药时，优选的每日剂量为约0.1mg/kg/24hr至约55mg/kg/24hr，更优选为约2mg/kg/24hr至约20mg/kg/24hr。
当然，用于给药的每种组分的精确剂量可根据以下因素而变化：处方中规定的具体组分、受治疗对象、疾病的严重性如炎症反应的严重性、给药方式和处方医生的判断。因此，由于患者与患者之间的变化，以上给出的剂量为指导性的，且医生可调整所述化合物的剂量以实现医生认为恰当的治疗。
试剂盒
在其他方面，本发明的实施方案提供了包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器装有一种或多种分离的HRS多肽、多核苷酸、抗体和结合蛋白，如本文所述。所述试剂盒可包含关于如何使用这类组合物的书面指导(例如，调节细胞信号转导、炎症状况、诊断等)。
本文的试剂盒还可包含一种或多种适合或满足受治疗病症或期望的诊断应用需要的另外的治疗剂或其他组分。如需要，另外的治疗剂可包含在第二容器中。另外的治疗剂的实例，包括但不限于，抗肿瘤剂、抗炎剂、抗细菌剂、抗病毒剂、血管生成剂等。
本文的试剂盒还可包含一个或多个注射器或必需的或期望的其他组分以促进预期的递送模式(例如，支架、可植入的储库(depot)等)。
在本发明的另一个方面，试剂盒包含：a)容纳有HRS多肽组分的容器；和b)使用说明书。说明书可包括如何处理所述HRS多肽、如何储存所述HRS多肽的步骤，以及通过使用所述HRS多肽期望获得的。
在本发明的另一个方面，试剂盒包含：a)容纳有包含编码HRS多肽组分的核酸的重组载体或多核苷酸的容器；和b)使用说明书。说明书可包括如何处理所述载体或多核苷酸、如何储存所述载体或多核苷酸，或如何用所述载体或多核苷酸转染细胞的步骤。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗疾病或病症的试剂盒，其包含：a)容纳有在药学上可接受的制剂中包含HRS多肽组分的药物组合物的容器，和b)说明书和/或产品附页。
诊断
HRS多肽和相应的多核苷酸(HRS多核苷酸)可用于诊断分析和诊断性组合物中。包括生物化学、组织学和基于细胞的方法和组合物等。
这些和相关的实施方案包括检测所述HRS多核苷酸序列或相应的HRS多肽序列或其部分或其所针对的抗体。例如，某些方面包括检测一个或多个新鉴别的HRS剪接变体和/或这样的剪接变体的一个或多个剪接点的HRS多核苷酸序列或相应的多肽序列或其部分。在某些实施方案中，至少一个所述剪接点的多核苷酸或相应的多肽序列对于该特定的HRS剪接变体为唯一的。在一些实施方案中，这类HRS剪接变体可表明疾病的易感性，包括例如，自身免疫疾病、炎性疾病、肌营养不良症、横纹肌溶解症、恶病质和本文描述的其他疾病。
还包括直接检测HRS蛋白片段，包括剪接变体、蛋白水解片段等。在某些实施方案中，一种或多种新鉴别的HRS蛋白片段的存在或水平与一种或多种细胞类型或细胞状态(包括例如特定的自身抗体)有关或相关。因此，HRS多肽或多核苷酸的存在或水平可用于区分不同的细胞类型或不同的细胞状态。可根据本文所述和本领域所知的基于多核苷酸和/或多肽的诊断技术来检测HRS蛋白片段或其相关多核苷酸的存在或水平。
某些方面可以采用HRS蛋白片段或HRS多核苷酸作为伴随诊断方法的一部分，通常用于评估对象或者群体对象是否有利地响应特定医学治疗。例如，基于对象是否具有针对给定疾病或状况的一种或多种选定的生物标记或抗体，可以将基于给定HRS多肽的治疗剂(例如，蛋白片段、抗体、结合剂)鉴定为适合对象或某个群体对象。生物标记的实例包括血清/组织标记、已有的针对组氨酰-tRNA合成酶的抗体，以及可以通过医学成像技术鉴定的标记。在某些实施方案中，天然存在的HRS蛋白或其片段(或其相应的多核苷酸)本身可以提供血清和/或组织生物标记，其可用于测量特定对象或特定群体的对象中的抗-HRS多肽水平或游离HRS多肽水平。在某些方面，HRS多肽或多核苷酸参考序列的鉴定可以包括鉴定无论是在选定的对象、选定的组织还是其他中该序列的差异表达，如本文所述和本领域所知。
本文提供的某些方法依赖于HRS多肽或多核苷酸的差异表达来表征细胞、组织或对象的病症或状态，并且将其与另一细胞、组织或对象区分。非限制性的实例包括，检测除原代细胞培养物和其他细胞培养物，例如永生化细胞培养物外的生物样品中HRS多肽或多核苷酸的存在或水平以区分不同物种的细胞或组织、不同组织或器官的细胞、细胞发育状态如新生的和成体的、细胞分化状态、疾病状况如健康、患病和接受了治疗的、细胞内和细胞外级分。
差异表达包括，与合适的对照中的相同序列的表达水平相比，HRS多核苷酸或多肽参考序列的一种或多种基因表达水平的统计学显著差异。统计学显著差异可指所测量的表达水平的增加或降低，所述测量是通过RNA水平、蛋白水平、蛋白功能或诸如本文所述的基因表达的任何其他相关测量进行的。还包括本发明HRS多核苷酸或多肽与通常是相同或相应类型的全长或野生型胞浆或线粒体HRS序列之间的比较。可以通过本领域和本文描述的许多技术来检测差异表达，包括基于多核苷酸和多肽的技术，如实时PCR、差减杂交、多核苷酸和多肽阵列等。
如果结果不可能是偶然发生的，则其通常被称为统计学上显著的。测试或结果的显著性水平通常涉及概率统计的假设检验概念。在简单情况下，统计学上的显著性可以被定义为当零假设事实上为真时做出否决该零假设的判定(被称为第I类错误或“假阳性确定”的判定)的概率。该判定通常用p值进行：如果p值小于显著性水平，则否决零假设。p值越小，结果越显著。贝叶斯(Bayes)因子也可用于确定统计学上的显著性(参见例如Goodman S.,Ann Intern Med130:1005-13,1999)。
在更复杂的但实际上重要的情况下，测试或结果的显著性水平可以反映这样的分析，其中当零假设事实上为真的时做出否决该零假设的判定的概率不超过规定的概率。该类分析允许那样的应用，其中决定否决的概率可以远小于零假设中所包含的某些假定集合的显著性水平。
在某些示例性的实施方案中，统计学上显著的差异表达可以包括这样的情况，其中相比合适的对照，可疑的生物样品中给定的HRS序列的表达水平提供至少约1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.9X、2.0X、2.2X、2.4X、2.6X、2,8X、3.0X、4.0X、5.0X、6.0X、7.0X、8.0X、9.0X、10.0X、15.0X、20.0X、50.0X、100.0X或更大的表达差异(即，可以为更高或更低表达的差异表达)，包括其间的所有整数和小数(例如，1.24X、1.25X、2.1X、2.5X、60.0X、75.0X等)。在某些实施方案中，统计学上显著的差异表达可以包括这样的情况，其中相比合适的对照，可疑的生物样品中给定的HRS序列的表达水平提供至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000百分比(％)或更大的表达差异(即，可以为更高或更低的差异表达)，包括其间的所有整数和小数。
作为另外的实例，还可以通过进行本文所述及本领域内已知的Z检验确定差异表达，即计算绝对Z评分。Z检验通常用于鉴定样品平均值和群体平均值之间的显著性差异。例如，相比95％置信区间(即5％的显著性水平)的标准正常表(例如，对照组织)，绝对值大于1.96的Z评分指示非随机性。对于99％的置信区间，如果绝对Z大于2.58，意味着p＜0.01，并且差异更加显著—可以更高的置信度否决零假设。在这些和相关实施方案中，1.96、2、2.58、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更高的绝对Z评分(包括其间所有小数(例如，10.1、10.6、11.2等))，可提供统计学上显著性的有力度量。在某些实施方案中，大于6的绝对Z评分可提供特别高的统计学上的显著性。
基本上相似地通常是指生物样品与参考对照之间的表达水平缺乏统计学上显著性的差异。基本上相似表达水平的实例可以包括这样的情况，其中相比参考样品，可疑的生物样品中给定的SSCIGS的表达水平提供少于约.05X、0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1.0X.、1.1X、1.2X、1.3X或1.4X的表达差异(即，可以为更高或更低表达的差异表达)，包括其间所有小数(例如，0.15X、0.25X、0.35X等)。在某些实施方案中，差异表达可以包括这样的情况，其中相对于参考样品，可疑的生物样品中给定的HRS序列的表达水平提供少于约0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50百分比(％)的表达差异(即，可以为更高或更低的差异表达)，包括其间所有小数。
在某些实施方案中，例如当使用Affymetrix微阵列测量HRS多核苷酸或多肽参考序列的表达水平时，还可以通过平均表达值确定差异表达，所述平均表达值由Affymetrix微阵列第5套软件(Affymetrix，Santa Clara，CA)或其他相似软件所概括，通常换算为1000的平均表达值。
本发明的实施方案包括检测HRS多核苷酸或多肽参考序列的存在或水平以表征或诊断细胞、组织、器官或对象的疾病状况的方法，其中该疾病状况可以表征为健康的、患病的、有患病风险的或接受了治疗的。为了该诊断目的，术语“诊断的(diagnostic)”或“诊断的(diagnosed)”包括鉴定病理状况的存在或性质、表征发展这种状况的风险和/或检测该病理状况响应治疗的改变(或未改变)。诊断方法可在其灵敏度和特异性上有差异。在某些实施方案中，诊断测定的“灵敏度”是指测试为阳性的患病细胞、组织或对象的百分比(“真阳性”的百分比)。未被该测定检测到的患病细胞、组织或对象通常被称为“假阴性”。未患病且在测定中测试为阴性的细胞、组织或对象可以称为“真阴性”。在某些实施方案中，诊断测定的“特异性”可以定义为一(1)减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为没有疾病且测试为阳性的那些样品或对象的比例。尽管特定诊断方法可能不提供疾病状况的最终诊断，但如果该方法能提供辅助诊断的阳性指示，它就算合格。
在某些情况下，可以通过将与病理状况相关的一种或多种选择的HRS多核苷酸或其多肽参考序列或其部分或其所针对的抗体的存在或水平与合适的对照相比(无论水平是增加的还是降低)，来诊断病理状态的存在或发展病理状况的风险。“合适的对照”或“适当的对照”包括组织或生物的细胞或其他生物样品中确定的值、水平、特征、特性或性质，例如，表现出例如正常性状如不存在所述状况的对照或正常细胞、组织或生物。在某些实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”是预先确定的值、水平、特征、特性或性质。其他合适的对照对本领域技术人员是显而易见的。疾病和状况的实例，例如，与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病，在本文其他地方有描述。
本发明的实施方案包括基于HRS多核苷酸或核酸的检测技术，该技术由于检测的灵敏度而提供某些优势。因此，某些实施方案涉及作为诊断方法或测定的一部分的HRS多核苷酸的使用或检测。HRS多核苷酸的存在和/或水平可以通过本领域已知的任何方法测量，包括杂交检测如Northern印迹、定量或定性聚合酶链式反应(PCR)、定量或定性逆转录酶PCR(RT-PCR)、微阵列、斑点印迹或狭缝印迹或原位杂交如荧光原位杂交(FISH)等。这些方法中的某些在下文有更详细描述。
可以使用本领域内已知的技术从血液、生物流体、组织、器官、细胞系或其他相关样品中收集和/或产生HRS多核苷酸如DNA和RNA，如描述于以下文献中的那些方法：Kingston.(2002Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons,Inc.,NY,NY(参见例如，描述于Nelson等人Proc Natl Acad Sci U S A,99:11890-11895,2002的)等。而且，许多可商购的用于构建RNA的试剂盒可用于制备本发明所用的RNA。可以从获自正常健康对象的器官/组织/细胞来构建RNA；然而，本发明还包括从患病对象构建RNA。某些实施方案包括使用来自任何类型的对象或动物的任何类型的器官。对于测试样品，RNA可以获自具有或没有可见疾病的个体(例如，任何动物，包括哺乳动物)和组织样品、生物流体(例如全血)等。
在某些实施方案中，cDNA序列的扩增或构建可有助于提高检测能力。本公开以及本领域提供了进行此类任务的必需水平的细节。在一个示例性实施方案中，全血被用作RNA来源，因此，任选使用了RNA稳定试剂，例如PAX管，例如描述于Thach等人,J.Immunol.Methods.Dec283(1-2):269-279,2003，和Chai等人,J.Clin.Lab Anal.19(5):182-188,2005(两篇参考文献均通过引用并入)的。可以使用本领域已知的技术产生互补DNA(cDNA)文库，例如描述于以下文献中的那些技术：Ausubelet al.(2001Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publ.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons,Inc.,NY,NY)；Sambrook et al.(1989MolecularCloning,Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY)；Maniatis et al.(1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY)等。而且，用于构建cDNA文库的许多可商购的试剂盒可用于制备本发明的cDNA文库。可以从获自正常的健康对象的器官/组织/细胞构建文库。
某些实施方案可以利用用于检测HRS多核苷酸序列的杂交方法。用于进行多核苷酸杂交测定的方法在领域内已得到良好的发展。杂交测定程序和条件可根据应用而变化，并且根据已知通用的结合方法进行选择，包括以下文献中描述的那些方法：Maniatis et al.Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Berger和Kimmel，Methods in Enzymology,第152卷,Guide to Molecular CloningTechniques(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1987)；Young和Davis,PNAS.80:1194(1983)。进行重复和受控的杂交反应的方法和装置已经描述于美国专利第5,871,928、5,874,219、6,045,996号和第6,386,749、6,391,623号，其各自通过引用并入本文。
某些实施方案可利用用于检测HRS多核苷酸序列的核酸扩增方法。术语“扩增”或“核酸扩增”是指包含预期的特异性靶核酸序列的至少一部分的靶核酸的多个拷贝的产生。多个拷贝可以被称为扩增子或扩增产物。在某些实施方案中，扩增的靶标所包含的序列小于完整的靶基因序列(内含子和外显子)或表达的靶基因序列(外显子和位于侧翼的非翻译序列的剪接转录物)。例如，可以利用与靶标多核苷酸的内部位置杂交并从该位置启动聚合的扩增引物，通过扩增该靶标多核苷酸的一部分来产生特异性的扩增子。优选地，扩增出的部分包含可检测的靶序列，其可以利用多种公知方法的任一种进行检测。
如本文所用，“选择性扩增”或“特异性扩增”是指扩增本发明的靶核酸序列，其中靶序列的可检测的扩增基本上限于测试的目的核酸样品提供的靶序列的扩增，且并非由某些其他样品来源提供的靶核酸序列所提供，例如扩增反应期间使用的试剂中或进行扩增反应的环境中存在的污染。
术语“扩增条件”是指允许按照本发明进行核酸扩增的条件。在某些实施方案中，扩增条件可不如本文所述的“严格杂交条件”严格。在扩增条件下，本发明的扩增反应中使用的寡核苷酸与它们的预期靶标杂交，但在严格杂交条件下可能杂交也可能不杂交。另一方面，本发明的检测探针通常在严格杂交条件下杂交。本领域技术人员根据所用的特定扩增方法可容易地确定按照本发明实施核酸扩增的可接受的条件。
许多公知的核酸扩增方法需要热循环以交替地使双链核酸变性并与引物杂交；然而，其他公知的核酸扩增方法是等温的。通常被称为PCR的聚合酶链式反应(美国专利第4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188号)使用变性、引物对与互补链的退火和引物延伸的多个循环以指数方式增加靶序列的拷贝数。在被称作RT-PCR的变形中，使用逆转录酶(RT)从mRNA产生互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝。
如上所述，术语“PCR”指选择性地扩增靶核酸种类的多个扩增循环。包括定量PCR(qPCR)、实时PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)和定量逆转录PCR(qRT-PCR)，其在领域内有良好的描述。术语“pPCR”指定量聚合酶链式反应，且术语“qRT-PCR”是指定量逆转录聚合酶链式反应。qPCR和qRT-PCR可以用于扩增靶标cDNA分子并同时对其进行定量。它使得可以对cDNA库中的特定序列，例如选择的AARS基因或转录物，同时进行检测和定量。
术语“实时PCR”可以使用DNA结合染料与PCR中的所有双链(ds)DNA结合以引起染料发出荧光。因此，PCR期间DNA产物的增加导致荧光强度的增加，并在每个循环进行测量，从而允许对DNA浓度进行定量。然而，dsDNA染料如SYBR Green与所有dsDNA PCR产物结合。在实时PCR热循环仪中检测并测量荧光，并且其与产物的指数增加相对应的几何级数增加被用来确定每个反应中的阈值循环(“Ct”)。
术语“Ct评分”指阈值循环数，其为PCR扩增超过阈值水平的循环。如果样品中特定基因的mRNA的量较高，则其将比低表达的基因更早跨越阀值，因为有更多的起始RNA用于扩增。因此，Ct评分低表示样品中的基因表达高，而Ct评分高表示基因表达低。
某些实施方案可以采用通常被称为LCR的连接酶链式反应(Weiss，Science.254：1292,1991)，其使用与靶核酸的邻近区域杂交的两对互补的DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸可以在热变性、杂交和连接的重复循环中通过DNA连接酶共价连接，从而产生可检测的双链连接的寡核苷酸产物。
另一方法是链置换扩增(Walker,et al.,1992,PNAS USA89:392-396；美国专利第5,270,184和5,455,166号)，通常称为SDA，其利用以下的循环：使引物序列对与靶序列的相对链退火、在dNTPαS存在下延伸引物以产生双链体半硫代磷酸酯化的引物延伸产物、半修饰的限制内切核酸酶识别位点的内切核酸酶介导的切口产生(nicking)，和聚合酶介导的从切口的3’端延伸引物以置换现有链并产生用于下一轮引物退火、切口产生和链置换的链，导致产物的几何级扩增。嗜热的SDA(tSDA)以基本相同的方法在更高的温度下使用嗜热的内切核酸酶和聚合酶(欧洲专利第0684315号)。
