CN101704795A - 盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍,其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。它可通过化学合成得到，所需的原料价格低，原料易得，且其制备方法简便，得率较高，适宜于工业化生产。通过药理活性试验表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的体内外抗乙肝病毒，丙肝病毒，流感病毒，肺炎病毒及单纯疱疹病毒的活性比盐酸吗啉胍显著增强，而且毒性也比盐酸吗啉胍的毒性低1倍以上。因此，它可应用于制备抗病毒药物，尤其是应用于制备抗流感药物，抗丙肝药物，抗乙肝药物，抗病毒性肺炎药物和抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物。

Description

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种新的盐酸吗啉胍衍生物，即盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍及其制备方法和在制备抗病毒药物中的应用，特别是在制备抗流感药物，抗丙肝药物，抗乙肝药物，抗病毒性肺炎药物和抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物中的应用。

背景技术

病毒是病原微生物中最小的一种，在细胞内繁殖，其核心是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)，外壳是蛋白质，不具有细胞结构。病毒寄生于宿主细胞内，依赖宿主细胞代谢系统进行增殖复制。在病毒基因提供的遗传信息调控下合成病毒核酸和蛋白质，然后在胞浆内装配为成熟的感染性病毒体，以各种方式自细胞释出而感染其他细胞。多数病毒缺乏酶系统，不能独立自营生活，必须依靠宿主的酶系统才能使其本身繁殖(复制)，病毒核酸有时整合于细胞，不易消除，因此抗病毒药研究发展缓慢。

由病毒引起的人类疾病种类繁多，已经确定的如伤风、流感、水痘等一般性疾病，以及天花、艾滋病、SARS和禽流感等严重疾病；还有一些疾病可能是以病毒为致病因子，例如人疱疹病毒6型与一些神经性疾病，如多发性硬化症和慢性疲劳综合症之间可能相关。

一些病毒能够引起慢性感染，可以在机体内不断复制而不受宿主防御系统的影响；这类病毒包括乙肝病毒和丙肝病毒。受到慢性感染的人群即是病毒携带者，因为他们相当于储存了保持感染性的病毒。当人群中有较高比例的携带者时，这一疾病就可以发展为流行病，如甲肝等。

病毒病是人类的主要传染病，病毒可侵犯不同组织器官，感染细胞引起疾病。由病毒引起的常见疾病有①流行性疾病：流行性感冒、普通感冒、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、小儿麻痹；②慢性感染：乙型肝炎、艾滋病(AIDS)；③潜伏感染：疱疹性角膜炎、性病疱疹病毒与肿瘤有关的某些肿瘤。

抗病毒感染的途径很多，如直接抑制或杀灭病毒、干扰病毒吸附、阻止病毒穿入细胞、抑制病毒生物合成、抑制病毒释放或增强宿主抗病毒能力等。而疫苗与抗病毒药物是预防与治疗病毒病的最主要手段。

盐酸吗啉胍能抑制病毒核酸的聚合酶，阻止病毒蛋白合成，从而抑制病毒繁殖。在人胚肾细胞上，1％浓度的盐酸吗啉胍对DNA病毒(腺病毒)和RNA病毒(埃可病毒及流感病毒)均具有明显抑制作用，对病毒增殖周期各个阶段均有抑制作用。盐酸吗啉胍为广谱的抗病毒药物，临床主要用于治疗普通感冒、流感、病毒性肺炎、病毒性支气管炎、腮腺炎、水痘、扁平疣、疱疹及病毒性角膜结膜炎，局部用于眼浅表部位的真菌感染。

上述盐酸吗啉胍虽为广谱的抗病毒药物，但由于盐酸吗啉胍毒性较大，不利于临床应用；因此，为了降低其毒性，增强其抗病毒活性，本发明将盐酸吗啉胍制成新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，以提高药物的疗效。

发明内容

本发明提供一种新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。

本发明提供这种新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备方法。

本发明提供这种新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在制备抗病毒药物中的应用，特别是在制备抗流感药物，抗丙肝药物，抗乙肝药物，抗病毒性肺炎药物和抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物中的应用。

