IT202100014333A1 - Nuovo impiego terapeutico di inibitori della iodiotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) - Google Patents

Nuovo impiego terapeutico di inibitori della iodiotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) Download PDF

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Description

Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: "Nuovo impiego terapeutico di inibitori della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2)"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo dei trattamenti terapeutici di malattie dei muscoli e della pelle, in particolare di disturbi da deperimento muscolare e di lesioni del tessuto muscolare o cutaneo.
L'atrofia muscolare scheletrica, nota anche come deperimento muscolare, ? una condizione debilitante che si sviluppa lentamente durante l'invecchiamento (sarcopenia) cos? come dopo un'inattivit? prolungata, o che si manifesta rapidamente in una variet? di patologie come il cancro (cachessia), malattie renali croniche, insufficienza cardiaca, malattia polmonare ostruttiva cronica. Le malattie da deperimento muscolare sono caratterizzate da una perdita massiccia e progressiva di massa muscolare con conseguente perdita di forza e funzione muscolare. In generale, la perdita di massa muscolare comporta un deterioramento delle condizioni fisiche del paziente, che vanno dall'instabilit? posturale a una capacit? respiratoria e cardiaca compromessa. Ad esempio, circa l?80% dei pazienti oncologici in fase avanzata mostra una grave perdita di massa muscolare, una condizione chiamata cachessia neoplastica. In questi pazienti oncologici, la perdita di massa muscolare ? associata a una prognosi peggiore e a una risposta ridotta alla terapia.
Poich? la funzione muscolare ? essenziale per la respirazione, i movimenti, la masticazione e la deglutizione, la riduzione della massa e della funzione muscolare ? associata a una maggiore morbilit? e mortalit?, nonch? a una ridotta qualit? della vita.
Anche se la prevalenza di persone che soffrono di qualsiasi tipo di debolezza muscolare ? elevata, in particolare di cachessia e sarcopenia, non ? disponibile alcun trattamento specifico per il deperimento muscolare e il muscolo rimane un organo sotto-medicato. Fino ad oggi, non sono disponibili farmaci efficaci per migliorare la massa e la funzione muscolare, che si siano dimostrati in grado di interferire con il meccanismo fisiopatologico (cio? infiammazione sistemica) alla base della perdita di forza muscolare nelle malattie di deperimento muscolare.
Le terapie attuali per la cachessia-sarcopenia sono basate su tre diverse classi di farmaci: agonisti dei recettori della grelina (anamorelina); anticorpi monoclonali diretti contro i mediatori infiammatori responsabili della cachessia e del deperimento muscolare (p.es. anticorpi contro IL-1, IL-6, TNF-alfa, miostatina); e modulatori selettivi dei recettori degli androgeni non steroidei (SARM, p.es. enobosarm). I farmaci menzionati sopra sono stati testati in studi clinici di fase 2 e fase 3 ( Lancet Diabetes Endocrinol. 2015 3(12):948-57 2015; Lancet Oncol. 2016; 17: 519-531), e hanno tutti mostrato effetti farmaceutici di prevenzione per la perdita muscolare e il guadagno di massa corporea. Tuttavia, finora, nessun dato clinico ha dimostrato la capacit? dei farmaci testati di aumentare la forza muscolare e migliorare la funzione fisico-meccanica del muscolo.
Oltre alla cachessia e alla sarcopenia, anche le lesioni fisiche possono portare alla perdita della massa muscolare. Le lesioni muscolari sono di solito conseguenti a forze esterne, quali contusioni muscolari e lacerazioni muscolari. Le lesioni muscolari di grandi dimensioni hanno una capacit? di guarigione limitata e il processo di riparazione di solito provoca la formazione di tessuto cicatriziale. La presenza di una cicatrice intramuscolare altera il normale vettore di contrazione muscolare riducendo la forza e aumentando la fatica.
Anche traumi meccanici o chimici possono danneggiare la pelle. Le lesioni cutanee implicano molto comunemente ustioni, lacerazioni, fratture e lesioni da schiacciamento. Tipicamente, tali disturbi cutanei possono portare a perdita dell'epidermide e spesso di porzioni del derma e anche del grasso sottocutaneo. Il trattamento di queste lesioni pu? essere complesso e pu? avere un impatto significativo sulla funzione e sull'estetica del paziente. Inoltre, processi di guarigione della pelle compromessi possono causare ferite croniche, che rappresentano un grande e crescente carico di malattia.
Come detto sopra, i danni muscolari e cutanei possono causare compromissione funzionale e grave disabilit?, nonch? deformit? cosmetiche. Di conseguenza, queste lesioni generano una continua sfida dal punto di vista della ricostruzione e della rigenerazione nel lavoro clinico al fine di consentire la rigenerazione dei tessuti e di ridurre le complicanze dei trapianti.
Per promuovere la riparazione e la rigenerazione dei muscoli e della pelle, sono state sviluppate diverse strategie nel corso dell'ultimo secolo e soprattutto negli ultimi decenni, tra cui tecniche chirurgiche, terapia fisica, biomateriali, ingegneria dei tessuti muscolari e terapia cellulare. Tuttavia, le limitazioni intrinseche degli attuali approcci evidenziano la necessit? di strategie alternative.
Vi ? quindi una forte necessit? di fornire nuove strategie terapeutiche efficaci volte a ritardare o a prevenire la progressione di malattie implicanti il deperimento muscolare, in particolare la degenerazione muscolare legata all'et?, nonch? condizioni di atrofia muscolare secondarie a patologie.
Vi ? anche una forte necessit? di fornire nuovi approcci farmacologici volti a migliorare le lesioni muscolari e/o cutanee mediante promozione della riparazione dei tessuti e della rigenerazione funzionale dei tessuti.
Queste e altre necessit? sono soddisfatte da un composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l'impiego terapeutico come definito nella rivendicazione 1 allegata e da una composizione farmaceutica comprendente detto composto inibitore di D2 come definito nella rivendicazione 7 allegata. Forme di realizzazione preferite dell?invenzione sono definite nelle rivendicazioni dipendenti.
Le rivendicazioni indipendenti e dipendenti annesse formano parte integrante della presente descrizione.
La iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) ? un enzima che svolge un ruolo chiave nel mantenimento dei livelli circolanti e tissutali degli ormoni tiroidei. Come noto nell?arte, la concentrazione intracellulare degli ormoni tiroidei ? regolata da tre selenoproteine di membrana, gli enzimi deiodinasi di tipo 1, 2, e 3 (D1, D2, D3) (Gereben B. et al, Endocr Rev. 2008 29(7): 898-938). In particolare, D1 e D2 convertono il pro-ormone tiroxina (T4) nell'ormone attivo T3. Viceversa, D3 converte T3 (triiodotironina) in T2 (diiodotironina) e T4 in rT3 (triiodotironina inversa), entrambe metaboliti inattivi degli ormoni tiroidei.
Come verr? spiegato in maggior dettaglio nella sezione sperimentale che segue, i presenti inventori hanno osservato per la prima volta che l'enzima deiodinasi di tipo 2 (D2) ? espresso in cellule staminali mitoticamente quiescenti sia del muscolo che della pelle e hanno mostrato che questo enzima svolge un ruolo critico nel mantenimento dello stato di quiescenza di queste cellule.
