CN104302651B - 锗的配位化合物、其生产方法和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预期用于预防和/或治疗特别地由疱疹病毒导致的病毒疾病的药物的研发。提出的是具有如下结构通式的锗的配位化合物：Gex[AD][CA]y[AA]z(I)，其中AD是嘌呤系列的含氮碱的衍生物，其具有抗病毒活性且可以选自鸟嘌呤衍生物，例如阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦；或选自腺嘌呤衍生物，例如阿糖腺苷；CA是羟基羧酸，其可以选自酸例如(但不限于)柠檬酸、乳酸和苹果酸；AA是氨基酸，其可以选自各种α‑氨基酸，例如精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸，且其中x＝1‑2，у＝2‑4，且z＝0‑2。锗的配位化合物具有高水平的抗病毒和免疫刺激活性且易溶于水。上述举出的化合物通过下列步骤生产：生产二氧化锗的水性混悬液；向其中添加羟基羧酸、嘌呤系列的含氮碱的衍生物并任选但优选地添加氨基酸；在40‑100℃的温度下将产生的混合物加热3‑14小时，同时搅拌并且从该溶液中除去水，由此产生锗的配位化合物。

Description

锗的配位化合物、其生产方法和药物
技术领域
本发明涉及药物和药理学，即预期用于预防和/或治疗各种病毒疾病、特别是由疱疹病毒导致的那些疾病且适用于与抗癌疗法和免疫疗法联用的治疗药物的设计。
本发明涉及锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和优选氨基酸形成的新的锗配位化合物。特别地，本发明涉及锗与腺嘌呤和/或鸟嘌呤衍生物、优选是阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦、阿糖腺苷等种类形成的锗配位化合物。
请求保护的化合物提供了高水平的生物学、特别是针对疱疹病毒例如针对单纯疱疹病毒1型和2型(包括抗性株例如阿昔洛韦-抗性株)的抗病毒活性。
背景技术
目前，一些含氮碱衍生物用作治疗和预防各种病毒感染、特别是由疱疹病毒导致的感染的治疗药物，包括HIV-感染和癌症患者和具有器官移植物的患者的联合疗法。例如，鸟嘌呤衍生物用作抗病毒治疗药物，其特别地用于治疗由疱疹病毒导致的感染。
疱疹是最常见的人体疾病，其病原体是疱疹病毒。已知存在8种类型的疱疹病毒，最为公知的是单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(HHV-3)、eb病毒(HHV-4)、巨细胞病毒(HHV-5)等。世界上有相当部分的人群感染潜伏感染形式的疱疹病毒。疱疹病毒持久地存在于感染人的神经细胞中，但该病自身仅在加剧期间有临床表现，即病原体活动复制期间。HSV-1是例如角膜炎、“唇上发冷(cold on the lips)”和脑炎这样的疾病的原因；HSV-2导致生殖器感染；HHV-3导致水痘带状疱疹和带状疱疹疾病；HHV-4是传染性单核细胞增多症的原因；且HHV-5是巨细胞病毒肝炎、结肠炎和肺炎的原因。
用于治疗由疱疹病毒导致的疾病的治疗药物是那些只要定期接受就能够有效地抑制病毒感染、病毒复制和发育症状的药物。一种这样的广泛应用的治疗药物是阿昔洛韦，其为鸟嘌呤衍生物并且抑制细胞中的病毒复制。然而，阿昔洛韦在以高剂量使用时才有效地抑制病毒复制；特别地，这种治疗药物的摄入用量高达4,000mg/天。增加一次阿昔洛韦剂量降低了其生物利用度且这可能产生对身体的药物毒性作用。阿昔洛韦的一个更大的缺陷在于其低水溶性：在25℃为1.3mg/mL，且在37℃为2.5mg/mL；而此外，阿昔洛韦几乎不溶于疏水系统。由于这一原因，阿昔洛韦摄入产生微细结晶在尿(urea)中形成的一定可能性(参见Mason，W.J.和Nickols H.H.，“Crystal luria from acyclovir use,”N.Engl.J.Med.，2008，358：e14)以及出现肾毒性(nefrotoxicity)的一定可能性。此外，阿昔洛韦-抗性疱疹病毒株近来已经以甚至递增的频率出现，尤其是在免疫受损的人中。
伐昔洛韦是阿昔洛韦的修饰种类且具有更高的活性和生物利用度：54％，相对于阿昔洛韦的15-20％。但是伐昔洛韦如同阿昔洛韦一样，仅在1,000-4,000mg/天的高剂量下才有效。
还已知其它鸟嘌呤衍生物例如喷昔洛韦和更昔洛韦对单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)、水痘带状疱疹病毒、eb病毒和巨细胞病毒感染具有活性且用于治疗和预防由这些病毒导致的感染，特别是用于治疗和预防免疫受损的人，例如AIDS患者、癌症患者和那些具有器官移植物的患者。喷昔洛韦和更昔洛韦的一个常见缺陷在于其中度的水溶性(喷昔洛韦为0.17％且更昔洛韦为0.43％)和低生物利用度(分别为1.5％和5％)。
抗病毒治疗药物应具有如下特性：穿透细胞的能力、最小的细胞毒性、选择性、无成瘾性和在体内不蓄积。因此，一线剂型设计在于寻找在配制时可以改善现有技术治疗药物抗病毒活性的化合物。专利EP0477871(1992，IPC：A61K 31/52)公开了具有针对单纯疱疹病毒1型和2型的选择性和协同作用活性的抗病毒组合物。该抗病毒组合物由至少两种化合物组成，其为鸟嘌呤衍生物奥塔诺新G(OXT-G)、阿昔洛韦(ACV)和碳环奥塔诺新G(C-OXT-G)。