本发明盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的化学结构式如下：

本发明盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备方法，包含以下步骤：

1.2-(1-乙基丙基)吗啉的制备

a)2-(1-乙基丙基)环氧乙烷与2-氨基乙醇按1∶0.5-5的摩尔比，反应温度40-70℃，搅拌，反应1.5-4小时，反应结束后，通过减压蒸馏得1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇；

b)接着依次加入摩尔比为1∶1-3的浓磷酸和1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇，在50-80℃搅拌融化，然后升温至60-95℃，按1mol 1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇加入2-8g固体杂多酸催化剂，所述固体杂多酸催化剂是二氧化硅负载的磷钨钼杂多酸催化剂(杂多酸催化剂的制备方法参见文献：杨水金等.稀有金属，2007，31(4)：533-536.)，搅拌反应1-5小时，分馏出反应生成的水；降温至室温，过滤；固体杂多酸催化剂循环使用，滤液重新加入反应器，再加入1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇中和磷酸，1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇的加入摩尔量为反应器中已加入浓磷酸量的摩尔数的1-3倍。在80-90℃搅拌反应6-10h，分馏出2-(1-乙基丙基)吗啉。反应总收率为70-95％。

2.盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

摩尔比为1∶1-4的2-(1-乙基丙基)吗啉和浓盐酸在溶剂二甲苯中反应，二甲苯的体积用量为2-(1-乙基丙基)吗啉摩尔量100-200倍，加热至80-120℃，回流脱水，直至脱水完全，自然冷至30-80℃，加入摩尔量为2-(1-乙基丙基)吗啉摩尔数的1-4倍的双氰胺，搅拌，加热至80-100℃，回流2-6h，生成白色固体物，抽滤，乙醇洗涤滤饼两次，抽干，将所得物用乙醇重结晶两次，得产品白色结晶盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。反应收率为75％-95％。

合成技术路线如下：

本发明盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的药理实验：

1.通过体内外抗乙肝病毒实验(参见实施例4，实施例5)，显示盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有很强的抗乙肝病毒的作用(参见表1，表2)。

2.通过体内抗流感病毒实验(参见实施例6)，显示盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有很强的抗流感病毒的作用(参见表3)。

3.通过体内抗肺炎病毒实验(参见实施例7)，显示盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有很强的抗肺炎病毒的作用(参见表4)。

4.通过治疗兔单纯疱疹病毒性角膜炎实验(参见实施例8)，显示显示盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有很强的抗疱疹病毒的作用(参见表5)

5.通过体内抗丙肝病毒实验(参见实施例9)，显示盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有很强的抗丙肝病毒的作用(参见表6)。

6.通过细胞毒性实验(参见实施例10)，显示盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍毒性较盐酸吗啉胍毒性低(参见表7)。

7.通过体内急性毒性实验(参见实施例11)，显示盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍毒性较盐酸吗啉胍毒性低(参见表8-11)。

根据药理实验结果，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在抗病毒活性实验中显示出显著的效果，而且毒性较低。因此，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍可作为制备抗病毒药物，特别是作为制备抗流感药物、抗丙肝药物、抗乙肝药物、抗病毒性肺炎药物和抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。

本发明盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍可以按药物制备的常规方法制成药物，药物中含有有效量的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍及常规的可药用载体。将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍与一种或多种固体或液体药物赋形剂和(或)辅剂结合，制成可作为药物使用的适当的施用形式或剂量形，如片剂、丸剂、胶囊剂、口服液、滴眼剂、注射剂等剂型的制剂，也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂以及各种微粒给药制剂。制剂中含有0.1-90重量％的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。

为了将给药单元制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种药用载体.关于药用载体，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、糖粉、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、糖粉、蜂蜜、饴糖、液状葡萄糖、阿拉伯胶浆、明胶浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、吐温-80、泡腾崩解剂、交联羧甲基淀粉钠、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，如月桂醇硫酸镁、棕榈酸、富马酸、滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等；甜味剂，如蛋白糖、甜蜜素、环己烷氨基磺酸、醇糖、糖精钠(钙)、甘草甜素等；矫味剂，如薄荷脑、各种香精、肉桂及各种果味料等.还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片.为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种药用载体.关于药用载体，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、糖浆、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；冷却剂，如液状石蜡、二甲硅油和植物油等.为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种药用载体；关于这类药用载体例如可可脂、高级醇的酯等.为了将给药单元制成眼部用药制剂，可以广泛使用本领域公知的各种药用载体；关于这类药用载体例如玻璃酸钠等.为了将给药单元制成胶囊剂，将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍与上述的各种药用载体混合，并将由此得到的混合物置于明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮及其它高分子材料制成的硬胶囊或软胶囊中.也可将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂.为了将给药单元制成注射用制剂，例如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂与乳化剂，如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、卵磷脂、吐温类、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等；例如脂质体，可以使用本领域常用的薄膜法、逆相蒸发法、溶剂注入法、复乳法等方法制备.另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油；此外，还可以添加常规的助溶剂、PH调节剂等.此外，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂或其它材料.