Come noto nell?arte, le cellule staminali sono cruciali per la rigenerazione e l'omeostasi dei tessuti adulti. Ulteriori esperimenti condotti dagli inventori hanno rivelato che, in seguito a lesione muscolare, la deplezione genetica in vivo di D2 ha migliorato e accelerato la rigenerazione dei tessuti muscolari e cutanei rispetto agli animali di tipo selvatico, in particolare in condizioni rigenerative acute come in lesioni muscolari indotte da cardiotossina e nella guarigione delle ferite.
Esaminando ulteriormente il ruolo della deiodinasi di tipo 2 nel muscolo e nella pelle, i presenti inventori hanno sorprendentemente trovato che, in modelli animali di atrofia muscolare, l'espressione di questo enzima aumenta drasticamente nei muscoli cachettici. Inoltre, in modelli genetici di topo con deplezione di D2, l'assenza dell?attivit? della deiodinasi di tipo 2 ha impedito l?atrofia dei muscoli scheletrici indotta sperimentalmente.
Per valutare ulteriormente gli effetti della modulazione di D2 sul muscolo e sulla pelle, nonch? per sfruttare il ruolo di questo enzima come potenziale bersaglio clinico, i presenti inventori hanno effettuato studi farmacologici in vitro e in vivo dedicati bloccando in maniera transiente l'attivit? di D2 per mezzo di vari composti inibitori. Come mostrato nelle Figure 9, 10 e 11, in accordo con risultati precedenti in modelli preclinici di atrofia, gli animali sottoposti a trattamento con un composto inibitore di D2 erano protetti contro la denervazione e la perdita muscolare indotta da cachessia neoplastica. In particolare, in topi portatori di tumore ? stato osservato anche un aumento significativo del tasso di sopravvivenza (Figura 10I).
Inoltre, in modelli animali di lesione muscolare o cutanea, la somministrazione di un composto inibitore di D2 ha portato a un marcato aumento del numero di fibre muscolari e di mioblasti attivati nei muscoli danneggiati di topi trattati, rispetto agli animali di controllo (Figura 7), cos? come a un processo di guarigione delle ferite significativamente pi? rapido ed efficiente in seguito alle lesioni cutanee (Figura 8).
Senza voler essere vincolati da alcuna teoria, i presenti inventori ritengono che l'attivazione dell'azione degli ormoni tiroidei (TH) nel tessuto muscolare da parte dell'enzima deiodinasi di tipo 2 sia cruciale nell'innescare il catabolismo muscolare accelerato che causa la perdita muscolare in una moltitudine di stati patologici. Gli inventori ritengono inoltre che l'espressione di D2 contraddistingua le cellule staminali in uno stato di quiescenza nel muscolo e nella pelle e che la deplezione acuta di D2 nelle cellule staminali quiescenti inneschi la loro transizione spontanea da G0 a uno stato GAlert, cio? uno stato intermedio del ciclo cellulare tra la fase G0 e la fase G1, in cui le cellule staminali sono pi? rapidamente inclini a entrare nel ciclo cellulare in risposta a una lesione.
Sulla base di tutti i risultati sorprendenti illustrati sopra, l'attenuazione dell'attivit? enzimatica di D2 a livello tissutale fornisce un nuovo mezzo terapeutico molto efficace per proteggere il muscolo contro l'atrofia e/o per promuovere la rigenerazione di tessuti muscolari e/o cutanei danneggiati.
Un primo aspetto della presente invenzione ? quindi un composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l?impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare e/o nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle.
Come qui utilizzato, il termine "composto inibitore" si riferisce a una sostanza in grado di ridurre e/o bloccare l'attivit? di un enzima legandosi a questa proteina e modificando le propriet? catalitiche dell'enzima. A meno che non sia specificato o evidente, ? inteso che l'espressione "composto inibitore" comprende inibitori sia selettivi che non selettivi della iodotironina deiodinasi di tipo 2.
Come qui utilizzato, salvo diversa indicazione, il termine "trattamento terapeutico" si riferisce alla somministrazione del composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) secondo l'invenzione dopo l'insorgenza di sintomi della condizione patologica implicante il deperimento muscolare, nonch? alla somministrazione antecedente l'insorgenza dei sintomi, in particolare a soggetti a rischio della malattia.
Il termine "terapia rigenerativa", come qui utilizzato, si riferisce a trattamenti mirati alla ricrescita, riparazione o sostituzione di cellule, tessuti o organi danneggiati o malati in un soggetto.
In una forma di realizzazione, il composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) adatto per l?impiego secondo l?invenzione ? scelto dal gruppo consistente di triiodotironina inversa (rT3), amiodarone (AMIO), desetilamiodarone (DEA), 5-metil-2-tiouracile (MTU), 6-benzil-2-tiouracile (BTU), xantoumolo (XTH), genisteina (GEN), 6-propil-2-tiouracile (PTU), metimazolo (MMI), acido iopanoico (IAc), desametasone, aurotioglucosio (GTG), e qualsiasi loro combinazione.
Composti inibitori di D2 preferiti secondo l'invenzione sono descritti nella Tabella 1 insieme a indici di suscettibilit? di D2 all'inibizione da parte di questi composti e a relativi riferimenti bibliografici.
Tabella 1
Preferibilmente, il composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l'impiego secondo l'invenzione ? scelto tra triiodotironina inversa (rT3), amiodarone (AMIO) e desetilamiodarone (DEA), pi? preferibilmente tra triiodotironina inversa (rT3) e amiodarone (AMIO).
Il composto triiodotironina inversa (rT3, 3,3?5?-triiodotironina, numero CAS: 5817-39-0) ? una forma metabolicamente inattiva di ormone tiroideo, che viene generata dal pro-ormone tiroxina (T4) mediante rimozione di un atomo di iodio nell'anello interno di T4 attraverso l'enzima 5?-deiodinasi di tipo 3.
L'amiodarone (AMIO) ? un derivato iodato del benzofurano noto principalmente per la sua indicazione approvata nel trattamento delle malattie cardiache. Questo farmaco ? un potente agente antiaritmico di classe III capace di indurre un prolungamento dei potenziali di azione e dei periodi refrattari nel cuore.
Il desetilamiodarone (DEA) rappresenta il principale metabolita bioattivo dell?amiodarone e viene prodotto in una reazione di N-demetilazione catalizzata dal citocromo P450 3A4.
Una forma di realizzazione preferita secondo l'invenzione ? la triiodotironina inversa (rT3) per l'impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare, come ad esempio la cachessia o la sarcopenia.
Un'altra forma di realizzazione preferita secondo l'invenzione ? la triiodotironina inversa (rT3) per l'impiego nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle.
Ancora un'altra forma di realizzazione preferita secondo l'invenzione ? l'amiodarone (AMIO) per l'impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare, come ad esempio la cachessia e la sarcopenia.
Ancora un'altra forma di realizzazione preferita secondo l'invenzione ? l?amiodarone (AMIO) per l'impiego nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle.
Secondo l'invenzione, ? previsto che nella presente invenzione sia compresa qualsiasi possibile combinazione di composti inibitori della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) come definiti sopra.
Per esempio, in una forma di realizzazione dell'invenzione, rT3 ? utilizzata in combinazione con 6-propil-2-tiouracile (PTU). Vantaggiosamente, in questa forma di realizzazione, il PTU blocca l'attivit? epatica di D1 nel fegato, aumentando cos? l'emivita di rT3.