在Vero细胞培养物中研究了那些抗病毒组合物对单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)复制的作用。使单层Vero细胞培养物在37℃温度下生长在补充了10％小牛血清的Eagle营养培养基中。此后，使该培养物感染HSV-1和HSV-2。然后将鸟嘌呤衍生物各自或与彼此组合的方式插入到感染细的胞培养基中，并且测定提供病毒诱导的致细胞病变效应50％抑制的浓度(ID50)。显示由两种化合物组成的组合物在低于每种成分各自所需的浓度下达到ID50值。例如，阿昔洛韦(0.04-0.4mcg/mL)与奥塔诺新G(0.4-5.4mcg/mL)或与碳环奥塔诺新G(0.01-0.2mcg/mL)的组合提供了对HSV-1的协同作用且阿昔洛韦(0.1-3.4mcg/mL)与奥塔诺新G(0.4-4mcg/mL)或与碳环奥塔诺新G(0.04-0.54mcg/mL)的组合提供了对HSV-2的协同作用。
俄罗斯联邦专利2240792(2004，IPC：A61K 31/40)请求保护包含纺缍菌素或其双-衍生物与阿昔洛韦和更昔洛韦的组合物，这些组合物提供了对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的高抗病毒活性。
纺缍菌素化合物与阿昔洛韦和更昔洛韦的组合与分别服用组合抗病毒药中的每种药相比提供了可感觉到的增强作用。例如，对纺缍菌素(2.5mcg/mL)和双-纺缍菌素(0.15mcg/mL)与阿昔洛韦的组合应用，对于0.075mcg/mL和0.15mcg/mL的阿昔洛韦浓度，病毒诱导的致细胞病变效应的50％抑制浓度分别低于单独使用的阿昔洛韦的浓度(0.4mcg/mL)5和3倍。纺缍菌素和双-纺缍菌素与阿昔洛韦的组合提供了5倍于更昔洛韦浓度的降低。
美国专利6448227(2002，IPC：A61K 38/00)公开了包含S-乙酰基谷胱甘肽和阿昔洛韦的混合物，其作为针对单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒的活性剂。谷胱甘肽是三肽γ-谷氨酰基半胱氨酰基甘氨酸。
经证实S-乙酰基谷胱甘肽为针对单纯疱疹病毒(HSV-1)的有效活性剂，起始浓度为0.35mg/mL；阿昔洛韦尤其在0.45mcg/mL浓度下有效。S-乙酰基谷胱甘肽和阿昔洛韦的组合产生对HSV-1的强协同作用。例如，当S-乙酰基谷胱甘肽(0.7mg/mL)与阿昔洛韦(0.45mcg/mL)联用时，未测得病毒滴度。
经证实S-乙酰基谷胱甘肽(0.35mg/mL)与3种阿昔洛韦浓度的组合物对水痘带状疱疹病毒产生显著的协同作用，在阿昔洛韦浓度为0.9mcg/mL时尤其强。
俄罗斯联邦专利2104032(1998，IPC：A61K 47/22)公开了通过有机锗化合物(吉马烷(germatrane)衍生物)增强治疗药物的效能的方法。经证实有机锗化合物增强许多已知抗病毒治疗药物例如金刚烷衍生物(美沙酮和金刚乙胺)、核苷类似物(阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷和碘苷)、氨硫脲衍生物(美替沙腙)和膦甲酸的活性。治疗指数增加4倍，同时减轻了毒性并且缓解了副作用。在感染单纯疱疹病毒HSV-2的雄性豚鼠中测定了由吉马烷衍生物与膦甲酸或阿昔洛韦组成的组合物的抗病毒活性。临床研究显示吉马烷衍生物与膦甲酸或阿昔洛韦一起配制的应用对后者治疗HSV-2的效果方面提供了2倍至4倍的增强。
德国专利10343365(2005，IPC：A61K 45/00)请求保护黄原酸酯(二硫代碳酸酯)与抗病毒治疗药物组合的药物组合物。黄原酸酯、尤其是三环癸烷-9-基-黄原酸酯(D609)因其抗病毒和抗肿瘤活性而众所周知。
黄原酸酯作为抗病毒药物的应用与如下事实同时发生：高浓度的这些活性剂是治疗活体所需的。最新引述的专利证实黄原酸酯衍生物例如D609与阿昔洛韦组合的应用导致抗病毒活性增强。在无效的低浓度黄原酸酯的存在下，阿昔洛韦在细胞培养物中的活性增加了5倍。在对活体的实验中，D609和阿昔洛韦的组合对感染HSV-1的所有动物体提供了存活。
如下用于现有技术所用的用于改善已知治疗药物的抗病毒活性的方式包括制备包含几种活性化合物的抗病毒组合物，其增强治疗药物的抗病毒活性。
本发明的作者提出了完全不同的方法以改善已知化合物的抗病毒活性。本发明请求保护：锗与嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸形成的锗配位化合物，其中与相关嘌呤含氮碱衍生物相比，这些锗配位化合物是具有改善的生物药剂学参数(biopharmaceuticalvalues)、特别是高水溶性并且具有的抗病毒活性高于相关的嘌呤含氮碱衍生物的单独的化学化合物。
发明目的
本发明的一个目的在于提供锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和任选但优选的氨基酸形成的新的锗配位化合物，使得其可以具有特别是针对疱疹病毒的抗病毒活性。
本发明的另一个目的在于提供锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和任选但优选的氨基酸形成的新的锗配位化合物，使得其可以具有特别是针对疱疹病毒的抗病毒活性，这种抗病毒活性高于相关含氮碱的抗病毒活性。
本发明的另一个目的在于提供锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和任选但优选的氨基酸形成的新的锗配位化合物，使得其可以具有良好的水溶性。
本发明的另一个目的在于提供锗与各种嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、各种性质的羟基羧酸和各种性质的氨基酸形成的新的锗配位化合物的简单制备方法，使得所述新的锗配位化合物可以在固态下稳定且易于转化成为水溶液。
本发明的另一个目的在于研发用于制备锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和任选但优选的氨基酸形成的新的锗配位化合物的方法，使得可以控制该配位化合物中锗、嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸之间的比例，即可以控制该配位化合物的组成。