其他扩增方法包括例如：基于核酸序列的扩增(美国专利第5,130,238号)，通常称为NASBA；其利用通常称为Qβ复制酶的RNA复制酶扩增探针分子本身(Lizardi,et al.,1988,BioTechnol.6:1197-1202)；基于转录的扩增方法(Kwoh,D.et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177)；自维持序列复制(Guatelli,J.et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878)；和转录介导的扩增(美国专利第5,480,784和5,399,491号)，常称为TMA。关于已知扩增方法的进一步讨论，参见Persing,David H.,1993,“In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques”，Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persing etal.Eds.),pp.51-87(American Society for Microbiology,Washington,DC)。
本发明示例性的基于转录的扩增系统包括TMA，其利用RNA聚合酶来产生靶区域的多个RNA转录物(美国专利第5,480,784和5,399,491号)。TMA利用了在逆转录酶和RNA聚合酶存在下与靶核酸杂交以形成双链启动子的“启动子-引物”，RNA聚合酶从所述双链启动子产生RNA转录物。这些转录物可成为模板用于在能够与RNA转录物杂交的第二引物存在下的其他轮次TMA。不同于PCR、LCR或需要热变性的其他方法，TMA是等温方法，其利用RNA酶H活性来消化RNA:DNA杂合体的RNA链，从而使DNA链可用于与引物或启动子-引物杂交。一般而言，利用了为扩增提供的逆转录酶相关的RNA酶H活性。
在示例性的TMA方法中，一个扩增引物是包含启动子序列的寡核苷酸启动子-引物，其在为双链、位于靶标结合序列的5’时为功能性的，所述靶标结合序列能够在待扩增序列的3’位置与靶RNA的结合位点杂交。当对T7RNA聚合酶识别具有特异性时，启动子-引物可以被称为“T7引物”。在某些情况下，启动子-引物或此类启动子-引物亚群的3’端可以被修饰以阻断或减少引物延伸。从未修饰的启动子-引物，逆转录酶产生靶RNA的cDNA拷贝，而RNA酶H活性降解靶RNA。然后第二扩增引物结合至cDNA。该引物可以被称为“非T7引物”以使之区别于“T7引物”。从该第二扩增引物，逆转录酶产生另一条DNA链，得到在一端具有功能性启动子的双链DNA。当成为双链时，启动子序列能够结合RNA聚合酶以开始与启动子-引物杂交的靶序列的转录。RNA聚合酶利用该启动子序列产生多个RNA转录物(即，扩增子)，一般约100-1,000个拷贝。每个新合成的扩增子可以与第二扩增引物退火。然后逆转录酶可以产生DNA拷贝，而RNA酶H活性降解该RNA:DNA双链体的RNA。然后，启动子-引物可以结合新合成的DNA，允许逆转录酶产生双链DNA，由此RNA聚合酶产生多个扩增子。因此，使用两个扩增引物可以实现十亿倍的等温扩增。
在某些实施方案中，其他技术可用于评估来自特定cDNA文库的转录本的RNA转录本，包括微阵列分析(Han,et al.,Nat Biotechnol,19:631-635,2001；Bao et al.,Anal Chem,74:1792-1797,2002；Schena et al.,PNAS USA93:10614-19,1996；和Heller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:2150-55,1997)和SAGE(基因表达系列分析)。与MPSS相似，SAGE是数字化的并可以产生大量的信号序列(参见例如Velculescu,V.E.,et al.,Trends Genet,16:423-425.,2000；Tuteja R.和Tuteja N.Bioessays.2004Aug；26(8):916-22)，但是数量级小于可从诸如MPSS的技术获得的信号序列。
在某些实施方案中，术语“微阵列”包括具有与基底结合的多个核酸的“核酸微阵列”，与所述多个结合的核酸中的每个的杂交可被分别检测。基底可以是实心的或多孔的、平面的或非平面的、整体的或分散的。核酸微阵列包括以下文献中所述的所有装置：Schena(ed.),DNA Microarrays:A Practical Approach(Practical Approach Series),Oxford University Press(1999)；Nature Genet.21(1)(增刊):1-60(1999)；Schena(ed.),MicroarrayBiochip:Tools and Technology,Eaton Publishing Company/BioTechniquesBooks Division(2000)。核酸微阵列可以包含与基底结合的多个核酸，其中所述多个核酸位于多个珠子上而不是整体的平面基底上，例如Brenneret al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(4):1665-1670(2000)中所描述的。核酸微阵列的实例可参见以下文献：美国专利第6,391,623、6,383,754、6,383,749、6,380,377、6,379,897、6,376,191、6,372,431、6,351,712、6,344,316、6,316,193、6,312,906、6,309,828、6,309,824、6,306,643、6,300,063、6,287,850、6,284,497、6,284,465、6,280,954、6,262,216、6,251,601、6,245,518、6,263,287、6,251,601、6,238,866、6,228,575、6,214,587、6,203,989、6,171,797、6,103,474、6,083,726、6,054,274、6,040,138、6,083,726、6,004,755、6,001,309、5,958,342、5,952,180、5,936,731、5,843,655、5,814,454、5,837,196、5,436,327、5,412,087和5,405,783号，通过引用将这些专利的公开内容并入本文。
其他实例包括可从Affymetrix(Santa Clara，Calif.)商购的商标名为GENECHIPTM的核酸阵列。制备和使用阵列的其他示例性的方法提供于例如美国专利第7,028,629、7,011,949、7,011,945、6,936,419、6,927,032、6,924,103、6,921,642和6,818,394号中。
涉及阵列和微阵列的本发明还包括连接到固体基底的聚合物的多种用途。这些用途包括基因表达监测、谱型分析、文库筛选、基因分型和诊断。基因表达监测和谱型分析方法以及用于基因表达监测和谱型分析的方法描述于以下文献中：美国专利第5,800,992、6,013,449、6,020,135、6,033,860、6,040,138、6,177,248和6,309,822号中。基因分型及其用途描述于以下文献中：美国申请系列第10/442,021、10/013,598号(美国申请第2003/0036069号)以及美国专利第5,925,525、6,268,141、5,856,092、6,267,152、6,300,063、6,525,185、6,632,611、5,858,659、6,284,460、6,361,947、6,368,799、6,673,579和6,333,179号中。可以与本文所公开的方法联合使用的核酸扩增、标记和分析的其他方法，示例于美国专利第5,871,928、5,902,723、6,045,996、5,541,061和6,197,506号。
如本文所述，某些实施方案可将寡核苷酸如引物或探针用于扩增或检测，这对本领域技术人员是显而易见的。可以通过本领域普通技术人员已知的技术产生确定的序列和化学结构的寡核苷酸，例如通过化学或生化合成，以及通过从重组核酸分子例如细菌或病毒载体进行体外或体内表达。在某些实施方案中，寡核苷酸不仅仅由野生型染色体DNA或其体内转录产物组成。
可以任何方式修饰寡核苷酸或引物，只要给定的修饰与给定的寡核苷酸所预期功能相容。本领域普通技术人员能够容易地确定给定的修饰是否适合本发明任何给定的寡核苷酸或是其所需的。本文其他地方更详细描述了相关的AARS寡核苷酸。
如本文所述，尽管寡核苷酸的设计和序列取决于其功能，但通常应考虑数个变量。最相关的变量有：长度、解链温度(Tm)、特异性、与系统内其他寡核苷酸的互补性、G/C含量、多聚嘧啶(T、C)或多聚嘌呤(A、G)区段(stretch)以及3’端序列。控制这些和其他变量是寡核苷酸设计的标准和公知的方面，且可容易获得各种计算机程序来筛选大量潜在的寡核苷酸以获得最佳的寡核苷酸。
因此，某些实施方案包括检测样品中靶AARS多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含本文所述的参考AARS多核苷酸的序列，所述方法包括：a)将样品与探针杂交，所述探针包含与样品中靶多核苷酸互补的序列，并且在所述探针和所述靶多核苷酸或其片段之间能够形成杂交复合体的条件下，所述探针与所述靶多核苷酸特异性杂交，和b)检测是否存在所述杂交复合体，并且任选地(如果存在)检测其含量。还包括检测样品中靶HRS多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含本文所述的参考HRS多核苷酸序列，所述方法包括：a)扩增所述靶多核苷酸或其片段，和b)检测是否存在所述扩增的靶多核苷酸或其片段，并且任选地(如果存在)检测其含量。具体实施方案涉及检测AARS剪接变体，例如通过检测剪接变体的独特剪接点，无论是通过杂交、扩增还是其他检测方法。
本发明的实施方案包括多种基于HRS多肽的检测技术，包括基于抗体的检测技术。这些实施方案包括将HRS多肽应用于生物样品如血清、全血或血浆中抗-HRS抗体的检测、定量或表位图谱分析。某些实施方案可以利用标准方法和检测器，如蛋白质印迹和免疫沉淀反应、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术和利用成像设备的免疫荧光测定(IFA)。
相比依赖非人的和/或粗制组氨酰-tRNA合成酶的现有抗体检测方法，这类人HRS多肽具有出人意料的优异抗体结合特性。
在这些分析的一些实施方案中，所述HRS多肽为表D1-D9中列举的或由其衍生的HRS多肽。在一些实施方案中，所述HRS多肽包含标签(tag)以促进附着至固体表面。在一个实施方案中，所述标签为聚-His标签。
因此，在一些实施方案中，所述HRS多肽可用于表征患者特性以确定其Jo-1抗体疾病负担。这类特性表征使得能够将患者分选为可从HRS多肽治疗中获益的亚群、预测可能的治疗结果，和/或确定最适于用作治疗剂的HRS多肽。
在一个实施方案中，本发明包括确定存在对HRS多肽给药产生不利的免疫应答的风险的人对象的方法，其包括a)测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象具有针对组氨酰-tRNA合成酶或所述HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。
在一些方面，如果所述对象在其血清中具有大于约1微摩尔的组氨酰-tRNA合成酶抗体浓度，则可将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。
在一些方面，如果所述对象在其血清中具有大于约2微摩尔的组氨酰-tRNA合成酶抗体浓度，则可将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。
在一些方面，如果所述对象在其血清中具有大于约4微摩尔的组氨酰-tRNA合成酶抗体浓度，则可将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的高风险。
在另一个实施方案中，本发明包括挑选HRS多肽以治疗患有自身免疫或炎性疾病状况的人对象的方法，其包括：a)测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)挑选相比野生型组氨酰-tRNA合成酶，针对抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体具有降低的亲和力的HRS多肽。
在一个实施方案中，本发明包括预测人对象的疾病进展的方法，其包括：a)测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象具有针对组氨酰-tRNA合成酶或所述HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为存在发展更严重疾病的风险。
在一些方面，如果所述对象在其血清中具有大于约1微摩尔的组氨酰-tRNA合成酶抗体浓度，则可将所述对象确定为存在发展更严重疾病的风险。
在一些方面，如果所述对象在其血清中具有大于约2微摩尔的组氨酰-tRNA合成酶抗体浓度，则可将所述对象确定为存在发展更严重疾病的风险。
在一些方面，如果所述对象在其血清中具有大于约4微摩尔的组氨酰-tRNA合成酶抗体浓度，则可将所述对象确定为存在发展更严重疾病的高风险。
在另一个实施方案中，本发明包括预测对象对HRS多肽给药的应答的方法，其包括a)测定对象中所述抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象没有可检测的针对组氨酰-tRNA合成酶或所述HRS多肽的抗体，则将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
在一些方面，如果对象血清中组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度小于约1微摩尔，则可将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
在一些方面，如果对象血清中组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度小于约0.1微摩尔，则可将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
在一些方面，如果对象血清中组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度大于约0.01微摩尔，则可将所述对象确定为适于HRS多肽给药。
某些实施方案可以利用“阵列”如“微阵列”。在某些实施方案中，“微阵列”还可以指具有与基底结合的多肽集合或多个多肽的“肽微阵列”或“蛋白微阵列”，与所述多个结合的多肽中每一个的结合可以被单独地检测。可选地，肽微阵列可以具有多种结合剂，包括但不限于，可以特异性检测本文所述的HRS多肽的结合的单克隆抗体、多克隆抗体、噬菌体展示结合剂、酵母双杂交结合剂和适体。所述阵列可以基于这些HRS多肽的自身抗体检测，例如，Robinson et al.,Nature Medicine8(3):295-301(2002)中所描述的。肽阵列的实例可参见，WO02/31463、WO02/25288、WO01/94946、WO01/88162、WO01/68671、WO01/57259、WO00/61806、WO00/54046、WO00/47774、WO99/40434、WO99/39210和WO97/42507以及美国专利第6,268,210、5,766,960和5,143,854号，其各自通过引用并入本文。
某些实施方案可以利用MS或其他基于分子量的方法用于诊断性地检测HRS多肽序列。质谱法(MS)通常是指用于确定样品或分子的元素组成的分析技术。MS还可用于确定诸如肽和其他化合物的分子的化学结构。
通常，MS原理由以下组成：将化合物电离以产生带电的分子或分子片段，然后测量它们的质荷比。在示例性的MS方案中：将样品加载到MS装置上，并经过汽化，通过多种方法中的一种将样品的组分电离(例如，通过用电子束轰击它们)，这导致形成带正电的粒子，然后通过磁场加速阳离子，根据所述离子穿过电磁场时的运动细节，以及先前步骤中根据m/z分选的离子的检测来计算粒子的质荷比(m/z)。
示例性的MS装置具有三个模块：离子源，其将气相的样品分子转化成离子(或在电喷雾电离的情况下，将溶液中存在的离子移动到气相中)；质量分析器，其通过施加电磁场根据离子的质量将其分类；和检测器，其测量指示剂量的值，并因而提供数据用于计算存在的每种离子的丰度。
MS技术同时具有定性和定量用途，包括鉴定未知化合物、确定分子中元素的同位素组成，和通过观察化合物的断裂(fragmentation)确定其结构。其他用途包括对样品中化合物的量进行定量或研究气相离子化学的基本原理(真空中离子和中性粒子的化学)。包括气相色谱-质谱(GC/MS或GC-MS)、液相色谱质谱(LC/MS或LC-MS)和离子迁移谱/质谱(IMS/MS或IMMS)。因此，根据本文所提供的任何方法可以将MS技术用于测量生物样品中本发明的AARS多肽的存在或水平，并将这些水平与对照样品或预定值进行比较。
某些实施方案可以采用细胞分选或细胞可视化或成像设备/技术来检测或定量AARS多核苷酸或多肽的存在或水平。实例包括流式细胞术或FACS、免疫荧光分析(IFA)和原位杂交技术如荧光原位杂交(FISH)。
某些实施方案可以采用用于诊断目的的常规生物学方法、软件和系统。本发明的计算机软件产品通常包括具有计算机可执行指令的计算机可读介质，所述计算机可执行指令用于进行本发明方法的逻辑步骤。适合的计算机可读介质包括软盘、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、硬盘驱动、闪存、ROM/RAM、磁带等。计算机可执行指令可用合适的计算机语言或几种语言的组合来编写。基本的计算机生物学方法描述于例如，Setubal和Meidanis et al.,Introduction to Computational Biology Methods(PWSPublishing Company,Boston,1997)；Salzberg,Searles,Kasif,(Ed.),Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998)；Rashidi和Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Scienceand Medicine(CRC Press,London,2000)，以及Ouelette和BzevanisBioinformatics:A Practical Guide for Analysis of Gene and proteins(Wiley& Sons,Inc.,第2版,2001)。参见美国专利第6,420,108号。