Come menzionato sopra, un approccio terapeutico basato sulla somministrazione di un composto inibitore di D2 ? particolarmente adatto per il trattamento di condizioni patologiche implicanti la perdita di massa muscolare e di forza muscolare quali, ad esempio, patologie di deperimento secondario (cachessia) o la degenerazione muscolare associata all'et? (sarcopenia).
Oltre alla protezione contro l'atrofia muscolare, il blocco farmacologico dell'attivit? della deiodinasi di tipo 2 determina la stimolazione della proliferazione delle cellule staminali muscolari e cutanee, rendendo in tal modo la modulazione tessuto-specifica dell'enzima D2 uno strumento efficace e innovativo in contesti terapeutici per la medicina rigenerativa.
A titolo di esempio, ma non di limitazione, la condizione patologica implicante il deperimento muscolare secondo l'invenzione pu? essere scelta dal gruppo consistente di sarcopenia, cancro, sepsi, diabete, insufficienza cardiaca cronica, malattia polmonare cronica ostruttiva, insufficienza renale cronica, cirrosi epatica, fibrosi cistica e qualsiasi loro combinazione.
Una forma di realizzazione preferita della presente invenzione si riferisce a un metodo terapeutico mirato a controllare la cachessia neoplastica.
Con riferimento alla terapia rigenerativa muscolare, malattie esemplificative che possono essere trattate secondo l'invenzione includono, ma non sono limitate a, indolenzimento muscolare a insorgenza ritardata (DOMS), contusione muscolare, strappo muscolare e lacerazione muscolare.
Nel contesto della terapia rigenerativa cutanea si pu? citare, ad esempio, ma senza limitazioni, il trattamento terapeutico di ulcere, dermatiti, ferite cutanee, ustioni e lacerazioni.
Il composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l'impiego secondo l'invenzione pu? anche essere efficacemente somministrato sotto forma di composizione farmaceutica.
Di conseguenza, un secondo aspetto della presente invenzione ? una composizione farmaceutica per l?impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare e/o nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle, detta composizione farmaceutica comprendendo una quantit? terapeuticamente efficace di almeno un composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) come definito sopra, e un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
Come qui utilizzato, il termine "quantit? terapeuticamente efficace" si riferisce a una quantit? del composto inibitore di D2 per l'impiego secondo l'invenzione sufficiente a mostrare un effetto terapeutico rivelabile. La quantit? efficace precisa per un soggetto dipender? dalle dimensioni e dalla salute del soggetto, dalla natura e dalla gravit? della condizione da trattare.
Il termine "farmaceuticamente accettabile" si riferisce a composti e composizioni che possono essere somministrati ai mammiferi senza indebita tossicit? a concentrazioni coerenti con l'attivit? efficace del principio attivo.
La scelta di veicoli, eccipienti e/o diluenti adatti alla composizione farmaceutica dell'invenzione pu? essere determinata da una persona di ordinaria abilit? nell?arte che utilizzi le sue conoscenze normali.
Preferibilmente, l?almeno un composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 nella composizione farmaceutica per l?impiego secondo l?invenzione ? scelto tra triiodotironina inversa (rT3), amiodarone (AMIO), desetilamiodarone (DEA), 5-metil-2-tiouracile (MTU), 6-benzil-2-tiouracile (BTU), xantoumolo (XTH), genisteina (GEN), 6-propil-2-tiouracile (PTU), metimazolo (MMI), acido iopanoico (IAc), desametasone, aurotioglucosio (GTG), e qualsiasi loro combinazione.
Una composizione farmaceutica preferita secondo l'invenzione comprende triiodotironina inversa (rT3) ed ? idonea per l'impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare, come ad esempio la cachessia o la sarcopenia.
Un'altra composizione farmaceutica preferita secondo l'invenzione comprende triiodotironina inversa (rT3) ed ? idonea per l'impiego nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle.
Ancora un'altra composizione farmaceutica preferita secondo l'invenzione comprende amiodarone (AMIO) ed ? idonea per l'impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare, come ad esempio la cachessia e la sarcopenia.
Ancora un'altra composizione farmaceutica preferita secondo l'invenzione comprende amiodarone (AMIO) ed ? idonea per l'impiego nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle.
? anche previsto dalla presente invenzione che nella composizione farmaceutica dell'invenzione possa essere presente qualsiasi combinazione di composti inibitori della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) come menzionati sopra.
In una forma di realizzazione, la composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione comprende rT3 in combinazione con qualsiasi tra amiodarone (AMIO), desetilamiodarone (DEA), 6-propil-2-tiouracile (PTU) e acido iopanoico (IAc).
In un'altra forma di realizzazione, la composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione comprende amiodarone in combinazione con qualsiasi tra rT3, desetilamiodarone (DEA), 6-propil-2-tiouracile (PTU) e acido iopanoico (IAc).
La composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione ? idonea a essere somministrata come terapia contro malattie correlate ai muscoli e/o alla pelle, e/o per riparare lesioni ai tessuti muscolari e/o cutanei, il tutto come definito sopra con riferimento all'utilizzo terapeutico del composto inibitore di D2.
La composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione pu? essere formulata in qualsiasi forma di dosaggio adatta, ad esempio per la somministrazione per via topica, orale, enterale o parenterale.
Come qui utilizzata, la somministrazione parenterale include, ma non ? limitata a, la somministrazione di una composizione farmaceutica mediante iniezione sottocutanea e intramuscolare, l'impianto di depositi a rilascio prolungato, la somministrazione per iniezione endovenosa.
La composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione pu? essere somministrata per applicazione topica in una soluzione, una crema, un unguento, uno spray, un gel o attraverso qualsiasi applicazione locale. La composizione farmaceutica dell'invenzione pu? anche essere somministrata per via transdermica per mezzo di un dispositivo di eluizione del farmaco, come una garza, un cerotto, un tampone o una spugna.
La composizione farmaceutica dell'invenzione pu? anche essere formulata in forme di dosaggio adatte alla somministrazione orale, quali compresse, capsule, una polvere, un granulato, una soluzione, una sospensione, uno sciroppo e simili.
In una composizione farmaceutica, la quantit? del principio attivo somministrato pu? variare ampiamente a seconda di considerazioni quali il particolare composto e la particolare unit? di dosaggio impiegati, la modalit? e il tempo di somministrazione, il periodo di trattamento, l'et?, il sesso e le condizioni generali del soggetto trattato, la natura e l'entit? della condizione trattata, la velocit? del metabolismo e dell?escrezione del farmaco, le potenziali combinazioni di farmaci e le interazioni farmacofarmaco.
La composizione farmaceutica per l'impiego secondo l'invenzione viene somministrata come dose singola o sotto forma di dosi multiple, e con la frequenza necessaria e per il tempo necessario per ottenere l'effetto terapeutico desiderato. Una persona di ordinaria abilit? nell?arte pu? facilmente determinare un ciclo di trattamento adatto utilizzando le composizioni farmaceutiche per l'impiego secondo l'invenzione.
Secondo la forma di realizzazione in cui la composizione farmaceutica comprende T3 inversa, il regime terapeutico ? preferibilmente basato sulla somministrazione al paziente di una dose giornaliera di rT3 compresa tra 50 microgrammi (?g) e 500 ?g.