本发明盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的给药剂量取决于诸多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。通常体重约75公斤患者，用于流感疾病所给盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的日剂量为0.1mg/kg体重-100mg/kg体重，优选5mg/kg体重-20mg/kg体重；用于病毒性肝炎所给盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的日剂量为1ng/kg体重-50mg/kg体重，优选1ng/kg体重-10mg/kg体重；用于病毒性肺炎所给盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的日剂量为0.1mg/kg体重-100mg/kg体重，优选5mg/kg体重-20mg/kg体重。用于单纯疱疹病毒性角膜炎，滴入眼睑内，所给盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的日剂量为5mg-600mg，优选10mg-200mg。给药剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。具体病例可由医师根据病情调整。

本发明的创新之处在于：

1.本发明新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的毒性比盐酸吗啉胍的毒性低1倍以上。

2.通过药理活性试验表明，本发明新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有显著的抗病毒活性。它的体内外抗乙肝病毒，丙肝病毒，流感病毒，肺炎病毒及单纯疱疹病毒的活性比盐酸吗啉胍显著增强。

3.通过化学合成得到本发明新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，所需的原料价格低，原料易得，且其制备方法简便，得率较高，适宜于工业化生产。

4.本发明提供了新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在制备抗病毒药物，特别是在制备抗流感药物、抗丙肝药物、抗乙肝药物、抗病毒性肺炎药物和抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物方面的应用。

5.本发明新的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍制备的抗流感药物、抗乙肝药物、抗丙肝药物、抗病毒性肺炎药物和抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物，可以制成不同剂型，可以不同方式给药，增加临床应用的选择性。

具体实施方式

下面的实施例仅用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

1.2-(1-乙基丙基)吗啉的制备

1mol 2-(1-乙基丙基)环氧乙烷与1mol 2-氨基乙醇加入反应釜中，反应温度40℃，搅拌，反应1.5小时，反应结束后，通过减压蒸馏得到1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇。

接着向反应釜中依次加人1mol的浓磷酸和1mol的1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇，在50℃搅拌至样品完全融化，然后加热至65℃，加入3g固体杂多酸催化剂，搅拌反应2小时，打开脱水装置分馏出反应生成的水；反应完毕，降温至室温，过滤；固体杂多酸催化剂循环使用，滤液重新加人反应釜，再加入1mol 1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇中和磷酸，在80℃搅拌反应6h，打开减压蒸馏装置，分馏出2-(1-乙基丙基)吗啉。反应总收率75％。下列波谱数据显示为2-(1-乙基丙基)吗啉。

ESI-MS(m/z)：180.24[M+Na]。b.p.：145-147℃

¹H-NMR(C₅D₅N)：δ3.66(2H，m，H-6)，3.64(1H，t，H-2)，2.87(2H，m，H-5)，2.83(2H，t，H-3)，1.28(4H，m，H-1”，H-2’)，0.95(6H，t，H-2”，H-3’)。

¹³CNMR(C₅D₅N)：δ81.0(C2)，72.1(C6)，52.4(C5)，54.6(C3)，40.2(C1’)，21.4(C2’，C1”)，12.2(C3’，C2”)。

2、盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

在装有搅拌器、分承器和回流冷凝管的三口瓶中，加入0.2mol6-(1-乙基丙基)吗啉，20mL二甲苯，搅拌下加入0.2mol浓盐酸.加热至80℃，回流脱水，直至脱水完全，自然冷至30℃，加入0.2mol双氰胺，搅拌，加热至85℃，回流3h，有大量白色固体物生成，冰水冷至室温，抽滤，适量乙醇洗涤滤饼两次，抽干，将所得产品用乙醇重结晶两次，得白色结晶盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。反应收率为78％。下列波谱数据显示为盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。

ESI-MS(m/z)：300.78[M+Na]。m.p.：185-187℃

¹H-NMR(C₅D₅N)：δ3.67(2H，m，H-6)，3.65(1H，t，H-2)，2.9(2H，m，H-5)，2.8(2H，t，H-3)，1.29(4H，m，H-1”，H-2’)，0.96(6H，t，H-2”，H-3’)。

¹³CNMR(C₅D₅N)：δ78.6(C2)，69.7(C6)，163(胍基C)，52.6(C5)，50.3(C3)，40.1(C1’)，21.3(C2’，C1”)，12.1(C3’，C2”)。

实施例2  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

1.2-(1-乙基丙基)吗啉的制备

1mol 2-(1-乙基丙基)环氧乙烷与3mol 2-氨基乙醇加入反应釜中，反应温度50℃，搅拌，反应2.5小时，反应结束后，通过减压蒸馏得到1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇。