某些实施方案可以采用用于多种目的，如探针设计、数据管理、分析和仪器操作的各种计算机程序产品和软件。参见，美国专利第5,593,839、5,795,716、5,733,729、5,974,164、6,066,454、6,090,555、6,185,561、6,188,783、6,223,127、6,229,911和6,308,170号。
全基因组采样分析(WGSA)描述于例如，Kennedy et al.,Nat.Biotech.21,1233-1237(2003),Matsuzaki et al.,Gen.Res.14:414-425,(2004)和Matsuzaki,et al.,Nature Methods1:109-111(2004)。用于作图分析的算法描述于例如，Liu et al.,Bioinformatics.19:2397-2403(2003)和Di et al.Bioinformatics.21:1958(2005)。与WGSA相关的其他方法和用于WGSA的阵列以及WGSA的应用公开于例如，美国专利申请第60/676,058(2005年4月29日提交)、60/616,273(2004年10月5日提交)、10/912,445、11/044,831、10/442,021、10/650,332和10/463,991号。使用作图分析的全基因组关联研究描述于例如，Hu et al.,Cancer Res.；65(7):2542-6(2005),Mitra et al.,Cancer Res.,64(21):8116-25(2004),Butcher et al.,Hum MolGenet.,14(10):1315-25(2005),和Klein et al.,Science.308(5720):385-9(2005)。
此外，某些实施方案可以包括用于在网络例如因特网上提供遗传信息的方法，例如在以下文献中所示的：美国申请第10/197,621、10/063,559(美国公布号2002/0183936)、10/065,856、10/065,868、10/328,818、10/328,872、10/423,403和60/482,389号。
实施例
实施例1
制备His-标记的Resokine(HRS(1-60))
密码子优化和基因合成
使用DNA2.0(Menlo Park,CA)发展的算法，将编码Resokine(HRS(1-60))的DNA进行密码子优化以用于大肠杆菌表达。将所述基因与C-端6xHis标签一起合成，并亚克隆至pJexpress411载体，其中使用T7启动子驱动转录并使用卡那霉素抗性来进行抗生素筛选。所述密码子优化的DNA序列如下：
ATGGCAGAACGTGCGGCATTGGAAGAATTGGTTAAACTGCAAGGTGAACGTGTTCGTGGTCTGAAGCAGCAGAAGGCTAGCGCGGAGCTGATCGAAGAAGAGGTGGCCAAACTGCTGAAGCTGAAGGCGCAGCTGGGCCCGGACGAGAGCAAACAAAAGTTCGTCCTGAAAACCCCGAAACACCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO:40)
翻译的蛋白序列如下：
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKHHHHHH(SEQ ID NO:41)
表达菌株。用密码子优化的表达构建体转化BL21(DE3)感受态细胞(Novagen,目录号69450)。简而言之，将质粒(1μL)加入至50μL的感受态细胞中。将反应物混合并在冰上孵育30min。将反应物于42℃热休克30s(秒)，然后在冰上冷休克2min。接着加入SOC培养基(500μL)，将所述管于37℃、250rpm下孵育1hr。最后，将小份的培养物(50μL)涂布于卡那霉素平板(Teknova S9641)上，并于37℃孵育过夜。挑选出单个克隆用于表达放大。
培养基。将200mL无菌的M9低盐培养基5X(BD248510)、778mL于无菌纯净水中的30g/L酵母提取物(BD212750)、20mL无菌的20％葡萄糖(Sigma G7021)和2mL无菌1.0M MgSO4(Sigma M7506)混合以制备M9YE培养基。所述进料溶液包含5％酵母提取物、50％葡萄糖、微量元素和2g/L硫酸镁。在M9YE和进料溶液中均添加硫酸卡那霉素(Invitrogen15160)至终浓度为100μg/mL。
补料分批发酵。将配备MFCS/DA软件的4L发酵罐(Sartorius BiostatB plus)用于补料分批发酵。搅拌转速设为1000rpm。通过添加30％氢氧化铵(Sigma221228)和30％磷酸(Sigma P5811)自动地将pH值控制在7.0。用无油隔膜式空气压缩机(Cole-Parmer)以4L/min的流速提供空气。使空气通过0.2μm Midisart2000过滤器(Sartorius17805)。自动化提供纯氧(West Air)以将溶解氧水平控制在70％。用Neslab RTE7循环器(ThermoScientific)将温度控制在30℃。通过添加消泡剂204(Sigma A8311)控制泡沫。M9YE培养基在发酵罐中的起始体积为3L。将150mL的种子培养物接种发酵罐，于30℃和250rpm下生长过夜。当容器中的葡萄糖被消耗后，通过设定于0.9mL/min的蠕动泵将浓缩的进料溶液引入该容器中。当在600nm处的细胞光密度达到约30时，用0.5mM IPTG(FisherScientific BP1755)诱导所述培养物。将培养物运行过夜(约18-hr的分批补料时长)，并在6,000xg下离心1hr进行收集。将细胞聚集体于-20℃储存直至纯化。在SDS-PAGE上确认Resokine的表达。
Resokine的纯化。将冷冻的细胞团(paste)(70g)重悬于280mL(即4mL/g细胞团)的裂解缓冲液(50mM Tris,300mM NaCl,10mM咪唑,5mM β-ME,pH7.5)中。将完全无EDTA的(Complete EDTA-FREE)蛋白酶抑制剂片(Roche)按照1片/50mL的比率添加至所述悬浮液中。用冰冷却的同时使所述悬浮液以15,000psi通过微流化器(Microfluidics)两次。于4℃、15,000xg下离心该溶解产物30min。将上清液通过0.45+0.22μmAcropak400囊式过滤器(Pall)过滤。
将澄清的溶解物结合至Ni-NTA树脂(Qiagen)，用Ni-NTA结合缓冲液(50mM Tris,300mM NaCl,10mM咪唑,pH7.5)预平衡。用50倍柱体积的Ni-NTA结合缓冲液+0.1％Triton X-114洗涤该柱，然后用20倍柱体积的Ni-NTA结合缓冲液洗涤。用4倍柱体积的Ni-NTA洗脱缓冲液(50mM Tris,300mM NaCl,300mM咪唑,pH7.5)洗脱所述结合蛋白Resokine。
用阳离子交换柱进一步纯化该Ni-NTA洗出液。具体地，用SP结合缓冲液(10mM磷酸钠,pH7.0)将该Ni-NTA洗出液稀释20倍，并加载至33mL SP-琼脂糖HP柱，用SP结合缓冲液预平衡。该柱的大小为直径2.6cm，高6.2cm。用在SP结合缓冲液中的0-0.5M NaCl线性梯度的10倍柱体积将所需的产物从该柱中洗脱出来。将纯化的蛋白浓缩至6mg/mL，经缓冲液交换至PBS(Invitrogen产品#10010)，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。纯化蛋白的产率为150mg(自70g的细胞团)，且其内毒素水平<1.7EU/mg。
实施例2
制备His-标记的全长组氨酰-tRNA合成酶(HRS)
密码子优化和基因合成。将全长HisRS基因进行密码子优化用于大肠杆菌表达，并亚克隆至pET21a载体，其中使用T7启动子驱动转录。此外，将5-氨基酸连接子和6xHis标签连接于C-端。
所述DNA序列如下：
ATGGCGGAACGTGCCGCACTGGAAGAATTGGTTAAATTACAGGGAGAACGCGTACGTGGTCTTAAACAACAAAAAGCCTCTGCGGAATTGATTGAAGAAGAAGTTGCCAAATTACTGAAACTGAAAGCTCAACTTGGACCCGATGAAAGTAAACAAAAATTTGTGTTGAAAACGCCCAAAGGAACCCGTGATTATAGTCCACGTCAAATGGCCGTTCGTGAAAAAGTGTTCGACGTTATTATTCGCTGTTTTAAACGTCACGGTGCTGAAGTAATCGATACCCCCGTATTTGAATTGAAAGAGACTCTGATGGGCAAATATGGTGAAGATTCTAAACTGATTTATGATTTGAAAGACCAAGGAGGTGAACTGCTGAGCCTGCGCTACGACTTAACTGTGCCTTTTGCCCGTTACTTAGCCATGAATAAaTTaACCAACATCAAACGTTACCATATTGCAAAAGTATATCGCCGCGACAACCCTGCAATGACTCGTGGACGCTATCGCGAATTCTATCAGTGTGATTTTGATATTGCCGGAAATTTCGACCCGATGATCCCGGATGCCGAGTGTTTGAAAATTATGTGTGAAATTCTGAGTTCGTTGCAGATCGGAGACTTTCTTGTAAAAGTTAATGACCGCCGTATTCTGGATGGTATGTTTGCTATTTGCGGTGTTTCTGATTCCAAATTCCGTACAATCTGCTCAAGCGTGGACAAATTGGATAAAGTGTCTTGGGAAGAAGTAAAAAATGAAATGGTGGGAGAAAAAGGCCTGGCTCCAGAAGTAGCAGACCGTATTGGTGACTATGTTCAACAACATGGCGGTGTGTCCTTAGTCGAACAGTTATTACAGGATCCTAAACTGAGCCAAAATAAACAAGCACTTGAAGGACTGGGAGATCTGAAATTACTCTTTGAATATCTGACCTTATTTGGGATTGATGATAAAATTAGCTTTGATCTGAGCTTGGCCCGCGGTCTTGATTATTATACCGGCGTGATTTACGAAGCTGTTCTCTTGCAAACCCCAGCCCAGGCGGGCGAAGAGCCTTTGGGAGTCGGCAGTGTGGCAGCCGGTGGTCGTTATGATGGTTTGGTAGGAATGTTTGACCCTAAAGGCCGTAAAGTACCATGTGTGGGGCTTTCTATCGGTGTCGAACGTATCTTTTCTATTGTTGAACAACGTCTTGAAGCTTTGGAGGAAAAGATCCGTACCACGGAAacCCAAGTCTTAGTTGCaAGTGCCCAAAAAAAACTGTTAGAAGAACGCCTGAAACTCGTATCAGAACTTTGGGACGCCGGCATCAAGGCCGAACTGCTGTATAAAAAGAACCCGAAATTGTTAAACCAACTCCAGTATTGTGAAGAAGCTGGGATCCCACTCGTAGCTATTATTGGTGAGCAAGAATTAAAAGATGGCGTGATTAAACTGCGTTCAGTAACAAGCCGTGAAGAGGTAGATGTACGTCGCGAAGACTTAGTGGAAGAAATTAAACGCCGCACCGGTCAACCGTTATGTATTTGCGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(SEQ ID NO:42)
翻译的蛋白序列如下：
MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCICAAALEHHHHHH(SEQ IDNO:43)
表达菌株。用密码子优化的表达构建体转化BL21(DE3)感受态细胞(Novagen,目录号69450)。简而言之，将质粒(1μL)加入至50μL的感受态细胞中。将反应物混合并在冰上孵育30min。将反应物于42℃热休克30s(秒)，然后在冰上冷休克2min。接着加入SOC培养基(500μL)，并将所述管于37℃、250rpm下孵育1hr。最后，将小份的培养物(50μL)涂布于氨苄青霉素平板(Teknova S9641)上，并于37℃孵育过夜。挑选出单个克隆并用于表达放大。
培养基。将200mL无菌的M9低盐培养基5X(BD248510)、778mL于无菌纯净水中的30g/L酵母提取物(BD212750)、20mL无菌的20％葡萄糖(Sigma G7021)和2mL无菌1.0M MgSO4(Sigma M7506)混合以制备M9YE培养基。所述进料溶液包含5％酵母提取物、50％葡萄糖、微量元素和2g/L硫酸镁。在M9YE和进料溶液中均添加氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL。
补料分批发酵。将配备MFCS/DA软件的4L发酵罐(Sartorius BiostatB plus)用于补料分批发酵。搅拌转速设为1000rpm。通过添加30％氢氧化铵(Sigma221228)和30％磷酸(Sigma P5811)自动地将pH值控制在7.0。用无油隔膜式空气压缩机(Cole-Parmer)以4L/min的流速提供空气。使空气通过0.2μm Midisart2000过滤器(Sartorius17805)。自动化提供纯氧(West Air)以将溶解氧水平控制在70％。用Neslab RTE7循环器(ThermoScientific)将温度控制在30℃。通过添加消泡剂204(Sigma A8311)控制泡沫。M9YE培养基在发酵罐中的起始体积为3L。将150mL的种子培养物接种到发酵罐中，于30℃和250rpm下生长过夜。当容器中的葡萄糖被消耗后，通过设定为0.9mL/min的蠕动泵将浓缩的进料溶液引入该容器中。当在600nm处的细胞光密度达到约30时，用0.5mM IPTG(FisherScientific BP1755)诱导所述培养物。将培养物运行过夜(约18-hr的分批补料时长)，并在6,000xg下离心1hr进行收集。将细胞聚集体于-20℃储存直至纯化。在SDS-PAGE上确认HisRS的表达。
HisRS的纯化。将冷冻的细胞团(paste)(40g)重悬于160mL(即4mL/g细胞团)的裂解缓冲液(20mM Tris,400mM NaCl,20mM咪唑,14mM β-ME,于4℃，pH8.0)中。将完全无EDTA的蛋白酶抑制剂片(Roche)按照1片/50mL的比率添加至所述悬浮液中。用冰冷却的同时使所述悬浮液以15,000psi通过微流化器(Microfluidics)两次。于4℃、35,000xg下离心该溶解产物45min。将上清液通过0.22μm Acropak200囊式过滤器(Pall)过滤。
将澄清的溶解物结合至Ni-NTA树脂(Qiagen)，其用Ni-NTA结合缓冲液(20mM Tris,400mM NaCl,20mM咪唑,5mMβ-ME,于4℃，pH8.0)预平衡。用500倍柱体积的Ni-NTA结合缓冲液+0.1％Triton X-114洗涤该柱，然后用50倍柱体积的Ni-NTA结合缓冲液洗涤。用5倍柱体积的Ni-NTA洗脱缓冲液(20mM Tris,400mM NaCl,500mM咪唑,5mMβ-ME,于4℃，pH8.0)洗脱所述结合蛋白HisRS。
用阴离子交换柱进一步纯化该Ni-NTA洗出液。具体地，将Ni-NTA洗出液对Q结合缓冲液(20mM Tris,50mM NaCl,1mM DTT,pH7.4)透析，并加载至5mL Q-琼脂糖柱，其用Q结合缓冲液预平衡。用于Q结合缓冲液中的0-1M NaCl线性梯度的10倍柱体积将所需的产物从该柱中洗脱出来。将纯化的HisRS浓缩并经缓冲液交换至PBS(Invitrogen产品#10010)+1mM DTT，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。
实施例3
Resokine(HRS(1-60))作为抗炎剂的评估
为了评估HRS衍生的多肽的潜在抗炎特性，在TNBS诱导的结肠炎模型(Epistem,Ltd,UK)中测试包含HRS的氨基酸1-60(Resokine)的天然存在的N-端剪接变体。
炎性肠病(IBD)、克罗恩氏症和溃疡性结肠炎的最常见形式为消化道的慢性和进行性炎性病症。克罗恩氏症通常影响回肠和结肠，而溃疡性结肠炎通常仅影响结肠和直肠的最里层。克罗恩氏症和溃疡性结肠炎的症状通常类似于腹痛和腹泻。在中度至严重的溃疡性结肠炎中，经常观察到血便。目前还无法治愈IBD。药物和生物制品通常用于治疗症状、诱导缓解和防止复发。抗炎药如柳氮磺胺吡啶、氨水杨酸和皮质类固醇通常是治疗IBD以诱导缓解的一线药物，而免疫系统抑制剂通常用于帮助维持缓解。用于治疗IBD的最常用免疫系统调节剂为咪唑硫嘌呤、巯嘌呤和生物治疗剂如抗肿瘤坏死因子(抗-TNF-α)。
IBD的动物模型的发展有助于对IBD治疗的了解和探索。硫酸葡聚糖(DSS)和三硝基苯磺酸(TNBS)结肠炎的啮齿类模型表明，体重降低的程度、结肠组织病理学和内窥镜检查评分与优先引起中性粒细胞和基质金属蛋白酶渗透的促炎性细胞因子和趋化因子相关联。这些IBD啮齿类模型也已经用于验证鉴定用于IBD治疗的潜在新药的计算方法。
在雄性BDF-1小鼠中进行研究，12只小鼠/组；治疗组中的所有小鼠在研究的第0天通过结肠滴注接受于50％乙醇/盐水中的3mg TNBS，以便诱导结肠炎，且以5mg/kg经口加入布地奈德作为阳性对照。
在该研究中，TNBS治疗前3小时，通过静脉注射以1或5mg/Kg浓度每天给予Resokine。图1中所示的数据表明，用任一浓度的Resokine(HRS(1-60))处理使得存活率明显增加。因此，Resokine看来具有有效的抗炎效果，这与HRS多肽与炎症进程的局部控制有关的假设一致。
为了直接对HRS(1-60)和HRS(1-506)进行比较，通过生物模型(Biomodel)(MA,USA，C57BL/6只小鼠)来进行重复TNBS研究。
研究设计：无处理对照组由5只小鼠组成，对其经直肠内给予TNBS的媒介物(组1)。在第0天将TNBS(4mg/100μL50％乙醇)给予至组2(15只小鼠/组)和组3-7(10只小鼠/组)。第1-5天，组2和4-7每天一次通过静脉内分别接受媒介物、3和1mg/kg的HRS(1-506)，以及5和1mg/kg的Tyr1920给药。第1-5天，组3每天一次经口接受2mg/kg的泼尼松龙给药。每天给动物称重。在第3和5天对所有动物进行视频内窥镜检查，以评估结肠炎严重程度，以及是否能观察到任何有益的治疗效果。在第5天对所有存活的动物进行安乐死，以便获得结肠组织用于测量重量和长度以及病理检查。
方法：用小型动物内窥镜(Karl Storz Endoskope,Germany)以盲试方式进行内窥镜检查。为评估结肠炎严重程度，将动物用异氟烷麻醉，以对下部结肠进行视频内窥镜检查。根据从0代表正常至4代表严重溃疡的5点评级对结肠炎进行目测打分。在描述性术语中，该评级根据表E1中的描述来定义。对每只小鼠给出对应于在整个结肠长度上观察到的最严重损伤的单个分数。在第5天，对动物施行安乐死并切除其结肠，洗涤、称重并测量其长度。