Secondo un'altra forma di realizzazione in cui la composizione farmaceutica comprende amiodarone, il regime terapeutico ? preferibilmente basato sulla somministrazione al paziente di una dose giornaliera di amiodarone compresa tra 100 mg e 700 mg, pi? preferibilmente di una dose giornaliera di amiodarone compresa tra 200 mg e 600 mg.
Un regime terapeutico preferito secondo questa forma di realizzazione comprende la somministrazione orale al paziente di un regime consistente di un dosaggio giornaliero di 600 mg di amiodarone per le prime due settimane di trattamento, un dosaggio giornaliero di 400 mg di amiodarone per la terza settimana di trattamento e un dosaggio giornaliero di 200 mg di amiodarone durante il periodo di mantenimento della terapia.
Come noto nell?arte, la terapia con amiodarone pu? potenzialmente provocare un'ampia gamma di effetti avversi. Vantaggiosamente, detto regime di trattamento riduce l'incidenza di effetti avversi correlati al farmaco senza influenzare l'efficacia dell?amiodarone.
La seguente sezione sperimentale ? fornita unicamente a titolo di illustrazione e con essa non si intende limitare la portata dell?invenzione come definita nelle rivendicazioni allegate. Nella seguente sezione sperimentale si fa riferimento ai disegni allegati, in cui:
La Figura 1 mostra che la iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) ? altamente espressa in cellule staminali quiescenti di tessuti differenti. I risultati sono basati sulla IF su topi Pax7-nGFP e D2-3xflag in cellule staminali muscolari e cutanee (SC). (A) Colorazione rappresentativa in immunofluorescenza (IF) dell'espressione di Pax7 (verde) e di D2-flag (rosso) su criosezioni del muscolo tibiale anteriore (TA) non lesionato (barra di scala, 50 ?m). (B) Colorazione IF rappresentativa dell'espressione di CD34 (rosso) e di Flag-D2 (verde) nel follicolo pilifero dell'epidermide (barra di scala);
La Figura 2 mostra che l'espressione di D2 nel muscolo viene indotta in differenti modelli animali di deperimento muscolare. ? stata determinata l'espressione dell?mRNA di D2 e D3 nel muscolo TA (A) di animali con cachessia neoplastica (trattati con C26) sacrificati 6, 9 e 11 giorni dopo l'induzione della cachessia neoplastica, (B) di topi denervati sacrificati 6, 12 e 15 giorni dopo la denervazione, e (C) di topi a digiuno per 6, 12 e 24 ore. Espressione dell?mRNA di TR?, TR? (recettori degli ormoni tiroidei), MCT8 e MCT10 (trasportatori degli ormoni tiroidei) nel muscolo TA di topi cachettici (D), denervati (E) e a digiuno (F). Espressione dell?mRNA di MuRF-1 nel muscolo TA di topi cachettici (G), denervati (H) e a digiuno (I). Espressione dell?mRNA di atrogin-1 nel muscolo TA di topi cachettici (J), denervati (K) e a digiuno (L); La Figura 3 mostra che la deplezione di D2 nelle cellule staminali quiescenti accelera la rigenerazione muscolare. (A) Diagramma schematico del progetto sperimentale (in alto) e micrografie rappresentative (in basso) che mostrano la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) delle sezioni di TA di topi di tipo selvatico (wt) e di topi privi di deiodinasi (cD2KO) dopo induzione con tamoxifene (barra di scala, 100 ?m). (B) Percentuale di nuclei posizionati centralmente valutata nelle sezioni mostrate in A. (C) Quantificazione dell'area della sezione trasversale delle sezioni di TA mostrate in A. (D) Quantificazione della percentuale di cellule positive mediante doppia colorazione di Pax7/MyoD e Pax7/BrdU (wt n=5; cD2KO n=5 in tre esperimenti singoli). (E) Quantificazione dell'area della sezione trasversale di sezioni di TA di topi adulti cD2KO e wt (Pax7<creER>- tTd /GFP) 60 giorni dopo l'iniezione di CTX;
La Figura 4 mostra che la deplezione di D2 nelle cellule staminali quiescenti accelera la rigenerazione della pelle. ? stato eseguito un esperimento di guarigione di ferita in topi scD2KO e topi wt dopo la deplezione di D2 indotta da tamoxifene. (A sinistra) Immagini rappresentative dell'area della ferita a 0, 1, 7 e 10 giorni dopo la guarigione della ferita. (A destra) Grafico che mostra l'area della ferita calcolata utilizzando il Cell*F Olympus Imaging Software (la barra di scala rappresenta 1 cm).
La Figura 5 mostra che la deplezione globale di D2 nei topi attenua il deperimento muscolare indotto dal cancro (cachessia). (A) Micrografie rappresentative che mostrano la colorazione H&E e (B) grafici che mostrano il diametro medio delle fibre e la distribuzione di frequenza dell'area della sezione trasversale (CSA) delle miofibre di muscoli TA di topi wt e D2KO sacrificati 12 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26. (C) Grafico che mostra l'andamento temporale delle variazioni di peso corporeo di topi wt e D2KO monitorati per 14 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26. (D) Grafici che mostrano il peso del cuore e la vitalit? di topi wt e D2KO sacrificati 15 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26. (E) Espressione dell?mRNA di Atrogin-1 e (F) di Murf-1 nel muscolo TA di animali sacrificati 6, 9 e 12 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26;
La Figura 6 mostra che la deplezione globale di D2 nei topi attenua il deperimento muscolare indotto dalla denervazione. (A) Grafico che mostra l'andamento temporale delle variazioni di peso corporeo di topi wt e D2KO monitorati per 12 giorni dopo la denervazione dell?arto posteriore. (B) Grafico che rappresenta la distribuzione di frequenza della CSA delle miofibre di muscoli TA di topi wt e D2KO sacrificati 12 giorni dopo la denervazione. (C) Espressione dell?mRNA di Atrogin-1 e (D) di Murf-1 nel muscolo TA di animali sacrificati 6, 9 e 12 giorni dopo la denervazione;
La Figura 7 mostra la capacit? terapeutica di rT3 di attivare le cellule staminali durante la rigenerazione muscolare tramite blocco di D2. (A) Panoramica schematica del progetto sperimentale. (B) Micrografie rappresentative che mostrano la colorazione H&E di sezioni di TA di topi trattati con rT3 e non trattati (controllo, ctr), sacrificati 7 giorni dopo la lesione (barra di scala, 50?m). (C) Quantificazione dell'area della sezione trasversale delle sezioni di tessuto mostrate in B. (D) Grafico che mostra la percentuale di colorazione di Pax7/EdU su sezioni di TA di topi trattati con rT3 e di topi ctr (Ctr=3; rT3=3 topi in due esperimenti singoli). (E) Micrografie rappresentative che mostrano la colorazione H&E di topi trattati con rT3 e di topi Ctr, sacrificati 21 giorni dopo la lesione (barra di scala, 50?m). (F) Quantificazione dell'area della sezione trasversale delle sezioni di tessuto mostrate in E;