本发明的另一个目的在于提供抗病毒治疗药物，其包含锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和任选但优选的氨基酸形成的锗配位化合物作为活性成分。
本发明的另一个目的在于锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和任选但优选的氨基酸形成的锗配位化合物在制备用于改善免疫性的治疗药物中的应用。
本发明的另一个目的在于锗与嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)、羟基羧酸和任选但优选的氨基酸形成的锗配位化合物在治疗和/或预防病毒疾病、特别是由疱疹病毒导致的那些病毒疾病中的应用。
本发明的简单公开内容
请求保护的主题因提供新的有机锗配位化合物得以实现，所述新的有机锗配位化合物包含嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)，其组成由如下结构式描述：
Gex[AD][CA]y[AA]z (I)
其中AD是具有抗病毒活性的嘌呤含氮碱衍生物；
CA是羟基羧酸；
AA是可以选自α-氨基酸的氨基酸，
其中x＝1-2，y＝2-4，且z＝0-2，并且其中
所述配位化合物中的所有AD相同或不同，
所述配位化合物中的所有CA相同或不同，且
所述配位化合物中的所有AA相同或不同。
本发明上下文中有用的嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)是腺嘌呤和/或鸟嘌呤衍生物，优选阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和阿糖腺苷。
用于本发明的优选的羟基羧酸是柠檬酸、乳酸和/或苹果酸。
用于本发明的优选的氨基酸是精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸。
结构式(I)的锗配位化合物是充分溶于水且可以以固体形式分离的单独的化学化合物。
包含嘌呤含氮碱衍生物的结构式(I)的锗配位化合物具有高抗病毒和免疫刺激活性。
制备结构式(I)的锗配位化合物的方法包括：混合二氧化锗与水，得到二氧化锗的水性淤浆；向得到的淤浆中添加羟基羧酸、嘌呤含氮碱衍生物和任选但优选的氨基酸的混合物；将由此得到的混合物在40-100℃的温度下加热3-14小时，形成期望的产物；和通过任意已知方法除去水，得到粉状产物。
在本发明的方法中，可以向二氧化锗的水性淤浆中添加一种以上化学上不同的氨基酸的混合物和/或一种以上化学上不同的羟基羧酸的混合物和/或不同的嘌呤含氮碱衍生物的混合物。
发明详述
我们已经制备了包含嘌呤含氮碱衍生物(核苷类似物)的新的有机锗配位化合物，其组成由如下结构式描述：
Gex[AD][CA]y[AA]z (I)
其中AD是具有抗病毒活性的嘌呤含氮碱衍生物；
CA是羟基羧酸；
AA是选自α-氨基酸的氨基酸，
其中x＝1-2，y＝2-4，且z＝0-2，并且其中
所述配位化合物中的所有AD相同或不同，
所述配位化合物中的所有CA相同或不同，且
所述配位化合物中的所有AA相同或不同。
在结构式(I)中；x可以具有1或2的值；y可以是2、3或4；且z可以是0、1或2；即x、y和z各自是整数。
本发明上下文中有用的嘌呤含氮碱衍生物(AD)是具有特别是针对疱疹病毒的抗病毒活性的腺嘌呤和/或鸟嘌呤衍生物。这种衍生物是现有技术中众所周知的。它们示例为鸟嘌呤衍生物，其属于阿昔洛韦(cyclovir)家族，例如阿昔洛韦(9-[(2-羟基乙氧基)甲基]鸟嘌呤)、伐昔洛韦(2-(鸟嘌呤-9-基甲氧基)乙基L-缬氨酸醚)、更昔洛韦(9-[(1,3-二羟基-2-丙氧基)甲基]鸟嘌呤)、喷昔洛韦(9-[4-羟基-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)等。已知的腺嘌呤衍生物例如阿糖腺苷(9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤)在本发明上下文中也是有用的。在本领域中，这些化合物可选地称作核苷类似物。在本申请的上下文中，这些术语可以互换使用。
用于本发明的优选的嘌呤含氮碱衍生物(AD)是具有特别是针对疱疹病毒的抗病毒活性的鸟嘌呤衍生物。
本发明上下文中有用的羟基羧酸(CA)是各种羟基羧酸，例如柠檬酸、乳酸、苹果酸等。柠檬酸优选用于本发明的方法。
本发明上下文中有用的氨基酸(AA)是任意的α-氨基酸，优选精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸且最优选精氨酸和赖氨酸。
结构式(I)的化合物是可以以固态分离为无定形粉末的单独的化学化合物。
式(I)的单独的化学化合物是有机锗化合物，其在1个分子中包含一种以上生物活性成分，例如锗和具有抗病毒活性的含氮碱衍生物。这赋予了请求保护的化合物高抗病毒和免疫刺激活性。所述配位化合物中涉及的羟基羧酸和氨基酸赋予该配位化合物高度水溶性。此外，所述氨基酸和羟基羧酸增强式(I)的配位化合物的生物活性。
本发明提供了一种用于制备式(I)的化合物的简单方法，其包含最少数量的步骤。
本发明方法的特征在于将二氧化锗与水混合，得到水性淤浆。向搅拌的二氧化锗水性淤浆中加入含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸或含氮碱衍生物和羟基羧酸。根据该方法，可以加入一种以上含氮碱衍生物、一种以上羟基羧酸和一种以上氨基酸。将该混合物在40-100℃搅拌3-14小时，得到期望产物的溶液；然后通过任意已知的方法除去水，得到期望的产物，其为白色无定形粉末。