向反应釜中依次加人0.5mol的浓磷酸和1mol的1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇，在50℃搅拌至样品完全融化，然后加热至75℃，加入5g固体杂多酸催化剂，搅拌反应3小时，打开脱水装置分馏出反应生成的水；反应完毕，降温至室温，过滤；固体杂多酸催化剂循环使用，滤液重新加入反应釜，再加入0.5mol 1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇中和磷酸，在90℃搅拌反应8h，打开减压蒸馏装置，分馏出2-(1-乙基丙基)吗啉。反应总收率80.2％。

2、盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

在装有搅拌器、分承器和回流冷凝管的三口瓶中，加入0.2mol6-(1-乙基丙基)吗啉，30mL二甲苯，搅拌下加入0.4mol浓盐酸.加热至90℃，回流脱水，直至脱水完全，自然冷至30℃，加入0.6mol双氰胺，搅拌，加热至95℃，回流4h，有大量白色固体物生成，冰水冷至室温，抽滤，适量乙醇洗涤滤饼两次，抽干，将所得产品用乙醇重结晶两次，得白色结晶盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。反应收率为85％。

实施例3  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

1.2-(1-乙基丙基)吗啉的制备

2mol 2-(1-乙基丙基)环氧乙烷与10mol 2-氨基乙醇加入反应釜中，反应温度70℃，搅拌，反应3.5小时，反应结束后，通过减压蒸馏得到1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇。

向反应釜中依次加入0.5mol的浓磷酸和1.5mol的1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇，在80℃搅拌至样品完全融化，然后加热至95℃，加入7g固体杂多酸催化剂，搅拌反应5小时，打开脱水装置分馏出反应生成的水；反应完毕，降温至室温，过滤；固体杂多酸催化剂循环使用，滤液重新加人反应釜，再加入1mol 1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇中和磷酸，在80℃搅拌反应10h，打开减压蒸馏装置，分馏出2-(1-乙基丙基)吗啉。反应总收率92.5％。

2、盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

在装有搅拌器、分承器和回流冷凝管的三口瓶中，加入0.2mol6-(1-乙基丙基)吗啉，40mL二甲苯，搅拌下加入0.6mol浓盐酸.加热至100℃，回流脱水，直至分脱水完全，自然冷至30℃，加入0.8mol双氰胺，搅拌，加热至110℃，回流6h，有大量白色固体物生成，冰水冷至室温，抽滤，适量乙醇洗涤滤饼两次，抽干，将所得产品用乙醇重结晶两次，得白色结晶盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。反应收率为93.5％。

实施例4  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的体外抗乙肝病毒实验

1、材料

HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞的HepG22.2.15(中国科学院武汉病毒研究所产品)。

恩替卡韦(百时美施贵宝公司产品)，以蒸馏水制成8ng/L的溶液。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)，以蒸馏水制成8ng/L的溶液。

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，自制(参见实施例1)；以蒸馏水制成8ng/L的溶液。

以上药物于实验时用维持液稀释至所需浓度；G418，L-谷氨酰胺(北科化学试剂公司进口分装)；胎牛血清(美国Hyclonelab公司产品)；卡那霉素(Sigma分装)。细胞用MEM培养，培养液中含10％胎牛血清、0.03％谷氨酰胺、G418 380ug/L、卡那霉素50U/ml，调PH至7.2。细胞消化液用0.25％胰蛋白酶。乙肝定量PCR试剂盒(美国BiotroniCS公司产品)。

2、HepG2 2.2.15培养

在长满HepG2 2.2.15的培养瓶内加0.25％胰蛋白酶，37℃消化3-4min，加培养液吹打，1-3天传代，2天长满。消化后计数，配制成1×10⁵/ml个细胞接种于24孔培养板，1ml/孔，37℃，5％CO₂培养24h，细胞长成单层后进行以下实验。

各药物用维持液稀释后，分别加入24孔培养板，每药物每浓度三孔，37℃，5％CO₂培养，每3天换原浓度药液培养，第9天末收集培养液，-20℃冰冻保存。阳性对照组为恩替卡韦组。以维持液配制成4ng/L的溶液。同时设立阴性对照组。