La Figura 8 mostra la capacit? terapeutica di rT3 di attivare le cellule staminali durante la rigenerazione cutanea tramite blocco di D2. (A) (in alto) Panoramica schematica del progetto sperimentale, (a sinistra) immagini rappresentative della guarigione di ferite cutanee in topi trattati con rT3 rispetto al controllo, e (a destra) grafico che illustra la quantificazione della chiusura della ferita presentata come media della percentuale delle dimensioni iniziali della ferita (n = 4 per ciascun gruppo in quattro esperimenti indipendenti) (barra di scala 1 cm). B) Immagini rappresentative di animali a 28 giorni post-lesione. Agli animali ? stata somministrata rT3 5 giorni prima della rasatura, e le ferite cutanee mostrano miglioramenti nella ricrescita dei peli. I dati sono rappresentati come media ? SEM; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 utilizzando un test di Mann-Whitney quando si confrontano due condizioni, e un T-test per confronti multipli;
La Figura 9 mostra che il blocco dell'attivit? di D2 con rT3 attenua l'atrofia muscolare in vitro. (A) Immagine rappresentativa dell'immunoblot di PARP in cellule pp6. ERK funge da controllo di caricamento. (B) Immagine rappresentativa dell'immunoblot di PARP misurata in cellule pp6. La tubulina funge da controllo di caricamento. (C) Colorazione IF rappresentativa di p65/NFKB su cellule pp6 trattate con o senza rT3. (D) Immagine rappresentativa dell'immunoblot di p65/NFKB in cellule pp6. Tubulina e PARP fungono da controlli di caricamento rispettivamente per i compartimenti citosolico e nucleare. (E) Immagine rappresentativa dell'immunoblot di p65/NFKB e caspasi8 in cellule pp6. La tubulina funge da controllo di caricamento. (F) Immagine rappresentativa dell'immunoblot di PARP in cellule C2C12. La tubulina funge da controllo di caricamento. (G) Immagine rappresentativa dell'immunoblot di PARP in cellule pp6;
La Figura 10 mostra che il trattamento con amiodarone protegge contro il deperimento muscolare in modelli di topo con cachessia neoplastica. (A) Panoramica schematica del progetto sperimentale. (B) Andamento temporale delle variazioni di peso corporeo di topi Ctr e di topi trattati con amiodarone monitorati per 11 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26. (C - E) Grafici che mostrano (C) peso del cuore, (D) TA ed (E) peso del muscolo gastrocnemio (GC) di topi Ctr e di topi trattati con amiodarone sacrificati 11 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26. (F) Grafico che mostra il peso del tumore in topi ctr e in topi trattati con amiodarone sacrificati 11 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26. (G) Espressione dell?mRNA di MURF-1 e (H) di Atrogin-1 nel muscolo TA di animali sacrificati 11 giorni dopo l'iniezione delle cellule C26. (I) Grafico che mostra la sopravvivenza globale (%) di topi Ctr e di topi trattati con amiodarone monitorati dopo l'iniezione delle cellule C26. (J) Distribuzione di frequenza della CSA delle miofibre di muscoli TA di topi Ctr e di topi trattati con amiodarone sacrificati 11 giorni dopo la cachessia;
La Figura 11 mostra che l?amiodarone protegge contro il deperimento muscolare in modelli di topo denervati. (A - B) Grafici che mostrano i livelli relativi di espressione dell?mRNA di (A) MURF-1 e (B) Atrogin-1 in Ctr (muscolo gastrocnemio controlaterale) e DEN (muscolo gastrocnemio denervato a seguito di transezione del nervo sciatico nel topo), con o senza trattamento con amiodarone. (C) Grafico che mostra la massa muscolare espressa in mg come differenza tra il muscolo gastrocnemio Ctr e il muscolo gastrocnemio DEN (PESO ?GC, NN DEN/DEN). MATERIALI E METODI
Animali
Gli animali sono stati alloggiati e mantenuti nella struttura per animali del CEINGE Biotecnologie Avanzate, Napoli, Italia. Gli esperimenti e la cura degli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali. Tg: Pax7-nGFP; Pax7CreER sono stati forniti da (Istituto Pasteur, Parigi, Francia) ( 2012 Cell 148(1-2): 112-125), Dio2 flox/flox ( 2015 Endocrinology 156(2): 745-754), D2-3xFLAG (
2017 J Clin Endocrinol Metab 102(5): 1623-1630), global-D2KO ( 2007 Endocrinology 148(3): 954-960) e utilizzati in questo studio. C57BL/6 e Balb/c sono stati acquistati da (Stock n.: 000664 e 000651). Tutti i topi utilizzati per gli esperimenti erano adulti, di et? compresa tra 12-16 settimane. Entrambi i sessi sono stati utilizzati per gli esperimenti come indicato. Gli animali sono stati genotipizzati mediante PCR utilizzando il DNA della coda.
Approvazione dello studio sugli animali
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformit? alle linee guida del Ministero della Salute e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Utilizzo degli Animali (IACUC: 167/2015-PR e 354/2019-PR). Colture cellulari, trasfezioni e reagenti Colture muscolari primarie (pp6) sono state isolate come descritto ( 1998 J Cell Biol 142(5): 1257-1267) dalle linee murine indicate. Mioblasti immortalizzati (C2C12) sono stati ottenuti da ATCC. Le cellule in via di proliferazione sono state coltivate in 20% terreno di Eagle modificato di Dulbecco con Siero Fetale Bovino a 37?C con penicillina/streptomicina. Le trasfezioni transienti sono state eseguite utilizzando Lipofectamina 2000 (Life Technologies) secondo le istruzioni del produttore. Gli anticorpi anti-MyoD (sc-304) e per la tubulina (sc-8035) sono stati acquistati da . Gli anticorpi anti-Pax7 provenivano da Developmental Studies Hybridoma Bank. Anti-PARP proveniva da Cell Signaling Technology.
Lesione muscolare
Gli animali sono stati anestetizzati mediante un cocktail di ketamina-xilazina, e 12,5 ?l di 60 ?g/ml CTX (Naja mossambica mossambica,
) sono stati iniettati in e per tutta la lunghezza del tibiale anteriore (TA) destro (Yan, 2003 J Biol Chem 278(10): 8826-8836) e 25 ?l nel muscolo gastrocnemio. CTX ? stata iniettata in un giorno diverso da Tam.
Area della sezione trasversale (CSA)
I muscoli tibiali anteriori (TA) sono stati dissezionati e fissati in isopentano in azoto liquido, e tagliati a fettine in sezioni di 7 ?m. L'area della sezione trasversale ? stata analizzata e quantificata utilizzando CellF*Olympus Imaging Software.
Immunofluorescenza e istologia
I muscoli dissezionati sono stati congelati istantaneamente in isopentano raffreddato con azoto liquido, sezionati (7 ?m di spessore) e colorati. Per la colorazione immunofluorescente, le cellule o le sezioni sono state fissate con 4% formaldeide (PFA) e permeabilizzate in 0,1% Triton X-100, poi saturate con 0,5% siero di capra ed incubate con un anticorpo primario. ? stato utilizzato un anticorpo secondario coniugato con Alexa FluorTM 594/647. Le immagini sono state acquisite con un microscopio IX51 Olympus e con il software Cell?F. Per la colorazione con ematossilina/eosina (H&E), le sezioni sono state fissate per 15 minuti e poste in ematossilina per 5 minuti, quindi lavate, e poste per 5 minuti in eosina.
Preparazione delle ferite, esame macroscopico e analisi istologiche
Il pelo del dorso dei topi ? stato rasato e la pelle ? stata pulita con alcool al 70%. La pelle dorsale ? stata sollevata usando una pinza e sono state create due ferite cutanee a tutto spessore di 8 mm lungo la linea mediana usando un punzone sterile per biopsia circolare da 8 mm premendo attraverso entrambi gli strati della pelle sollevata. La guarigione delle ferite cutanee ? stata misurata ogni 2-3 giorni anestetizzando gli animali ed eseguendo l'imaging dell'area ferita.