所用的二氧化锗可以是不溶于水的α-二氧化锗或溶于水的β-二氧化锗。水不溶性α-二氧化锗是优选的，因为在与水混合时，它形成二氧化锗的水性淤浆。
有用的嘌呤含氮碱衍生物(AD)是腺嘌呤或鸟嘌呤衍生物，其特别地对疱疹病毒具有抗病毒活性。优选用于该方法的衍生物是阿昔洛韦(cyclovir)家族的鸟嘌呤衍生物，例如阿昔洛韦(9-[(2-羟基乙氧基)甲基]鸟嘌呤)、伐昔洛韦(2-(鸟嘌呤-9-基甲氧基)乙基L-缬氨酸醚)、更昔洛韦(9-[(1,3-二羟基-2-丙氧基)甲基]鸟嘌呤)和喷昔洛韦(9-[4-羟基-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。本发明方法的另一个实施方案使用已知的腺嘌呤衍生物，例如，阿糖腺苷(9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤)。
本发明方法中有用的羟基羧酸(CA)是例如柠檬酸、乳酸、苹果酸等的羟基羧酸。柠檬酸优选用于本发明的方法中。
本发明方法中有用的氨基酸(AA)是任意的α-氨基酸，优选是精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和苏氨酸且最优选是精氨酸和赖氨酸。
锗、嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸之间在锗配位化合物中的比例取决于所述成分加入到二氧化锗水性淤浆中的量。调整二氧化锗的量与嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸的量的比例，可以得到具有锗、嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸之间不同比例的配位化合物。当将含氮碱衍生物以化学计算比例加入到二氧化锗水溶液中时，含氮碱与二氧化锗之间在得到的配位化合物中的摩尔比为1:1。调整鸟嘌呤衍生物与二氧化锗之间的摩尔比，由此可以调节得到的配位化合物中锗与嘌呤含氮碱衍生物之比。
可以以相同方式调整锗与羟基羧酸和氨基酸在配位化合物中的比例。当将羟基羧酸(或氨基酸)以化学计算比例加入到具有二氧化锗的水溶液中时，锗与羟基羧酸(或氨基酸)在得到的配位化合物中的摩尔比为1:1。当以相对于化学计算量双倍的用量加入羟基羧酸(或氨基酸)，羟基羧酸(或氨基酸)与锗在得到的配位化合物中的摩尔比为2:1。
在更详细的方式中，制备本发明具有锗、嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸之间不同比例的锗配位化合物的切实可行性通过本发明的示例性实施方案加以证实。
调整本发明锗配位化合物的组成，能够得到包含不同量的嘌呤含氮碱衍生物的配位化合物。这构成了请求保护的配位化合物作为治疗病毒疾病的治疗药物的应用的重要优点，这归因于能够制备具有增加或降低的抗病毒活性的治疗药物。
进行制备锗与嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸任选但优选的氨基酸形成的锗配位化合物的反应时的温度为40-100℃。优选的温度为80-100℃；更优选的温度85-100℃。
反应时间为3-14小时。优选的反应时间为5-12小时；更优选的反应时间为6-8小时。
通过二氧化锗完全溶解(当使用不溶性二氧化锗时)和形成澄清溶液监测有机锗配合物的形成。任意其它方法也用于监测产物形成，例如，涉及采样和分析样品的那些方法。
为了分离有机锗配位化合物，过滤溶液，然后通过任意已知方法从该溶液中除去水。任意已知的方法适合于该目的，例如水蒸发、真空加热蒸馏或冻干(冷冻干燥)。得到期望的化合物，为无定形粉末。
可以将嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸同时或通过同时导入这些成分加入到二氧化锗的水性淤浆中。所述成分的添加顺序不会显著地影响得到的期望产物，如果照此添加，则期望的产物为锗与嘌呤含氮碱衍生物、羟基羧酸和氨基酸形成的锗配合物。
该方法的一个实施方案是包括下列步骤的方法：将羟基羧酸加入到二氧化锗的水性淤浆中，并在搅拌下在80-100℃将由此得到的混合物加热6-10小时，直到形成澄清溶液为止；然后添加氨基酸和嘌呤含氮碱衍生物，特别是鸟嘌呤衍生物；和在80-100℃持续加热2-3小时，过滤溶液，并除去水，得到配位化合物。
该方法的另一个实施方案是包括下列步骤的方法：将氨基酸加入到二氧化锗的水性淤浆中；在搅拌下在80-100℃将由此得到的混合物加热3-5小时，直到形成澄清溶液为止；然后添加羟基羧酸和嘌呤含氮碱衍生物，特别是鸟嘌呤衍生物；和在80-100℃持续加热3-5小时，过滤溶液，并除去水，得到固体形式的配位化合物。
该方法的另一个实施方案是包括下列步骤的方法：将氨基酸和羟基羧酸加入到二氧化锗的水性淤浆中；在搅拌下在80-100℃将由此得到的混合物加热6-8小时，直到形成澄清溶液为止；然后添加嘌呤含氮碱衍生物，特别是鸟嘌呤衍生物；和在80-100℃持续加热2-3小时，过滤溶液，并除去水，得到固体形式的配位化合物。
该方法的另一个实施方案是包括下列步骤的方法：将氨基酸、羟基羧酸和嘌呤含氮碱衍生物特别是鸟嘌呤衍生物的混合物加入到二氧化锗的水性淤浆中；在搅拌下在80-100℃将由此得到的混合物加热6-12小时，直到形成澄清溶液为止；过滤溶液，并除去水，得到固体形式的配位化合物。
该方法的另一个实施方案是包括下列步骤的方法：将羟基羧酸加入到二氧化锗的水性淤浆中，并在搅拌下在80-100℃将由此得到的混合物加热8-9小时，直到形成澄清溶液为止。然后添加嘌呤含氮碱衍生物，特别是鸟嘌呤衍生物；在80-100℃持续加热2-3小时，过滤溶液，并除去水，得到固体形式的配位化合物。