3、荧光定量PCR检测HBV-DNA

收集药物处理后第9天末的培养液，用荧光定量PCR检测培养上清液中HBV-DNA的含量。计算给药组对HBV-DNA的抑制率。

4、结果

抑制率＝(W_{阴性对照组}-W_给药组)/W_{阴性对照组}×100％(见表1)。

W_{阴性对照组}：阴性对照组HBV-DNA的含量；W_给药组：给药组HBV-DNA的含量。统计学分析：运用SPSS10.0软件中的t检验进行统计分析。

表1盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍体外抑制HBV-DNA作用

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在HepG22.2.15培养中对HBV-DNA有着很明显的抑制作用，相同浓度的的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组对HBV-DNA的抑制作用比盐酸吗啉胍组强1倍以上；随着浓度的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的剂量依赖性，IC₅₀＝0.56ng/L；因此，可将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍用于制备抗病毒性乙肝的药物。

实施例5  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的体内抗乙肝病毒实验

1、材料

试剂和仪器：乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测试剂盒(华美生物工程公司产品)；Multiskan MK3酶标仪(生命科学国际<香港>有限公司产品)；TGL-16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂产品)。

药物

恩替卡韦(百时美施贵宝公司产品)，以蒸馏水制成8ng/ml的溶液。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)，以蒸馏水制成8ng/ml的溶液。

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍盐酸，自制(参见实施例2)；以蒸馏水制成8ng/ml的溶液。

动物

M-TgHBV转基因小鼠(上海南方模式生物科技发展有限公司产品)42只，雌雄各半，以原核注射方式导入C1型HBV基因，在获得的Founder小鼠血清中检测到HBsAg的表达，经与C57BL/6J品系小鼠回交7代以上建立了由HBV转基因的C57BL/6J品系小鼠，转基因小鼠血清中HBsAg表达稳定。

2、方法

将48只M-TgHBV转基因小鼠随机分组，每组6只。分别给予试验药物8，4，2ng/kg，灌胃给药；阳性对照组分别给恩替卡韦4ng/kg，盐酸吗啉胍4ng/kg，灌胃；阴性对照组，给予生理盐水0.4mL/只。每组均连续给药12天。在第13天时，通过眼眶取血，检测HBsAg。

3、结果

用药前、后血清HBsAg定量检测结果(见表2)。

用SPSS统计分析软件的重复测量数据方法进行方差分析。

表2盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍用药前、后血清HBsAg定量检测结果

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍可以显著抑制血清HBsAg的表达水平，相同浓度的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组的对血清HBsAg的表达水平的抑制作用比盐酸吗啉胍组和恩替卡韦组明显增强；因此，可将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍用于制备抗病毒性乙肝的药物。

实施例6  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的体内抗流感病毒实验

1、药物

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，自制(参见实施例2)；以蒸馏水配成50ug/ml的溶液。用蒸馏水稀释后给药。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)，以蒸馏水配成50ug/ml的溶液。

利巴韦林(石家庄市欣向荣药业有限公司公司产品)，以蒸馏水配成50ug/ml的溶液。

2、动物

NIH小鼠(第二军医大学实验动物中心产品)，雌雄，体重14～16g，符合清洁级实验标准。

3、流感病毒株

甲1型流感病毒株(广东省防疫站病毒室产品)，在狗肾细胞(MDCK)中传代，以病变及公鸡红血球血凝法判断其滴度，在35℃、体积分数5％CO₂的培养箱中培养。

4、对小鼠体内感染流感病毒的死亡保护作用

将NIH小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、利巴韦林组(剂量为100μg/kg^-1/d^-1)、盐酸吗啉胍组(剂量为100μg/kg^-1/d^-1)及盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍高、中、低剂量组(剂量分别为100、10、1μg/kg^-1/d^-1)，分别以流感病毒FM1株2个LD50滴鼻感染，给药组自感染病毒1天开始，到感染后4天灌胃给药，对照组灌胃给予等容积蒸馏水，逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14天，计算死亡保护率：P_死亡保护＝(P_{模型组死亡}-P_{给药组死亡})/P_{模型组死亡}×100％。

5、结果

对体内感染流感病毒小鼠的死亡保护作用(见表3)。

表3盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍对体内感染流感病毒小鼠的死亡保护作用

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组存活率与模型组比较差异有显著性意义(P＜0.05)，相同剂量的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组对体内感染流感病毒小鼠的死亡保护作用比盐酸吗啉胍组和利巴韦林组显著增强，表明盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有显著抗流感病毒的作用；因此，可将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍用于制备抗病毒性流感的药物。

实施例7  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的体内抗肺炎病毒实验

1、药品与材料

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，自制(参见实施例1)；以蒸馏水配成50mg/ml的溶液，用蒸馏水稀释后给药。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)，以蒸馏水配成50mg/ml的溶液。