按如下进行组织学评估，检查切割的每只动物的整个下部5cm的结肠，并将来自每一端的2cm节段固定于10％福尔马林中，包埋后按约5微米厚度切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色以用于组织学分析。将中间的1cm结肠节段速冻，并存储于-80℃。由委员会认证的在GI病理学方面具有具体经验的病理医师以盲试方式检查组织节段。采用5点评级根据表E2所列的标准，针对炎症、水肿和上皮坏死/损失对每个节段进行打分。将这4个切割节段中每一节段的分数平均，以获得每只小鼠每个参数的单个平均分数。还报告了作为这3个参数分数总和的平均总分。
结果：所有TNBS-处理的动物在第1天体重均明显减轻，并在第3或4天体重开始增加。在第3和5天，用1和3mg/kg的HRS(1-506)或者1和5mg/kg的HRS(1-60)处理产生了结肠炎分数的轻度至中度的降低(表E3)。相比在第3和5天的其他处理组，用3mg/kg的HRS(1-506)处理一致地产生了结肠炎分数的最大降低(表E3)。用2mg/kg的泼尼松龙处理在第5天产生了轻度的结肠炎分数降低，但在第3天无影响。相比用TNBS+媒介物处理，用1和3mg/kg的HRS(1-506)或者1和5mg/kg的HRS(1-60)处理导致了炎症、水肿、上皮坏死/损失分数和总分的明显降低(表E3)。
结论：在TNBS-诱导的结肠炎小鼠模型中，用1和5mg/kg的HRS(1-60)以及1和3mg/kg的HRS(1-506)经静脉内处理，使得内窥镜检查的结肠炎分数和炎症、水肿、上皮坏死/损失的病理学分数和总分明显降低。没有源于用HRS(1-60)、HRS(1-506)或泼尼松龙处理的不良作用。这些结果确认了此前的研究，并进一步确立了HRS多肽在炎性疾病和病症如IBD中的抗炎作用。
实施例4
全长HARS中的半胱氨酸残基的活性位点滴定
为确定全长HARS中表面暴露的半胱氨酸残基的位置和特性(identity)，将纯化的重组蛋白与碘乙酰胺在天然和变性的条件下一起孵育以烷基化任何表面暴露的半胱氨酸残基。然后，通过限制性蛋白水解以及随后的液相色谱-质谱(LC-mass)来分析样品，以确定所述修饰的半胱氨酸残基的位置和特性。
为进行烷基化研究，首先通过将全长的多组氨酸标记的HRS(于PBS中6.65mg/ml、10％甘油、2mM DTT，pH7.4，实施例2)与10mM DTT于室温孵育45min来完全还原。与碘乙酰胺的孵育是用30mM(“低”)或100mM(“高”)浓度的碘乙酰胺在黑暗中进行30min，且在HARS的天然和变性的样品中进行以确认所述反应成功了。将所述蛋白与4M的胍于50℃预孵育45min来制备变性的HARS。用碘乙酰胺孵育后，采用10KDa分子量截留的透析膜，将样品在PBS(pH7.4)中于4℃透析，并至少更换3次缓冲液，然后按如下所述用于质谱分析。
简而言之，通过将所述蛋白稀释于0.1％的甲酸中至终浓度为1m/ml以制备样品，并注射5μg蛋白样品，并通过反相HPLC进行分析，然后采用Agilent TOF质谱仪进行质谱分析。首先将样品在C3HPLC柱(Agilent ZORBAX 300SB-C3,5μm,2.1x150mm柱)上采用线性梯度(2-60％的流动相B)分离18min(流动相A:0.1％甲酸；流动相B:0.1％甲酸的乙腈溶液)。以轮廓模式(profile mode)进行样品的质谱分析。获得数据并通过MassHunter(Agilent)进行分析。通过MassHunter Bioconfirm Agilent来计算测量的分子量。
结果(数据未显示)表明，在天然条件下仅3或4个半胱氨酸残基是易于修饰的，然而通过比较，当所述蛋白首先被变性以破坏其天然构象后所有10个半胱氨酸均容易变性。
为了确定修饰的半胱氨酸残基的特性，将用碘乙酰胺孵育之前和之后的样品在4M盐酸胍中于37℃变性30min，然后用LysC以10:1的比例(w/w)于室温蛋白水解切割20h。采用Dionex HPLC和Thermo LTQ XL质谱仪通过LC/MS/MS分析蛋白消化产物。首先在C18HPLC柱(AgilentZORBAX 300SB-C18,5μm,2.1x150mm)上采用流动相B梯度(流动相A:0.1％甲酸；流动相B:0.1％甲酸的乙腈溶液)分离样品。该梯度10min内以1-3％B起始，然后在76min内达至40％B。分离的蛋白消化产物通过完全MS以轮廓模式或者通过完全MS扫描进行分析，通过串联MS/MS扫描对顶部的3种鉴定的离子进行分析。获得了数据并通过Xcalibur(Thermo)进行分析。基于每种肽的MS/MS光谱进行肽测序，其中b-和y-离子峰匹配其理论离子。肽的确定和修饰位点的图谱分析基于其分子量并通过使用MS/MS光谱的肽测序确定，其列举于表E4中。
这些结果揭示(数据未显示)，Cys235、Cys507和Cys509容易通过碘乙酰胺处理来修饰，因而可能是易于接受化学修饰的表面暴露的残基。
实施例5
产生具有改变的半胱氨酸含量的修饰的HRS多肽
为了确定全长HRS中10个天然存在的半胱氨酸残基的任一个是否能够被突变为替代性天然存在的氨基酸残基或者被缺失，设计了引物以选择性突变每个半胱氨酸残基。为实现这一点，可使用基于以下的引物(参见表E5)。
为了确定活性位点滴定数据，采用程序Getarea1.1分析全长HRS的晶体结构以评估所述10个半胱氨酸残基的相对位置。结果(数据未显示)显示，除了Cys235、Cys507和Cys509，在SEQ ID NO:1的位置Cys174、Cys191和Cys224处的半胱氨酸至少部分地暴露于表面，且有可能通过标准试剂来修饰。此外，HRS的晶体结构分析显示，Cys174和Cys191能够形成内部二硫键，而Cys507和Cys509能够在HRS二聚体内形成链间二硫键，二者均可能有助于能够有利地被消除的微异质性。
为直接评估这两个C-端半胱氨酸残基在促进链间二硫键形成方面的重要性，在还原之前和之后通过SDSPAGE分析来比较His-标记形式的全长HRS和C-端缺失形式的HRS(HRS(1-506))，如下文所述。如图2所示的结果表明，全长HRS为非共价的和SS-连接的二聚体的～50:50混合物，而HRS(1-506)明显减少了SS连接的二聚体。如下文所述，通过竞争性ELISA比较这两种蛋白揭示，针对Jo-1抗体结合这两种蛋白具有相当的IC50值(数据未显示)。HRS(1-506)有关的链间二硫键形成明显减少表明，该变体是开发改善的下一代产品形式的合适起点。
为确定全长HRS中其余4个部分暴露的半胱氨酸残基中任一个是否能够被突变为替代性天然存在的氨基酸残基，设计了引物以选择性突变C174、C191、C224和C235残基。为实现这一点，使用了以下表E6中列举的引物。
采用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(Agilent,目录号210518)按照生产商的指导，通过诱变来引入突变。诱变后，用Dpn I酶于37℃处理样品，并采用常规方法转化至XL10-Gold感受态细胞。使多个克隆在Terrific Broth培养基中于37℃过夜，并将所得的质粒用QIAprep Spin质粒小提试剂盒(Qiagen目录号27106)纯化。将质粒测序以确定每个克隆的氨基酸替换的特性。将代表性克隆转化至NovaBlue感受态细胞(Novagen目录号70181)中，并在250ml M9YE培养基中于37℃过夜。采用HiSpeed质粒大提试剂盒(Qiagen目录号12663)进行大规模制备以产生突变体的质粒储备用于进一步分析。通过测量A260、A280和A230来确定浓度和纯度。将纯化的质粒储存在-20℃，然后按照标准方法转染至大肠杆菌或哺乳动物细胞中。
为评价每个残基突变的突变影响，将代表性的克隆转化至大肠杆菌或哺乳动物细胞中，在ELISA分析中检测其产率、内毒素含量、稳定性和相对活性以确定Jo-1抗体结合，如下文所述。
蛋白生产。用编码还原型半胱氨酸构建体的密码子优化的表达构建体转化BL21(DE3)感受态细胞(Novagen,目录号69450)或W3110细胞(ATTC)，如上所述。在调整生产规模和所用细胞团的量以后，用于产生重组蛋白的表达系统、发酵培养基、发酵条件和纯化步骤基本上与下文的实施例6中描述的相同。以下的表E7显示了制备的蛋白的纯化产率和内毒素水平。
结果显示，所有还原型Cys变体均相对很好地被表达，并成功地以低内毒素水平被纯化。尤其是，基于Cys191和Cys235的突变的还原型半胱氨酸变体展示了良好的表达水平；但所有克隆均展现了合理的表达水平和低内毒素水平。相比全长HRS的表达，所有的半胱氨酸修饰的蛋白均展示出明显更少的内毒素含量。而且，相比全长野生型HARS，还原型半胱氨酸突变体HRS(1-506)、HRS(1-506)C191V、HRS(1-506)C191S和HRS(1-506)C235S均显示出改善的表达。
为评估半胱氨酸突变对纯化的蛋白的电荷异质性的影响，通过等电聚焦分析了每个克隆的样品。将样品(10μg)加载至等电聚焦凝胶(pH3-10)，其采用Life Technologies的Novex pH3-10IEF凝胶1.0mm(目录号P/N EC6645BOX)、Novex IEF标记物3-10(目录号P/N391201)、NovexpH3-10IEF缓冲液试剂盒(目录号P/N LC5317)，用1X阴极缓冲液(上部腔室)和1X阳极缓冲液(下部腔室)在100V下运行1h、200V下运行1h，以及500V下运行30min。将凝胶用含有3.5％磺基水杨酸的12％TCA溶液固定30min，并用Expedeon的InstantBlue(目录号P/N ISB1L)染色。数据(结果未显示)表明，在174位置的半胱氨酸突变明显降低了等电点异质性，这与该半胱氨酸残基经历与半胱氨酸191的分子内二硫键形成的可能性一致。
为了评估半胱氨酸修饰对所得蛋白的热稳定性、聚集倾向、结构和tRNA合成酶活性的影响，通过差示扫描荧光分析、尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)、竞争性ELISA和活性位点滴定来评估该蛋白。结果如下文的表E8所示。
通过监测热变性期间亲脂性染料的荧光性与荧光强度的函数关系对蛋白样品进行差示扫描荧光分析。在100μL最终体积的PBS(150mMNaCl,20mM磷酸盐，pH7.0)中将样品稀释至0.5mg/mL，并与热转移染料溶液混合后对样品进行研究，所述热转移染料溶液是通过在超纯净蒸馏水(Gibco,P/N10977)中将储备液(Applied Biosystems/Life Technologies,P/N4461146)稀释20倍而制备的。将5μL的稀释染料添加至100μL的样品中。将该混合物接种至384-孔透光反应平板(Applied Biosystems/LifeTechnologies P/N4309849)上，每孔20μL，且每个样品4个孔的重复。用ViiA7实时PCR仪(Applied Biosystems/Life Technologies,P/N4453552)对该平板进行读数。该热变性方案以1.6℃/s的速率变化启动，直至温度达到25℃，此时仪器保持该温度2min，然后以0.5℃/s的速率进一步升温至99℃，此时另外保持该温度2min。
对纯化的蛋白样品进行尺寸排阻HPLC分析，其使用TSKgel SuperSW3000,4.6mm ID x30cm,4μm粒径，柱(Tosoh,18675)；采用的流动相为200mM磷酸钠、150mM NaCl(pH7.0)，流速0.3ml/min；使用的Agilent1260HPLC系统配备有真空脱气装置、二元/四元泵、恒温的自动进样器、恒温的柱室、二极管阵列检测器(DAD)和Chemstation色谱分析软件)。将每种蛋白的未稀释样品(40μg)进行简短离心后加注。使用系统适应性样品(牛血清白蛋白,BSA,Thermo Scientific,P/N:23209)和内部对照(野生型HRS)来支持样品以确保该测试的有效性。
在96-孔平板(Immulon 4HBX)中进行竞争性ELISA，所述平板涂覆有50μL的全长his-标记的HARS溶液，并用PBS将其浓度调整为2μg/mL。将平板密封并于4℃孵育过夜。使用前用PBST洗涤平板5次，然后用100μl1％BSA的PBS溶液于室温封闭1h。当封闭ELISA平板时，在单独的孵育平板(Costar3357 96-孔)中将还原型半胱氨酸竞争分子(浓度范围为1x10-6M至1x10-13M)与于1％BSA PBS中以1:10,000稀释的α-Jo-1抗体(GenWay GWB-FB7A3D或Immunovision HJO-0100)于4℃孵育1h。完成封闭后，用PBST洗涤ELISA平板3次，并将含有抗体和竞争物的50μL溶液添加至ELISA平板，并于室温孵育样品1.5h。在最初的结合孵育后，用PBST洗涤平板5次。然后添加50μL以1:5,000稀释的检测抗体(AbD Serotec山羊抗-人IgG F(ab’)2:HRP0500-0099)，并于室温孵育1h。第二次结合孵育后，用PBST洗涤平板5次，并添加50μL TMB底物(Thermo Scientific Pierce TMB底物PI-34021)。反应进行8min后添加50μL的2M硫酸终止液。采用SpectraMax平板读数仪于450nM处进行比色定量。
为了确定在每个HARS506半胱氨酸变体中的催化活性位点的数目，进行了活性位点滴定检测(如Fersht et al.,(1975)Biochemistry中所描述)。简而言之，于室温进行分析，使用于标准缓冲液(100mM HEPES pH7.5,20mM KCl)中的5μM HARS、10mM MgCl2、50μM ATP、20mM L-组氨酸、2μg/mL无机焦磷酸酶和1.65μM[γ-32P]ATP。在低容PCR平板中用酶启动反应，在含有HClO4/木炭悬浮物(1:47％HClO4:10％木炭悬浮物)的96-孔PVDF multiScreen过滤平板Millipore中于以下时间点进行淬灭：30s、1min、2min、4min、6min和10min。通过吸量管上下混合往后，将样品喷至含有Supermix闪烁材料的收集板中，并在Microbetae平板读数仪中计数。
来自这些研究的结果确认，所有半胱氨酸突变体均具有活性，通过活性位点滴定、ELISA结合以及针对热变性的Tm测定的测量，其活性、稳定性或构象损失很少或没有损失。tRNA合成酶活性的活性位点滴定揭示，所有还原型半胱氨酸突变体均具有活性，因而适用于本发明的任何组合物、方法和试剂盒。通常，如通过等电聚焦所测，Cys191替换展现总体上较低的热稳定性，而Cys174突变体展现明显更小的异质性。
实施例6
制备具有C-端截短的修饰的HRS多肽(HisRSN8)
为了缺失最后3个氨基酸和野生型HisRS和His标签之间的连接子，设计了引物以与QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(Agilent,目录号210519)一起使用。为实现这一点，使用了如以下表E9中所列举的引物：
按照QuikChange Lightning定点诱变试剂盒生产商的说明书指导产生缺失。诱变后用Dpn I酶于37℃处理样品，并用常规方法转化至XL10-Gold感受态细胞。将多个克隆在Luria-bertani液体培养基中于37℃生长过夜，并用QIAprep Spin质粒小提试剂盒(Qiagen目录号27106)纯化所得的质粒。将质粒测序以确认每个克隆的氨基酸替换的特性。为了缺失His标签，设计了引物以与QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(Agilent,目录号210519)一起使用。为实现这一点，使用如以下表E10所列举的引物：
按照QuikChange Lightning定点诱变试剂盒生产商的说明书指导产生缺失，如以上所述。
蛋白制备。用编码HisRSN8(HRS(1-506))的密码子优化的表达构建体转化BL21(DE3)感受态细胞(Novagen,目录号69450)或W3110细胞(ATTC)，如实施例2中所述。用于产生重组蛋白的表达系统、发酵培养基和发酵条件基本上与实施例2中描述的相同。
无标记的HisRSN8(HisRS(1-506))的纯化。将冷冻的细胞团(400g)重悬于4-倍体积(1600mL)的裂解缓冲液(50mM Tris,50mM NaCl,5mMMgCl2,2mM L-半胱氨酸,pH7.4)中。以1片/50mL的比率将完全无EDTA的蛋白酶抑制剂片(Roche,目录号05 056 489 001)添加至所述悬浮液中。用冰冷却的同时将悬浮液以18,000psi通过微流化器(Microfluidics)两次。以15,000xg于4℃离心该裂解产物45min。将上清液通过2-3个AcroPak1500囊式过滤器(0.8/0.2μm,Pall,PN12675)过滤。
将澄清的裂解产物加载至用Q缓冲液A(50mM Tris,50mM NaCl,pH7.4)预平衡的382ml Q HP柱(5x19.5cm)。用0-30％线性梯度的Q缓冲液B(50mM Tris,1M NaCl,pH7.4)的10倍柱体积(CV)洗脱产物。以1/2CV/级分收集级分并通过SDS-PAGE进行分析。基于凝胶分析进行合并。
将3.5M硫酸铵溶液添加至上述的Q HP合并液中至终浓度为1.2M。将混合物通过AcroPak 200(0.2μm)过滤，并加载至用20mM Tris、1.2M硫酸铵(pH7.0)预平衡的481ml Phenyl HP柱(5x24.5cm)。用于20mMTris/pH7.0中的1.2–0M硫酸铵线性梯度的10CV洗脱产物。将含有基于SDS-PAGE分析的产物的级分(1/2CV/级分)合并。
通过TFF系统将源自以上的Phenyl合并液浓缩至0.5L，所述TFF系统由Pellicon Mini盒座(Millipore目录号XX42PMINI)、Masterflex I/P泵，和2x0.1m2盒(30kD MWCO,Novasep目录号PP030M01L)组成。然后将所述浓缩的溶液与6倍渗滤体积(diavolume)(3L)的CHT缓冲液A(10mM磷酸钠,150mM NaCl,pH7.0)进行缓冲液交换。将渗余液通过0.2μm Millex GP-50过滤器(Millipore part#SLGP05010)过滤，然后再进行下一步骤。
将以上溶液加载至用CHT缓冲液A预平衡的380ml陶瓷羟基磷灰石(CHT)柱(5x19.4cm)。将该柱先用缓冲液A洗涤，然后用6％缓冲液B(500mM磷酸钠,150mM NaCl,pH7.0)洗涤。用6-56％缓冲液B线性梯度的10CV洗脱产物。将含有基于SDS-PAGE分析的产物的级分(1/2CV/级分)合并。