得到产物，为白色无定形粉末，其易溶于水。值得注意地，大部分鸟嘌呤衍生物通常难溶于水(除外伐昔洛韦)。例如：阿昔洛韦的水溶性在37℃为2.5mg/mL，更昔洛韦的水溶性在25℃为4.3mg/mL，喷昔洛韦的水溶性在20℃为1.74mg/mL，而伐昔洛韦的水溶性在25℃为174mg/mL。按照相同方式，腺嘌呤衍生物具有有限的水溶性；例如，阿糖腺苷难溶于水且作为软膏使用。根据本发明制备的锗配位化合物具有良好的水溶性，在20℃超过25wt％，即在20℃超过250mg/mL。根据本发明制备的锗配位化合物的高水溶性使得水溶液具有高浓度的所制备的这些化合物并且用作抗病毒治疗药物，而不会导致肾毒性副作用。
研究了锗与嘌呤含氮碱衍生物特别是鸟嘌呤衍生物、羟基羧酸和氨基酸形成的锗配位化合物的NMR和IR光谱，如果使用它们，则根据本发明制备并且还对这些化合物进行元素分析。结果显示这些锗配位化合物具有如下结构通式：
Gex[AD][CA]y[AA]z (I)
其中AD是具有抗病毒活性的嘌呤含氮碱衍生物；CA是羟基羧酸；AA是α-氨基酸，其中x＝1-2，y＝2-4，且z＝0-2，其中x、y和z各自是整数，并且其中
所述配位化合物中的所有AD相同或不同，
所述配位化合物中的所有CA相同或不同，且
所述配位化合物中的所有AA相同或不同。
嘌呤含氮碱、氨基酸和羟基羧酸的存在赋予锗配位化合物高生物活性和良好的水溶性，使得这些化合物可以用于制备用于不同医疗应用的新的药物组合物和治疗药物。改变嘌呤含氮碱、氨基酸和/或羟基羧酸的性质提供了制备锗配位化合物的方式，所述锗配位化合物具有极高的生物活性，用于制备高度有效的药物。我们提出了在这些药物和治疗药物中使用本发明的锗配位化合物作为活性成分。预期请求保护的优选的锗配位化合物具有与涉及的嘌呤含氮碱所具有的相同类型的生物活性，恰如下文根据实施例1和5制备的化合物所证实的。然而，锗配位化合物还可以具有另一种类型的生物活性，使得它并非本文涉及的起始成分固有的。预期锗配位化合物以有效量使用。药物组合物和制剂还可以包含常规的辅助成分，它们是本领域众所周知的。
在下文中我们描述了锗与嘌呤含氮碱衍生物特别是鸟嘌呤和腺嘌呤衍生物、羟基羧酸和氨基酸形成的锗配位化合物制剂(如果照此使用的话)。这些实施例仅用于示例制备锗配位化合物的方法，而绝不预以将本发明限于这些实施例。
实施例1.
向安装搅拌器和温度计的圆底烧瓶中加入3.12g(0.03mol)α-二氧化锗和12.6g(0.06mol)一水合柠檬酸和200mL蒸馏水。将该淤浆在加热下搅拌(在85-95℃)8-9小时，直到形成澄清溶液为止。然后加入2.61g(0.015mol)精氨酸和3.38g(0.015mol)阿昔洛韦，进行加热搅拌(在85-95℃)2小时。此后，冷却该溶液，过滤，用旋转蒸发器除去水。得到产物，为19.5g(95％)白色无定形粉末。
测定NMR和IR光谱，对根据实施例1制备的锗配位化合物得到元素分析数据。图1展示了具有精氨酸、柠檬酸和阿昔洛韦的锗配位化合物在D2O中的1H NMR光谱。图2展示了具有精氨酸、柠檬酸和阿昔洛韦的锗配位化合物的IR光谱。根据实施例1制备的锗配位化合物得到元素分析数据展示在表1中。根据实施例1制备的化合物在下文中表示为WDS-1。
实施例2.
向安装搅拌器和温度计的圆底烧瓶中加入3.12g(0.03mol)α-二氧化锗、12.6g(0.06mol)一水合柠檬酸、4.5g(0.06mol)甘氨酸、9.73g(0.03mol)伐昔洛韦和250mL蒸馏水。将该淤浆在加热下搅拌(在85-95℃)10-12小时。冷却得到的澄清溶液，过滤，用旋转蒸发器除去水。得到产物，为27.1g(94％)白色无定形粉末。相关元素分析数据展示在表1中。本实施例的化合物在下文中表示为WDS-2。
实施例3.
向安装搅拌器和温度计的圆底烧瓶中加入3.12g(0.03mol)α-二氧化锗、12.6g(0.06mol)一水合柠檬酸、7.6g(0.03mol)喷昔洛韦和250mL蒸馏水。将该淤浆在加热下搅拌(在85-95℃)7-9小时，直到形成澄清溶液为止。然后加入5.22g(0.03mol)精氨酸，进行加热搅拌(在85-95℃)2小时。此后，冷却该溶液，过滤，用旋转蒸发器除去水。得到产物，为26g(95％)白色无定形粉末。相关元素分析数据展示在表1中。本实施例的化合物在下文中表示为WDS-3。
实施例4.
向安装搅拌器和温度计的圆底烧瓶中加入3.12g(0.03mol)α-二氧化锗、7.14g(0.06mol)苏氨酸和250mL蒸馏水。将该淤浆在加热下搅拌(在85-95℃)5-7小时。然后加入7.65g(0.03mol)更昔洛韦和8.04g(0.06mol)苹果酸，将该混合物加热搅拌(在85-95℃)3小时。此后，冷却该溶液，过滤，用旋转蒸发器除去水。得到产物，为23.1g(93％)白色无定形粉末。相关元素分析数据展示在表1中。本实施例的化合物在下文中表示为WDS-4。
实施例5.
向安装搅拌器和温度计的圆底烧瓶中加入3.12g(0.03mol)α-二氧化锗、2.46g(0.015mol)一水合赖氨酸、12.6g(0.06mol)一水合柠檬酸和200mL蒸馏水。将该淤浆在加热下搅拌(在(85-95℃)6-7小时，直到形成澄清溶液为止。本实施例的化合物在下文中表示为根据实施例5制备的化合物的NMR和IR光谱分别如图3和图4中所示。相关元素分析数据展示在表1中。本实施例的化合物在下文中表示为WDS-5。
实施例6.
向安装搅拌器和温度计的圆底烧瓶中加入3.12g(0.03mol)α-二氧化锗、12.6g(0.06mol)一水合柠檬酸和200mL蒸馏水。将该淤浆在加热下搅拌(在85-95℃)8-9小时，直到形成澄清溶液为止。然后加入3.38g(0.015mol)阿昔洛韦，进行加热搅拌(在85-95℃)2小时。此后，冷却该溶液，过滤，通过冷冻干燥除去水。得到产物，为16.9g(94％)白色无定形粉末。相关元素分析数据展示在表1中。本实施例的化合物在下文中表示为WDS-6。
实施例7.