利巴韦林(石家庄市欣向荣药业有限公司公司产品)，以蒸馏水配成50mg/ml的溶液。

病毒株HCMV AD169株(上海复旦大学医学院微生物教研室产品)。使用前进行复苏及增毒；以6.0logTCID₅₀/ml病毒作为实验毒种。

实验动物

4周龄SPF级♀Balb/c小鼠，体重15～20g(中国科学院上海实验动物中心产品)。

2、方法

实验动物适应环境1周后随机分为正常对照组、模型对照组、利巴韦林治疗组、盐酸吗啉胍组以及盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍高、中、低剂量治疗组，每组10只。正常对照组腹腔注射Eagle培养液(DulbeccomodifiedEaglemedium，DMEM)0.5ml/只，其余组均腹腔注射6.0logTCID₅₀/ml HCMVAD 169病毒0.5ml/只；接种5天后，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍高、中、低剂量分别为80、60、30mg/kg^-1/d^-1，利巴韦林组和盐酸吗啉胍组剂量均为60mg/kg^-1/d^-1，各治疗组均腹腔注射相应药物，感染模型组和正常对照组腹腔注射等量生理盐水。连续给药5天后，逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14天，计算死亡率。

3、结果见表4。

表4盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍对体内感染肺炎病毒小鼠的死亡保护作用

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍具有显著抗肺炎病毒的作用，相同剂量的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组对体内感染肺炎病毒小鼠的死亡保护作用比盐酸吗啉胍组和利巴韦林组显著增强；因此，可将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍用于制备抗病毒性肺炎的药物。

实施例8  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的抗单纯疱疹病毒实验

1、实验材料

1、1动物

30只健康新西兰白兔(第二军医大学实验动物中心产品)，体重1.70～2.35kg，雌雄不限，双眼无结膜炎、角膜炎等眼部疾病。

1、2药品

阿昔洛韦滴眼液(0.1％，质量百分含量)(沈阳圣元药业有限公司产品)。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)。以蒸馏水配成0.1％的浓度。

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍自制(参见实施例3)；以蒸馏水配成重量百分含量分别为0.05％，0.1％，0.2％不同浓度。

1、3细胞和病毒

Hep-2细胞：为人喉癌细胞；HSV-1病毒：为HSV-1Sm44株，在Hep-2细胞上增殖，TCID/ml(病毒毒力参数)＝1.0×10⁶(山东省医学科学院基础研究所微生物室产品)。

2、方法

2、1制作单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)动物模型

于接种病毒前2天给实验兔双眼滴加0.25％氯霉素眼液，每次1滴，每日3次.手术前24只兔双眼分别用1％盐酸丁卡因滴眼液滴眼，3min后再滴1次，以麻醉兔眼.用4.5号针头作兔角膜上皮层井字划痕，长度5～6mm，深度约0.5mm，吸取HSV-1毒株原液30ul滴人结膜囊，被动闭合兔眼，轻揉20s.接种病毒24～48h后，将兔眼用荧光素染色，在裂隙灯下观察角膜感染情况，当兔角膜出现树枝状或地图状病灶时，说明病毒感染成功，动物模型制成.

2、2动物分组及治疗方法

36只兔感染成功后随机分为6组，每组6只：(1)种毒对照组：不用任何药物治疗。(2)阿昔洛韦组：给阿昔洛韦滴眼液治疗；盐酸吗啉胍组：给药方法与剂量同阿昔洛韦组。方法：每2h滴眼1次，每次1滴，每天5次。(3)盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组：给0.05％，0.1％，0.2％不同浓度的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍点眼，方法同阿昔洛韦组。

2、3裂隙灯显微镜观察

每日用荧光素染色后，在裂隙灯下观察兔角膜上皮、基质及前房病变程度，并进行评分。角膜上皮病变评分标准采用Trousdale记分法。其中以角膜上皮病变分值(comealepithelial involvement Score，CEIS)为主要指标(见表5)。

3、结果

采用SPSS 11.0统计软件包中配对样本T检验，进行统计学分析。

表5各组不同时期病变程度(CEIS)记录表

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍不同浓度具有显著抗单纯疱疹病毒的作用，相同浓度的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组对单纯疱疹病毒引起的角膜炎的治疗作用比盐酸吗啉胍组和阿昔洛韦组显著增强；因此，可将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍用于制备抗单纯疱疹病毒性角膜炎的药物。