Sono state fatte asetticamente delle ferite cutanee escissionali a tutto spessore sulla pelle dorsale afferrando una piega cutanea in corrispondenza della linea mediana e utilizzando un punzone bioptico monouso sterile con un diametro di 8 mm per perforare i due strati di pelle. In questo modo, sono state fatte contemporaneamente due ferite su ciascun lato della linea mediana. Ciascun sito ferito ? stato fotografato digitalmente con Nikon FX-35A agli intervalli di tempo indicati, e le aree delle ferite sono state determinate sulle fotografie con CellF*. Le variazioni nelle aree delle ferite sono state espresse come percentuale delle aree iniziali delle ferite.
Esperimenti di qPCR
L?RNA totale ? stato estratto da cellule selezionate o coltivate con un Qiagen RNeasy Micro kit secondo le istruzioni del produttore (
Germania) e poi retro-trascritto in cDNA usando la trascrittasi inversa VILO (Invitrogen Life Technologies Ltd). Per la PCR in tempo reale, ? stata utilizzata la SYBR Green Master mix (Biorad). Ciclofilina A ? stata utilizzata come controllo endogeno per normalizzare l'espressione.
Analisi di Western blot
Estratti proteici totali di cellule e tessuti sono stati fatti correre su un gel per elettroforesi di 10% sodio dodecil solfato-poliacrilammide e trasferiti su una membrana di trasferimento Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). La membrana ? stata poi saturata con 5% latte scremato in polvere in soluzione salina tamponata con fosfato, sondata con l'anticorpo primario, lavata e incubata con un anticorpo secondario anti-immunoglobuline G di coniglio o di topo coniugato con perossidasi di rafano (1:3000) e rivelata mediante chemiluminescenza (Millipore). Dopo lavaggio accurato, la membrana ? stata incubata con un anticorpo anti-tubulina-specifico o per ERK (1:10.000; sc-8035, Dallas, TX) come controllo di caricamento.
Modello murino di deperimento muscolare Esperimento di denervazione
Gli animali sono stati anestetizzati con un cocktail di ketamina-xilazina ed ? stata fatta una piccola incisione (? 0,5 mm) nella pelle sul lato sinistro. Il nervo sciatico ? stato esposto con l'aiuto di un piccolo gancio chirurgico e poi tagliato prima della separazione dei rami del nervo sciatico. ? stata rimossa una piccola sezione di nervo (2-5 mm) per prevenire la reinnervazione. La denervazione ? stata eseguita unilateralmente, utilizzando l'arto posteriore contro-laterale come controllo negativo. Sono stati prelevati tessuti 2, 6, 12 o 15 giorni dopo l'intervento di denervazione.
Negli esperimenti di denervazione /-Amiodarone, i topi sono stati trattati per 13 giorni con Amiodarone e sono stati sacrificati 5 giorni dopo la denervazione indotta (dal giorno -7 fino al giorno 5 dopo la denervazione).
Modello murino di deperimento muscolare
Modello murino di cachessia
Cellule murine di adenocarcinoma del colon 26 (C26) sono state coltivate in DMEM contenente 10% siero fetale bovino, 100 U/ml penicillina e 100 ?g/ml streptomicina. Per l'inoculazione in vivo, una singola sospensione di 7 x 10<6 >cellule in 100 ?l di soluzione salina fisiologica ? stata iniettata per via sottocutanea nel fianco destro dei topi BALB/c. Lo stesso volume di soluzione salina fisiologica ? stato iniettato nei gruppi di controllo.
Negli esperimenti di cachessia /- Amiodarone, i topi sono stati trattati per 18 giorni con Amiodarone e sono stati sacrificati 7 giorni dopo la cachessia indotta. L?Amiodarone ? stato somministrato dal giorno -7 al giorno 7 (il giorno 1 ? il giorno dell'iniezione delle cellule).
Modello murino di deperimento muscolare Esperimento di digiuno
Topi C57BL6 sono stati fatti digiunare per 6, 12 e 24 ore con accesso illimitato all'acqua.
Somministrazione di rT3
In vivo: i topi (topi C56BL6) sono stati trattati per via sistemica con una iniezione i.v. di 100 ?l di 30 ng/?l rT3 (Sigma Aldrich) o di veicolo PBS di controllo per 4 giorni consecutivi.
In vitro: Cellule pp6 o C2C12 sono state trattate con rT3 (30 nM)
Somministrazione di amiodarone
I topi (topi C57BL6) sono stati trattati con 0,45 mg/ml di Amiodarone ( , A8423, St. Louis, MO, USA) Circulation Research 1987; 60:621-625; Oncotarget, 2015; 6(40): 42976?42987) in acqua potabile ad libitum a partire da 1 settimana prima della denervazione o della cachessia indotta, fino al sacrificio.
Preparazione di amiodarone: 45 mg dissolti in 1 ml di acqua per 10 minuti a 80?C.
Trattamento con TNF?
Cellule pp6 o C2C12 sono state trattate con TNF? (40 ng/?l) per 24 ore.
Analisi statistica
Le differenze significative sono state determinate utilizzando ANOVA unidirezionale, test di Mann-Whitney e t-test di Student, in cui p <0,05 ? considerato staticamente significativo. Tutte le statistiche e la grafica sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism7 e appaiono pi? dettagliatamente nell'Appendice SI, S20. In tutte le figure, le barre di errore rappresentano il SEM. Un valore di p < 0,05 veniva riconosciuto come significativo (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001).
RISULTATI
Esempio 1: D2 ? espressa nelle cellule staminali quiescenti del muscolo e della pelle
I presenti inventori hanno analizzato l'espressione di D2 mediante immunofluorescenza nel topo knock-in per 3xFLAG-D2 caratterizzato precedentemente ( 2017 J Clin Endocrinol Metab 102(5): 1623-1630). Con i loro esperimenti, gli inventori hanno trovato che D2 era colocalizzata con il marcatore Pax7+ delle cellule staminali muscolari (Seale, 2000 Cell 102(6): 777-786) nel muscolo tibiale anteriore (TA) a riposo (Figura 1A). ? interessante notare che l'espressione di D2 ? co-localizzata con il marcatore CD34 delle cellule staminali del follicolo pilifero, che marca specificamente il rigonfiamento del follicolo pilifero, dove sono localizzate le cellule staminali quiescenti (Figura 1B).
Nel complesso, questi risultati indicano che D2 marca le cellule staminali quiescenti.
Esempio 2: la deiodinasi di tipo 2 viene indotta nel muscolo in diversi modelli di deperimento muscolare.