向安装搅拌器和温度计的圆底烧瓶中加入3.12g(0.03mol)α-二氧化锗、12.6g(0.06mol)一水合柠檬酸和200mL蒸馏水。将该淤浆在加热下搅拌(在85-95℃)8-9小时，直到形成澄清溶液为止。然后加入8.55g(0.03mol)一水合阿糖腺苷，进行加热搅拌(在85-95℃)2小时。此后，冷却该溶液，过滤，通过冷冻干燥除去水。得到产物，为20.5g(95％)白色无定形粉末。相关元素分析数据展示在表1中。本实施例的化合物在下文中表示为WDS-7。
急性毒性
在无谱系(nonlinear)白色雄性小鼠中测定新化合物、特别是根据实施例1、5和6制备的那些化合物的急性毒性，小鼠体重为18-20g，一次灌胃(i/g)给药剂量为1,000、2,000、3,000、4,000和5,000mg/kg的20％水溶液，每20g小鼠体重的用量分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mL。各自给予所述化合物。在给予每种化合物后14天，未发现中毒征兆、体重增加延迟或动物死亡。在所研究剂量范围内未观察到动物的运动、反射或行为紊乱。解剖研究未发现肺、肾、脾或其他器官的任何改变。所研究的化合物在小鼠中的LD50值大于5,000mg/kg，且由此根据俄罗斯联邦标准(GOST)12.1.007-76，这些化合物在物质的有害分级方面因其对身体的影响而可以被分类为IV类危险；或根据Hodge和Sterner等级(1943)被分类为V类毒性(实际上无毒性)。
实施方案还发现测试化合物无皮肤刺激性、皮肤再吸收性或致敏效应。
测试化合物在体内无蓄积且不具有蓄积性质。当将所述化合物通过以1,000mg/kg剂量灌胃给予无谱系小鼠14天时，实验组动物与对照组动物中的相应值相比未显示死亡且无体重或实质器官(肝、肾和脾)重量系数改变。
生物药剂学参数
药物在胃肠道生物流体(胃液、肠液)中的溶解性是重要的生物药剂学特性。我们已经研究了一些新制备的化合物特别是WDS-1和WDS-5与阿昔洛韦比较的选择的生物药剂学参数。进行符合Guidance on the Investigation of Bioequivalence，EuropeanMedicines Agency (EMA)，Committee for Medicinal Products of Human Use(CHMP)，2010要求的试验。
为了该目的，我们研究了这些化合物在相当于胃肠液(肠液：pH为1.2；十二指肠液：pH 4.4；和小肠液：pH 6.8)的不同pH下的溶解性。
能够将治疗药物(TD)描述为具有“高”或“低”溶解性的化合物的一种生物药剂学溶解性值是剂量/溶解性比(D/S)。将剂量/溶解性比测定如下：最大剂量(D)(mg)/水溶性(S)(mg/mL)。当D/S≤250mL时，TD在相关水溶液中具有“高”溶解性。
重要地，生物药剂学溶解性对于指定治疗药物(TD)而言并非恒定值；而是取决于预期用于全身作用的速释TD的最大注册剂量。在这些实验中，使用俄罗斯联邦药用注册的片剂剂型中的最大阿昔洛韦剂量(800mg)计算剂量/溶解性比。
另一种生物药剂学参数是在生物相关介质中的溶解性。它们是尽可能地在化学组成和物化特性(pH、渗透重量摩尔浓度(osmomolality)、缓冲容量和表面张力)方面接近人体液(肠液和胃液)的溶出介质。通过将表面活性剂(卵磷脂和牛磺胆酸钠)导入这些介质提供对生理条件的模拟。存在两种主要类型的生物相关介质，即：空腹(禁食模拟肠液(FaSSIF))和餐后(进食模拟肠液(FeSSIF))中的人工肠液。可以将化合物在这些介质中的溶解性差异考虑到优化剂量方案中(空腹或餐后取值)。当治疗药物的最大剂量完全溶于250-mL部分的每种这些介质时，我们可以将这种药物称作具有“高”生物相关溶解性。
可以用作溶质通过小肠壁吸收的测量值的标准是渗透性，即物质通过肠壁渗透的部分。对渗透性提供最大贡献的分子的物化特性是亲脂性。用于间接评价肠渗透性的亲脂性测量值是辛醇-水分配系数log P，其为未电离的物质在两种不能混合的液体系统(正辛醇和水)中的粘度比的对数。“高”(超过90％)肠渗透性的间接标准如下：当分配系数log P超过参比物质值(美托洛尔，log P＝1.72)时，肠渗透性被视为高。将实验结果概述在表2中。
表2.化合物WDS-1和WDS-5与阿昔洛韦比较的生物药剂学参数
*测试化合物的pH为4.4，阿昔洛韦的pH为4.5。
因此，根据本发明制备的锗配位化合物的生物药剂学溶解性可以被视为“高”于生理pH值的整个范围，该范围相当于胃、十二指肠或小肠初段中的pH值。值得注意地，本发明的锗配位化合物的溶解性值不同于阿昔洛韦的溶解性，不仅是在定量方面，而且是在定性方面。因此，锗配位化合物的溶解性值至少是阿昔洛韦溶解性的10倍，此外，本发明的锗配位化合物的溶解性“高”于所研究的整个pH范围，而阿昔洛韦的溶解性在pH 44-4.5和6.8下均“低”。
本发明的锗配位化合物在生物相关介质(FaSSIF和FeSSIF)中的生物相关溶解性均“高”且每250mL中有10个以上物质的最大剂量溶解。因为溶解性在两种生物相关介质中均是高的，所以进食对于胃肠道环境中物质的溶出而言不是限速方法，而应在优化剂量方案中考虑另外的因素(例如，是否导致对胃肠壁的刺激，是否化合物在进食时被破坏等)。
所研究的本发明锗配位化合物的分配系数log P低于美托洛尔，且其值与阿昔洛韦的分配系数log P相当。因此，可以将这些化合物的肠渗透性表征为“低”。鉴于这些化合物的高生物药剂学溶解性(在上文中讨论且显示在表2中)，所以同时预期本发明的锗配位化合物具有高于阿昔洛韦生物利用度的生物利用度。然而，不能排除通过肠壁吸收是本发明的化合物进入血流的限速阶段。
总之，由于具有类似于阿昔洛韦的亲脂性，所以本发明的锗配位化合物具有非常高的生物相关性和生物药剂学溶解性并且可以用作其较高生物利用度的证据。