实施例9盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的体内抗丙肝病毒实验

1、实验材料

1、1实验动物

昆明种小鼠，

，18～22g(第二军医大学实验动物中心产品)。

1、2药品与试剂

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，自制(参见实施例1)；以蒸馏水配成1mg/ml的溶液，用注射用水稀释后给药。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)。

利巴韦林注射液(上海信谊药业有限公司产品)。

卡介苗(BCG)(上海生物制品公司产品)。

脂多糖(LPS)(Sigma公司产品)。

ALT、AST试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)。

2、实验方法

动物随机分组，尾ivBCG2Sit/只，正常对照组和模型对照组给予等量生理盐水，治疗组给予不同剂量的药物，每天1次，阳性对照组分别给予利巴韦林，盐酸吗啉胍，40ug/kg，每天1次。正常饲养10天，末次给药后再次尾ivLPSlOug/只，进行攻击，16h后眼眶静脉取血，进行肝功能检测(血清ALT、AST测定)。

3、结果

对免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(见表6)

表6盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍对免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(n＝6只)

P＜0.05

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍可不同程度地抑制BCG和LPS诱导的小鼠血清ALT、AST水平的升高，对小鼠免疫性肝损伤具有保护作用，相同剂量的盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组对BCG和LPS诱导的小鼠血清ALT、AST水平的抑制作用比盐酸吗啉胍组和利巴韦林组明显增强；因此，可将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍用于制备抗病毒性丙肝的药物。

实施例10  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的细胞毒性实验

1、材料

HBVDNA克隆转染的人肝癌细胞HepG2.2.2.15细胞系(中国科学院武汉病毒研究所产品)。

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，自制(参见实施例1)；以无血清的DMEM配制成10mg/mL原液，过滤除菌备用。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)，以无血清的DMEM配制成10mg/mL原液，过滤除菌备用。

DMEM培养基、胎牛血清(FCS)、四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Gbico公司产品)；OLYMPUSIXS1倒置显微镜(日本奥林巴斯公司产品)；HEPA FILTER型CO₂培养箱(ThermoForma公司产品)；SynergyHT型酶标检测仪(美国BIO.TEK仪器公司产品)。

2、方法

2、1对细胞毒性的检测

将HepG22.2.15细胞以3×10⁵/mL的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100ul，置37℃、5％CO₂培养箱中培养48h；将盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍药物原液用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)配制成4，2，1，0.5，0.25，0.125mg/mL6种浓度的稀释液，加入上述细胞中(100ul/孔)，每种浓度重复6孔，同时设阳性对照盐酸吗啉胍组和阴性对照组；继续置37℃、5％CO₂培养箱中培养5天；每孔再加入浓度为5mg/mL MTT的磷酸缓冲液(PBS)100ul，继续37℃培养4h，吸弃原液，立即加入DMSO 100ul/孔，室温放置并轻度振荡10-15min；然后在酶标仪上测定其吸光度(A)值，测定波长为490nm。

2、2评价方法

细胞相对增值率(relative growth rate，RAR)按公式(1)计算。用6级毒性分类法评定药物的细胞毒性。用直线回归方程计算细胞的半数中毒浓度(TC₅₀)。

3、结果

RAR＝(A均值_实验组/A均值_{阴性对照组})×100％(1)，细胞的TC₅₀为5.36mg/mL(见表7)。

表7相对增殖率及细胞毒性分级结果(n＝6只)

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在浓度为4，2，1，0.5，0.25，0.125mg/mL时对HepGz22.2.15细胞均无明显细胞毒性作用，毒性比盐酸吗啉胍组明显降低。

实施例11  盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的急性毒性实验

1、实验材料

1、1药物

盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，自制(参见实施例1)；以蒸馏水配制成一定浓度的溶液。

盐酸吗啉胍(珠海远城医药原料制造有限公司产品)，以蒸馏水配制成一定浓度的溶液。

1、2动物

NIH小鼠，雌雄各半，5～6周龄，体重18-22g，购第二军医大学实验动物中心。

2、预实验

首先用10倍稀释的一系列药液，0.2mL/10g容量各试4鼠，腹腔注射给药，进而在4/4及0/4致死组之间，再按等比级插入3～5档剂量，如取4/4组的药液浓度，将剂量递减为每10g用0.14，0.10，0.07，0.05，0.035mL，再各试4鼠。如某组死亡率为4/4，其前一组是2/4或3/4，则以该组剂量为100％致死剂量(Dm)；同法找出最低致死量(Dn)。(见表8)。