使用相同的TFF系统，将该CHT合并液浓缩至～0.2L，与6倍渗滤体积(diavolume)的当前配制缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl,pH7.0)进行缓冲交换，并浓缩至～10mg/ml的目标浓度。将产物溶液通过0.2μmMillex GP-50过滤器(Millipore part#SLGP05010)过滤，并储存于-80℃冰箱中。
实施例7
评估HRS多肽与来自人患者样品的抗-JO-1抗体的结合
将96-孔平板(Immulon4HBX)用50μL蛋白溶液涂覆，用PBS调整浓度为2μg/mL。将平板密封并于4℃孵育过夜。使用前用PBST洗涤平板5次，随后用在PBS中的100μL1％BSA于室温封闭1h。当ELISA平板进行封闭时，在单独的孵育平板(Costar3357 96-孔)中将竞争分子与商购的于1％BSA PBS中的各种稀释的α-Jo-1抗体(GenWayGWB-FB7A3D,Immunovision HJO-0100或RDL)于4℃孵育1h。封闭完成后，用PBST洗涤ELISA平板3次，并将50μL含有抗体和竞争物的溶液加载至ELISA平板，并将样品于室温孵育1.5h。初始结合孵育后，用PBST洗涤平板5次。然后，将50μL的检测抗体(AbD Serotec山羊抗人IgG F(ab’)2:HRP0500-0099)以1:5,000的稀释度添加，并于室温孵育1h。第二次结合孵育后，用PBST洗涤平板5次，并添加50μL TMB底物(Thermo Scientific Pierce TMB底物PI-34021)。反应进行8min，此时添加50μL的2M硫酸终止液。用SpectraMax平板读数仪于450nM处进行比色定量。
显示了HisRSN8(HRS1-506)相比全长HRS(图5)、Resokine(HisRSN4:HRS(1-60))相比全长HRS(图4)，和以一系列稀释度的血清孵育的全长HRS(图3)的竞争性ELISA的代表性结果。数据显示，HisRSN8和全长HRS而非Resokine，能够竞争性地结合抗-Jo-1抗体，所述抗体来自具有抗-Jo-1抗体的炎性肌肉疾病和/或间质性肺病人患者样品。因此，HisRSN8和全长HRS提供了可行的策略来竞争和封闭抗-Jo-1抗体的活性，该抗-Jo-1抗体来自患有与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体有关的疾病的人临床样品。
此外，数据出人意料地显示，当全长组胺酰t-RNA合成酶结合至平板表面时，这些条件下的Resokine(HisRSN4)没有明显地与抗-Jo-1抗体交叉反应，且没有明显地竞争直至其存在的浓度大于约1x10-7M。Resokine(HisRSN4)因而可给予至患者以介导抗炎效果，可能不会导致与循环的抗-Jo-1抗体明显的交叉反应。
为进一步探索该观察，采用常规滴定ELISA检测进行了另外的竞争研究(图6)。这些结果显示，当HisRSN4或基本上全长的组氨酰-tRNA合成酶结合至平板的表面上时，抗-Jo-1抗体的结合曲线大致相当，表明亲和力或其他作用可能主要归因于在竞争性ELISA检测中观察到的明显差异。
实施例8
抗-JO-1抗体表位特异性的评估
为评估来自多名患者的抗-Jo-1抗体的表位特异性，从RDL(California)获得了血清样品，并用消耗ELISA法进行筛选以确定样品的相对抗体特异性。
简而言之，用His-标记的如图7所列的蛋白样品建立ELISA平板，如此前所述，这些样品如实施例2中所述在大肠杆菌中被表达和纯化。首先在含有上述所列蛋白的ELISA平板中孵育样品(参见实施例5)，然后将上清液转移至基本上全长的组氨酰-tRNA合成酶所结合的新的ELISA平板。通过比较消耗之前和之后的抗体滴度，可能预测每种蛋白构建体特异性的结合抗-Jo-1抗体部分。
如图8所示的数据显示了，对WHEP结构域区(1-60)以及蛋白的剩余部分(dWHEP)均具有特异性的众多抗体。
实施例9
用HRS多肽在体外去除JO-1抗体
为评估HRS多肽是否能够用于有效地免疫消耗来自患者血清的抗-HRS抗体(例如，抗-Jo-1抗体)，将HRS(1-506)和HRS(1-60)样品固定于固体载体，然后与血清接触以确定是否能够免疫消耗血清样品的抗-HRS抗体。在加载至亲和柱之前和之后测量抗-Jo-1抗体的滴度以评估每种HRS多肽去除抗-Jo-1抗体的能力。
HRS多肽的固定和Jo-1抗体消耗。采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联化学按照生产商的推荐(Bio-Rad Affi-gel10，目录号153-6046)，将全长HARS、HRS(1-506)、HRS(1-60)和牛血清白蛋白固定于琼脂糖凝胶。采用每1mL树脂2mg蛋白的比率进行缀合。将获自提供商(RDL,LosAngeles CA)的人抗-Jo-1抗体以1:1,000稀释，然后使样品流经用每种按如上所述制备的固定的HRS多肽琼脂糖缀合物制成的柱。在流经亲和柱之前和之后，按如下所述测定Jo-1抗体滴度。
Jo-1抗体滴定。以于PBS中的2mcg/mL浓度的HisRS1涂覆96-孔平板(Thermo scientific Immulon4HBX平板，目录号6484)，于4℃过夜。第二天用PBST洗涤平板，并用在PBS中稀释的1％BSA(Invitrogen,目录号15260)于室温下封闭1h。然后用PBST洗涤平板3次，并与含有Jo-1抗体的样品于37℃孵育1.5h。然后再用PBST洗涤平板3次，并用第二抗体(AbD Serotec山羊抗人IgG,目录号0500-0099)孵育，并于室温孵育1h。然后再用PBST洗涤平板3次，并用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(Thermo scientific,目录号34021)孵育5min，并添加2M硫酸并混合以终止该反应。然后于450nM处对平板读数并确定相对抗体滴度。
结果(图9)揭示，全长HARS和HRS(1-506)均在免疫消耗来自人血清样品的Jo-1抗体中有效。出人意料的是，仅流经亲和树脂一次，HRS(1-506)能够去除高达99％的可检测的Jo-1抗体，而在同样条件下全长HARS能够去除仅约93％的可检测的抗体。与此前的研究一致的是，使用更小片段的HARS——HRS(1-60)能够去除仅约20％的可检测的抗体，显示了该HRS多肽能够用于选择性去除循环的Jo-1抗体的特定亚群。
实施例10
HRS多肽用于治疗他汀类诱导的肌肉炎和横纹肌溶解症的评估
他汀类是HMG CoA还原酶抑制剂，其抑制甲羟戊酸合成，这是胆固醇合成中的限速步骤。已经证明他汀类治疗在降低患者胆固醇水平中有效。然而，他汀类治疗的副作用和并发症包括肌无力、肌肉炎和横纹肌溶解症。肌肉病是几种市售他汀类的并发症，且如果患者展现任何这些症状则常常解除他们的他汀类治疗。和很多其他肌肉疾病、肌营养不良症和肌肉炎性病症一样，他汀类诱导的肌肉疾病似乎由于最初的化学、基因或身体损伤而发生，其由于免疫细胞侵入受损的肌肉细胞而使得炎症愈发加剧。
因此，他汀类诱导的肌肉疾病代表一种广泛适用的研究药物诱导的肌肉炎的模型系统，其可直接应用于其他肌肉疾病和肌营养不良症，这些病症均具有通过促进免疫细胞入侵受损的肌肉组织而介导疾病进展的共同炎性组分。
如响应HRS(1-506)治疗而改变的循环的酶水平，以及肌肉功能的基因表达变化和炎性标记物所显示，本研究的目的是评估HRS(1-506)在逆转他汀类诱导的肌肉炎效果中的效力。
为实现这一点，用1mg/kg西立伐他汀每日向大鼠给药，然后改为隔日(qod)用西立伐他汀给药。该给药方案的目的是维持动物中的持续疾病状态，但疾病没有严重到使得大鼠存活率大受影响的程度。然后在他汀类给药已经引起肌肉炎的循环的标记物可测量的变化后，评估HRS(1-506)的剂量范围的效力。
方案和方法。在本研究中，从第1天开始用于0.5％甲基纤维素中的1mg/kg西立伐他汀((Sigma,目录号SML0005)经口填喂处理10周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠。每日给药7天后，在第9、11和13天对大鼠改为隔日给药策略(qod)。从第6天开始通过静脉内注射给予HRS(1-506)和媒介物，并每日向大鼠给药至第14天(如图10A中所示)。在最后的测试物给药24h后以及最后的他汀类给药48h后，即在第15天处死所有大鼠。于20mM NaPO4、0.15M NaCl(pH7.0)中的HRS(1-506)每日以3种剂量(0.3、1.0和3.0mg/kg)给药。
为实现本研究的首要目的，进行了以下研究测量和端点：第12和15天的大鼠存活率、体重、循环的血清CK水平、第15天腿筋样品的H&E染色、第15天血液的肌钙蛋白-I ELISA、CBC、腿筋样品的qPCR和血清内源HARS水平。
qPCR方法。从动物切下小鼠腿筋并于-80℃储存直至分析。采用Qiagen’s RNeasy纤维组织中提试剂盒(目录号75742)以10个腿筋的组准备组织。一旦从Qiagen柱中洗脱RNA后，即在Agilent生物分析仪2100上运行以检测RNA完整性，并在NanoDrop上测定RNA浓度和纯度。然后将RNA储存于-80℃。
在Eppendorf’s Mastercycler PCR仪上以96-孔PCR板形式按照以下程序进行RNA至cDNA的逆转录(RT)：37℃，60min；95℃，5min。96-孔平板的边缘孔没有使用，而灌注了50mcL水以防止里面的孔蒸发。每个样品RT使用20mcL RNA和30mcL的逆转录Master Mix(Ambion’sTaqMan PreAmp Cells to CT试剂盒目录号4387299)。一旦RT完成，下一步即为样品cDNA中目的基因的预扩增。将目的基因的引物(Fluidigm设计的DELTA基因引物)合并至终浓度为200nM。使用这些引物，预扩增每个样品中的目的基因。采用Applied Biosystems ViiA7PCR仪，以384-孔形式在10mcL反应物(2.5mcL cDNA,7.5mcL Pre-Amp mastermix)中按以下程序进行预扩增：95℃，10min；95℃下15s和60℃下4min共14个循环。预扩增步骤后，添加核酸外切酶(New England BioLabs目录号M0293L)以从每个样品中去除未整合的引物。该核酸外切酶反应也在ViiA7PCR仪中按以下程序完成：37℃，30min；80℃，15min。核酸外切酶消化后，进一步以1:5稀释RT样品(7mcL核酸外切酶样品+18mcL低EDTA缓冲液)。
用于在Fluidigm生物标记系统上运行qPCR的芯片为用于基因表达的96.96动态阵列IFC。在样品和Assay试剂加载以前，首先按照生产商的推荐用IFC Controller HX装填(prime)该芯片。为制备待加载至芯片上的Assay试剂，在96-孔平板中制备了针对每种目的基因的3.6mcL 20mcM正向和反向引物的4.4mcL Assay Master Mix(Fluidigm’s2X Assay加载试剂，目录号8500736和低EDTA TE)。为制备样品，将4.5mcL样品MasterMix(Ambion’s2X TaqMan基因表达Master Mix,Fluidigm的20X DNA结合染料样品加载试剂，目录号100-0388，和Biotium的20X EvaGreen，目录号31000)添加至96-孔平板上的3mcL稀释的预扩增/核酸外切酶样品中。一旦完成芯片装填，即将以上制备的5mcL样品或Assay加载至芯片上。然后将芯片返回至IFC Controller以便将样品加载至芯片。完成芯片加载后，然后可在采用具有熔解曲线的、针对用于基因表达的96.96动态阵列的预设程序的Biomark上运行qPCR，以确定引物的特异性。通过Δ-ΔCt法测定相对基因表达。
胞外HARS的定量。采用夹心形式的2种小鼠抗-HARS单克隆抗体M03(Sigma#SAB1403905和Abnova#H00003035-M03)和M01(Abgent#AT2317a)内部研发了基于96-孔的ELISA，以检测大鼠血清中的HARS。利用以HRS(1-506)储备溶液产生的范围为75-0.1ng/ml的7点标准曲线，在96-孔Costar平板(Costar96-孔平板#3369)上运行Assay试剂；(7.5mg/ml,20mM NaPO4,0.15M NaCl pH7.0,采用1x PBST(0.05％吐温-20)作为稀释剂)。在内部将M01小鼠单克隆的克隆1C8(Abgent#AT2317a)生物素化并用作检测抗体，并将M03小鼠单克隆抗体(Sigma#SAB1403905,lot#11238,0.5mg/mL；和Abnova#H00003035-M03,lot#11238,0.5mg/mL)用作捕获抗体。将酪蛋白(Thermo Scientific#37528)用作封闭剂，并将1xPBST(0.05％吐温-20)用作洗涤缓冲剂。采用链霉亲和素-HRP(Invitrogencat#434323,Lot#816755A)，使用TMB底物(Thermo#34021)进行抗体结合的定量，并用2M硫酸作为终止液。
通过用于1X PBS中的0.6-2μg/ml M03抗体涂覆平板过夜来运行ELISA分析，然后通过与酪蛋白孵育1h来封闭，并用PBST洗涤3次。然后将平板与标准品和样品孵育1h，用PBST洗涤3次，然后与稀释于PBST中的500ng/ml生物素化的M01孵育1h，用PBST洗涤3次，与200ng/ml链霉亲和素-HRP孵育1h，用PBST洗涤3次，然后添加TMB底物4min。用终止液终止反应，并在450nm处读取吸光度。
基于根据未做背景削减的平均原始吸光度值制作的标准曲线对结果进行定量。使用Prism进行标准曲线拟合。模型：针对每个单独的浓度点(非平均的)，按照下式计算Log(激动剂)相对于响应拟合[4-参数逻辑回归]恢复百分比：
其他读取。每日对大鼠称重。在第1、8、12天(通过尾静脉)和第15天(终点)进行血清取样以用于循环酶的分析(Idexx)和血清骨骼肌肌钙蛋白-I的测量，采用商购的ELISA试剂盒进行测量。在第3、5、8、10、12和15天当天给药之前进行尿液检验。在对大鼠实施安乐死之前，对在第15天分离的血液进行CBC分析。在第15天对小鼠实施安乐死，并将一部分腿筋肌肉和肺(未充气的)放置于10％NBF中用于石蜡包埋和切片的H&E染色(Premier Laboratory)。将另一部分腿筋肌肉和肺放置于-80℃用于RNA提取和特性分析。在第15天还分离了肝、肾和心脏并放置于锌-福尔马林中用于石蜡包埋(TSRI Histology)以进行长期组织保存。
结果。在该研究中有100％的存活率，并且所有大鼠均活到预定处死的第15天。相比没有给予他汀类的对照大鼠，给予他汀类的大鼠具有更低的平均体重。在第15天，他汀类+媒介物组在所有组中具有最低的大鼠平均体重，而他汀类+3mg/kg HRS(1-506)给药组具有所有他汀类处理的动物中最高的平均体重(数据未显示)。CBC分析显示了不同动物处理组间变化的总体类似形式(数据未显示)。
在第12和15天，相比未处理的对照，在他汀类处理的大鼠中观察到血清CK的小量增加。在第12天，相比他汀类+媒介物处理的动物，以1mg/kg和3mg/kg HRS(1-506)给药的大鼠具有更小的、更紧密CK平均值。(图11)与HRS(1-506)处理对他汀类诱导的肌肉炎的积极影响一致，也与HRS(1-506)对肌肉功能的积极作用一致，在HRS(1-506)处理的动物中肌肉肌钙蛋白C水平也降低了(图10B)。而且，相比未接受他汀类的大鼠，他汀类处理的大鼠中内源血清HRS水平提高了(图12)，这表明释放的HRS可作为肌肉炎症的内源调节剂发挥作用。相比给予媒介物和给予0.3mg/kg HRS(1-506)的大鼠，在以1mg/kg和3mg/kg HRS(1-506)给药的他汀类处理大鼠中，腿筋的H&E染色显示减少的肌肉退化/坏死和炎症分数(图13)。
为进一步研究HRS对他汀类诱导的肌肉疾病的作用机制，在完成该研究后，对处理的动物腿筋中的基因表达的变化进行了检测。对如上所述在第15天分离自大鼠的腿筋肌肉进行RNA特性分析。这些研究的结果表明，响应他汀类处理而提高多于5倍的所有13个基因，通过用HRS(1-506)处理而降低了(参见表E11；和图14-15)。
他汀类处理的大鼠腿筋的转录特性分析：揭示了10个糖尿病/代谢综合征相关基因(图16)和几个管家基因(数据未显示)未受到HRS处理的明显影响。相反，他汀类处理的大鼠腿筋的26个免疫细胞标记基因的转录特性分析揭示了大多数基因的明显变化(参见图17-19)，包括ITGAL(CD11a)、CD11b、CD8a、CD8b、CD18、CCR5和PTPPC(CD45R)表达的剂量依赖性抑制作用。此外，HRS(1-506)可有效降低许多炎性标记基因的表达，包括IL6、MCP1、IL10和IFN-γ(参见图20-21)。在14个粘附、发育和纤维变性相关基因中(参见图22-23)，在肌肉收缩性基因Neb中(数据未显示)，以及在肌肉消耗、萎缩和肌生成相关基因中(参见图24-25)，也观察到转录的变化。
结论。相比接受媒介物或0.3mg/kg的低剂量HRS(1-506)的动物，在接受1.0mg/kg或3.0mg/kg的更高剂量HRS(1-506)的动物中均观察到降低的CK、血清肌钙蛋白-I和肌肉细胞退化/坏死和肌肉炎症。RNA特性分析的数据，通过显示被给予更高剂量HRS(1-506)的他汀类处理的大鼠腿筋中降低的CD8a、IL-6、MCP-1和MMP-9表达而支持这些结果。这些基因的上调很可能是由于增加的免疫细胞渗入至受损肌肉组织中。基于表达的基因的特性，渗入的免疫细胞很可能由以下一种或多种细胞类型组成：T细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞/单核细胞。所有这些细胞类型均与肌肉炎症有关，并且HRS多肽的能力，包括HRS(1-506)介导对该免疫细胞侵入的显著抑制的能力，表明HRS多肽如HRS(1-506)代表有效的免疫调节剂，其能够在众多的炎症和自身免疫疾病和病症中作为有效的免疫调节剂。
实施例11
HRS多肽用于治疗肌营养不良症的评估
杜兴氏肌营养不良症(DMD)是由编码抗肌萎缩蛋白的基因的突变引起，所述抗肌萎缩蛋白是一种在抗肌萎缩蛋白相关的糖蛋白复合物(DGC)中起作用的亚肌纤维膜蛋白。DGC复合体连接细胞内细胞骨架与细胞外基质。DGC集中在肌节的Z线并使得力在肌肉纤维间传递。破坏这一环节导致膜不稳定，其最终导致肌纤维膜的破裂。细胞外钙离子涌入改变了分子过程如肌肉收缩并激活蛋白水解活性。受影响的肌肉纤维坏死或凋亡，并释放促有丝分裂的化学诱导物，其引发炎症过程。变性和再生周期最终导致不可逆的肌肉萎缩并被纤维和脂肪组织替代。
通过激活未分化的生肌前体细胞(卫星细胞)有可能使肌肉再生，卫星细胞通常为静止的且其位于基膜和肌纤维之间。激活以后，卫星细胞增殖并不对称地分裂，其子细胞具有不同的细胞命运。子细胞中仅一种向成肌细胞期分化和发展，并于随后与其他成肌细胞或受损的肌纤维融合以诱导肌纤维修复。另一类子细胞保持增殖状态或回复至静止状态。在卫星细胞中也存在导致DMD的遗传变异。因此，恢复正常肌肉功能的能力依然受阻。少量肌纤维能够产生功能性抗肌萎缩蛋白，主要是由于生肌前体细胞中的第二次突变，其恢复了阅读框。然而，这些所谓的回复突变体纤维为极少数从而不能缓解抗肌萎缩蛋白缺乏症。由于退化和再生循环引起的卫星细胞池枯竭被认为是该疾病的主要原因。