抗病毒活性
(A)本发明锗配位化合物的体外抗病毒活性研究
根据常规技术在体外对绿猴肾细胞(VERO)培养物研究了本发明的新锗化合物、特别是WDS-1和WDS-5的抗病毒活性(参见Gus'kova，T.A.，Nikolaeva，I.S.和Peters，V.V.，“Methodological Guidance to Study Antiviral Activity of PharmacologicalAgents”，“The Manual on the Experimental(Preclinical)Study of NewPharmacological Agents,”Moscow，Ministry of Public Healthcare of the RussianFederation，Remedium IPA，CJSC，2000，pp.274-280；Cotarelo，M.，Catalan，P.，Sanchez-Carrillo，C.，Menasalvas，A.，Cercenado，E.等人，“Cytopathic effect inhibitionassay for determining the in vitro susceptibility of herpes simplex virus toantiviral agents,”J.Antimicrob.Chemother.，1999，Vol.44，pp.705-708；Kruppenbacher，J.P.，Klass，R.和Eggers，H.J.，“Arapid and reliable assay fortesting acyclovir sensitivity of clinical herpes simplex virus isolatesindependent of virus dose and reading time,”Antiviral Res.，1994，Vol.23，pp.11-22；和Flint，S.J.，Enquist，W.，Racaniello，V.R.和Skalka，A.M.，(2009)。“VirologicalMethods”in Principles of Virology，ASM Press)。
所用的参比物分别为阿昔洛韦和伐昔洛韦。
用于研究抗病毒活性的测试病毒为单纯疱疹病毒I型(HSV)株，其对阿昔洛韦具有高度抗性(株“L2/R”)。
用于评价抗病毒活性的标准是：防止病毒诱导的致细胞病变效应发生的能力和抑制病毒在细胞培养物中复制的能力。在使培养物感染一定剂量的病毒后将测试样品插入营养培养基1h(治疗方案)。每天使用光学显微镜检查，根据细胞单层形态改变的程度，监测细胞培养物中样品的抗病毒活性和病毒诱导的致细胞病变效应。在充分确定的(100％)致细胞病变效应出现在对照样品(阳性对照)中后，终点在细胞接触感染物第4天时。将在本发明的有机锗化合物样品中存在抗病毒活性确定为在实验组与对照组中测定的病毒滴度之差。根据Reed和Muench(Reed，L.J.和Muench，H.，“A s imple method of estimating fiftypercent endpoints,”The American Journal of Hygiene 1938，27：493-497)测定病毒滴度。当滴度差为≤1.5log TCD50时，即导致单层中50％细胞死亡的致细胞病变组织培养剂量(TCD50是导致50％培养的细胞中细胞病理学情况的组织培养剂量)，该化合物被视为具有低抗病毒活性；当这种差异在1.5-2.0log TCD50的范围时，该化合物被视为具有适度的抗病毒活性；而当这种差异为≥2.0log TCD50时，该化合物具有充分确定的HSV-抑制活性。
在本实验中，浓度范围在500-100mcg/mL的阿昔洛韦样品显著地将病毒感染活性降低2.0log-1.0log的值。500mcg/mL和250mcg/mL浓度的伐昔洛韦样品显著地将HSV-1“L2/R”病毒感染活性降低1.5log。等效于400-160mcg/mL阿昔洛韦浓度范围的本发明配位化合物WDS-1的样品显著地将HSV-1“L2/R”病毒感染活性降低3.25-1.5logTCD50的值。等效于400-160mcg/mL阿昔洛韦浓度范围的本发明配位化合物WDS-5的样品显著地将HSV-1“L2/R”病毒感染活性降低1.75-1.0log TCD50的值。
(B)本发明锗配位化合物的体内抗病毒活性研究
(a)本发明化合物的治疗抗病毒活性
对家兔中诱导的疱疹性眼疱疹体(角膜炎)进行体内实验，该实验预以评价使用阿昔洛韦制备本发明化合物WDS-1的治疗效能(Kaufman，Н.Е.，Martola，E.L.和Dohlman，C.H.，“The use of 5-iodo-2-deoxyuridine(IDU)in the treatment of herpes simplexkeratitis,”Arch.Ophthalmol.1962；68：235-239)。使动物感染包含10TCID50剂量的HSV-1的培养物流体(TCID50是组织培养的50％感染剂量，其导致50％的单层细胞损害)，使用移液管将其施用于预擦伤的角膜(随后摩擦)。在感染后48小时开始治疗HSV-感染的家兔。每日经口给予6次所述活性剂，浓度为10mg/mL，持续8天。
本发明化合物WDS-1的应用显示充分确定的治疗作用，并且与对照组中相应的值相比，导致眼部疱疹的临床现象严重性出现具有统计学意义的缓解，疾病期限缩短且防止疱疹性眼部感染并发脑膜脑炎的发生。