表8盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍对小鼠致死量的预实验结果

实验表明盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的Dm为17400mg/kg，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的Dn为7720mg/kg。

3、正式实验

取NIH小鼠70只，雌雄各半，随机分成7组，每组10只。其中1，2，3，4，5，6组为盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍组，腹腔注射给药。根据预实验结果，以Dm和Dn的剂量作为正式试验的最高和最低剂量组，以1.17为组距设定6个盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍试验组。第7组为空白对照组。禁食不禁水12h，于次日上午给药1次，常规饲养，连续观察7天，记录动物反应及死亡情况。

4、结果见表9。

表9盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍对小鼠LD₅₀测定结果

注：∑p＝2.9，∑p²＝2.09

统计学处理采用改良寇氏法计算半数致死量(LD₅₀)和LD₅₀的95％可信限。计算公式为：

LD₅₀＝lg^-1[X_m-i(∑p-0.5)]    (1)

LD₅₀的95％可信限＝log^-1(X₅₀±1.96Sx₅₀)    (2)

${\mathrm{Sx}}_{50}=i\&times;\sqrt{\mathrm{\&Sigma;}(p-p2)}/n---\left(3\right)$

X₅₀＝logLD₅₀

Sx₅₀：logLD₅₀的标准误差

X_m：最大剂量组的对数值；i：相邻的两个剂量组对数剂量之差；p：各组动物死亡率，以小数表示；∑p：各组动物死亡率之和；n：每组动物数。

计算结果为：

LD₅₀＝11994mg/kg；LD₅₀的95％可信限为：13076.8～11000.7mg/kg

盐酸吗啉胍按上述方法同样实验，实验结果见表10，表11。

表10盐酸吗啉胍对小鼠致死量的预实验结果

表11盐酸吗啉胍对小鼠LD₅₀测定结果

注：∑p＝3.1，∑p²＝2.29

计算结果为：

LD₅₀＝5814.6mg/kg；LD₅₀的95％可信限为：6339.6～6333.1mg/kg

上述实验结果表明，盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍急性毒性比盐酸吗啉胍低很多。

Claims (8)

1.盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍，其特征在于具有下列化学结构式：

2.权利要求1所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)2-(1-乙基丙基)吗啉的制备

a)2-(1-乙基丙基)环氧乙烷与2-氨基乙醇按1∶0.5-5的摩尔比，反应温度40-70℃，搅拌，反应1.5-4小时，反应结束后，通过减压蒸馏得1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇；

b)接着依次加入摩尔比为1∶1-3的浓磷酸和1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇，在50-80℃搅拌融化，然后加热至60-95℃，按1mol 1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇加入2-8g固体杂多酸催化剂，搅拌反应1-5小时，分馏出反应生成的水；降温至室温，过滤；固体杂多酸催化剂循环使用，滤液重新加入反应器，再加入1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇中和磷酸，1-乙醇氨基-2-乙基-2-丁醇的加入摩尔量为反应器中已加入浓磷酸量的摩尔数的1-3倍，在80-90℃搅拌反应6-10h，分馏出2-(1-乙基丙基)吗啉；

(2)盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的制备

摩尔比为1∶1-4的2-(1-乙基丙基)吗啉和浓盐酸在溶剂二甲苯中反应，二甲苯的体积用量为2-(1-乙基丙基)吗啉摩尔量100-200倍，加热至80-120℃，回流脱水，直至脱水完全，自然冷至30-80℃，加入摩尔量为2-(1-乙基丙基)吗啉摩尔数的1-4倍的双氰胺，搅拌，加热至80-100℃，回流2-6h，生成白色固体物，抽滤，乙醇洗涤滤饼两次，抽干，将所得物用乙醇重结晶两次，得产品白色结晶盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍。

3.按权利要求2所述2-(1-乙基丙基)吗啉的制备方法，其特征在于合成步骤(1)b)中所述固体杂多酸催化剂是二氧化硅负载的磷钨钼杂多酸催化剂。

4.权利要求1所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的应用，其特征在于所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在制备抗病毒性流感药物中的应用。

5.权利要求1所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的应用，其特征在于所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在制备抗病毒性丙型肝炎药物中的应用。

6.权利要求1所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的应用，其特征在于所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在制备抗病毒性乙型肝炎药物中的应用。

7.权利要求1所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的应用，其特征在于所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在制备抗病毒性肺炎药物中的应用。

8.权利要求1所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍的应用，其特征在于所述盐酸2-(1-乙基丙基)吗啉胍在制备抗单纯疱疹病毒性角膜炎药物中的应用。