Inoltre, gli inventori hanno analizzato il metabolismo di TH nell'atrofia muscolare scheletrica per mezzo di tre diversi modelli di atrofia muscolare, ovvero denervazione, cachessia neoplastica e digiuno. La denervazione ? stata indotta in topi di due mesi di et? mediante rescissione del nervo sciatico di una zampa. La zampa contro-laterale ? stata utilizzata come controllo interno. Nei topi denervati, prelevati in diversi punti temporali dopo la denervazione, sono stati misurati i livelli dell?mRNA di differenti modulatori di TH (D2, D3, TR?, TR?, MCT8 e MCT10). L'mRNA e la proteina D2 sono stati bruscamente sovraregolati sei giorni dopo la denervazione e la sua espressione ? stata mantenuta fino al giorno 15 (Figura 2A, D). Analogamente, l'espressione di D2 ? aumentata nella cachessia in topi BalbC sottoposti a iniezione per via sottocutanea (s.c.) con 7 x 10<6 >cellule di adenocarcinoma del colon 26 (C26) (Figura 2B). Anche il digiuno ha indotto un simile aumento dell'espressione di D2 all?inizio del digiuno (Figura 2C). Questi risultati suggeriscono che l'induzione di D2 e, di conseguenza, un'amplificazione locale della segnalazione di TH, sia una caratteristica comune di diversi modelli di atrofia muscolare.
Esempio 3: La deplezione di D2 potenzia la proliferazione delle cellule staminali durante la rigenerazione muscolare
Per determinare le conseguenze della deplezione di D2 nelle cellule satellite in seguito a lesione, gli inventori hanno analizzato i muscoli TA di topi cD2KO specifici per le cellule satellite prelevati 21 giorni dopo l'iniezione di cardiotossina (CTX) (Figura 3A).
La deplezione di D2 ha dato come risultato un maggior numero di fibre nucleate centralmente rispetto al controllo, associato a un diametro di fibra minore (Figure 3B-C). Di conseguenza, il numero di cellule Pax7+/MyoD+ e delle cellule Pax7+/BrdU+ equivalenti aumentava, mentre il numero di cellule Pax7+/MyoD- e Pax7-/MyoD+ della popolazione diminuiva (Figura 3D). Ci? ha suggerito che l'assenza di D2 facesse aumentare la capacit? proliferativa delle cellule staminali mentre il completamento del programma miogenico viene ritardato.
? interessante notare che 60 giorni dopo la lesione da CTX, il diametro delle fibre era maggiore nei topi cD2KO rispetto al controllo, il che suggerisce che la maturazione completa possa essere ottenuta con un tempo prolungato in assenza di D2 (Figura 3E).
Esempio 4: La deplezione di D2 potenzia la proliferazione delle cellule staminali durante la rigenerazione cutanea
Per caratterizzare gli effetti della deplezione di D2 in vivo durante la rigenerazione tissutale, gli inventori hanno condotto dei saggi di guarigione delle ferite. Il decorso temporale dell'epidermide in via di rigenerazione ha mostrato che la chiusura della ferita era significativamente pi? veloce nell'epidermide con deplezione di D2 che nella pelle di controllo (Figura 4A). Nel complesso, questi dati indicano un ruolo chiave di D2 nel preservare le cellule staminali del follicolo pilifero da un'attivazione incontrollata.
Esempio 5: la deplezione globale di D2 nei topi attenua il deperimento muscolare.
Per valutare il ruolo funzionale dell'induzione di D2 nell'atrofia muscolare, gli inventori hanno condotto studi di cachessia neoplastica in topi D2KO. Coppie abbinate di topi D2KO e di tipo selvatico (WT) sono state sottoposte a iniezione con cellule C26 e il deperimento muscolare ? stato monitorato a 12 e 15 giorni dopo l'iniezione.
I muscoli WT sono andati incontro a un drastico deperimento muscolare dal giorno 8-9 al giorno 15 dopo l'iniezione, come dimostrato dalla colorazione con ematossilina ed eosina, dall'area della sezione trasversale (CSA) delle fibre, dal peso del corpo e del cuore (Figure 5A-D). Per contro, i muscoli D2KO sono stati preservati dal massiccio deperimento muscolare e, fino a 15 giorni dopo l'iniezione, il processo atrofico era attenuato rispetto ai topi WT (Figure 5A-D).
? importante notare che, mentre la vitalit? media dei topi WT era di 12,7 giorni, i topi D2KO hanno quasi raddoppiato la loro vitalit? (22,4 giorni, Figura 5D). ? interessante notare che l'induzione di atrogeni, un segno comune dell?atrofia muscolare in corso, era fortemente ridotta nei topi D2KO (Figure 5E ed F).
Studi di denervazione muscolare in topi D2KO hanno mostrato un fenotipo simile di ridotto deperimento muscolare nei topi D2KO rispetto ai topi WT. A 9 e 12 giorni dopo la denervazione, il peso del gastrocnemio (GC) di animali WT era ridotto rispettivamente del 38% e del 34%, mentre la perdita di peso muscolare nei topi D2KO era del 4% e del 6% (Figura 6A). Coerentemente, il diametro delle fibre dei topi D2KO era notevolmente maggiore a 12 giorni dopo la denervazione, rispetto ai topi WT (Figura 6B).
Anche le ubiquitina-ligasi MuRF-1 e Atrogin-1 erano fortemente sotto-regolate nei topi D2KO denervati rispetto ai topi WT denervati, indicando che la stimolazione dell?UPS ? drasticamente ridotta in assenza di D2 (Figure 6C e D).
Questi dati dimostrano l'efficienza dell'ablazione di D2 e la conseguente riduzione dell'azione dei TH per una drastica attenuazione dell'atrofia sperimentalmente indotta in vivo.
Esempio 6: inibizione di D2 indotta da farmaco come nuovo strumento terapeutico per attivare le cellule staminali
Per sfruttare terapeuticamente la capacit? della deplezione di D2 di attivare le cellule staminali e accelerare la riparazione del tessuto muscolare, i topi sono stati trattati con triiodotironina inversa orale (rT3, uno specifico inibitore di D2) per 7 giorni (-5/+2 rispetto alla lesione indotta da CTX) (Figura 7A). L'analisi con ematossilina ed eosina 7 giorni post-CTX ha mostrato la presenza di un numero maggiore di fibre, che erano anche pi? piccole rispetto al controllo nei topi trattati con rT3 (Figure 7B e 7C). Nei topi trattati con rT3, le cellule Pax7+/EdU+ erano aumentate rispetto al controllo (Figura 7D). ? importante sottolineare che, 21 giorni dopo la lesione, sono state osservate fibre pi? grandi nei topi trattati con rT3 che nel controllo, in accordo con l?arco di tempo limitato (7 giorni) dell'inibizione di D2 (Figure 7E e 7F).
In un contesto simile, i presenti inventori hanno anche testato se l'inibizione di D2 influenzasse positivamente la rigenerazione della ferita nella pelle. Infatti, i topi trattati con rT3 riparano le ferite pi? rapidamente ed efficientemente del controllo (Figura 8A). ? interessante notare che, in momenti successivi dopo il ferimento cutaneo, ? stato osservato che gli animali trattati con rT3 mostravano una ricrescita pi? completa dei peli nell'area rasata (Figura 8B).
Considerati nel complesso, questi risultati hanno dimostrato che il blocco di D2 con rT3 mediante "attivazione" delle cellule staminali facilita la rigenerazione in diversi contesti tissutali e potrebbe essere sfruttato terapeuticamente in vivo.
Esempio 7: TH regola la via di segnalazione di NFKB/TNF?
Durante l'atrofia muscolare, la maggior parte delle citochine pro-infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale (TNF)-alfa, l'interleuchina (IL)-1beta e IL-6, ? sovra-espressa insieme a un'attivazione potenziata del Fattore Nucleare Kappa B (NFKB) (Bonaldo P. and Sandri M., Dis Model Mech. Gennaio 2013; 6(1): 25-39).