针对DMD的mdx小鼠模型具有在Dmd基因的外显子23中的自发突变，引入了提前终止密码子。mdx小鼠病理学的特征在于，其组织学上定义明确的阶段与人病理学类似。新生的肌肉组织看起来不受影响。坏死或凋亡过程结合炎症约在3周龄时出现。再生过程约在6周龄左右开始并持续，同时与进行中的退化交替直至12周龄。Mdx小鼠在晚期(>65周)显示出其再生能力的降低，而坏死过程则持续。由于其退化过程类似于在人病理学中观察到的该过程，其再生差异可能含有恢复正常肌肉功能的线索之一。
因此，该小鼠模型提供了一个体内模型系统以检测HRS多肽对遗传背景与人疾病直接相关的肌肉细胞退化、再生和炎症以及肌营养不良症治疗的影响。
本研究的目的是评估HRS(1-506)在反转mdx小鼠模型中抗肌萎缩蛋白基因遗传缺陷对肌肉功能的进行性丧失的的年龄相关作用的效力，其通过响应HRS(1-506)治疗的循环酶水平改变以及肌肉功能的基因表达和炎症标记物变化来显示。
为实现这一点，对8只动物的多个组(C57B:/10ScSn-Dmdmdx/J小鼠；研究开始时为6周龄)通过静脉注射每天给予媒介物、HRS(1-506)(3mg/Kg)或阳性对照(地塞米松)(1mg/Kg)，持续14天。
方案和方法。在研究的第1、8和15天将小鼠称重。在第1、8和15天进行挂线(wire hang)肌肉功能测试以评估肌肉力量。在第1、8天(通过尾静脉)和第15天(终点)进行血清取样以用于循环的酶分析(Idexx)。在对鼠施行安乐死之前，用在第15天分离的血液进行CBC分析。在第15天对鼠施行安乐死，并将部分胫骨前肌和横隔膜放置在10％NBF中用于石蜡包埋以及切片的H&E染色(Premier Laboratory)。
结果：相比该研究的第8或15天的未处理的对照，用HRS(1-506)或地塞米松(DEX)处理的动物没有观察到重量、悬挂时间或CBC数据的明显差异(数据未显示)。然而，相比媒介物对照，在用HRS(1-506)和地塞米松处理的小鼠中观察到血清CK、AST和LDH降低(图26)。
这些结果显示，仅仅给药14天就观察到肌肉炎症的多种血清标记物包括CK、AST和LDH水平的循环水平持续降低，表明HRS(1-506)在杜兴氏肌营养不良症(DMD)的mdx小鼠模型中具有治疗效果。
实施例12
针对HRS的抗体在肢带型肌营养不良症发展中的效果评估
肢带型肌营养不良症2B型(LGMD2B)是由Dysferlin基因中的功能丧失突变引起。Dysferlin主要表达于骨骼肌和心肌中，也表达于单核细胞、巨噬细胞和其他组织中，其中其定位于胞质囊和细胞膜上。Dysferlin看起来涉及膜融合和运输以及修复过程。LGMD2B是晚期发作的(青少年/年轻成人)肌肉疾病，其特征为进行性对称肌无力和明显的侵袭性免疫/炎症病理学。肌肉活组织检查通常显示明显的炎症细胞浸润，主要由巨噬细胞/巨噬细胞激活标记物(HLA-DR、HLA-ABC、CD86)、CD8+细胞毒性T细胞和CD4+T细胞以及肌肉纤维退化/再生组成。
SJL/J小鼠具有Dysferlin的外显子45的3’剪接点中的171bp的框内缺失。当它们年龄变老时发展为与明显的肌肉炎症有关的自发性肌肉疾病。总之，这些特征使得SJL/J小鼠是人Dysferlin缺陷肌肉疾病的遗传同系物。SJL/J小鼠肌肉中的炎症变化通常开始于约4–6周龄，且其特征为激活的巨噬细胞以及随后的CD4+T细胞的浸润。在6个月时，所述浸润主要由巨噬细胞以及一些肌肉纤维坏死组成。到16个月时，肌肉纤维完全退化并被脂肪和胶原替代。
尽管SJL/J品系的生物化学和组织学特征已经有相对良好的记载，但进行性肌肉疾病的功能性原因还没有被充分表征，尤其是在疾病的早期阶段，其最可能用于评估潜在的治疗策略。为了直接评价内源HRS多肽在调节SJL/J品系中发生的炎症过程中的作用，用全长HRS免疫小鼠以掩蔽任何内源HRS。如果HRS参与调节肌肉中的炎症过程，那么该方法应引起肌肉炎症的诱导。因此，该小鼠模型提供了HRS多肽在调节遗传背景与人疾病直接相关的肌肉细胞退化、再生和炎症以及肌营养不良症治疗中的作用的额外支持。
为了产生针对全长HARS的抗体，用完全弗氏佐剂(CFA)在第1天通过皮下对SJL/J小鼠进行免疫并在第15和29天用IFA强化抗原以进一步刺激抗体产生。
方案和方法。在第1、15和29天使用完全弗氏佐剂，将多组8只动物的SLJ/J雄性小鼠(JAX labs)；(在研究开始时为8周龄)用0.2mg全长小鼠HRS(mHRS)通过皮下给药进行免疫。在第10、25和43天分离血清以确定抗体产生。在第43天处死小鼠并采集腿筋和肺(肺为充气的)以用于组织学检测(切片的H&E染色(Premier Laboratory))。检测第43天分离的血清中的循环酶水平(Idexx)。
结果：用mHisRS通过皮下免疫SJL/J小鼠产生了响应全长HisRS的强抗体(图27A)。相比媒介物对照，在免疫的小鼠中没有观察到循环酶水平的明显变化，尽管在用HRS免疫的组中CK水平有轻微升高(数据未显示)。然而，来自HisRS-免疫小鼠的肌肉组织清楚地显示了一些细胞浸润和肌肉炎的区域(图27B)，并且与组织病理学检测一致的是两只免疫小鼠展示了肌肉炎的征象。
实施例13
研制HRS多肽的稳定制剂
为了确定储存HRS多肽的最佳缓冲液条件，采用逐步方法来优化基本的制剂条件。这些研究涉及确定最佳pH范围、优选的稳定缓冲液和赋形剂以维持蛋白稳定性和溶解度。
将蛋白以2mg/ml的浓度储存在“对照缓冲液”(20mM磷酸钠,150mM NaCl,pH7.0)中进行研究。将储备蛋白浓度(12.5mg/ml储存在-80℃)在各自的缓冲液中稀释至2mg/ml的浓度且最终体积为9.1ml而制备HRS(1-506)的工作储备溶液。然后于2-8℃，使用10kDa MWCOSlide-A-Lyzers(Thermo Fisher)将稀释的蛋白对2L期望的缓冲液透析(P/N:66810)，然后于第二天透析至2L新鲜缓冲液中，透析4小时。
透析后，检测样品以确定所测量参数的零时间值，并以1ml/条件的体积分装于5ml聚苯乙烯管(BD Falcon,#352859)。盖上这些管，并用石蜡包封盖子。在透析之前或之后进行目测检查。对每个样品进行的分析包括外观、pH、差示扫描荧光分析、浑浊度和乳白光、尺寸排阻HPLC分析(SE-HPLC)和SDS-PAGE分析。
分析方法：
外观：通过目测以两种类型来评估蛋白外观：A)乳白光和B)颗粒。类型A:1＝清澈；2＝稍微发乳白光；3＝乳白光；类型B:1＝无颗粒；2＝存在颗粒；3＝纤维。结果表示为“类型A，然后是类型B”。例如，“1,1”是指溶液清澈且无颗粒。
pH：用带有微探针(Accumet电极，cat#13-620-292)的Accumet BasicAB15+pH计(Fisher Scientific)测量样品的pH。根据生产商是指导手册进行校准和测量。
吸光度：采用SpectraMax M2分光光度计(Molecular Devices)测量280nm、340nm和580nm处的吸光度。在每个时间点，将100μL未处理的(纯)样品用于A340(浑浊度)和A580(乳白光)读取。将剩余的样品以14,000rcf旋转离心5min，并将上清液稀释4倍于对应的缓冲液中并测量A280吸光度。
差示扫描荧光分析(DSF)通过监测热变性期间与亲脂性染料的荧光强度成函数关系的荧光性来对蛋白样品进行。在100μL最终体积的PBSpH7.0(150mM NaCl,20mM磷酸盐)中将样品稀释至0.5mg/mL，并与通过在超纯蒸馏水(Gibco,P/N10977)中将储备溶液(Applied Biosystems/LifeTechnologies,P/N4461146)稀释20倍而制备的热转移染料溶液混合，然后对样品进行研究。将5μL的稀释染料添加至100μL样品中。将混合物接种至384-孔的透光反应平板上(Applied Biosystems/Life TechnologiesP/N4309849，每孔20μL，每个样品4个孔的重复。通过ViiA7实时PCR仪(Applied Biosystems/Life Technologies,P/N4453552)对平板读数。热变性方案开始的变化速率为1.6℃/s，直至温度达到25℃，此时仪器保持该温度2min，然后以0.5℃/s的速率将温度进一步升高至99℃，此时继续保持该温度2min。
对纯化的蛋白样品进行尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)分析，采用TSKgel Super SW3000,4.6mm ID x30cm,4μm粒径,柱(Tosoh,18675)；使用200mM磷酸钠、150mM NaCl(pH7.0)的流动相，流速0.3ml/min；利用Agilent1260HPLC系统(其配备有真空脱气装置、二元/四元泵、恒温自动进样器、恒温柱隔室、二极管阵列检测器(DAD)和Chemstation色谱分析软件)。简短离心后将未稀释的每种蛋白样品(40μg)注入。将系统适应性样品(牛血清白蛋白,BSA,Thermo Scientific,P/N:23209)和内部对照(野生型HRS)用于样品归类(bracket)以确保检测的有效性。
SDS-PAGE分析：为评估片段化和聚集，针对每个时间点运行还原的和非还原的SDS凝胶。将10μg每种蛋白的样品加载于每个泳道，并按照生产商的指导用XCell Surelock小型电泳槽系统(Invitrogen)，采用4-12％Bis-Tris NuPAGE预制凝胶、1.5mm x10-孔(Invitrogen PNNP0335BOX)和NuPAGE MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen PN NP0002)或NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液(Invitrogen PN NP001)进行分析。从4x储备液(0.25M Tris,8％SDS,40％甘油,0.008％溴苯酚蓝，20％14.3M βME)制备还原性样品缓冲液；制备无巯基乙醇的非还原性样品缓冲液。预染色的分子量标记物获自Invitrogen(参见Blue Plus2,Invitrogen PNLC5925)。用InstantBlue(Expedeon PN ISB1L)按照生产商的指导染色凝胶。
pH和组氨酸对热稳定性影响的初步研究。采用6xHis-标记的全长HARS和6xHis-标记的HRS(1-506)进行探索性稳定性研究。通过过夜透析至各个pH的缓冲液中，将全长蛋白透析至所示pH(pH5.5、6.0、6.5、7.0或7.5)的20mM磷酸钠缓冲液中。DSF分析的结果表明，在pH7-7.5下孵育时HRS有两次热转变。如图28A中箭头所示，第一次转变发生于48℃，而在该pH范围的主要转变发生于约54℃。每个pH孵育条件的主要转变温度概括于表E12中。SE-HPLC分析揭示了储存在pH6.5-7.5的样品的可比较水平的高分子量(HMW)峰，且储存在约pH5.5的样品的HMW含量明显更高的(数据未显示)。pH5.5缓冲液中储存的样品也观察到沉淀，且未对该样品进行进一步评估。
因此，来自这些初步研究的结果显示，最佳pH范围约为pH6.5-7.5，且在该pH范围内进一步进行了更详细的研究，详情概括如下。
为确定添加外源组氨酸是否能够影响HARS的稳定性，在0.1-50mM组氨酸浓度范围内进行了初步的稳定性研究。在0.5-10mM组氨酸范围内的实验结果如图28B中所示，且更宽浓度范围内的作用如表E13中所示。
来自这些实验的结果表明，添加外源组氨酸于宽的浓度范围内在稳定HRS多肽的结构上是有效的。组氨酸浓度低至0.03mM时具有明显的效果，且在浓度为约5mM或更高时开始达到其最大效果。因此，约0.03-50mM范围内的组氨酸浓度在稳定HRS多肽上有效，且约2mM至约50mM范围的组氨酸浓度提供了HRS多肽的明显改善的热稳定性。
pH对HRS多肽稳定性影响的详细表征。在较宽范围的孵育条件下评估了pH对HRS(1-506)稳定性的影响，并在pH6.0-7.5的范围内进行了更详细的分析表征。采用以上描述的分析方法进行这些研究，并将样品在5℃、室温和37℃孵育长达一周。来自这些研究的结果概括于表E14中。
这些结果总体上显示，当在pH为约pH7.0至约pH7.5范围内的缓冲液中孵育时，该蛋白是相对稳定，但在更低pH下其开始出现可能的降解和聚集问题。基于测试的条件和获得的分析结果，可得出的结论为储存HRS多肽的最佳pH范围是约pH7.0至约7.5。
不同缓冲液组合物对HRS多肽稳定性影响的详细表征。采用3种选择性的缓冲系统即磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液，在3个pH值即7.3、7.0和6.5下评估缓冲液组成对HRS(1-506)稳定性的影响。采用以上描述的分析方法进行这些研究，将样品在5℃、室温和37℃孵育长达一周，其结果概括于表E15中。
结果和结论：在这些研究中约pH7.0-7.4范围内的组氨酸缓冲液具有最佳性能。组氨酸缓冲液还将HRS多肽折叠稳定性增加了～8℃(数据未显示)。在宽范围的pH值内(pH6.7-7.3)的柠檬酸盐缓冲液中，HRS多肽也展现出良好的稳定性。
对柠檬酸盐缓冲液相比组氨酸缓冲液的可接受的pH的更大范围观察显示，基于组氨酸和柠檬酸盐的缓冲液是潜在的有吸引力的用于进一步评估HRS多肽的储存缓冲液的候选缓冲液系统。
不同赋形剂对HRS多肽稳定性影响的详细表征。采用各种可能的赋形剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、精氨酸、甘氨酸、甘油和高盐(280mM NaCl)，评估缓冲液组成对HRS(1-506)稳定性的影响。采用以上描述的分析方法进行这些研究，并将样品在5℃、室温和37℃孵育长达一周，且其结果概括于表E16和E17中。
这些结果表明，在pH7.0-7.5范围内在组氨酸缓冲液以及氯化钠、精氨酸、蔗糖、海藻糖、山梨醇和/或甘氨酸存在下，HRS多肽的稳定性得到明显改善。为进一步评估研发具有其他稳定特性的制剂的可能，评估了表E17中列举的组合。
结果：当样品在5℃或室温下孵育时，采用这些缓冲系统在浑浊度或HMW聚集体形成方面有很少或没有变化。然而，当在37℃孵育时，对于所有样品，在这些参数中均观察到随时间的增加。经5个循环的冻融以后所有制剂均很少有变化。
总之，基于对高分子量的聚集体形成的SE-HPLC分析，PS20(组氨酸/蔗糖/PS20)和F68(组氨酸/蔗糖/F68)条件的表现最好，且当所述HRS多肽于37℃孵育达7天时，这些试剂能够明显降低HMW峰的形成。
关于浑浊度形成(A340)，添加精氨酸的表现最好，其次为高盐(280mM NaCl和140mM NaCl条件)，表明当在37℃孵育延长的时间时，这些试剂能够有效降低或防止所述HRS多肽的聚集和变性。如HPLC分析所测定，在这些条件下，聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和普朗尼克F68也有效降低了浑浊度和HMW聚集体形成。在这些研究中，蔗糖和海藻糖看来大致相当，且当在37℃孵育延长的时间时，如通过降低的浑浊度和HMW形成所测定，两种试剂均明显抑制蛋白变性。
基于这些研究，通过利用pH范围为约7.0-7.5的组氨酸缓冲液，HRS多肽的稳定可容易地实现。令人惊奇的是，当在37℃孵育延长的时间时，在约100mM至约300mM范围内进一步添加氯化钠，为这些缓冲液提供了额外的稳定性，使得Tm进一步增加至61℃(数据未显示)并引起变性减低。通过添加糖如约0.2％至5％范围内的海藻糖或约0.2％至5％范围内的蔗糖可进一步提高稳定性。同样，尤其是当在37℃孵育延长的时间时，添加表面活性剂包括约0.01％-1％范围内的聚山梨醇酯20或80或者普朗尼克F68进一步提高了总体的稳定性。也可通过添加还原剂(抗氧化剂)和/或螯合剂进一步改善总体的蛋白稳定性，如本文所述。
基于这些研究，用于展现出提高的稳定性的HRS多肽的示例性制剂包括含有表E18中所列的一种或多种组分的缓冲液。

Claims (192)

1.治疗组合物，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的、长度为约20-90个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；且c)基本上无内毒素。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述HRS多肽的至少20个氨基酸来自SEQ ID NO:1的第1-67位残基所限定的区域。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述HRS多肽的至少40个氨基酸来自SEQ ID NO:1的第1-67位残基所限定的区域。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述HRS多肽的至少60个氨基酸来自SEQ ID NO:1的第1-67位残基所限定的区域。
5.治疗组合物，其包含长度为至少约400个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，所述HRS多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的80个或更多个连续的氨基酸，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；且c)基本上无内毒素。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述HRS多肽包含与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性的200个或更多个氨基酸。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述HRS多肽包含与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性的400个或更多个氨基酸。
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述HRS多肽长度为至少约500个氨基酸。
9.如权利要求5所述的组合物，其中所述HRS多肽包含全长人HRS(SEQ ID NO:1)的序列。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述HRS多肽在SEQ ID NO:1的在残基505(HRS(1-505))或506(HRS(1-506))处被截短。
11.如权利要求5所述的组合物，其中所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、Cys455、Cys507和Cys509。
13.治疗组合物，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的、长度为至少约400个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；且c)基本上无内毒素。