图5显示家兔中眼部疱疹的动力学情况。化合物WDS-1的治疗指数为42.9％。在用WDS-1治疗的家兔组中，早在第2天治疗时就注意到炎症过程的严重性减轻，导致临床表现快速减少。活性剂自身在治疗上皮角膜炎中显示最快速的的活性。截止到感染后第13天时，临床表现减弱。实验组中动物的存活率为100％，与对照组中的66.7％相比，在该环境中具有良好的耐受性。
由于使用WDS-1，所以仅在早于对照组3天感染后9天时才在动物中注意到来自眼拭子的病毒分离物(表3)。
表3.化合物WDS-1对得自具有眼部疱疹的家兔的眼拭子样品中HSV-1复制的作用
从表3中可以看出，从在感染后第5天时接受WDS-1的动物中分离的病毒滴度值明显低于从接受安慰剂的动物中分离的病毒滴度；相应的值为1.25log TCD50/0.1mL与4.0logTCD50/0.1mL。对照组动物中高病毒滴度表明活动性病毒复制持续，特别是在角膜上皮中。
有关测试化合物对具有病毒分离物的动物中的HSV-1复制频率和水平产生的作用的结果表明化合物WDS-1具有特异性抗病毒作用。
(b)本发明化合物的免疫刺激活性研究
与测定化合物WDS-1对在家兔中诱导的疱疹性眼部感染过程的的作用的同时，我们研究了在家兔中的体外中和反应中产生特异性病毒中和抗体(VAB)。在本实验前，在全部动物中不存在病毒中和抗体。感染后14天，在感染动物中给予新物质，导致诱导病毒中和抗体(VAB)显著增加。因此，对照组动物具有中和指数(NI)，其显示病毒中和抗体(VAB)的血清浓度为2.0log TCD50，而在给予WDS-1环境的感染动物中，中和指数为3.5log TCD50。在21天观察中观察到类似的趋势。
因此，我们的研究证实本发明的锗配位化合物具有联合抗病毒活性机制。它们不仅对疱疹病毒斑块阿昔洛韦-抗性株(特别是HSV-1“L2/R”)具有抑制作用，而且同时刺激特异性体液免疫形成和维持长时间期限。
本发明的锗配位化合物可以用于治疗和预防不同的感染，特别是由疱疹病毒导致的那些感染。此外，本发明的锗配位化合物可以用作免疫刺激剂。由于本发明化合物的联合活性机制，所以包含它们的治疗药物可以有效地治疗和预防免疫受损的人，例如，AIDS患者和癌症患者，以及那些具有器官移植物的患者。
新制备的化合物是无毒性的并且具有良好的生物药剂学参数，且由此可以制备宽谱治疗药物，其包含如本发明请求保护的有效剂量的锗配位化合物作为活性成分。本发明的治疗药物可以示例为不同的剂型：固体剂型(胶囊、片剂)、液体剂型(输注和摄入用溶液、滴眼液)、软剂型(软膏剂、凝胶、栓剂)等，且它们可以包含药学可接受的载体和其它常用成分作为辅助成分。

Claims (9)

1.具有如下结构通式(I)的锗配位化合物：
Gex[AD][CA]y[AA]z (I)
其中AD是具有抗病毒活性的嘌呤含氮碱衍生物；
CA是羟基羧酸；
AA是选自α-氨基酸的氨基酸，
其中x＝1-2，y＝2-4，且z＝0-2，并且其中
所述配位化合物中的所有AD相同或不同，
所述配位化合物中的所有CA相同或不同，且
所述配位化合物中的所有AA相同或不同，其中所述AD是鸟嘌呤或腺嘌呤的衍生物，所述鸟嘌呤衍生物选自阿昔洛韦(9-[(2-羟基乙氧基)甲基]鸟嘌呤)、伐昔洛韦(2-(鸟嘌呤-9-基甲氧基)乙基L-缬氨酸醚)、更昔洛韦(9-[(1,3-二羟基-2-丙氧基)甲基]鸟嘌呤)、喷昔洛韦(9-[4-羟基-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)及其混合物，所述腺嘌呤衍生物为阿糖腺苷(9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤)，其中所述羟基羧酸CA选自柠檬酸、乳酸、苹果酸及其混合物，和
其中所述氨基酸AA选自精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸及其混合物。
2.制备权利要求1的锗配位化合物的方法，包括下列步骤：
(a)混合二氧化锗与水，得到水溶液或水性淤浆；
(b)向所述水溶液或所述水性淤浆中添加：
(i)至少一种是具有抗病毒活性的嘌呤含氮碱衍生物的化合物、至少一种羟基羧酸和至少一种氨基酸；
或
(ii)至少一种是具有抗病毒活性的嘌呤含氮碱衍生物的化合物和至少一种羟基羧酸，
其中以任意顺序添加所述成分；
(c)在搅拌下在40-100℃的温度下将由此得到的混合物加热3-14小时；
(d)过滤得到的溶液；和
(e)从该溶液中除去水，得到锗配位化合物，
其中所述AD是鸟嘌呤或腺嘌呤的衍生物，所述鸟嘌呤衍生物选自阿昔洛韦(9-[(2-羟基乙氧基)甲基]鸟嘌呤)、伐昔洛韦(2-(鸟嘌呤-9-基甲氧基)乙基L-缬氨酸醚)、更昔洛韦(9-[(1,3-二羟基-2-丙氧基)甲基]鸟嘌呤)、喷昔洛韦(9-[4-羟基-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)及其混合物，所述腺嘌呤衍生物为阿糖腺苷(9-β-D-阿糖呋喃腺嘌呤)，其中所述羟基羧酸CA选自柠檬酸、乳酸、苹果酸及其混合物，和
其中所述氨基酸AA选自精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸及其混合物。
3.权利要求2的方法，其中加热在80-100℃的温度下进行5-12小时。
4.权利要求3的方法，其中加热在85-100℃的温度下进行6-8小时。
5.权利要求2的方法，其中加热在搅拌下进行至形成澄清溶液为止。
6.治疗药物，具有抗病毒活性且包含权利要求1的锗配位化合物作为活性成分。
7.权利要求6的治疗药物，具有针对疱疹病毒的抗病毒活性。
8.权利要求6的治疗药物，具有针对疱疹病毒1型和2型的抗病毒活性。
9.免疫刺激剂，包含权利要求1的锗配位化合物作为活性成分，其中所述AD是阿昔洛韦，CA是柠檬酸，AA是精氨酸。
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