Gli inventori hanno testato gli effetti della modulazione di TH sul trattamento con TNF? delle cellule muscolari. Quando le cellule sono state trattate con TNF? in siero normale, ? stata osservata morte cellulare a 24 ore (Figure 9A-G). Per contro, cellule coltivate in assenza di TH (o quando l'attivazione di TH ? stata impedita tramite il blocco di D2 mediante rT3) sono state protette dall'apoptosi, mentre l?aggiunta del recettore di TNF? ha salvato l'effetto anti-apoptotico del blocco di D2 (Figure 2A e B). Il TNF ? uno dei pi? potenti induttori fisiologici del fattore di trascrizione nucleare NF-kappa B che media molti dei suoi effetti biologici come l'apoptosi; qui ? stato dimostrato che l'attivazione di NF-KB e la conseguente traslocazione della subunit? p65 al nucleo sono state bloccate da rT3 (Figure 9C e D).
Gli inventori hanno osservato che, pur non cambiando i livelli totali di p65, TNF? induceva l?attivit? della Caspasi-8 in cellule coltivate con siero normale, e questo effetto era quasi assente in assenza dei TH (o quando l'attivazione dei TH ? stata impedita tramite blocco di D2 mediante rT3, o quando le cellule sono state coltivate in terreno sottoposto a stripping su carbone) (Figura 9E). In accordo con ci?, la sovra-espressione di D3 nelle cellule muscolari le proteggeva dall'apoptosi indotta da TNF (Figure 9F e G), mentre l'aggiunta del recettore di TNF salvava l'effetto protettivo della sovra-espressione di D3 (Figura 9G).
Considerati nel complesso, questi dati indicano un ruolo importante di TH nell'indurre un mediatore cruciale dell'atrofia muscolare e confermano il ruolo protettivo dell'inattivazione di D2 contro la morte delle cellule muscolari indotta da atrofia. Esempio 8: inibizione di D2 indotta da farmaco come nuovo strumento terapeutico per attenuare il deperimento muscolare
Per sfruttare terapeuticamente la capacit? del blocco di D2 di proteggere i topi dal massiccio deperimento muscolare, i presenti inventori hanno utilizzato un inibitore specifico di D2, amiodarone. In modelli murini di cachessia indotta da tumore, i topi sono stati trattati con amiodarone orale per 18 giorni (-7/+11 rispetto all'iniezione di C26) (Figura 10A). Un gruppo abbinato di topi trattati con amiodarone e di controllo ? stato sottoposto a iniezione con cellule C26 e il deperimento muscolare ? stato monitorato a diversi giorni dopo l'iniezione. I muscoli dei topi di controllo sono andati incontro a un drastico deperimento muscolare, come dimostrato dall'area della sezione trasversale (CSA) delle fibre, e dal peso del corpo, del cuore, del TA (tibiale anteriore) e del GC (muscolo gastrocnemio) (Figure 10B-E e 10J). Per contro, i muscoli di topi trattati con amiodarone sono stati protetti da un massiccio deperimento muscolare (Figura 10B-E). Inoltre, non vi sono stati effetti significativi sul peso del tumore tra i topi trattati con amiodarone e quelli di controllo, indicando che il trattamento con amiodarone non ha inibito la crescita del tumore (Figura 10F).
Anche le ubiquitina-ligasi MuRF-1 e Atrogin-1 erano fortemente sotto-regolate nei topi trattati con amiodarone rispetto al controllo (Figure 10 G e H). ? importante sottolineare che, mentre la percentuale di sopravvivenza dei topi di controllo era di circa 12,7 giorni, i topi trattati con amiodarone hanno quasi raddoppiato la loro sopravvivenza (pi? di 27 giorni, Figura 10I), analogamente a quanto osservato nella cachessia indotta da tumore in topi a deplezione genetica di D2.
Nei modelli murini di denervazione, i topi sono stati trattati con amiodarone orale per 13 giorni (dal giorno -7 al giorno 5 dopo la denervazione). In accordo con il modello di cachessia indotta da tumore in topi D2KO, le ubiquitina-ligasi MuRF-1 e Atrogin-1 erano anche fortemente sotto-regolate nei topi trattati con amiodarone rispetto ai topi di controllo (Figura 11A e B). Inoltre, anche dopo la denervazione, i muscoli dei topi trattati con amiodarone sono stati protetti dal massiccio deperimento muscolare, come dimostrato dal mantenimento della massa del muscolo gastrocnemio (Figura 11 C).
Questi dati dimostrano l'efficacia dell'ablazione di D2 nell'attenuazione drastica dell'atrofia muscolare indotta sperimentalmente in vivo.

Claims (10)

RIVENDICAZIONI
1. Composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l?impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare e/o nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle.
2. Composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l?impiego secondo la rivendicazione 1, che ? scelto nel gruppo che consiste di triiodotironina inversa (rT3), amiodarone (AMIO), desetilamiodarone (DEA), 5-metil-2-tiouracile (MTU), 6-benzil-2-tiouracile (BTU), xantoumolo (XTH), genisteina (GEN), 6-propil-2-tiouracile (PTU), metimazolo (MMI), acido iopanoico (IAc), desametasone, aurotioglucosio (GTG), e qualsiasi loro combinazione.
3. Composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l?impiego secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la condizione patologica implicante il deperimento muscolare ? scelta dal gruppo che consiste di sarcopenia, cancro, sepsi, diabete, insufficienza cardiaca cronica, malattia polmonare cronica ostruttiva, insufficienza renale cronica, cirrosi epatica, fibrosi cistica, e qualsiasi loro combinazione.
4. Composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l?impiego secondo la rivendicazione 3, in cui la condizione patologica implicante il deperimento muscolare ? la cachessia neoplastica.
5. Composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l?impiego secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la terapia rigenerativa ? idonea per il trattamento di una patologia muscolare scelta dal gruppo che consiste di indolenzimento muscolare a insorgenza ritardata (DOMS), contusione muscolare, strappo muscolare, lacerazione muscolare, cachessia neoplastica, atrofia muscolare, e qualsiasi loro combinazione.
6. Composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) per l?impiego secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la terapia rigenerativa ? idonea per il trattamento di una patologia cutanea scelta dal gruppo che consiste di ulcere, dermatiti, ferite cutanee, ustioni, lacerazioni, e qualsiasi loro combinazione.
7. Composizione farmaceutica per l?impiego nel trattamento terapeutico di una condizione patologica implicante il deperimento muscolare e/o nella terapia rigenerativa del muscolo e/o della pelle, detta composizione farmaceutica comprendendo una quantit? terapeuticamente efficace di almeno un composto inibitore della iodotironina deiodinasi di tipo 2 (D2) come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, ed un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
8. Composizione farmaceutica per l?impiego secondo la rivendicazione 7, che ? in una forma farmaceutica idonea alla somministrazione per via topica, orale, enterale o parenterale.
9. Composizione secondo la rivendicazione 8, in cui la forma farmaceutica idonea alla somministrazione per via topica ? scelta dal gruppo che consiste di crema, unguento, spray, gel, garza, tampone, cerotto, cerotto medicato e spugna.
10. Composizione secondo la rivendicazione 8, in cui la forma farmaceutica idonea per la somministrazione orale ? scelta dal gruppo che consiste di compressa, capsula, polvere, granulo, soluzione, sospensione e sciroppo.
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