14.如权利要求13所述的组合物，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的、长度为至少约500个氨基酸的HRS多肽。
15.如权利要求13所述的组合物，其中所述HRS多肽包含SEQ IDNO:1(全长人HRS)的序列。
16.如权利要求13所述的组合物，其中所述HRS多肽在SEQ IDNO:1的残基505(HRS(1-505))或506(HRS(1-506))处被截短。
17.如权利要求13所述的组合物，其中所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、Cys455、Cys507和Cys509。
19.治疗组合物，其包含长度为500-506个氨基酸的组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽，所述HRS多肽与SEQ ID NO:70(HRS(1-506))具有至少90％的同一性并且缺少SEQ ID NO:1的第507-509位残基，其中所述组合物/HRS多肽：a)纯度为至少约95％；b)聚集小于约5％；且c)基本上无内毒素。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述HRS多肽长度为505-506个氨基酸，与SEQ ID NO:70具有至少90％的同一性。
21.如权利要求19所述的组合物，其中所述HRS多肽长度为506个氨基酸。
22.如权利要求19所述的组合物，其中所述HRS多肽包含SEQ IDNO:70。
23.如权利要求19所述的组合物，其中所述HRS多肽基本上由SEQID NO:70组成。
24.如权利要求19所述的组合物，其中所述HRS多肽由SEQ IDNO:70组成。
25.如权利要求19所述的组合物，其中所述HRS多肽长度为505个氨基酸。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述HRS多肽包含SEQ IDNO:70的残基2-506(HRS(2-506))。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述HRS多肽基本上由SEQID NO:70的残基2-506(HRS(2-506))组成。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述HRS多肽由SEQ IDNO:70的残基2-506(HRS(2-506))组成。
29.如权利要求19所述的组合物，其中所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述至少一个半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235和Cys455。
31.如权利要求19-30中任一项所述的组合物，其中在约4-40℃和pH约6.0-8.0的可比较条件下，所述HRS多肽相比SEQ ID NO:1(全长人HRS)的多肽具有增加的生物活性、稳定性和/或同质性。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述条件包括温度为约20-25℃(室温)和pH为约7.0-7.5，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。
33.如权利要求31所述的组合物，其中所述条件包括温度为约37℃和pH为约7.0-7.5，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。
34.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其中增加的活性包括非经典生物活性的至少约10％的绝对增加。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述非经典活性是抗炎活性或特异性结合抗-Jo-1抗体。
36.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其中在还原条件下，所述HRS多肽相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽具有减少的链间二硫键形成。
37.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽具有减少的电荷异质性。
38.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其中在溶液中，所述HRS多肽相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽具有减少的高分子量聚集体形成。
39.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其中增加的同质性包括所述HRS多肽相比SEQ ID NO:1的多肽的单分散性的至少10％的增加。
40.如权利要求19-39中任一项所述的组合物，其中在大肠杆菌中重组制备后，所述HRS多肽相比SEQ ID NO:1(全长HRS)的多肽具有增加的可溶性蛋白产率。
41.如权利要求1-40中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽融合至异源的融合伴侣，任选T-细胞配体。
42.如权利要求1-40中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽包含至少一个D-氨基酸。
43.如权利要求1-42中任一项所述的组合物，其包含浓度范围为约0.03mM至约100mM的缓冲剂。
44.如权利要求43所述的组合物，其包含浓度范围为约2mM至约50mM的缓冲剂。
45.如权利要求43所述的组合物，其包含浓度范围为约40mM至约60mM的缓冲剂。
46.如权利要求43所述的组合物，其包含浓度范围为约45mM至约55mM的缓冲剂。
47.如权利要求43所述的组合物，其包含浓度为约50mM的缓冲剂。
48.如权利要求43-47中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂，且其中在约4-40℃和pH约7.0-7.5的可比较的条件下，所述HRS多肽相比没有所述组氨酸缓冲剂的可比较组合物中的相应的HRS多肽具有增加的稳定性。
50.如权利要求48所述的组合物，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂，且其中在约4-40℃和pH约6.5-7.5的可比较的条件下，所述HRS多肽相比没有所述柠檬酸盐缓冲剂的可比较组合物中的相应的HRS多肽具有增加的稳定性。
51.如权利要求48所述的组合物，其中所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂，且其中在约4-40℃和pH约7.0-7.5的可比较的条件下，所述HRS多肽相比没有所述磷酸盐缓冲剂的可比较组合物中的相应的HRS多肽具有增加的稳定性。
52.如权利要求49-51中任一项所述的组合物，其中所述条件包括温度为约5℃，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。
53.如权利要求49-51中任一项所述的组合物，其中所述条件包括温度为约20-25℃(室温)，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。
54.如权利要求49-51中任一项所述的组合物，其中所述条件包括温度为约37℃，任选地持续约1、2、3、4、5、6或7天的时长。
55.如权利要求49-54中任一项所述的组合物，其中增加的稳定性包括热稳定性，其中所述HRS多肽的解链温度(Tm)比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物中相应的HRS多肽的解链温度高至少约5℃。
56.如权利要求49-54中任一项所述的组合物，其中增加的稳定性包括热稳定性，其中所述HRS多肽的解链温度以比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物中相应的HRS多肽的速率慢至少10％的速率展开。
57.如权利要求49-56中任一项所述的组合物，其中在其他可比较的条件下，所述组合物相比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物具有减少的聚集和/或沉淀。
58.如权利要求57所述的组合物，其中如通过A340处的吸光度所测，聚集减少了至少约10％。
59.如权利要求49-58中任一项所述的组合物，其中在其他可比较条件下，所述组合物相比没有所述缓冲剂和/或在所述pH值范围之外的组合物具有减少的高分子量聚集体。
60.如权利要求55-59中任一权利要求所述的组合物，其中所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂，且其中所述HRS多肽与SEQ ID NO:1的残基1-506或2-506具有至少90％的同一性，并且缺少SEQ ID NO:1的第507-509位残基。
61.如权利要求55-59中任一权利要求所述的组合物，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂，且其中所述HRS多肽与SEQ ID NO:1的残基1-506或2-506具有至少90％的同一性，并且缺少SEQ ID NO:1的第507-509位残基。
62.如权利要求60或61所述的组合物，其中所述HRS多肽是HRS(1-506)或HRS(2-506)。
63.如权利要求1-62中任一项所述的组合物，其包含浓度范围为约100-300mM，任选地为约140mM的氯化钠(NaCl)。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述HRS多肽与SEQ IDNO:1的残基1-506或2-506具有至少90％的同一性，并且缺少SEQ IDNO:1的第507-509位残基，任选地其中所述HRS多肽具有至少约60℃的解链温度(Tm)。
65.如权利要求64所述的组合物，其中所述HRS多肽是HRS(1-506)或HRS(2-506)，任选地其中所述HRS多肽具有至少约60℃的解链温度(Tm)。
66.如权利要求1-65中任一项所述的组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的赋形剂选自：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、精氨酸、甘氨酸和甘油。
68.如权利要求66或67所述的组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的赋形剂浓度范围为约0.2％-5.0％。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂为约1％-3％蔗糖，任选地为约2％蔗糖。
70.如权利要求68所述的组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂为约1％-3％海藻糖，任选地为约2％海藻糖。
71.如权利要求1-70中任一项所述的组合物，其包含一种或多种表面活性剂。
72.如权利要求71所述的组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20(PS20)、聚山梨醇酯40(PS40)、聚山梨醇酯60(PS60)或聚山梨醇酯80(PS80)。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述聚山梨醇酯为PS20。
75.如权利要求72所述的组合物，其中所述泊洛沙姆为普朗尼克F68。
76.如权利要求71-74中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂以约0.1％-5.0％(w/v)的范围存在。
77.如权利要求76所述的组合物，其中所述表面活性剂为约0.05％(w/v)的PS20。
78.如权利要求1-74中任一项所述的组合物，其包含抗氧化性化合物。
79.如权利要求78所述的组合物，其中所述抗氧化性化合物选自：半胱氨酸、蛋氨酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)。
80.如权利要求78或79所述的组合物，其中所述抗氧化性化合物以约0.1-5.0mM的浓度范围存在。
81.如权利要求1-80中任一项所述的组合物，其包含螯合剂。
82.如权利要求81所述的组合物，其中所述螯合剂为乙二胺四乙酸盐(EDTA)。
83.如权利要求81或82所述的组合物，其中所述螯合剂以约0.1-2.0mM的浓度范围存在。
84.如权利要求1-83中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽以至少约10mg/ml的浓度存在。
85.如权利要求1-83中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽以至少约25mg/ml的浓度存在。
86.如权利要求1-83中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽以至少约50mg/ml的浓度存在。
87.如权利要求1-86中任一项所述的组合物，其中如通过A340处的吸光度所测，所述组合物具有小于约0.5的浑浊度。
88.如权利要求87所述的组合物，其中A340处的吸光度是在37℃孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。
89.如权利要求87所述的组合物，其中A340处的吸光度是在室温孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。
90.如权利要求87所述的组合物，其中A340处的吸光度是在冻融所述组合物至少约1、2、3、4或5次后测量的。
91.如权利要求1-86中任一项所述的组合物，其中如通过A580处的吸光度所测，所述组合物具有小于约0.6的乳白光。
92.如权利要求91所述的组合物，其中A580处的吸光度是在37℃孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。
93.如权利要求91所述的组合物，其中A580处的吸光度是在室温孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。
94.如权利要求91所述的组合物，其中A580处的吸光度是在冻融所述组合物至少1、2、3、4或5次后测量的。
95.如权利要求1-94中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有小于约3％的高分子量聚集体。
96.如权利要求95所述的组合物，其中高分子量(HMW)聚集是在37℃孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。
97.如权利要求95所述的组合物，其中高分子量(HMW)聚集是在室温孵育至少约1、2、3、4、5、6或7天后测量的。
98.如权利要求95所述的组合物，其中高分子量聚集是在冻融所述组合物至少约1、2、3、4或5次后测量的。
99.如权利要求1-98中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽在所述组合物中具有至少约50℃的解链温度(Tm)。
100.如权利要求99所述的组合物，其中所述HRS多肽在所述组合物中具有至少约55℃的解链温度(Tm)。
101.如权利要求100所述的组合物，其中所述HRS多肽在所述组合物中具有至少约60℃的解链温度(Tm)。
102.如权利要求1-101中任一项所述的组合物，其中所述HRS多肽为至少约90％单分散的。
103.如权利要求1-102中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约50mM L-组氨酸、约140mM NaCl、约2％海藻糖、约0.05％聚山梨醇酯20(PS20)，并且具有约7.0-7.4的pH。
104.如权利要求1-102中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约50mM L-组氨酸、约140mM NaCl、约2％蔗糖、约0.05％聚山梨醇酯20(PS20)，并且具有约7.0-7.4的pH。
105.如权利要求103或104所述的组合物，其中所述HRS多肽是HRS(1-506)或HRS(2-506)，且在所述组合物中具有至少约60℃的解链温度(Tm)。
106.如权利要求105所述的组合物，其中如通过A340处的吸光度所测，所述组合物具有小于约0.1或小于约0.05的浑浊度。
107.如权利要求105所述的组合物，其中如通过A580处的吸光度所测，所述组合物具有小于约0.1或小于约0.05的乳白光。
108.如权利要求105所述的组合物，其中所述组合物具有小于约2％或小于约1％的高分子量聚集体。
109.用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶不足相关的疾病的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽能够代替组氨酰-tRNA合成酶的至少一种经典的或非经典的功能。
110.如权利要求109所述的治疗组合物，其中在浓度高达约5x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
111.用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体相关的疾病的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被所述自身抗体特异性识别的表位，且其中所述HRS多肽能够引起耐受性。
112.用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体相关的疾病的治疗组合物，其包含编码哺乳动物HRS多肽的重组核酸，其中所述HRS多肽包含至少一个被所述自身抗体特异性识别的表位，且其中所述核酸可操作地与表达调控序列偶联，且其中所述核酸的表达引起耐受性。
113.用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体相关的疾病的治疗组合物，其包含重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，所述HRS多肽包含至少一个被所述自身抗体特异性识别的表位，且其中所述核酸可操作地与表达调控序列偶联以使得能在所述宿主细胞中表达所述HRS。
114.用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性的自身抗体相关的疾病的治疗组合物，其包含抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白，其中所述抗体或结合蛋白阻止所述自身抗体结合天然的组胺酰-tRNA合成酶。
115.用于治疗炎性疾病的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有至少一种非经典活性。
116.用于治疗肌营养不良症的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有至少一种非经典活性。
117.如权利要求116所述的治疗组合物，其中所述肌营养不良症选自：杜兴氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、埃-德氏肌营养不良症、肢-带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症和先天性肌营养不良症。
118.用于治疗横纹肌溶解症、肌肉萎缩、恶病质、肌肉炎症或肌肉损伤的治疗组合物，其包含至少一种HRS多肽，其中所述HRS多肽具有至少一种非经典活性。
119.组氨酰-tRNA合成酶(HRS)多肽在制备用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的药物中的应用。
120.如权利要求109-118中任一项所述的治疗组合物或权利要求119所述的应用，其中所述治疗组合物或HRS多肽如权利要求1-108中任一项中所定义。
121.如权利要求109-118中任一项所述的治疗组合物或权利要求119所述的应用，其中所述HRS多肽长度为约10至约60个氨基酸。
122.如权利要求109-118中任一项所述的治疗组合物或权利要求119所述的应用，其中所述HRS多肽长度为约60至约80个氨基酸。
123.如权利要求109-118中任一项所述的治疗组合物或权利要求119所述的应用，其中所述HRS多肽长度为约80至约200个氨基酸。
124.如权利要求109-118中任一项所述的治疗组合物或权利要求119所述的应用，其中所述HRS多肽为全长的。
125.如权利要求109-118中任一项所述的治疗组合物或权利要求119所述的应用，其中所述HRS多肽在SEQ ID NO:1的残基505或506处被截短。
126.如权利要求109-118中任一项所述的治疗组合物或权利要求119所述的应用，其中所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。
127.如权利要求126所述的治疗组合物，其中所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、Cys455、Cys507和Cys509。
128.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物或应用，其中所述HRS多肽包含至少一种D-氨基酸。
129.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物或应用，其中所述HRS多肽包含WHEP结构域或基本上由WHEP结构域组成。
130.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物或应用，其中所述HRS多肽包含：a)与SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列，或b)与表D1、D3-D6或D8中的序列中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
131.如前述权利要求中任一项所述的治疗组合物或应用，其中所述HRS多肽与异源蛋白融合。
132.如权利要求131所述的治疗组合物或应用，其中所述异源蛋白包含T细胞配体。
133.治疗与自身抗体相关的疾病的方法，其包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽；或d)抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白。
134.如权利要求133所述的方法，其中在出现疾病症状前，向所述对象给予所述治疗组合物。
135.如权利要求133或134所述的方法，其中所述自身抗体为人组氨酰-tRNA合成酶特异性的。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述HRS多肽包含所述组氨酰-tRNA合成酶的至少一个被所述疾病特异性自身抗体识别的表位。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述HRS多肽阻止所述自身抗体结合天然的人组氨酰-tRNA合成酶。
138.如权利要求133所述的方法，其中所述HRS多肽导致自身反应性T细胞的克隆缺失。
139.如权利要求133所述的方法，其中所述HRS多肽造成参与自身免疫应答的T细胞的功能失活。
140.如权利要求133所述的方法，其中所述HRS多肽引起减少的肌肉或肺部炎症。
141.如权利要求133所述的方法，其中所述HRS多肽诱导耐受性。
142.如权利要求133-141中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽长度为约10至约60个氨基酸。
143.如权利要求133-141中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽长度为约40至约80个氨基酸。
144.如权利要求133-141中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽长度为约80至约200个氨基酸。
145.如权利要求133-141中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽为全长的。
146.如权利要求133-141中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽在残基505或506处被截短。
147.如权利要求133-141中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽具有至少一个半胱氨酸残基的突变。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述半胱氨酸残基选自：Cys174、Cys191、Cys224、Cys235、Cys455、Cys507和Cys509。
149.如权利要求133-148中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽包含至少一个D-氨基酸。
150.如权利要求133-149中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽包含WHEP结构域或基本上由WHEP结构域组成。
151.如权利要求133-150中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽包含：a)与SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列，或b)与表D1、D3-D6或D8中的序列中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
152.如权利要求133-151中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽与异源蛋白融合。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述异源蛋白包含T细胞配体。
154.如权利要求133-153中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制为用于经口、鼻内、肺部、肌肉内或肠胃外给药来递送。
155.如权利要求133-154中任一项所述的方法，其中所述疾病选自：炎性肌肉疾病，包括炎性肌肉疾病、多发性肌炎、皮肌炎和相关病症、多发性肌炎-硬皮病重叠、包涵体肌炎(IBM)、抗合成酶综合征、间质性肺病、关节炎和雷诺现象。
156.如权利要求133-155中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽包含至少一个被来自所述对象的血清中的抗体识别的免疫优势表位。
157.如权利要求133-156中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽结合人组织相容性复合体(MHC)II型分子。
158.如权利要求133所述的方法，其中所述核酸可操作地与表达调控序列偶联，且其中所述核酸的表达引起耐受性。
159.如权利要求133所述的方法，其中所述治疗组合物包含选自脂质体、胶束、乳剂和细胞的递送载体。
160.减少组织炎症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞；其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
161.如权利要求160所述的方法，其中所述组织选自肌肉、肺和皮肤。
162.减少肌肉或肺部炎症的方法，其包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
163.治疗肌营养不良症的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述肌营养不良症选自：杜兴氏肌营养不良症、贝克氏肌营养不良症、埃-德氏肌营养不良症、肢-带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良、眼咽型肌营养不良症、远端型肌营养不良症和先天性肌营养不良症。
165.治疗横纹肌溶解症、肌肉萎缩、恶病质、肌肉炎症或肌肉损伤的方法，其包括向有需要的对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸，或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽。
166.诱导对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的耐受性的方法，其包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽，b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被所述自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物造成对所述自身抗原的耐受性。
167.清除参与对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的自身免疫应答的T细胞群或亚群的方法，其包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被所述自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物造成自身反应性T细胞的克隆缺失。
168.在参与对组氨酰-tRNA合成酶(HisRS)自身抗原的自身免疫应答的T细胞中诱导无能的方法，其包括向对象给予组合物，所述组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；或c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽，其中所述HRS多肽包含至少一个被所述自身抗体特异性识别的表位，且其中给予所述组合物造成参与自身免疫应答的T细胞的功能失活。
169.用于治疗与组氨酰-tRNA合成酶不足相关的疾病的替代疗法，包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含以下中的一种或多种：a)HRS多肽；b)编码异源HRS多肽的重组核酸；c)重组宿主细胞，其中所述宿主细胞表达至少一种异源HRS多肽；或d)抗体或所述自身抗体特异性的结合蛋白；其中所述HRS多肽在功能上补偿所述组氨酰-tRNA合成酶的不足。
170.治疗自身免疫疾病或炎性疾病的方法，其包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含至少一种HRS多肽。
171.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在浓度高达约5x10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS蛋白不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
172.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽长度为约10至约60个氨基酸。
173.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽长度为约60至约80个氨基酸。
174.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽长度为约80至约200个氨基酸。
175.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽为全长的。
176.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽包含至少一种D-氨基酸。
177.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽包含WHEP结构域或基本上由WHEP结构域组成。
178.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽包含：a)与SEQ ID NO:1-23、39、41、43、70-71、74-153、160-172或176-182中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列，或b)与表D1、D3-D6或D8中的序列中任一序列具有至少80％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
179.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HRS多肽与异源蛋白融合。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述异源蛋白包含免疫识别结构域或免疫共刺激结构域。
181.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制为用于经口、鼻内、肺部、肌肉内或肠胃外给药来递送。
182.测定样品中HRS多肽或其片段的存在或水平的方法，其包括将所述样品与特异性结合所述HRS多肽的一种或多种结合剂接触，并检测所述结合剂是否存在，从而确定所述HRS多肽的存在或水平。
183.测定抗-HRS多肽抗体对特定HRS多肽的表位特异性的方法，所述方法包括将所述抗体与一种或多种HRS多肽接触，并检测是否存在抗体结合，从而确定所述抗体的表位特异性。
184.治疗与组氨酰-tRNA合成酶特异性自身抗体相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的对象给予治疗组合物，所述治疗组合物包含至少一种HRS多肽，其中在浓度高达约1x 10-7M的竞争性ELISA中，所述HRS多肽不显著性竞争疾病相关的自身抗体与组氨酰-tRNA合成酶的结合。
185.确定存在对HRS多肽给药具有不利免疫应答风险的人对象的方法，其包括：a)测定所述对象中抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象具有针对组氨酰-tRNA合成酶或HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。
186.如权利要求185所述的方法，其中当所述对象血清中组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度大于约2微摩尔时，将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。
187.如权利要求185所述的方法，其中当所述对象血清中组氨酰-tRNA合成酶抗体的浓度大于约2微摩尔时，将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。
188.体外免疫吸附来自细胞外体液的抗-组氨酰-tRNA合成酶(HRS)抗体的方法，其包括：(a)提供已从对象获得的细胞外体液，将所述细胞外体液与吸附有至少一种组氨酰-tRNA合成酶多肽的生物相容性固体载体接触，从而将所述抗-HRS抗体捕获在所述固体载体上，和(c)将来自步骤(b)的所述细胞外体液重新输入所述对象中。
189.如权利要求188所述的方法，其中所述抗-HRS抗体包括Jo-1抗体。
190.选择HRS多肽以治疗患有自身免疫病症或炎性病症的人对象的方法，其包括a)测定所述对象中抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)挑选相比野生型组氨酰-tRNA合成酶，具有针对抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的减少的亲和力的HRS多肽。
191.预测人对象的疾病进展的方法，其包括：a)测定所述对象中抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象具有针对组氨酰-tRNA合成酶或HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为存在发展更严重疾病的风险。
192.预测对象对HRS多肽给药的应答的方法，其包括a)测定所述对象中抗-组氨酰-tRNA合成酶抗体的抗体水平或表位特异性；和b)如果所述对象具有针对组氨酰-tRNA合成酶或HRS多肽的可检测的抗体，则将所述对象确定为存在发展对HRS多肽给药的不利免疫应答的风险。
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